„ANEXA I

CARACTERISTICILE ULEIURILOR DE MĂSLINE

„ANEXA XVII:

METODĂ DE DETERMINARE A CONȚINUTULUI DE STIGMASTADIENE DIN ULEIURILE VEGETALE

1.   OBIECT

Determinarea conținutului de stigmastadiene din uleiurile vegetale conținând concentrații scăzute din aceste hidrocarburi, în special în uleiul virgin de măsline și în uleiul brut din resturi de măsline.

2.   DOMENIU DE APLICARE

Metoda se utilizează pentru toate uleiurile vegetale, dar măsurătorile sunt fiabile doar în cazul în care conținutul de hidrocarburi este cuprins între 0,01 și 4,0 mg/kg. Această metodă este adecvată în special pentru detectarea prezenței uleiurilor vegetale rafinate (de măsline, resturi de măsline, floarea soarelui, palmier etc.) în ulei virgin de măsline, deoarece uleiurile rafinate conțin stigmastadiene, iar uleiurile virgine nu conțin.

3.   PRINCIPIU

Izolarea substanței nesaponificabile. Separarea fracțiunii de hidrocarburi steroidale prin cromatografie în coloană pe silicagel și analiza prin cromatografie în fază gazoasă în coloană capilară.

4.   APARATURĂ

4.1.   Baloane adecvate de 250 ml cu un condensator cu reflux.

4.2.   Pâlnii de decantare de 500 ml.

4.3.   Baloane cu fund rotund de 100 ml.

4.4.   Evaporator rotativ.

4.5.   Coloană cromatografică de sticlă (diametru intern între 1,5 și 2,0 cm și lungime de 50 cm) cu robinet de teflon și un dop din fibră din vată de sticlă sau un disc din sticlă sinterizată la fund. Pentru a prepara coloana de silicagel, a se turna hexan în coloana cromatografică până la înălțimea de aproximativ 5 cm și apoi a se completa cu o suspensie de silicagel în hexan (15 g în 40 ml) cu ajutorul unor fracțiuni de hexan. A se lăsa să se depună și a se termina depunerea prin aplicarea unei ușoare vibrații. A se adăuga sulfat de sodiu anhidru până la o înălțime de aproximativ 0,5 cm și la sfârșit a se elua hexanul în exces.

4.6.   Cromatograf în fază gazoasă cu detector de ionizare a flăcării, injector cu splitare sau injector pe coloană rece «on-column» și cuptor programabil între ± 1 °C.

4.7.   Coloană capilară din silice topită pentru cromatografia în fază gazoasă (diametru intern de 0,25 sau 0,5 mm și lungime de 25 m), acoperită cu fază de fenilmetilsilicon 5 %, cu grosime a peliculei de 0,25 mm.

Nota 1:

Pot fi utilizate alte coloane cu polaritate similară sau mai scăzută.

4.8.   Integrator-înregistrator care permite o integrare vale-vale.

4.9.   Microseringă de 5-10 ml pentru cromatografie în fază gazoasă cu ac cimentat.

4.10.   Manta de încălzire electrică sau placă de încălzire.

5.   REACTIVI

Toți reactivii trebuie să fie puri, în lipsa unor indicații contrare. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă cu o puritate cel puțin echivalentă.

5.1.   Hexan sau amestec de alcani cu intervalul de fierbere între 65 și 70 °C, distilat cu coloană de rectificare.

Nota 2:

Solventul trebuie distilat pentru a îndepărta impuritățile.

5.2.   Etanol v/v 96.

5.3.   Sulfat de sodiu anhidru.

5.4.   Soluție de 10 % de hidroxid de potasiu alcoolic. A se adăuga 10 ml de apă la 50 g de hidroxid de potasiu, a se amesteca și apoi a se dizolva amestecul în etanol până la obținerea a 500 ml de soluție.

Nota 3:

Potasa alcoolică devine cafenie în repaus. Trebuie preparată proaspăt în fiecare zi și păstrată în vase de sticlă neagră bine astupate.

