”BILAGOR

SAMMANFATTNING

Bilaga I	Egenskaper hos olivolja
Bilaga Ia	Provtagning av olivolja eller olivolja av pressrester som levereras i detaljhandelsförpackningar
Bilaga Ib	Flödesschema för kontroll av huruvida ett prov av olivolja överensstämmer med den kategori som uppgetts
Bilaga II	Bestämning av fria fettsyror, metod vid låg temperatur
Bilaga III	Bestämning av peroxidtalet
Bilaga IV	Bestämning av vaxhalten genom kapillärgaskromatografi
Bilaga VII	Bestämning av procentandelen 2-glycerylmonopalmitat
Bilaga IX	Spektrofotometrisk undersökning i ultraviolett ljus
Bilaga X	Bestämning av fettsyrametylestrar med gaskromatografi
Bilaga XI	Bestämning av halten flyktiga halogenerade lösningsmedel i olivolja
Bilaga XII	Internationella olivoljerådets metod för organoleptisk bedömning av jungfruolja
Bilaga XV	Oljehalt i pressrester av oliver
Bilaga XVI	Bestämning av jodtal
Bilaga XVII	Metod för bestämning av stigmastadiener i vegetabiliska oljor
Bilaga XVIII	Bestämning av skillnaden mellan faktiskt och teoretiskt innehåll av triglycerider med ECN 42
Bilaga XIX	Bestämning av sammansättningen och halten av steroler och alkoholföreningar genom kapillärgaskromatografi
Bilaga XX	Metod för bestämning av halter av vaxer, fettsyreetylestrar och fettsyremetylestrar genom kapillärgaskromatografi
Bilaga XXI	Resultat av kontroller av överensstämmelse som utförs på olivolja enligt artikel 8.2

”BILAGA I

EGENSKAPER HOS OLIVOLJA

Kvalitetsegenskaper

Fettsyraetylestrar (mg/kg)		≤ 35	—	—	—	—	—	—	—
Organoleptisk bedömning	Medianvärde för fruktighet (Mf)	Mf > 0,0	Mf > 0,0	—	—	—	—	—	—
	Defekternas medianvärde (Md) (*)	Md = 0,0	Md ≤ 3,5	Md> 3,5 (1)
Delta-K		≤ 0,01	≤ 0,01	—	≤ 0,16	≤ 0,15	—	≤ 0,20	≤ 0,18
K268 eller K270		≤ 0,22	≤ 0,25	—	≤ 1,25	≤ 1,15	—	≤ 2,00	≤ 1,70
K232		≤ 2,50	≤ 2,60	—	_	_	—	_	_
Peroxidtal (mEq O2/kg)		≤ 20,0	≤ 20,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0
Syrahalt (%) (*)		≤ 0,80	≤ 2,0	> 2,0	≤ 0,30	≤ 1,00	—	≤ 0,30	≤ 1,00
Kategori		1. Extra jungfruolja	2. Jungfruolja	3. Bomolja	4. Raffinerad olivolja	5. Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja	6. Oraffinerad olivolja av pressrester	7. Raffinerad olivolja av pressrester	8. Olivolja av pressrester

Renhetsegenskaper

2-glycerylmonopalmitat (%)

≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14,00 %

≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14,00 %

≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14,00 %

≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14,00 %

≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14,00 %

≤ 1,1 om totalhalten palmitinsyra > 14,00 %

≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14,00 %

≤ 1,1 om totalhalten palmitinsyra > 14,00 %

≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14,00 %

≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14,00 %

≤ 1,4

≤ 1,4

≤ 1,2

Skillnad: ECN 42 (HPLC) och ECN 42 (teoretisk beräkning)

≤ |0,20|

≤ |0,20|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,60|

≤ |0,50|

≤ |0,50|

Stigmastadiener (mg/kg)\ (3)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,50

—

—

—

—

—

Totalt isomerer av translinolsyra + isomerer av translinolensyra (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,10

≤ 0,35

≤ 0,35

Totalt transolein-isomerer (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,40

Fettsyrasammansättning (2)

syra (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

Behensyra (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,30

Eikosensyra (%)

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

Eikosansyra (arakinsyra) (%)

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

Linolensyra (%)

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

Myristinsyra (%)

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

Kategori

1. Extra jungfruolja

2. Jungfruolja

3. Bomolja

4. Raffinerad olivolja

5. Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja

6. Oraffinerad olivolja av pressrester

7. Raffinerad olivolja av pressrester

8. Olivolja av pressrester

Vaxer (mg/kg) (**)		C42 + C44 + C46 ≤ 150	C42 + C44 + C46 ≤ 150	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (6)	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (7)	C40 + C42 + C44 + C46 > 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350
Erytrodiol och uvaol (%) (**)		≤ 4,5	≤ 4,5	≤ 4,5 (6)	4,5	≤ 4,5	> 4,5 (7)	4,5	> 4,5
Totalhalt steroler (mg/kg)		≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 2 500	≥ 1 800	≥ 1 600
Sterolsammansättning	Delta-7-stigmastenol (4) (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
	App. β–sitosterol (5) (%)	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0
	Stigmasterol (%)	< Kamp.	< Kamp.	—	< Kamp.	< Kamp.	—	< Kamp.	< Kamp.
	Kampesterol (4) (%)	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0
	Brassikasterol (%)	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,2	≤ 0,2	≤ 0,2
	Kolesterol (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
Kategori		1. Extra jungfruolja	2. Jungfruolja	3. Bomolja	4. Raffinerad olivolja	5. Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja	6. Oraffinerad olivolja av pressrester	7. Raffinerad olivolja av pressrester	8. Olivolja av pressrester

