32000D0428

Kommissionens beslut

av den 4 juli 2000

om fastställande av diagnos- och provtagningsmetoder samt kriterier för utvärdering av resultaten från laboratorietest för påvisande och differentialdiagnos beträffande vesikulär svinsjuka (SVD)

[delgivet med nr K(2000) 1805]

(Text av betydelse för EES)

(2000/428/EG)

EUROPEISKA GEMENSKAPERNAS KOMMISSION HAR FATTAT DETTA BESLUT

med beaktande av Fördraget om upprättandet av Europeiska gemenskapen,

med beaktande av rådets direktiv 92/119/EEG av den 17 december 1992 om införande av allmänna gemenskapsåtgärder för bekämpning av vissa djursjukdomar och särskilda åtgärder mot vesikulär svinsjuka(1), senast ändrat genom Anslutningsakten för Österrike, Finland och Sverige, särskilt bilaga II punkt 3 i detta, och

av följande skäl:

(1) Det är nödvändigt att på gemenskapsnivå fastställa diagnos- och provtagningsmetoder för vesikulär svinsjuka (SVD), liksom kriterier för utvärdering av resultaten från laboratorietest för påvisande av denna sjukdom och för snabb differentialdiagnos till mal- och klövsjuka, så att båda dessa sjukdomar kan bekämpas på ett effektivare sätt.

(2) För att de diagnosmetoder för vesikulär svinsjuka (SVD) som används i medlemsstaterna skall kunna samordnas, i samråd med kommissionen, fastställs i bilaga III till direktiv 92/119/EEG vilka uppgifter och skyldigheter som åligger gemenskapens referenslaboratorium för denna sjukdom. Till dessa åligganden hör genomförandet av regelbundna jämförande test och tillhandahållande av standardreagens på gemenskapsnivå.

(3) Nyligen utvecklade laboratorietest gör det möjligt att snabbt diagnostisera vesikulär svinsjuka (SVD) samt att skilja denna sjukdom från mul- och klövsjuka.

(4) Resultaten från de senaste jämförande test som utförts på gemenskapsnivå tyder på att det finns tillförlitliga test för att påvisa antigen och virusgenom för SVD-virus samt att dessa test kan bli ett viktigt komplement till virusisoleringtest när det gäller att diagnostisera vesikulär svinsjuka (SVD).

(5) De senaste årens erfarenheter från bekämpningen av vesikulär svinsjuka (SVD) har lett till att man kunnat fastställa vilka provtagningsmetoder som är mest ändamålsenliga samt vilka kriterier som bör användas vid tolkningen av resultaten från laboratorietesten i syfte att ställa en korrekt diagnos för sjukdomen under olika förhållanden.

(6) Yttrandet och rekommendationerna beträffande vesikulär svinsjuka (SVD) från Vetenskapliga kommittén för djurs hälsa och välbefinnande har beaktats.

(7) De åtgärder som föreskrivs i detta beslut är förenliga med yttrandet från Ständiga veterinärkommittén.

HÄRIGENOM FÖRESKRIVS FÖLJANDE.

Artikel 1

1. Medlemsstaterna skall se till att påvisandet av vesikulär svinsjuka (SVD) och differentialdiagnosen till mul- och klövsjuka grundar sig på följande faktorer:

a) Kliniska tecken på sjukdomen.

b) Påvisande av virus, antigen eller virusgenom i prov från epitelvävnad, vätska från blåsorna eller avföring.

c) Påvisande av specifik antikroppsreaktion i serumprov.

De skall också se till att undersökningen sker med hjälp av de diagnos- och provtagningsmetoder samt utvärderingskriterier för resultat från laboratorietest som fastställs i den handbok som bifogas detta beslut.

2. De nationella diagnostiska laboratorier som avses i bilaga II.5 till direktiv 92/119/EEG får dock tillämpa modifierade varianter av de laboratorietest som avses i handboken eller använda sig av andra test, under förutsättning att man kunnat visa att testen har samma känslighet och specificitet.

Känsligheten och specificiteten hos dessa modifierade eller alternativa test skall utvärderas genom de återkommande jämförande test som utförs av gemenskapens referenslaboratorium för vesikulär svinsjuka (SVD).

Artikel 2

Detta beslut skall tillämpas från och med den 1 oktober 2000.

Artikel 3

Detta beslut riktar sig till medlemsstaterna.

Utfärdat i Bryssel den 4 juli 2000.

På kommissionens vägnar

David Byrne

Ledamot av kommissionen

(1) EGT L 62, 15.3.1993, s. 69.

BILAGA

HANDBOK MED METODER FÖR DIAGNOS OCH PROVTAGNING SAMT KRITERIER FÖR UTVÄRDERING AV RESULTATEN FRÅN LABORATORIETEST FÖR PÅVISANDE OCH DIFFERENTIALDIAGNOS AV VESIKULÄR SVINSJUKA (SVD)

KAPITEL I

Inledning, syfte och definitioner

1. Om den här handboken

a) Handboken innehåller riktlinjer och minimikrav för diagnos- och provtagningsmetoder avseende vesikulär svinsjuka (SVD). Den anger också kriterier för utvärdering av resultaten från laboratorietest som gör det möjligt att korrekt diagnostisera denna sjukdom. Särskild vikt läggs också vid differentialdiagnosen till mul- och klövsjuka.

b) Genom handboken integreras bestämmelserna i bilaga II till direktiv 92/119/EEG, särskilt punkterna 4, 7 och 8.

c) Handboken riktar sig i första hand till de myndigheter som ansvarar för bekämpningen av vesikulär svinsjuka (SVD). Tyngdpunkten ligger därför på principerna bakom laboratorietesten, tillämpningen av testen, samt utvärderingen av resultaten från dessa, snarare än på detaljerade laboratoriemetoder.

