„ANEXA I

CARACTERISTICILE ULEIURILOR DE MĂSLINE

Note:

(a)	Rezultatele analizelor trebuie să conțină același număr de zecimale ca cele indicate pentru fiecare caracteristică. Ultima cifră trebuie mărită cu o unitate în cazul în care cifra următoare este mai mare de 4.

(b)	Este de ajuns ca o singură caracteristică să nu fie conformă cu valorile indicate pentru ca uleiul să fie încadrat într-o altă categorie sau să fie declarat neconform din punct de vedere al purității.

(c)

Caracteristicile indicate cu asterisc (*), care fac referire la calitatea uleiului, semnifică următoarele: — pentru uleiul de măsline lampant, limitele aferente pot să nu fie respectate în mod simultan; — pentru uleiurile de măsline virgine, nerespectarea cel puțin a uneia dintre aceste limite implică schimbarea categoriei, cu toate că uleiul rămâne clasificat într-una din categoriile de uleiuri de măsline virgine.

(d)	Caracteristicile indicate cu două asteriscuri (**), care fac referire la calitatea uleiului, semnifică faptul că, pentru toate uleiurile din resturi de măsline, limitele aferente pot să nu fie respectate în mod simultan.”

Categorie	Aciditate (%) (*)	Indice de peroxid mEq O2/kg (*)	Ceară mg/kg (**)	Monopalmitat de 2-gliceril (%)	Stigmastadienol mg/kg (1)	Diferență ECN42 (HPLC) și ECN42 (calcul teoretic)	K232 (*)	K270 (*)	Delta-K (*)	Evaluare organoleptică Valoarea medie a defectului (Md) (*)	Evaluare organoleptică Valoarea medie a atributului fructat (Mf) (*)
1. Ulei de măsline virgin extra	≤ 0,8	≤ 20	≤ 250	≤ 0,9 dacă % Acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 1,0 dacă % Acid palmitic total > 14 %	≤ 0,10	≤ 0,2	≤ 2,50	≤ 0,22	≤ 0,01	Md = 0	Mf > 0
2. Ulei de măsline virgin	≤ 2,0	≤ 20	≤ 250	≤ 0,9 dacă % Acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 1,0 dacă % Acid palmitic total > 14 %	≤ 0,10	≤ 0,2	≤ 2,60	≤ 0,25	≤ 0,01	Md ≤ 2,5	Mf > 0
3. Ulei de măsline lampant	> 2,0	—	≤ 300 (3)	≤ 0,9 dacă % Acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 1,1 dacă % Acid palmitic total > 14 %	≤ 0,50	≤ 0,3	—	—	—	Md > 2,5 (2)	—
4. Ulei de măsline rafinat	≤ 0,3	≤ 5	≤ 350	≤ 0,9 dacă % Acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 1,1 dacă % Acid palmitic total > 14 %	—	≤ 0,3	—	≤ 1,10	≤ 0,16	—	—
5. Ulei de măsline compus din uleiuri de măsline rafinate și uleiuri de măsline virgine	≤ 1,0	≤ 15	≤ 350	≤ 0,9 dacă % Acid palmitic total ≤ 14 % ≤ 1,0 dacă % Acid palmitic total > 14 %	—	≤ 0,3	—	≤ 0,90	≤ 0,15	—	—
6. Ulei brut din resturi de măsline	—	—	> 350 (4)	≤ 1,4	—	≤ 0,6	—	—	—	—	—
7. Ulei rafinat din resturi de măsline	≤ 0,3	≤ 5	> 350	≤ 1,4	—	≤ 0,5	—	≤ 2,00	≤ 0,20	—	—
8. Ulei din resturi de măsline	≤ 1,0	≤ 15	> 350	≤ 1,2	—	≤ 0,5	—	≤ 1,70	≤ 0,18	—	—

Categorie

Conținutul de acizi (5)

Sumele izomerilor trans ai uleiului oleic (%)

Sumele izomerilor trans ai uleiului linoleic și ai uleiului linolenic (%)

Conținutul de steroli

Steroli totali (mg/kg)

Eritrodiol și uvaol (%) (**)

Miristic (%)

Linolenic (%)

Arahidic (%)

Eicosanoic (%)

Behenic (%)

Lignoceric (%)

Colesterol (%)

Brassicasterol (%)

Campesterol (%)

