—

Sublot: je del večjega lota, ki je določen za vzorčenje. Vsak sublot mora biti fizično ločen od preostalega dela lota in določljiv.

—

Primarni vzorec: je količina materiala, vzetega iz enega mesta v lotu ali sublotu.

—

Sestavljeni vzorec: je vzorec, sestavljen iz vseh primarnih vzorcev, vzetih iz lotov ali sublotov.

—

Laboratorijski vzorec: je reprezentativni del/količina sestavljenega vzorca, namenjen za laboratorijsko analizo.

—

Če lot za vzorčenje vsebuje majhne ribe (posamezne ribe, teže < približno 1 kg), se iz primarnega vzorca vzame cela riba, da se oblikuje sestavljeni vzorec. Če sestavljeni vzorec tehta več kot 3 kg, lahko posamezne vzorce sestavlja srednji del rib, ki tvorijo sestavljeni vzorec, pri čemer vsak posamezni vzorec tehta najmanj 100 g. Celoten del, za katerega velja mejna vrednost, se uporabi za homogenizacijo vzorca.

Riba ima težišče v srednjem delu, ki se v večini primerov nahaja pri hrbtni plavuti (če jo riba ima) ali med škrgo in anusom.

—

Če lot, ki ga je treba vzorčiti, vsebuje večje ribe (posamezne ribe, ki so težje od približno 1 kg), se posamezni vzorec sestoji iz srednjega dela ribe. Vsak posamezni vzorec tehta najmanj 100 g.

Pri ribah srednje velikosti (približno 1 do 6 kg) se posamezni vzorec odvzame iz srednjega dela ribe, iz predela med hrbtenico in trebuhom.

Pri zelo velikih ribah (npr. > približno 6 kg), se posamezni vzorec mesa mišic odvzame iz srednjega dela ribe, in sicer iz desnega hrbtno-bočnega dela (pogled od spredaj). Če bi odvzem takšnega dela iz srednjega dela ribe povzročil bistveno gospodarsko škodo, zadošča odvzem treh posameznih vzorcev po najmanj 350 g, ne glede na velikost lota. Lahko pa se posamezni vzorec, ki je reprezentativen glede vsebnosti dioksina v celi ribi, dobi tako, da se odvzame ustrezni del mesa mišic ene ribe iz predela v bližini repa in glave.

—

V zvezi s sestavljanjem vzorca se uporabljajo določbe iz točke 4.3.

—

Če je kategorija/razred velikosti in teže prevladujoča (približno 80 % lota ali več), se odvzame vzorec rib s prevladujočo težo ali velikostjo. Ta vzorec se šteje kot reprezentativen za celoten lot.

—

Če nobena posebna kategorija/razred velikosti ali teže ni prevladujoča, potem je treba zagotoviti, da so ribe, ki se jih izbere za odvzem vzorca, reprezentativne za celotno pošiljko. Posebna navodila za takšne primere vsebujejo „Navodila za vzorčenje lotov rib, ki vsebujejo cele ribe različnih velikosti in/ali teže (2)“.

—

Z izračunom razširjene nezanesljivosti, ob uporabi faktorja za zajetje 2, ki da omogoča 95-odstotno stopnjo zaupanja. Lot ali sublot je neskladen, če je izmerjena vrednost minus U nad določeno dovoljeno vrednostjo. V primeru ločenega preskušanja za določitev dioksinov in dioksinom podobnih PCB je treba vsoto ocenjene razširjene nezanesljivosti ločenih rezultatov analize vsebnosti dioksinov in dioksinu podobnih PCB uporabiti za vsoto dioksinov in dioksinom podobnih PCB.

—

Z uvedbo odločitvene meje (CCα) v skladu z Odločbo Komisije 2002/657/ES z dne 12. avgusta 2002 o izvajanju Direktive Sveta 96/23/ES glede opravljanja analitskih metod in razlage rezultatov (5) (točka 3.1.2.5. te priloge – primer snovi z določeno dovoljeno vrednostjo) je lot ali sublot neskladen, če je izmerjena vrednost enaka ali večja od odločitvene meje.

—

Sprejeti je treba ukrepe za preprečitev navzkrižne kontaminacije na vseh stopnjah vzorčenja in analitskega postopka.

—

Vzorci se morajo hraniti in prevažati v steklenih, aluminijastih, polipropilenskih ali polietilenskih posodah. Iz posode za vzorce morajo biti odstranjeni sledovi papirnega prahu. Steklene posode je treba sprati s topili, ki dokazano ne vsebujejo dioksinov ali pa je treba prisotnost dioksinov v topilih predhodno preveriti.

