EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 32017R0735

Komission asetus (EU) 2017/735, annettu 14 päivänä helmikuuta 2017, testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla annetun asetuksen (EY) N:o 440/2008 liitteen muuttamisesta sen mukauttamiseksi tekniikan kehitykseen (ETA:n kannalta merkityksellinen teksti. )

C/2017/0773

OJ L 112, 28.4.2017, p. 1–402 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2017/735/oj

28.4.2017   

FI

Euroopan unionin virallinen lehti

L 112/1


KOMISSION ASETUS (EU) 2017/735,

annettu 14 päivänä helmikuuta 2017,

testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 nojalla annetun asetuksen (EY) N:o 440/2008 liitteen muuttamisesta sen mukauttamiseksi tekniikan kehitykseen

(ETA:n kannalta merkityksellinen teksti)

EUROOPAN KOMISSIO, joka

ottaa huomioon Euroopan unionin toiminnasta tehdyn sopimuksen,

ottaa huomioon kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemikaaliviraston perustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/21/EY kumoamisesta 18 päivänä joulukuuta 2006 annetun Euroopan parlamentin ja neuvoston asetuksen (EY) N:o 1907/2006 (1) ja erityisesti sen 13 artiklan 2 kohdan,

sekä katsoo seuraavaa:

(1)

Komission asetuksessa (EY) N:o 440/2008 (2) vahvistetaan asetuksen (EY) N:o 1907/2006 soveltamiseksi käytettävät testimenetelmät, joilla määritellään kemikaalien fysikaalis-kemialliset ominaisuudet, myrkyllisyys ja myrkyllisyys ympäristölle.

(2)

On tarpeen ajantasaistaa asetus (EY) N:o 440/2008, jotta siihen voidaan sisällyttää uusia ja ajantasaistettuja testimenetelmiä, jotka Taloudellisen yhteistyön ja kehityksen järjestö (OECD) on vastikään hyväksynyt, tekniikan kehityksen huomioon ottamiseksi ja sen varmistamiseksi, että koetarkoituksiin käytettävien eläinten määrää vähennetään Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivin 2010/63/EU (3) mukaisesti. Sidosryhmiä on kuultu tästä säädösluonnoksesta.

(3)

Tämä mukauttaminen tekniikan kehitykseen sisältää 20 testimenetelmää: yksi menetelmä, joka koskee fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien määrittämistä, viisi uutta ja yksi ajantasaistettu testimenetelmä, jotka koskevat ekotoksisuuden arviointia, kaksi ajantasaistettua testimenetelmää, jotka koskevat ympäristössä kulkeutumisen ja käyttäytymisen arviointia, sekä neljä uutta ja seitsemän ajantasaistettua testimenetelmää, jotka koskevat ihmisten terveydelle aiheutuvien vaikutusten määrittämistä.

(4)

OECD tarkistaa testiohjeitaan säännöllisesti yksilöidäkseen ne testiohjeet, jotka eivät enää ole tieteellisesti päteviä. Tässä mukautuksessa tekniikan kehitykseen poistetaan kuusi testimenetelmää, joita vastaavat OECD:n testiohjeet on peruutettu.

(5)

Sen vuoksi asetusta (EY) N:o 440/2008 olisi muutettava.

(6)

Tässä asetuksessa säädetyt toimenpiteet ovat asetuksen (EY) N:o 1907/2006 133 artiklalla perustetun komitean lausunnon mukaiset,

ON HYVÄKSYNYT TÄMÄN ASETUKSEN:

1 artikla

Muutetaan asetuksen (EY) N:o 440/2008 liite tämän asetuksen liitteen mukaisesti.

2 artikla

Tämä direktiivi tulee voimaan kahdentenakymmenentenä päivänä sen jälkeen, kun se on julkaistu Euroopan unionin virallisessa lehdessä.

Tämä asetus on kaikilta osiltaan velvoittava, ja sitä sovelletaan sellaisenaan kaikissa jäsenvaltioissa.

Tehty Brysselissä 14 päivänä helmikuuta 2017.

Komission puolesta

Puheenjohtaja

Jean-Claude JUNCKER


(1)  EUVL L 396, 30.12.2006, s. 1.

(2)  Komission asetus (EY) N:o 440/2008, annettu 30 päivänä toukokuuta 2008, testimenetelmien vahvistamisesta kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista annetun asetuksen (EY) N:o 1907/2006 (REACH) nojalla (EUVL L 142, 31.5.2008, s. 1).

(3)  Euroopan parlamentin ja neuvoston direktiivi 2010/63/EU, annettu 22 päivänä syyskuuta 2010, tieteellisiin tarkoituksiin käytettävien eläinten suojelusta (EUVL L 276, 20.10.2010, s. 33).