Stigmasterol (%)

Betasitosterol (%) (6)

Delta-7-Stigmastenol (%)

1. Ulei de măsline virgin extra

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

2. Ulei de măsline virgin

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

3. Ulei de măsline lampant

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,10

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5 (7)

4. Ulei de măsline rafinat

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

5. Ulei de măsline compus din uleiuri de măsline rafinate și uleiuri de măsline virgine

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

6. Ulei brut din resturi de măsline

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 2 500

> 4,5 (8)

7. Ulei rafinat din resturi de măsline

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 800

> 4,5

8. Ulei din resturi de măsline

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 600

> 4,5

ANEXA IV

DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE CEARĂ CU AJUTORUL CROMATOGRAFIEI ÎN FAZĂ GAZOASĂ CU COLOANĂ CAPILARĂ

1.   OBIECT

Metoda descrie un procedeu de determinare a conținutului de ceară din uleiurile de măsline. Tipurile de ceară sunt definite în funcție de numărul de atomi de carbon. Metoda poate fi folosită în special pentru a deosebi uleiul de măsline obținut prin presare de cel obținut prin extracție (ulei din resturi de măsline).

2.   PRINCIPIU

Materia grasă, la care s-a adăugat un standard intern adecvat, este fracționată prin cromatografie pe o coloană de silicagel hidratat; fracțiunea eluată prima în condițiile de testare (a cărei polaritate este mai mică decât cea a trigliceridelor) este recuperată, apoi analizată direct prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3.   APARATURĂ

3.1.   Pahar Erlenmeyer de 25 ml.

3.2.   Coloană de sticlă pentru cromatografie în fază gazoasă, cu un diametru interior de 15 mm, o înălțime de 30-40 cm, echipată cu un robinet.

3.3.   Cromatograf în fază gazoasă adaptat la funcționarea cu coloană capilară, echipat cu un sistem de introducere directă în coloană, alcătuit din:

3.3.1.   Incintă termostatată pentru coloane, echipată cu un dispozitiv de programare a temperaturii;

3.3.2.   Injector la rece pentru introducere directă în coloană;

3.3.3.   Detector cu ionizare în flacără și convertizor-amplificator;

3.3.4.   Aparat de înregistrare-integrator adaptat la funcționarea cu un convertizor-amplificator (3.3.3), cu un timp de răspuns sub 1 secundă și cu o viteză a hârtiei variabilă (se pot utiliza, de asemenea, sisteme informatizate de obținere a datelor de cromatografie în fază gazoasă cu ajutorul unui computer);

3.3.5.   Coloană capilară de sticlă sau silice topită, cu o lungime de 8-12 m și un diametru interior de la 0,25-0,32 mm, acoperită în interior cu lichid de repartizare, într-un strat de grosime uniformă cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm (lichide de repartizare adaptate utilizării, de tip SE 52 sau SE 54, în comerț).

3.4.   Microseringă de 10 μl pentru introducerea directă în coloană, echipată cu un ac cementat.

3.5.   Agitator electric.

3.6.   Evaporator rotativ.

3.7.   Cuptor închis.

3.8.   Balanță analitică cu o precizie garantată a măsurii de + 0,1 mg.

3.9.   Sticlărie standard de laborator.

4.   REACTIVI

4.1.   Silicagel cu o granulometrie cuprinsă între 60 și 200 μm.

Silicagelul se păstrează în cuptor la 500 °C timp de cel puțin patru ore. După răcire, se adaugă 2 % apă în raport cu cantitatea de silicagel prelevată. Se agită bine pentru a omogeniza cantitatea. Se păstrează la întuneric timp de cel puțin 12 ore înainte de utilizare.

4.2.   n-hexan, pentru cromatografie.

4.3.   Eter etilic, pentru cromatografie.

4.4.   n-heptan, pentru cromatografie.

4.5.   Soluție standard de lauril arahidat, la 0,1 % (m/V) în hexan (standard intern) (se poate utiliza, de asemenea, palmitat de palmitil sau stearat de miristil).

4.5.1.   Sudan 1 (1-fenilazo-2-naftol).

4.6.   Gaz transportor: hidrogen sau heliu pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.7.   Gaze auxiliare:

—	hidrogen pur, pentru cromatografie în fază gazoasă;

—	aer pur, pentru cromatografie în fază gazoasă.