—

Hramba in prevoz vzorcev morata biti izvedena tako, da se ohrani neoporečnost vzorca živila.

—

Če je ustrezno, se vsak laboratorijski vzorec drobno zmelje in temeljito premeša po postopku, s katerim se dokazano doseže popolna homogenizacija (npr. zmleto tako, da se preseje z 1-milimetrskim sitom); če je vsebnost vlage previsoka, je treba vzorce pred mletjem posušiti.

—

Izvedba slepe analize z izvedbo celotnega analitskega postopka, iz katerega se izpusti le vzorec.

—

Masa vzorca, uporabljenega za ekstrakcijo, mora biti zadostna, da so izpolnjene zahteve glede občutljivosti.

—

Posebne postopke za pripravo vzorca, ki se uporabljajo za obravnavane proizvode, je treba validirati v skladu z mednarodno priznanimi smernicami.

—

V primeru rib je treba odstraniti kožo, saj mejna vrednost velja za meso mišic brez kože. Vendar pa je treba vse preostalo meso mišic in maščobnega tkiva na notranji strani kože temeljito in popolnoma odstraniti, preostanek mesa mišic in maščobnega tkiva pa je treba dodati vzorcu za analizo.

—

Laboratoriji dokažejo zmogljivost metode v območju predpisane vrednosti, npr. 0,5-kratna, 1-kratna in 2-kratna predpisana vrednost s sprejemljivim koeficientom variacije za ponovljene analize. Za podrobnosti glede meril sprejemljivosti glej del 5.

—

Meja kvantifikacije za potrditveno metodo mora biti v območju približno ene petine predpisane vrednosti.

—

Redne slepe kontrole in preskusi z dodatkom ali analize kontrolnih vzorcev (če je na voljo, je zaželen certificiran referenčni material) se izvajajo kot notranji nadzorni ukrepi za zagotavljanje kakovosti.

—

Sposobnost laboratorijev se dokazuje z nenehnim uspešnim sodelovanjem v medlaboratorijskih študijah za določanje dioksinov in dioksinom podobnih PCB v ustreznih matricah krme/hrane.

—

V skladu z določbami Uredbe (ES) št. 882/2004 akreditirajo laboratorije priznani organi, ki delujejo v skladu z zahtevami ISO Guide 58, s čimer je zagotovljeno, da le-ti uporabljajo analitsko zagotavljanje kakovosti. Laboratoriji se akreditirajo na podlagi standarda EN ISO/IEC/17025.

—

Visoka občutljivost in nizke meje zaznavanja Zaradi izredne toksičnosti nekaterih od teh spojin morajo biti za PCDD in PCDF zaznavne količine v pikogramskem območju TEQ (10–12 g). Za PCB je znano, da se pojavljajo pri višjih vrednostih kot PCDD in PCDF. Za večino kongenerov PCB je občutljivost v nanogramskem območju (10–9 g) že zadostna. Vendar pa mora biti za merjenje bolj toksičnih dioksinom podobnih kongenerov PCB (zlasti ne-orto substituiranih kongenerov) dosežena ista občutljivost kakor za PCDD in PCDF.

—

Visoka selektivnost (specifičnost) Zahteva se razlikovanje med PCDD, PCDF in dioksinom podobnimi PCB ter številnimi drugimi, motečimi spojinami, ki se ekstrahirajo hkrati in so morda s svojo prisotnostjo moteče pri koncentracijah, ki so za več velikostnih razredov višje od predpisanega analita. Za metode plinske kromatografije/masne spektrometrije (GC/MS) je potrebno razlikovanje med različnimi kongeneri, kot na primer med toksičnimi (npr. sedemnajst 2,3,7,8-substituiranimi PCDD, PCDF in dioksinom podobnimi PCB) in drugimi kongeneri. Biološki testi morajo omogočati določanje vrednosti TEQ selektivno kot seštevek PCDD, PCDF in dioksinom podobnih PCB.

—

Visoka točnost (pravilnost in natančnost) Določanje zagotovi veljavne in zanesljive ocene pravih koncentracij v vzorcu. Visoka točnost (točnost meritve: ujemanje merilnega rezultata s pravo ali dogovorjeno vrednostjo meritve) je potrebna, da se prepreči zavrnitev rezultata analize vzorca na podlagi slabe zanesljivosti ocene TEQ. Točnost se izrazi kot pravilnost (razlika med srednjo vrednostjo izmerjenega analita v certificiranem materialu in njegovo certificirano vrednostjo, izraženo kot odstotek te vrednosti) in natančnost (RSDR natančnost se običajno izračuna kot relativni standardni odmik od rezultatov, pridobljenih pri vnaprej določenih pogojih).