5.5.   Silicagel 60 pentru cromatografie în coloană, 70 - 230 mesh (Merck, referința 7734 sau similară).

Nota 4:

De obicei, silicagelul poate fi utilizat direct din recipient fără vreun tratament prealabil. Cu toate acestea, unele loturi de silicagel pot avea o activitate scăzută din cauza unei insuficiente separări cromatografice. În acest caz, silicagelul ar trebui tratat în modul următor: a se dezactiva prin încălzire timp de cel puțin 4 ore la 550 °C. După încălzire, a se plasa silicagelul într-un exsicator până la răcire și apoi a se transfera silicagelul într-un balon închis. A se adăuga 2 % apă și a se agita până la dispariția bulgărilor și obținerea unei pulberi care plutește liber.

În cazul în care pentru unele loturi de silicagel rezultă cromatograme cu valori de vârf care interferează, silicagelul trebuie tratat după metoda indicată mai sus. O alternativă ar putea fi utilizarea unui alt silicagel extrapur 60 (Merck, referința 7754).

5.6.   Soluție-mamă (200 ppm) de colesta-3,5-dienă (Sigma, puritate 99 %) în hexan (10 mg în 50 ml).

5.7.   Soluție standard de colesta-3,5-dienă în hexan la o concentrație de 20 ppm, obținută prin diluarea soluției de mai sus.

Nota 5:

Soluțiile de la punctele 5.6 și 5.7 sunt stabile pentru o perioadă de cel puțin patru luni în cazul în care sunt păstrate la mai puțin de 4 °C.

5.8.   Soluție de n-nonacosan în hexan la o concentrație de aproximativ 100 ppm.

5.9.   Gaz purtător pentru cromatografie: heliu sau hidrogen cu puritate de de 99,9990 %.

5.10.   Gaze auxiliare pentru detectorul de ionizare cu flacără: hidrogen cu puritate 99,9990 % și aer purificat.

6.   MOD DE LUCRU

6.1.   Prepararea substanței nesaponificabile

6.1.1.   A se cântări 20 ± 0,1 g de ulei într-un balon de 250 ml (punctul 4.1), a se adăuga 1 ml din soluția standard de colesta-3,5-dienă (20 μg) și 75 ml de potasă alcoolică la 10 %, a se instala condensatorul cu reflux și a se încălzi menținând o fierbere moderată timp de 30 de minute. A se îndepărta de sursa de căldură balonul care conține eșantionul și a se permite răcirea ușoară a soluției (a nu se permite răcirea completă, întrucât eșantionul se va depune). A se adăuga 100 ml de apă și a se transfera soluția într-o pâlnie separatoare (punctul 4.2) cu ajutorul a 100 ml de hexan. A se agita puternic amestecul timp de 30 de secunde și a se permite formarea diferitelor straturi.

Nota 6:

În cazul în care se formează o emulsie care nu dispare rapid, a se adăuga mici cantități de etanol.

6.1.2.   A se transfera faza apoasă de dedesubt într-o a doua pâlnie separatoare și a se extrage din nou cu 100 ml de hexan. A se recupera din nou faza inferioară și a se spăla extractele de hexan (regrupate într-o altă pâlnie de separare) de trei ori, de fiecare dată cu 100 ml dintr-un amestec etanol-apă (1: 1) până se ajunge la un pH neutru.

6.1.3.   A se trece soluția de hexan prin sulfat de sodiu anhidru (50 g), a se spăla cu 20 ml hexan și a se usca într-un evaporator rotativ la 30 °C la presiune redusă.

6.2.   Separarea fracțiunii de hidrocarbură steroidală

6.2.1.   A se așeza reziduul în coloana de fracționare cu ajutorul a două fracțiuni de 1 ml de hexan, a se scurge eșantionul de-a lungul coloanei permițând scăderea nivelului soluției până deasupra sulfatului de sodiu și a se începe eluția cromatografică cu hexan la un debit de aproximativ 1 ml/min. A se elimina primii 25-30 ml de eluat și apoi a se colecta următoarea fracțiune de 40 ml. După colectare, a se transfera această fracțiune într-un balon cu fundul rotund de 100 ml (punctul 4.3).

