“ANNESSI

SOMMARJU

Anness I	Karatteristiki taż-żejt taż-żebbuġa
Anness Ia	It-teħid ta' kampjuni taż-żejt taż-żebbuġa jew taż-żejt mir-residwi taż-żebbuġ mogħtija f'pakketti għall- konsum
Anness Ib	Dijagramma sekwenzjali biex jiġi vverifikat jekk kampjun taż-żejt taż-żebbuġa huwiex konsistenti mal-kategorija ddikjarata jew le
Anness II	Determinazzjoni tal-aċidi grassi liberi, metodu fil-kiesaħ
Anness III	Determinazzjoni tal-valur tal-perossidu
Anness IV	Determinazzjoni tal-kontenut tax-xama' permezz tal-kromatografija b'fażi gassuża f'kolonna kapillari
Anness VII	Determinazzjoni tal-perċentwal ta' 2-gliceril monopalmitat
Anness IX	Investigazzjoni spettrofotometrika fl-ultravjola
Anness X	Determinazzjoni tal-esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin permezz tal-kromatografija b'fażi gassuża
Anness XI	Determinazzjoni tal-kontenut ta' solventi volatili aloġinati fiż-żejt taż-żebbuġa
Anness XII	Il-metodu tal-kunsill internazzjonali taż-żebbuġ għall-valutazzjoni organolettika taż-żejt taż-żebbuġa verġni
Anness XV	Kontenut ta' żejt tal-fdal taż-żebbuġ
Anness XVI	Determinazzjoni tal-valur tal-jodju
Anness XVII	Metodu għad-determinazzjoni tas-stigmastadienes fiż-żjut tal-ħaxix
Anness XVIII	Determinazzjoni tad-differenza bejn il-kontenut attwali u teoretiku tat-triaċiligliċeroli mal-ECN 42
Anness XIX	Determinazzjoni tal-kompożizzjoni u tal-kontenut tal-isteroli u tal-komposti alkoħoliċi permezz ta' kromatografija b'fażi gassuża f'kolonna kapillari
Anness XX	Metodu biex jiġi determinat il-kontenut ta' xema', esteri metiliċi tal-aċidi xaħmin, u esteri etiliċi tal-aċidi xaħmin permezz ta' kromatografija b'fażi gassuża f'kolonna kapillari
Anness XXI	Riżultati tal-verifiki tal-konformità mwettqa fuq iż-żjut taż-żebbuġa msemmija fl-Artikolu 8(2)

“ANNESS I

KARATTERISTIKI TAŻ-ŻEJT TAŻ-ŻEBBUĠA

Karatteristiki tal-kwalità

Esteri etiliċi tal-aċidi xaħmin (mg/kg)		≤ 35	—	—	—	—	—	—	—
Evalwazzjoni organolettika	Valur medjan tat-togħma ta' frott (Mf)	Mf > 0,0	Mf > 0,0	—	—	—	—	—	—
	Valur medjan tad-difett (Md) (*)	Md = 0,0	Md ≤ 3,5	Md> 3,5 (1)
Delta-K		≤ 0,01	≤ 0,01	—	≤ 0,16	≤ 0,15	—	≤ 0,20	≤ 0,18
K268 jew K270		≤ 0,22	≤ 0,25	—	≤ 1,25	≤ 1,15	—	≤ 2,00	≤ 1,70
K232		≤ 2,50	≤ 2,60	—	—	—	—	—	—
Valur tal-perossidu (mEq O2/kg)		≤ 20,0	≤ 20,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0
Aċidità (%) (*)		≤ 0,80	≤ 2,0	> 2,0	≤ 0,30	≤ 1,00	—	≤ 0,30	≤ 1,00
Kategorija		1. Żejt taż-żebbuġa straverġni	2. Żejt taż-żebbuġa verġni	3. Żejt taż-żebbuġ lampante	4. Żejt taż-żebbuġa raffinat	5. Żejt taż-żebbuġa magħmul minn żejt taż-żebbuġa raffinat u żjut taż-żebbuġa verġni	6. Żejt mhux raffinat mir-residwi taż-żebbuġ	7. Żejt raffinat mir-residwi taż-żebbuġ	8. Żejt mir-residwi taż-żebbuġ

Karatteristiċi tal-purità

2-gliċeril monopalmitat (%)

≤ 0,9 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ≤ 14,00 %

≤ 1,0 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' > 14,00 %

≤ 0,9 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ≤ 14,00 %

≤ 1,0 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' > 14,00 %

≤ 0,9 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ≤ 14,00 %

≤ 1,1 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun > 14,00 %

≤ 0,9 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ≤ 14,00 %

≤ 1,1 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' > 14,00 %

≤ 0,9 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun ta' > 14,00 %

≤ 1,0 jekk il-perċentwal totali ta' aċidu palmitiku jkun > 14,00 %

≤ 1,4

≤ 1,4

≤ 1,2

Differenza: ECN42 (HPLC) u ECN42 (kalkolu teoretiku)

≤ |0,20|

≤ |0,20|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,60|

≤ |0,50|

≤ |0,50|

Stigmasta- dienes (mg/kg) (3)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,50

—

—

—

—

—

Total ta' isomeri linolejċi + translinoleniċi (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,10

≤ 0,35

≤ 0,35

Ammont totali ta' isomeri transolejċi (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,40

Kompożizzjoni ta' aċidi xaħmin (2)

Linjoċeriku (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

Beeniku (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,30

Ejkosenojku (%)

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

Arakidiku (%)

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

Linoleniku (%)

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

Miristiku (%)

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

Kategorija

1. Żejt taż-żebbuġa straverġni

2. Żejt taż-żebbuġa verġni

3. Żejt taż-żebbuġ lampante

4. Żejt taż-żebbuġa raffinat

5. Żejt taż-żebbuġa magħmul minn żejt taż-żebbuġa raffinat u żjut taż-żebbuġa verġni

6. Żejt mhux raffinat mir-residwi taż-żebbuġ

7. Żejt raffinat mir-residwi taż-żebbuġ

8. Żejt mir-residwi taż-żebbuġ

Xama' (mg/kg) (**)		C42 + C44 + C46 ≤ 150	C42 + C44 + C46 ≤ 150	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (6)	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (7)	C40 + C42 + C44 + C46 > 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350
Eritrodijol u uvaol (%) (**)		≤ 4,5	≤ 4,5	≤ 4,5 (6)	≤ 4,5	≤ 4,5	> 4,5 (7)	> 4,5	> 4,5
Total ta' steroli (mg/kg)		≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 2 500	≥ 1 800	≥ 1 600
Kompożizzjoni tal-isteroli	Delta-7-stigmastenol (4) (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
	App β-sitosterol (5) (%)	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0
	Stigmasterol (%)	< Kamp.	< Kamp.	—	< Kamp.	< Kamp.	—	< Kamp.	< Kamp.
	Kampesterol (4) (%)	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0
	Brassikasterol (%)	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,2	≤ 0,2	≤ 0,2
	Kolesterol (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
Kategorija		1. Żejt taż-żebbuġa straverġni	2. Żejt taż-żebbuġa verġni	3. Żejt taż-żebbuġ lampante	4. Żejt taż-żebbuġa raffinat	5. Żejt taż-żebbuġa magħmul minn żejt taż-żebbuġa raffinat u żjut taż-żebbuġa verġni	6. Żejt mhux raffinat mir-residwi taż-żebbuġ	7. Żejt raffinat mir-residwi taż-żebbuġ	8. Żejt mir-residwi taż-żebbuġ

Noti:

(a)	Ir-riżultati tal-analiżijiet għandhom jingħataw bl-istess għadd ta' ċifri wara l-punt deċimali bħal dak użat għal kull karatteristika. L-aħħar ċifra trid tiżdied b'unità waħda jekk iċ-ċifra ta' warajha tkun ta' iktar minn 4.