—

Dodatek 13C-označenih 2,3,7,8-klor substituiranih notranjih PCDD/F standardov in 13C-označenih notranjih standardov za dioksinom podobne PCB je treba izvesti na samem začetku analitske metode, na primer pred ekstrakcijo, da se validira analitski postopek. Dodati je treba vsaj en kongener za vsako od tetra- do okta- kloriranih homolognih skupin za PCDD/F in vsaj en kongener za vsako od homolognih skupin za dioksinom podobne PCB in alternativno vsaj en kongener za vsak spektrometričen izbran ion s funkcijo evidentiranja, ki se uporablja za spremljanje PCDD/F in dioksinom podobnih PCB. Prednost ima, še zlasti v primerih potrditvenih metod, uporaba vseh sedemnajstih 13C-označenih 2,3,7,8-klor substituiranih notranjih PCDD/F standardov in vseh dvanajstih 13C-označenih notranjih standardov za dioksinom podobne PCB.

Prav tako je treba določiti relativne odzivne faktorje za tiste kongenerje, za katere ni dodan noben od 13C-označenih analogov z uporabo ustreznih raztopin za umerjanje.

—

Za živila rastlinskega izvora in živila živalskega izvora, ki vsebujejo manj kot 10 % maščob, je dodatek notranjih standardov pred ekstrakcijo obvezen. Za živila živalskega izvora, ki vsebujejo več kot 10 % maščob, se lahko notranji standardi dodajo pred ekstrakcijo ali po ekstrakciji maščob. Izvesti je treba ustrezno validacijo učinkovitosti ekstrakcije, ki je odvisna od faze, pri kateri se dodajo notranji standardi, in od tega, ali se o rezultatih poroča na podlagi proizvoda ali maščob.

—

Pred analizo GC/MS je treba dodati en ali dva standarda za izkoristek (surogat).

—

Potreben je nadzor izkoristka. Za potrditvene metode naj bi bili izkoristki posameznih notranjih standardov v območju 60 % do 120 %. Nižji ali višji izkoristki za posamezne kongenere, še zlasti za nekatere hepta in okta klorirane dibenzodioksine in dibenzofurane, so sprejemljivi pod pogojem, da njihov prispevek k vrednosti TEQ ne presega 10 % celotne vrednosti TEQ (temelji zgolj na PCDD/F). Pri presejalnih metodah naj bi bili izkoristki v območju 30 % do 140 %.

—

Ločevanje dioksinov od motečih kloriranih spojin, kakor so PCB in klorirani difenil etri, je treba izvesti z ustreznimi kromatografskimi tehnikami (prednost imajo florizil, koloni iz aluminijevega oksida in/ali ogljikovi koloni).

—

Plinsko kromatografsko ločevanje izomerov naj bi bilo zadostno (< 25 % od vrha do vrha med 1,2,3,4,7,8-HxCDF in 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

Določanje naj poteka v skladu z metodo EPA, 1613 revizija B: Tetra- skozi okta-klorirani dioksini in furani z izotopsko razredčeno HRGC/HRMS ali drugo z enakovrednimi merili zmogljivosti.

—

Razlika med vrednostjo, zaokroženo navzgor in vrednostjo, zaokroženo navzdol, naj ne presega 20 % pri živilih, kontaminiranih z dioksinom, približno 1 pg WHO-TEQ/g maščobe (na podlagi vsote PCDD/PCDF in dioksinom podobnih PCB). Pri živilih z nizko vsebnostjo maščob je treba uporabiti iste zahteve za ravni kontaminacije, in sicer približno 1 pg WHO-TEQ/g proizvoda. Za nižje ravni kontaminacije, na primer 0,50 pg WHO-TEQ/g proizvoda, je lahko razlika med zgornjo in spodnjo vrednostjo v območju 25 do 40 %.

—

V vsak preskusni lot je treba vključiti slepi(-e) vzorec(-e) in referenčni(-e) vzorec(e), ki se ekstrahirajo in preskušajo hkrati in po enakimi pogoji. Referenčni vzorec mora kazati izrazito višji odziv v primerjavi s slepim.

—

Vključijo se dodatni referenčni vzorci z 0,5-kratno in 2-kratno predpisano vrednostjo, da se dokaže primerna zmogljivost preskusa v območju predpisane vrednosti.

—

Pri preskušanju drugih matrik se mora dokazati ustreznost referenčnega vzorca/vzorcev, prednostno z vključitvijo vzorcev, pri katerih se z HRGC/HRMS pokaže, da je vrednost TEQ v bližini vrednosti v referenčnem vzorcu, ali s slepim vzorcem z dodatkom pri tej vrednosti.

