1)

Na parte A, é aditado o seguinte capítulo:

«A.25   CONSTANTES DE DISSOCIAÇÃO EM ÁGUA (MÉTODO DE TITULAÇÃO — MÉTODO ESPETROFOTOMÉTRICO — MÉTODO CONDUTIMÉTRICO)

INTRODUÇÃO

Este método de ensaio é equivalente ao Test Guideline 112 (1981) da OCDE.

Pré-requisitos

Dados para orientação

Condições de admissibilidade

Documentos normalizados

O presente método baseia-se nos métodos indicados nas referências incluídas na respetiva secção e no Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification da EPA, de 18 de agosto de 1978.

MÉTODO — INTRODUÇÃO, FINALIDADE, ÂMBITO, PERTINÊNCIA, APLICAÇÃO E LIMITES DO ENSAIO

A dissociação de uma substância na água é importante para avaliar o seu impacto no ambiente. Determina a forma da substância, que, por sua vez, determina o seu comportamento e o seu transporte. Pode afetar a absorção da substância nos solos e nos sedimentos, bem como nas células biológicas.

Definições e unidades

Dissociação é a divisão reversível em duas ou mais espécies químicas, que podem ser iónicas. O processo, em termos gerais, é expresso pela equação

RX ⇌ R ++ X –

A constante de equilíbrio que rege a reação, expressa em função da concentração, é dada por

Por exemplo, no caso particular em que R é o hidrogénio (substância ácida), a constante é

ou

Substâncias de referência

Quando se investiga uma substância nova, não é necessário utilizar em todos os casos as substâncias de referência que se seguem. Referem-se, principalmente, para executar com regularidade a calibração do método, bem como para possibilitar a comparação dos resultados se se aplicar outro método.

Seria útil dispor de uma substância com vários pKs, conforme se referirá na descrição do princípio do método. Uma substância desse tipo pode ser, por exemplo:

Princípio do método de ensaio

Em termos gerais, o processo descrito depende apenas ligeiramente da temperatura, na gama de temperaturas relevantes do ponto de vista ambiental. A determinação da constante de dissociação exige a medição das concentrações das formas dissociada e não dissociada do produto químico. A constante pode ser determinada com base na estequiometria da reação de dissociação indicada em «Definições e unidades» No caso específico descrito no presente método de ensaio, a substância comporta-se como ácido ou como base, sendo a determinação feita, de forma mais prática, pela determinação das concentrações relativas das formas ionizada e não ionizada da substância e do pH da solução. A relação entre estes termos é dada pela equação que define o pKa, na secção «Definições e unidades» Algumas substâncias apresentam várias constantes de dissociação, para as quais se podem estabelecer equações semelhantes. Alguns dos métodos a seguir descritos são também adequados para processos de dissociação que não envolvam ácidos nem bases.

Critérios de qualidade

Repetibilidade

A constante de dissociação deve ser reprodutível com uma aproximação a ± 0,1 unidades logarítmicas (no mínimo, três determinações).

DESCRIÇÃO DO PROTOCOLO DE ENSAIO

Podem adotar-se duas abordagens básicas para a determinação do pKa. Uma delas consiste na titulação de uma determinada quantidade de substância com um padrão ácido ou básico, consoante o caso; a outra consiste em determinar a concentração relativa das formas ionizada e não ionizada e a sua dependência do pH.

Preparações

Os métodos baseados nos referidos princípios compreendem processos de titulação, espetrofotométricos e condutimétricos.

Soluções utilizadas no ensaio

Nos métodos de titulação e condutimétrico, o produto químico deve ser dissolvido em água destilada. No caso da espetrofotometria e de outros métodos, utilizam-se soluções-tampão. A concentração da substância em estudo não pode exceder 0,01 M ou metade da concentração de saturação (prevalecendo o menor destes valores), devendo utilizar-se uma substância com a maior pureza possível para completar as soluções. Se a substância for moderadamente solúvel, pode ser dissolvida numa pequena quantidade de solvente miscível em água antes de ser adicionada nas concentrações atrás indicadas.

Deve averiguar-se a presença de emulsões nas soluções por recurso a um feixe de filtração, em especial se se utilizar um cossolvente para reforçar a solubilidade. Se se utilizarem soluções-tampão, a concentração do tampão não pode exceder 0,05 M.

Condições de realização do ensaio

Temperatura

A temperatura deve ser mantida num intervalo máximo de ± 1 °C. A determinação deve ser efetuada, de preferência, à temperatura de 20 °C.

Caso se preveja que os resultados dependam da temperatura, a determinação deve ser efetuada a, pelo menos, duas outras temperaturas de ensaio. Nestas condições, os intervalos de temperatura devem ser de 10 °C e a temperatura deve ser mantida a ± 0,1 °C.

Análises

O método será determinado pela natureza da substância que se pretende ensaiar. Deve ser suficientemente sensível para permitir a determinação das diferentes espécies em cada concentração de ensaio.

Realização do ensaio

Método de titulação

A solução de ensaio é titulada com a solução-padrão de ácido ou de base, consoante o caso, medindo-se o pH após cada adição de titulante. Devem efetuar-se, pelo menos, 10 adições antes de ser atingido o ponto de equivalência. Se o equilíbrio for atingido com rapidez suficiente, pode utilizar-se um potenciómetro registador. Neste método, tanto a quantidade total como a concentração da substância têm de ser conhecidas com rigor. Devem ser tomadas precauções para evitar a interferência de dióxido de carbono. Os ensaios de referência (p. ex., referências (1), (2), (3) e (4)) contêm pormenores sobre o procedimento, as precauções a tomar e os cálculos.

Método espetrofotométrico

Determina-se o comprimento de onda ao qual as formas ionizada e não ionizada da substância têm coeficientes de extinção consideravelmente diferentes. Obtém-se o espetro de absorção no UV/VIS de soluções de concentração constante, em função do pH, para substâncias essencialmente não ionizadas e totalmente ionizadas, a vários pH intermédios. Para tal, pode proceder-se à adição de porções de ácido ou base concentrados a um volume relativamente grande de uma solução da substância num tampão multicomponentes, a um pH inicialmente alto ou baixo (ref. 5), ou à adição de volumes iguais de uma solução de reserva da substância (p. ex., em água ou metanol) a volumes constantes de diversas soluções-tampão que abranjam o intervalo de pH pretendido. A partir dos valores de pH e de absorvância no comprimento de onda selecionado, calcula-se um número suficiente de valores de pKa utilizando dados a, pelo menos, cinco pH, se a substância for ionizada a, pelo menos, 10 % e a menos de 90 %. A referência (1) apresenta dados experimentais complementares e o método de cálculo.

Método condutimétrico

Utilizando uma célula de constante conhecida (baixa), mede-se a condutividade de uma solução aproximadamente 0,1 M da substância em água condutora. Medem-se também as condutividades de uma série de diluições rigorosas da solução. Reduz-se a concentração para metade em cada ensaio, devendo a série abranger, pelo menos, uma ordem de grandeza de concentração. Determina-se a condutividade-limite a uma diluição infinita, realizando um ensaio similar com o sal sódico e extrapolando. O grau de dissociação pode ser calculado a partir da condutividade de cada solução, utilizando a equação de Onsager; a constante de dissociação pode ser calculada por recurso à lei da diluição de Ostwald, de acordo com a equação K = α2C/(1 – α, em que C é a concentração, em moles por litro, e α a fração dissociada. Devem tomar-se precauções para evitar a interferência de CO2. Os textos normalizados e as referências (1), (6) e (7) apresentam dados experimentais complementares, assim como o método de cálculo.

RESULTADOS E RELATÓRIO

Tratamento dos resultados

Método de titulação

Calcula-se o pKa para 10 pontos medidos na curva de titulação. Calculam-se a média e o desvio-padrão dos valores de pKa. Juntamente com a apresentação na forma de quadro, deve fornecer-se uma representação gráfica do pH em função do volume da base-padrão ou do ácido-padrão.

Métodos espetrofotométricos

Tabulam-se a absorvância e o pH relativamente a cada espetro. Calculam-se, pelo menos, cinco valores de pKa a partir dos dados espetrais intermédios, calculando-se também a média e o desvio-padrão dos resultados.

Método condutimétrico

A condutividade equivalente, Λ, é calculada para cada concentração de ácido e para cada concentração de uma mistura de um equivalente de ácido e 0,98 equivalentes de hidróxido de sódio isento de carbonatos. Utiliza-se ácido em excesso a fim de evitar um excesso de iões OH– devido à ocorrência de hidrólise. Representa-se graficamente 1/Λ em função de Ö_C; o valor Λo do sal pode ser determinado por extrapolação à concentração zero.

O valor Λo do ácido pode ser calculado utilizando os valores referidos na bibliografia para H+ e Na+. O pKa pode ser calculado com base nas equações α = Λi /Λo e Ka = α2C/(1 – α), para cada concentração. Podem obter-se valores mais rigorosos de Ka aplicando correções relativas à mobilidade e à atividade. Devem calcular-se a média e o desvio-padrão dos valores de pKa.

Relatório de ensaio

Devem apresentar-se todos os dados em bruto e os valores calculados de pKa, juntamente com o método de cálculo (de preferência em forma de quadro, como sugerido na ref. 1), assim como os parâmetros estatísticos acima descritos. No respeitante aos métodos por titulação, devem fornecer-se pormenores sobre a normalização dos titulantes.

No respeitante ao método espetrofotométrico, devem apresentar-se todos os espetros. No respeitante ao método condutimétrico, deve especificar-se o modo de determinação da constante da célula. Devem também fornecer-se informações sobre a técnica utilizada, os métodos analíticos e a natureza dos eventuais tampões utilizados.

Devem ainda comunicar-se as temperaturas de ensaio.

REFERÊNCIAS

2)

Na parte B, o capítulo B.5 é substituído pelo seguinte texto:

«B.5   IRRITAÇÃO/CORROSÃO OCULAR AGUDAS

INTRODUÇÃO

Este método de ensaio é equivalente ao Test Guideline 405 (2012) da OCDE. Para que espelhem o estado da ciência, os Test Guidelines da OCDE para o ensaio de produtos químicos são revistos periodicamente. Em revisões anteriores do Test Guideline 405, foi dada especial atenção aos possíveis melhoramentos resultantes da avaliação de toda a informação já existente sobre o produto químico em estudo, de modo a evitar ensaios desnecessários em animais de laboratório e assim atender à problemática do bem-estar animal. O Test Guideline 405 (adotado em 1981 e atualizado em 1987, 2002 e 2012) inclui a recomendação de se efetuar uma análise de ponderação da suficiência da prova (1) dos dados relevantes já existentes antes de se realizar o ensaio in vivo descrito para a irritação/corrosão aguda. No caso de não se encontrarem disponíveis dados suficientes, recomenda-se a obtenção desses dados através da aplicação de ensaios sequenciais (2) (3). A estratégia de ensaio recomendada inclui a realização de ensaios in vitro validados e reconhecidos, como se descreve no suplemento do presente método. As orientações da Agência Europeia dos Produtos Químicos (ECHA) compreendem igualmente uma estratégia de ensaio integrada (21) para os efeitos do Regulamento (CE) n.o 1907/2006, relativo ao registo, avaliação, autorização e restrição dos produtos químicos (REACH) (2). Apenas se deve recorrer a ensaios em animais se tal vier a ser considerado necessário depois de examinados os métodos alternativos disponíveis e de aplicados os tidos como adequados. À data da atualização do presente método de ensaio, há casos em que continua a ser necessário recorrer a este método ou em que determinados quadros legislativos o exigem.

A atualização mais recente, sem incidências nos conceitos básicos e na estrutura das orientações de ensaio, centrou-se na utilização de analgésicos e de anestésicos. O ICCVAM (3) e um painel científico internacional independente de pares avaliadores examinaram a utilidade e as limitações da utilização rotineira de anestésicos tópicos, de analgésicos sistémicos e de parâmetros eticamente aceitáveis em ensaios de irritação ocular in vivo realizados por razões de segurança. Concluiu-se do exame efetuado que o recurso a anestésicos tópicos e a analgésicos sistémicos pode eliminar praticamente ou mesmo eliminar na totalidade a dor e o sofrimento causados aos animais, sem prejudicar os resultados dos ensaios, tendo sido recomendada a utilização sistemática dessas substâncias. O presente método tem em conta o referido exame. Nos ensaios de irritação e corrosão ocular aguda in vivo devem ser utilizados rotineiramente anestésicos tópicos, analgésicos sistémicos e parâmetros eticamente aceitáveis. As exceções a este princípio têm de ser justificadas. Os aperfeiçoamentos incorporados no presente método reduzirão substancialmente ou eliminarão mesmo a dor e o sofrimento dos animais na maior parte das situações ensaiadas, nos casos em que continue a ser necessário realizar ensaios oculares in vivo por razões de segurança.

Uma gestão preventiva e equilibrada da dor passa: (i) pela administração rotineira de um anestésico tópico (proparacaína ou tetracaína, por exemplo) e de um analgésico sistémico (por exemplo a buprenorfina) antes da aplicação do produto químico em estudo; (ii) por um programa de analgesia sistémica de rotina após a aplicação do produto químico em estudo (através da buprenorfina e do meloxicam, por exemplo); (iii) por um programa de observação, monitorização e registo de sinais clínicos de dor e/ou sofrimento nos animais; (iv) por um programa de observação, monitorização e registo da natureza, intensidade e evolução das lesões oculares. Apresentam-se mais elementos nos procedimentos atualizados a seguir descritos. Para evitar interferências no estudo, não devem ser administrados anestésicos ou analgésicos tópicos depois de administrado o produto químico em estudo. Os analgésicos anti-inflamatórios (por exemplo o meloxicam) não devem ser aplicados por via tópica e as doses utilizadas por via sistémica não devem interferir nos efeitos oculares.

Estabelecem-se definições no apêndice 1 do método de ensaio.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

Tendo em vista o melhor interesse científico e o bem-estar animal, não se deve encarar a realização de ensaios in vivo enquanto não tiverem sido avaliados, por meio de uma análise de ponderação da suficiência da prova, todos os dados disponíveis relevantes para os potenciais efeitos corrosivos/irritantes do produto químico ao nível ocular. Os dados compreendem elementos indiciadores de estudos já realizados no ser humano e/ou em animais de laboratório, provas de efeitos corrosivos/irritantes de uma ou mais substâncias estruturalmente afins ou de misturas dessas substâncias, dados reveladores de elevada acidez ou alcalinidade do produto químico (4) (5) e resultados de ensaios in vitro ou ex vivo de corrosão da pele e de corrosão/irritação ocular validados e reconhecidos (6) (13) (14) (15) (16) (17). Estes estudos podem ter sido realizados antes de uma análise de ponderação da suficiência da prova ou tê-lo sido no seguimento dessa análise.

No caso de alguns produtos químicos, a referida análise pode revelar a necessidade de estudos in vivo do potencial de irritação/corrosão ocular do produto químico. Nesses casos, antes de se ponderar a realização de um ensaio ocular in vivo, deve efetuar-se, preferencialmente, um estudo in vitro e/ou in vivo dos efeitos de corrosão da pele do produto químico, a avaliar de acordo com a estratégia de ensaio sequencial descrita no método de ensaio B.4 (7) ou com a estratégia de ensaio integrada descrita nas orientações da Agência Europeia dos Produtos Químicos (21).

O presente método compreende um suplemento descritivo de uma estratégia de ensaio sequencial que contempla a realização de ensaios validados de corrosão/irritação ocular in vitro ou ex vivo. A mesma estratégia é contemplada nas orientações da ECHA, para efeitos do Regulamento REACH (21). Recomenda-se a aplicação dessa estratégia de ensaio sequencial antes da realização de ensaios in vivo. No caso dos produtos químicos novos, recomenda-se o recurso a uma metodologia de ensaio por etapas para obter dados científicos fiáveis sobre os efeitos corrosivos/irritantes do produto químico. No caso dos produtos químicos já existentes, mas para os quais não se disponha de dados suficientes sobre corrosão/irritação da pele e corrosão/irritação ocular, pode recorrer-se à referida estratégia para obter os dados em falta. Caso se opte por uma estratégia ou um protocolo de ensaio diferente ou se decida não aplicar uma metodologia de ensaio por etapas, será necessário justificá-lo.

PRINCÍPIO DO ENSAIO IN VIVO

Após a administração de um analgésico sistémico e a indução da anestesia tópica adequada, aplica-se uma dose única do produto químico em estudo num dos olhos do animal utilizado no ensaio, servindo o outro olho de amostra de controlo. Avalia-se o grau de irritação/corrosão ocular pontuando as lesões da conjuntiva, da córnea e da íris a intervalos determinados. Para possibilitar uma avaliação completa dos efeitos, também se descrevem os outros efeitos oculares e as perturbações sistémicas. A duração do estudo deve ser suficiente para avaliar a reversibilidade ou irreversibilidade dos efeitos.

Os animais que, em qualquer estádio do ensaio, apresentem sinais de dor e/ou sofrimento acentuados ou lesões que excedam os níveis máximos eticamente aceitáveis descritos neste método (ver o ponto 26) devem ser eutanasiados, procedendo-se à avaliação do produto químico em conformidade. Os critérios por que se deve reger a decisão de eutanasiar animais moribundos e animais em grande sofrimento constam de um documento de orientações da OCDE (8).

PREPARAÇÃO PARA O ENSAIO IN VIVO

Escolha da espécie

O coelho albino é o animal de laboratório mais adequado, devendo recorrer-se a animais adultos jovens e saudáveis. Se forem utilizadas outras estirpes ou espécies será necessário justificá-lo.

Preparação dos animais

24 horas antes de lhe dar início, examinam-se ambos os olhos de cada animal provisoriamente selecionado para o ensaio. Não devem ser utilizados animais que apresentem irritação ocular, defeitos oculares ou lesões da córnea.

Condições de alojamento e de alimentação

Os animais devem ser alojados individualmente. A temperatura do biotério para o coelho deve ser de 20 °C (± 3 °C). A humidade relativa deve estar compreendida entre 50 % e 60 %, embora sejam aceitáveis valores compreendidos entre 30 %, no mínimo, e um valor máximo que, preferencialmente, não deve exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do biotério. A iluminação deve ser artificial, com uma alternância de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. A intensidade luminosa não deve ser excessiva. Para a alimentação, podem ser usadas dietas convencionais de laboratório, com acesso ilimitado a água potável.

PROTOCOLO DE ENSAIO

Utilização de anestésicos tópicos e de analgésicos sistémicos

Para evitar ou minimizar a dor e o sofrimento nos ensaios oculares realizados por razões de segurança, recomendam-se os procedimentos a seguir descritos. Em alternativa, pode proceder-se de outro modo que comprovadamente permita evitar ou aliviar a dor e o sofrimento com eficácia idêntica ou superior à destes procedimentos.

Aplicação do produto químico em estudo

Deposita-se o produto químico em estudo no saco conjuntival de um dos olhos de cada animal, depois de cuidadosamente afastada do globo ocular a pálpebra inferior. Em seguida, juntam-se cuidadosamente as pálpebras durante cerca de um segundo, para evitar perdas. O outro olho, no qual não é aplicado o produto químico em estudo, serve de amostra de controlo.

Irrigação

Os olhos dos animais utilizados no ensaio não devem ser lavados durante, pelo menos, as 24 horas seguintes à instilação do produto químico em estudo, exceto no caso dos sólidos (ver o ponto 18) e se surgir imediatamente alguma manifestação de corrosão ou de irritação. Passadas 24 horas, pode efetuar-se uma lavagem, se se considerar adequado.

Não se recomenda a utilização de um grupo-satélite de animais para investigar a influência da lavagem, a menos que razões científicas o justifiquem. Se for necessário um grupo-satélite de animais, este deve ser constituído por dois coelhos. As condições de lavagem devem ser cuidadosamente documentadas; por exemplo: data e hora da lavagem; composição e temperatura da solução de lavagem; duração, volume e velocidade de aplicação.

Nível de dosagem

1)   Ensaio de líquidos

No ensaio de líquidos utiliza-se uma dose de 0,1 ml. Não devem ser utilizados nebulizadores de bomba para instilar diretamente o produto químico no olho. O líquido deve ser nebulizado e recolhido num recipiente antes de se instilarem 0,1 ml no olho.

2)   Ensaio de sólidos

No ensaio de sólidos, massas ou produtos químicos em partículas, a quantidade a utilizar deve ser de 0,1 ml ou uma massa não superior a 100 mg. O produto químico em estudo deve ser reduzido a um pó fino. O volume da matéria sólida deve ser medido após compactação ligeira; por exemplo: batendo várias vezes, com cuidado, no recipiente que a contém. Se, aquando da primeira observação, 1 hora após a aplicação do produto químico sólido em estudo, este não tiver sido removido, pelos mecanismos fisiológicos, do olho do animal ensaiado, pode lavar-se o olho com soro fisiológico ou água destilada.