(b)	Jekk karatteristika waħda biss ma tkunx konformi mal-valuri ddikjarati, għall-għanijiet ta' dan ir-Regolament, il-kategorija taż-żejt tista' tinbidel jew iż-żejt jista' jiġi ddikjarat bħala mhux konformi.

(c)	Għaż-żejt taż-żebbuġa lampante, iż-żewġ karatteristiċi tal-kwalità mmarkati b'asterisk (*) jistgħu jvarjaw b'mod simultanju mil-limiti stabbiliti għal dik il-kategorija.

(d)

Jekk karatteristika tkun immarkata b'żewġ asterisks (**), dan ifisser li għaż-żejt mhux raffinat mir-residwi taż-żebbuġ, huwa possibbli li ż-żewġ limiti rilevanti jkunu differenti mill-valuri ddikjarati fl-istess ħin. Għaż-żejt mir-residwi taż-żebbuġ u għaż-żejt raffinat mir-residwi taż-żebbuġ wieħed mil-limiti rilevanti jista' jkun differenti mill-valuri ddikjarati.

Appendiċi

Siġar tad-deċiżjonijiet

Dijagramma tad-deċiżjonijiet għall-kampesterol għaż-għaż-żjut taż-żebbuġa verġni u straverġni:

Il-parametri l-oħra għandhom ikunu konformi mal-limiti stabbiliti f'dan ir-Regolament.

Siġra tad-deċiżjonijiet ta' Delta-7-stigmastenol għal:

—	Żjut taż-żebbuġa straverġni u verġni

Il-parametri l-oħra għandhom ikunu konformi mal-limiti stabbiliti f'dan ir-Regolament.

—	Żjut mir-residwi taż-żebbuġ (mhux raffinati u raffinati)

Il-parametri l-oħra għandhom ikunu konformi mal-limiti stabbiliti f'dan ir-Regolament.

“ANNESS Ib

DIJAGRAMMA SEKWENZJALI BIEX JIĠI VVERIFIKAT JEKK KAMPJUN TAŻ-ŻEJT TAŻ-ŻEBBUĠA HUWIEX KONSISTENTI MAL-KATEGORIJA DDIKJARATA JEW LE

Tabella ġenerali

Tabella 1 — Żejt taż-Żebbuġa Straverġini — Kriterji ta' kwalità

Tabella 2 — Żejt taż-Żebbuġa Verġni — Kriterji ta' kwalità

Tabella 3 — Żejt taż-Żebbuġa Straverġini u Żejt taż-Żebbuġa Verġni — Kriterji ta' purità

Tabella 4 — Żejt taż-Żebbuġa Lampante — Kriterji ta' purità

Tabella 5 — Żejt taż-Żebbuġa Raffinat — Kriterji ta' kwalità

Tabella 6 — Żejt taż-żebbuġa (magħmul minn taħlita ta' żejt taż-żebbuġa raffinat u żjut taż-żebbuġa verġni) — Kriterji ta' kwalità

Tabella 7 — Żejt taż-Żebbuġa Raffinat u żejt taż-żebbuġa magħmul minn żejt taż-żebbuġa raffinat u Żjut taż-Żebbuġa Verġni — Kriterji ta' purità

Tabella 8 — Żejt Mhux Raffinat mir-Residwi taż-Żebbuġ — Kriterji ta' purità

Tabella 9 — Żejt Raffinat mir-Residwi taż-Żebbuġ -– Kriterji ta' kwalità

Tabella 10 — Żejt mir-Residwi taż-Żebbuġ – Kriterji ta' kwalità

Tabella 11 — Żejt Raffinat mir-Residwi taż-Żebbuġ u Żejt mir-Residwi taż-Żebbuġ — Kriterji ta' purità

“ANNESS XIX

DETERMINAZZJONI TAL-KOMPOŻIZZJONI U TAL-KONTENUT TAL-ISTEROLI U TAL-KOMPOSTI ALKOĦOLIĊI PERMEZZ TAL-KROMATOGRAFIJA B'FAŻI GASSUŻA F'KOLONNA KAPILLARI

1.   KAMP TA' APPLIKAZZJONI

Il-metodu jiddeskrivi proċedura għad-determinazzjoni tal-kontenut totali ta' komposti alkoħoliċi ta' żjut taż-żebbuġa u żjut mir-residwi taż-żebbuġ kif ukoll taħlitiet ta' dawn iż-żewġt iżjut.

Il-komposti alokoliċi fiż-żjut taż-żebbuġa u fiż-żjut mir-residwi taż-żebbuġa jinkludu l-akoħol alifatiku, l-isteroli u d-dialkoħol triterpeniku.

2.   PRINĊIPJU

Iż-żjut, b'α-kolestanol u 1-ejkosanol miżjuda bħala standards interni, jiġu sapunifikati bl-idrossidu tal-potassju f'soluzzjoni etanolika u l-materja mhux sapunifikabbli u mbagħad tiġi estratta bl-eteru etiliku.

Il-frazzjonijiet ta' komposti alkoħoliċi differenti jiġu separati mill-materja mhux sapunifikabbli bi kromatografija ta' saff irqiq fuq pjanċar tal-ġell tas-siliċ bażika (metodu ta' referenza) jew permezz tal-HPLC b'kolonna tal-ġell tas-siliċe. Il-frazzjonijiet irkuprati mill-ġell tas-siliċe jinbidlu f'eteri tat-trimetilsilil u mbagħad jiġu analizzati permezz tal-kromatografija b'fażi gassuża f'kolonna kapillari.

IL-PARTI 1

TĦEJJIJA TAL-MATERJA MHUX SAPUNIFIKABBLI

1.   KAMP TA' APPLIKAZZJONI

Din il-Parti tiddeskrivi l-preparazzjoni u l-estrazzjoni tal-materja mhux sapunifikabbli. Hija tinkludi l-preparazzjoni u l-estrazzjoni tal-materja mhux sapunifikabbli minn żjut taż-żebbuġa u żjut mir-residwi taż-żebbuġ.

2.   PRINĊIPJU

Porzjon tat-test jiġi sapunifikat bit-togħlija taħt rifluss b'soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju etanoliku. Il-materja mhux sapunifikabbli tiġi estratta bl-etere dietiliku.