2. I handboken används följande beteckningar med motsvarande definitioner:

a) seropositivt svin: svin som vid ett virusneutralisationstest utfört av det nationella laboratoriet har en antikroppstiter i serum som är lika med eller högre än titern för det referensserum 4 för vesikulär svinsjuka (SVD) som avses i kapitel X.

b) "singleton reactor": ett enskilt seropositivt svin som befinner sig på en anläggning och som har genomgått ett serologiskt test avseende vesikulär svinsjuka (SVD) med positivt resultat men som under sin levnad inte kommit i kontakt med SVD-virus och för vilket det inte finns några belägg för spridning av infektionen till kontaktsvin. Ett seropositivt svin skall anses vara "singleton reactor" om de villkor som avses i kapitel VIII C är uppfyllda.

c) kontaktsvin: svin som har eller som under de senaste 28 dagarna har haft direkt kontakt med ett eller flera seropositiva svin eller med ett eller flera svin som misstänks vara smittade med SVD-virus. Det kan vara så att kontaktsvinen vistas eller har vistats i samma box eller intilliggande boxar, om det är möjligt för svinen att komma i kontakt med varandra genom boxarnas sidor.

KAPITEL II

Riktlinjer för kontroller på svin som visar kliniska tecken på vesikulär svinsjuka (SVD)

1. Om det finns misstanke om SVD-virus på en anläggning skall medlemsstaterna se till att ett statistiskt signifikant antal svin så snart som möjligt kontrolleras av den officiella veterinären så att det är möjligt att upptäcka de kliniska sjukdomstecken som avses i kapitel IX.

2. Om svin uppvisar kliniska tecken som tyder på vesikulär svinsjuka (SVD) eller mul- och klövsjuka skall medlemsstaterna se till att det så snart som möjligt ställs en differentialdiagnos med hjälp av lämpliga provtagningsmetoder och laboratorieundersökningar och enligt de bestämmelser som avses i kapitlen IV, VII och VIII i den här handboken.

KAPITEL III

Allmänna bestämmelser om provtagning och transport av prov

1. Alla personer som kommer in på eller lämnar sådana svinanläggningar där det finns en misstanke om vesikulär svinsjuke (SVD) skall vidta alla hygienåtgärder som krävs för att minska risken för förorening och spridning av virus.

2. Svin som provtagits skall förses med en märkning som gör att varje enskilt svin kan identifieras vid en eventuell upprepad provtagning. Det rekommenderas att man för varje svin som provtas på anläggningen registrerar var det befinner sig, liksom vilket identifieringsnummer det har. Detta gäller särskilt om prov tas från misstänkta svin.

3. Proven skall skickas till laboratoriet tillsammans med relevanta dokument som bl.a. redogör för bakgrunden för de svin som provtagits samt kliniska tecken som eventuellt observerats.

4. Eftersom alla typer av blåsor hos svin kan tyda på mul- och klövsjuka skall särskild försiktighet iakttas då de misstänkta proven förpackas. Det är särskilt viktigt att de behållare som används inte går sönder eller läcker och att föroreningar undviks, men det bör också säkerställas att proven kommer fram i godtagbart skick. Om en förpackning innehåller is får det inte läcka ut något vatten. Behållare med prov som misstänks innehålla SVD-virus får aldrig öppnas från det att de lämnar den infekterade anläggningen till dess att de kommer fram till laboratoriet.

5. Prov som misstänks innehålla SVD-virus får bara analyseras på laboratorier som är godkända för hantering av mul- och klövsjukevirus för diagnostiska ändamål, enligt gemenskapens lagstiftning om bekämpning av mul- och klövsjuka, om inte mul- och klövsjuka redan har uteslutits.

6. Om transporttiden till laboratoriet är mindre än 48 timmar räcker det att proven håller temperaturen 4 °C, i övriga fall skall transporten ske vid en temperatur på högst 20 °C.

7. Prov som är avsedda för gemenskapens referenslaboratorium och som kommer från andra medlemsstater än Förenade kungariket skall transporteras med flygfrakt till London-Heathrow eller London-Gatwick. Innan provet skickas iväg måste laboratoriet informeras via fax (44) 1483-23 26 21 eller e-post om vilken flight det gäller, datum, förväntad ankomsttid samt flygfraktsedelns nummer, så att paketet kan identifieras när det kommer fram. Paketet skall adresseras till Institute for Animal Health Pirbright Laboratory Community Reference Laboratory for swine vesicular disease Ash Road, Pirbright, Woking Surrey GU24 ONF England , UK

Följande uppgifter skall också anges på etiketten:

"Animal Pathological Material of no commercial value. Perishable. Fragile. To be collected at airport by addressee. Not to be opened outside the laboratory" (Djurpatologiskt material utan kommersiellt värde. Lättförstörbart. Bräckligt. Hämtas på flygplatsen av mottagaren. Får inte öppnas utanför laboratoriet).