3)   Ensaio de aerossóis

Recomenda-se que o volume a instilar seja previamente extraído do nebulizador de bomba ou pulverizador de aerossol, antes de o aplicar no olho. A única exceção é para produtos químicos que se apresentem em recipientes de aerossol pressurizados, os quais não podem ser previamente extraídos por se vaporizarem. Nesses casos, deve manter-se o olho aberto e administrar-se o produto químico por meio de um jato único com a duração aproximada de um segundo, mantendo o recipiente à distância de 10 cm, diretamente à frente do olho. A distância pode variar em função da pressão do jato e da composição do mesmo. Devem ser tomadas precauções adequadas para que a pressão do jato não lesione o olho. Em determinados casos, pode ser necessário avaliar o potencial de lesão «mecânica» do olho pela força exercida pelo jato.

Pode obter-se uma estimativa da dose de um aerossol através da simulação da aplicação no ensaio da seguinte forma: pulveriza-se o produto químico para um papel de pesagem através de uma abertura do tamanho de um olho de coelho, colocada diretamente à frente do papel. O aumento de peso do papel corresponde aproximadamente à quantidade pulverizada no olho. No caso dos produtos químicos voláteis, pode estimar-se a dose pesando o recipiente que contém o produto químico em estudo antes e depois de este dele ser retirado.

Ensaio inicial (ensaio in vivo de irritação/corrosão ocular num único animal)

Recomenda-se vivamente que o ensaio in vivo seja realizado uma primeira vez num único animal (ver o suplemento «Estratégia de ensaio sequencial para irritação e corrosão oculares» a este método de ensaio). A passagem ou não a um ensaio de confirmação noutro animal depende da intensidade e do grau de reversibilidade observados no primeiro.

Se os resultados deste primeiro ensaio, realizado conforme descrito, indicarem que o produto químico é corrosivo ou irritante severo para o olho, deve pôr-se termo aos ensaios de irritação ocular.

Ensaio de confirmação (ensaio in vivo de irritação ocular noutros animais)

Se, no ensaio inicial, não for observada corrosão nem irritação severa, é necessário confirmar a reação de irritação ou a reação negativa noutro animal ou noutros dois animais. Se, no ensaio inicial, for observada irritação, recomenda-se que o ensaio de confirmação seja realizado num animal de cada vez, não expondo os dois animais simultaneamente. Se for observada corrosão ou irritação severa no segundo animal, não se continua o ensaio. Se os resultados observados no segundo animal permitirem estabelecer uma classificação de perigosidade, também não será necessário prosseguir o ensaio.

Período de observação

O período de observação deve ser suficiente para uma avaliação completa da intensidade e da reversibilidade dos efeitos observados. No entanto, as experiências devem ser imediatamente interrompidas se algum animal apresentar sinais de dor intensa ou de grande sofrimento (8). Para determinar a reversibilidade dos efeitos, normalmente os animais devem ser examinados durante 21 dias após a administração do produto químico em estudo. Caso se observe reversibilidade antes de terminado o período de 21 dias, interrompem-se imediatamente as experiências.

Exames clínicos e pontuação das reações oculares

Uma hora após a aplicação do produto químico em estudo e, subsequentemente, pelo menos uma vez por dia, observam-se atentamente os olhos para verificar a presença ou ausência de lesões oculares. Nos três primeiros dias, os animais devem ser examinados várias vezes por dia, para que as eventuais decisões de pôr termo aos ensaios possam ser tomadas atempadamente. Os animais utilizados no ensaio devem ser sujeitos a exames de rotina durante o estudo, pelo menos duas vezes por dia, respeitando um intervalo de, pelo menos, seis horas entre os exames (que, ainda assim, pode ser reduzido em caso de necessidade), com vista à deteção de sinais clínicos de dor e/ou sofrimento (por exemplo, tocam repetidamente com as patas no olho, ou coçam-no repetidamente, pestanejam demasiado ou lacrimejam muito) (9) (10) (11). Estes exames são necessários para: (i) detetar adequadamente qualquer sinal de dor ou de sofrimento dos animais, a fim de poder tomar decisões fundamentadas sobre a necessidade de aumentar ou não a dose de analgésicos; (ii) detetar qualquer indício de que os níveis máximos eticamente aceitáveis tenham sido excedidos, a fim de poder tomar decisões fundamentadas sobre a conveniência de eutanasiar os animais, em ambos os casos atempadamente. Para facilitar a deteção e a medição das lesões oculares e determinar se os níveis máximos eticamente aceitáveis já foram excedidos, utiliza-se normalmente a coloração pela fluoresceína e, se necessário (por exemplo para determinar a profundidade da lesão em caso de ulceração da córnea), um biomicroscópio equipado com lâmpada de fenda. Para referência e para manter um registo permanente da extensão das lesões oculares, podem tirar-se fotografias digitais das lesões observadas. Os animais só devem ser mantidos em ensaio durante o tempo necessário para obter informações definitivas. Os que evidenciem dor intensa ou grande sofrimento devem ser eutanasiados sem demora, procedendo-se à avaliação do produto químico em conformidade.

Devem ser eutanasiados os animais que, depois da instilação, apresentem as seguintes lesões oculares (ver no quadro 1 a descrição da graduação das lesões): perfuração da córnea ou ulceração significativa da córnea associada a estafiloma; presença de sangue na câmara anterior do olho; opacidade da córnea de grau 4; ausência de reflexo à luz (resposta da íris de grau 2), persistente durante 72 horas; ulceração da membrana conjuntival; necrose das conjuntivas ou da membrana nictitante; ou descamação. A razão disto é que normalmente estas lesões são irreversíveis. Recomenda-se ainda que as lesões oculares a seguir indicadas sejam consideradas motivo eticamente suficiente para pôr termo ao estudo antes de concluído o período de observação programado de 21 dias (trata-se de lesões indiciadoras de sintomatologia de efeitos corrosivos ou de irritação severa e de lesões previsivelmente não reversíveis na totalidade até ao final do período de observação de 21 dias): lesões muito profundas (por exemplo ulcerações da córnea que vão além das camadas superficiais do estroma), destruição do limbo superior a 50 % (evidenciada pelo embranquecimento do tecido conjuntival) e infeção ocular severa (corrimento purulento). A associação de vascularização da superfície da córnea (pano) a uma superfície corada pela fluoresceína que não vai diminuindo dia a dia e/ou à inexistência de reepitelização 5 dias após a aplicação do produto químico em estudo também pode ser ponderada como critério potencialmente útil a ter em conta nas decisões clínicas de pôr ou não termo ao estudo antecipadamente. Todavia, cada uma destas observações não é, por si só, suficiente para justificar o termo antecipado do estudo. Se forem detetados efeitos oculares severos, deve solicitar-se, ao veterinário assistente, a outro veterinário especializado em animais de laboratório ou a pessoal formado na identificação de lesões clínicas, que proceda a um exame clínico para determinar se a associação dos ditos efeitos constitui motivo suficiente para antecipar o termo do estudo. Determinam-se e registam-se os graus de reação ocular (das conjuntivas, da córnea e da íris) transcorridas 1, 24, 48 e 72 horas sobre a aplicação do produto químico em estudo (quadro 1). Os animais nos quais não se desenvolvam lesões oculares nos três dias subsequentes à instilação podem ser retirados do estudo. Os que não apresentem lesões severas devem permanecer sob observação até ao desaparecimento das lesões ou durante 21 dias, após o que se põe termo ao estudo. Como mínimo, os exames de avaliação de lesões e de apreciação da reversibilidade ou irreversibilidade destas devem ser efetuados, e os seus resultados registados, transcorridos 1 hora, 24 horas, 48 horas, 72 horas, 7 dias, 14 dias e 21 dias sobre a aplicação do produto químico em estudo. Se necessário, podem realizar-se exames mais frequentes para determinar se um determinado animal deve ser eutanasiado, com base em critérios éticos, ou retirado do estudo, por evidenciar resultados negativos.

Ao realizar um exame, registam-se os graus das lesões oculares (quadro 1). Quaisquer outras lesões oculares (por exemplo: pano da córnea, coloração ou alterações da câmara anterior) ou perturbações sistémicas devem igualmente ser mencionadas no relatório.

O exame das reações pode ser facilitado pela utilização de uma lupa binocular, de uma lâmpada de fenda portátil, de um biomicroscópio ou de outro instrumento apropriado. Uma vez registadas as observações às 24 horas, pode prosseguir-se o exame dos olhos com o auxílio de fluoresceína.

A graduação das reações oculares é necessariamente subjetiva. Numa perspetiva de harmonização da graduação das reações oculares e em benefício dos laboratórios de ensaio e das pessoas envolvidas na realização dos exames e na interpretação das observações, o pessoal que realiza os exames deve receber formação adequada sobre o sistema de graduação utilizado.

DADOS E RELATÓRIOS

Avaliação dos resultados

Os graus de irritação ocular devem ser avaliados conjuntamente com a natureza, a intensidade e a reversibilidade ou irreversibilidade das lesões. As pontuações individuais não representam um padrão absoluto das propriedades irritantes do produto químico em estudo, pois são também avaliados outros efeitos do mesmo. Pelo contrário, as pontuações individuais devem ser encaradas como valores de referência e só têm significado quando enquadradas numa descrição e numa avaliação completas do conjunto das observações.

Relatório do ensaio

Elementos a constar do relatório do ensaio:

Interpretação dos resultados

A extrapolação, para seres humanos, de resultados de estudos de irritação ocular em animais de laboratório tem algumas limitações de validade. Em muitos casos, o coelho albino é mais sensível do que o ser humano a produtos químicos irritantes ou corrosivos oculares.

A interpretação dos dados deve ser cuidadosa, para excluir qualquer irritação resultante de infeções secundárias.

REFERÊNCIAS

Quadro 1

Graduação de lesões oculares

SUPLEMENTO AO MÉTODO DE ENSAIO B.5  (4)

ESTRATÉGIA DE ENSAIO SEQUENCIAL PARA IRRITAÇÃO E CORROSÃO OCULARES

Aspetos gerais

Tendo em vista o melhor interesse científico e o bem-estar animal, importa evitar a utilização desnecessária de animais e minimizar os ensaios que neles possam causar reações severas. Antes de se ponderar a realização de ensaios in vivo, devem ser analisadas todas as informações disponíveis sobre o produto químico com importância para as potencialidades de irritação/corrosão ocular do mesmo. Pode dar-se o caso de existirem já dados suficientes para classificar o produto químico em estudo em termos do seu potencial irritante ou corrosivo ocular, sem necessidade de realizar ensaios em animais de laboratório. O recurso a uma análise de ponderação da suficiência da prova e a uma estratégia de ensaio sequencial minimizará, portanto, a necessidade de ensaios in vivo, especialmente no caso dos produtos químicos suscetíveis de produzir reações severas.

Recomenda-se o recurso a uma análise de ponderação da suficiência da prova para avaliar a informação existente sobre irritação e corrosão oculares causadas por produtos químicos e para determinar se a caracterização do potencial de irritação e corrosão oculares exige a realização de estudos adicionais, que não estudos oculares in vivo. No caso de serem necessários estudos adicionais, recomenda-se uma estratégia de ensaio sequencial para obter os dados experimentais relevantes. No caso das substâncias que nunca tenham sido ensaiadas, também deve ser utilizada a dita estratégia sequencial para obter os dados necessários à avaliação da capacidade irritante e da corrosividade oculares da substância. A estratégia de ensaio inicial descrita neste suplemento foi elaborada por um grupo de trabalho da OCDE (1). Foi subsequentemente confirmada e ampliada no sistema harmonizado e integrado de classificação dos perigos das substâncias químicas para a saúde humana e para o ambiente, aprovado na 28.a sessão conjunta do comité dos produtos químicos e do grupo de trabalho «Produtos Químicos» realizada em novembro de 1998 (2), e atualizada por um grupo de peritos da OCDE em 2011.

Apesar de não fazer parte do método de ensaio B.5, esta estratégia de ensaio expressa a metodologia recomendada para a determinação de propriedades de irritação/corrosão ocular. Esta metodologia representa, não só as melhores práticas, mas também uma referência ética para os ensaios in vivo de irritação/corrosão ocular. O método de ensaio dá orientações para a realização de ensaios in vivo e resume os fatores a ter em conta antes de a ponderar. A estratégia de ensaio sequencial compreende uma metodologia de ponderação da suficiência da prova, para avaliar os dados já existentes sobre as propriedades de irritação/corrosão oculares de produtos químicos, e uma abordagem sequencial por etapas, para obter os dados necessários sobre os produtos químicos que careçam de estudos adicionais ou que nunca tenham sido estudados. A estratégia inclui, primeiro, a realização de ensaios in vitro ou ex vivo validados e reconhecidos e, em seguida, a realização de estudos segundo o método de ensaio B.4, adaptados às circunstâncias específicas (3) (4).

Descrição da estratégia de ensaio por etapas

Antes de realizar ensaios integrados na estratégia de ensaio sequencial (ver o quadro infra), deve avaliar-se, com base nas informações disponíveis, se são ou não necessários ensaios oculares in vivo. Embora possam obter-se informações significativas avaliando isoladamente determinados parâmetros (por exemplo um pH extremo), importa examinar todas as informações existentes. Para uma decisão baseada na ponderação da suficiência da prova, devem ser avaliados todos os dados relevantes sobre os efeitos do produto químico, bem como dos análogos estruturais deste, e deve fundamentar-se a decisão tomada. Devem ser privilegiados os dados já existentes sobre os efeitos do produto químico em pessoas e animais, seguindo-se os resultados de ensaios in vitro ou ex vivo. Sempre que possível, devem evitar-se estudos in vivo de produtos químicos corrosivos. Fatores considerados na estratégia de ensaio:

ESTRATÉGIA DE ENSAIO E AVALIAÇÃO DE IRRITAÇÃO/CORROSÃO OCULAR

REFERÊNCIAS

3)

Na parte B, o capítulo B.10 é substituído pelo seguinte texto:

«B.10   Ensaio in vitro de aberrações cromossómicas em mamíferos

INTRODUÇÃO

O presente método de ensaio é equivalente ao Test Guideline 473 (2016) da OCDE. Faz parte integrante de uma série de métodos de ensaio no domínio da toxicologia genética. Está disponível um documento da OCDE que fornece informações sucintas sobre ensaios de toxicologia genética e resume as alterações recentemente efetuadas às orientações da OCDE nesse domínio (1).

O objetivo do ensaio in vitro de aberrações cromossómicas é identificar os produtos químicos que causam aberrações cromossómicas estruturais em culturas de células de mamíferos (2) (3) (4). As aberrações estruturais podem ser de dois tipos — cromossómicas ou cromatídicas. Em ensaios in vitro de aberrações cromossómicas pode observar-se poliploidia (incluindo endorreduplicação). Embora os aneugénios possam induzir a poliploidia, esta, por si só, não é um indicativo do potencial aneugénico, podendo indicar simplesmente uma perturbação do ciclo celular ou citotoxicidade (5). O presente ensaio não é concebido para detetar a aneuploidia. Para esse fim, é recomendável um ensaio in vitro de micronúcleos (6).

O ensaio in vitro de aberrações cromossómicas pode utilizar culturas de linhas celulares bem estabelecidas ou culturas primárias de células humanas ou de roedores. As células utilizadas devem ser selecionadas com base na sua capacidade de crescimento em cultura, na estabilidade do cariótipo (incluindo o número de cromossomas) e na frequência das aberrações cromossómicas espontâneas (7). Os dados atualmente disponíveis não permitem efetuar recomendações sólidas, mas sugerem que, ao avaliar os perigos químicos, é importante considerar o estatuto da proteína p53, a estabilidade genética (do cariótipo), a capacidade de reparação do ADN e a origem (roedores ou humanos) das células escolhidas para a realização do ensaio. Os utilizadores do presente método de ensaio são, assim, incentivados a ponderar a influência destas e de outras características celulares no desempenho de uma linha celular, ao detetarem a indução de aberrações cromossomáticas, dada a evolução constante dos conhecimentos nesta área.

As definições utilizadas figuram no apêndice 1.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES

Os ensaios in vitro necessitam, normalmente, de uma fonte exógena de ativação metabólica, a menos que as células sejam metabolicamente competentes em relação aos produtos químicos em estudo. O sistema exógeno de ativação metabólica não reproduz inteiramente as condições in vivo. Deve ter-se o cuidado de evitar condições que possam conduzir a falsos resultados positivos, ou seja, danos cromossomáticos não causados pela interação direta entre os produtos químicos em estudo e os cromossomas, condições essas que incluem alterações do pH ou da pressão osmótica (8) (9) (10), a interação com os componentes do meio (11) (12) ou níveis excessivos de citotoxicidade (13) (14) (15) (16).

O presente ensaio é utilizado para a deteção de aberrações cromossómicas que possam resultar de eventos clastogénicos. A análise da indução de aberrações cromossómicas deve utilizar células em metáfase. É, pois, essencial que as células atinjam a mitose tanto em culturas tratadas como não tratadas. No caso dos nanomateriais fabricados, podem ser necessárias adaptações específicas ao presente método de ensaio, que não são descritas no mesmo.

Antes da aplicação do método de ensaio a uma mistura para obter dados com fins regulamentares, importa ponderar se, e em caso afirmativo, por que motivo, o método pode proporcionar resultados adequados para o efeito. Tais considerações não são necessárias se existir um requisito regulamentar para o ensaio da mistura.

PRINCÍPIO DO ENSAIO

Expõem-se culturas de células humanas ou de outros mamíferos ao produto químico em estudo, juntamente com uma fonte exógena de ativação metabólica e sem essa fonte, a menos que se utilizem células com capacidade metabólica adequada (ver ponto 13). Após um período adequado, pré-estabelecido, de exposição das células ao produto químico em estudo, adiciona-se um produto para o bloqueio em metáfase (por exemplo, Colcemid ou colquicina); as células em metáfase são colhidas, coradas e analisadas microscopicamente para detetar a presença de aberrações cromatídicas ou cromossómicas.

DESCRIÇÃO DO MÉTODO

Preparações

Células

Podem utilizar-se várias linhas celulares — por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO, do inglês Chinese Hamster Ovary), células pulmonares de hamster chinês (CHL, do inglês Chinese Hamster Lung)/IU, TK6 — ou culturas celulares primárias, incluindo linfócitos do sangue periférico humano ou de outros mamíferos (7). A escolha das linhas celulares utilizadas deve ser justificada cientificamente. Se forem utilizadas células primárias, deve ponderar-se, sempre que possível e por razões de bem-estar dos animais, a utilização de células primárias de origem humana, obtidas em conformidade com os princípios éticos e regulamentares. Os linfócitos de sangue humano periférico devem provir de indivíduos jovens (18-35 anos), não fumadores, sem qualquer doença conhecida ou exposição recente a agentes genotóxicos (p. ex., produtos químicos, radiações ionizantes) a níveis suscetíveis de aumentar a incidência de base de aberrações cromossómicas. Desta forma, assegura-se uma incidência de base de aberrações cromossómicas baixa e coerente. A incidência de base de aberrações cromossómicas aumenta com a idade, sendo esta tendência mais pronunciada no sexo feminino do que no sexo masculino (17) (18). Se forem reunidas para utilização células de mais do que um dador, deve indicar-se o número de dadores. É necessário demonstrar que as células se dividiram desde o início do tratamento com o produto químico em estudo até à colheita das células. As culturas celulares são mantidas numa fase de crescimento exponencial (linhas celulares) ou estimuladas para se dividirem (culturas primárias de linfócitos), de forma a que as células sejam expostas em fases diferentes do ciclo celular, uma vez que a sensibilidade das fases celulares aos produtos químicos em estudo pode não ser conhecida. As células primárias que necessitam de ser estimuladas com agentes mitogénicos para se dividirem não são sincronizadas durante o período de exposição ao produto químico em estudo (caso, p. ex., dos linfócitos humanos após 48 horas de estimulação mitogénica). A utilização de células sincronizadas durante o tratamento não é recomendada, mas pode ser aceitável se se justificar.

Meios e condições de cultura

Devem manter-se as culturas em meios de cultura e condições de incubação adequados (tipo de recipiente, atmosfera humidificada com uma concentração de CO2 de 5 %, se pertinente, temperatura de incubação 37 °C). As linhas celulares devem ser periodicamente verificadas quanto à estabilidade do número modal de cromossomas e à ausência de contaminação por micoplasmas (7) (19), não devendo ser utilizadas se se verificar que foram contaminadas ou que o número modal de cromossomas se alterou. A duração do ciclo celular normal das linhas celulares ou das culturas primárias utilizadas no laboratório de ensaio deve ser estabelecida e ser compatível com as características celulares publicadas (20).