3.   TAGĦMIR

It-tagħmir tal-laboratorju tas-soltu u b'mod partikolari dan li ġej:

3.1.	Flask b'qiegħ tond mgħammar b'kondensatur ta' rifluss b'ġonot tal-ħġieġ mitħun, 250 ml.

3.2.	Lembut ta' separazzjoni, 500 mL.

3.3.	Flasks, 250 mL.

3.4.	Mikrosiringi, 100 μL u 500 μL.

3.5.	Lembut b'filtru forma ta' ċilindru b'septum poruż ta' G3 (b'porożità ta' 15-il μm sa 40 μm) li jkollu dijametru ta' madwar 2 ċm u jkun fond 5 ċm, li jkun adattat għall-filtrazzjoni f'vakwu b'ġonta interna tal-ħġieġ żmeriljat.

3.6.	Flask koniku b'ġonta esterna tal-ħġieġ mitħun, 50 mL li jista' jitwaħħal mal-lembut tal-filtru (3.5).

3.7.	Tubu tat-testijiet bil-qiegħ li jidjieq u tapp tal-ħġieġ li jissiġilla, 10 mL.

3.8.	Dessikatur tal-klorur tal-kalċju.

4.   REAĠENTI

4.1.	Titru minimu ta' idrossidu tal-potassju ta' 85 %.

4.2.

Madwar 2 M ta' soluzzjoni etanolika tal-idrossidu tal-potassju. Dewweb 130 g ta' idrossidu tal-potassju (4.1) permezz tat-tkessiħ f'200 ml ta' ilma distillat u mbagħad żidu bl-etanol (4.7) sa ma jkollok litru. Żomm is-soluzzjoni fi fliexken tal-ħġieġ skur magħluqin sewwa b'tapp u maħżuna għal mhux aktar minn jumejn.

4.3.	Etere etiliku għall-kwalità tal-analiżi.

4.4.	Sulfat tas-sodju anidru, għall-kwalità tal-analiżi.

4.5.	Aċeton għall-kwalità tal-kromatografija.

4.6.	Etere etiliku għall-kwalità tal-kromatografija.

4.7.	Etanol ta' kwalità analitika.

4.8.	Aċetat etiliku ta' kwalità analitika.

4.9.	Standard intern, α-kolestanol b'purità ta' aktar minn 99 % (il-purità trid tiġi ċċekkjata permezz ta' analiżi GC).

4.10.

Soluzzjoni standard interna ta' α-kolestanol, 0,2 soluzzjoni (m/V) f'aċetat etiliku (4.8).

4.11.

Soluzzjoni tal-fenolftaleina, 10 g/L fl-etanol (4.7).

4.12.

0,1 % (m/v) soluzzjoni ta' 1-ejkosanol f'aċetat etiliku (standard intern).

5.   PROĊEDURA

Filwaqt li tuża mikrosiringa ta' 500 μl (3.4), fil-flask ta' 250 ml (3.1) introduċi volum tas-soluzzjoni standard interna ta' α-kolestanol (4.12) u volum ta' 1-ejkosanol (4.12) b'ammont ta' kolestanol u ejkosanol li jikkorrispondi ma' madwar 10 % tal-kontenut ta' steroli u alkoħol tal-kampjun. Pereżempju, għal 5 g ta' kampjun ta' żejt taż-żebbuġa żid 500 μL tas-soluzzjoni α-kolestanol (4.10) u 250 μL ta' soluzzjoni 1-ejkosanol (4.12). Għal żjut mir-residwi taż-żebbuġ żid 1500 μL kemm ta' soluzzjoni α-kolestanol (4.10) kif ukoll ta' 1-ejkosanol (4.12). Evapora sakemm tnixxef b'kurrent ġentili ta' nitroġenu f'banju tal-ilma fietel. Wara li tkessaħ il-flask, iżen 5,00 ± 0,01 g tal-kampjun iffiltrat niexef fl-istess flask.

Nota 1:

Iż-żjut u x-xaħmijiet tal-annimali jew veġetali li jkun fihom kwantitajiet kbar ta' kolesterol jistgħu juru quċċata li l-ħin ta' żamma tagħha huwa identiku għal dak tal-kolestanol. Jekk dan iseħħ, il-frazzjoni tal-isteroli jkollha tiġi analizzata darbtejn, bl-istandard intern u mingħajru.

Żid 50 mL ta' 2M ta' soluzzjoni etanolika tal-idrossidu tal-potassju (4.2) u xi ftit ħaffiefa, poġġi l-kondensatur ta' rifluss u saħħan it-taħlita sakemm din tibda tagħli bil-mod u sa ma s-soluzzjoni ssir qisha sapun (sa ma ssir ċara). Kompli saħħan għal 20 minuta oħra mbagħad żid 50 mL ta' ilma ddistillat mill-parti ta' fuq tal-kondensatur, aqla' l-kondensatur u kessaħ il-flask sa ma jkollu bejn wieħed u ieħor temperatura ta' 30 °C.

Ittrasferixxi l-kontenut tal-flask b'mod kwantitattiv f'lembut ta' separazzjoni ta' 500 mL (3.2) billi tuża diversi porzjonijiet ta' ilma ddistillat (50 mL). Żid bejn wieħed u ieħor 80 ml ta' etere etiliku (4.6), ħawwad sew għal madwar 60 sekonda, filwaqt li tirrilaxxa l-pressjoni b'mod regolari billi taqleb il-lembut ta' separazzjoni ta' taħt fuq u tiftaħ it-tapp. Ħalli t-taħlita toqgħod sa ma jkun hemm separazzjoni kompluta taż-żewġ fażijiet (ara n-Nota 2). Imbagħad neħħi s-soluzzjoni tas-sapun b'mod kemm jista' jkun komplut u poġġieħa f'lembut tas-separazzjoni ieħor. Bl-istess mod, agħmel żewġ estrazzjonijiet oħra tal-fażi tal-ilma u l-alkoħol billi tuża 60 sa 70 ml ta' etere etiliku (4.6).

Nota 2:

Kwalunkwe emulsjoni tista' tiġi meqruda biż-żieda ta' kwantitajiet żgħar ta' etanol (4.7).

Ħallat it-tliet estratti tal-etere f'lembut ta' separazzjoni wieħed li jkun fih 50 mL ta' ilma. Kompli aħsel bl-ilma (50 ml) sakemm l-ilma tal-ħasil ma jibqax jagħti kulur roża meta tiżdiedlu qatra ta' soluzzjoni tal-fenolftaleina (4.12). Meta l-ilma tal-ħasil ikun tneħħa, iffiltra bis-sulfat tas-sodju anidru (4.4) fi flask ta' 250 mL li jkun intiżen qabel, filwaqt li taħsel il-lembut u l-filtru bi kwantitajiet żgħar ta' etere etiliku (4.6).