Paketen måste hämtas på flygplatsen av personal från gemenskapens referenslaboratorium enligt ett särskilt importtillstånd som utfärdats för detta syfte av ministeriet för jordbruk, livsmedel och fiske. Detta är ett stående arrangemang och det krävs inget separat intyg för varje importtillfälle. Det är inte tillåtet för icke godkänd personal att ta med sig misstänkt material från svinblåsor som handbagage till Förenade kungariket. Budfirmor får inte användas.

8. Transporten av prov till de nationella laboratorierna skall ske enligt de anvisningar som utfärdats av medlemsstaternas behöriga myndigheter.

KAPITEL IV

Provtagningsmetoder för anläggningar med kliniskt misstänkta svin

1. Om det till följd av att djur på en anläggning visar tecken på vesikulär svinsjuka (SVD) finns en misstanke om att SVD-virus förekommer på denna anläggning skall lämpliga prov tas från representativa grupper av svin som uppvisar dessa tecken så att det kan bekräftas om sjukdomen förekommer och så att det går att ställa differentialdiagnos till mul- och klövsjuka.

2. De prov som i första hand bör tas från dessa anläggningar för att en diagnos skall kunna ställas är epitelvävnad och vätska från blåsor som inte spruckit eller som nyligen spruckit. Dessa prov skall tas från svin som visar typiska tecken på sjukdomen och de skall analyseras med avseende på SVD-virus, antigen mot detta virus eller virusgenom. Det rekommenderas att prov tas från fem eller sex svin.

3. Även om det finns färsk epitelvävnad och vätska från blåsorna i tillräckliga mängder (1 g eller mer) skall också följande prov tas:

a) Blodprov från misstänkta svin och kontaktsvin för serologisk testning.

b) Avföringsprov för virologisk testning. Proven skall tas från misstänkta svin, från golvet i deras boxar samt från angränsande boxar.

4. Proven skall tas och transporteras på följande sätt:

a) Epitelvävnad och vätska från blåsorna:

- Om det är möjligt skall minst 1 g epitelvävnad tas från en blåsa som inte spruckit eller som nyligen spruckit. Det rekommenderas att svinen får någon typ av lugnande preparat innan proven tas, både för att undvika att personalen skadas och av djurskyddsskäl.

- Om transporten till det nationella laboratoriet sker omedelbart (mindre än tre timmar) efter provtagningen kan epitelprov transporteras utan transportmedium om de hålls kylda. Om den förväntade transporttiden är längre än tre timmar skall dock proven placeras i en liten volym transportmedium bestående av lika delar glycerol och 0,04 M fosfatbuffert eller motsvarande buffert (hepes) så att pH ligger inom det optimala intervallet för mul- och klövsjukevirus (pH 7,2-7,6). Transportmediet skall innehålla antibiotika för att motverka andra typer av mikroorganismer. Följande typer av antibiotika är lämpliga att använda, i de angivna slutkoncentrationerna:

i) penicillin 1000 IU

ii) neomycinsulfat 100 IU

iii) polymyxin B-sulfat 50 IU

iv) mycostatin 100 IU

- Om vätska tas från blåsor som inte spruckit skall denna vätska förvaras outspädd i en särskild behållare.

b) Blodprov:

- Blodprov kan tas för serologiska eller virologiska test. Vanligen tas de dock bara från svin som misstänks ha återhämtat sig från en klinisk eller subklinisk infektion och används sedan för antikroppstest. Anledningen till att de inte används för virustest i lika hög grad är att andra typer av prov är mer lämpade för detta, t.ex. epitelvävnad, vätska från blåsorna och avföringsprov från svin som uppvisar kliniska sjukdomstecken. Det rekommenderas att helblodsprov tas med hjälp av vacutainerrör utan antikoaguleringsmedel, och att dessa rör sedan transporteras i oöppnat skick.

c) Avföringsprov:

- Avföringsprov från golvet i den anläggning som misstänks ha eller ha haft svin som är infekterade med SVD-virus, eller bomullspinnar med avföringsprov samt vanliga avföringsprov från misstänkta levande svin skall placeras i kraftiga behållare som inte läcker.

Behållare med misstänkta prov skall desinficeras på utsidan innan de transporteras till laboratoriet. Lämpliga desinfektionsmedel är

- natriumhydroxid (spädning 1:100),

- formalin (en formalinlösning som innehåller minst 34 % formaldehyd späds 1:9), och

- natriumhypoklorit (2 % fritt klor).

Dessa desinfektionsmedel måste hanteras varsamt.

KAPITEL V

Provtagningsmetoder avseende vesikulär svinsjuka (SVD) vid seroövervakning

1. När seroövervakning genomförs i något av följande syften:

a) för övervakning på anläggningar för vilka det inte finns några belägg för eller någon misstanke om att sjukdomen finns,

b) för övervakning på slakterier, marknadsplatser, uppsamlingscenter eller liknande platser genom rutinmässig serologisk provtagning, eller

c) för icke-diskriminerande övervakning av svin från andra medlemsstater på importanläggningen

skall blodprov för serologiska test tas från svinen antingen enligt bestämmelserna i de program eller planer för övervakning och utrotning som godkänts i enlighet med rådets beslut 90/424/EEG(1) eller rådets direktiv 90/425/EEG(2), eller, om inga sådana bestämmelser finns, enligt bestämmelser som medlemsstaternas behöriga myndigheter utfärdat.