LIITE

Muutetaan asetuksen (EY) N:o 440/2008 liite seuraavasti:

1)

Lisätään A osaan luku seuraavasti:

”A.25   DISSOSIAATIOVAKIOT VEDESSÄ (TITRAUSMENETELMÄ – SPEKTROFOTOMETRINEN MENETELMÄ – KONDUKTOMETRINEN MENETELMÄ)

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 112 (1981)

Edellytykset

Sopiva analyysimenetelmä

Vesiliukoisuus

Ohjeet

Rakennekaava

Sähkönjohtavuus konduktometrisessä menetelmässä

Testimenetelmää koskevat lausumat

Kaikki testimenetelmät voidaan suorittaa puhtaille tai kauppalaatuisille aineille. Epäpuhtauksien mahdolliset vaikutukset tuloksiin on otettava rahuomioon.

Titrausmenetelmä ei sovellu huonosti liukeneville aineille (ks. testiliuokset jäljempänä).

Spektrofotometrinen menetelmä soveltuu ainoastaan aineille, joilla on selvästi erilaiset UV-valon ja näkyvän valon absorptiospektrit dissosioituneessa ja dissosioimattomassa muodossa Tämä menetelmä voi soveltua myös huonosti liukeneville aineille ja ei-happamille/emäksisille dissosiaatioille, esim. kompleksointi.

Tapauksissa, joissa Onsagerin yhtälö pätee, konduktometristä menettelyä voidaan soveltaa jopa kohtalaisen pienten pitoisuuksien osalta ja jopa tapauksissa, joissa vallitsee ei-hapan/emästasapaino.

Vakioasiakirjat

Tämä testimenetelmä perustuu menetelmiin, jotka annetaan osassa ”Lähdekirjallisuus” mainituissa lähteissä ja asiakirjassa Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA, 18. elokuuta 1978.

MENETELMÄ – JOHDANTO, TARKOITUS, SOVELTAMISALA, SOVELTAMINEN JA TESTIN KÄYTTÖ JA RAJAT

Aineen dissosiaatiolla vedessä on sen ympäristövaikutuksen arvioinnin kannalta merkitystä. Se ohjaa aineen muotoa, joka puolestaan määrittää sen toiminnan ja kulkeutumisen. Se voi vaikuttaa kemikaalin adsorptioon maaperään ja sedimentteihin sekä absorptioon biologisiin soluihin.

Määritelmät ja yksiköt

Dissosiaatio on reversiibeli jakautuminen kahteen tai useampaan kemialliseen aineeseen, jotka voivat olla ionisia. Tämä prosessi esitetään yleisesti seuraavasti

RXR ++ X

ja reaktiota koskeva tasapainopitoisuuden vakio on

Formula

Esimerkiksi erityistapauksessa, jossa R on vety (aine on happo), vakio on

Formula

tai

Formula

Vertailuaineet

Seuraavia vertailuaineita ei tarvitse käyttää kaikissa tapauksissa uutta ainetta tutkittaessa. Ne mainitaan ensisijaisesti siksi, jotta menetelmän kalibrointi voidaan suorittaa ajoittain ja jotta tarjotaan mahdollisuus vertailla tuloksia toista menetelmää sovellettaessa.

 

pK (1)

Lämpötila °C

p-nitrofenoli

7,15

25 (1)

Bentsoehappo

4,12

20

p-kloorianiliini

3,93

20

On hyödyllistä käyttää ainetta, jolla on useita pK-arvoja, kuten esitetään jäljempänä kappaleessa ’Testimenetelmän periaate’. Tällainen aine voi olla

Sitruunahappo

pKa (8)

Lämpötila °C

 

1) 3,14

20

 

2) 4,77

20

 

3) 6,39

20

Testimenetelmän periaate

Kuvattu kemiallinen prosessi on ainoastaan jonkin verran lämpötilariippuvainen ympäristön kannalta merkityksellisellä lämpötila-alueella. Dissosiaatiovakion määrittäminen edellyttää kemiallisen aineen liukenevien ja liukenemattomien muotojen pitoisuuksien mittaamista. Edellä kappaleessa ’Määritelmät ja yksiköt’ ilmoitetun dissosiaatioreaktion stoikiometrian tietämyksen perusteella voidaan määrittää asiaankuuluva vakio. Tässä testimenetelmässä kuvatussa erityistapauksessa aine käyttäytyy hapon tai emäksen tavoin, ja määritys tehdään helpoiten määrittämällä aineen ionisoitujen ja ei-ionisoitujen muotojen suhteelliset pitoisuudet ja liuoksen pH-arvo. Näiden termien välinen suhde annetaan edellä kappaleessa ’Määritelmät ja yksiköt’ esitetyssä pKa -yhtälössä. Joillain aineilla on enemmän kuin yksi dissosiaatiovakio, ja vastaavia yhtälöitä voidaan laatia. Jotkut tässä kuvatuista menetelmistä ovat myös sopivia ei-happamille/emäksisille dissosiaatioille.