5.   MOD DE LUCRU

5.1.   Pregătirea coloanei cromatografice

Se prepară o suspensie de 15 g de silicagel (4.1) în n-hexan (4.2) și se introduce pe coloană (3.2). Se lasă să se clarifice spontan și se definitivează clarificarea cu ajutorul unui agitator electric (3.5) pentru omogenizarea stratului de cromatografie. Se percolează 30 ml de n-hexan pentru a înlătura orice impurități. Se cântăresc cu exactitate cu ajutorul balanței (3.8) 500 mg din mostră în paharul Erlenmeyer de 25 ml (3.1), se adaugă cantitatea adecvată de standard intern (4.5), în funcție de conținutul de ceară estimat.

Se adaugă, de exemplu, 0,1 mg de lauril arahidat în cazul uleiului de măsline și între 0,25 și 0,5 mg pentru uleiul din resturi de măsline. Se transferă mostra astfel preparată în coloana cromatografică cu ajutorul a două doze de câte 2 ml de n-hexan (4.2).

Se lasă să scadă nivelul solventului până la 1 mm deasupra marginii superioare a absorbantului, apoi se percolează o cantitate suplimentară de 70 ml de n-hexan, pentru a elimina n-alcanii prezenți în mod natural. Se începe eluarea cromatografică prin colectarea a 180 ml de amestec de n-hexan/eter etilic, în raport de 99:1, la un debit de aproximativ 15 picături la fiecare 10 secunde. Eluarea mostrei se efectuează la o temperatură ambiantă de 22 ± 4 °C.

Note:

—	Amestecul de n-hexan/eter etilic (99:1) trebuie să fie pregătit zilnic.

—

Pentru a controla vizual eluarea corectă a cerii, se pot adăuga la mostra de soluție 100 μl de sudan de 1 % în amestecul de eluant. Deoarece colorantul prezintă o retenție intermediară între ceruri și trigliceride, eluarea trebuie întreruptă în momentul în care baza coloanei cromatografice se colorează, întrucât toate tipurile de ceară au fost eluate.

Fracțiunea astfel obținută este uscată într-un evaporator rotativ (3.6) până la eliminarea aproape totală a solventului. Ultimii 2 ml de solvent se elimină cu ajutorul unui ușor curent de azot; se adaugă apoi 2-4 ml de n-heptan.

5.2.   Analiza prin cromatografie în fază gazoasă

5.2.1.   Operațiuni preliminare

Se instalează coloana în cromatograful în fază gazoasă (3.3), conectând extremitatea de intrare la sistemul coloanei și extremitatea de ieșire la detector. Se efectuează controalele generale ale complexului de cromatografie în faza gazoasă (etanșeitatea circuitului de gaz, eficacitatea detectorului și a sistemului de înregistrare etc.).

În cazul în care coloana este folosită pentru prima dată, se recomandă ca aceasta să fie condiționată. Se trece un ușor flux de gaz prin coloană, apoi se conectează complexul de cromatografie în fază gazoasă. Se încălzește treptat până când se ajunge, după aproximativ 4 ore, la o temperatură de 350 °C. Se menține această temperatură timp de cel puțin două ore, apoi se reglează complexul la condițiile de funcționare [se reglează debitul de gaz, se aprinde flacăra, se conectează la aparatul de înregistrare electronic (3.3.4), se reglează temperatura camerei pentru coloană, detectorul etc.] și se înregistrează semnalul la o sensibilitate cel puțin de două ori mai mare decât cea prevăzută pentru efectuarea analizei. Traseul liniei de bază obținute trebuie să fie liniar, fără valori de vârf, de orice natură, și nu trebuie să prezinte abateri.

O abatere rectilinie negativă indică o etanșeitate imperfectă a conexiunilor coloanei; o abatere pozitivă indică o condiționare insuficientă a coloanei.