2. När seroövervakning genomförs i något av följande syften:

a) för övervakning av anläggningar som ligger inne i en skydds- eller övervakningszon och som har fastställts efter ett bekräftat utbrott av sjukdomen enligt bilaga II.7-8 i direktiv 92/119/EEG, eller

b) för övervakning av de anläggningar som avses i artikel 9 i direktiv 92/119/EEG

skall blodprov för serologiska test tas från svinen enligt följande system:

- När det gäller avelsanläggningar skall proven tas slumpmässigt så att det med 95 % konfidens går att upptäcka en prevalens på 5 %.

- När det gäller anläggningar som bara har slaktsvin skall det totala antalet prov som tas åtminstone motsvara det antal som krävs för att med 95 % konfidens upptäcka en prevalens på 5 %. Proven skall också tas från så många slumpmässigt utvalda boxar som möjligt.

- När det gäller anläggningar som både innehåller djur för avel och för slakt skall varje grupp svin som hålls i en separat enhet provfas på ett sådant sätt att det med 95 % konfidens går att upptäcka en prevalens på 5 % avseende serokonversion.

KAPITEL VI

Ytterligare åtgärder samt metoder för tagning av nya prov då seropositiva svin upptäcks

1. Om bara ett seropositivt svin upptäcks på en anläggning vid den övervakning som avses i kapitel V.1 a eller kapitel V.2 skall den behöriga myndigheten se till att

a) de åtgärder som avses i artikel 4 i direktiv 92/119/EEG vidtas på anläggningen, om de inte redan vidtagits,

b) en kontroll görs på anläggningen enligt de bestämmelser som avses i kapitel II.1, och att

c) blodprov tas för serologisk testning från

- det misstänkta svinet, och

- kontaktsvin som hålls i samma eller angränsande boxar som det misstänkta svinet. Prov från dessa svin skall tas på sådant sätt att man med 95 % konfidens kan upptäcka en prevalens på 50 % av serokonverterade djur i boxen.

2. Den behöriga myndigheten får dock besluta att inte längre tillämpa de åtgärder som avses i punkt 1 a om

a) den epidemiologiska undersökning som utförs enligt artikel 8 i direktiv 92/119/EEG tyder på att vesikulär svinsjuka (SVD) inte har förts in på anläggningen,

b) inga kliniska tecken på vesikulär svinsjuka (SVD) har upptäckts på anläggningen, och

c) anläggningen inte ligger i en övervakningszon eller i en zon som är föremål för restriktioner till följd av ett bekräftat sjukdomsutbrott och om anläggningen inte är föremål för andra restriktioner i samband med ett bekräftat utbrott av sjukdomen, och

på villkor att

- inga svin flyttas från anläggningen för att användas för handel inom gemenskapen, och

- de svin som flyttas från anläggningen antingen transporteras till slakteriet för omedelbar slakt eller till en annan anläggning från vilken inga svin används för handel inom gemenskapen,

till dess att resultatet av de ytterligare kontrollerna och de serologiska testen visar att förekomst av vesikulär svinsjuka (SVD) helt kan uteslutas.

3. Om de kontroller och serologiska test som avses i punkt 1 b-c ovan

a) ger negativt resultat eller om bara det tidigare kända seropositiva svinet bekräftas vara positivt ("singleton reactor") kan vesikulär svinsjuka (SVD) uteslutas. De åtgärder som avses i punkt 1 a skall ej längre tillämpas såvida inte anläggningen ligger i en skydds- eller övervakningszon som upprättats runt platsen för ett sjukdomsutbrott i de fall där åtgärderna för att utrota sjukdomen skall fortsätta att tillämpas enligt punkt 7 eller punkt 8 i bilaga II till direktiv 92/119/EEG,

b) tyder på att det finns mer än ett seropositivt svin på anläggningen skall antingen förekomsten av vesikulär svinsjuka (SVD) bekräftas eller, om de villkor för bekräftelse av sjukdomen som fastställs i bilaga II.4 till rådets direktiv 92/119/EEG inte är uppfyllda, ytterligare prov tas på anläggningen med hjälp av de metoder som avses i punkt 5.

4. Om mer än ett seropositivt svin upptäcks på en anläggning efter den provtagning och serologiska testning som avses i kapitel V.1 a eller c eller kapitel V.2 men de villkor för bekräftelse av sjukdomen som fastställs i bilaga II.4 till direktiv 92/119/EEG inte är uppfyllda, skall den behöriga myndigheten se till att

a) de bestämmelser som avses i artikel 4 i direktiv 92/119/EEG börjar att tillämpas eller att tillämpningen av dessa bestämmelser fortsätter,

b) en kontroll görs på anläggningen enligt de bestämmelser som avses i kapitel II.1,

c) blodprov för serologisk testning tas från de seropositiva svinen och kontaktsvinen enligt punkt 1 c,

d) blodprov för serologisk testning tas från svin i övriga byggnader på anläggningen enligt den metod som avses i kapitel V.2,

e) ett tillräckligt antal avföringsprov för virologiska test tas från

- de seropositiva svinen,

- golvet i de boxar som innehåller seropositiva svin samt från angränsande boxar,

- slumpvis utvalda boxar från andra byggnader på anläggningen.