Anmärkningar:

a)	Analysresultaten ska anges med samma antal decimaler som anges för varje egenskap. Den sista siffran ska avrundas uppåt om efterföljande siffra är högre än 4.

b)	Det räcker med att en enda av egenskaperna inte motsvarar det angivna värdet för att en olja ska klassas i en annan kategori eller förklaras ej uppfylla kraven enligt denna förordning.

c)	För jungfruolja kan de båda kvalitetsegenskaper som är markerade med en asterisk (*) samtidigt skilja sig åt från de gränsvärden som fastställts för den kategorin.

d)	Egenskaper markerade med två asterisker (**) anger, för oraffinerad olivolja av pressrester, att båda gränsvärdena samtidigt får skilja sig från de angivna värdena. För olivolja av pressrester och raffinerad olivolja av pressrester får ett av gränsvärdena skilja sig från de angivna värdena.

Tillägg

Beslutsscheman

Beslutsschema avseende kampesterol för jungfruolja och extra jungfruolja:

Övriga parametrar ska uppfylla de gränsvärden som fastställs i denna förordning.

Beslutsschema avseende delta-7-stigmastenol för

—	Extra jungfruolja och jungfruolja

Övriga parametrar ska uppfylla de gränsvärden som fastställs i denna förordning.

—	Olivolja av pressrester (oraffinerad och raffinerad)

Övriga parametrar ska uppfylla de gränsvärden som fastställs i denna förordning.

”BILAGA Ib

FLÖDESSCHEMA FÖR KONTROLL AV HURUVIDA ETT PROV AV OLIVOLJA ÖVERENSSTÄMMER MED DEN KATEGORI SOM UPPGETTS

Översiktstabell

Tabell 1 – Extra jungfruolja – Kvalitetskriterier

Tabell 2 – Jungfruolja – Kvalitetskriterier

Tabell 3 – Extra jungfruolja och jungfruolja – Renhetskriterier

Tabell 4 – Bomolja – Renhetskriterier

Tabell 5 – Raffinerad olivolja – Kvalitetskriterier

Tabell 6 – Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja – Kvalitetskriterier

Tabell 7 – Raffinerad olivolja och olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja – Renhetskriterier

Tabell 8 – Oraffinerad olivolja av pressrester – Renhetskriterier

Tabell 9 – Raffinerad olivolja av pressrester – Kvalitetskriterier

Tabell 10 – Olivolja av pressrester – Kvalitetskriterier

Tabell 11 – Raffinerad olivolja av pressrester och olivolja av pressrester – Renhetskriterier

”BILAGA XIX

BESTÄMNING AV SAMMANSÄTTNINGEN OCH HALTEN AV STEROLER OCH ALKOHOLFÖRENINGAR GENOM KAPILLÄRGASKROMATOGRAFI

1.   TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Genom metoden beskrivs ett förfarande för bestämning av det enskilda och totala innehållet av alkoholföreningar i olivoljor och olivoljor av pressrester och i blandningar av dessa två oljor.

Alkoholföreningar i olivoljor och olivoljor av pressrester omfattar alifatiska alkoholer, steroler och triterpendialkoholer.

2.   PRINCIP

Oljor med tillsats av α-kolestanol och 1-eicosanol som intern standard förtvålas med kaliumhydroxid i etanollösning varefter de oförtvålbara ämnena extraheras med etyleter.

De olika alkoholföreningarnas fraktioner separeras från de oförtvålbara ämnena genom tunnskiktskromatografi på en basisk kiselgelplatta (referensmetod) eller genom vätskekromatografi (HPLC) på kiselgelkolonn. Den fraktion som återvinns från separation av kiselgelen överförs till trimetylsilyletrar och analyseras därefter genom kapillärgaskromatografi.

DEL 1

BEREDNING AV OFÖRTVÅLBARA ÄMNEN

1.   TILLÄMPNINGSOMRÅDE

I denna del beskrivs beredning och extraktion av oförtvålbara ämnen. Det omfattar beredning och extraktion av oförtvålbara ämnen från olivoljor och olivoljor av pressrester.

2.   PRINCIP

En provmängd förtvålas genom kokning under återflöde med kaliumhydroxid i etanollösning. De oförtvålbara ämnena extraheras med dietyleter.

3.   UTRUSTNING

Sedvanlig laboratorieutrustning, i synnerhet följande:

3.1	Rundkolv med återloppskylare med slipade anslutningsfogar, 250 ml.

3.2	Separertratt, 500 ml.

3.3	Kolvar, 250 ml.

3.4	Mikrosprutor, 100 μl och 500 μl.

3.5	En cylindrisk filtrertratt med poröst membran G 3 (porositet 15–40 μm), med en diameter på ca 2 cm och ett djup på 5 cm, som passar för vakuumfiltrering, med hanslipning.