5.2.2.   Alegerea condițiilor de funcționare

Condițiile de funcționare care trebuie respectate sunt, în general, următoarele:

—	temperatura coloanei:   20 °C/minut   5 °C/minut   20 °C/minut   la început 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

—	temperatura detectorului: 350 °C;

—	cantitatea de substanță injectată: 1 μl de soluție (2-4 ml) de n-heptan;

—	gaz transportor: heliu sau hidrogen cu viteză lineară optimă pentru gazul selectat (a se vedea apendicele);

—	sensibilitatea instrumentelor: adaptată condițiilor de mai jos:

Aceste condiții pot fi modificate în funcție de caracteristicile coloanei și ale cromatografului în fază gazoasă, astfel încât să se obțină o separare a tuturor tipurilor de ceară, o rezoluție convenabilă a valorilor de vârf (a se vedea figura) și un timp de retenție al standardului intern C32, care trebuie să fie de 18 ± 3 minute. Valoarea de vârf cea mai reprezentativă a cerii trebuie să se situeze la cel puțin 60 % din scara totală.

Parametrii de integrare ai valorilor de vârf trebuie să fie astfel impuși încât să se obțină o evaluare corectă a ariilor valorilor de vârf care sunt luate în considerare.

Notă: Având în vedere temperatura finală ridicată, se admite o variație pozitivă, care nu trebuie să depășească 10 % din scara totală.

5.3.   Efectuarea analizei

Se prelevează 1 μl de soluție cu microseringa de 10 μl; se trage înapoi pistonul seringii în așa fel încât acul să fie gol. Se introduce acul în complexul de injecție și după 1-2 secunde se injectează rapid; după aproximativ 5 secunde, acul se scoate lent.

Se procedează la înregistrare până la eluarea completă a cerii.

Linia de bază trebuie să corespundă întotdeauna condițiilor impuse.

5.4.   Identificarea valorilor de vârf

Identificarea valorilor de vârf unice se efectuează pe baza timpilor de retenție și prin comparație cu amestecurile de ceară cu timpi de retenție cunoscuți, analizate în aceleași condiții.

Figura prezintă cromatograma cerii pentru un ulei de măsline virgin.

5.5.   Evaluare cantitativă

Cu ajutorul integratorului, se procedează la calculul ariilor valorilor de vârf corespunzătoare standardului intern și esterilor alifatici de la C40 la C46.

Se calculează conținutul de ceară al fiecărui ester, în mg/kg de materie grasă, după formula:

unde:

Ax	=	aria valorii de vârf a fiecărui ester, exprimată în milimetri pătrați;
As	=	aria valorii de vârf a standardului intern, exprimată în milimetri pătrați;
ms	=	masa standardului intern adăugată, exprimată în miligrame;
m	=	masa mostrei prevalate pentru determinare, exprimată în grame.

6.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

Se indică suma conținuturilor diferitelor tipuri de ceară de la C40 la C46 în mg/kg de substanță grasă (ppm).

Notă: Componentele care trebuie cuantificate se referă la valorile de vârf cu număr par de atomi de carbon, cuprinse între esterii C40 și C46, după modelul cromatogramei cerii uleiului de măsline, prezentate în figura următoare. Pentru a identifica esterul C46, în cazul în care apare de două ori, se recomandă analizarea fracțiunii de ceară a unui ulei din resturi de măsline, a cărei valoare de vârf C46, prezentă în cantitate majoritară, este ușor de identificat.

Rezultatele se exprimă cu o zecimală.

Figură

Cromatograma tipurilor de ceară ale unui ulei de măsline (9)

Apendice

Determinarea vitezei liniare a gazului

În cromatograful în fază gazoasă, reglat la condiții de funcționare normale, se injectează 1-3 μl de metan (sau propan). Se măsoară timpul în care gazul trece prin coloană, din momentul în care a fost injectat până când apare vârful (tM).

Viteza liniară în cm/sec se obține prin formula L/tM, unde L este lungimea coloanei în centimetri, iar tM este timpul măsurat în secunde.

„ANEXA VII

DETERMINAREA PROCENTULUI DE MONOPALMITAT DE 2-GLICERIL

1.   OBIECTUL ȘI DOMENIUL DE APLICARE

Prezenta metodă descrie procedura analitică de determinare a procentului de acid palmitic în poziția 2 a trigliceridelor cu ajutorul evaluării monopalmitatului de 2-gliceril.

Prezenta metodă se aplică uleiurilor vegetale lichide la temperatură ambiantă (20 °C).

2.   PRINCIPIU

După preparare, mostra de ulei este supusă acțiunii lipazei pancreatice: o hidroliză parțială și specifică în pozițiile 1 și 3 ale moleculei de trigliceridă determină apariția monogliceridelor în poziția 2. Procentul de monopalmitat de 2-gliceril în fracțiunea de monogliceridă este determinat, după sililare, prin cromatografie în fază gazoasă cu coloană capilară.