Preparação das culturas

Linhas celulares: as células são propagadas a partir de culturas de arranque, inoculadas no meio de cultura a uma densidade tal que as células em suspensão ou em monocamadas continuem a crescer exponencialmente até ao momento da colheita (deve evitar-se, p. ex., a confluência no caso do crescimento de células em monocamadas).

Linfócitos: cultiva-se (p. ex., durante 48 horas, no caso dos linfócitos humanos) sangue integral, tratado com um anticoagulante (p.. ex., heparina), ou linfócitos separados, na presença de um agente mitogénico (p. ex., fito-hemaglutinina — PHA — para linfócitos de origem humana) destinado a induzir a divisão celular, antes da exposição ao produto químico em estudo.

Ativação metabólica

Se forem utilizadas células com capacidade metabólica endógena inadequada, será necessário utilizar sistemas metabolizantes exógenos. O sistema mais geralmente utilizado e que se recomenda por defeito, exceto motivo em contrário, é uma fração pós-mitocondrial reforçada com co-fator (S9) preparada a partir de fígados de roedores (em geral, ratos) tratados com agentes de indução enzimática, como, por exemplo, Aroclor 1254 (21) (22) (23) ou uma mistura de fenobarbital e β-naftoflavona (24) (25) (26) (27) (28) (29). Esta última combinação não é contrária à Convenção de Estocolmo sobre Poluentes Orgânicos Persistentes (30) e comprovou-se ser tão eficaz na indução de oxidases de função mista como o Aroclor 1254 (24) (25) (26) (28). A fração S9 é habitualmente utilizada em concentrações na gama de 1 % a 2 %, mas pode ser aumentada para a 10 % (v/v) no meio de ensaio final. Durante o tratamento, deve evitar-se a utilização de produtos que reduzem o índice mitótico, em especial complexantes de cálcio (31). A escolha do tipo e da concentração de sistema exógeno de ativação metabólica ou do indutor metabólico utilizado pode ser influenciada pela classe dos produtos químicos em estudo.

Preparação do produto químico em estudo

Os produtos químicos sólidos devem ser adicionados a solventes adequados e, se necessário, ser diluídos antes do tratamento das células (ver ponto 23). Os produtos químicos líquidos podem ser adicionados diretamente ao sistema de ensaio e/ou diluídos antes de serem utilizados no tratamento do sistema de ensaio. Para o ensaio de produtos químicos gasosos ou voláteis, devem efetuar-se alterações adequadas aos protocolos normalizados, como o tratamento em recipientes de cultura fechados (32) (33) (34). A preparação do produto químico em estudo deve ser feita imediatamente antes do tratamento, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o mesmo pode ser armazenado.

Condições de realização do ensaio

Solventes

O solvente deve ser escolhido de modo a otimizar a solubilidade dos produtos químicos em estudo sem afetar negativamente a realização do ensaio, por exemplo, alterando o crescimento celular, afetando a integridade do produto químico em estudo, reagindo com os recipientes de cultura ou alterando o sistema de ativação metabólica. Sempre que possível, recomenda-se a utilização de um solvente (ou meio de cultura) aquoso. A água e o dimetilssulfóxido, por exemplo, são solventes cujo desempenho é bem conhecido. Os solventes orgânicos não devem exceder, em geral, 1 % (v/v), e os solventes aquosos (salinos ou água) não devem exceder 10 % (v/v) no meio de tratamento final. Se forem utilizados solventes cujo desempenho não é bem conhecido (p. ex., etanol ou acetona), devem fornecer-se dados que comprovem a respetiva compatibilidade com os produtos químicos e o sistema em estudo e a inexistência de genotoxicidade à concentração utilizada. Na ausência de dados comprovativos, é importante incluir amostras de controlo não tratadas (ver apêndice 1) para demonstrar que o solvente escolhido não tem efeitos deletérios ou clastogénicos.

Medição da proliferação celular e da citotoxicidade e escolha das concentrações de tratamento

Ao determinar a concentração máxima a ensaiar do produto químico em estudo, devem evitar-se concentrações capazes de gerar respostas positivas falsas, como as que produzam citotoxicidade excessiva (ver ponto 22), precipitações no meio de cultura (ver ponto 23) ou alterações pronunciadas do pH ou da pressão osmótica (ver ponto 5). Se, ao ser adicionado, o produto químico em estudo causar uma alteração pronunciada do pH do meio, o pH pode ser ajustado por tamponamento do meio final, de modo a evitar falsos resultados positivos e manter condições de cultura adequadas.

Efetuam-se medições da proliferação celular para garantir que um número suficiente de células tratadas atingiu a mitose durante o ensaio e que os tratamentos são efetuados a níveis adequados de citotoxicidade (ver pontos 18 e 22). A citotoxidade deve ser determinada na experiência principal tanto na presença como na ausência de um sistema de ativação metabólica, por recurso a um indicador adequado da morte e do crescimento celulares. Embora a avaliação da citotoxicidade num ensaio inicial possa ser útil para definir melhor as concentrações a utilizar no ensaio principal, esse ensaio não é obrigatório. Se for efetuado, não deve substituir a determinação da citotoxicidade no ensaio principal.

A duplicação da população em termos relativos (RPD, de «Relative Population Doubling») ou o aumento relativo da contagem celular (RICC, de «Relative Increase in Cell Count») são métodos adequados para a avaliação da citotoxicidade em ensaios citogenéticos (13) (15) (35) (36) (55) (ver fórmulas no apêndice 2). Em caso de tratamento a longo prazo e tempos de colheita após o início do tratamento superiores a 1,5 ciclos celulares normais (ou seja, mais de 3 ciclos celulares, no total), a RPD pode levar a uma subestimação da citotoxicidade (37). Nestas condições, a RICC pode constituir uma melhor estimativa; a avaliação da citotoxicidade após 1,5 ciclos celulares normais proporcionaria uma estimativa útil com recurso à RPD.

Relativamente aos linfócitos em culturas primárias, embora o índice mitótico (IM) seja uma medida dos efeitos citotóxicos/citostáticos, é influenciado pelo tempo decorrido após o tratamento, o agente mitogénico utilizado e as eventuais perturbações do ciclo celular. Contudo, o IM é aceitável porque as medições de citotoxicidade de outros tipos podem revelar-se fastidiosas ou impraticáveis, podendo não ser aplicáveis à população-alvo de linfócitos em crescimento devido à estimulação com PHA.

Embora a RICC e a RPD, no caso de linhas celulares, e o IM, no caso da cultura primária de linfócitos, sejam os parâmetros de citotoxidade recomendados, outros indicadores de citotoxicidade (p. ex., integridade das células, apóptose, necrose, ciclo celular) podem fornecer informações adicionais úteis.

Devem avaliar-se, pelo menos, três concentrações de ensaio (não incluindo os controlos positivos e do solvente) que cumpram os critérios de aceitabilidade em termos de citotoxicidade adequada, número de células, etc. Independentemente do tipo de células (linhas celulares ou culturas primárias de linfócitos), podem utilizar-se, para cada concentração de ensaio, replicados ou culturas de tratamento único. Embora seja aconselhável a utilização de culturas em duplicado, as culturas únicas são igualmente aceitáveis desde que seja contado o mesmo número total de células nas culturas única ou em duplicado. O recurso a uma única cultura é particularmente importante quando são avaliadas mais de três concentrações (ver ponto 31). Os resultados obtidos com as culturas replicadas independentes, a uma dada concentração, podem ser agrupados para fins de análise de dados (38). No caso dos produtos químicos que demonstrem pouca ou nenhuma citotoxicidade, são adequados intervalos entre concentrações espaçados por um fator de 2 a 3. Quando se observa citotoxicidade, as concentrações escolhidas devem abranger uma gama com início na concentração que produz citotoxicidade, conforme descrito no ponto 22, e inclua as concentrações às quais se observa pouca ou nenhuma citotoxicidade. Muitos produtos químicos em estudo apresentam curvas concentração-resposta com declive acentuado, pelo que, para obter dados a citotoxicidade baixa e moderada, ou para analisar em pormenor a relação dose-resposta, será necessário recorrer a concentrações menos espaçadas e/ou a mais de três concentrações (no caso de culturas únicas ou de replicados), em especial nas situações em que for necessário repetir o ensaio (ver ponto 47).

Se a concentração máxima se basear na citotoxicidade, a concentração mais elevada deverá visar 55 ± 5 % de citotoxicidade, utilizando os parâmetros de citotoxicidade recomendados (ou seja, a redução do RICC e RPD, no caso das linhas celulares, e a redução do IM, no caso das culturas primárias de linfócitos, para 45 ± 5 % da amostra de controlo negativa correspondente). Os resultados positivos observados apenas no segmento superior da gama de 55 ± 5 % de citotoxicidade devem ser interpretados com cuidado (13).

No caso de produtos químicos pouco solúveis que não sejam citotóxicos a concentrações inferiores à concentração insolúvel mínima, a maior concentração analisada deve produzir, no final do tratamento com a substância química em estudo, turbidez ou um precipitado visível a olho nu ou com o auxílio de um microscópio invertido. Mesmo no caso de se observar citotoxicidade acima da menor concentração insolúvel, é conveniente ensaiar uma única concentração que produza turbidez ou um precipitado visível, devido aos efeitos falsos que possam ser induzidos pelo precipitado. À concentração que produz um precipitado, devem tomar-se os devidos cuidados para assegurar que este não interfere com a realização do ensaio (p. ex., em termos de coloração ou contagem). Neste contexto, pode ser útil determinar a solubilidade no meio de cultura antes do ensaio.

Se não se observar precipitação nem citotoxicidade condicionante, a maior concentração ensaiada deve corresponder à menor das seguintes concentrações: 10 mM, 2 mg/ml ou 2 μl/ml (39) (40) (41). Se o produto químico em estudo não for de composição definida (caso, p. ex., de uma substância de composição desconhecida ou variável, de produtos de reação complexos ou de materiais biológicos (UVCB) (42), de extratos ambientais, etc.), a concentração de topo poderá ter de ser mais elevada (p. ex., 5 mg/ml) na ausência de citotoxicidade, para aumentar a concentração de cada um dos componentes. Importa, contudo, notar que estes requisitos podem diferir no caso de medicamentos para uso humano (43).

Grupos de controlo

Para cada colheita, devem também realizar-se controlos negativos paralelos (ver ponto 15), em que as células são expostas apenas ao solvente e ao meio de tratamento, procedendo-se do mesmo modo que num ensaio normal.

São necessários controlos positivos para demonstrar a capacidade do laboratório para identificar os clastogénios nas condições do protocolo de ensaio, bem como a eficácia do sistema exógeno de ativação metabólica, se pertinente. O quadro 1 apresenta exemplos de controlos positivos. Podem ser utilizados produtos químicos de controlo positivo alternativos, se tal se justificar. Dado que os ensaios de toxicidade genética com células de mamíferos in vitro são suficientemente normalizados, o recurso a controlos positivos pode limitar-se a um clastogénio que necessite de ativação metabólica. Desde que efetuada em simultâneo com o ensaio não-ativado, com a mesma duração de tratamento, esta resposta única do controlo positivo demonstrará a atividade do sistema de ativação metabólica e a capacidade de resposta do sistema de ensaio. No entanto, devem efetuar-se controlos positivos (sem S9) para os tratamentos a longo prazo, dado que a duração do tratamento diferirá da do ensaio com ativação metabólica. Cada amostra de controlo positiva deverá ser utilizada numa ou mais das concentrações a que se prevê um aumento detetável e reprodutível relativamente à base, a fim de demonstrar a sensibilidade do sistema de ensaio (ou seja, efeitos claros, mas que não permitam revelar de imediato ao operador a identidade das lâminas codificadas), e a resposta não deve ser comprometida pela citotoxicidade de modo a exceder os limites especificados no método de ensaio.

Quadro 1

Produtos químicos de referência recomendados para avaliação da competência de um laboratório e para a seleção dos controlos positivos.

PROCEDIMENTO DE ENSAIO

Tratamento com o produto químico em estudo

As células em proliferação são expostas ao produto químico em estudo na presença e na ausência de um sistema de ativação metabólica.

Intervalo de amostragem das culturas

Para uma avaliação exaustiva, necessária para concluir um resultado negativo, as três seguintes condições experimentais devem ser aplicadas utilizando um tratamento curto com e sem ativação metabólica e um tratamento longo sem ativação metabólica (ver pontos 43, 44 e 45):

Caso a aplicação de uma das referidas condições experimentais conduza a uma resposta positiva, pode não ser necessário investigar nenhum dos outros regimes de tratamento.

Preparação dos cromossomas

As culturas de célula são tratadas com Colcemid ou colquicina, geralmente durante 1-3 horas antes da colheita. Cada cultura de células é colhida e processada separadamente para a preparação dos cromossomas. Preparação dos cromossomas envolve o tratamento hipotónico das células, seguido de fixação e coloração. No final do tratamento de três a seis horas, podem estar presentes células mitóticas em monocamadas (identificáveis pela sua forma arredondada e por se destacarem da superfície). Por se destacarem com facilidade, estas células podem perder-se quando da remoção do meio com o produto químico em estudo. Se existirem provas de um aumento substancial do número de células mitóticas relativamente aos controlos, que indique um provável bloqueio da mitose, as células devem ser recolhidas por centrifugação e adicionadas de novo às culturas, de modo a evitar a perda de células que se encontrem em mitose, bem como o risco da ocorrência de aberrações cromossómicas, no momento da colheita.

Análise

Todas as lâminas, incluindo as dos controlos positivos e negativos, devem ser independentemente codificadas antes da análise microscópica para a deteção de aberrações cromossómicas. Uma vez que os processos de fixação dão frequentemente lugar à perda de cromossomas por uma determinada proporção das células em metáfase, as células contadas devem apresentar um número de centrómeros igual ao número modal ± 2.

Para se concluir que um produto químico em estudo dá um resultado claramente negativo, devem contabilizar-se, pelo menos, 300 metáfases bem espalhadas para cada concentração e para o controlo (ver ponto 45). A 300 células devem ser divididas equitativamente entre os replicados, quando forem utilizadas culturas em duplicado. Quando são utilizadas culturas simples por cada concentração (ver ponto 21), devem contar-se em cada cultura, pelo menos, 300 metáfases bem espalhadas. A contabilização de 300 células tem a vantagem de aumentar a representatividade estatística do ensaio, além de raramente permitir observar valores nulos (prevê-se que estes sejam da ordem de apenas 5 %) (44). O número de metáfases contabilizadas pode ser reduzido caso se observem números elevados de células com aberrações cromossómicas e o produto químico em estudo for considerado inequivocamente positivo.

As células com aberrações cromossómicas estruturais, incluindo e excluindo as lacunas, devem ser contabilizadas. As quebras e as lacunas são definidas no apêndice 1, cf. (45) (46). As aberrações cromatídicas e cromossómicas devem ser registadas separadamente e classificadas em subtipos (quebras, intercâmbios). Os procedimentos utilizados no laboratório devem assegurar que a análise de aberrações cromossómicas é efetuada por operadores com formação adequada, com avaliação interpares, se for caso disso.

Embora o objetivo do ensaio consista na deteção de aberrações cromossómicas estruturais, deve registar-se a frequência de poliploidia e de endorreduplicação, quando ocorram (ver ponto 2).

Proficiência do laboratório

A fim de estabelecer um nível de experiência suficiente antes da utilização rotineira do ensaio, o laboratório deve ter efetuado uma série de experiências com produtos químicos de referência positivos que atuem por diferentes mecanismos, bem como vários controlos negativos (utilizando vários solventes ou veículos). As respostas observadas nos controlos positivos e negativos devem ser coerentes com as referências bibliográficas. Este critério não é aplicável a laboratórios com a experiência, isto é, que disponham de uma base de dados históricos, como definido no ponto 37.

Deve investigar-se uma seleção de produtos químicos de controlo positivos (ver quadro 1 no ponto 26), aplicados em tratamentos de curta e de longa duração na ausência de ativação metabólica, bem como num tratamento curto na presença de ativação metabólica, a fim de demonstrar a proficiência para detetar produtos químicos clastogénicos e determinar a eficácia do sistema de ativação metabólica. A gama de concentrações dos produtos químicos selecionados deve ser escolhida de forma a proporcionar aumentos reprodutíveis e dependentes da concentração relativamente à base, de forma a demonstrar a sensibilidade e a gama dinâmica do sistema de ensaio.

Dados históricos de controlo

O laboratório deve elaborar:

Ao obter os primeiros dados para um historial de distribuição dos controlos negativos, os controlos negativos em paralelo devem ser coerentes com os dados de controlo publicados, caso existam. À medida que forem sendo adicionados mais dados experimentais à distribuição dos controlos, os controlos negativos em paralelo devem, de preferência, situar-se dentro dos limites de controlo de 95 % daquela distribuição (44) (47). A base de dados históricos de controlo negativo deve ser inicialmente constituída por um mínimo de 10 experiências, embora de preferência, seja constituída por, pelo menos, 20 experiências efetuadas em condições experimentais comparáveis. Os laboratórios devem utilizar métodos de controlo de qualidade como gráficos de controlo (p. ex., gráficos C ou gráficos de barras (48)), para identificar a variabilidade dos seus dados de controlo positivo e negativo e demonstrar que, no seu laboratório, a metodologia está «sob controlo» (44). Encontram-se na bibliografia (47) outras recomendações sobre a forma de obter e utilizar os dados históricos (critérios de inclusão e exclusão de dados em séries históricas e critérios de aceitação para um determinado ensaio).

Quaisquer alterações ao protocolo experimental devem ser ponderadas em função da sua coerência com as bases de dados históricos de controlo do laboratório. Quaisquer incoerências de monta devem traduzir-se na constituição de uma nova base de dados históricos de controlo.

Os dados relativos ao controlo negativo devem ser constituídos pela frequência de células com aberrações cromossómicas numa única cultura ou na soma dos replicados das culturas, como descrito no ponto 21. Os controlos negativos em paralelo devem, de preferência, situar-se dentro dos limites de controlo de 95 % da distribuição da base de dados históricos de controlo negativo do laboratório (44) (47). Se os dados do controlo negativo realizado em paralelo se situarem fora dos limites de controlo de 95 % podem ser aceitáveis para inclusão no historial de distribuição de controlo se não forem valores extremos e houver indícios de que o sistema de ensaio está «sob controlo» (ver ponto 37), bem como provas da inexistência de erros humanos ou técnicos.

RESULTADOS E RELATÓRIO

Apresentação dos resultados

Deve avaliar-se a percentagem de células com aberrações cromossómicas estruturais. As aberrações cromatídicas e cromossómicas, classificados em subtipos (quebras, intercâmbios), devem ser indicadas separadamente, com indicação do respetivo número e frequência, no respeitante às culturas experimentais e de controlo. A ocorrência de lacunas é registada e incluída no relatório separadamente, mas não é contabilizada para o cálculo da frequência total das aberrações. Deve registar-se a percentagem de poliploidia e/ou de células endorreduplicadas, sempre que ocorram.

Durante a experiência principal para a deteção de aberrações, devem ser registadas as medições da citotoxidade realizadas em paralelo com os ensaios, para todas as culturas de controlo e para os casos de resposta negativa e positiva.

Devem ser fornecidos dados individuais das culturas. Além disso, todos os dados devem ser apresentados sob a forma de um quadro.

Critérios de aceitabilidade

A aceitação do ensaio baseia-se nos seguintes critérios:

Avaliação e interpretação dos resultados

Se forem cumpridos todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente positivo se, em qualquer das condições experimentais examinadas (ver ponto 28):

Se todos estes critérios estiverem preenchidos, o produto químico em estudo é considerado passível de induzir aberrações cromossómicas em células de mamífero cultivadas no presente sistema de ensaio. As referências bibliográficas (49) (50) (51) contém recomendações sobre os métodos estatísticos mais adequados.

Se forem cumpridos todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente negativo se, em todas as condições experimentais examinadas (ver ponto 28):

O produto químico em estudo não é considerado passível de induzir aberrações cromossómicas em células de mamífero cultivadas no presente sistema de ensaio.

Não existe nenhuma exigência concreta para a verificação de uma resposta inequivocamente positiva ou negativa.

No caso de a resposta não ser inequivocamente positiva nem negativa como atrás descrito, ou para estabelecer a importância biológica do resultado, os dados devem ser avaliados por peritos e/ou uma investigação complementar. Neste contexto, pode ser útil a contagem de células adicionais (se adequado) ou a realização de uma nova experiência, eventualmente com alteração das condições experimentais (intervalo diferente entre as concentrações ou outras condições de ativação metabólica — p. ex., concentração ou origem do S9).

