„ANHÄNGE

INHALT

Anhang I	Merkmale von Olivenölen
Anhang Ia	Probenahme bei Olivenöl oder Oliventresteröl, das in unmittelbaren Verpackungseinheiten geliefert wird
Anhang Ib	Ablaufdiagramm für die Prüfung der Konformität einer Olivenölprobe mit der deklarierten Kategorie
Anhang II	Bestimmung der freien Fettsäuren, Kaltverfahren
Anhang III	Bestimmung der Peroxidzahl
Anhang IV	Kapillargaschromatografische Bestimmung des Wachsgehalts
Anhang VII	Bestimmung des prozentualen Gehalts an 2-Glycerinmonopalmitat
Anhang IX	UV-spektrophotometrische Analyse
Anhang X	Bestimmung des Gehalts an Fettsäuremethylestern durch Gaschromatografie
Anhang XI	Bestimmung des Gehalts an flüchtigen halogenierten Lösungsmitteln in Olivenöl
Anhang XII	Verfahren des internationalen Olivenölrates für die organoleptische Prüfung von nativen Olivenölen
Anhang XV	Ölgehalt der Oliventrester
Anhang XVI	Bestimmung der Iodzahl
Anhang XVII	Methode zur Bestimmung von Stigmastadienen in pflanzlichen Ölen
Anhang XVIII	Bestimmung der Differenz zwischen dem tatsächlichen und dem theoretischen Gehalt an Triglyceriden mit ECN 42
Anhang XIX	Bestimmung der Zusammensetzung von und des Gehalts an Sterinen und des Gehalts an alkoholischen Verbindungen durch Kapillar-Gaschromatografie
Anhang XX	Verfahren für die Bestimmung des Gehalts an Wachsen, Fettsäuremethylestern und Fettsäureethylestern durch Kapillar-Gaschromatografie
Anhang XXI	Ergebnisse der durchgeführten Konformitätskontrollen von Olivenölen gemäß Artikel 8 Absatz 2

„ANHANG I

MERKMALE VON OLIVENÖLEN

Qualitätsmerkmale

Fettsäureethylester (mg/kg)		≤ 35	—	—	—	—	—	—	—
Sensorische Prüfung	Fruchtigkeitsmedian (Mf)	Mf > 0,0	Mf > 0,0	—	—	—	—	—	—
	Fehlermedian (Md) (*)	Md = 0,0	Md ≤ 3,5	Md > 3,5 (1)
Delta-K		≤ 0,01	≤ 0,01	—	≤ 0,16	≤ 0,15	—	≤ 0,20	≤ 0,18
K268 oder K270		≤ 0,22	≤ 0,25	—	≤ 1,25	≤ 1,15	—	≤ 2,00	≤ 1,70
K232		≤ 2,50	≤ 2,60	—	—	—	—	—	—
Peroxidzahl (meq O2/kg)		≤ 20,0	≤ 20,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0	—	≤ 5,0	≤ 15,0
Säuregehalt (%) (*)		≤ 0,80	≤ 2,0	> 2,0	≤ 0,30	≤ 1,00	—	≤ 0,30	≤ 1,00
Kategorie		1. Natives Olivenöl extra	2. Natives Olivenöl	3. Lampantöl	4. Raffiniertes Olivenöl	5. Olivenöl — bestehend aus raffinierten Olivenölen und nativen Olivenölen	6. Rohes Oliventresteröl	7. Raffiniertes Oliventresteröl	8. Oliventresteröl

Reinheitsmerkmale

2- Glycerinmonopalmitat (%)

≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure ≤ 14,00 %

≤ 1,0 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure > 14,00 %

≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure ≤ 14,00 %

≤ 1,0 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure > 14,00 %

≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure ≤ 14,00 %

≤ 1,1 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure > 14,00 %

≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure ≤ 14,00 %

≤ 1,1 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure > 14,00 %

≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure ≤ 14,00 %

≤ 1,0 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure > 14,00 %

≤ 1,4

≤ 1,4

≤ 1,2

ECN42-Differenz zwischen HPLC-Messwert und theoretischer Berechnung

≤ |0,20|

≤ |0,20|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,30|

≤ |0,60|

≤ |0,50|

≤ |0,50|

Stigmastadiene (mg/kg) (3)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,50

—

—

—

—

—

Summe transisomere Linol- und Linolensäure (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,10

≤ 0,35

≤ 0,35

Summe transisomere Ölsäure (%)

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,10

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,40

Zusammensetzung der Fettsäuren (2)

Lignocerinsäure (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

Behensäure (%)

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,30

≤ 0,30

Eicosensäure (%)

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

≤ 0,50

Arachninsäure (%)

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

≤ 0,60

Linolensäure (%)

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

≤ 1,00

Myristinsäure (%)

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

≤ 0,03

Kategorie

1. Natives Olivenöl extra

2. Natives Olivenöl

3. Lampantöl

4. Raffiniertes Olivenöl

5. Olivenöl — bestehend aus raffinierten Olivenölen und nativen Olivenölen

6. Rohes Oliventresteröl

7. Raffiniertes Oliventresteröl

8. Oliventresteröl

Wachse (mg/kg) (**)		C42 + C44 + C46 ≤ 150	C42 + C44 + C46 ≤ 150	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 300 (6)	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 ≤ 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350 (7)	C40 + C42 + C44 + C46 > 350	C40 + C42 + C44 + C46 > 350
Erytrodiol und Uvaol (%) (**)		≤ 4,5	≤ 4,5	≤ 4,5 (6)	≤ 4,5	≤ 4,5	> 4,5 (7)	> 4,5	> 4,5
Sterine insges. (mg/kg)		≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 1 000	≥ 2 500	≥ 1 800	≥ 1 600
Zusammensetzung der Sterine	Delta-7-Stigmasterol (4) (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
	App. β-Sitosterol (5) (%)	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0	≥ 93,0
	Stigmasterol (%)	< Camp.	< Camp.	—	< Camp.	< Camp.	—	< Camp.	< Camp.
	Campesterol (4) (%)	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0	≤ 4,0
	Brassicasterol (%)	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,1	≤ 0,2	≤ 0,2	≤ 0,2
	Cholesterol (%)	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5	≤ 0,5
Kategorie		1. Natives Olivenöl extra	2. Natives Olivenöl	3. Lampantöl	4. Raffiniertes Olivenöl	5. Olivenöl — bestehend aus raffinierten Olivenölen und nativen Olivenölen	6. Rohes Oliventresteröl	7. Raffiniertes Oliventresteröl	8. Oliventresteröl