3.   APARATURĂ ȘI MATERIALE

3.1.   Pahar Erlenmeyer de 25 ml.

3.2.   Pahare de laborator de 100, 250 și 300 ml.

3.3.   Coloană de sticlă pentru cromatografie, cu diametru interior de 21-23 mm, lungime de 400 mm, echipată cu un disc din sticlă sinterizată și un robinet.

3.4.   Eprubete gradate de 10, 50, 100 și 200 ml.

3.5.   Baloane de 100 și 250 ml.

3.6.   Evaporator rotativ.

3.7.   Tuburi de centrifugare, cu capăt conic de 10 ml, cu dop din sticlă rodată.

3.8.   Eprubetă de centrifugare pentru tuburi de 10 și 100 ml.

3.9.   Termostat pentru menținerea temperaturii la 40 °C ± 0,5 °C.

3.10.   Pipete gradate de 1 și 2 ml.

3.11.   Seringă hipodermică de 1 ml.

3.12.   Microseringă de 100 μl.

3.13.   Pâlnie, 1 000 ml.

3.14.   Cromatograf în fază gazoasă pentru coloane capilare, echipat cu un dispozitiv de injecție «on-column» la rece pentru introducerea directă a mostrei în coloană și cu un cuptor capabil să mențină temperatura aleasă în limita a 1 °C.

3.15.   Injector «on-column» la rece pentru introducerea directă a mostrei în coloană.

3.16.   Detector cu ionizare în flacără și electrometru.

3.17.   Aparat de înregistrare-integrator adaptat la electrometru cu un timp de răspuns sub 1 secundă și cu o viteză a hârtiei variabilă.

3.18.   Coloană capilară de sticlă sau silice topită cu o lungime de 8-12 metri și un diametru interior de la 0,25-0,32 mm, acoperită cu metil-polisiloxan sau 5 % fenil-metil-polisiloxan, într-un strat cu o grosime cuprinsă între 0,10 și 0,30 μm, care poate fi utilizată la 370 °C.

3.19.   Microseringă de 10 μl echipată cu un ac cementat, cu o lungime de cel puțin 7,5 cm pentru introducerea directă în coloană.

4.   REACTIVI

4.1.   Silicagel cu o granulometrie cuprinsă între 0,063 și 0,200 mm (70/280 Mesh), preparat astfel: se introduce silicagelul într-o capsulă de porțelan, se lasă la uscat în etuvă la 160 °C timp de 4 ore, apoi se lasă la răcit într-un desicator, la temperatura ambiantă. Se adaugă un volum de apă echivalent cu 5 % din greutatea silicagelului, astfel: într-un pahar Erlenmeyer de 500 ml, se cântăresc 152 g de silicagel și se adaugă 8 g de apă distilată, se pune dopul și se agită ușor pentru a obține o repartizare uniformă a apei. Se lasă în repaus cel puțin 12 ore înainte de utilizare.

4.2.   n-hexan (pentru cromatografie).

4.3.   Izopropanol.

4.4.   Izopropanol, soluție apoasă 1/1 (V/V).

4.5.   Lipază pancreatică. Lipaza utilizată trebuie să aibă o activitate cuprinsă între 2-10 unități de lipază/mg. (Există în comerț lipaze pancreatice cu activitate cuprinsă între 2-10 unități/mg de enzimă).

4.6.   Soluție tampon de tri-hidroximetilaminometan soluție apoasă 1 M ajustată până la un pH de 8 (control cu potențiometrul) prin adăugarea de acid clorhidric concentrat (1/1 V/V).

4.7.   Colat de sodiu, calitate enzimatică, soluție apoasă de 0,1 % (această soluție trebuie utilizată în decurs de 15 zile de la preparare).

4.8.   Clorură de calciu, soluție apoasă de 22 %.

4.9.   Eter dietilic pentru cromatografie.

4.10.   Solvent de developare: amestec de n-hexan/eter dietilic (87/13 V/V).

4.11.   Hidroxid de sodiu, soluție de 12 % din greutate.

4.12.   Fenolftaleină, soluție de 1 % în etanol.

4.13.   Gaz transportor: hidrogen sau heliu, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.14.   Gaze auxiliare: hidrogen cu puritate de minimum 99 %, fără umiditate și impurități organice, și aer de puritate echivalentă, pentru cromatografie în fază gazoasă.