Ħalli s-solvent jevapora permezz tad-distillazzjoni f'evaporatur rotatorju fi 30 °C f'vakwu. Żid 5 mL ta' aċeton (4.5) u neħħi s-solvent volatili kompletament f'kurrent ħafif ta' nitroġenu. Nixxef ir-residwu fil-forn f'temperatura ta' 103 °C ± 2 °C għal kwarta. Kessaħ f'dessikaturi u iżen sal-eqreb 0,1 mg.

PARTI 2

IS-SEPARAZZJONI TAL-FRAZZJONIJIET TA' KOMPOSTI ALKOĦOLIĊI

1.   KAMP TA' APPLIKAZZJONI

Il-materja mhux sapunifikabbli ppreparata fil-Parti 1 tiġi frazzjonata f'komposti alkoħoliċi differenti, alkoħol alifatiku, steroli u dialkoħol triterpeniku (eritrodijol u uvaol).

2.   PRINĊIPJU

Il-materja mhux sapunifikabbli tista' tiġi frazzjonata bl-użu ta' kromatografija bażika ta' saff irqiq (metodu ta' referenza), żvelata u l-faxex korrispondenti migrufa u estratti. Bħala metodu ta' separazzjoni alternattiv, HPLC bl-użu ta' kolonna tal-ġell tas-siliċe u individwatur tal-UV u l-frazzjonijiet differenti miġbura. L-alkoħol alifatiku u triterpeniku kif ukoll id-dialkoħol tal-isteroli u triterpeniku jiġu iżolati flimkien.

3.   TAGĦMIR

L-apparat tal-laboratorju tas-soltu u b'mod partikolari dan li ġej:

3.1.	Apparat komplut għall-analiżi bil-kromatografija b'saff irqiq bl-użu ta' pjanċi tal-ħġieġ ta' 20 cm b'20 cm.

3.2.	Lampa tar-radjazzjoni ultravjola b'tul tal-mewġa ta' 366 nm jew 254 nm.

3.3.	Mikrosiringi, 100 μL u 500 μL.

3.4.	Lembut b'filtru forma ta' ċilindru b'septum poruż ta' G3 (b'porożità ta' 15-il μm sa 40 μm) li jkollu dijametru ta' madwar 2 ċm u jkun fond 5 ċm, li jkun adattat għall-filtrazzjoni f'vakwu b'ġonta interna tal-ħġieġ żmeriljat.

3.5.	Flask koniku b'ġonta esterna tal-ħġieġ mitħun, 50 mL li jista' jitwaħħal mal-lembut tal-filtru (3.4.).

3.6.	Tubu tat-testijiet bil-qiegħ li jidjieq u tapp tal-ħġieġ li jissiġilla, 10 mL.

3.7.	Dessikatur tal-klorur tal-kalċju.

3.8.	Sistema tal-HPLC, li tikkonsisti minn: 3.8.1. Pompa binarja. 3.8.2. Injettur manwali jew awtomatiku mgħammar b'loop tal-injezzjoni ta' 200 μL. 3.8.3. Apparat li jneħħi l-gass in-line. 3.8.4. Individwatur UV-VIS jew IR.

3.9.	Kolonna tal-HPLC (25 cm × 4 mm i.d.) b'ġell tas-siliċe 60 (daqs tal-partikuli ta' 5 μm).

3.10.

Filtru tas-siringa, 0,45 μm

3.11.

Flask koniku, 25 mL.

4.   REAĠENTI

4.1.	85 % ta' titru minimu ta' idrossidu tal-potassju.

4.2.

Madwar 2 M ta' soluzzjoni etanolika tal-idrossidu tal-potassju. Dewweb 130 g ta' idrossidu tal-potassju (4.1) permezz tat-tkessiħ f'200 ml ta' ilma distillat u mbagħad żidu b'litru etanol (4.9). Żomm is-soluzzjoni fi fliexken tal-ħġieġ skur magħluqin sewwa b'tapp u maħżuna għal mhux aktar minn jumejn.

4.3.	Etere etiliku, għall-kwalità tal-analiżi.

4.4.	Madwar 0,2 M ta' soluzzjoni etanolika tal-idrossidu tal-potassju. Dewweb 13-il g ta' idrossidu tal-potassju (4.1) f'20 ml ta' ilma distillat u żidu b'litru etanol (4.9).

4.5.	Pjanċi tal-ħġieġ 20x20 miksijin bil-ġell tas-silika, mingħajr indikatur tal-fluworexxenza, u bi ħxuna ta' 0,25 mm (dawn jinsabu għall-bejgħ lesti għall-użu).

4.6.	Aċeton għall-kwalità tal-kromatografija.

4.7.	n-Eżan għall-kwalità tal-kromatografija.

4.8.	Etere etiliku, għall-kwalità tal-kromatografija.

4.9.	Etanol ta' kwalità analitika.

4.10.

Aċitat etiliku ta' kwalità analitika.

4.11.

Soluzzjoni ta' referenza għall-kromatografija b'saff irqiq: Soluzzjoni ta' 5 % kolesterol, fitosteroli, alkoħol, u Eritrodijol f'Aċetat etiliku (4.10.).

4.12.

Soluzzjoni ta' 2,7-diklorofluworexxein, 0,2 % f'soluzzjoni etanolika. Ġibha ftit bażika billi żżid xi qtar ta' soluzzjoni alkoħolika ta' 2 M ta' soluzzjoni tal-idrossidu tal-potassju (4.2).

4.13.

Taħlita ta' 65:35 (V/V) ta' n-eżan (4.7)/etere etiliku (4.8).

4.14.

(1:1) (V/V) n-eżan (4.7)/etere etiliku (4.8) fażi mobbli ta' HPLC.

5.   METODU TA' REFERENZA: IS-SEPARAZZJONI TAL-KOMPOSTI ALKOĦOLIĊI PERMEZZ TA' PJANĊA BAŻIKA TA' KROMATOGRAFIJA FUQ SAFF IRQIQ (TLC)

Ipprepara l-pjanċi bażiċi ta' kromatografija fuq saff irqiq. Għaddas il-pjanċi tal-ġell tas-silika (4.5) madwar 4 cm fis-soluzzjoni etanolika tal-idrossidu tal-potassju ta' 0,2 M (4.4) għal 10 sekondi, imbagħad ħallihom sagħtejn jinxfu f'kabinett għad-dħaħen u fl-aħħar poġġihom f'forn f'temperatura 100 °C għal siegħa.

Neħħihom mill-forn u żommhom f'dessikatur tal-klorur tal-kalċju (3.7) sa ma jkun hemm bżonn jintużaw (il-pjanċi li jkunu għaddew minn din il-proċedura jridu jintużaw fi żmien ħmistax).

Qiegħed it-taħlita ta' eżan/etere etiliku (4.13) (Nota 3) fil-kompartiment tal-iżvilupp, f'fond ta' madwar 1 cm. Agħlaq il-kompartiment b'għatu xieraq u ħallih hekk għal mhux anqas minn nofs siegħa, f'post frisk, sabiex jiġi stabbilit l-ekwilibriju ta' bejn il-likwidu u l-fwar. Jistgħu jitpoġġew strippi ta' filtri tal-karta mgħaddsa fl-eluent fuq il-wiċċ ġewwieni tal-kamra. Dan inaqqas il-ħin tal-iżvilupp bejn wieħed u ieħor b'terz u jwassal għal elwizzjoni aktar uniformi u regolari tal-komponenti.