Avföringsprov som tagits enligt första och andra strecksatsen ovan skall undersökas så snart det är möjligt. Om dessa prov visar sig vara negativa men resultaten från de serologiska testen antyder att SVD-virus kan ha spritt sig till andra byggnader, skall också de avföringsprov som tagits enligt tredje strecksatsen ovan undersökas.

Om de villkor som fastställs i bilaga II.4 till direktiv 92/119/EEG inte är uppfyllda när det gäller att bekräfta förekomst av vesikulär svinsjuka (SVD) efter det dessa ytterligare kontroller och test utförts, skall de seropositiva svinen avlivas eller slaktas i enlighet med de bestämmelser som avses i bilaga II.4 d till direktiv 92/119/EEG. Om ytterligare svin har befunnits vara seropositiva utöver dem om redan konstaterats vara seropositiva vid den tidigare provtagningen skall dock de bestämmelser och förfaranden som fastställs i a-e ovan gälla i tillämpliga delar.

5. Utan att det påverkar tillämpningen av de åtgärder som avses i artikel 9 i direktiv 92/119/EEG skall den behöriga myndigheten, om ett eller flera seropositiva svin har upptäckts genom den övervakning som avses i kapitel V.1 b eller kapitel V.1 c, se till följande:

a) Om det är nödvändigt och möjligt skall ytterligare kontroller i form av bland annat provtagning utföras för att bekräfta eller utesluta förekomst av vesikulär svinsjuka (SVD) på den plats där de seropositiva svinen upptäcktes och med beaktande av lokala förhållanden.

b) De åtgärder som avses i artikel 4 i direktiv 92/119/EEG skall vidtas på svinens ursprungsanläggning.

c) En kontroll skall göras på svinens ursprungsanläggning enligt de bestämmelser som avses i kapitel II.1.

d) Blodprov skall tas för serologisk testning från svin på ursprungsanläggningar med seropositiva svin, i enlighet med de bestämmelser som avses i kapitel V.2.

6. Den behöriga myndigheten får dock besluta att inte längre tillämpa de åtgärder som avses i punkt 5 b om

a) den epidemiologiska undersökning som utförs enligt artiklarna 4 och 8 i direktiv 92/119/EEG tyder på att vesikulär svinsjuka (SVD) inte har förts in på anläggningen,

b) inga kliniska tecken på vesikulär svinsjuka (SVD) har upptäckts på anläggningen, och

c) anläggningen inte ligger i en övervakningszon eller i en zon som är föremål för restriktioner till följd av ett bekräftat sjukdomsutbrott och om anläggningen inte är föremål för andra restriktioner i samband med ett bekräftat utbrott av sjukdomen, och

på villkor att

- inga svin flyttas från anläggningen för att användas för handel inom gemenskapen,

- de svin som flyttas från anläggningen antingen transporteras till slakteriet för omedelbar slakt eller till en annan anläggning från vilken inga svin används för handel inom gemenskapen,

till dess att resultatet av de ytterligare kontroller och serologiska test som gjorts på den plats där de seropositiva svinen upptäckts och på ursprungsanläggningen visar att förekomst av vesikulär svinsjuka (SVD) helt kan uteslutas.

KAPITEL VII

Principer för och tillämpning av virologiska test samt utvärdering av resultatet från dessa

A. Påvisande av virusantigen

1. Indirekt sandwich-ELISA-teknik har ersatt komplementbindningstest som den. viktigaste metoden för påvisande av virusantigen för vesikulär svinsjuka (SVD). Testet är identiskt med det som används för diagnos av mul- och klövsjuka. Testen för de båda sjukdomarna skall utföras vid samma tillfälle såvida inte mul- och klövsjuka redan har uteslutits. Det rekommenderas särskilt att dessa prov används på prov från epitelvävnad och blåsor från kraftigt infekterade svin där både SVD- och mul- och klövsjukevirus kan finnas i hög titer och att analysen görs inom ett fåtal timmar(3).

Belägg två brunnsrader i 96-håls ELISA-plattor med kanin-antiserum mot SVD-virus respektive mot var och en av de sju aerotyperna av mul- och klövsjukevirus. Detta är de primära antikropparna som fungerar som uppfångare av antigen i efterföljande steg. Suspensionerna av det prov som skall testas tillsätts i de båda brunnsraderna. Lämpliga kontroller görs. I nästa steg tillsätts homologt detekterande serum från marsvin till respektive rader, följt av kanin anti-marsvin-serum konjugerat till ett enzym, till exempel pepparrotsperoxidas. Mellan varje steg görs en noggrann tvättning för att avlägsna ej bundet material. Positiv reaktion innebär att det sker en färgförändring vid tillsats av kromogen och substrat. Starkt positiva reaktioner syns med blotta ögat, men resultaten kan också avläsas spektrofotometriskt, och i dessa fall innebär en absorbans på 0,1 enheter över bakgrundsnivån att reaktionen är positiv.