Anmerkungen:

a)	Die Analyseergebnisse müssen bis auf die gleiche Anzahl Dezimalstellen angegeben werden wie die für jedes Merkmal vorgesehenen Werte. Ist die nächstfolgende Ziffer größer als 4, so ist die angegebene letzte Stelle aufzurunden.

b)	Auch wenn nur ein einziges Merkmal nicht mit dem vorgesehenen Grenzwert übereinstimmt, muss das Öl einer anderen Kategorie zugeordnet werden oder als nicht konform im Sinne der vorliegenden Verordnung erklärt werden.

c)	Bei Lampantöl können beide mit einem Sternchen (*) versehenen Qualitätsmerkmale gleichzeitig von den für diese Kategorie festgelegten Grenzwerten abweichen.

d)

Die mit zwei Sternchen (**) gekennzeichneten Ölqualitätsmerkmale bedeuten im Fall roher Oliventresteröle, dass von den beiden betreffenden Grenzwerten gleichzeitig abgewichen werden kann. Bei Oliventresterölen und raffinierten Oliventresterölen kann von einem der betreffenden Grenzwerte abgewichen werden.

Anlage

Schematisierte Entscheidungsabläufe

Entscheidungsablauf Campesterol für native Olivenöle und native Olivenöle extra:

Die übrigen Parameter müssen die in dieser Verordnung festgelegten Grenzwerte einhalten.

Entscheidungsablauf Delta-7-Stigmasterol für:

—	Native Olivenöle extra und native Olivenöle

Die übrigen Parameter müssen die in dieser Verordnung festgelegten Grenzwerte einhalten.

—	Oliventresteröle (roh und raffiniert)

Die übrigen Parameter müssen die in dieser Verordnung festgelegten Grenzwerte einhalten.

„ANHANG Ib

ABLAUFDIAGRAMM FÜR DIE PRÜFUNG DER KONFORMITÄT EINER OLIVENÖLPROBE MIT DER DEKLARIERTEN KATEGORIE

Allgemeines Schema

Schema 1 — Natives Olivenöl extra — Qualitätskriterien

Schema 2 — Natives Olivenöl — Qualitätskriterien

Schema 3 — Natives Olivenöl extra und natives Olivenöl — Reinheitskriterien

Schema 4 — Lampantöl — Reinheitskriterien

Schema 5 — Raffiniertes Olivenöl — Qualitätskriterien

Schema 6 — Olivenöl (bestehend aus raffinierten Olivenölen und nativen Olivenölen) — Qualitätskriterien

Schema 7 — Raffiniertes Olivenöl und Olivenöl bestehend aus raffinierten Olivenölen und nativen Olivenölen — Reinheitskriterien

Schema 8 — Rohes Oliventresteröl — Reinheitskriterien

Schema 9 — Raffiniertes Oliventresteröl — Qualitätskriterien

Schema 10 — Oliventresteröl — Qualitätskriterien

Schema 11 — Raffiniertes Oliventresteröl und Oliventresteröl — Reinheitskriterien

„ANHANG XIX

BESTIMMUNG DER ZUSAMMENSETZUNG VON UND DES GEHALTS AN STERINEN UND DES GEHALTS AN ALKOHOLISCHEN VERBINDUNGEN DURCH KAPILLAR-GASCHROMATOGRAFIE

1.   GEGENSTAND

Diese Methode umfasst ein Verfahren zur Bestimmung des Gehalts jeder alkoholischen Verbindung sowie von deren Gesamtgehalt in Olivenölen und Oliventresterölen sowie in Mischungen dieser beiden Öle.

Die alkoholischen Verbindungen in Olivenölen und Oliventresterölen umfassen aliphatische Alkohole, Sterine und Triterpen-Dialkohole.

2.   PRINZIP

Die Öle werden mit α-Cholestanol und 1-Eicosanol als internen Standards versetzt, mit ethanolischer Kaliumhydroxidlösung verseift und das Unverseifbare mit Ethylether extrahiert.

Die verschiedenen Fraktionen der alkoholischen Verbindungen werden von dem Unverseifbaren entweder mittels Dünnschichtchromatografie auf einer basischen Kieselgelplatte (Referenzverfahren) oder durch HPLC mittels Kieselgelsäule abgetrennt. Die über die Kieselgeltrennung isolierte Fraktion wird in Trimethylsilylether überführt und anschließend mithilfe der Kapillar-Gaschromatografie untersucht.

TEIL 1

HERSTELLUNG DES UNVERSEIFBAREN

1.   GEGENSTAND

In diesem Teil wird die Herstellung und Extraktion des Unverseifbaren beschrieben. Dieser Schritt umfasst die Herstellung und Extraktion des Unverseifbaren aus Olivenölen und Oliventresterölen.

2.   PRINZIP

Eine Testmenge wird durch Kochen unter Rückfluss mit einer ethanolischen Kaliumhydroxidlösung verseift. Das Unverseifbare wird mittels Diethylether extrahiert.