3.6	E-kolv med honslipning, 50 ml, som kan användas för filtrertratten (punkt 3.5).

3.7	Provrör med konisk botten och glaspropp, 10 ml.

3.8	Exsickator med kalciumklorid.

4.   REAGENSER

4.1	Kaliumhydroxid, minst 85 %.

4.2	Kaliumhydroxid i etanollösning, ca 2 M. Lös 130 g kaliumhydroxid (punkt 4.1) under kylning i 200 ml destillerat vatten och späd sedan till 1 liter med etanol (punkt 4.7). Förvara lösningen i väl tillslutna, mörka flaskor som lagras i högst två dagar.

4.3	Etyleter, av analyskvalitet.

4.4	Vattenfritt natriumsulfat, av analyskvalitet.

4.5	Aceton, av kromatografisk kvalitet.

4.6	Etyleter, av kromatografisk kvalitet.

4.7	Etanol, av analyskvalitet.

4.8	Etylacetat, av analyskvalitet.

4.9	Intern standard, α-kolestanol, renhet över 99 % (renheten måste kontrolleras genom analys med gaskromatografi).

4.10	α-kolestanol som intern standard, 0,2 % lösning (m/V) i etylacetat (punkt 4.8).

4.11	Fenolftaleinlösning, 10 g/l i etanol (punkt 4.7).

4.12	En 0,1 % (m/v) lösning av 1-eicosanol i etylacetat (intern standard).

5.   FÖRFARANDE

Med hjälp av en 500 μl mikrospruta (punkt 3.4) införs i 250 ml kolven (punkt 3.1) en volym α-kolestanollösning som intern standard (punkt 4.10) och en volym 1-eicosanol (punkt 4.12) innehållande en mängd kolestanol och eicosanol motsvarande ca 10 % av sterol- och alkoholhalten i provet. För olivolja tillsätts exempelvis 500 μl α-kolestanollösning (punkt 4.10) och 250 μl 1-eicosanollösning (punkt 4.12) per 5 g prov. För olivoljor av pressrester tillsätts 1 500 μl både av α-kolestanollösning (punkt 4.10) och av 1-eicosanol (punkt 4.12). Indunsta till torrhet under en svag ström av kväve i ett varmt vattenbad. Kyl kolven. Väg upp 5,00 ± 0,01 g torrt filtrerat prov i samma kolv.

Anmärkning 1:

Animaliska eller vegetabiliska oljor och fetter som innehåller betydande kvantiteter av kolesterol kan visa en topp med en retentionstid som är identiskt med den för kolestanol. Om detta inträffar måste sterolfraktionen analyseras dubbelt med och utan intern standard.

Tillsätt 50 ml 2 M kaliumhydroxid i etanollösning (punkt 4.2) och lite pimpsten. Sätt på återloppskylaren och värm till svag kokning tills förtvålning inträder (lösningen blir klar). Fortsätt upphettningen under ytterligare 20 minuter och tillsätt sedan 50 ml destillerat vatten från toppen av återloppskylaren. Ta bort kylaren och kyl kolven till ca 30 °C.

Överför kolvens innehåll kvantitativt till en 500 ml separertratt (punkt 3.2) genom att använda flera portioner destillerat vatten (50 ml). Tillsätt ca 80 ml etyleter (punkt 4.6). Skaka omsorgsfullt i ungefär 60 sekunder och frigör regelbundet trycket genom att vända upp och ned på separertratten och öppna avstängningsventilen. Låt stå tills de två faserna har separerats fullständigt (Anmärkning 2). Överför därefter tvållösningen så fullständigt som möjligt i en annan separertratt. Genomför ytterligare två extraheringar av vatten-alkoholfasen på samma sätt med användande av 60–70 ml etyleter (punkt 4.6).

Anmärkning 2:

Eventuell emulsion kan förstöras genom tillsats av små kvantiteter etanol (punkt 4.7).

Samla de tre eterextrakten i en separertratt som innehåller 50 ml vatten. Fortsätt att tvätta med vatten (50 ml) till dess att tvättvattnet inte längre ger en rosa färg vid tillsättning av en droppe fenolftaleinlösning (punkt 4.11). När tvättvattnet har avlägsnats, filtrera på vattenfritt natriumsulfat (punkt 4.4) ner i en i förväg vägd 250 ml kolv. Tvätta därefter tratten och filtret med små mängder etyleter (punkt 4.6).

Låt lösningsmedlet avdunsta genom destillation i en rotationsindunstare vid 30 oC under vakuum. Tillsätt 5 ml aceton (punkt 4.5) och avlägsna allt flyktigt lösningsmedel i en svag ström av kväve. Torka återstoden i torkskåp vid 103 ± 2 °C i 15 minuter. Kyl i exsickator och väg med 0,1 mg noggrannhet.

