a)

antigeeni: antigeenin on sisällettävä nautaeläinten tarttuvan leukoosiviruksen spesifistä glykoproteiinia, joka on standardoitu E05-seerumia vastaan;

b)

tutkittava seerumi;

c)

tunnettu positiivinen kontrolliseerumi;

d)

agargeeli:

—

antigeeni: 32 μl,

—

kontrolliseerumi: 73 μl,

—

tutkittava seerumi: 73 μl.

a)

Tutkittava seerumi on positiivinen, jos se muodostaa määrätyn saostumaviivan BLV-antigeenin kanssa sekä täysin samanlaisen viivan kontrolliseerumin kanssa.

b)

Tutkittava seerumi on negatiivinen, ellei se muodosta määrättyä saostumaviivaa BLV-antigeenin kanssa eikä taivuta kontrolliseerumin viivaa.

c)

Reaktiota ei voida pitää varmana, jos se

a)

40 ml 1,6-prosenttista agaroosia, joka on valmistettu 0,05-prosenttiseen M Tris-HCl-puskuriin (pH 7,2), jossa on 8,5 prosenttia NaCl:ää;

b)

15 ml nautaleukoosiseerumia, jossa on vasta-ainetta ainoastaan nautaleukoosiviruksen glykoproteiineja vastaan ja joka on laimennettu suhteessa 1:10 puskuriliuokseen, jonka koostumus on 0,05 M Tris/HCl, pH 7,2 ja 8,5 % NaCl;

c)

15 ml nautaleukoosiseerumia, jossa on vasta-ainetta ainoastaan nautaleukoosiviruksen glykoproteiineja vastaan ja joka on laimennettu suhteessa 1:5 puskuriliuokseen, jonka koostumus on 0,05 M Tris/HCl, pH 7,2 ja 8,5 % NaCl;

d)

neljä muovista petrimaljaa, joiden läpimitta on 85 mm;

e)

lävistin, jonka läpimitta on 4–6 mm;

f)

vertailuantigeeni;

g)

standardoitava antigeeni;

h)

vesihaude (56 °C).

a)

petrimaljat 1 ja 3:

b)

petrimaljat 2 ja 4:

a)

Koe on suoritettava kahdella seerumilaimennoksella (1:5 ja 1:10) optimaalisen saostumisen saavuttamiseksi.

b)

Jos saostuman läpimitta on liian pieni molemmilla laimennoksilla, on seerumia laimennettava enemmän.

c)

Jos saostuman läpimitta molemmissa laimennoksissa on liian suuri ja heikosti näkyvä, on valittava alempi seerumitaso.

d)

Agaroosin lopullisen pitoisuuden on oltava 0,8 % ja seerumien vastaavasti 5 % ja 10 %.

e)

Laaditaan kuvaaja mitatuista läpimitoista seuraavassa esitettävässä koordinaatistossa. Käyttölaimennos on se tutkittavan antigeenin laimennos, jolla saadaan sama läpimitta kuin vertailuantigeenia käyttämällä.

a)

kiinteän faasin mikrotiitterilevyt, kyvetit tai muu kiinteä faasi;

b)

antigeeni kiinnitetään kiinteään faasiin joko käyttämällä apuna polyklonaalisia tai monoklonaalisia sieppausvasta-aineita tai ilman niiden apua. Jos antigeeni pinnoitetaan suoraan kiinteään faasiin, on kaikki positiivisen tutkimustuloksen antaneet tutkittavat näytteet tutkittava uudelleen kontrolliantigeenia vastaan. Kontrolliantigeenin olisi oltava identtinen tutkittavan antigeenin kanssa, kuitenkin ilman BLV-antigeeneja. Jos kiinteä faasi pinnoitetaan sieppausvasta-aineilla, nämä vasta-aineet eivät saa reagoida muita antigeeneja kuin BLV-antigeeneja vastaan;

c)

tutkittava biologinen neste;

d)

vastaavasti positiiviset ja negatiiviset kontrollit;

e)

konjugaatti;

f)

käytettävää entsyymiä vastaava substraatti;

g)

pysäytysliuos tarvittaessa;

h)

liuokset tutkittavien näytteiden laimentamiseksi, reagenssien valmistamiseksi ja pesuihin;

i)

tulosten lukemiseen käytettävä järjestelmä, joka sopii käytettyihin substraatteihin.

a)

ELISA-määritystä voidaan käyttää vain seerumi- ja maitonäytteiden tutkimiseen.

b)

Jos ELISA-testejä käytetään sertifiointitarkoituksiin 6 artiklan 2 kohdan c alakohdan mukaisesti tai karjan tautitilanteen toteamiseen ja ylläpitämiseen liitteessä D olevan I luvun mukaisesti, seerumi- tai maitonäytteet on yhdistettävä siten, että kiistatta tiedetään yhdistettyyn näytteeseen kuuluvat eläimet. Mahdolliset varmentavat testit on tehtävä yksittäisistä eläimistä otetuilla näytteillä.

c)

Jos ELISA-testejä käytetään tankkimaitonäytteen tutkimiseen, näyte on otettava sellaisen karjan maidosta, jossa ainakin 30 prosenttia lehmistä on lypsäviä. Mahdolliset varmentavat testit on tehtävä yksittäisistä eläimistä otetuilla seerumi- tai maitonäytteillä.”