Em certos casos raros, mesmo após uma investigação complementar, os dados obtidos não permitirão concluir um resultado positivo ou negativo, pelo que se considerará que a resposta do produto químico em estudo é ambígua.

Um aumento do número de células poliplóides pode indicar que o produto químico em estudo apresenta potencial de inibição da mitose e de indução de aberrações cromossómicas numéricas. Um aumento do número de células com cromossomas endorreduplicados pode indicar que o produto químico em estudo apresenta potencial de inibição da progressão do ciclo celular (54) (2) (ver ponto 2). Por conseguinte, deve registar-se separadamente a frequência de células poliploides e de células com cromossomas endorreduplicados.

Relatório de ensaio

Elementos a incluir no relatório de ensaio:

BIBLIOGRAFIA

Apêndice 2

FÓRMULAS DE QUANTIFICAÇÃO DA CITOTOXICIDADE

Índice mitótico (IM):

Recomenda-se o recurso ao aumento relativo da contagem celular (RICC) ou à duplicação da população em termos relativos (RPD), pois ambos os parâmetros têm em conta a proporção de células que sofreu divisão na população celular.

em que:

Duplicação da população = [log (n.o de células após tratamento ÷ n.o inicial de células)] ÷ log 2

Por exemplo, um RICC ou uma RPD de 53 % corresponde uma citotoxicidade/citóstase de 47 % e uma citotoxicidade/citóstase de 55 %, determinada com base no IM, indica que o IM real é de 45 % do controlo.

Em qualquer caso, deve determinar-se o número de células antes do tratamento, bem como nas culturas tratadas e de controlo negativo.

Embora o RCC (isto é, número de células nas culturas tratadas/culturas de controlo) tinha sido utilizado como parâmetro de citotoxicidade no passado, deixou de ser recomendado, uma vez que pode subestimar a citotoxicidade.

Nas culturas de controlo negativas, a duplicação da população deve ser compatível com a exigência de colher as células, após tratamento, num instante equivalente a 1,5 ciclos celulares normais, devendo o índice mitótico ser suficientemente elevado para obter um número suficiente de células em mitose e calcular de um modo fiável a redução de 50 %.

4)

Na parte B, o capítulo B.11 é substituído pelo seguinte texto:

«B.11   Ensaio de aberrações cromossómicas em células da medula de mamíferos

INTRODUÇÃO

O presente método de ensaio é equivalente ao Test Guideline 475 (2016) da OCDE. Faz parte integrante de uma série de métodos de ensaio no domínio da toxicologia genética. Está disponível um documento da OCDE que fornece informações sucintas sobre ensaios de toxicologia genética e resume as alterações recentemente efetuadas às orientações da OCDE nesse domínio (1).

O ensaio in vivo de aberrações cromossómicas da medula óssea de mamíferos é particularmente importante para a avaliação da genotoxicidade, visto que, embora possam variar de espécie para espécie, os fatores do metabolismo in vivo, da farmacocinética e dos processos de reparação do ADN estão ativos e contribuem para as respostas. Os ensaios in vivo são igualmente úteis para a investigação suplementar da genotoxicidade detetada in vitro.

O ensaio de aberrações cromossómicas em células da medula de mamíferos é utilizado para a deteção de aberrações cromossómicas estruturais induzidas pelos produtos químicos em estudo em células da medula de animais, geralmente roedores — (2), (3), (4) e (5). As aberrações cromossómicas estruturais podem ser de dois tipos, um afetando os cromossomas, o outro os cromatídeos. Embora as aberrações genotóxicas induzidas por produtos químicos sejam, na sua maioria, cromatídicas, podem também ocorrer aberrações cromossómicas. As lesões cromossómicas e os eventos relacionados causam diversas doenças genéticas humanas, havendo provas substanciais de que, quando causam alterações nos oncogenes e nos genes supressores de tumores das células somáticas, estas lesões e os eventos relacionados têm influência na indução de cancro nos seres humanos e nos animais utilizados em experiências. Em ensaios de aberrações cromossómicas in vivo pode observar-se poliploidia (incluindo endorreduplicação). Contudo, o aumento da poliploidia, por si só, não é indicativo do potencial aneugénico, podendo indicar simplesmente uma perturbação do ciclo celular ou citotoxicidade. O presente ensaio não é concebido para detetar a aneuploidia. Os ensaios in vivo e in vitro recomendados para a deteção de aneuploidia são, respetivamente, o ensaio in vivo de micronúcleos em eritrócitos de mamíferos (capítulo B.12 do presente anexo) e o ensaio in vitro de micronúcleos em células de mamíferos (capítulo B.49 do presente anexo).

As definições utilizadas figuram no apêndice 1.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

O presente ensaio utiliza, normalmente, roedores mas, em alguns casos, podem ser adequadas outras espécies, mediante justificação científica. A medula é o tecido objeto do ensaio, por se tratar de um tecido altamente vascularizado e conter uma população de células com grande ritmo de duplicação que podem ser facilmente isoladas e processadas. A justificação científica para a utilização de outras espécies que não ratos ou ratinhos deve constar do relatório. Se se utilizarem espécies que não sejam roedores, recomenda-se que a medição das aberrações cromossómicas da medula óssea seja integrada noutro ensaio de toxicidade adequado.

Se houver provas de que nem os produtos químicos em estudo nem os seus metabolitos entram em contacto com o tecido-alvo, o presente ensaio pode não ser adequado.

Antes da aplicação do método de ensaio a uma mistura para obter dados com fins regulamentares, importa ponderar se — e, em caso afirmativo, por que motivo — o método pode proporcionar resultados adequados para o efeito. Tais considerações são desnecessárias se houver um requisito regulamentar para o ensaio da mistura.

PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO

Os animais são expostos ao produto químico em estudo através de um modo de exposição apropriado. Ao cabo de um período pós-exposição adequado, eutanasiam-se (por métodos humanos). Antes da eutanásia, tratam-se com um agente fixador da metáfase (p. ex., colquicina ou colcemida). Fazem-se, seguidamente, preparações de cromossomas a partir de células da medula: após coloração, analisam-se as células em metáfase para detetar aberrações cromossómicas.

VERIFICAÇÃO DA PROFICIÊNCIA DO LABORATÓRIO

Determinação da proficiência

A fim de adquirir experiência suficiente com o ensaio antes da sua utilização rotineira, o laboratório deve demonstrar aptidão para reproduzir os resultados previstos com base nos dados publicados (p. ex., (6)), no respeitante à frequência das aberrações cromossómicas, com um mínimo de dois produtos químicos de controlo positivo (incluindo respostas fracas induzidas por baixas doses de controlos positivos), nomeadamente os resultados que constam do quadro 1, e com controlos compatíveis veículo/solvente (ver ponto 22). Nestas experiências devem utilizar-se doses que originem aumentos reprodutíveis e dependentes das doses e demonstrem a sensibilidade e a gama dinâmica do sistema de ensaio no tecido em causa (medula óssea), recorrendo ao método de classificação a utilizar no laboratório. Este requisito não é aplicável a laboratórios com experiência, isto é, que disponham de uma base de dados históricos, conforme definição nos pontos 10-14.

Dados históricos de controlo

Na determinação da proficiência, o laboratório deve estabelecer:

Ao obter os primeiros dados para um historial da distribuição dos controlos negativos, os controlos negativos em paralelo devem ser coerentes com os dados de controlo eventualmente publicados. À medida que forem sendo adicionados mais dados experimentais ao historial de distribuição dos controlos, os controlos negativos em paralelo devem, de preferência, situar-se dentro dos limites de controlo de 95 % daquela distribuição. A base de dados históricos do laboratório sobre o controlo negativo deve ser estatisticamente sólida, a fim de garantir a capacidade do laboratório para avaliar a distribuição dos seus dados de controlo negativo. A bibliografia sugere que podem ser necessários, no mínimo, 10 ensaios, devendo, de preferência, efetuar-se, pelo menos, 20 ensaios em condições experimentais comparáveis. Os laboratórios devem utilizar métodos de controlo de qualidade como gráficos de controlo (p. ex., gráficos C ou gráficos de barras (7)), para identificar a variabilidade dos seus dados e demonstrar que, no seu laboratório, a metodologia está sob controlo. Encontram-se na bibliografia (8) outras recomendações sobre a forma de obter e utilizar os dados históricos (critérios de inclusão e exclusão de dados em séries históricas e critérios de aceitação para um determinado ensaio).

Se o laboratório não realizar um número suficiente de ensaios para estabelecer a distribuição estatisticamente sólida das amostras de controlo negativo (ver ponto 11) durante a determinação da proficiência (descrita no ponto 9), é aceitável que a distribuição possa ser definida nos primeiros ensaios de rotina. Esta abordagem deve seguir as recomendações enunciadas na bibliografia (8); os resultados de controlo negativo obtidos com estes ensaios devem ser coerentes com os dados de controlo negativo publicados.

Quaisquer alterações ao protocolo experimental devem ser ponderadas em função do seu impacto nos dados resultantes, que devem permanecer coerentes com as bases de dados históricos de controlo de que o laboratório dispõe. Apenas as incoerências mais expressivas devem traduzir-se na criação de uma nova base de dados históricos de controlo, caso um parecer de perito determine que a distribuição difere da anterior (ver ponto 11). Durante o novo processo, pode não ser necessária uma base de dados de controlo negativo completa para permitir a realização de um ensaio real, desde que o laboratório possa demonstrar que os valores de controlo negativo em paralelo permanecem coerentes com a base de dados anterior ou com os correspondentes dados publicados.

Os dados de controlo negativo devem consistir na incidência de aberrações cromossómicas estruturais (excluindo lacunas) em cada animal. Os controlos negativos em paralelo devem, de preferência, situar-se dentro dos limites de controlo de 95 % da distribuição da base de dados históricos do laboratório sobre o controlo negativo. Os dados do controlo negativo realizado em paralelo que se situem fora dos limites de controlo de 95 % são aceitáveis para inclusão no historial de distribuição de controlo se não forem valores extremos e ainda se houver indícios de que o sistema de ensaio está «sob controlo» (ver ponto 11) e não houver indícios da existência de erros humanos ou técnicos.

DESCRIÇÃO DO MÉTODO

Preparações

Escolha da espécie animal

Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis das espécies de laboratório mais comuns. Utilizam-se geralmente ratos, embora possam também servir ratinhos. Pode utilizar-se qualquer outra espécie adequada de mamífero, se o relatório fornecer uma justificação científica.

Condições de alojamento e de alimentação dos animais

No caso dos roedores, a temperatura na sala onde se encontram os animais deve ser de 22 °C (± 3 °C). Embora a humidade relativa ideal seja de 50-60 %, na prática pode descer a 40 %, não devendo exceder 70 %, exceto durante a lavagem do biotério. A iluminação deve ser artificial, com uma alternância de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Na alimentação, podem utilizar-se dietas convencionais de laboratório e deve ser fornecida água de beber sem restrições. Se o produto químico em estudo for administrado pela alimentação, a escolha da dieta poderá ser condicionada pela necessidade de assegurar a dosagem adequada. Os roedores devem ser alojados em pequenos grupos (não mais de cinco por gaiola) do mesmo sexo e grupo de tratamento — caso não se preveja nenhum comportamento agressivo –, de preferência em gaiolas com pavimento sólido e enriquecimento ambiental adequado. Os animais só podem ser alojados individualmente se tal se justificar do ponto de vista científico.

Preparação dos animais

Utilizam-se, como regra geral, animais adultos jovens saudáveis (no caso dos roedores, idealmente com 6-10 semanas de idade no início do tratamento, embora sejam aceitáveis animais ligeiramente mais velhos), distribuídos aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos grupos de exposição. Os animais são identificados de forma inequívoca, utilizando um método humano minimamente invasivo (p. ex., colocação de anilhas, marcações, microchips ou identificação biométrica, mas sem cortes nas orelhas ou nas falanges) e devem ser aclimatados às condições de laboratório durante, pelo menos, cinco dias. As gaiolas devem ser dispostas de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. Deve evitar-se a contaminação cruzada pelo controlo positivo e pelo produto químico em estudo. No início do estudo, a variação de peso entre os animais deve ser mínima, não excedendo ± 20 % do peso médio de cada sexo.

Preparação das doses

Os produtos químicos em estudo na forma sólida devem ser dissolvidos ou suspensos em solventes ou veículos adequados, ou ainda misturados na dieta ou na água potável antes da sua administração aos animais. Os produtos químicos em estudo líquidos podem ser administrados diretamente ou diluídos antes da sua administração. No caso de exposições por inalação, os produtos químicos em estudo podem ser administrados sob a forma de gás, vapor ou aerossol sólido/líquido, consoante as respetivas propriedades físico-químicas. Devem utilizar-se preparações frescas do produto químico em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o mesmo pode ser armazenado e determinem as condições de armazenagem adequadas.

Solvente/veículo

O solvente/veículo não deve produzir efeitos tóxicos nas doses utilizadas nem ser suscetível de reagir com o produto químico em estudo. Caso se utilizem solventes/veículos cujas propriedades não se encontrem totalmente elucidadas, devem fornecer-se dados que justifiquem a sua compatibilidade. Sempre que possível, recomenda-se a utilização prioritária de um solvente/veículo aquoso. A água, o soro fisiológico, uma solução de metilcelulose, uma solução de sal de sódio de carboximetilcelulose, o azeite e o óleo de milho constituem exemplos de solventes/veículos compatíveis de utilização comum. Na ausência de dados de controlo históricos ou publicados que demonstrem que o solvente/veículo atípico escolhido não induz nenhuma aberração estrutural ou outros efeitos deletérios, deve realizar-se um ensaio preliminar destinado a estabelecer a aceitabilidade do controlo do solvente ou veículo.

Controlos

Amostras de controlo positivas

Como regra geral, deve incluir-se em cada ensaio um grupo de animais expostos a um produto químico de controlo positivo. Este princípio pode não ser respeitado caso o laboratório de ensaio tenha demonstrado aptidão para a realização do ensaio e estabelecido um historial de gamas de controlos positivos. Se não for incluído um grupo de controlo positivo paralelo, cada experiência deve compreender controlos de contagem (lâminas fixas e não coradas). Estes podem ser realizados mediante a inclusão, no estudo, de amostras de referência adequadas obtidas e armazenadas a partir de um controlo positivo em separado efetuado a intervalos regulares (p. ex., todos os 6-18 meses), no laboratório em que o ensaio é realizado: por exemplo, em testes de proficiência e, subsequentemente, de uma forma regular, se necessário.

Os produtos químicos de controlo positivo devem produzir, de forma fiável, um aumento detetável na frequência das células com aberrações cromossómicas estruturais em relação ao nível de ocorrência espontânea. A dose de controlo positiva a administrar deve ser escolhida de modo a que os seus efeitos sejam claros mas também a que as amostras codificadas não sejam imediatamente identificadas pelo operador que procede às leituras. É aceitável que o controlo positivo seja administrado por uma via diferente da substância em estudo, de acordo com um calendário diferente, e que a amostragem seja realizada num único instante. Se se justificar, deve considerar-se a possibilidade de utilizar produtos químicos de uma classe relacionada para o controlo positivo. O quadro 1 inclui exemplos de produtos químicos de controlo positivo.

Quadro 1

Exemplos de substâncias de controlo positivo

Controlos negativos

Todas as amostragens devem incluir animais do grupo de controlo negativo, tratados do mesmo modo que os animais dos grupos de exposição, exceto o facto de não serem expostos à substância química em estudo. Se se utilizar um solvente/veículo para administrar o produto químico em estudo, o grupo de controlo deve receber esse solvente/veículo. No entanto, se os dados históricos de controlo negativo demonstrarem, para cada tempo de amostragem e laboratório de ensaio, a coerência da variabilidade entre animais e da frequência de células com aberrações estruturais, pode ser necessária apenas uma amostra de controlo negativo. Em caso de recurso a uma única amostragem para os controlos negativos, esta deve corresponder ao primeiro tempo de amostragem utilizado no estudo.

PROCEDIMENTO DE ENSAIO

Número e sexo dos animais

Em geral, a resposta do micronúcleo é idêntica nos machos e nas fêmeas (9), prevendo-se que o mesmo se verifique no caso das aberrações cromossómicas estruturais; por conseguinte, os estudos podem, na sua maioria, ser realizados com animais de qualquer sexo. A existência de dados que demonstrem diferenças importantes entre machos e fêmeas (p. ex., diferenças em termos de toxicidade sistémica, metabolismo, biodisponibilidade, toxicidade para a medula óssea, etc., que incluam, nomeadamente, um estudo exploratório) recomenda a utilização de animais de ambos os sexos. Neste caso, poderá ser adequado um estudo com ambos os sexos: por exemplo, no contexto de um estudo de toxicidade de dose repetida. Pode justificar-se o recurso ao modelo fatorial caso se utilizem animais de ambos os sexos. O apêndice 2 debruça-se sobre a análise dos dados por recurso a este modelo.

A dimensão dos grupos deve ser estabelecida no início do estudo, para que se disponha de um mínimo de 5 animais analisáveis de um sexo ou (se se utilizarem ambos os sexos) de cada sexo, por grupo. Nos casos em que a exposição humana aos produtos químicos possa ser específica de cada sexo, como acontece com alguns produtos farmacêuticos, o ensaio deve ser executado com animais do sexo em causa. A título de orientação, um estudo com medula óssea realizado com dois tempos de amostragem, três grupos de doses e um grupo de controlo negativo em paralelo, além de um grupo de controlo positivo (composto por cinco animais do mesmo sexo), necessita, no máximo, de 45 animais.

Doses

Se for realizado um estudo preliminar para avaliação da gama de doses a administrar, por não estarem disponíveis dados apropriados de apoio à seleção de doses, esse estudo deve ter lugar no mesmo laboratório, utilizando a mesma espécie, a mesma linha celular, o mesmo sexo e o mesmo regime de exposição do estudo principal (10). O estudo deve procurar identificar a dose máxima tolerável (DMT), definida como a dose mais elevada que se tolera sem sinais de toxicidade limitativa do estudo, relativamente à sua duração (p. ex., induzindo quebras do peso corporal ou citotoxicidade para o sistema hematopoiético), mas sem causar a morte nem sinais de dor, sofrimento ou tensão que levem à eutanásia por meios humanos (11).

Pode igualmente definir-se dose mais elevada como uma dose que produz indicações de toxicidade para a medula óssea.

Os produtos químicos que apresentam saturação de propriedades toxicocinéticas ou induzem processos de desintoxicação passíveis de conduzir a uma diminuição da exposição após um tratamento a longo prazo podem constituir uma exceção aos critérios de base de fixação da dose, devendo ser avaliados numa base casuística.

Um estudo completo destinado a obter informação sobre a resposta às doses deve incluir um grupo de controlo negativo e, no mínimo, três doses espaçadas, geralmente, por um fator de 2, mas não superior a 4. Se o produto químico em estudo não produzir efeitos tóxicos num estudo de avaliação da gama de doses ou com base em dados existentes, a dose mais elevada administrada de uma só vez deve ser de 2 000 mg/kg de peso corporal. Contudo, se o produto químico em estudo não provocar toxicidade, a DMT deve coincidir com a dose máxima administrada, e as doses utilizadas devem, de preferência, abranger uma gama compreendida entre a dose que produz a toxicidade máxima e uma dose que produz uma toxicidade baixa ou nula. Caso se observe toxicidade no tecido-alvo (medula óssea) com todas as doses de ensaio, recomenda-se a realização de um estudo complementar com doses não tóxicas. Os estudos destinados a caracterizar de modo mais preciso a informação quantitativa dose-resposta podem exigir outras gamas de doses. Estes limites podem variar para certos tipos de produtos químicos em estudo abrangidos por exigências específicas (p. ex., medicamentos para uso humano).

Ensaio no limite

Se os estudos de avaliação da gama de doses ou dados existentes relativos a espécies animais afins indicarem que um regime de tratamento com, pelo menos, a dose-limite (adiante descrita) não produz efeitos tóxicos observáveis (entre os quais a inibição da proliferação da medula óssea ou outros sinais de citotoxicidade no tecido-alvo) e não for de prever a ocorrência de genotoxicidade, com base em estudos de genotoxicidade in vitro ou dados referentes a produtos químicos estruturalmente afins, pode não ser necessário um estudo completo com três doses, desde que se tenha demonstrado que o(s) produto(s) químico(s) em estudo atinge(m) o tecido-alvo (medula óssea). Em tais casos, pode ser suficiente uma dose única (a dose-limite). Para um período de administração superior a 14 dias, a dose-limite é de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia. Para períodos de administração iguais ou inferiores a 14 dias, a dose-limite é de 2 000 mg/kg de peso corporal/dia.