DEL 2

SEPARATION AV FRAKTIONER AV ALKOHOLFÖRENINGAR

1.   TILLÄMPNINGSOMRÅDE

De oförtvålbara ämnen som bereds enligt del 1 fraktioneras i olika alkoholföreningar: alifatiska alkoholer, steroler och triterpendialkoholer (erytrodiol och uvaol).

2.   PRINCIP

De oförtvålbara ämnena kan fraktioneras med basiska plattor för tunnskiktskromatografi (referensmetod). De identifieras och motsvarande band skrapas av och extraheras. En alternativ metod för separation är vätskekromatografi (HPLC) med kiselgelkolonn och UV-detektor, varvid de olika fraktionerna samlas upp. Alifatiska alkoholer och triterpenalkoholer respektive sterol- och triterpendialkoholer isoleras tillsammans.

3.   UTRUSTNING

Sedvanlig laboratorieutrustning, i synnerhet följande:

3.1	Komplett apparatur för tunnskiktskromatografi med 20 × 20 cm glasplattor.

3.2	UV-lampa med en våglängd på 366 eller 254 nm.

3.3	Mikrosprutor, 100 μl och 500 μl.

3.4	En cylindrisk filtrertratt med poröst membran G 3 (porositet 15–40 μm), med en diameter på ca 2 cm och ett djup på 5 cm, som passar för vakuumfiltrering, med hanslipning.

3.5	E-kolv med honslipning, 50 ml, som kan användas för filtrertratten (punkt 3.4).

3.6	Provrör med konisk botten och glaspropp, 10 ml.

3.7	Exsickator med kalciumklorid.

3.8	HPLC-system bestående av följande: 3.8.1 Binär pump. 3.8.2 Manuell eller automatisk injektor försedd med en 200 μL injektionsslinga. 3.8.3 In-line-avgasare. 3.8.4 UV-VIS eller IR-detektor.

3.9	HPLC-kolonn (25 cm x 4 mm innerdiameter) med kiselgel 60 (partikelstorlek 5 μm).

3.10	Sprutfilter, 0,45 μm.

3.11	E-kolv, 25 ml.

4.   REAGENSER

4.1	Kaliumhydroxid, minst 85 %.

4.2	Kaliumhydroxid i etanollösning, ca 2 M. Lös 130 g kaliumhydroxid (punkt 4.1) under kylning i 200 ml destillerat vatten och späd sedan till 1 liter med etanol (punkt 4.9). Förvara lösningen i väl tillslutna, mörka flaskor som lagras i högst två dagar.

4.3	Etyleter, av analyskvalitet.

4.4	Kaliumhydroxid i etanollösning, ca 0,2 M. Lös 13 g kaliumhydroxid (punkt 4.1) i 20 ml destillerat vatten och späd till 1 liter med etanol (punkt 4.9).

4.5	Glasplattor (20x20) täckta med kiselgel utan fluorescensindikator, tjocklek 0,25 mm (finns i handeln färdiga för användning).

4.6	Aceton, av kromatografisk kvalitet.

4.7	n-hexan, av kromatografisk kvalitet.

4.8	Etyleter, av kromatografisk kvalitet.

4.9	Etanol, av analyskvalitet.

4.10	Etylacetat, av analyskvalitet.

4.11	Referenslösning för tunnskiktskromatografi: kolesterol, fytosteroler, alkoholer och erytrodiol 5 % lösning i etylacetat (punkt 4.10).

4.12	Lösning av 2,7-diklorflourecein, 0,2 %, i etanollösning. Denna görs lätt basisk genom tillsättning av ett par droppar 2 M alkoholisk kaliumhydroxidlösning (punkt 4.2).

4.13	n-hexan (punkt 4.7)/etyleter (punkt 4.8): blandning 65:35 (V/V).

4.14	Mobil fas för HPLC, n-hexan (punkt 4.7)/etyleter (punkt 4.8) (1:1) (V/V).

5.   REFERENSMETOD: SEPARATION AV ALKOHOLFÖRENINGAR GENOM BASISKA PLATTOR FÖR TUNNSKIKTSKROMATOGRAFI

Beredning av de basiska plattorna för tunnskiktskromatografi. Sänk ner eller doppa kiselgelplattorna (punkt 4.5) ca 4 cm i 0,2 M kaliumhydroxidetanollösning (punkt 4.4) i 10 sekunder och låt sedan torka i dragskåp i två timmar varefter de placeras i ett torkskåp vid 100 oC i en timme.

Ta ut plattorna från torkskåpet och förvara dem i en exsickator med kalciumklorid (punkt 3.7) tills de ska användas (plattor som behandlas på detta sätt måste användas inom 15 dagar).

Fyll på n-hexan/etyleterblandningen (punkt 4.13) (Anmärkning 3) i framkallningskammaren till ett djup av ca 1 cm. Stäng kammaren med tillhörande lock och låt stå svalt i minst en halvtimme så att jämvikten vätska/gas inställer sig. Remsor av filtrerpapper som doppas ner i eluenten kan placeras på insidorna av kammaren. Detta minskar framkallningstiden med ca en tredjedel och leder till en jämnare eluering av komponenterna.

Anmärkning 3:

Framkallningsblandningen ska bytas för varje prov för att få exakt reproducerbara elueringsförhållanden. En blandning av 50:50 (V/V) av n-hexan/etyleter kan också användas.