2. Alternativa ELISA-metoder där utvalda monoklonala antikroppar används som bindande antikroppar och peroxidaskonjugerade monoklonala antikroppar som detekterande antikroppar kan användas för påvisande av SVD-antigen och för differentialdiagnos till mul- och klövsjuka i prov från epitelvävnad, vätska från blåsorna eller infekterad vävnadskultur.

3. För undersökningar av den antigeniska variationen mellan olika stammar av SVD-virus kan en ELISA-metod baserad på monoklonala antikroppar användas. Vävnadsodlat virusantigen fångas upp med hyperimmunt kaninantiserum mot vesikulär svinsjuka (SVD) som adsorberats till den fasta fasen. Lämpliga paneler av monoklonala antikroppar tillsätts sedan till antigenbelagda plattor och de monoklonala antikropparnas bindning till fältstammar jämförs med bindningen till moderstammar. Likheter i bindning tyder på att det finns liknande epitoper på moder- och fältstammarna.

B. Isolering och odling av virus

1. Klarnade suspensioner av epitelvävnadsprov, vätska från blåsorna eller avföring som misstänks innehålla SVD-virus skall rutinmässigt ympas på mottagliga cellkulturer. Om prov från spruckna blåsor inte finns i tillräcklig mängd eller av godtagbar kvalitet för att genast kunna analyseras med ELISA-teknik är det nödvändigt att uppföröka virus i vävnadskultur för att få tillräckligt stor mängd virusantigen.

2. Vid isolering och odling av virus ympas klarnade suspensioner av epitelvävnad på en monolagerodling av IB-RS-2-celler. Epitelvävnadssupensionen skall spädas två gånger, en stark spädning (1/500) och en svag (1/10), för att undvika att tillväxten hos SVD-virus påverkas av frisatt interferon. Vid isoleringen av virus tillsätts bara antibiotika till uppehållsmediet. För differentialdiagnos till mul- och klövsjukevirus ympas också primära bovina sköldkörtelceller eller njurceller från hamsterungar (BHK-21).

3. Om en cytopatisk effekt inträder skall supernatanten skördas från positiva kulturer när effekten är fullständig och användas i ett ELISA-test för identifiering av virus. Negativa kulturer skall ympas på färsk vävnadskultur i 48 eller 72 timmar och undersökas högst 72 timmar senare som en blindpassage. Om ingen cytopatisk effekt uppträder kan provet efter ytterligare en blindpassage förklaras vara negativt när det gäller levande virus.

4. Suspensioner av avföringsprov kan behandlas enligt punkt 1. Eftersom det i allmänhet finns mindre virus i avföring än i epitelvävnad är det viktigt att använda en tredje blindpassage om ingen cytopatisk effekt kan påvisas under de två första passagen.

5. Samtidig ympning av en cellinje från svin och en cellinje från en av ovannämnda vävnadsodlingssystem (helst primära bovina sköldkörtelceller) ger en viktig antydan om huruvida prov från blåsor innehåller SVD- eller mul- och klövsjukevirus, eftersom den förra typen bara kan odlas i svinceller. Isolat av mul- och klövsjukevirus som under en längre tid har överförts mellan svin kan dock i vissa fall tillväxa bättre i odlingar av svinceller.

C. Polymeras-kedjereaktion (PCR) för påvisande av virusgenom

1. Metoder för påvisande av nukleinsyra kan användas för att detektera SVD-virusgenom i kliniskt material med hjälp av polymeras-kedjereaktion (PCR) samt för att fastställa förhållandet mellan isolat av SVD-virus genom bestämning av nukleotidsekvensen för delar av genomet. Metoder som bygger på PCR har utvecklats för att göra diagnosen känsligare. Närbesläktade metoder som bygger på användning av omvänt transkriptas-PCR finns också beskrivna, och i dessa används primrar som motsvarar starkt konservativa regioner i 1 C- och 1 D-generna.

2. PCR-tekniken är snabb (resultaten vanligen inom 24 timmar), den kan användas för påvisande av alla genotyper av SVD-virus, och den är tillräckligt känslig för att användas på prov som samlats in från misstänkta kliniska sjukdomsfall.

3. Om det finns misstanke om subklinisk infektion eller om prov samlas in efter det att klinisk sjukdom har konstaterats eller vid behandling av avföringsprov erbjuder förbättrade RT-PCR-metoder i form av exempelvis "nested RT-PCR", immun-PCR, ELISA-PCR och mer förfinade extraktionsmetoder för RNA ett minst lika känsligt detektionssystem som samtidigt är betydligt snabbare än vävnadsodling i flera steg.

4. 1 D-genen kodar för ett stort strukturprotein med beteckningen VP1. Genom sekvensering av omkring 200 av 1D-genens nukleotider är det möjligt att gruppera stammar av SVD-virus efter sekvensernas grad av homologi och att epidemiologiskt relatera stammar som orsakar sjukdom i olika regioner eller vid olika tidpunkter.

D. Utvärdering av resultaten från de virologiska testen

Påvisandet av antigen eller genom från SVD-virus genom ELISA och PCR har samma diagnostiska värde som virusisolering.