Administração das doses

Na conceção de um ensaio, deve ponderar-se a via prevista de exposição humana. Por conseguinte, podem escolher-se, com justificação, vias de exposição como a alimentação, a água de beber, as vias tópica, subcutânea, intravenosa e oral (por sonda gástrica), a inalação, a via intratraqueal ou os implantes. Em qualquer caso, a via deve ser escolhida de modo a garantir a exposição adequada do(s) tecido(s)-alvo. A injeção intraperitoneal, não é, em geral, recomendada, pois não se trata de uma via prevista de exposição humana, só devendo utilizar-se com justificação científica específica. Se o produto químico em estudo for misturado na alimentação ou na água de beber, especialmente no caso de dose única, deve ter-se o cuidado de prever um intervalo suficiente entre a ingestão dos alimentos ou da água e a amostragem, para permitir detetar os efeitos (ver pontos 33-34). O volume máximo de líquido que pode ser administrado por gavagem (sonda gástrica) ou por injeção, numa toma, depende do tamanho do animal, não devendo exceder 1 ml/100 g de peso corporal; excetuam-se as soluções aquosas, que podem ser administradas na proporção máxima de 2 ml/100 g de peso corporal. Deve justificar-se a utilização de volumes mais elevados. Exceto no caso de produtos químicos irritantes ou corrosivos, que normalmente produzem efeitos exacerbados em concentrações superiores, a variabilidade no volume de ensaio deve ser minimizada ajustando a concentração de modo a garantir a administração a um volume constante relativamente à massa corporal, em todas as doses.

Programação do ensaio

Os produtos químicos em estudo são geralmente administrados numa exposição única, podendo, contudo, ser administrados em dose dividida (ou seja, duas ou mais exposições no mesmo dia, separadas por não mais de 2-3 horas), para facilitar a administração de grandes volumes. Nestas circunstâncias, ou no caso da administração do produto químico por inalação, a amostragem deve ser programada em função do momento da última administração ou do termo da exposição.

Há poucos dados disponíveis sobre a adequação ao presente ensaio de um protocolo por doses repetidas. Contudo, nos casos em que for desejável integrar este ensaio com um ensaio de toxicidade de dose repetida, deve ter-se o cuidado de evitar a perda de células mitóticas com danos cromossomáticos, passível de ocorrer com doses tóxicas. Essa integração é aceitável se a dose mais elevada for igual ou superior à dose-limite (ver ponto 29) e for administrado um grupo de doses que abranja a dose-limite durante o período de tratamento. O ensaio do micronúcleo (método B.12) deve considerar-se o ensaio in vivo recomendado de aberrações cromossómicas quando se pretende a integração com outros estudos.

As amostras de medula óssea devem ser colhidas em dois momentos diversos após um único tratamento. No caso dos roedores, a primeira amostra deve ser colhida após o tempo necessário para completar 1,5 ciclos celulares normais, que é, normalmente, de 12-18 horas após a exposição. Dado que o tempo necessário para a absorção e para o metabolismo do(s) produto(s) químico(s) em estudo, bem como o seu efeito sobre a cinética do ciclo celular, podem afetar o momento ótimo para a deteção de uma eventual aberração cromossómica, recomenda-se a recolha de uma segunda amostra 24 horas após a primeira. A primeira amostragem para análise deve abranger todos os grupos de doses; no entanto, na(s) amostragem(ns) posterior(es) só será necessário administrar a dose mais elevada. Se, com justificação científica, forem utilizados regimes de administração ao longo de mais de um dia, deve, geralmente, colher-se uma amostra a cerca de 1,5 ciclos celulares normais após a exposição final.

Após a exposição e antes da amostragem, os animais são injetados intraperitonealmente com uma dose apropriada de um agente fixador da metáfase (por exemplo, colcemida ou colquicina), sendo as amostras colhidas após um período adequado. No caso dos ratinhos, esse período é de cerca de 3-5 horas e, no caso dos ratos, de 2-5 horas. As células da medula são colhidas, dilatadas, fixadas, coloridas e analisadas para deteção de aberrações cromossómicas.

Exames

Devem ser feitas observações clínicas gerais dos animais em estudo, registando-se os respetivos sinais clínicos pelo menos uma vez por dia, de preferência à(s) mesma(s) hora(s), tendo em conta o período de pico dos efeitos previstos após a administração da dose. Durante o período de exposição, devem observar-se todos os animais pelo menos duas vezes por dia, para a deteção de sinais de morbilidade e mortalidade. Todos os animais devem ser pesados no início do estudo, bem como, pelo menos, uma vez por semana (em estudos com doses repetidas) e no momento da eutanásia. Nos estudos com a duração mínima de uma semana, o consumo de alimentos deve ser medido pelo menos uma vez por semana. Se o produto químico em estudo for administrado através da água de beber, deve medir-se o consumo desta em cada mudança de água e pelo menos uma vez por semana. Os animais que exibam indicadores não letais de toxicidade excessiva devem ser eutanasiados (por métodos humanos) antes da conclusão do período de ensaio (11).

Exposição dos tecidos-alvo

Sempre que se justifique e nos casos em que não haja outros dados de exposição (ver ponto 44), deve colher-se uma amostra de sangue em momentos oportunos, a fim de permitir a determinação dos níveis dos produtos químicos em estudo no plasma, tendo em vista comprovar que ocorreu exposição da medula óssea.

Preparação da medula óssea e dos cromossomas

Imediatamente após a eutanásia (por métodos humanos), retiram-se células da medula óssea dos fémures ou das tíbias dos animais, expõem-se a uma solução hipotónica e fixam-se. As células em metáfase são depois espalhadas nas lâminas e coradas por métodos bem definidos [ver (3) (12)].

Análise

Todas as lâminas, incluindo as dos controlos positivos e negativos, devem ser codificadas independentemente antes da análise, a qual deve ser realizada de forma aleatória, para que o operador não conheça o tipo de tratamento.

Como medida da citotoxicidade, deve determinar-se o índice mitótico em pelo menos 1 000 células por animal, para todos os animais expostos à substância em estudo (incluindo os controlos positivos), para os animais não expostos e para os animais não expostos do controlo negativo com o veículo/solvente.

Devem analisar-se, pelo menos, 200 metáfases por animal, para pesquisa de aberrações cromossómicas estruturais, incluindo e excluindo lacunas (6). No entanto, se os dados históricos relativos ao controlo negativo indicarem que a frequência de aberrações cromossómicas estruturais de fundo no laboratório de ensaio é < 1 %, deve ponderar-se a contagem de células adicionais. Devem registar-se separadamente as aberrações cromatídicas e cromossómicas, classificando-as em subtipos (quebras, intercâmbios). Os procedimentos utilizados no laboratório devem assegurar que a análise de aberrações cromossómicas é efetuada por operadores com formação adequada, com avaliação interpares se for caso disso. Dado que os procedimentos de preparação das lâminas dão frequentemente lugar à rutura de uma determinada proporção das células em metáfase, com perda dos cromossomas, as células contabilizadas devem, portanto, conter um número de centrómeros não inferior a 2n±2, em que n é o número de cromossomas haploides na espécie em causa.

RESULTADOS E RELATÓRIO

Tratamento dos resultados

Os dados respeitantes a cada animal devem ser apresentados num quadro. Para cada animal, devem fornecer-se o índice mitótico, o número de células em metáfase contabilizadas, o número de aberrações por cada célula em metáfase e a percentagem de células com aberrações cromossómicas estruturais. Os diferentes tipos de aberração cromossómica estrutural devem ser enumerados, com os respetivos números e frequências, para os grupos expostos à substância em estudo e os grupos de controlo. Registam-se separadamente as lacunas, bem como as células poliploides e as células com cromossomas endorreduplicados. A frequência das lacunas é incluída no relatório, mas em geral não é tida em conta na análise da frequência total das aberrações estruturais. Se não houver diferença visível entre os sexos no tocante à resposta, os dados podem ser combinados para fins estatísticos. Devem também comunicar-se os resultados da toxicidade em animais e os sinais clínicos.

Critérios de aceitabilidade

Critérios para determinar a aceitabilidade do ensaio:

Avaliação e interpretação dos resultados

Caso se cumpram todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente positivo se:

Se, num determinado tempo de amostragem, apenas se analisar a dose mais elevada, o produto químico em estudo é considerado claramente positivo caso se verifique um aumento estatisticamente significativo em comparação com o controlo negativo em paralelo e os resultados se situem fora da distribuição dos dados históricos de controlo negativo (p. ex., limites de controlo de 95 % com base numa distribuição de Poisson). A referência bibliográfica (13) contém recomendações sobre os métodos estatísticos adequados. Quando se efetua um estudo da resposta à dosagem, devem analisar-se, pelo menos, três grupos de doses tratados. Os testes estatísticos utilizados devem considerar que o animal constitui a unidade experimental. Um resultado positivo no ensaio de aberrações cromossómicas indica que o produto químico em estudo induz aberrações cromossómicas estruturais na medula óssea das espécies ensaiadas.

Se se cumprirem todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente negativo caso, em todas as condições experimentais examinadas:

A referência bibliográfica (13) contém recomendações sobre os métodos estatísticos mais adequados. A prova da exposição das células da medula a um produto químico em estudo pode consistir numa depressão do índice mitótico ou na medição dos níveis do produto químico no plasma ou no sangue. Em caso de administração intravenosa, não são necessárias provas da exposição. Alternativamente, podem utilizar-se dados ADME obtidos no âmbito de um estudo independente, com recurso à mesma via e à mesma espécie, para demonstrar que ocorreu exposição da medula óssea. Um resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, o produto químico em estudo não induz aberrações cromossómicas estruturais nas células da medula das espécies sujeitas ao ensaio.

Não há nenhuma exigência concreta para a verificação de uma resposta positiva clara ou de uma resposta negativa clara.

Nos casos em que a resposta não for inequivocamente negativa ou positiva, a fim de contribuir para a definição da importância biológica dos resultados (p. ex., um aumento ténue ou no limite), os dados devem ser avaliados por pareceres de peritos e/ou investigações complementares das experiências concluídas. Em alguns casos, poderá ser útil analisar mais células ou repetir o ensaio alterando as condições experimentais.

Em certos casos raros, mesmo após uma investigação complementar, os dados obtidos não permitem concluir um resultado positivo ou negativo, pelo que se considerará que o produto químico em estudo produz uma resposta ambígua.

A frequência de poliploidia e de metáfases endorreduplicadas entre as metáfases totais deve ser registada separadamente. Um aumento do número de células poliploides ou endorreduplicadas pode indicar que o produto químico em estudo apresenta o potencial de inibir a mitose ou a progressão do ciclo celular (ver ponto 3).

Relatório do ensaio

Elementos a incluir no relatório de ensaio:

Resumo

REFERÊNCIAS

5)

Na parte B, o capítulo B.12 é substituído pelo seguinte texto:

«B.12   Ensaio de micronúcleos em eritrócitos de mamíferos

INTRODUÇÃO

Este método de ensaio é equivalente ao Test Guideline 474 (2016) da OCDE. Faz parte de uma série de métodos de ensaio sobre toxicologia genética. Está disponível um documento da OCDE que fornece informações sucintas sobre ensaios de toxicologia genética e resume as alterações recentemente efetuadas às orientações da OCDE nesse domínio (1).

O ensaio in vivo de micronúcleos em células de mamíferos é particularmente importante para a avaliação da genotoxicidade, visto que, embora possam variar de espécie para espécie, os fatores do metabolismo in vivo, a farmacocinética e os processos de reparação do ADN estão ativos e contribuem para as respostas. Os ensaios in vivo são igualmente úteis para investigação suplementar de genotoxicidade detetada in vitro.

O ensaio in vivo de micronúcleos em células de mamíferos é utilizado na deteção de danos induzidos pelo produto químico em estudo nos cromossomas ou no aparelho mitótico dos eritroblastos, através da avaliação da formação de micronúcleos em eritrócitos colhidos na medula óssea ou provenientes de células de sangue periférico de animais, geralmente roedores.

O objetivo do ensaio de micronúcleos é identificar produtos químicos que causem danos citogenéticos indutores da formação de micronúcleos que contenham cromossomas inteiros ou fragmentos de cromossoma retardatários.

Quando um eritroblasto de medula óssea evolui para um eritrócito imaturo (também designado por «eritrócito policromático» ou «reticulócito»), o núcleo principal é expulso, mas os micronúcleos eventualmente já formados podem permanecer no citoplasma. A visualização ou deteção dos micronúcleos nestas células é facilitada pela ausência de núcleo principal. Um aumento da frequência de eritrócitos imaturos micronucleados nos animais expostos ao produto químico em estudo constitui uma indicação de aberrações cromossómicas estruturais, ou numéricas, induzidas.

Identificam-se e quantificam-se os eritrócitos micronucleados recém-formados por coloração, seguida de contagem visual ao microscópio ou análise automática. O recurso a meios de contagem automática facilita grandemente a contagem de um número suficiente de eritrócitos imaturos no sangue periférico ou na medula óssea de animais adultos. O recurso a meios automáticos constitui uma alternativa aceitável à avaliação não-automática (2). Os estudos comparativos realizados revelaram que os métodos automáticos, associados à utilização de padrões de calibração adequados, podem proporcionar melhores sensibilidade, reprodutibilidade interlaboratorial e reprodutibilidade intralaboratorial do que a contagem não-automática ao microscópio (3) (4). Entre os sistemas automáticos que podem medir frequências de eritrócitos micronucleados contam-se os citómetros de fluxo (5), analisadores de imagem (6) (7) e citómetros de varrimento por laser (8).

Embora isso não faça normalmente parte do ensaio, vários critérios permitem distinguir entre fragmentos de cromossoma e cromossomas inteiros. É o caso da identificação da presença ou ausência de cinetócoro ou de ADN centromérico, ambos característicos dos cromossomas intactos. A ausência de cinetócoro ou de ADN centromérico indica que o micronúcleo contém apenas fragmentos de cromossomas; a presença de algum deles indica perda cromossómica.

O apêndice 1 estabelece definições da terminologia utilizada.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

Uma vez que os eritrócitos são produzidos na medula óssea, o tecido-alvo dos danos genéticos avaliados neste ensaio é medula óssea de roedores adultos jovens. Desde que se apresentem razões científicas para isso, pode igualmente realizar-se a contagem de micronúcleos em eritrócitos imaturos de sangue periférico de outras espécies de mamíferos, cuja sensibilidade na deteção de produtos químicos causadores de aberrações cromossómicas estruturais ou numéricas tenha sido demonstrado ser adequada (por indução de micronúcleos em eritrócitos imaturos). A frequência dos eritrócitos imaturos micronucleados é o parâmetro principal. Se os animais forem expostos ao produto químico em estudo de forma contínua durante um período superior ao tempo de vida dos eritrócitos da espécie em causa (por exemplo, no caso do rato, quatro ou mais semanas), a frequência de eritrócitos maduros micronucleados no sangue periférico pode igualmente utilizar-se como parâmetro em espécies sem grande seleção esplénica contra células micronucleadas.

Se houver provas de que nem o produto ou os produtos químicos em estudo nem nenhum dos seus metabolitos entram em contacto com o tecido-alvo, o presente ensaio pode não ser adequado.

Antes da aplicação deste método de ensaio a uma mistura para obter dados relacionados com exigências normativas, importa ponderar se — e, em caso afirmativo, por que motivo — o método pode fornecer resultados adequados para o efeito. Essa ponderação não é necessária se exigências normativas impuserem o ensaio da mistura em causa.

PRINCÍPIO DO MÉTODO DE ENSAIO

Expõem-se os animais ao produto químico em estudo, por uma via adequada. Se for utilizada medula óssea, eutanasiam-se os animais transcorrido(s) o(s) período(s) adequado(s) após a exposição e extrai-se-lhes medula; em seguida, realizam-se as preparações e procede-se à sua coloração (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Se for utilizado sangue periférico, colhe-se o sangue uma vez transcorrido(s) o(s) período(s) adequado(s) após a exposição; em seguida, realizam-se as preparações e procede-se à sua coloração (12) (16) (17) (18). Se a administração do produto químico for rápida, é importante colher o sangue ou a medula óssea depois de transcorrido um período suficiente para possibilitar a deteção de eritrócitos imaturos com micronucleação induzida pela exposição. Se forem colhidas amostras de sangue periférico, é necessário que tenha passado um período suficiente para que os efeitos se manifestem na circulação sanguínea. Pesquisam-se os micronúcleos nas preparações por exame ao microscópio, análise de imagem, citometria de fluxo ou citometria de varrimento por laser.

VERIFICAÇÃO DA COMPETÊNCIA TÉCNICA DO LABORATÓRIO

Determinação da competência técnica

A fim de comprovar que possui experiência suficiente na realização do ensaio antes de passar a utilizar este método em ensaios de rotina, o laboratório deve ter-se demonstrado capaz de reproduzir os resultados de frequência de micronúcleos decorrentes dos dados publicados (por exemplo: (17) (19) (20) (21) (22)) com, pelo menos, dois produtos químicos de controlo positivo (incluindo respostas fracas induzidas por doses baixas desses produtos químicos), nomeadamente os constantes do quadro 1, e com amostras de controlo do excipiente/do solvente compatíveis (ver o ponto 26). Estas experiências devem utilizar doses que originem aumentos reprodutíveis e dependentes da dose e devem demonstrar a sensibilidade e a gama dinâmica do sistema de ensaio no tecido em causa (medula óssea ou sangue periférico), recorrendo ao método de contagem a utilizar no laboratório. Este requisito não é aplicável a laboratórios com experiência, isto é, que disponham de uma base de dados históricos, como se refere nos pontos 14 a 18.

Dados históricos de controlo

No decurso da determinação da competência técnica, o laboratório deve estabelecer:

Ao obter os primeiros dados para um historial de distribuição dos controlos negativos, os controlos negativos realizados em paralelo devem ser coerentes com os dados de controlo publicados, caso existam. À medida que se forem adicionando mais dados experimentais ao historial de distribuição dos controlos, os controlos negativos realizados em paralelo devem, idealmente, situar-se dentro dos limites de 95 % dos controlos daquela distribuição. A base de dados históricos de controlo negativo do laboratório deve ter a solidez estatística necessária para que o laboratório possa avaliar a distribuição dos seus dados de controlo negativo. A bibliografia indica que podem ser necessárias, no mínimo, 10 experiências, embora, de preferência, devam ser realizadas, pelo menos, 20 experiências em condições experimentais comparáveis. Os laboratórios devem utilizar métodos de controlo de qualidade, como gráficos de controlo (por exemplo: gráficos C ou gráficos de barras (23)), para identificar a variabilidade dos seus dados e demonstrar que o laboratório domina a metodologia. Encontram-se na bibliografia (24) outras recomendações sobre a forma de obter e utilizar dados históricos (critérios de inclusão e exclusão de dados em séries históricas e critérios de aceitação das experiências realizadas).

Se o laboratório não realizar um número suficiente de experiências para estabelecer uma distribuição estatisticamente sólida dos controlos negativos (ver o ponto 15) durante a determinação da competência técnica (ponto 13), é aceitável que a distribuição possa ser completada nos primeiros ensaios de rotina. Este procedimento deve seguir as recomendações enunciadas na bibliografia (24); os resultados de controlo negativo obtidos nas referidas experiências devem ser coerentes com os dados de controlo negativo publicados.

As eventuais alterações ao protocolo experimental devem ser ponderadas em função da manutenção da coerência dos dados delas resultantes com a base de dados históricos de controlo do laboratório. Apenas grandes incoerências justificam a constituição de uma nova base de dados históricos de controlo, caso um parecer de perito considere que a nova distribuição diferirá da anterior (ver o ponto 15). Durante a constituição da nova base, pode não ser necessário dispor de uma base de dados de controlo negativo completa para realizar ensaios reais, desde que o laboratório possa demonstrar que os valores de controlo negativo obtidos em paralelo são coerentes com a sua base de dados anterior ou com os dados publicados correspondentes.

Os dados de controlo negativo devem ser constituídos pela incidência de eritrócitos imaturos micronucleados em cada animal. Os controlos negativos realizados em paralelo devem, idealmente, situar-se dentro dos limites de 95 % dos controlos da distribuição da base de dados históricos de controlo negativo do laboratório. Caso se situem fora desses limites, os dados de controlos negativos realizados em paralelo podem ser aceitáveis para inclusão no historial de distribuição de controlos se não forem valores aberrantes extremos, se o sistema de ensaio estiver comprovadamente dominado (ver o ponto 15) e se não houver indícios de erro humano ou de deficiência técnica.