Nota 3:

It-taħlita tal-iżvilupp għandha tinbidel għal kull test sabiex jinkisbu kondizzjonijiet ta' elużjoni perfettament riproduċibbli. Jista' jintuża solvent alternattiv 50:50 (V/V) n-eżan/etere etiliku.

Ipprepara soluzzjoni ta' madwar 5 % ta' dik mhux sapunifikabbli ppreparata fil-Parti 1 fl-aċitat etiliku (4.10) u, bl-użu tal-mikrosiringa ta' 100 μl (3.3), poġġi 0.3 ml mis-soluzzjoni fuq strixxa dejqa u uniformi fin-naħa t'isfel (2 cm) tal-pjanċa kromatografika (4.5). B'mod parallel mal-istrixxa, qiegħed bejn 2 u 3 μL tas-soluzzjoni ta' referenza tal-materjal (4.11) sabiex il-faxex tal-isterol, tad-dialkoħol triterpen u tal-alkoħol ikunu jistgħu jiġu identifikati wara l-iżvilupp.

Qiegħed il-pjanċa fil-kompartiment tal-iżvilupp (3.1). It-temperatura ambjentali għandha tinżamm bejn 15 u 20 °C (Nota 4). Agħlaq il-kamra mal-ewwel bl-għatu u ħalli l-proċess ta' elużjoni jseħħ sa ma l-parti ta' quddiem tas-solvent tasal madwar ċentimetru mit-tarf ta' fuq tal-pjanċa. Neħħi l-pjanċa mill-kamra tal-iżvilupp u ħalli s-solvent jevapora f'kurrent ta' arja sħuna jew billi tħalli l-pjanċa għal ftit ħin taħt għata.

Nota 4:

Temperatura ogħla minn hekk tista' tgħarraq is-separazzjoni.

Sprejja l-pjanċa kemm kemm u b'mod uniformi bis-soluzzjoni ta' 2,7-diklorofluworexxein(4.12) u mbagħad ħalliha tinxef. Meta l-pjanċa tiġi osservata f'dawl ultravjola (3.2), il-faxex tal-isteroli, tad-dialkoħol tat-triterpen u tal-alkoħol ikunu jistgħu jiġu identifikati billi jiġu allinjati mat-tbajja' miksubin permezz tas-soluzzjoni ta' referenza (4.11). Immarka l-limiti tal-faxex mat-truf tal-fluworexxenza b'lapes iswed (ara l-pjanċa tat-TLC f'Figura 1).

Obrox il-ġell tas-silika minn fuq il-parti mmarkata billi tuża spatula tal-metall. Poġġi l-materjal mitħun fin li jkun tneħħa fil-lembut tal-filtru (3.4). Żid 10 mL ta' aċetat etiliku sħun (4.10), ħawdu bil-mod bl-ispatula tal-metall u ffiltrah (f'vakwu jekk ikun meħtieġ), filwaqt li tiġbor il-filtrat fil-flask koniku (3.5.) imwaħħal mal-lembut b'filtru.

Aħsel ir-residwu fil-flask tliet darbiet bl-etere etiliku (4.3) (madwar 10 mL kull darba), filwaqt li tiġbor il-filtrat fl-istess flask imwaħħal mal-lembut, evapora l-filtrat sa ma jintlaħaq volum ta' bejn 4 u 5 mL, ittrasferixxi s-soluzzjoni li jifdal għal ġot-tubu tat-testijiet ta' 10 mL li jkun intiżen minn qabel (3.6), evaporaha permezz ta' tisħin ħafif fi fluss ħafif ta' nitroġenu sa ma jinxef, erġa' oħloqha mill-ġdid billi tuża ftit qtar ta' aċeton (4.6) u evaporaha għal darb'oħra sa ma tinxef. Ir-residwu fit-tubu tat-testijiet jikkonsisti mill-isteroli u d-dialkoħol tat-triterpen jew mill-alkoħol u frazzjonijiet ta' alkoħol triterpeniku.

6.   IS-SEPARAZZJONI TAL-FRAZZJONI ALKOĦOLIKA PERMEZZ TAL-HPLC

Is-soluzzjoni mhux sapunifikabbli miksuba mill-Parti 1 tiġi maħlula fi 3 mL tal-fażi mobbli (4.14), iffiltra s-soluzzjoni b'filtru tas-siringa (3.10 u rriżerva.

Injetta 200 μL tas-soluzzjoni mhux sapunifikabbli ffiltrata fl-HPLC (3.8).

Wettaq is-separazzjoni tal-HPLC b'0,8 mL/min, armi l-ewwel 5 min. u iġbor fi flasks koniċi ta' 25 mL (3.11) bejn il-5 u 10 min. għal alkoħol alifatiku u triterpeniku u bejn 11 u 25 min għal steroli u eritrodijol u uvaol (Nota 5).

Is-separazzjoni tista' tiġi mmonitorjata b'individwatur tal-UV b'tul tal-mewġa ta' 210 nm jew individwatur tal-indiċi rifrattiv (ara l-Figura 6).

Il-frazzjonijiet jiġu evaporati sat-tnixxif u jiġu mħejjija għal analiżi kromatografika.

Nota 5:

Ikkontrolla l-pressjoni tal-pompa tal-HPLC bir-reqqa, l-eteru etiliku jista' jżid il-pressjoni, aġġusta l-fluss biex iżżomm il-pressjoni taħt kontroll.

PARTI 3

ANALIŻI KROMATOGRAFIKA TAL-GASS TAL-FRAZZJONIJIET TA' KOMPOSTI ALKOĦOLIĊI

1.   KAMP TA' APPLIKAZZJONI

Din il-parti tagħti gwida ġenerali għall-applikazzjoni tal-kromatografija b'fażi gassuża f'kolonna kapillari, sabiex tiġi ddeterminata l-kompożizzjoni kwalitattiva u kwantitattiva tal-komposti alkoħoliċi iżolati skont il-metodu speċifikat fil-Parti 2 ta' dan il-metodu.

2.   PRINĊIPJU

Il-frazzjonijiet miġbura mill-materja mhux sapunifikabbli bl-użu tat-TLC jew tal-HPLC jiġi derivatizzati f'eteri tat-trimetilsilil u analizzati bi kromatografija b'fażi gassuża f'kolonna kapillari b'injezzjoni maqsuma u individwatur tal-jonizzazzjoni tal-fjamma.

3.   APPARAT

L-apparat tas-soltu tal-laboratorju u b'mod partikulari dan li ġej:

3.1.	Tubu tat-testijiet bil-qiegħ li jidjieq u tapp tal-ħġieġ li jissiġilla, 10 mL.

3.2.