3.   GERÄTE

Übliche Laboreinrichtung und insbesondere nachstehende Geräte:

3.1.	Rundkolben, mit Rückflusskühler und Schliffstopfen, 250 ml.

3.2.	Scheidetrichter, 500 ml.

3.3.	Kolben, 250 ml.

3.4.	Mikroliterspritzen, 100 μl und 500 μl.

3.5.	Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15-40 μm), etwa 2 cm Durchmesser, 5 cm Höhe, geeignet für die Vakuumfiltration mit Normschliff (Kern).

3.6.	Erlenmeyerkolben mit Normschliff (Hülse), 50 ml, für Glasfiltertiegel (3.5).

3.7.	l-Röhrchen mit konischem Boden und dicht schließendem Glasstopfen, 10 ml.

3.8.	Calciumdichlorid-Exsikkator.

4.   REAGENZIEN

4.1.	Kaliumhydroxid (Titer mindestens 85 %).

4.2.	Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung, etwa 2 M. 130 g Kaliumhydroxid (4.1) unter Kühlen in 200 ml destilliertem Wasser lösen und mit Ethanol (4.7) auf einen Liter auffüllen. Die Lösung ist in gut verschlossenen Braunglasflaschen maximal zwei Tage haltbar.

4.3.	Ethylether, analysenrein.

4.4.	Wasserfreies Natriumsulfat, analysenrein.

4.5.	Aceton für die Chromatografie.

4.6.	Ethylether für die Chromatografie.

4.7.	Ethanol, analyserein.

4.8.	Ethylacetat, analyserein.

4.9.	Interner Standard, α-Cholestanol, Reinheit mehr als 99 % (Reinheit mit GC-Analyse überprüfen).

4.10.

α-Cholestanol-Lösung, interner Standard, 0,2 %ige Lösung (m/V) in Ethylacetat (4.8).

4.11.

Phenolphthalein-Lösung, 10 g/l in Ethanol (4.7).

4.12.

0,1 %ige Lösung (m/V) von 1-Eicosanol in Ethylacetat (interner Standard).

5.   VERFAHREN

Mit einer 500-μl-Mikroliterspritze (3.4) so viel der α-Cholestanol-Lösung (interner Standard) (4.10) und so viel 1-Eicosanol (4.12) in einen 250-ml-Kolben (3.1) geben, dass die Menge an Cholestanol und Eicosanol etwa 10 % des Sterin- und Alkoholgehalts der Probe entspricht. So werden z. B. für 5 g Olivenöl 500 μl der α-Cholestanol-Lösung (4.10) und 250 μl der 1-Eicosanol-Lösung (4.12) benötigt. Für Oliventresteröle werden 1 500 μl sowohl der α-Cholestanol-Lösung (4.10) als auch der 1-Eicosanol-Lösung (4.12) hinzugefügt. Im leichten Stickstoffstrom im warmen Wasserbad bis zur Trocknung abdampfen. Nach dem Abkühlen des Kolbens in den gleichen Kolben 5,00 ± 0,01 g der trockenen und filtrierten Probe einwiegen.

Anmerkung 1:

Bei tierischen oder pflanzlichen Ölen und Fetten, die größere Mengen an Cholesterol enthalten, kann ein Peak mit derselben Retentionszeit wie Cholestanol auftreten. In diesem Fall ist die Sterinfraktion einmal mit und einmal ohne internen Standard zu analysieren.

Die Probe bei aufgesetztem Rückflusskühler mit 50 ml 2-M-ethanolischer Kaliumhydroxidlösung (4.2) und Bims versetzen, erhitzen und unter schwachem Sieden verseifen (wobei sich die Lösung klärt). Die Probe weitere 20 Minuten am Sieden halten und dann durch den Rückflusskühler mit 50 ml destilliertem Wasser versetzen, den Rückflusskühler entfernen und den Kolben auf etwa 30°C abkühlen.

Den Kolbeninhalt quantitativ in einen 500-ml-Scheidetrichter (3.2) überführen, wobei mehrfach mit destilliertem Wasser (50 ml) nachgespült wird. Die Probe mit etwa 80 ml Ethylether (4.6) versetzen, etwa 60 Sekunden kräftig schütteln und den Druck durch Umdrehen des Scheidetrichters und Öffnen des Sperrhahns periodisch entlassen. Stehen lassen, bis die beiden Phasen vollständig getrennt sind (Anmerkung 2). Anschließend die Seifenlösung so vollständig wie möglich in einen anderen Scheidetrichter ablassen und dann die Wasser-Alkohol-Phase noch zweimal nach dem gleichen Verfahren mit 60-70 ml Ethylether (4.6) extrahieren.

Anmerkung 2:

Etwaige Emulsionen können durch Zusatz kleiner Mengen Ethanol (4.7) zerstört werden.

Die drei Etherauszüge in einem Scheidetrichter mit 50 ml Wasser vereinigen. Weiter mit Wasser (50 ml) waschen, bis sich das Waschwasser bei Zusatz eines Tropfens Phenolphthalein-Lösung (4.11) nicht mehr rosa färbt. Nach Ablassen des Waschwassers über wasserfreiem Natriumsulfat (4.4) in einen zuvor gewogenen 250-ml-Kolben filtrieren. Scheidetrichter und Filter mit kleinen Mengen Ethylether (4.6) nachspülen.

Das Lösungsmittel durch Destillieren in einem Rotationsverdampfer bei 30 °C im Vakuum eindampfen. 5 ml Aceton (4.5) hinzugeben und das flüchtige Lösungsmittel in einem leichten Stickstoffstrom vollständig entfernen. Den Rückstand bei 103° C ± 2 °C im Trockenschrank 15 Minuten lang trocknen. Im Exsikkator abkühlen lassen und auf 0,1 mg genau wiegen.

TEIL 2

TRENNUNG DER FRAKTIONEN DER ALKOHOLISCHEN VERBINDUNGEN

1.   GEGENSTAND

Das unter Teil 1 hergestellte Unverseifbare wird in die verschiedenen alkoholischen Verbindungen, nämlich aliphatische Alkohole, Sterine und Triterpen-Dialkohole (Erythrodiol und Uvaol), fraktioniert.