Som referenstest används dock isolering av virus, och detta test måste i vissa fall användas för att bekräfta resultaten, särskilt om ett positivt testresultat genom ELISA eller PCR inte kan kopplas till

a) upptäckt av kliniska sjukdomstecken,

b) upptäckt av seropositiva svin, eller

c) ett direkt epidemiologiskt samband med ett bekräftat utbrott.

KAPITEL VIII

Principer för och tillämpning av serologiska test samt utvärdering av resultat

A. Virusneutralisationstest (VN)

1. Det kvantitativa VN-mikrotestet för påvisande av antikroppar mot SVD-virus utförs på celler av typen IB-RS-2 eller likvärdigt cellbaserat testsystem i flatbottnade mikrotiterplattor för vävnadsodling.

2. Virus odlas i monolager av IB-RS-2-celler och lagras antingen vid -20 °C efter tillsats av 50 % glycerol eller vid -70 °C utan glycerol. Före testning inaktiveras serumen i 30 minuter vid 56 °C.

B. ELISA-metoder

1. För påvisande av antikroppar används kompetitiv ELISA med monoklonala antikroppar. Om serumprovet innehåller antikroppar mot SVD-virus kommer bindningen av en viss peroxidaskonjugerad monoklonal antikropp till virusantigenet att hindras.

Metoden innebär att SVD-virusantigenet binds till den fasta fasen med monoklonala antikroppar. Därefter inkuberas serumproven i lämplig spädning följt av tillsättning av peroxidaskonjugerade monoklonala antikroppar. Inhiberingen av de monoklonala antikropparnas bindning mäts med hjälp av substrat och kromogen.

2. En indirekt ELISA-metod med isotypspecifika monoklonala antikroppar för att påvisa svin IgG eller IgM som är specifika för SVD-virus är ett användbart verktyg för att uppskatta när svinen infekterades eller när en viss anläggning nåddes av infektionen.

Vid isotypspecifik ELISA binds virusantigenet till den fasta fasen med hjälp av en antigenbindande antikropp. Om serumprovet innehåller antikroppar mot SVD-virus kan dessa påvisas med anti-svin IgG eller en monoklonal antikropp av typen anti-svin IgM som konjugerats med peroxidas. Bindningens omfattning mäts med hjälp av substrat och kromogen.

Isotypspecifik ELISA kan också vara användbart för att skilja svin av typen "singleton reactor" från verkligt positiva svin, enligt C nedan.

C. Tillämpning av serologiska test och utvärdering av resultat

1. De rekommenderade serologiska testen är virusneutralisationstest och ELISA-test. I kapitel X förtecknas motsvarande referensserum som tillhandahålls av gemenskapens referenslaboratorium. Syftet med detta är att standardisera de serologiska test som används i gemenskapen.

Som referenstest bör virusneutralisationstestet användas. Detta har dock nackdelen att det tar 2-3 dagar att få fram resultat och det måste finnas tillgång till utrustning för vävnadsodling.

ELISA-test är snabbare och kan lättare standardiseras. Den kompetitiva ELISA-metod där man använder sig av monoklonala antikroppar är den mest tillförlitliga antikroppsbaserade ELISA-metod för vesikulär svinsjuka (SVD) som hittills beskrivits. Den rekommenderas som screeningtest om antalet prov är stort.

Virusneutralisationstestet skall dock användas som kontroll där så är nödvändigt, särskilt efter det att positiva prov tagits för första gången på en anläggning. Svin som har fått positivt resultat på ett ELISA-test men negativt resultat på ett VN-test behöver inte tas med.

2. Det kan misstänkas att ett svin är av typen "singleton reactor"(4) om ett enda seropositivt svin upptäcks och dessutom följande villkor är uppfyllda:

a) Det finns inga kliniska sjukdomstecken bland djuren på anläggningen.

b) Det finns inga relevanta uppgifter om tidigare kliniska sjukdomar på anläggningen.

c) Det finns inga uppgifter om tidigare kontakt med ett känt utbrott av sjukdomen.

3. Det anses bekräftat att ett svin tillhör typen "singleton reactor" då

a) inga andra seropositiva svin upptäcks vid ett senare test,

b) provtagning på kontaktsvin efter upptäckt av en "singleton reactor" inte visar på någon serokonversion, och

c) antikroppstitern vid upprepad provtagning förblir konstant eller minskar.

4. Följande ytterligare förhållanden och principer skall dock också beaktas då man försöker ta reda på om ett svin är av typen "singleton reactor":

a) Djur av denna typ har en prevalens på ungefär 1 per 1000 svin.

b) Serum från svin av typen "singleton reactor" har i allmänhet följande egenskaper:

- Låg antikroppstiter vid virusneutralisationstest.

- De visar nätt och jämnt positiv reaktion vid kompetitiv ELISA med monoklonala antikroppar.

- Endast IgM och inget IgG vid ELISA-test med isotypspecifika SVD-antikroppar(5).

KAPITEL IX

Kliniska tecken och egenskaper hos vesikulär svinsjuka (SVD)

Vesikulär svinsjuka (SVD) är en smittsam svinsjukdom som orsakas av ett enterovirus av Picornaviridae-familjen. Sjukdomen kan vara subklinisk, mild eller allvarlig beroende på virusstam, infektionsväg, infektionsdos samt förhållandena på den anläggning där svinen hålls. Andra stressfaktorer som t.ex. transporter, sammanfösning med andra svin eller extrema temperaturer kan också göra att kliniska tecken lättare utvecklas.