4.15.   Reactiv silanizant: amestec de piridină/hexametildisilazan, trimetilclorosilan 9/3/1 (V/V/V) (în comerț există soluții gata preparate. Pot fi utilizați alți reactivi silanizanți, cum ar fi bi-trimetilsililtrifluorescentamida + 1 % trimetilclorosilan, diluați cu un volum egal de piridină anhidră).

4.16.   Mostre de referință: monogliceride pure sau amestecuri de monogliceride cu o compoziție în procent cunoscută apropiată de cea a mostrei.

5.   PROCEDURĂ

5.1.   Prepararea mostrei

5.1.1.   În cazul uleiurilor cu o aciditate liberă mai mică de 3 %, nu este necesară neutralizarea acestora înainte de cromatografia în coloană de silicagel. Uleiurile cu o aciditate liberă mai mare de 3 % se neutralizează în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.1.1.

5.1.1.1.   În pâlnia de 1 000 ml (3.13) se introduc 50 g de ulei și 200 ml de n-hexan. Se adaugă 100 ml de izopropanol și o cantitate de soluție de hidroxid de sodiu de 12 % (4.11) corespunzătoare acidității libere a uleiului, majorată cu 5 %. Se agită energic timp de un minut. Se adaugă 100 ml de apă distilată, se agită din nou și se lasă în repaus.

După separare, se elimină stratul inferior de săpunuri. Se elimină orice straturi intermediare (mucilagii și materii insolubile). Se spală soluția de hexan de ulei neutralizat cu doze succesive de 50-60 ml de soluție izopropanol/apă 1/1 (V/V) (4.4), până când dispare culoarea roz a fenolftaleinei.

Se elimină cea mai mare parte de hexan prin distilarea sub vid (a se utiliza, de exemplu, un evaporator rotativ) și se transferă uleiul într-un balon de 100 ml (3.5). Se usucă uleiul în vid până la eliminarea totală a solventului.

La încheierea acestei operațiuni, aciditatea uleiului trebuie să fie mai mică de 0,5 %.

5.1.2.   Se introduce 1 g de ulei preparat conform indicațiilor anterioare într-un pahar Erlenmeyer de 25 ml (3.1.) și se dizolvă în 10 ml de amestec de developare (4.10). Soluția se lasă în repaus timp de cel puțin 15 minute înainte de cromatografia în coloană de silicagel.

În cazul în care soluția este tulbure, se centrifughează pentru a asigura condiții optime pentru cromatografie. (Pot fi utilizate cartușe de silicagel SPE de 500 mg, gata pregătite.)

5.1.3.   Pregătirea coloanei cromatografice

Se toarnă în coloană (3.3) aproximativ 30 ml de solvent de developare (4.10), se introduce o bucată de vată în partea de jos a coloanei cu ajutorul unei baghete de sticlă; se exercită presiune pentru a elimina aerul.

Într-un pahar de laborator, se prepară o suspensie de 25 g de silicagel (4.1) în aproximativ 80 ml de solvent de developare și se toarnă în coloană cu ajutorul unei pâlnii.

Se verifică dacă întreaga cantitate de silicagel a fost introdusă în coloană; se spală cu solvent de developare (4.10), se deschide robinetul și se lasă ca nivelul lichidului să ajungă la circa 2 mm deasupra nivelului superior al silicagelului.

5.1.4.   Cromatografie în coloană

Într-un pahar Erlenmeyer de 25 ml (3.1), se cântărește exact 1 g din mostra preparată în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.

Se dizolvă mostra în 10 ml de solvent de developare (4.10). Soluția se toarnă în coloana cromatografică pregătită în conformitate cu indicațiile de la punctul 5.1.3. Se evită balansarea suprafeței coloanei.

Se deschide robinetul și se lasă să se scurgă soluția mostrei până la atingerea nivelului de silicagel. Se developează cu ajutorul a 150 ml de solvent de developare. Se ajustează debitul la 2 ml/min. (astfel încât 150 ml să se scurgă în coloană în circa 60-70 de minute).

Se recuperează soluția eluată într-un balon de 250 ml, cântărit în prealabil. Se evaporă solventul sub vid și se înlătură ultimele urme ale acestuia cu ajutorul unui curent de azot.