Förbered en ca 5 % lösning av de oförtvålbara ämnen som beretts enligt del 1 i etylacetat (punkt 4.10) och stryk med 100 μl mikrosprutan (punkt 3.3) ut 0,3 ml av lösningen smalt och jämnt på den nedre delen (2 cm) av kromatografiplattan (punkt 4.5). Placera i linje med strykningen 2 till 3 μl av referenslösningen (punkt 4.11) så att sterol-, triterpendialkohol- och alkoholbanden kan identifieras efter framkallning.

Placera plattan i framkallningskammaren (punkt 3.1). Rumstemperaturen ska hållas mellan 15 och 20 °C (Anmärkning 4). Stäng kammaren omedelbart med locket och påbörja elueringen tills lösningsmedlets främre kant når till ca 1 cm från övre änden av plattan. Ta ut plattan ur framkallningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i en ström av varmluft eller genom att plattan får ligga en kort stund i dragskåp.

Anmärkning 4:

Högre temperatur kan försämra separationen.

Spraya plattan lätt och jämnt med 2,7-diklorfloureceinlösningen (punkt 4.12) och låt torka. När plattan betraktas i ultraviolett ljus (punkt 3.2) kan sterol-, triterpendialkohol- och alkoholbanden identifieras genom att de ligger i höjd med fläckarna som erhållits från referenslösningen (punkt 4.11). Markera änden av banden längs kanterna av fluorescensen med svart blyerts (se TLC-platta, figur 1).

Skrapa med hjälp av en metallspatel bort kiselgelen från det markerade området. Placera det finfördelade materialet som tagits bort i filtrertratten (punkt 3.4). Tillsätt 10 ml het etylacetat (punkt 4.10), blanda omsorgsfullt med metallspateln och filtrera (vid behov under vakuum) i E-kolven (punkt 3.5) som är ansluten till filtrertratten.

Tvätta återstoden i kolven tre gånger med etyleter (punkt 4.3) (ca 10 ml varje gång) och samla upp filtratet i samma kolv som är ansluten till filtrertratten. Indunsta filtratet till en volym på 4–5 ml och överför resterande lösning till det tidigare vägda 10 ml provröret (punkt 3.6). Låt indunsta till torrhet under lätt uppvärmning, i svagt kväveflöde, fyll på nytt genom att använda några droppar aceton (punkt 4.6) och indunsta åter till torrhet. Återstoden i provröret består av sterol- och triterpendialkoholfraktionerna eller av alkohol- och triterpenalkoholfraktionerna.

6.   SEPARATION AV ALKOHOLFRAKTIONER GENOM VÄTSKEKROMATOGRAFI (HPLC)

Lös upp de oförtvålbara ämnen som erhålls enligt del 1 i 3 ml av den mobila fasen (4.14), filtrera lösningen med ett sprutfilter (punkt 3.10) och ställ åt sidan.

Spruta in en lösning 200 μL av de oförtvålbara ämnena i HPLC-systemet (punkt 3.8).

Genomför HPLC-separationen med 0,8 ml/min. Häll bort under de första fem min. Därefter samlas i 25 ml e-kolvar (punkt 3.11) alifatiska alkoholer och triterpenalkoholer mellan den femte och tionde minuten samt steroler, erytrodiol och uvaol mellan den elfte och 25:e minuten (Anmärkning 5).

Separationen kan övervakas med en UV-detektor på våglängden 210 nm eller med en refraktionsindexdetektor (se figur 6).

Fraktionerna får indunsta till torrhet och förbereds för kromatografanalys.

Anmärkning 5:

Kontrollera noggrant HPLC-pumpens tryck. Etyleter kan öka trycket. Justera flödet för att hålla trycket under kontroll.

DEL 3

GASKROMATOGRAFISK ANALYS AV FRAKTIONER AV ALKOHOLFÖRENINGAR

1.   TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Denna del ger allmänna riktlinjer för tillämpning av kapillärgaskromatografi för att bestämma den kvalitativa och kvantitativa sammansättning av de alkoholföreningar som isoleras enligt den metod som beskrivs i del 2.

2.   PRINCIP

De fraktioner som samlas från de oförtvålbara ämnena med hjälp av tunnskiktskromatografi (TLC) eller vätskekromatografi (HPLC) derivatiseras till trimetylsilyletrar och analyseras med kapillärgaskromatografi med splitinjektion och flamjoniseringsdetektor.

3.   UTRUSTNING

Sedvanlig laboratorieutrustning, i synnerhet följande:

3.1	Provrör med konisk botten och glaspropp, 10 ml.

3.2

Gaskromatograf lämpad för användning med kapillärkolonn med splitinjektion, bestående av följande: 3.2.1 Termostatstyrd kolonnugn som kan hålla den önskade temperaturen med en noggrannhet av ± 1 °C. 3.2.2 Injektor med inställbar temperatur och försedd med ett förångningselement av glas med silaniserad yta och splitsystem. 3.2.3 Flamjoniseringsdetektor. 3.2.4 System för datainsamling lämpligt för användning tillsammans med flamjoniseringsdetektorn (punkt 3.10.3), som kan ställas in på manuell integration.