Kromatografu b'fażi gassuża li jkun jista' jintuża ma' kolonna kapillari, li jkollu sistema ta' injezzjoni maqsuma u li jkun magħmul minn: 3.2.1. Kompartiment termostatiku għall-kolonni li jifilħu jżommu t-temperatura mixtieqa bi preċiżjoni ta' ± 1 °C; 3.2.2. Unità ta' injezzjoni b'temperatura li tista' tiġi adattata li jkollha element ta' vaporizzazzjoni tal-ħġieġ persilanizzat u sistema maqsuma; 3.2.3. Individwatur tal-jonizzazzjoni bi fjamma (FID); 3.2.4. Sistema għall-ksib tad-data xierqa għall-użu mal-individwatur FID (3.10.3.), b'kapaċità ta' integrazzjoni manwali.

3.3.	Kolonna kapillari tas-silika mdewba twila bejn 20 u 30 m, b'dijametru intern ta' bejn 0,25 mm u 0,32 mm, miksija b'5 % Difenil u 95 % Dimetilpolisilossan (il-fażi stazzjonarja ta' SE-52 jew SE-54 jew l-ekwivalenti), hekk li jkollha ħxuna uniformi ta' bejn 0,10 μm u 0.30 μm.

3.4.	Mikrosiringa, b'kapaċità ta' 10 μL, għall-kromatografija b'fażi gassuża, b'labra mwaħħla adattata għall-injezzjoni maqsuma.

4.   REAĠENTI

4.1.	Piridin anidruż, għall-kwalità tal-kromatografija.

4.2.	Disilażan tal-eżametil ta' kwalità analitika.

4.3.	Trimetilklorosilan ta' kwalità analitika.

4.4.	Mudelli tas-soluzzjonijiet tal-eteri tat-trimetilsilil tal-isteroli. Dawn għandhom jitħejjew fil-ħin tal-użu mill-isteroli u l-eritrodiol miksubin miż-żjut li jkun fihom dawn is-sustanzi.

4.5.	Soluzzjonijiet standard ta' eteri tat-trimetilsilil ta' alkoħol alifatiku minn C20 sa C28. Dawn jistgħu jiġu mħejjija minn taħlitiet ta' alkoħol pur fil-ħin li jkunu meħtieġa għall-użu.

4.6.	Gass trasportatur: l-idroġenu jew l-elju, pur għall-kromatografija tal-gass.

4.7.	Gassijiet awżiljarji: l-idroġenu, l-elju, in-nitroġenu u l-arja, li jkunu puri għall-kromatografija tal-gass.

4.8.	Reaġent ta' sililazzjoni, li jikkonsisti f'taħlita ta' 9:3:1 (V/V/V) ta' piridina/disilażan tal-eżametil/trimetilklorosilan.

4.9.	n-Eżan, għall-kwalità tal-kromatografija.

5.   TĦEJJIJA TAL-ETERI TAT-TRIMETILSILIL

Żid ir-reaġent ta' sililazzjoni (4.8) (Nota 6), fil-proporzjon ta' 50 μl għal kull milligramma ta' kompost alkoħoliku, fit-tubu tat-testijiet (3.1) li jkun fih il-frazzjoni ta' komposti alkoħoliċi, filwaqt li tevita kwalunkwe assorbiment ta' umdità (Nota 7).

Nota 6:

Wieħed jista' jsib għall-bejgħ soluzzjonijiet lesti għall-użu. Wieħed jista' jsib ukoll reaġenti ta' sililazzjoni oħrajn bħal, pereżempju, il-bistrimetilsilil trifluwor aċetammid + 1 % trimetilklorosilan, li jrid jiġi dilwit bl-istess volum ta' piridina anidruża. Minflok il-piridina jista' jintuża l-istess ammont ta' aċetonitril.

Nota 7:

L-opalexxenza ħafifa li tista' tirriżulta hija normali u ma toħloq l-ebda anomalija. Il-formazzjoni ta' bjuda jew l-apparenza ta' kulur roża jindikaw il-preżenza ta' umdità jew deterjorament tar-reaġent. Jekk dan iseħħ, it-test irid jerġa' jsir (jekk jintuża l-eżametildisilażan jew it-trimetilklorosilan biss).

Agħlaq it-tubu tat-testijiet (3.1), ħawdu bil-galbu (mingħajr ma taqilbu rasu 'l isfel) sakemm il-komponenti jinħallu kompletament. Ħallih joqgħod għal mill-inqas kwarta f'temperatura ambjentali u mbagħad ħawdu b'azzjoni ċentrifuga għal ftit minuti. Is-soluzzjoni ċara tkun lesta biex tiġi analizzata bil-kromatografija b'fażi gassuża.

6.   ANALIŻI TAL-KROMATOGRAFIJA B'FAŻI GASSUŻA

6.1.   L-operazzjonijiet preliminari, il-kundizzjonament tal-kolonna kapillari.

Waħħal il-kolonna (3.3) fil-kromatografu b'fażi gassuża billi tqabbad it-tarf ta' ġewwa mal-apparat għall-injezzjoni maqsuma u t-tarf ta' barra mal-individwatur.

Wettaq kontrolli ġenerali fuq il-kromatografu b'fażi gassuża (nixxijiet miċ-ċirkwiti tal-gass, l-effiċjenza tal-individwatur, l-effiċjenza tas-sistema ta' separazzjoni u s-sistema ta' reġistrazzjoni, eċċ.).

Jekk il-kolonna tkun qed tintuża għall-ewwel darba, huwa rrakkomandat li għandha tiġi soġġetta għal kundizzjonament: jingħadda fluss ħafif ta' gass mill-kolonna nnifisha, imbagħad jitqabbad il-kromatografu b'fażi gassuża u jibda t-tisħin b'mod gradwali sa ma tintlaħaq temperatura ta' mill-anqas 20 °C aktar mit-temperatura ta' tħaddim (Nota 8). Żomm din it-temperatura għal mill-inqas sagħtejn, imbagħad qiegħed l-apparat kollu fil-modalità tat-tħaddim (l-aġġustament tal-kurrenti tal-gass u tas-sistema ta' separazzjoni, it-tqabbid tal-fjamma, il-konnessjoni mas-sistema tal-kompjuter, l-aġġustament tat-temperatura tal-kolonna, tal-individwatur u tal-apparat għall-injezzjoni, eċċ.) u mbagħad irreġistra s-sinjal b'sensittività li tkun mill-inqas darbtejn iktar minn dik maħsuba għall-analiżi. Ir-rotta tal-linja ta' referenza trid tkun lineari, mingħajr ebda quċċata, u m'għandhiex turi devjazzjonijiet. Drift negattiva f'linja dritta tindika nixxija mill-konnessjonijiet tal-kolonna: drift pożittiv tindika kundizzjonament inadegwat tal-kolonna.

Nota 8:

It-temperatura tal-kundizzjonament dejjem trid tkun mill-inqas 20 °C inqas mit-temperatura massima speċifikata għall-fażi stazzjonarja użata.