DESCRIÇÃO DO MÉTODO

Preparativos

Escolha da espécie animal

Devem ser utilizados animais adultos, jovens e saudáveis, das estirpes de laboratório mais comuns. Podem ser utilizados ratos, ratazanas ou qualquer outra espécie de mamífero adequada. Caso se utilize sangue periférico, deve comprovar-se que a eliminação, pelo baço, de células micronucleadas em circulação não compromete a deteção de micronúcleos induzidos na espécie escolhida, o que foi claramente demonstrado em relação ao sangue periférico dos ratos e ratazanas (2). Deve constar do relatório a justificação científica da utilização de uma espécie que não seja o rato ou a ratazana. Se forem utilizadas espécies que não sejam roedores, recomenda-se que a medição dos micronúcleos induzidos seja integrada noutro ensaio de toxicidade adequado.

Condições de alojamento e de alimentação dos animais

No caso dos roedores, a temperatura do biotério deve ser de 22 °C (± 3 °C). Idealmente, a humidade relativa deve estar compreendida entre 50 % e 60 %, embora sejam aceitáveis valores compreendidos entre 40 %, no mínimo, e um valor máximo que, preferencialmente, não deve exceder 70 %, salvo durante os períodos de limpeza do biotério. A iluminação deve ser artificial, com uma alternância de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Para a alimentação, podem ser usadas dietas convencionais de laboratório, com acesso ilimitado a água potável. Quando o produto químico em estudo for administrado por via alimentar, a escolha da dieta pode ser condicionada pela necessidade de assegurar uma incorporação adequada. Os roedores devem ser alojados em pequenos grupos (não mais de cinco por gaiola) do mesmo sexo e grupo de exposição — caso não se prevejam comportamentos agressivos –, de preferência em gaiolas com pavimento contínuo e enriquecimento ambiental adequado, embora possam ser alojados individualmente se houver razões científicas que o justifiquem.

Preparação dos animais

Normalmente utilizam-se animais adultos, jovens e saudáveis (no caso dos roedores, idealmente com 6-10 semanas no início da exposição, embora sejam aceitáveis animais ligeiramente mais velhos), que se distribuem aleatoriamente pelos grupos de controlo e pelos grupos de exposição. Identificam-se os animais de forma unívoca, utilizando um método que não cause sofrimento e seja o menos invasivo possível (por exemplo: anilhas, marcações, microchips ou identificação biométrica, mas não entalhe de orelhas nem amputação de falanges), e aclimatam-se às condições do laboratório durante, pelo menos, cinco dias. As gaiolas devem estar dispostas de forma a minimizar possíveis efeitos derivados do seu posicionamento. Devem ser evitadas contaminações cruzadas pelo produto químico de controlo positivo e pelo produto químico em estudo. No início do estudo, a diferença de peso entre os animais deve ser mínima e não deve exceder ± 20 % do peso médio de cada sexo.

Preparação das doses

Os produtos químicos em estudo que se apresentem no estado sólido devem ser dissolvidos ou suspensos em solventes ou excipientes adequados, ou misturados na dieta ou na água de beber, antes da administração aos animais. Os produtos químicos em estudo que se apresentem no estado líquido podem ser administrados diretamente ou ser diluídos antes da administração. No caso de exposições por inalação, os produtos químicos em estudo podem ser administrados sob a forma de gás, vapor ou aerossol sólido/líquido, em função das suas propriedades físico-químicas. Devem ser utilizadas preparações frescas do produto químico em estudo, a menos que os dados de estabilidade demonstrem que o mesmo pode ser armazenado e definam as condições de armazenagem adequadas.

Condições de realização do ensaio

Solvente/excipiente

O solvente/excipiente não deve produzir efeitos tóxicos nas doses utilizadas nem reagir quimicamente com o produto químico em estudo. A eventual utilização de solventes/excipientes menos habituais deve ser fundamentada por dados de referência que indiquem serem compatíveis. Recomenda-se, sempre que possível, a utilização prioritária de solventes/excipientes aquosos. A água, o soro fisiológico, uma solução de metilcelulose, uma solução de sal de sódio de carboximetilcelulose, o azeite e o óleo de milho constituem exemplos de solventes/excipientes compatíveis de utilização comum. Na ausência de dados de controlo, históricos ou publicados, demonstrativos de que o solvente/excipiente inabitual eventualmente escolhido não induz a formação de micronúcleos nem outros efeitos deletérios, deve realizar-se um ensaio preliminar que permita tirar conclusões sobre a aceitabilidade do controlo do solvente/excipiente utilizado.

Controlos

Controlos positivos

Como regra geral, deve incluir-se em cada ensaio um grupo de animais expostos a um produto químico de controlo positivo. Este princípio pode não ser seguido caso o laboratório de ensaio se tenha demonstrado competente na realização do ensaio e tenha estabelecido um gama histórica de controlo positivo. Se não se incluir um grupo de controlo positivo paralelo, cada ensaio deve compreender controlos de contagem (lâminas fixadas e não-coradas ou amostras de suspensões celulares, conforme o método de contagem utilizado). Para o efeito, podem incluir-se na contagem realizada no estudo amostras de referência adequadas, provenientes de experiências de controlo positivo efetuadas separadamente a intervalos regulares (por exemplo todos os 6 a 18 meses) e armazenadas em seguida — por exemplo obtidas nos ensaios de demonstração de competência técnica e, subsequentemente, com a regularidade necessária.

Os produtos químicos de controlo positivo devem gerar, com fiabilidade, um aumento detetável da frequência de formação de micronúcleos, em relação ao nível de ocorrência espontâneo. Quando se recorre a microscopia para efetuar uma contagem não-automática, a dose de controlo positivo a administrar deve ser escolhida de modo a evidenciar efeitos claros, mas não imediatamente reveladores da identidade das amostras codificadas à pessoa que efetua as contagens. É aceitável administrar o controlo positivo por via diferente da utilizada para o produto químico em estudo, seguir um programa de exposição diferente e colher amostras uma única vez. Quando se justifique, pode ainda ponderar-se a utilização de produtos químicos de controlo positivo da mesma classe química. O quadro 1 apresenta exemplos de produtos químicos de controlo positivo.

Quadro 1

Exemplos de produtos químicos de controlo positivo.

Produto químico e n.o de registo CAS

Metanossulfonato de etilo [62-50-0]

Metanossulfonato de metilo [66-27-3]

Etilnitrosoureia [759-73-9]

Mitomicina C [50-07-7]

Ciclofosfamida (mono-hidratada) [50-18-0 (6055-19-2)]

Trietilenomelamina [51-18-3]

Colquicina [64-86-8] ou vimblastina [865-21-4] — como aneugénios

Controlos negativos

A todos os tempos de colheita de amostras deve estar associado um grupo de animais de controlo negativo, tratados da mesma forma que os animais dos grupos expostos, exceto não serem expostos ao produto químico em estudo. Se for utilizado um solvente/excipiente para administrar o produto químico em estudo, o grupo de controlo deve recebê-lo também. No entanto, se os dados históricos de controlo negativo do laboratório de ensaio demonstrarem, para cada tempo de colheita de amostras, coerência na variabilidade entre animais e na frequência de células com micronúcleos, pode ser suficiente uma única amostragem de controlo negativo. Em caso de recurso a uma única amostragem de controlo negativo, esta deve corresponder ao primeiro tempo de colheita de amostras utilizado no estudo.

Se for utilizado sangue periférico e o estudo for de curta duração, uma amostra colhida antes da exposição pode fazer as vezes de amostra de controlo negativo ensaiada em paralelo, desde que os dados daí resultantes sejam coerentes com a base de dados históricos de controlo do laboratório de ensaio. Foi demonstrado na ratazana que a colheita de pequenos volumes (por exemplo menos de 100 μl/dia) de amostras antes da exposição tem incidência mínima na frequência de fundo da formação de micronúcleos (25)

PROTOCOLO DE ENSAIO

Número e sexo dos animais

Em geral, a resposta dos animais, em termos de formação de micronúcleos em machos e fêmeas, é semelhante, pelo que a maioria dos estudos pode ser realizada em qualquer dos sexos (26). Dados reveladores de diferenças significativas entre machos e fêmeas (por exemplo: diferenças de toxicidade sistémica, de metabolismo, de biodisponibilidade, de toxicidade para a medula óssea etc., designadamente em estudos exploratórios de gamas de dosagem) aconselham a utilização de ambos os sexos. Neste caso, pode justificar-se o estudo em ambos os sexos: por exemplo no contexto de um estudo de toxicidade com repetição da dose. Caso se utilizem animais de ambos os sexos, pode justificar-se o recurso ao modelo fatorial. O apêndice 2 explica como analisar os dados por recurso a este modelo.

A dimensão dos grupos no início do estudo deve permitir dispor de um mínimo de 5 animais analisáveis do mesmo sexo por grupo ou, se forem utilizados ambos os sexos, de um mínimo de 5 animais analisáveis de cada sexo por grupo. Nos casos em que a exposição humana ao produto químico possa ser específica de um dos sexos, como acontece com alguns produtos farmacêuticos, o ensaio deve ser executado com animais do sexo em causa. A título de orientação, o número máximo de animais necessário num estudo em medula óssea realizado de acordo com os parâmetros estabelecidos no ponto 37, com três grupos de dosagem e, em paralelo, um grupo de controlo negativo e um grupo de controlo positivo (cada um deles constituído por cinco animais do mesmo sexo), será normalmente de 25 a 35.

Níveis de dosagem

Se, por não estarem disponíveis dados que possam servir de orientação na escolha das doses, se realizar previamente um estudo exploratório da gama de dosagens a administrar, este deve ter lugar no mesmo laboratório, utilizando a mesma espécie, a mesma estirpe, o mesmo sexo e o mesmo regime de exposição previstos para o estudo principal (27). Este estudo deve procurar identificar a dose máxima tolerável (DMT), definida como a dose mais elevada que será tolerada sem gerar sinais de toxicidade limitativos do estudo, atendendo à duração do mesmo (por exemplo: que induza quebras do peso corporal ou citotoxicidade no sistema hematopoiético, mas que não cause morte nem sinais de dor, sofrimento ou tensão que obriguem a eutanasiar os animais (28)).

A dose máxima pode igualmente ser definida como a dose que gera toxicidade na medula óssea (por exemplo: redução de mais de 50 % da proporção de eritrócitos imaturos no total de eritrócitos da medula óssea ou do sangue periférico, mas sem que essa proporção se reduza a menos de 20 % do valor correspondente ao grupo de controlo). Todavia, quando se analisam células com reação positiva à CD71 na circulação sanguínea periférica (por citometria de fluxo), esta fração de eritrócitos imaturos muito jovens responde a ações tóxicas mais rapidamente do que o grupo, mais numeroso, de eritrócitos imaturos com reação positiva ao ARN. Por conseguinte, nas experiências que, após exposição aguda, examinem a fração de eritrócitos imaturos com reação positiva à CD71, a toxicidade pode parecer superior à revelada em experiências que identifiquem os eritrócitos imaturos com base no teor de ARN. Por este motivo, nas experiências que prevejam cinco ou menos dias de exposição, pode definir-se o nível máximo de dosagem de um produto químico tóxico como a dose que provoca uma redução com significância estatística da proporção de eritrócitos imaturos com reação positiva à CD71 no total de eritrócitos, mas sem que essa proporção se reduza a menos de 5 % do valor correspondente ao grupo de controlo (29).

Os produtos químicos cujas propriedades toxicocinéticas atinjam a saturação ou que induzam processos de desintoxicação passíveis de se traduzirem numa diminuição da exposição após administração prolongada podem constituir exceção aos critérios de fixação das doses, devendo ser avaliados caso a caso.

Um estudo completo que vise obter informação sobre a resposta às doses deve incluir um grupo de controlo negativo e, no mínimo, três níveis de dosagem, espaçados por um fator que, em geral, é 2 e não pode ser superior a 4. Se o produto químico em estudo não gerar toxicidade num estudo exploratório da gama de dosagens ou os dados disponíveis o comprovarem, a dose mais elevada deve ser de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia, para períodos de administração de 14 ou mais dias, ou de 2 000 mg/kg de peso corporal/dia, para períodos de administração de menos de 14 dias. Se o produto químico em estudo gerar toxicidade, a dose máxima administrada deve ser a DMT e as doses utilizadas devem, de preferência, abranger uma gama compreendida entre a dose máxima e uma dose de toxicidade baixa ou nula. Caso se observe toxicidade no tecido-alvo (medula óssea) a todas as doses ensaiadas, recomenda-se a realização de um estudo complementar com doses não-tóxicas. Os estudos destinados a obter informações quantitativas dose-resposta mais precisas podem necessitar de mais grupos de dosagem. Os limites indicados podem variar no caso do estudo de certos tipos de produtos químicos (por exemplo medicamentos para uso humano) abrangidos por exigências específicas.

Ensaio do limite

Se os estudos exploratórios da gama de dosagens ou dados existentes relativos a estirpes animais afins indicarem que um regime de exposição, pelo menos, à dose-limite (abaixo indicada) não gera efeitos tóxicos observáveis (nomeadamente inibição de proliferação na medula óssea ou outros sinais de citotoxicidade no tecido-alvo) e, com base em estudos de genotoxicidade in vitro ou em dados referentes a produtos químicos estruturalmente afins, não for de prever a ocorrência de genotoxicidade, pode não ser necessário um estudo completo com três níveis de dosagem, desde que tenha sido demonstrado que o(s) produto(s) químico(s) em estudo atinge(m) o tecido-alvo (medula óssea). Nesses casos, pode ser suficiente um nível de dosagem único, correspondente à dose-limite. Se a administração se prolongar por 14 dias ou mais, a dose-limite é de 1 000 mg/kg de peso corporal/dia. Se o período de administração for inferior a 14 dias, a dose-limite é de 2 000 mg/kg de peso corporal/dia.

Administração das doses

Na conceção do ensaio, deve ter-se em conta a via prevista de exposição humana. Por conseguinte, desde que devidamente justificadas, podem escolher-se vias de exposição como a alimentação, a água de beber, as vias tópica, subcutânea ou intravenosa, a via oral (por sonda gástrica), a via inalatória ou a via intratraqueal, ou o recurso a implantes. A via escolhida deve garantir a exposição adequada do(s) tecido(s)-alvo. A injeção intraperitoneal não é, em geral, recomendada, uma vez que não se trata de uma via previsível de exposição humana, só devendo utilizar-se com justificação científica específica. Se o produto químico em estudo for misturado nos alimentos ou na água de beber, especialmente no caso de uma dose única, deve ter-se o cuidado de prever, entre o consumo dos alimentos e da água e a colheita de amostras, um intervalo suficiente para permitir a deteção dos efeitos (ver o ponto 37). O volume máximo de líquido que se pode administrar de cada vez por sonda gástrica ou injeção depende do tamanho do animal, não devendo normalmente exceder 1 ml/100 g de peso corporal; excetuam-se as soluções aquosas, que podem ser administradas na proporção de 2 ml/100 g de peso corporal. A utilização de volumes superiores carece de justificação. Exceto no caso de produtos químicos irritantes ou corrosivos, que normalmente produziriam efeitos exacerbados a concentrações superiores, a variabilidade do volume de ensaio deve ser minimizada ajustando a concentração, de modo a garantir a administração de um volume constante relativamente à massa corporal, a todos os níveis de dosagem.

Programa de exposição

De preferência, realizam-se duas ou mais exposições, intervaladas de 24 horas, sobretudo quando o ensaio se integra noutros estudos de toxicidade. Em alternativa, caso haja razões científicas para isso (por exemplo no caso dos produtos químicos que reconhecidamente bloqueiam o ciclo celular), pode efetuar-se uma exposição única. Para facilitar a administração de grandes volumes, os produtos químicos em estudo também podem ser administrados sob a forma de uma dose dividida (ou seja, duas ou mais exposições no mesmo dia, separadas por não mais de 2 a 3 horas). Nesses casos, ou no caso da administração do produto químico em estudo por inalação, a colheita das amostras deve ser programada em função do momento da última administração ou do termo da exposição.

O ensaio pode ser realizado em ratos ou ratazanas de um dos seguintes modos:

Se necessário e cientificamente justificado, e para facilitar a combinação com outros ensaios de toxicidade, podem ser adotados outros regimes de dosagem ou de colheita de amostras.

Exames

Os animais em estudo devem ser sujeitos a exames clínicos gerais, registando-se os sinais clínicos detetados, pelo menos uma vez por dia, de preferência à(s) mesma(s) hora(s) todos os dias e tendo em consideração o período de pico dos efeitos previstos após a exposição. Pelo menos duas vezes por dia, durante o período de exposição, verificam-se os casos de morbidez ou mortalidade no conjunto dos animais. Todos os animais devem ser pesados no início do estudo, pelo menos uma vez por semana (em estudos com repetição da dose) e quando forem eutanasiados. Nos estudos que se prolonguem por uma semana ou mais, o consumo de alimentos deve ser medido, pelo menos, uma vez por semana. Se o produto químico em estudo for administrado através da água de beber, o consumo desta deve ser medido a cada mudança de água e, pelo menos, uma vez por semana. Os animais com indicadores não-letais de toxicidade excessiva devem ser eutanasiados antes do termo do período de ensaio (28). Em determinados casos, pode monitorizar-se a temperatura corporal dos animais, dado que estados de hipertermia ou de hipotermia induzidos pela exposição ao produto químico em estudo podem falsear os resultados (32) (33) (34).

Exposição dos tecidos-alvo

Sempre que isso se justifique e nos casos em que não haja outros dados de exposição (ver o ponto 48), deve colher-se uma amostra de sangue num ou mais momentos oportunos, para se poderem determinar os níveis dos produtos químicos em estudo no plasma e assim comprovar que ocorreu exposição da medula óssea.

Preparação da medula óssea/do sangue

As células da medula óssea são normalmente colhidas nos fémures ou nas tíbias dos animais imediatamente após a eutanásia. Geralmente, colhem-se, preparam-se e coram-se as células por métodos bem definidos. Para se obterem pequenos volumes de sangue periférico respeitando as normas aplicáveis de bem-estar animal, pode recorrer-se a um método que permita a sobrevivência do animal, como a colheita na veia caudal ou noutro vaso sanguíneo adequado, ou optar-se por realizar a colheita num vaso principal ou por punção cardíaca, depois de eutanasiar o animal. Tanto no caso dos eritrócitos provenientes de medula óssea como no caso dos eritrócitos provenientes de sangue periférico, e conforme o método de análise utilizado, pode efetuar-se imediatamente uma coloração supravital das células (16) (17) (18), proceder-se à preparação de esfregaços das mesmas, que são em seguida corados para análise microscópica, ou optar-se por fixar e corar as células de modo adequado a uma análise por citometria de fluxo. A utilização de um corante específico do ADN — por exemplo: laranja de acridina (35) ou uma combinação do corante 33258 da Hoechst e de pironina-Y (36) — pode eliminar alguns erros associados à utilização de corantes inespecíficos do ADN. Esta vantagem não exclui a utilização de corantes convencionais (por exemplo o Giemsa para análise microscópica). Podem igualmente ser utilizados outros sistemas — por exemplo colunas de celulose para remoção das células nucleadas (37) (38) –, desde que comprovadamente compatíveis com a preparação laboratorial das amostras.

Caso sejam aplicáveis, podem ser utilizados anticorpos anticinetócoro (39), o método FISH com sondas de ADN pancentromérico (40) ou a marcação in situ com iniciadores pancentroméricos específicos, em combinação com uma coloração de contraste adequada do ADN (41), para identificar a natureza dos micronúcleos (cromossomas inteiros ou fragmentos de cromossomas), a fim de determinar se o mecanismo indutor da formação de micronúcleos resulta de atividade clastogénica e/ou aneugénica. Na diferenciação entre clastogénios e aneugénios, podem ser utilizados outros métodos, cuja eficácia tenha sido demonstrada.

Análise (automática e não-automática)

Todas as lâminas ou amostras a analisar, incluindo as dos grupos de controlo positivo e negativo, devem ser codificadas individualmente e de forma aleatória antes de qualquer análise, para que a pessoa que efetua as contagens não fique a par dos níveis de exposição. Essa codificação é desnecessária quando se utilizam sistemas de contagem automáticos, que não se baseiam num exame visual, influenciável pelo operador. Determina-se a proporção de eritrócitos imaturos no total de eritrócitos (imaturos + maturos) para cada animal através da contagem de, pelo menos, 500 eritrócitos, no caso da medula óssea, ou 2 000 eritrócitos, no caso do sangue periférico (42). A incidência de eritrócitos imaturos micronucleados deve ser determinada examinando, pelo menos, 4 000 eritrócitos imaturos por animal (43). Se a base de dados históricos de controlo negativo do laboratório indicar que a frequência média de fundo de eritrócitos imaturos micronucleados é inferior a 0,1 %, deve ponderar-se o exame de células adicionais. Nas amostras analisadas, a proporção de eritrócitos imaturos no total de eritrócitos, nos animais expostos, não deve ser inferior a 20 % da proporção verificada no grupo de controlo do excipiente/solvente, numa contagem ao microscópio, nem inferior a aproximadamente 5 % da proporção verificada no grupo de controlo do excipiente/solvente, numa contagem por métodos citométricos dos eritrócitos imaturos com reação positiva à CD71 (ver o ponto 31) (29). Por exemplo, no caso de um ensaio de medula óssea com contagem por microscopia, se a proporção de eritrócitos imaturos na medula óssea do grupo de controlo for de 50 %, o limite superior de toxicidade será de 10 % de eritrócitos imaturos.