2.   PRINZIP

Das Unverseifbare kann mittels basischer Dünnschichtchromatografie (Referenzverfahren) fraktioniert und sichtbar gemacht werden und die entsprechenden Banden können abgekratzt und extrahiert werden. Als alternative Trennmethode kann eine HPLC mit Kieselgelsäule und einem UV-Detektor verwendet und können die verschiedenen Fraktionen gesammelt werden. Die aliphatischen und Triterpen-Alkohole sowie die Sterine und Triterpen-Dialkohole werden gemeinsam isoliert.

3.   GERÄTE

Übliche Laboreinrichtung und insbesondere nachstehende Geräte:

3.1.	komplette Apparatur für die Dünnschichtchromatografie mit Glasplatten 20 × 20 cm.

3.2.	UV-Lampe, Wellenlänge 366 oder 254 nm.

3.3.	Mikroliterspritzen, 100 μl und 500 μl.

3.4.	Glasfiltertiegel mit Porenfilter G 3 (Porosität 15-40 μm), etwa 2 cm Durchmesser, 5 cm Höhe, geeignet für die Vakuumfiltration mit Normschliff (Kern).

3.5.	Erlenmeyerkolben mit Normschliff (Hülse), 50 ml, für Glasfiltertiegel (3.4).

3.6.	l-Röhrchen mit konischem Boden und dicht schließendem Glasstopfen, 10 ml.

3.7.	Calciumdichlorid-Exsikkator.

3.8.	HPLC-System, bestehend aus: 3.8.1. binärer Pumpe, 3.8.2. manuellem oder automatischem Injektor mit einer Injektionsschleife von 200 μl, 3.8.3. integriertem Entgaser, 3.8.4. UV-VIS- oder IR-Detektor,

3.9.	HPLC-Säule (25 cm × 4 mm Innendurchmesser), mit Kieselgel 60 (Korngröße 5 μm),

3.10.

Spritzenfilter, 0,45 μm,

3.11.

Erlenmeyerkolben, 25 ml.

4.   REAGENZIEN

4.1.	Kaliumhydroxid (Titer mindestens 85 %).

4.2.	Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung etwa 2 M. 130 g Kaliumhydroxid (4.1) unter Kühlen in 200 ml destilliertem Wasser lösen und mit Ethanol (4.9) auf einen Liter auffüllen. Die Lösung ist in gut verschlossenen Braunglasflaschen maximal zwei Tage haltbar.

4.3.	Ethylether, analysenrein.

4.4.	Kaliumhydroxid, ethanolische Lösung etwa 0,2 M. 13 g Kaliumhydroxid (4.1) in 20 ml destilliertem Wasser lösen und mit Ethanol (4.9) auf einen Liter auffüllen.

4.5.	Kieselgelbeschichtete Glasplatten (20 × 20 cm) ohne Fluoreszenzindikator, Schichtdicke 0,25 mm (gebrauchsfertig im Handel erhältlich).

4.6.	Aceton für die Chromatografie.

4.7.	n-Hexan für die Chromatografie.

4.8.	Ethylether für die Chromatografie.

4.9.	Ethanol, analyserein.

4.10.

Ethylacetat, analyserein.

4.11.

Referenzlösung für die Dünnschichtchromatografie: Cholesterol, Phytosterole, Alkohole und Erythrodiol-Lösung 5 % in Ethylacetat (4.10).

4.12.

0,2 %ige Lösung von 2,7-Dichlorfluorescein in ethanolischer Lösung. Leicht alkalisch durch Zusatz einiger Tropfen alkoholischer 2-M-Kaliumhydroxid-Lösung (4.2).

4.13.

n-Hexan (4.7)/Ethylether (4.8)-Gemisch 65:35 (V/V).

4.14.

Mobile Phase der HPLC, n-Hexan (4.7)/Ethylether (4.8) (1:1) (V/V).

5.   REFERENZMETHODE: TRENNUNG DER ALKOHOLISCHEN VERBINDUNGEN MITTELS BASISCHER DÜNNSCHICHTCHROMATOGRAFIE-PLATTE

Vorbereitung der basischen Dünnschichtchromatografie-Platten. Die Kieselgelplatten (4.5) etwa 4 cm tief und ca. 10 Sekunden lang in eine 0,2 M-ethanolische Kaliumhydroxidlösung (4.4) ein- oder untertauchen, dann unter einem Abzug 2 Stunden trocknen lassen, anschließend 1 Stunde bei 100 °C in den Trockenschrank legen.

Die Platten aus dem Trockenschrank nehmen und in einem Exsikkator über Calciumchlorid (3.7) bis zum Gebrauch aufbewahren. (Derart behandelte Platten müssen innerhalb von 15 Tagen verwendet werden.)

Die Entwicklerkammer bis zu einer Höhe von etwa 1 cm mit einem Hexan/Ethylether-Gemisch (4.13) (Anmerkung 3) beschicken. Die Kammer mit einem geeigneten Deckel verschließen und mindestens eine halbe Stunde an einem kühlen Ort stehen lassen, damit sich ein Gleichgewicht zwischen Flüssigkeit und Dampfphase einstellt. An der Innenwand der Kammer können Filterpapierstreifen befestigt werden, die in das Elutionsmittel eintauchen. Dadurch kann die Laufzeit um ein Drittel verkürzt und eine gleichmäßige Elution der Komponenten erzielt werden.

Anmerkung 3:

Das Elutionsmittel sollte für jeden Test frisch angesetzt werden, damit die Wiederholbarkeit der Elution gewährleistet ist. Als alternatives Lösungsmittel kann n-Hexan/Ethylether 50:50 (V/V) verwandt werden.