6.2.   Kundizzjonijiet ta' tħaddim

Ottimizza l-programm tat-temperatura u l-fluss tal-gass trasportatur sabiex ikunu jistgħu jinkisbu l-kromatogrammi simili għall-Figuri minn 3 sa 6.

Il-parametri li ġejjin ġew ittestjati u nsabu utli:

6.2.1.   Alkoħol alfatiku

Programm tal-Forn	180 °C (8 min.) → 260 °C (at 5 °C/min) → 260 °C (15 min)
Temperatura tal-Injettur	280 °C
Temperatura tal-Individwatur	290 °C
Veloċità Lineari tal-Gass trasportatur	Elju (bejn 20 u 30 cm/s); Idroġenu – (bejn 30 u 50 cm/s)
Proporzjon tal-Qasma	bejn 1:50 u 1:100
Volum Injettat	bejn 0,5 u 1 μl tas-soluzzjoni ta' TMSE

6.2.2.   Steroli u dialkoħol triterpeniku

Programm tal-Forn	260 ± 5 °C Isotermiku
Temperatura tal-Injettur	280 – 300 °C
Temperatura tal-Individwatur	280 – 300 °C
Veloċità Lineari tal-Gass trasportatur	Elju (bejn 20 u 30 cm/s); Idroġenu (bejn 30 u 50 cm/s)
Proporzjon tal-firda	bejn 1:50 u 1:100
Volum Injettat	0,5 sa 1 μl tas-soluzzjoni TMSE

Dawn il-kundizzjonijiet jistgħu jinbidlu skont il-karatteristiċi tal-kolonna u tal-kromatografu b'fażi gassuża sabiex jinkisbu kromatogrammi li jilħqu r-rekwiżiti li ġejjin:

—	Il-ħin ta' żamma tal-alkoħol C26 għandha tkun 18 ± 5 minuti.

—	Il-quċċata tal-alkoħol C22 għandha tkun 80 ± 20 % tal-valur tal-iskala sħiħa għaż-żejt taż-żebbuġa u 40 ± 20 % tal-valur tal-iskala sħiħa għaż-żejt mir-residwi taż-żebbuġ.

—	Il-ħin ta' żamma għall-quċċata tal-β-sitosterol għandu jkun ta' 20 ± 5 min.

—	Il-quċċata tal-kampesterol għandha tkun: għaż-żejt taż-żebbuġa (b'kontenut medju ta' 3 %) 20 ± 5 % tal-iskala sħiħa.

—

L-isteroli kollha preżenti jridu jiġu separati. Barra milli jkunu mifrudin, il-qċaċet għandhom jkunu wkoll maqtugħin għal kollox, i.e. il-linja tal-quċċata għandha tmur lura lejn il-linja bażi qabel ma titlaq għall-quċċata li jmiss. Madankollu, jista' jkun hemm riżoluzzjoni mhux sħiħa, dejjem jekk il-quċċata f'RRT 1,02 (is-sitostanol) tkun tista' tiġi kkwantifikata permezz tal-linja perpendikulari.

6.3.   Il-proċedura analitika

Ħu 1 μl ta' eżan billi tuża l-mikrosiringa ta' 10 μl (3.4), iġbed għal ġo fiha 0,5 μl ta' arja u mbagħad 0,5 μl sa 1 μl tas-soluzzjoni tal-kampjun. Għolli l-planġer tas-siringa iktar sabiex il-labra tiżvojta. Imbotta l-labra fil-membrejn tal-apparat għall-injezzjoni u wara sekonda jew tnejn injetta malajr, imbagħad neħħi l-labra bil-mod wara madwar ħames sekondi. Jista' jintuża wkoll apparat awtomatiku għall-injezzjoni.

Irreġistra sakemm it-TMSE tal-komposti alkoħoliċi korrispondenti preżenti jiġu kompletament elwiti. Il-linja bażi trid tkompli tissodisfa r-rekwiżiti tal-kundizzjonijiet ta' tħaddim korrispondenti (6.2.1 jew 6.2.2).

6.4.   L-identifikazzjoni tal-qċaċet

Identifika l-qċaċet individwali fuq il-bażi tal-ħinijiet ta' żamma u billi tqabbel mat-taħlita tal-alkoħol alifatiku u triterpeniku u t-TMSE tad-dialkoħol tal-isterol u t-triperpen, anlizzati bl-istess kundizzjonijiet. Kromatogramma tal-frazzjoni ta' alkoħol alifatiku u triterpeniku tintwera f'Figura 3 u l-kromatogrammi korrispondenti għall-isteroli u d-dialkoħol triterpeniku jintwerew f'Figura 2.

L-alkoħol alifatiku jiġi elwit fl-ordni li ġejja: C20-ol (I.S.), C22-ol, C23-ol, C24-ol, C25-ol, C26-ol, C27-ol u C28-ol.

L-isteroli u d-d-dialkoħol tat-triterpen huma elwiti fl-ordni li ġejja: kolesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-metilin-kolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, eritrodiol u uvaol.

6.5.   Evalwazzjoni kwantitattiva

L-erji tal-quċċata ta' 1-ejkosanol u tal-alkoħol alifatiku C22, C24, C26, C28 jiġu kkalkulati minn sistema tal-akkwiżizzjoni tad-data. Il-fattur ta' rispons għall-α-ejkosanol għandu jitqies daqs 1.

Ikkalkula l-erjas tal-α-kolestanol u l-qċaċet tal-isteroli u tad-dialkoħol tat-triterpen billi tuża s-sistema tal-kompjuter. Tagħtix każ tal-qċaċet għal kwalunkwe sustanza komposta li mhix inkluża fost dawk elenkati fit-Tabella 1 (l-ergosterol ma jridx jiġi kkalkulat). Il-fattur tat-tweġiba għall-α-kolestanol għandu jitqies li huwa ta' 1.

Ikkalkula l-konċentrazzjoni ta' kull kompost alkoħoliku individwali, f'mg/kg ta' materjal xaħmi, kif ġej:

fejn:

Ax	=	L-erja tal-quċċata għall-kompost alkoħoliku x, f'komputazzjonijiet tas-sistema tal-kompjuter.
As	=	L-erja tal-quċċata tal-1-ejkosanol/α-kolestanol f'komputazzjonijiet tas-sistema tal-kompjuter.
ms	=	Il-massa ta' 1-ejkosanol/α-kolestanol miżjud, f'milligrammi;
m	=	Il-massa tal-kampjun użat għad-determinazzjoni, fi grammi.

7.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

Irrapporta l-konċentrazzjonijiet tal-alkoħol triterpeniku u alifatiku individwali individwali f'mg/kg ta' materjal xaħmi u t-total tagħhom bħala ‘kontenut totali ta' alkoħol alifatiku’. Il-kontenut totali huwa t-total ta' C22, C24, C26 u C28.

Il-kompożizzjoni ta' kull wieħed mill-komposti alkoħoliċi individwali għandu jiġi espress sa punt deċimali wieħed.

Il-konċentrazzjoni totali ta' steroli għandha tiġi espressa mingħajr l-ebda punt deċimali.