Sjukdomen utmärks av lätt feber samt blåsor på övre delen av klövarna, trampdynorna och på huden på fram- och bakbenen. Mindre ofta uppträder blåsorna på nos, läppar, tunga och spenar. Sjukdomsfrekvensen kan vara så hög som 100 % men dödligheten är mycket låg eller noll.

Infektionen kan utvecklas subkliniskt eller i en mild form så att den bara märks genom en övergående försämring av svinens allmäntillstånd. Antikroppar som neutraliserar viruset utvecklas då på några få dagar(6).

Eftersom sjukdomen kan uppträda i subklinisk eller mild form misstänker man den ofta först efter serologiska test i samband med sjukdomsövervakning eller utfärdande av exportintyg. De senaste europeiska utbrotten av sjukdomen har karaktäriserats av mindre allvarliga eller inga kliniska tecken, vilket gör att serologiska metoder ofta måste tillgripas för diagnos.

De kliniska tecknen på vesikulär svinsjuka (SVD) går dock inte att skilja från tecknen på mul- och klövsjuka. Alla tillstånd där blåsor uppträder måste till en början behandlas som mul- och klövsjuka och differentialdiagnos skall ställas så snabbt som möjligt.

Inkubationstiden för vesikulär svinsjuka (SVD) hos enskilda svin ligger vanligen på mellan två och sju dagar. Därefter kan övergående feber på upp till 41 °C uppträda, men det kan dröja längre innan de kliniska tecknen upptäcks på en anläggning. Blåsor utvecklas då på klövarms övre del, i typiska fall på gränsen till bakhoven. Blåsorna kan täcka hela den övre delen av hoven och leda till att denna faller av. Mer sällsynt kan blåsor också uppträda på nosen, särskilt på den övre delen, på läpparna, tungan och spenarna. Ytliga erosioner kan drabba knäna. Smittade svin kan bli förlamade och vara oförmögna att stå i ett par dagar.

Yngre svin drabbas hårdare, även om dödligheten - till skillnad från vid mul- och klövsjuka - är mycket låg.

Sjukdomstecken som hänför sig till nervsystemet har rapporterats, även om de är sällsynta. Missfall är inte något typiskt kännetecken på vesikulär svinsjuka (SVD). Hjärtsvikt på grund av multifokal myokardit kan vara ett tecken på mul- och klövsjuka och encefalomyokardit, särskilt hos mindre smågrisar, men det är inget tecken på vesikulär svinsjuka (SVD).

Svinen återhämtar sig i regel helt och hållet efter 2-3 veckor, och det enda spåret av infektionen är då en mörk, tvärgående linje på hoven där tillväxten tillfälligt avbrutits.

Drabbade svin kan utsöndra virus från tryne och mun samt från avföringen upp till 48 timmar innan de kliniska tecknen visar sig. Virusproduktionen är som störst under de första sju dagarna efter infektion, och utsöndringen av virus från näsa och mun upphör vanligen inom två veckor. Virus kan isoleras från avföringen upp till 20 dagar efter infektion, och det finns rapporter om att virus påträffats där i upp till tre månader. Virus kan också under en längre tid återfinnas i den nekrotiska vävnad som finns i anslutning till spruckna blåsor, samt i avföring.

KAPITEL X

Referensserum för vesikulär svinsjuka (SVD)

>Plats för tabell>

(1) EGT L 224, 18.8.1990, s. 19.

(2) EGT L 224, 18.8.1990, s. 29.

(3) Positivt resultat på ELISA-testet innebär att virusmängden i provet är minst 105 TCID50 (Tissue Culture Infectious Doses).

(4) En liten andel djur av typen "singleton reactor" kan upptäckas genom något av de nu befintliga serologiska testen för vesikulär svinsjuka (SVD). Det är inte känt vad som ligger bakom förekomsten av djur av typen "singleton reactor". Serologiska korsreaktioner med SVD-virus kan tänkas uppkomma på grund av infektion med andra, ännu oidentifierade, picornavirus eller hänföras till andra icke-specifika faktorer i serum.

(5) I serumprov från svin som är infekterade med SVD-virus kan man i regel bara påvisa specifika IgG eller både IgG och IgM, medan serum från djur av typen "singleton reactor" i allmänhet bara innehåller IgM. Specifika IgG går inte att påvisa i serumprov från svin som infekterats med SVD-virus under de föregående 10-14 dagarna, trots att specifika IgG bör kunna påvisas vid ett andra blodprov. Nyligen infekterade svin kan dock inte säkert skiljas från djur av typen "singleton reactor" innan deras immunreaktion ändras från produktion av IgM till produktion av IgG. Se även kapitel IX och fotnot 6.

(6) Specifika 1gM kan vanligen påvisas i blodet 2-3 dagar efter infektion och de försvinner efter cirka 30-50 dagar. Specifika IgG kan vanligen påvisas i blodet 10-14 dagar efter infektion och finnas kvar i några år. Ig-isotypen kan påvisas med den ELISA-metod som beskrivs i kapitel VIII B.2.