—

Ker se pri bioloških testih ne morejo uporabiti notranji standardi, so preskusi ponovljivosti zelo pomembni za pridobitev podatkov o standardnem odmiku v okviru enega preskusnega lota. Koeficient variacije mora biti pod 30 %.

—

Za biološke teste je treba opredeliti ciljne spojine, možne interference in najvišje sprejemljive slepe vrednosti.

—

Pri presejanju se lahko uporabijo GC/MS analitske metode in biološki testi. Za metode GC/MS je treba uporabiti zahteve iz točke 6. Za biološke teste na celični osnovi so posebne zahteve določene v točki 7.3 in za biološke teste na osnovi opreme v točki 7.4 te priloge.

—

Potrebna je informacija o številu lažno pozitivnih in lažno negativnih rezultatov večjega števila vzorcev pod ali nad njo mejno vrednostjo, ali vrednost ukrepanja, v primerjavi z vsebnostjo TEQ, določeno s potrditveno analitsko metodo. Dejanska stopnja lažnih negativnih rezultatov bi morala biti pod 1 %. Stopnja lažnih pozitivnih vzorcev bi morala biti dovolj nizka, da je uporaba presejalnega orodja koristnejša.

—

Pozitivne rezultate je treba vedno potrditi s kvantitativno analitsko metodo (HRGC/HRMS). Poleg tega bi bilo treba vzorce iz širokega TEQ območja potrditi z HRGC/HRMS (približno 2 % do 10 % negativnih vzorcev). Na voljo bi morali biti tudi podatki o ujemanju med biološkim testom in rezultati HRGC/HRMS.

—

Pri izvajanju biološkega testa vsaka serija preskusov zahteva serijo referenčnih koncentracij TCDD ali dioksin/furan mešanice (celotna krivulja odziva odmerka z R2 > 0,95). Vendar pa se za namene izločitve lahko za analizo vzorcev pri nizkih vrednostih uporabi razširjena krivulja nizkih vrednosti.

—

Uporabiti bi bilo treba TCDD referenčno koncentracijo (približno trikratna meja kvantifikacije) na diagramu obvladovanja kakovosti rezultatov za rezultate biološkega testa v neprekinjenem časovnem obdobju. Druga možnost je lahko relativni odziv referenčnega vzorca v primerjavi z umeritveno premico TCDD, ker je odziv celic lahko odvisen od številnih dejavnikov.

—

Za vsako vrsto referenčnega materiala je treba voditi in preverjati kontrolne karte (QC) za zagotovitev, da so rezultati v skladu z zastavljenimi smernicami.

—

Zlasti pri količinskih izračunih mora biti uvedba uporabljene razredčitve vzorca znotraj linearnega dela krivulje odziva. Vzorci nad linearnim delom krivulje odziva se morajo razredčiti in ponovno preskusiti. Zato se hkrati preskušajo najmanj tri razredčitve ali več.

—

Odstotni standardni odmik naj ne bo nad 15 % pri trikratnem določanju za vsako razredčitev vzorca in ne nad 30 % med tremi neodvisnimi poskusi.

—

Meja zaznavanja se lahko določi kot trikratni standardni odmik slepega topila ali odziva ozadja. Drugi pristop je uporaba odziva, ki je nad ozadjem (uporabljeni faktor petkratno slepo topilo), izračunan iz umeritvene krivulje za tisti dan. Meja kvantifikacije se lahko določi kot petkratni ali šestkratni standardni odmik slepega topila ali odziva ozadja, ali pa se uporabi odziv, ki je razločno nad ozadjem (uporabljeni faktor desetkratno slepo topilo), izračunan iz umeritvene krivulje za tisti dan.

—

Zagotoviti je treba, da je biološki test na osnovi pribora dovolj občutljiv in zanesljiv za uporabo v živilih.

—

Glede priprave vzorca in analize je treba slediti navodilom proizvajalca.

—

Preskusna oprema se ne bi smela uporabljati po pretečenem roku.

—

Ne sme se uporabljati materialov ali sestavnih delov, ki so namenjeni za drug pribor.

—

Preskusno opremo je treba hraniti v ustreznem območju temperature hranjenja in jo uporabljati pri ustrezni delovni temperaturi.

—

Meja zaznavnosti za imunoanalize se določi kot trikratni standardni odmik, ki temelji na 10 ponovitvah analize slepega vzorca, ki se deli z naklonom linearne regresijske enačbe.

—

Referenčne standarde bi bilo treba uporabiti za preskuse v laboratorijih, da se zagotovi odzivnost na standard v sprejemljivem območju.