Ikkalkula l-perċentwal ta' kull sterol individwali mill-proporzjon tal-erja tal-quċċata rilevanti mal-arja totali tal-quċċata għall-isteroli:

fejn:

Ax	=	Erja tal-quċċata għal sterol x.
ΣA	=	L-erja totali tal-quċċata għall-isteroli.

β-sitosterol evidenti: Δ5,23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5,24-stigmastadienol.

Ikkalkula l-perċentwal ta' eritrodijol u uvaol:

fejn:

AEr	=	L-erja ta' Eritrodijol f'komputazzjonijiet tas-sistema tal-kompjuter.
AUv	=	L-erja ta' Uvaol f'komputazzjonijiet tas-sistema tal-kompjuter.
Σ ΑΤ	=	L-erja totali tal-isteroli + l-eritrodijol + l-uvaol f'komputazzjonijiet tas-sistema tal-kompjuter.

Barra mill-kalkolu tal-perċentwal relattiv ta' steroli u uniċi u diajalkoħol triterpeniku u l-konċentrazzjoni totali ta' steroli, trid tiġi kkalkulata l-konċentrazzjoni ta' eritrodijol u ta' uvaol u t-total tagħhom, f'mg/kg ta' materjal xaħmi, skont l-espressjonijiet li ġejjin:

fejn:

AEr	=	Erja tal-quċċata tal-Eritrodiol, f'komputazzjonijiet ta' sistema kompjuterizzata.
AUv	=	Erja ta' Uvaol f'komputazzjonijiet tas-sistema kompjuterizzata.
As	=	Erja tal-quċċata ta' α-kolestanol, f'komputazzjonijiet tas-sistema kompjuterizzata.
ms	=	Massa ta' α-kolestanol miżjud, f'milligrammi.
m	=	Massa tal-kampjun użat għad-determinazzjoni, fi grammi.

Appendiċi

1 Idrokarburi 2 α-Tokoferol 3 Prenoli 4 Alkoħol Triterpeniku 5 Alkoħol Alfatiku 6 Steroli tal-Metil 7 Steroli 8 Dialkoħol Triterpeniku

Figura 1 — TLC tal-frazzjoni mhux sapunifikabbli miż-żejt mir-residwi taż-żebbuġ elwit darbtejn bl-eżan: etere dieteiliku (65:35), żviluppat b'SO4H2 (50 %) u msaħħan. Il-faxex li għandhom jintremew huma dawk fir-rettangolu, 1 huma l-faxex għall-alkoħol alifatiku u 2 għall-isteroli u għad-dialkoħol triterpeniku.

Tabella I — Il-ħinijiet relattivi ta' żamma għall-isteroli

Quċċata	Identifikazzjoni		Il-ħin relattiv ta' żamma
			Il-kolonna SE 54	Il-kolonna SE 52
1	Kolesterol	Δ-5-kolesten-3ß-ol	0,67	0,63
2	Kolestanol	5α-kolestan-3ß-ol	0,68	0,64
3	Brassikasterol	[24S]-24-metil-Δ-5,22-kolestadijen-3β-ol	0,73	0,71
*	Ergosterol	[24S]-24-metil-Δ-5,7,22 kolestatrijen-3β-ol	0,78	0,76
4	24-metilen -kolesterol	24-metilen-Δ-5,24-kolestadijen-3ß-o1	0,82	0,80
5	Kampesterol	(24R)-24-metil-Δ-5-kolesten-3ß-ol	0,83	0,81
6	Kampestanol	(24R)-24-metil-kolestan-3ß-ol	0,85	0,82
7	Stigmasterol	(24S)-24-etil-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol	0,88	0,87
8	Δ-7-kampesterol	(24R)-24-metil-Δ-7-kolesten-3ß-ol	0,93	0,92
9	Δ-5,23-kampesterol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,23-kolestadien-3ß-ol	0,95	0,95
10	Klerosterol	(24S)-24-etil-Δ-5,25-kolestadien-3ß-ol	0,96	0,96
11	ß-sitosterol	(24R)-24-etil-Δ-5-kolesten-3ß-ol	1,00	1,00
12	Sitostanol	24-etil-kolestan-3ß-ol	1,02	1,02
13	Δ-5-kampesterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-kolesten-3ß-ol	1,03	1,03
14	Δ-5,24-stigmastadienol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,24-kolestadien-3ß-ol	1,08	1,08
15	Δ-7-stigmastenol	(24R,S)-24-etil-Δ-7-kolesten-3ß-ol	1,12	1,12
16	Δ-7-avenasterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-7-kolesten-3ß-ol	1,16	1,16
17	Eritrodiol	5α-olean-12-en-3β,28-diol	1,41	1,41
18	Uvaol	Δ12-ursen-3β,28-diol	1,52	1,52

Figura 2 — Profil kromatografiku GC-FID tal-isterol u tad-dialkoħol triterpeniku miż-żejt taż-żebbuġa raffinat. (1) Kolesterol, (2) α-kolestanol (I.S.), (3) 24-metilenkolesterol, (4) kampesterol, (5) kampestanol, (6) stigmasterol, (7) Δ5,23-stigmastadienol, (8) klerosterol, (9) β-sitosterol, (10) sitostanol, (11) Δ5-avenasterol, (12) Δ5,24-stigmastadienol, (13) Δ7-stigmastenol, (14) Δ7-avenasterol, (15) eritrodiol, (16) uvaol.

Figura 3 — Profil kromatografiku GC-FID tal-isteroli u tad-dialkoħol triterpeniku miż-żejt taż-żebbuġa lampante. (1) Kolesterol, (2) α-kolestanol, (3) brassikasterol, (4) 24-metilenkolesterol, (5) kampesterol, (6) kampestanol, (7) stigmasterol, (8) Δ7-kampesterol, (9) Δ5,23-stigmastadienol, (10) klerosterol, (11) β-sitosterol, (12) sitostanol, (13) Δ5-avenasterol, (14) Δ5,24-stigmastadienol, (15) Δ7-stigmastenol, (16) Δ7-avenasterol, (17) eritrodiol, (18) uvaol.

Figura 4 — Profil kromatografiku GC-FID ta' alkoħol alifatiku u alkoħol triterpeniku taż-żejt taż-żebbuġa. (I.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) alkoħol triterpeniku.

Figura 5 — Profil kromatografiku GC-FID ta' alkoħol alifatiku u alkoħol triterpeniku ta' żejt taż-żebbuġa raffinat u żejt taż-żebbuġa tat-tieni ċentrifugazzjoni. (I.S.) C20-ol, (1) C22-ol, (2) C24-ol, (3) C26-ol, (4) C28-ol, (5) alkoħol triterpeniku.

Figura 6 — Kromatogramma tal-HPLC ta' żejt taż-żebbuġa mhux sapunifikabbli separat permezz tal-HPLC bl-użu ta' individwatur tal-UV. (1) Alkoħol alifatiku u triperpeniku; (2) Steroli u dialkoħol triterpeniku.