Eine etwa 5 %ige Lösung des unter Teil 1 hergestellten Unverseifbaren in Ethylacetat (4.10) vorbereiten und mit einer 100-μl-Mikroliterspritze (3.3) 0,3 ml der Lösung als dünnen, gleichmäßigen Strich auf den unteren Rand (2 cm) der Chromatografieplatte (4.5) auftragen. In der Verlängerung der Startlinie werden 2-3 μl der Referenzlösung (4.11) aufgetragen, um die Sterin-, Triterpen-Dialkohol- und Alkoholbanden nach der Entwicklung zu identifizieren.

Die Platte in die Entwicklerkammer (3.1) stellen. Die Temperatur der Umgebung sollte 15-20 °C betragen (Anmerkung 4). Die Kammer sofort mit dem Deckel verschließen und die Platte so lange eluieren, bis die Elutionsmittelfront etwa 1 cm unter den oberen Plattenrand gestiegen ist. Dann die Platte aus der Entwicklerkammer nehmen und das Lösungsmittel in einem warmen Luftstrom abdampfen oder die Platte kurze Zeit unter dem Abzug liegen lassen, um das Lösungsmittel abzudampfen.

Anmerkung 4:

Eine höhere Temperatur könnte die Separation verschlechtern.

Die Platte vorsichtig und gleichmäßig mit 2',7'-Dichlorfluoresceinlösung (4.12) besprühen und anschließend trocknen lassen. Unter UV-Licht (3.2) können auf der Platte die Sterin-, Triterpen-Dialkohol- und Alkoholbanden mithilfe der Flecke der Referenzlösung (4.11) bestimmt werden. Die Bandbegrenzungen entlang der Ränder des fluoreszierenden Bereichs mit einem schwarzen Stift markieren (siehe Dünnschichtplatte in Abbildung 1).

Das in der markierten Zone liegende Kieselgel mit einem Metallspatel abkratzen, fein mahlen und in einen Glasfiltertiegel (3.4) überführen. Mit 10 ml heißem Ethylacetat (4.10) versetzen, mithilfe des Metallspatels vorsichtig vermischen und (ggf. unter Vakuum) filtrieren. Das Filtrat in dem an dem Glasfiltertiegel angeschlossenen Erlenmeyerkolben (3.5) auffangen.

Den Rückstand in der Flasche dreimal mit je ca. 10 ml Ethylether (4.3) waschen und das Filtrat wiederum in dem an dem Glasfiltertiegel angeschlossenen Erlenmeyerkolben auffangen. Das Filtrat bis auf ein Volumen von etwa 4-5 ml eindampfen und den Rest der Lösung in das zuvor gewogene 10-ml-Probenglas (3.6) überführen. Durch vorsichtiges Erhitzen unter einem schwachen Stickstoffstrom bis zur Trocknung eindampfen. Mit einigen Tropfen Aceton (4.6) versetzen, wieder bis zur Trocknung eindampfen. Der Rückstand in dem Probenglas besteht aus den Sterin- und Triterpen-Dialkohol-Fraktionen oder den Alkohol- und Triterpen-Alkohol-Fraktionen.

6.   TRENNUNG DER ALKOHOL-FRAKTION DURCH HPLC

Das Unverseifbare aus Teil 1 in 3 ml der mobilen Phase (4.14) auflösen und die Lösung mit einem Spritzenfilter (3.10) filtern und aufbewahren.

200 μl der gefilterten Lösung des Unverseifbaren in das HPLC-System (3.8) einführen.

HPLC-Trennung mit einem Fluss von 0,8 ml/min laufen lassen, die ersten 5 Minuten außer Acht lassen und im Zeitraum zwischen 5 und 10 min die aliphatischen und Triterpen-Alkohole und im Zeitraum zwischen 11 und 25 min die Sterine sowie Erythrodiol und Uvaol in Erlenmeyerkolben mit 25 ml Fassungsvermögen (3.11) auffangen (Anmerkung 5).

Die Trennung kann mittels eines UV-Detektors bei einer Wellenlänge von 210 nm oder mittels eines Refraktionsindexdetektors überwacht werden (siehe Abbildung 6).

Die Fraktionen bis zur Trocknung eindampfen und für die chromatografische Analyse vorbereiten.

Anmerkung 5:

Der Druck der HPLC-Pumpe muss sorgsam kontrolliert werden, da Ethylester den Druck erhöhen kann, und die Flussrate muss angepasst werden, um den Druck unter Kontrolle zu halten.

TEIL 3

GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE DER FRAKTIONEN DER ALKOHOLISCHEN VERBINDUNGEN

1.   GEGENSTAND

Dieser Teil enthält allgemeine Leitlinien zur Anwendung der Kapillar-Gaschromatografie, um die qualitative und quantitative Zusammensetzung der nach der in Teil 2 dargelegten Methode isolierten alkoholischen Verbindungen zu bestimmen.

2.   PRINZIP

Die mittels TLC oder HPLC aus dem Unverseifbaren gesammelten Fraktionen werden in Trimethylsilylether überführt und mittels Kapillar-Gaschromatografie mit Split-Injektion und Flammenionisationsdetektor analysiert.

3.   GERÄTE

Übliche Laboreinrichtung und insbesondere nachstehende Geräte:

3.1.	l-Röhrchen mit konischem Boden und dicht schließendem Glasstopfen, 10 ml.

3.2.

Gaschromatograf, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen mit Splitsystem, bestehend aus: 3.2.1. einem thermostatisierbaren Säulenofen, einstellbar auf die gewünschte Temperatur mit einer Genauigkeit von ± 1 °C, 3.2.2. einem temperaturregelbaren Injektor mit Verdampfer aus persilanisiertem Glas und Splitsystem, 3.2.3. einem Flammenionisationsdetektor (FID), 3.2.4. einem Datenerfassungssystem, geeignet zur Verwendung mit dem FID (3.10.3), manuell integrierbar.