Dado que o baço da ratazana retém e destrói os eritrócitos micronucleados, é preferível restringir a análise de eritrócitos imaturos micronucleados à fração mais jovem, para garantir uma sensibilidade elevada ao analisar sangue periférico desta espécie. Quando se recorre a métodos de análise automáticos, é possível identificar esses eritrócitos mais imaturos com base no teor elevado de ARN dos mesmos ou no elevado nível de recetores da transferina (reação positiva à CD71) expressos à superfície dos ditos (31). Porém, a comparação direta de vários métodos de coloração revelou que podem ser obtidos resultados satisfatórios por diversos métodos, nomeadamente pela coloração clássica com laranja de acridina (3) (4).

DADOS E RELATÓRIOS

Tratamento dos resultados

Devem ser apresentados num quadro os dados relativos a cada animal. Devem ser indicados separadamente, para cada animal examinado, o número de eritrócitos imaturos, o número de eritrócitos imaturos micronucleados e a proporção de eritrócitos imaturos no total de eritrócitos. Se se tiverem exposto ratos ao produto químico em estudo continuamente durante quatro semanas ou mais, também devem ser indicados os dados eventualmente obtidos relativamente ao número e à proporção de eritrócitos maturos micronucleados. Devem também ser indicados dados relativos à toxicidade revelada nos animais e aos sinais clínicos neles evidenciados.

Critérios de aceitabilidade

Critérios para determinar a aceitabilidade do ensaio:

Avaliação e interpretação dos resultados

Se forem cumpridos todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente positivo se:

Se, ao se colherem amostras uma vez transcorrido um período determinado para o efeito, apenas se examinar a dose mais elevada, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente positivo caso se verifique aumento, com significância estatística, em relação ao grupo de controlo negativo ensaiado em paralelo e os resultados correspondentes se situem fora da distribuição dos dados históricos de controlo negativo (por exemplo: limites de 95 % dos controlos, com base numa distribuição de Poisson). As referências bibliográficas (44) (45) (46) (47) contêm recomendações sobre os métodos estatísticos mais adequados. Quando se estuda a resposta à dosagem, devem ser analisados, pelo menos, três grupos expostos a doses diferentes do produto químico em estudo. A unidade experimental dos testes estatísticos deve ser o animal. Um resultado positivo no ensaio de micronúcleos indica que o produto químico em estudo induz a formação de micronúcleos, como resultado de danos provocados nos cromossomas ou no aparelho mitótico dos eritroblastos da espécie ensaiada. Caso se tenha realizado um ensaio de deteção de centrómeros em micronúcleos, considerar-se-ão aneugénicos os produtos químicos que produzam micronúcleos com centrómeros (deteção de ADN centromérico ou de cinetócoro, indicativos de perda cromossómica total).

Se forem cumpridos todos os critérios de aceitabilidade, o produto químico em estudo é considerado inequivocamente negativo se, em todas as condições experimentais examinadas:

As referências bibliográficas (44) (45) (46) (47) contêm recomendações sobre os métodos estatísticos mais adequados. A exposição da medula óssea ao produto químico em estudo pode ser comprovada por uma redução da razão entre os eritrócitos imaturos e os eritrócitos maturos ou por medição dos níveis do produto químico em estudo no plasma ou no sangue. No caso da administração intravenosa, não são necessárias provas da exposição. Em alternativa, para demonstrar a exposição da medula óssea, pode recorrer-se a dados de absorção, distribuição, metabolismo e excreção (ADME) obtidos num estudo independente, pela mesma via e na mesma espécie. Um resultado negativo indica que, nas condições do ensaio, o produto químico em estudo não induz a formação de micronúcleos em eritrócitos imaturos da espécie ensaiada.

As respostas inequivocamente positivas ou inequivocamente negativas não carecem de confirmação.

No caso de a resposta não ser inequivocamente negativa nem inequivocamente positiva, para se tirarem conclusões sobre a importância biológica de um resultado (por exemplo um aumento ténue ou no limite), os dados devem ser avaliados por peritos e/ou as experiências realizadas devem ser objeto de estudos complementares. Em alguns casos, pode ser útil analisar mais células ou repetir o ensaio, alterando as condições experimentais.

Em certos casos, raros, mesmo após estudos complementares, os dados obtidos não permitirão concluir por um resultado positivo ou negativo do ensaio do produto químico, pelo que se considerará que o resultado do estudo é ambíguo.

Relatório do ensaio

Elementos a constar do relatório do ensaio:

REFERÊNCIAS

6)

Na parte B, é suprimido o capítulo B.15.

7)

Na parte B, é suprimido o capítulo B.16.

8)

Na parte B, é suprimido o capítulo B.18.

9)

Na parte B, é suprimido o capítulo B.19.

10)

Na parte B, é suprimido o capítulo B.20.

11)

Na parte B, é suprimido o capítulo B.24.

12)

Na parte B, o capítulo B.47 é substituído pelo seguinte texto:

«B.47   Método de ensaio de opacidade e permeabilidade da córnea em bovinos para identificação de produtos químicos indutores de lesões oculares graves e de produtos químicos que não necessitem de ser classificados em termos de irritação ocular nem de lesões oculares graves

INTRODUÇÃO

Este método de ensaio é equivalente ao Test Guideline 437 (2013) da OCDE. O método de ensaio de opacidade e permeabilidade da córnea em bovinos (Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP)) foi avaliado em 2006 e 2012 pelo ICCVAM (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods), em colaboração com o ECVAM (European Centre for the Validation of Alternative Methods) e o JaCVAM (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods) (1) (2). A primeira avaliação incidiu na utilidade do método BCOP para a identificação de produtos químicos (substâncias e misturas) indutores de lesões oculares graves (1). A segunda avaliação incidiu na utilidade do método para a identificação de produtos químicos (substâncias e misturas) não classificados em termos de irritação ocular nem de lesões oculares graves (2). A base de dados de validação do método BCOP contava com 113 substâncias e 100 misturas (2) (3). Destas avaliações e da correspondente avaliação interpares concluiu-se que este método de ensaio identifica corretamente os produtos químicos (substâncias e misturas) indutores de lesões oculares graves (categoria 1) e os que não necessitam de ser classificados em termos de irritação ocular nem de lesões oculares graves, conforme definição do Sistema Mundial Harmonizado de Classificação e Rotulagem de Produtos Químicos (GHS) da ONU (4) e do Regulamento (CE) n.o 1272/2008, relativo à classificação, rotulagem e embalagem de substâncias e misturas (CRE) (7), tendo o método sido considerado cientificamente válido para ambas as finalidades. São lesões oculares graves as lesões produzidas nos tecidos oculares ou uma degradação grave da visão em consequência da aplicação do produto químico em estudo na superfície anterior do olho, não totalmente reversíveis nos 21 dias após a aplicação. Os produtos químicos que induzem lesões oculares graves são classificados na categoria 1 do sistema GHS da ONU. São produtos químicos não classificados em termos de irritação ocular nem de lesões oculares graves os que não preenchem os requisitos de classificação nas categorias 1 ou 2 (2A ou 2B) do sistema de classificação GHS da ONU, ou seja, os ditos de «Nenhuma categoria» no sistema GHS da ONU. O presente método inclui a utilização recomendada e as limitações do método de ensaio BCOP decorrentes das avaliações realizadas. Principais diferenças entre a versão inicial de 2009 e a versão de 2013 do Test Guideline da OCDE (enumeração não-exaustiva): utilização do método BCOP na identificação de produtos químicos que não necessitam de ser classificados no sistema GHS da ONU (pontos 2 e 7); clarificação da aplicabilidade do método ao ensaio de álcoois, cetonas e sólidos (pontos 6 e 7) e a substâncias e misturas (ponto 8); clarificação do modo como devem ser ensaiadas as substâncias tensioativas e as misturas que contêm substâncias tensioativas (ponto 28); atualizações e clarificações relativas às amostras de controlo positivas (pontos 39 e 40); atualização dos critérios de decisão do método BCOP (ponto 47); atualização dos critérios de aceitação do estudo (ponto 48); atualização dos elementos a constar dos relatórios dos ensaios (ponto 49); atualização do apêndice 1, relativo às definições; aditamento do apêndice 2, relativo à capacidade de previsão do método BCOP em vários sistemas de classificação; atualização do apêndice 3, relativo à lista de produtos químicos recomendados para demonstração de competência técnica; atualização do apêndice 4, relativo aos suportes de córnea utilizados no método BCOP (ponto 1) e ao opacímetro (pontos 2 e 3).

É geralmente aceite que, no futuro previsível, não estará disponível nenhum ensaio de irritação ocular in vitro único, alternativo ao ensaio ocular in vivo pelo método de Draize, para previsões em toda a gama de irritação que cubram as diferentes classes de produtos químicos. Porém, a combinação de vários métodos de ensaio alternativos no âmbito de uma estratégia de ensaio sequencial (por etapas) pode substituir-se ao ensaio ocular pelo método de Draize (5). A abordagem descendente (5) destina-se a ser utilizada quando, com base nas informações disponíveis, for previsível que o produto químico tenha elevado potencial irritante, ao passo que a abordagem ascendente (5) se destina a ser utilizada quando, com base nas informações disponíveis, for previsível que o produto químico não provoque irritação ocular suficiente para que seja necessário classificá-lo. O método de ensaio BCOP é um método in vitro que pode ser utilizado em determinadas circunstâncias, respeitadas determinadas limitações, para classificar e rotular produtos químicos em função da perigosidade ocular dos mesmos. Embora não seja considerado, por si só, uma alternativa válida ao ensaio ocular in vivo no coelho, o método de ensaio BCOP é recomendado como etapa inicial numa estratégia de ensaio do tipo da abordagem descendente proposta por Scott et al. (5) para identificar, sem necessidade de ensaios complementares, produtos químicos indutores de lesões oculares graves, isto é, produtos químicos classificáveis na categoria 1 do sistema GHS da ONU (4). O método BCOP é igualmente recomendado, no âmbito de uma estratégia como a abordagem ascendente (5), para identificar produtos químicos que não necessitem de ser classificados em termos de irritação ocular nem de lesões oculares graves, conforme definido pelo sistema GHS da ONU («nenhuma categoria» nesse sistema) (4). Todavia, se a aplicação do método BCOP a um determinado produto químico não permitir prever se este causa lesões oculares graves ou que não é necessário classificá-lo em termos de irritação ocular nem de lesões oculares graves, o produto químico em causa terá de ser sujeito a ensaios adicionais (in vitro e/ou in vivo) para determinar a classificação definitiva.

Na descrição deste método de ensaio, pretende-se explicar o processo utilizado para avaliar o potencial de perigosidade ocular de um produto químico, medido pela capacidade deste de induzir opacidade e um aumento de permeabilidade em córneas de bovino isoladas. Medem-se os efeitos tóxicos na córnea do seguinte modo: i) redução da transmissão de luz (opacidade) e ii) aumento da passagem do corante fluoresceína de sódio (permeabilidade). Combinam-se os resultados das determinações de opacidade e de permeabilidade da córnea após exposição ao produto químico em estudo, de modo a obter a pontuação de irritação in vitro (« In Vitro Irritancy Score» IVIS) correspondente, que é utilizada para classificar o nível de irritação causado pelo produto químico.

Estabelecem-se definições no apêndice 1.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS E LIMITAÇÕES

Este método de ensaio baseia-se no protocolo do método BCOP do ICCVAM (6) (7), inicialmente elaborado a partir de informações baseadas no protocolo do Institute for in vitro Sciences (IIVS) e no Protocolo 124 do INVITTOX (8). Este último foi o protocolo utilizado no estudo de prevalidação efetuado em 1997-98 com o patrocínio da Comunidade Europeia. Estes dois protocolos basearam-se no método de ensaio BCOP descrito pela primeira vez por Gautheron et al. (9).

O método BCOP pode ser utilizado para identificar produtos químicos indutores de lesões oculares graves, na aceção do sistema GHS da ONU, ou seja, produtos químicos classificáveis na categoria 1 desse sistema (4). Quando utilizado com essa finalidade, a exatidão global do método BCOP é de 79 % (150/191), a taxa de falsos positivos é de 25 % (32/126) e a taxa de falsos negativos é de 14 % (9/65), comparativamente aos dados obtidos pelo método de ensaio ocular in vivo no coelho, classificados de acordo com o sistema de classificação GHS da ONU (3) (ver o apêndice 2, quadro 1). Excluindo da base de dados determinados produtos químicos de certas classes químicas (álcoois, cetonas) ou físicas (sólidos), a exatidão global do método BCOP é de 85 % (111/131), a taxa de falsos positivos é de 20 % (16/81) e a taxa de falsos negativos é de 8 % (4/50), no sistema de classificação GHS da ONU (3). A base de dados de validação do método de ensaio BCOP revela que, quando este é utilizado para identificar produtos químicos indutores de lesões oculares graves (categoria 1 do sistema GHS da ONU), o método tem insuficiências potenciais ao nível de taxas de falsos positivos elevadas no caso dos álcoois e das cetonas e de taxas de falsos negativos elevadas no caso dos sólidos (1) (2) (3). Porém, uma vez que o método BCOP não sobreavalia todos os álcoois e cetonas e que a previsão de categoria 1 do sistema GHS da ONU é correta no caso de alguns deles, não se consideram estes dois grupos funcionais orgânicos excluídos do domínio de aplicabilidade do método. Compete ao utilizador do método BCOP decidir se, no caso dos álcoois e cetonas, é aceitável que nem todos os resultados que o indiciem sejam efetivamente positivos ou se são necessários ensaios complementares no âmbito de uma abordagem baseada na ponderação da suficiência da prova. No que respeita à taxa de falsos negativos no caso dos sólidos, importa salientar que os sólidos podem gerar condições de exposição variáveis e extremas no ensaio de irritação ocular in vivo pelo método de Draize, que podem falsear as previsões do real potencial de irritação (10). Importa igualmente salientar que, no contexto da identificação de produtos químicos indutores de lesões oculares graves (categoria 1 do sistema GHS da ONU), a nenhum dos falsos negativos identificados na base de dados de validação do ICCVAM (2) (3) esteve associada uma pontuação de irritação in vitro (IVIS) igual ou inferior a 3, critério utilizado para identificar os produtos químicos classificados de «nenhuma categoria» no sistema GHS da ONU. Acresce que a obtenção de falsos negativos no método BCOP neste contexto não constitui aspeto crítico, porque os produtos químicos cuja pontuação de irritação in vitro seja superior a 3 e inferior ou igual a 55 são em seguida ensaiados por outros métodos in vitro adequadamente validados ou, em derradeira opção, no coelho, conforme as exigências normativas, por recurso a uma estratégia de ensaio sequencial baseada na ponderação da suficiência da prova. Atendendo a que a previsão de categoria 1 do sistema GHS da ONU pelo método BCOP é correta no caso de alguns produtos químicos sólidos, também não se considera a fase sólida excluída do domínio de aplicabilidade do método. Os investigadores podem ponderar o recurso a este método de ensaio para todos os tipos de produtos químicos, aceitando uma pontuação de irritação in vitro superior a 55 como indicativa de uma reação indutora de lesões oculares graves, merecedora da classificação 1 do sistema GHS da ONU sem necessidade de ensaios complementares. Porém, como referido, os resultados positivos obtidos no caso de álcoois ou cetonas devem ser interpretados com cautela, devido ao risco de não serem efetivamente positivos em todos os casos que o indiciem.

Também pode recorrer-se ao método BCOP para identificar produtos químicos que não necessitem de ser classificados em termos de irritação ocular nem de lesões oculares graves no sistema de classificação GHS da ONU (4). Quando utilizado com essa finalidade, a exatidão global do método BCOP é de 69 % (135/196), a taxa de falsos positivos é de 69 % (61/89) e a taxa de falsos negativos é de 0 % (0/107), comparativamente aos dados obtidos pelo método de ensaio ocular in vivo no coelho, classificados de acordo com o sistema de classificação GHS da ONU (3) (ver o apêndice 2, quadro 2). A taxa de falsos positivos obtida (produtos químicos com a classificação in vivo «nenhuma categoria» no sistema GHS da ONU, mas com pontuação de irritação in vitro superior a 3 — ver o ponto 47) é bastante elevada, mas neste contexto não constitui aspeto crítico, porque os produtos químicos cuja pontuação de irritação in vitro seja superior a 3 e inferior ou igual a 55 são seguidamente ensaiados por outros métodos in vitro adequadamente validados ou, em derradeira opção, no coelho, conforme as exigências normativas, por recurso a uma estratégia de ensaio sequencial baseada na ponderação da suficiência da prova. O método BCOP não evidencia insuficiências específicas no ensaio de álcoois, cetonas e sólidos quando visa identificar produtos químicos que não necessitem de ser classificados em termos de irritação ocular nem de lesões oculares graves («nenhuma categoria» no sistema GHS da ONU) (3). Os investigadores podem ponderar o recurso a este método de ensaio para todos os tipos de produtos químicos, aceitando um resultado negativo (pontuação de irritação in vitro igual ou inferior a 3) como indicativo de que não é necessária nenhuma classificação («nenhuma categoria» no sistema GHS da ONU). Uma vez que o método BCOP só consegue identificar corretamente 31 % dos produtos químicos que não necessitam de ser classificados em termos de irritação ocular nem de lesões oculares graves, este método de ensaio não deve ser privilegiado para iniciar uma abordagem ascendente (5), caso estejam disponíveis outros métodos in vitro validados e aceites com sensibilidade igualmente elevada, mas maior especificidade.

A base de dados de validação do método BCOP contava com 113 substâncias e 100 misturas (2) (3). Considera-se, portanto, o método BCOP aplicável ao ensaio de substâncias e misturas.

Devido ao número considerável de produtos químicos da categoria 1 do sistema GHS da ONU subclassificados na categoria 2, 2A ou 2B do mesmo sistema e de produtos químicos de «nenhuma categoria» do sistema GHS sobreclassificados na categoria 2, 2A ou 2B desse sistema, não é recomendado o recurso ao método BCOP na identificação de produtos químicos que devam ser classificados de irritantes oculares (categoria 2 ou 2A do sistema GHS da ONU) nem de produtos químicos que devam ser classificados de irritantes oculares moderados (categoria 2B do sistema GHS da ONU) (2) (3). Nesses casos, podem ser necessários ensaios complementares por outro método, que seja adequado.

Na manipulação de olhos e córneas de bovino devem seguir-se as regras e procedimentos estabelecidos no laboratório para a manipulação de matérias de origem animal (tecidos, fluidos biológicos etc.). Recomenda-se a aplicação das precauções gerais inerentes à prática laboratorial (11).

Embora o método BCOP não tenha em conta as lesões na conjuntiva nem na íris, tem em conta os efeitos na córnea, fator principal do sistema de classificação GHS da ONU em função dos efeitos in vivo. A reversibilidade das lesões da córnea não pode ser avaliada per se pelo método BCOP, pelo que, com base em estudos oculares no coelho, foi proposta a possibilidade de se recorrer à avaliação da profundidade inicial da lesão da córnea para identificar alguns tipos de efeitos irreversíveis (12). São, porém, necessários mais estudos científicos para se compreender a ocorrência de efeitos irreversíveis não associados a lesões iniciais importantes. Finalmente, o método BCOP não permite avaliar o potencial de toxicidade sistémica associado à exposição ocular.

Este método de ensaio será atualizado periodicamente em função de novos dados e informações. Por exemplo, a histopatologia é potencialmente útil quando se necessita de uma caracterização mais completa das lesões da córnea. Conforme é referido no documento de orientações n.o 160 da OCDE (13), incentivam-se os utilizadores a preservarem as córneas e a prepararem espécimes histopatológicos que possam ser utilizados na constituição de uma base de dados e na definição de critérios de decisão utilizáveis na melhoria da exatidão deste método de ensaio.

Os laboratórios que comecem a utilizar este método de ensaio devem recorrer aos produtos químicos para demonstração de competência técnica recomendados no apêndice 3. Antes de apresentarem dados obtidos pelo método BCOP para efeitos da classificação normativa de perigosidade, os laboratórios podem recorrer aos referidos produtos químicos para demonstrar a sua competência técnica na execução deste método.