Nota 7:

Prima fracțiune conține hidrocarburi saturate (figura 1 a) și a doua fracțiune pe cele steroidale. Continuând eluția, se obțin squalen și compuși înrudiți. Pentru a obține o bună separare între hidrocarburile saturate și cele steroidale, este necesară optimizarea volumelor fracțiunilor. Pentru aceasta, volumul primei fracțiuni ar trebui ajustat astfel încât, atunci când a doua fracțiune este analizată, valorile de vârf care reprezintă hidrocarburile saturate să fie scăzute (a se vedea figura 1 c); în cazul în care acestea nu apar, dar intensitatea valorii de vârf standard este scăzută, trebuie redus volumul. Oricum, nu este necesară o separare completă între componenții primei și celei de a doua fracțiuni, dat fiind că nu există o suprapunere a valorilor de vârf în timpul analizei prin cromatografie în faza gazoasă, dacă condițiile CG sunt adaptate în conformitate cu punctul 6.3.1. Optimizarea volumului celei de-a doua fracțiuni este, în general, inutilă, întrucât se obține o bună separare cu ajutorul componentelor următoare. Cu toate acestea, prezența unei valori de vârf ridicate la un timp de retenție cu aproximativ 1,5 minute mai redus decât cel standard se datorează squalenului și indică o separare insuficientă.

6.2.2.   A se evapora a doua fracțiune într-un evaporator rotativ la 30 °C și la o presiune redusă până la uscare și a se dizolva imediat reziduul în 0,2 ml de hexan. A se păstra soluția la frigider până la analiză.

Nota 8:

Reziduurile menționate la punctele 6.1.3 și 6.2.2 nu trebuie păstrate uscate și la temperatura camerei. Imediat ce sunt obținute, ar trebui adăugat solventul și soluțiile ar trebui păstrate la frigider.

6.3.   Cromatografie în fază gazoasă

6.3.1.   Condiții de lucru pentru injectare cu splitare:

Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile cromatografului și ale coloanei, pentru ca cromatogramele să îndeplinească următoarele cerințe: formarea valorii de vârf standard interne în aproximativ cinci minute din timpul indicat la punctul 6.3.2; valoarea de vârf standard internă trebuie să se întindă pe cel puțin 80 % din scara totală.

Sistemul de cromatografie în fază gazoasă ar trebui să fie controlat prin injectarea unui amestec din soluția-mamă de colestadienă (punctul 5.6) și din soluția de n-nonacosan (punctul 5.8). Valoarea de vârf a colesta-3,5-dienei trebuie să apară înainte de cea a n-nonacosan-ului (figura 1c); în cazul în care aceasta nu apare, se pot lua două măsuri: reducerea temperaturii cuptorului și/sau utilizarea unei coloane mai puțin polare.

6.3.2.   Identificarea valorilor de vârf

Valoarea de vârf standard internă apare la aproximativ 19 minute și 3,5-stigmastadiena la un timp de retenție relativ de aproximativ 1,29 (a se vedea figura 1b). 3,5-Stigmastadiena este însoțită de cantități mici de izomer și, în general, ambele produc o valoare de vârf cromatografică unică. Cu toate acestea, în cazul în care coloana este prea polară sau prezintă o putere de rezoluție prea mare, izomerul poate apărea ca o valoare de vârf scăzută înaintea și apropiată de cea a stigmasta-3,5-dienei (figura 2). Pentru a se asigura faptul că stigmastadienele produc o valoare de vârf unică, este recomandabil să se înlocuiască coloana cu una care este mai puțin polară sau are un diametru intern mai mare.

Nota 9:

Stigmastadienele de referință pot fi obținute din analiza unui ulei vegetal rafinat prin utilizarea unei cantități mai reduse din eșantion (1-2 g). Stigmastadienele produc o valoare de vârf proeminentă și ușor de identificat.

6.3.3.   Analiză cantitativă

Conținutul de stigmastadiene este determinat în conformitate cu formula:

mg/kg de stigmastadiene =

Limita de detecție: aproximativ 0,01 mg/kg.”