3.3.	Fused-Silica-Kapillarsäule, 20 bis 30 m Länge, 0,25 bis 0,32 mm Innendurchmesser, beschichtet mit 5 % Diphenyl-/95 % Dimethylpolysiloxan (SE-52 oder SE-54 stationäre Phase oder gleichwertig), gleichmäßige Schichtdicke zwischen 0,10 und 0,30 μm.

3.4.	Mikroliterspritze für die Gaschromatografie, 10 μl, mit gehärteter Nadel, geeignet für Split-Injektion.

4.   REAGENZIEN

4.1.	Wasserfreies Pyridin für die Chromatografie.

4.2.	Hexamethyldisilazan, analyserein.

4.3.	Trimethylchlorsilan, analyserein.

4.4.	Probelösungen von Sterin-Trimethylsilylethern, unmittelbar vor Gebrauch ansetzen mit Sterinen und Erythrodiol aus Ölen, in denen sie enthalten sind.

4.5.	Standardlösungen der Trimethylsilylether der aliphatischen Alkohole von C20 bis C28. Sie können unmittelbar vor Gebrauch aus einer Mischung reiner Alkohole angesetzt werden.

4.6.	Trägergas: Wasserstoff oder Helium, rein, für die Gaschromatografie.

4.7.	Hilfsgase: Wasserstoff, Helium, Stickstoff und Luft, rein, für die Gaschromatografie.

4.8.	Silanisierungsreagenz, bestehend aus einem Gemisch aus Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis 9:3:1 (V/V/V).

4.9.	n-Hexan für die Chromatografie.

5.   HERSTELLUNG DER TRIMETHYLSILYLETHER

Dem Probengläschen (3.1) mit der Fraktion der alkoholischen Verbindung werden je Milligramm alkoholischer Verbindung 50 μl Silanisierungsreagenz (4.8) zugesetzt (Anmerkung 6), unter Ausschluss von Feuchtigkeit (Anmerkung 7).

Anmerkung 6:

Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich. Daneben gibt es auch andere Silanisierungsreagenzien, z. B. N,O-bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trimethylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem Pyridin gemischt werden muss. Pyridin kann durch die gleiche Menge Acetonitril ersetzt werden.

Anmerkung 7:

Die Beobachtung einer leichten Opaleszenz ist normal und bedeutet keine Anomalie. Die Bildung eines weißen Niederschlags oder der Eindruck einer Rosafärbung sind Anzeichen der Anwesenheit von Feuchtigkeit oder der Zersetzung des Reagens. In diesem Fall muss der Test wiederholt werden (nur bei Verwendung von Hexamethyldisilazan/Trimethylchlorsilan).

Das Probengläschen (3.1) verschließen und vorsichtig (ohne es auf den Kopf zu stellen) schütteln, bis sich die Verbindungen vollständig gelöst haben. Die Probe mindestens 15 Minuten bei Raumtemperatur stehen lassen und dann einige Minuten zentrifugieren. Die klare Lösung kann gaschromatografisch analysiert werden.

6.   GASCHROMATOGRAFISCHE ANALYSE

6.1.   Vorbereiten, Konditionieren der Kapillarsäule,

Die Säule (3.3) in den Gaschromatografen einsetzen, wobei das Einlassteil an den Split-Injektor und das Auslassteil an den Detektor angeschlossen wird.

Überprüfung des Gaschromatografen (Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereitschaft des Detektors, des Splitsystems, des Schreibers usw.).

Wird die Säule zum ersten Mal verwendet, ist es ratsam, sie zu konditionieren: Einen schwachen Gasstrom durch die Säule selbst geben, den Gaschromatografen einschalten und allmählich auf eine Temperatur von mindestens 20 °C über der Arbeitstemperatur (Anmerkung 8) aufheizen. Diese Temperatur mindestens 2 Stunden konstant halten, dann das gesamte Gerät in den Betriebsmodus setzen (Anpassung der Gasströme und des Splitsystems, Zünden der Flamme, Rechensystemanschluss, Einstellen der Säulen-, Injektor- und Detektortemperatur usw.). Dann eine Empfindlichkeit wählen, die mindestens doppelt so groß ist wie die für die Analyse vorgesehene, und das Signal aufzeichnen. Die Grundlinie muss linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift. Eine negative Drift von der Grundlinie ist ein Indiz für einen undichten Anschluss der Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Konditionieren der Säule hin.

Anmerkung 8:

Die Konditionierungstemperatur muss in jedem Fall 20 °C unter der für die stationäre Phase angegebenen Maximaltemperatur liegen.

6.2.   Betriebsbedingungen

Das Temperaturprogramm und der Fluss des Trägergases sind so zu optimieren, dass Chromatogramme wie in den Abbildungen 3 bis 6 erzielt werden.

Die folgenden Parameter wurden getestet und für nützlich befunden:

6.2.1.   Aliphatische Alkohole

Ofenprogramm	180 °C (8 min) → 260 °C (je 5 °C/min.) → 260 °C (15 min)
Injektortemperatur	280 °C
Detektortemperatur	290 °C
Lineargeschwindigkeit des Trägergases	Helium (20-30 cm/s); Wasserstoff (30-50 cm/s)
Splitverhältnis	1:50 bis 1:100
Injiziertes Volumen	0,5-1 μl TMSE-Lösung

6.2.2.   Sterin und Triterpen-Dialkohole

Ofenprogramm	260 ± 5 °C isotherm
Injektortemperatur	280-300 °C
Detektortemperatur	280-300 °C
Lineargeschwindigkeit des Trägergases	Helium (20-30 cm/s); Wasserstoff (30-50 cm/s)
Splitverhältnis	1:50 bis 1:100
Injiziertes Volumen	0,5-1 μl TMSE-Lösung

Diese Bedingungen können entsprechend den Charakteristiken der Säule und des Gaschromatografen derart geändert werden, dass die damit aufgezeichneten Chromatogramme folgende Bedingungen erfüllen:

—	Die Retentionszeit des C26-Alkohols muss 18 ± 5 Minuten betragen.