Se cântărește balonul și se calculează materialul extras recuperat.

[În cazul utilizării unor cartușe SPE de silice gata preparate, se procedează astfel: se introduce 1 ml de soluție (5.1.2) în cartușele pregătite în prealabil cu 3 ml de n-hexan.

După percolarea soluției, se developează cu 4 ml de n-hexan/eter dietilic 9/1 (V/V).

Se recuperează soluția eluată într-o eprubetă de 10 ml și se utilizează un curent de azot pentru evaporarea până la uscare.

Reziduul uscat este supus acțiunii lipazei pancreatice (5.2). Este esențială verificarea compoziției de acizi grași înainte și după trecerea prin cartușul SPE].

5.2.   Hidroliză cu lipază pancreatică

5.2.1.   În eprubeta de centrifugare se cântăresc aproximativ 0,1 g de ulei preparat conform indicațiilor de la punctul 5.1. Se adaugă 2 ml de soluție tampon (4.6), 0,5 ml de soluție de colat de sodiu (4.7) și 0,2 ml de soluție de clorură de calciu, agitând bine după fiecare operațiune. Se închide eprubeta cu dopul din sticlă rodată și se pune în termostat la 40 ± 0,5 °C.

5.2.2.   Se adaugă 20 mg de lipază, se agită cu grijă (se va evita umezirea dopului) și se pune eprubeta în termostat timp de exact 2 minute, apoi se scoate din termostat și se agită energic timp de exact 1 minut, după care se lasă la răcit.

5.2.3.   Se adaugă 1 ml de eter dietilic, se închide și se agită energic, apoi se centrifughează și se transferă soluția de eter într-o eprubetă curată și uscată cu ajutorul unei microseringi.

5.3.   Prepararea derivaților silanizați și a cromatografiei în fază gazoasă

5.3.1.   Cu ajutorul unei microseringi, se introduc 100 μl de soluție (5.2.3) într-o eprubetă cu fund conic de 10 ml.

5.3.2.   Se elimină solventul într-un ușor curent de azot, se adaugă 200 μl de reactiv silanizant (4.15), se astupă eprubeta și se lasă în repaus timp de 20 de minute.

5.3.3.   După 20 de minute se adaugă între 1-5 ml de n-hexan (în funcție de condițiile cromatografice): soluția obținută este gata pentru cromatografia în fază gazoasă.

5.4.   Cromatografia în fază gazoasă

Condițiile de funcționare sunt următoarele:

—	temperatura injectorului (injector «on-column») mai mică decât temperatura de fierbere a solventului (68 °C);

—	temperatura detectorului: 350 °C;

—	temperatura coloanei: programarea temperaturii cuptorului: 60 °C timp de 1 minut, crescând cu 15 °C pe minut până la 180 °C, apoi cu 5 °C pe minut până la 340 °C, apoi 340 °C timp de 13 minute;

—

gaz transportor: hidrogen sau heliu, reglat la viteza lineară adecvată pentru a obține rezoluția indicată în figura 1. Timpul de retenție a trigliceridei C54 trebuie să fie de 40 ± 5 minute (a se vedea figura 2); (Condițiile de funcționare descrise anterior sunt propuse cu titlu indicativ. Fiecare operator va trebui să le optimizeze pentru a obține rezoluția dorită. Valoarea de vârf a monopalmitatului de 2-gliceril trebuie să atingă un nivel minim de 10 % din scara aparatului de înregistrare.);

—	cantitatea de substanță injectată: 0,5-1 μl de soluție (5 ml) de n-hexan (5.3.3).

5.4.1.   Identificarea valorilor de vârf

Monogliceridele individuale sunt identificate în funcție de timpii de retenție obținuți și în raport cu cei obținuți prin amestecurile standard de mopogliceride analizate în aceleași condiții.

5.4.2.   Evaluare cantitativă

Aria fiecărei valori de vârf se calculează cu ajutorul unui integrator electronic.

6.   EXPRIMAREA REZULTATELOR

Procentul de monopalmitat de gliceril se calculează pe baza raportului dintre aria valorii de vârf corespunzătoare și suma ariilor valorilor de vârf ale tuturor monogliceridelor (a se vedea figura 2), după formula:

Monopalmitat de gliceril(%):

unde:

Ax	=	aria valorii de vârf corespunzătoare monopalmitatului de gliceril;
ΣA	=	suma ariilor tuturor valorilor de vârf ale monogliceridelor.