3.3	Kapillärkolonn med kiseldioxid med en längd på 20–30 meter, innerdiameter 0,25–0,32 mm, belagd med 5 % difenyl - 95 % dimetylpolysiloxan (SE-52 eller SE-54, stationär fas eller motsvarande), med en enhetlig filmtjocklek mellan 0,10 och 0,30 μm.

3.4	Mikrospruta på 10 μl, för gaskromatografi, med härdad nål lämplig för splitinjektion.

4.   REAGENSER

4.1	Vattenfri pyridin, av kromatografisk kvalitet.

4.2	Hexametyldisilasan, av analyskvalitet.

4.3	Trimetylklorosilan, av analyskvalitet.

4.4	Provlösningar av steroltrimetylsilyletrar. Bereds omedelbart före användning av steroler och erytrodiol som erhållits från oljor som innehåller dem.

4.5	Standardlösningar av trimetylsilyletrar av alifatiska alkoholer från C20 till C28. De kan framställas av blandningar av rena alkoholer omedelbart innan de ska användas.

4.6	Bärgas: vätgas eller helium, ren, för gaskromatografi.

4.7	Hjälpgaser: väte, helium, kväve och luft, av gaskromatografisk kvalitet.

4.8	Silyleringsreagens, bestående av en blandning 9:3:1 (V/V/V) av pyridin/hexametyldisilasan/trimetylklorosilan.

4.9	n-hexan, av kromatografisk kvalitet.

5.   BEREDNING AV TRIMETYLSILYLETRAR

Tillsätt silyleringsreagensen (punkt 4.8) (Anmärkning 6), i förhållandet 50 μl för varje mg alkoholförening, i provröret (punkt 3.1) som innehåller alkoholföreningsfraktionen. Undvik upptag av fuktighet (Anmärkning 7).

Anmärkning 6:

Lösningar som är klara för användning finns i handeln. Andra silyleringsreagenser, t.ex. bistrimetylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylklorosilan, som måste spädas med lika stor volym vattenfri pyridin finns också i handeln. Pyridin kan ersättas med samma mängd acetonitril.

Anmärkning 7:

Eventuell bildning av en svag opalescens är normal och inverkar inte. Bildandet av en vit flockning eller rosafärgning är tecken på förekomst av fukt eller sönderfall hos reagensen. Om detta inträffar måste testet upprepas (endast om hexametyldisilazan/trimetylklorsilan används).

Sätt proppen i provröret (punkt 3.1), skaka försiktigt (utan att vända på det) tills föreningarna är helt lösta. Låt stå i minst 15 minuter i rumstemperatur och centrifugera sedan i ett par minuter. Den klara lösningen är nu färdig för analys med gaskromatografi.

6.   GASKROMATOGRAFISK ANALYS

6.1   Förberedelser, iordningställande av kapillärkolonn

Montera kolonnen (punkt 3.3) i gaskromatografen genom att kolonnens inlopp ansluts till splitinjektorn och kolonnens utlopp till detektorn.

En allmän kontroll av gaskromatografen genomförs (gasanslutningarna ska vara täta, detektorn i fullgott skick, splitsystem och registreringssystem fungerande etc.).

Kapillärkolonner som används för första gången bör prepareras. En liten mängd gas får flyta genom kolonnen och sedan kopplas gaskromatografen på och en gradvis upphettning genomförs tills temperaturen är minst 20 °C över drifttemperaturen (Anmärkning 8). Denna temperatur bibehålls i minst två timmar och sedan ställs kromatografen iordning för driftförhållanden (inställning av gasflöde och splittning, tändning av flamman, anslutning till databehandlingssystemet, inställning av temperaturen i kolonnen, detektorn och injektorn etc.), och signalen registreras med en känslighet som är minst två gånger högre än den som beräknas för analysen. Baslinjen ska vara linjär, utan några toppar av något slag, och får inte visa tecken på drift. Negativ drift av linjen är tecken på otäta kolonnanslutningar, medan en positiv drift tyder på otillräcklig preparering av kolonnen.

Anmärkning 8:

Temperaturen vid prepareringen ska alltid vara minst 20 °C lägre än den maximitemperatur som specificeras för den stationära fas som används.

6.2   Driftsförhållanden

Optimera temperaturprogrammet och bärgasflödet på så sätt att kromatogram som liknar figurerna 3–6 erhålls.

Följande parametrar har provats och befunnits vara användbara:

6.2.1   Alifatiska alkoholer

Program för torkskåp	180 °C (8 min.) → 260 °C (5 °C/min.) → 260 °C (15 min.)
Injektortemperatur	280 °C
Detektortemperatur	290 °C
Bärgasens linjära hastighet	helium (20–30 cm/s), väte (30–50 cm/s)
Splitförhållande	1:50 till 1:100
Injektionsvolym	0,5 till 1 μl av TMSE-lösning

6.2.2   Sterol- och triterpendialkoholer

Program för torkskåp	260 ± 5 °C (isotermisk)
Injektortemperatur	280–300 °C
Detektortemperatur	280–300 °C
Bärgasens linjära hastighet	helium (20–30 cm/s) väte (30–50 cm/s)
Splitförhållande	1:50 till 1:100
Injektionsvolym	0,5 till 1 μl av TMSE-lösning

Dessa parametrar kan ändras beroende på egenskaperna hos kolonnen och gaskromatografen för att få kromatogram som uppfyller följande krav:

—	Alkoholretentionstiden C26 ska vara 18 ± 5 minuter.