—	Der Peak des C22-Alkohols muss bei Olivenöl 80 ± 20 % der gesamten Skala und bei Oliventresteröl 40 ± 20 % der gesamten Skala erreichen.

—	Die Retentionszeit des Peaks von ß-Sitosterol muss 20 ± 5 Minuten betragen.

—	Der Campesterol-Peak muss bei Olivenöl (Durchschnittsgehalt 3 %) 20 ± 5 % der gesamten Skala erreichen.

—

Alle enthaltenen Sterine müssen getrennt werden. Die Peaks müssen nicht nur getrennt, sondern auch völlig aufgelöst sein, d. h. der Peakverlauf muss auf die Grundlinie zurückführen, bevor der nächste Peak beginnt. Eine unvollständige Auflösung ist nur unter der Bedingung akzeptabel, dass der RRT-1,02-Peak (Sitostanol) mithilfe der Senkrechten quantitativ zu bestimmen ist.

6.3.   Durchführung der Analyse

Mit der 10-μl-Mikroliterspritze (3.4) 1 μl Hexan entnehmen, 0,5 μl Luft und anschließend 0,5-1 μl Probenlösung aufziehen. Dabei den Kolben der Spritze so weit einziehen, dass die Nadel geleert wird. Die Nadel in die Membran des Injektors einführen, nach 1-2 Sekunden schnell einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam herausziehen. Es kann auch ein automatischer Injektor verwendet werden.

Das Chromatogramm aufzeichnen, bis die TMSE der entsprechend vorhandenen alkoholischen Verbindungen vollständig eluiert sind. Die Grundlinie muss stets den Anforderungen der entsprechenden Betriebsbedingungen (6.2.1 oder 6.2.2) genügen.

6.4.   Identifizierung der Peaks

Die einzelnen Peaks werden anhand der Retentionszeiten und durch Vergleich mit dem unter denselben Bedingungen analysierten Gemisch der TMSE der aliphatischen und der Triterpen-Alkohole oder der Sterine und der Triterpen-Dialkohole bestimmt. Ein Chromatogramm der Fraktion der aliphatischen und Triterpen-Alkohole ist in Abbildung 3 dargestellt und die entsprechenden Chromatogramme für Sterine und Triterpen-Dialkohole sind der Abbildung 2 zu entnehmen.

Die aliphatischen Alkohole werden in folgender Reihenfolge eluiert: C20-ol (I.S.), C22-ol, C23-ol, C24-ol, C25-ol, C26-ol, C27-ol und C28-ol.

Die Sterine und Triterpen-Dialkohole werden in folgender Reihenfolge eluiert: Cholesterol, Brassicasterol, Ergosterol, 24-Methylen-Cholesterol, Campesterol, Campestanol, Stigmasterol, Δ7-Campesterol, Δ5,23-Stigmastadienol, Clerosterol, ß-Sistosterol, Sitostanol, Δ5-Avenasterol, Δ5,24-Stigmastadienol, Δ7-Stigmastenol, Δ7-Avenasterol, Erythrodiol und Uvaol.

6.5.   Quantitative Bestimmung

Die Peak-Bereiche von 1-Eicosanol und der aliphatischen Alkohole C22, C24, C26 und C28 werden mittels eines Datenerfassungssystems berechnet. Der Responsefaktor von 1-Eicosanol soll gleich 1 gesetzt werden.

Mit Hilfe des Rechensystems werden die Peak-Flächen von α-Cholestanol und der Sterine und Triterpen-Dialkohole berechnet. Dabei sind auftretende Peaks von Verbindungen, die nicht in Tabelle 1 aufgeführt sind, nicht zu berücksichtigen (Ergosterol darf nicht berechnet werden). Der Responsefaktor von α-Cholestanol soll gleich 1 gesetzt werden.

Der Konzentration jeder einzelnen alkoholischen Verbindung in mg/kg Fett wird nach folgender Formel berechnet:

Darin bedeuten:

Ax	=	Peakfläche der alkoholischen Verbindung x in Computer-Counts.
As	=	Peakfläche von 1-Eicosanol/α-Cholestanol in Computer-Counts.
ms	=	zugesetzte Menge an 1-Eicosanol/α-Cholestanol in mg.
m	=	Menge der für die Bestimmung entnommenen Probe in g.

7.   ERGEBNISSE

Die Konzentration der einzelnen aliphatischen und Triterpen-Alkohole wird in mg/kg Fett angegeben, ihre Summe als ‚Gesamtgehalt an aliphatischen Alkoholen‘. Der Gesamtgehalt ergibt sich aus der Summe von C22, C24, C26 und C28.

Die Zusammensetzung der einzelnen alkoholischen Verbindungen wird mit einer Dezimalstelle angegeben.

Die Gesamtkonzentration von Sterin ist ohne Dezimalstelle anzugeben.

Der prozentuale Anteil jedes einzelnen Sterins errechnet sich aus dem Quotienten der Peakfläche des entsprechenden Peaks und der Summe der Peakflächen aller Sterine:

Darin bedeuten:

Ax	=	Peakfläche des Sterins x.
ΣΑ	=	Summe der Peakflächen aller Sterine.

Apparentes β-Sitosterol: Δ5,23-Stigmastadienol + Clerosterol + β-Sitosterol + Sitostanol + Δ5-Avenasterol + Δ5,24-Stigmastadienol.

Der prozentuale Anteil von Erythrodiol und Uvaol errechnet sich nach der Formel:

Darin bedeuten:

AEr	=	Fläche von Erythrodiol in Computer-Counts.
AUv	=	Fläche von Uvaol in Computer-Counts.
Σ AT	=	Gesamtfläche von Sterin + Erythrodiol + Uvaol in Computer-Counts.