PRINCÍPIO DO ENSAIO

O método BCOP assenta num modelo organotípico de manutenção in vitro das funções fisiológicas e bioquímicas normais da córnea de bovino por um período curto. Neste método de ensaio, as lesões provocadas pelo produto químico em estudo são avaliadas por meio de medições quantitativas, respetivamente com um opacímetro e um espetrofotómetro de luz visível, das alterações de opacidade e permeabilidade da córnea. Ambas as medições são utilizadas para calcular uma IVIS, com base na qual se atribui uma categoria de classificação de perigo de irritação in vitro, utilizada como previsão do potencial de irritação ocular in vivo do produto químico em estudo (ver os critérios de decisão no ponto 48).

O método BCOP utiliza córneas isoladas retiradas de olhos de bovinos acabados de abater. Determina-se quantitativamente a opacidade da córnea medindo a quantidade de luz transmitida através desta. Determina-se quantitativamente a permeabilidade da córnea medindo a quantidade do corante fluoresceína de sódio que atravessa totalmente a córnea e é detetada no meio de ensaio da câmara posterior. Aplicam-se os produtos químicos em estudo na superfície epitelial da córnea introduzindo-os na câmara anterior do suporte de córnea. Figuram no apêndice 4 uma descrição e um diagrama de um suporte de córnea utilizado no método BCOP. Os suportes de córnea podem ser adquiridos no comércio, de origens diversas, ou podem ser construídos.

Origem e idade dos olhos de bovino e seleção da espécie animal

O gado enviado para os matadouros é normalmente abatido para consumo humano ou outras utilizações comerciais. Só podem ser utilizados na colheita de córneas para o método BCOP animais saudáveis considerados adequados para entrarem na cadeia alimentar humana. Dado que o peso dos bovinos é muito variável, consoante a raça, a idade e o sexo, não se recomenda qualquer peso em concreto do animal no momento do abate.

As córneas podem apresentar variações dimensionais, devido à utilização de olhos de animais de idades diversas. As córneas de bovinos com mais de oito anos têm geralmente um eixo horizontal superior a 30,5 mm e espessura central (CCT) ≥ 1 100 μm; as de bovinos com menos de cinco anos têm geralmente um eixo horizontal inferior a 28,5 mm e CCT < 900 μm (14). Por essa razão, não se utilizam habitualmente olhos de bovinos com mais de 60 meses. Normalmente, também não se utilizam olhos de bovinos com menos de doze meses, dado que os olhos se encontram ainda em desenvolvimento e a espessura e o diâmetro da córnea são bastante inferiores aos registados para olhos de gado adulto. Porém, admite-se a utilização de córneas de animais jovens (6 a 12 meses de idade), por haver algumas vantagens, como maior facilidade de obtenção, um intervalo etário estreito e menor risco de exposição dos trabalhadores à encefalopatia espongiforme bovina (BSE) (15). Dado que seria útil avaliar melhor o efeito da dimensão ou espessura da córnea na reação a produtos químicos corrosivas ou irritantes, incentivam-se os utilizadores a indicarem a idade e/ou o peso estimados dos animais de origem das córneas utilizadas no estudo.

Colheita e transporte dos olhos para o laboratório

A colheita dos olhos é efetuada por empregados do matadouro. Para minimizar lesões mecânicas ou outros danos aos olhos, estes devem ser retirados das órbitas o mais rapidamente possível depois da morte e ser refrigerados imediatamente após a enucleação e durante o transporte. Para evitar que os olhos sejam expostos a produtos químicos potencialmente irritantes, os empregados do matadouro não devem utilizar detergentes na lavagem da cabeça do animal.

Utilizando um recipiente de tamanho adequado, mergulham-se os olhos completamente em solução HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution) refrigerada e transportam-se para o laboratório de uma maneira que minimize a deterioração e contaminações bacteriológicas. Como são colhidos durante o processo de abate, os olhos podem ser expostos a sangue e outras matérias biológicas, incluindo bactérias e outros microrganismos. Importa, pois, minimizar o risco de contaminação (por exemplo mantendo o recipiente dos olhos em gelo fundente durante a colheita e o transporte e adicionando antibióticos — tais como penicilina a 100 UI/ml e estreptomicina a 100 μg/ml — ao HBSS no qual se mergulham os olhos durante o transporte).

O intervalo entre a colheita dos olhos e a utilização das córneas no método BCOP deve ser mínimo (normalmente, os olhos devem ser colhidos e utilizados no mesmo dia) e não deve, comprovadamente, comprometer os resultados do ensaio. Os resultados dos ensaios estão relacionados com os critérios de seleção dos olhos e com as reações às amostras de controlo positivas e negativas. Os olhos utilizados num ensaio devem ser todos do mesmo grupo de colheita num determinado dia.

Critérios de seleção dos olhos utilizados no método BCOP

Uma vez chegados ao laboratório, examinam-se cuidadosamente os olhos para detetar eventuais defeitos, nomeadamente aumento de opacidade, escoriações e neovascularização. Só podem ser utilizadas córneas de olhos sem estes defeitos.

Também se avalia a qualidade da córnea em fases posteriores do ensaio. Descartam-se as córneas que, após um período inicial de uma hora para estabelecimento do equilíbrio, apresentem opacidade superior a sete unidades, ou opacidade equivalente para o opacímetro e os suportes de córnea utilizados (NOTA: calibrar o opacímetro com os padrões de opacidade utilizados para estabelecer as unidades de opacidade — ver o apêndice 4).

Cada grupo de tratamento (produto químico em estudo e amostras de controlo positivas e negativas ensaiadas em paralelo) é constituído por um mínimo de três olhos. Utilizam-se três córneas para amostras de controlo negativas de córnea no método de ensaio BCOP. Como as córneas são excisadas do globo ocular e colocadas nas câmaras, há potencial para a ocorrência de artefactos resultantes da manipulação, com incidência nos valores individuais de opacidade e permeabilidade da córnea (incluindo as amostras de controlo negativas). Os valores de opacidade e permeabilidade das córneas das amostras de controlo negativas são utilizados para corrigir os valores de opacidade e permeabilidade da córnea correspondentes ao produto químico em estudo e às amostras tratadas para controlo positivo utilizados no cálculo da IVIS.

PROTOCOLO DE ENSAIO

Preparação dos olhos

Dissecam-se córneas sem defeitos, deixando uma orla de 2-3 mm de esclerótica, para facilitar o manuseamento, e tomando as precauções necessárias para não danificar o epitélio e o endotélio da córnea. Coloca-se cada córnea num suporte especialmente concebido, constituído por um compartimento anterior e um compartimento posterior. O primeiro estabelece uma interface com a superfície epitelial da córnea; o segundo, com a superfície endotelial da mesma. Enchem-se as duas câmaras, até transbordar, com Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) isento de vermelho de fenol, previamente aquecido, começando pela câmara posterior e evitando a formação de bolhas. Coloca-se em seguida a dispositivo à temperatura de 32 ± 1 °C durante, pelo menos, uma hora, para que as córneas fiquem em equilíbrio com o meio e, tanto quanto possível, readquiram a sua atividade metabólica normal (a temperatura aproximada da superfície da córnea in vivo é de 32 °C).

Terminado o período previsto para se atingir o equilíbrio, adiciona-se EMEM isento de vermelho de fenol fresco pré-aquecido a ambas as câmaras e efetua-se a leitura da linha de base de opacidade para cada córnea. Descartam-se as córneas que evidenciem lesões macroscópicas nos tecidos (por exemplo escoriações, pigmentação ou neovascularização), opacidade superior a 7 unidades ou opacidade equivalente para o opacímetro e os suportes de córnea utilizados. Selecionam-se, para córneas de controlo negativas (ou de controlo do solvente), pelo menos três córneas. Distribuem-se a seguir as córneas restantes em dois grupos: córneas a submeter ao tratamento e córneas de controlo positivo.

Dado que a sua capacidade calorífica é superior à do ar, a água oferece condições de temperatura mais estáveis para incubação. Recomenda-se, portanto, a utilização de um banho-maria para manter o suporte de córnea e o seu conteúdo a 32 ± 1 °C. Admite-se, porém, a utilização de incubadores a ar, tomando as precauções necessárias para manter a temperatura estável (por exemplo aquecendo previamente os suportes e o meio de ensaio).

Aplicação do produto químico em estudo

Utiliza-se um protocolo de tratamento para líquidos e agentes tensioativos (sólidos ou líquidos) e outro para sólidos não-tensioativos.

Os líquidos são ensaiados sem diluição. Os semissólidos, cremes e ceras são normalmente ensaiados como se fossem líquidos. As substâncias tensioativas são ensaiadas à concentração de 10 % (m/v) numa solução a 0,9 % de cloreto de sódio, em água destilada ou noutro solvente comprovadamente sem efeitos adversos no sistema de ensaio. É necessário justificar convenientemente o recurso a outra diluição. As misturas que contenham agentes tensioativos podem ser ensaiadas sem diluição ou diluídas a uma concentração que se adeque ao cenário de exposição in vivo em causa. É necessário justificar convenientemente as concentrações ensaiadas. Expõem-se as córneas aos líquidos e aos agentes tensioativos durante 10 minutos. Se forem utilizados tempos de exposição diferentes, será necessário justificá-lo em termos científicos. Ver no apêndice 1 as definições de agente tensioativo e de mistura com agentes tensioativos.

Os sólidos não-tensioativos são normalmente ensaiados em solução ou suspensão, à concentração de 20 % (m/v), numa solução a 0,9 % de cloreto de sódio, em água destilada ou noutro solvente comprovadamente sem efeitos adversos no sistema de ensaio. Em determinadas circunstâncias e mediante justificação científica adequada, também pode ensaiar-se um sólido tal e qual, mediante aplicação direta na superfície da córnea pelo método da câmara aberta (ponto 32). Expõem-se as córneas aos sólidos durante quatro horas, mas, tal como no caso dos líquidos e dos produtos tensioativos, podem utilizar-se tempos de exposição diferentes, a justificar em termos científicos.

Podem ser utilizados diversos métodos de tratamento, consoante a natureza física e as características químicas do produto químico em estudo (sólidos, líquidos, líquidos viscosos ou não-viscosos etc.). O aspeto crítico é garantir que o produto químico cobre adequadamente a superfície epitelial e é adequadamente removido na fase de lavagem. Utiliza-se normalmente um método de câmara fechada para o ensaio de líquidos não-viscosos ou ligeiramente viscosos e um método de câmara aberta para o ensaio de líquidos semiviscosos ou viscosos, bem como para sólidos aplicados diretamente.

No método da câmara fechada, introduz-se na câmara anterior, através dos orifícios de dosagem existentes na parte de cima desta, uma quantidade do produto químico em estudo suficiente para cobrir a superfície epitelial da córnea (750 μl), fechando em seguida os orifícios com as respetivas tampas durante a exposição. É importante que cada córnea seja exposta ao produto químico em estudo durante o período adequado.

No método da câmara aberta, removem-se, antes do tratamento, a janela de vidro e o anel de fixação da janela da câmara anterior. Com uma micropipeta, aplica-se o produto químico em estudo ou de controlo diretamente na superfície epitelial da córnea (750 μl ou um volume do produto químico em estudo suficiente para cobrir completamente a córnea). Se for difícil pipetá-lo, o produto químico em estudo pode ser introduzido sob pressão numa pipeta volumétrica, para facilitar a dosagem. Para que a matéria em causa possa ser introduzida sob pressão na ponta da pipeta volumétrica, insere-se esta ponta na extremidade da seringa. Pressiona-se o êmbolo da seringa e, simultaneamente, puxa-se o pistão da pipeta para cima. Caso se formem bolhas de ar na ponta da pipeta, remove-se (expulsa-se) o produto químico em estudo e repete-se o processo, até a ponta da pipeta ficar cheia, sem bolhas de ar. Se necessário, pode utilizar-se uma seringa normal (sem agulha), pois permite medir um volume exato do produto químico em estudo e facilita a aplicação na superfície epitelial da córnea. Depois da dosagem, recoloca-se a janela de vidro na câmara anterior, para recriar um sistema fechado.

Incubação após a exposição

Após o período de exposição, removem-se da câmara anterior o produto químico em estudo, a amostra de controlo negativa ou o produto químico de controlo positivo e lava-se o epitélio pelo menos três vezes (ou até deixar de se ver produto químico em estudo) utilizando EMEM com vermelho de fenol. Utiliza-se na lavagem meio de ensaio com vermelho de fenol, porque pode seguir-se a evolução cromática do vermelho de fenol para determinar a eficácia de lavagem de produtos químicos ácidos ou alcalinos. Lavam-se as córneas mais de três vezes se a cor do vermelho de fenol continuar alterada (amarelo ou púrpura) ou o produto químico em estudo ainda for visível. Quando o meio já não contiver o produto químico em estudo, lavam-se as córneas uma última vez utilizando EMEM sem vermelho de fenol, para garantir a remoção deste último da câmara anterior antes da medição de opacidade. Volta então a encher-se a câmara anterior com EMEM fresco sem vermelho de fenol.

No caso dos líquidos ou dos agentes tensioativos, após a lavagem, incubam-se as córneas durante mais duas horas a 32 ± 1 °C. Em determinadas circunstâncias, pode ser útil um tempo de incubação mais longo depois da exposição, a ponderar caso a caso. As córneas tratadas com sólidos são bem lavadas no final do período de exposição de quatro horas, mas não é necessária incubação suplementar.

Regista-se a opacidade e a permeabilidade de cada córnea logo que terminar o período de incubação após a exposição, no caso dos líquidos e dos agentes tensioativos, ou o período de exposição de quatro horas, no caso dos sólidos não-tensioativos. Examina-se ainda visualmente cada córnea e registam-se as observações pertinentes (descamação de tecidos, resíduos do produto químico em estudo, perfil de opacidade não-uniforme etc.). Estas observações podem ser importantes, pois são passíveis de se traduzirem em variações nas leituras do opacímetro.

Produtos químicos de controlo

Em cada ensaio ensaiam-se em paralelo amostras de controlo positivas e negativas (ou do solvente/excipiente).

Ao ensaiar pelo método BCOP substâncias líquidas a 100 %, ensaia-se em paralelo uma amostra de controlo negativa (por exemplo solução a 0,9 % de cloreto de sódio ou água destilada), para possibilitar a deteção de alterações inespecíficas do sistema de ensaio e estabelecer uma linha de base para os parâmetros a determinar no ensaio. Essa amostra de controlo visa igualmente evitar que as condições do ensaio provoquem, inadequadamente, uma reação de irritação.

Ao ensaiar líquidos diluídos, agentes tensioativos ou sólidos, inclui-se no método BCOP um grupo paralelo de amostras de controlo do excipiente/solvente, para possibilitar a deteção de alterações inespecíficas do sistema de ensaio e estabelecer uma linha de base para os parâmetros a determinar no ensaio. Só podem utilizar-se solventes/excipientes que, comprovadamente, não tenham efeitos adversos no sistema de ensaio.

Para verificar a integridade e o bom funcionamento do sistema de ensaio, inclui-se em cada ensaio um produto químico que reconhecidamente induza reação positiva, para servir de amostra de controlo positiva paralela. Porém, para que possa determinar-se a variabilidade no tempo da reação à referida amostra de controlo positiva, a reação de irritação não deve ser excessivamente forte.

Como amostras de controlo positivas para produtos químicos em estudo líquidos, podem ser utilizados, por exemplo, etanol a 100 % e dimetilformamida a 100 %. Como amostra de controlo positiva para produtos químicos em estudo sólidos, pode utilizar-se, por exemplo, uma solução a 0,9 % de cloreto de sódio com 20 % (m/v) de imidazole.

Os produtos químicos de referência são úteis para avaliar o potencial de irritação ocular de produtos químicos desconhecidos de uma determinada classe química ou classe de produtos, ou para avaliar o potencial de irritação relativo de um irritante ocular numa determinada gama de reações de irritação.

Parâmetros medidos

Determina-se a opacidade com base na quantidade de luz transmitida através da córnea. Determina-se quantitativamente a opacidade da córnea medindo-a com um opacímetro numa escala contínua de valores de opacidade.

Determina-se a permeabilidade com base na quantidade do corante fluoresceína de sódio que penetra em todas as camadas celulares da córnea (ou seja, desde o epitélio da superfície exterior da córnea até ao endotélio da sua superfície interior). Coloca-se 1 ml de solução de fluoresceína de sódio (4 ou 5 mg/ml, consoante se ensaiem líquidos ou agentes tensioativos, por um lado, ou sólidos não-tensioativos, por outro) na câmara anterior do suporte de córnea, que estabelece interface com a superfície epitelial da córnea. Enche-se com EMEM fresco a câmara posterior, que estabelece interface com a superfície endotelial da córnea. Incuba-se a seguir o suporte, em posição horizontal, durante 90 ± 5 minutos, a 32 ± 1 °C. Determina-se quantitativamente, por espetrofotometria UV/VIS, a quantidade de fluoresceína de sódio que atravessa a córnea para a câmara posterior. Os valores das medições espetrofotométricas a 490 nm são registados numa escala contínua de absorvência ou densidade ótica (DO490). Determinam-se os valores de permeabilidade à fluoresceína utilizando os valores de DO490 obtidos com um espectrofotómetro de luz visível num percurso ótico normalizado de 1 cm.

Em alternativa, pode utilizar-se um dispositivo de leitura constituído por uma placa de microtitulação de 96 alvéolos, desde que: i) seja possível estabelecer uma gama de linearidade do leitor de placa para a determinação de valores de DO490 da fluoresceína; ii) se utilize na placa de 96 alvéolos o volume de amostras de fluoresceína que permite obter corretamente valores de DO490 equivalentes aos obtidos com o percurso ótico normalizado de 1 cm (normalmente 360 μl, podendo ser necessário encher completamente os alvéolos).

DADOS E RELATÓRIOS

Avaliação dos dados

Depois de se corrigirem os valores de opacidade e de permeabilidade média (DO490) em função dos valores da opacidade de fundo e da permeabilidade (DO490) correspondente à amostra de controlo negativa, combinam-se numa fórmula empírica os valores médios de opacidade e de permeabilidade (DO490) correspondentes a cada grupo de tratamento, a fim de calcular a respetiva pontuação de irritação in vitro (IVIS), do seguinte modo:

IVIS = valor médio de opacidade + 15 × valor médio de permeabilidade (DO490)

Sina et al. (16) referiram que esta fórmula foi estabelecida com base em estudos no seu laboratório e interlaboratoriais. A fim de determinar a equação que melhor correlacionava os dados in vivo e in vitro, fez-se uma análise multivariada dos dados obtidos num estudo multilaboratorial de uma série de 36 compostos. Essa análise foi efetuada por cientistas de duas empresas distintas, que chegaram a duas equações praticamente idênticas.

Os valores de opacidade e de permeabilidade devem ser também avaliados independentemente uns dos outros, para determinar se o produto químico em estudo induz corrosividade ou irritação severa com base em apenas um dos dois parâmetros medidos (ver «Critérios de decisão»).

Critérios de decisão

Seguem-se os valores-limite de pontuação de irritação in vitro (IVIS) para a identificação de produtos químicos indutores de lesões oculares graves (categoria 1 do sistema GHS da ONU) e de produtos químicos que não necessitem de ser classificados em termos de irritação ocular nem de lesões oculares graves («nenhuma categoria» do sistema GHS da ONU):

Critérios de aceitação do estudo

Considera-se o ensaio aceitável se a IVIS correspondente à amostra de controlo positiva não se desviar da média histórica vigente mais que o dobro do desvio-padrão. Essa média deve ser atualizada pelo menos de três em três meses ou sempre que se efetue um ensaio aceitável num laboratório que proceda a estes ensaios com pouca frequência (menos de uma vez por mês). Os valores de opacidade e permeabilidade correspondentes às amostras de controlo negativas e do solvente/excipiente devem ser inferiores aos limites superiores estabelecidos para os valores de opacidade e permeabilidade de fundo de córneas de bovino tratadas com os respetivos amostra de controlo negativa e solvente/excipiente. Quando a classificação do produto químico em estudo é inequívoca, basta normalmente uma série de ensaios constituída por, pelo menos, três córneas. Porém, nos casos de resultados inconclusivos na primeira série de ensaios, é de ponderar (mas não necessariamente exigível) a realização de uma segunda série de ensaios, e até de uma terceira se os resultados médios da IVIS das duas primeiras séries forem discordantes. Neste contexto, considera-se inconclusivo o resultado da primeira série de ensaios se as previsões referentes às três córneas não forem concordantes, do seguinte modo:

Relatório do ensaio

O relatório do ensaio deve incluir os seguintes elementos que tenham pertinência na realização do estudo em causa:

REFERÊNCIAS