—	Toppen för alkoholen C22 ska vara 80 ± 20 % av hela skalvärdet för olivolja och 40 ± 20 % av hela skalvärdet för olivolja av pressrester.

—	Retentionstiden för ß-sitosteroltoppen bör vara 20 ± 5 minuter.

—	Kampesteroltoppen bör vara följande: för olivolja (medelhalt 3 %) 20 ± 5 % av fullt utslag.

—

Alla närvarande steroler måste separeras. Förutom att separeras måste alla toppar vara helt och hållet synliga, dvs. varje toppkurva ska återvända till baslinjen innan nästa topp ritas. Ofullständig upplösning kan emellertid tolereras under förutsättning att toppen vid RRT 1,02 (sitostanol) kan kvantifieras med hjälp av topphöjden.

6.3   Analysförfarande

Sug med hjälp av en 10 μl mikrospruta (punkt 3.4) upp 1 μl hexan, sug in 0,5 μl luft och sedan 0,5–1 μl av provlösningen. Dra ut kolven ur sprutan ytterligare så att kanylen töms. Stick in kanylen genom membranet i injektorn och spruta snabbt efter en till två sekunder in innehållet och drag sedan sakta ut kanylen efter ca fem sekunder. En automatisk injektor kan även användas.

Genomför registreringen tills de närvarande motsvarande alkoholföreningarnas TMSE har eluerats fullständigt. Baslinjen måste fortfarande uppfylla kraven för motsvarande driftsförhållanden (punkt 6.2.1 eller 6.2.2).

6.4   Identifiering av toppar

Identifiera individuella toppar på grundval av retentionstiderna och genom jämförelse med blandningen av alifatiska alkoholer och triterpenalkoholer eller sterol- och triterpendialkohol-TMSE, som analyseras med samma parametrar. Ett kromatogram för de alifatiska alkoholernas och triterpenalkoholernas fraktion visas i figur 3 och motsvarande kromatogram för steroler och triterpendialkoholer visas i figur 2.

De alifatiska alkoholerna elueras i följande ordning: C20-ol (I.S.), C22-ol, C23-ol, C24-ol, C25-ol, C26-ol, C27-ol och C28-ol.

Sterolerna och triterpendialkoholerna elueras i följande ordning: kolesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-metylenkolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, erytrodiol och uvaol.

6.5   Kvantitativ utvärdering

Toppområdena för 1-eicosanol och de alifatiska alkoholerna C22, C24, C26 och C28 beräknas genom ett system för datainsamling. Responsen för 1-eicosanol ska vara lika med 1.

Beräkna areorna för α-kolestanol- och sterol- och triterpendialkoholtopparna med hjälp av databehandlingssystemet. Bortse från toppar för föreningar som inte finns med (ergosterol ska inte beräknas) bland de som är upptagna i tabell 1. Responsen för α-kolestanol ska vara lika med 1.

Beräkna koncentrationen för varje enskild alkoholförening i mg/kg fett enligt följande:

där

Ax	=	topparean för alkoholföreningen x, enligt beräkning av databehandlingssystemet,
As	=	arean av toppen för 1-eicosanol/α-kolestanol, enligt beräkning av databehandlingssystemet,
ms	=	massan av tillsatt 1-eicosanol/α-kolestanol i milligram,
m	=	massan av det prov som använts för bestämningen, i gram.

7.   RESULTATANGIVELSE

Ange de enskilda alifatiska alkoholernas och triterpenalkoholernas koncentration i mg/kg fett och summan av dem som ’totalhalten alifatiska alkoholer’. Totalhalten är summan av C22, C24, C26 och C28.

Varje enskild alkoholförenings sammansättning bör anges med en decimals noggrannhet.

Sterolkoncentrationen bör anges utan decimal.

Beräkna procentandelen av varje enskild sterol som förhållandet mellan den aktuella topparean och den totala topparean för steroler:

där

Ax	=	topparean för sterol x,
ΣA	=	total topparea för steroler.

Apparent β-sitosterol: Δ5,23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5,24-stigmastadienol.

Beräkna procentandelen erytrodiol och uvaol:

där

AEr	=	arean för erytrodiol enligt beräkning av databehandlingssystemet,
AUv	=	arean för uvaol enligt beräkning av databehandlingssystemet,
ΣAT	=	summan av arean för sterol + erytrodiol + uvaol enligt beräkning av databehandlingssystemet.