Neben der Berechnung des relativen Anteils der einzelnen Sterine und Triterpen-Dialkohole und der Gesamtkonzentration der Sterine muss die Konzentration von Erythrodiol und Uvaol sowie deren Summe in mg/kg Fett nach der folgenden Formel berechnet werden:

Darin bedeuten:

AEr	=	Peakfläche von Erythrodiol in Computer-Counts.
AUv	=	Fläche von Uvaol in Computer-Counts.
As	=	Peakfläche von α-Cholestanol in Computer-Counts.
ms	=	zugesetzte Menge an α-Cholestanol in mg.
m	=	Menge der für die Bestimmung entnommenen Probe in g.

Anlage

1 Kohlenwasserstoffe 2 α-Tocopherol 3 Prenole 4 Triterpen-Alkohole 5 Aliphatische Alkohole 6 Methylsterine 7 Sterine 8 Triterpen-Dialkohole

Abbildung 1 — TLC der unverseifbaren Fraktion aus Oliventresteröl, zweifach mit Hexan:Diethylether (65:35) eluiert, entwickelt mit SO4H2 (50 %) und erhitzt. Die abzukratzenden Banden sind in den Rechtecken zu sehen; Rechteck 1 sind die Banden von aliphatischen Alkoholen und Rechteck 2 die von Sterinen und Triterpen-Dialkoholen.

Tabelle I — Relative Retentionszeiten der Sterine

Peak	Identifizierung		Relative Retentionszeit
			Säule SE 54	Säule SE 52
1	Cholesterol	Δ-5-Cholesten-3ß-ol	0,67	0,63
2	Cholestanol	5α-Cholestan-3ß-ol	0,68	0,64
3	Brassicasterol	[24S]-24-Methyl-Δ-5,22-Cholestadien-3β-ol	0,73	0,71
*	Ergosterol	[24S]-24-Methyl-Δ-5,7,22 cholestatrien-3β-ol	0,78	0,76
4	24-Methylen-Cholesterol	24-Methylen-Δ-5,24-Cholestadien-3ß-o1	0,82	0,80
5	Campesterol	(24R)-24-Methyl-Δ-5-Cholesten-3ß-ol	0,83	0,81
6	Campestanol	(24R)-24-Methyl-Cholestan-3ß-ol	0,85	0,82
7	Stigmasterol	(24S)-24-Ethyl-Δ-5,22-Cholestadien-3ß-ol	0,88	0,87
8	Δ-7-Campesterol	(24R)-24-Methyl-Δ-7-Cholesten-3ß-ol	0,93	0,92
9	Δ-5,23-Stigmastadienol	(24R,S)-24-Ethyl-Δ-5,23-Cholestadien-3ß-ol	0,95	0,95
10	Clerosterol	(24S)-24-Ethyl-Δ-5,25-Cholestadien-3ß-ol	0,96	0,96
11	ß-Sitosterol	(24R)-24-Ethyl-Δ-5-Cholesten-3ß-ol	1,00	1,00
12	Sitostanol	24-Ethyl-Cholestan-3ß-ol	1,02	1,02
13	Δ-5-Avenasterol	(24Z)-24-Ethyliden-Δ-Cholesten-3ß-ol	1,03	1,03
14	Δ-5,24-Stigmastadienol	(24R,S)-24-Ethyl-Δ-5,24-Cholestadien-3ß-ol	1,08	1,08
15	Δ-7-Stigmastenol	(24R,S)-24-Ethyl-Δ-7-Cholesten-3ß-ol	1,12	1,12
16	Δ-7-Avenasterol	(24Z)-24-Ethyliden-Δ-7-Cholesten-3ß-ol	1,16	1,16
17	Erytrodiol	5α-Olean-12-en-3β,28-diol	1,41	1,41
18	Uvaol	Δ12-Ursen-3β,28-diol	1,52	1,52

Abbildung 2 — GC-FID chromatografisches Profil der Sterine und Triterpen-Dialkohole aus raffiniertem Olivenöl. 1) Cholesterol, 2) α-Cholestanol (I.S.), 3) 24-Methylencholesterol, 4) Campesterol, 5) Campestanol, 6) Stigmasterol, 7) Δ5,23-Stigmastadienol, 8) Clerosterol, 9) β-Sitosterol, 10) Sitostanol, 11) Δ5-Avenasterol, 12) Δ5,24-Stigmastadienol, 13) Δ7-Stigmastenol, 14) Δ7-Avenasterol, 15) Erythrodiol, 16) Uvaol.

Abbildung 3 — GC-FID chromatografisches Profil der Sterine und Triterpen-Dialkohole aus Lampantöl. 1) Cholesterol, 2) α-Cholestanol, 3) Brassicasterol, 4) 24-Methylencholesterol, 5) Campesterol, 6) Campestanol, 7) Stigmasterol, 8) Δ7-Campesterol, 9) Δ5,23-Stigmastadienol, 10) Clerosterol, 11) β-Sitosterol, 12) Sitostanol, 13) Δ5-Avenasterol, 14) Δ5,24-Stigmastadienol, 15) Δ7-Stigmastenol, 16) Δ7-Avenasterol, 17) Erythrodiol, 18) Uvaol.

Abbildung 4 — GC-FID chromatografisches Profil der aliphatischen und Triterpen-Alkohole aus Olivenöl. (I.S.) C20-ol, 1) C22-ol, 2) C24-ol, 3) C26-ol, 4) C28-ol, 5) Triterpen-Alkohole.

Abbildung 5 — GC-FID chromatografisches Profil der aliphatischen und Triterpen-Alkohole eines raffinierten Olivenöls und eines Olivenöls aus der zweiten Zentrifugation. (I.S.) C20-ol, 1) C22-ol, 2) C24-ol, 3) C26-ol, 4) C28-ol, 5) Triterpen-Alkohole.

Abbildung 6 — HPLC-Chromatogramm eines Olivenöls, Unverseifbares getrennt durch HPLC mittels eines UV-Detektors. 1) Aliphatische und Triterpen-Alkohole; 2) Sterine und Triterpen-Dialkohole.