Rezultatul trebuie exprimat cu o zecimală.

7.   RAPORTUL ANALIZEI

Raportul analizei va trebui să precizeze:

—	trimiterea la această metodă;

—	orice informație necesară identificării integrale a mostrei;

—	rezultatul analizei;

—	orice abatere de la această metodă, fie că este vorba de o decizie a părților implicate, fie dintr-un alt motiv;

—	detaliile de identificare a laboratorului, data efectuării analizei și semnătura persoanelor responsabile de aceasta.

Figura 1

Cromatogramă a produșilor de silanizare, obținuți prin acțiunea lipazei asupra unui ulei de măsline rafinat cu adaos de 20 % ulei esterificat (100 %)

Figura 2

Cromatogramă a unui:

A.   ulei de măsline neesterificat, după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta.

După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %.

Cromatogramă a unui:

B.   ulei esterificat după lipază; după silanizare; în aceste condiții (coloană capilară 8-12 mm), fracțiunea de ceară se eluează în același timp cu fracțiunea de digliceridă sau la puțin timp după aceasta.

După lipază, conținutul de trigliceride nu ar trebui să depășească 15 %.

8.   NOTE

Nota 1.   PREPARAREA LIPAZEI

Lipaze cu un nivel de activitate satisfăcător sunt disponibile în comerț. Acestea pot fi, de asemenea, preparate în laborator după cum urmează:

Se răcesc 5 kg de pancreas proaspăt de porc la 0 °C. Se elimină grăsimea solidă și țesutul conjunctiv din jur, apoi se triturează într-un malaxor până la obținerea unei paste fluide. Se agită această pastă într-un agitator cu 2,5 litri de acetonă anhidră timp de 4-6 ore, apoi se centrifughează. Se efectuează alte trei extracții de reziduu cu același volum de acetonă anhidră, apoi două extracții cu un amestec 1/1 (V/V) de acetonă și de eter dietilic și două extracții cu eter dietilic.

Se usucă reziduul sub vid timp de 48 ore pentru a obține o pudră stabilă, care se păstrează timp îndelungat în frigider și ferită de umiditate.

Nota 2.   CONTROLUL ACTIVITĂȚII LIPAZICE

Se prepară o emulsie de ulei de măsline astfel:

Se agită timp de 10 minute într-un agitator adecvat un amestec compus din 165 ml de soluție de gumă arabică de 100 g/l, din 15 g de gheață pisată și 20 ml dintr-un ulei neutralizat în prealabil.

Într-un pahar de laborator de 50 ml se toarnă succesiv câte 10 ml din această emulsie, apoi 0,3 ml de soluție de colat de sodiu de 0,2 g/ml și 20 ml de apă distilată.

Se plasează paharul de laborator într-un termostat menținut la 37 °C; se introduc electrozii unui pH-metru și un agitator cu spirală.

Cu ajutorul unei biurete, se adaugă soluția de hidroxid de sodiu 0,1 N picătură cu picătură, până când pH-ul atinge valoarea de 8,3.

Se adaugă o cantitate suficientă de suspensie apoasă de lipază (0,1 g/ml de lipază). Din momentul în care pH-metrul indică un pH de 8,3, se declanșează cronometrul și se începe adăugarea soluției de hidroxid de sodiu picătură cu picătură cu viteza necesară pentru a menține constant pH-ul de 8,3. Se notează la fiecare minut volumul de soluție consumat.

Se raportează observațiile pe o diagramă ce indică pe abscisă timpii și pe ordonată mililitrii de soluție alcalină de 0,1 N consumați pentru menținerea pH-ului constant. Rezultatul obținut trebuie să fie un grafic liniar.

Activitatea lipazei, exprimată în unități lipazice pe mg, este calculată cu ajutorul formulei următoare:

unde:

A	reprezintă activitatea în unități lipazice/mg;
V	reprezintă numărul de mililitri de soluție de hidroxid de sodiu 0,1 N pe minut (calculat pe baza graficului);
N	reprezintă valoarea normală a soluției de hidroxid de sodiu;
m	reprezintă masa în mg a mostrei de lipază.

Unitatea lipazică se definește ca fiind cantitatea de enzimă care produce 10 microechivalenți de acid pe minut.”;