Utöver beräkningen av procentandelen enskilda steroler och triterpendialkoholer och den totala sterolkoncentrationen ska även koncentrationen av erytrodiol och av uvaol och deras summor, i mg/kg fett, beräknas enligt följande:

där

AEr	=	toppområde för erytrodiol, enligt beräkning av databehandlingssystemet,
AUv	=	arean för uvaol enligt beräkning av databehandlingssystemet,
As	=	arean av toppen för α-kolestanol, enligt beräkning av databehandlingssystemet,
ms	=	massan av tillsatt α-kolestanol i milligram,
m	=	massan av det prov som använts för bestämningen, i gram.

Tillägg

1. Kolväten 2. α-tokoferol 3. Prenoler 4. Triterpenalkoholer 5. Alifatiska alkoholer 6. Metylsteroler 7. Steroler 8. Triterpendialkoholer

Figur 1 – TLC av den oförtvålbara fraktionen från olivolja av pressrester, eluerad två gånger med hexan:dietyleter (65:35), framkallad med SO4H2 (50 %) och upphettad. De band som ska skrapas av visas i rektanglarna. Rektangel 1 är banden för alifatiska alkoholer och rektangel 2 banden för steroler och triterpendialkoholer.

Tabell I – Relativa retentionstiden för steroler

Topp	Identifiering		Relativ retentionstid
			SE 54-kolonn	SE 52-kolonn
1	Kolesterol	Δ-5-kolesten-3ß-ol	0,67	0,63
2	Kolestanol	5α-kolestan-3ß-ol	0,68	0,64
3	Brassikasterol	[24S]-24-metyl-Δ-5,22-kolestadien-3β-ol	0,73	0,71
*	Ergosterol	[24S]-24-metyl-Δ-5,7,22 kolestatrien-3β-ol	0,78	0,76
4	24-metylenkolesterol	24-metylen-Δ-5,24-kolestadien-3ß-o1	0,82	0,80
5	Kampesterol	[24R]-24-metyl-Δ-5-kolesten-3ß-ol	0,83	0,81
6	Kampestanol	[24R]-24-metylkolestan-3ß-ol	0,85	0,82
7	Stigmasterol	[24S]-24-etyl-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol	0,88	0,87
8	Δ-7-kampesterol	[24R]-24-metyl-Δ-7-kolesten-3ß-ol	0,93	0,92
9	Δ-5,23-stigmastadienol	[24R,S]-24-etyl-Δ-5,23-koIestadien-3ß-ol	0,95	0,95
10	Klerosterol	[24S]-24-etyl-Δ-5,25-kolestadien-3ß-ol	0,96	0,96
11	ß-sitosterol	[24R]-24-etyl-Δ-5-kolesten-3ß-ol	1,00	1,00
12	Sitostanol	24-etyl-kolestan-3ß-ol	1,02	1,02
13	Δ-5-avenasterol	[24Z]-24-etyliden-Δ-kolesten-3ß-ol	1,03	1,03
14	Δ-5,24-stigmastadienol	[24R,S]-24-etyl-Δ-5,24-kolestadien-3ß-ol	1,08	1,08
15	Δ-7-stigmastenol	[24R,S]-24-etyl-Δ-7-kolesten-3ß-ol	1,12	1,12
16	Δ-7-avenasterol	[24Z]-24-etyliden-Δ-7-kolesten-3ß-ol	1,16	1,16
17	Erytrodiol	5α-olean-12-en-3β,28-diol	1,41	1,41
18	Uvaol	Δ12-ursen-3β,28-diol	1,52	1,52

Figur 2 – Kromatografisk profil (GC-FID) för sterol- och triterpendialkoholer från raffinerad olivolja. (1) kolesterol, (2) α-kolestanol (I.S.), (3) 24-metylenkolesterol, (4) kampesterol, (5) kampestanol, (6) stigmasterol, (7) Δ5,23-stigmastadienol, (8) klerosterol, (9) β-sitosterol, (10) sitostanol, (11) Δ5-avenasterol, (12) Δ5,24-stigmastadienol, (13) Δ7-stigmastenol, (14) Δ7-avenasterol, (15) erytrodiol, (16) uvaol.

Figur 3 – Kromatografisk profil (GC-FID) för sterol- och triterpendialkoholer från bomolja. (1) kolesterol, (2) α-kolestanol, (3) brassikasterol, (4) 24-metylenkolesterol, (5) kampesterol, (6) kampestanol, (7) stigmasterol, (8) Δ7-kampesterol, (9) Δ5,23-stigmastadienol, (10) klerosterol, (11) β-sitosterol, (12) sitostanol, (13) Δ5-avenasterol, (14) Δ5,24-stigmastadienol, (15) Δ7-stigmastenol, (16) Δ7-avenasterol, (17) erytrodiol, (18) uvaol.

Figur 4 – Kromatografisk profil (GC-FID) för alifatiska alkoholer och triterpenalkoholer från olivolja. (I.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) triterpenalkoholer.

Figur 5 – Kromatografisk profil (GC-FID) för alifatiska alkoholer och triterpenalkoholer från raffinerad olivolja och en andra centrifugering av olivolja. (I.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) triterpenalkoholer.

Figur 6 – HPLC-kromatogram för en olivolja, oförtvålbara ämnen separerade genom HPLC med hjälp av en UV-detektor. (1) Alifatiska alkoholer och triterpenalkoholer. (2) Steroler och triterpendialkoholer.