Laatuperusteet

Toistettavuus

Dissosiaatiovakio on toistettava (vähintään kolme määritystä) ± 0,1 log-yksikön puitteisiin.

TESTIMENETELMIEN KUVAUS

Arvon pKa määrittämiseen voidaan käyttää kahta lähestymistapaa. Ensimmäisessä tunnettua määrää ainetta titrataan tarvittaessa hapolla tai emäksellä; toisessa määritetään ionisoitujen ja ionisoitumattomien muotojen suhteellinen pitoisuus ja sen pH-riippuvuus.

Valmisteet

Näihin periaatteisiin perustuvat menetelmät voidaan luokitella titraus-, spektrofotometrisiksi ja konduktometrisiksi menetelmiksi.

Testiliuokset

Kemiallista ainetta tulee liuottaa tislattuun veteen titrausmenetelmässä ja konduktometrisessä menetelmässä. Spektrofotometrisessä ja muissa menetelmissä käytetään puskuriliuoksia. Testiaineen pitoisuus ei saisi olla yli 0,01 M tai yli puolet kyllästymispitoisuudesta, ja liuoksen valmistamisessa on käytettävä aineen puhtainta saatavilla olevaa muotoa. Jos aine on ainoastaan huonosti liukenevaa, sitä voidaan liuottaa pieneen määrään veteen sekoittuvaa liuotinta ennen kuin edellä mainittuja pitoisuuksia lisätään.

Tyndallin sirontaa käytetään tarkistamaan emulsioiden esiintyminen liuoksissa, erityisesti jos liukoisuuden parantamiseksi on käytetty tukiliuotinta. Jos käytetään puskuriliuoksia, puskurin pitoisuus ei saisi ylittää arvoa 0,05 M.

Testiolosuhteet

Lämpötila

Lämpötila on säädettävä ainakin ± 1 °C:n tarkkuudella. Määritys tulisi mieluiten suorittaa lämpötilassa 20 °C.

Jos epäillään merkittävää lämpötilariippuvuutta, määritys on tehtävä ainakin kahdessa muussa lämpötilassa. Lämpötilavälien on oltava tässä tapauksessa 10 °C ja lämpötilan säädön ± 0,1 °C.

Analyysit

Menetelmä määräytyy testattavan aineen luonteen mukaan. Sen on oltava tarpeeksi herkkä, jotta eri lajit voidaan määrittää kussakin testiliuoksen pitoisuudessa.

Testin suorittaminen

Titrausmenetelmä

Testiliuos määritetään titraamalla emäs- tai happoliuoksella ja pH-arvo mitataan jokaisen titrantin lisäyksen jälkeen. Ennen ekvivalenttipistettä on tehtävä ainakin 10 täydentävää lisäystä. Jos ekvivalenssi saavutetaan tarpeeksi nopeasti, voidaan käyttää piirturilla varustettua potentiometriä. Tässä menettelyssä aineen kokonaismäärä ja sen pitoisuus on oltava tarkasti tiedossa. On ryhdyttävä varotoimiin hiilidioksidin poissulkemiseksi. Yksityiskohtia menettelystä, varotoimista ja laskennasta annetaan vakiotesteissä, esim. viitteet (1), (2), (3) ja (4).

Spektrofotometrinen menetelmä

Löydetään aallonpituus, jossa aineen ionisoiduilla ja ionisoitumattomilla muodoilla on huomattavasti erilaiset ekstinktiokertoimet. UV-valon ja näkyvän valon absorptiospektri saadaan liuoksista, joissa on vakiopitoisuus, pH-olosuhteissa, joissa aine on olennaisesti ionisoitumaton ja täysin ionisoitu ja useissa pH-arvojen väliarvoissa. Tämä voidaan tehdä joko lisäämällä väkevää happoa (emästä) suhteellisen suureen määrään testiaineliuosta monikomponenttisessa puskuriliuoksessa aluksi korkealla (matalalla) pH-arvolla (viite 5), tai lisäämällä yhtä suuret tilavuudet aineen kantaliuosta esim. veteen, metanoliin, erilaisten puskuriliuosten, jotka kattavat halutun pH-välin, vakiotilavuuteen. Valitun aallonpituuden pH- ja absorbanssiarvoista lasketaan riittävä määrä arvoja pKa:lle käyttäen tietoja ainakin viidestä pH-arvosta, joissa aine on vähintään 10- ja korkeintaan 90-prosenttisesti ionisoitu. Lisätietoja kokeellisista yksityiskohdista ja laskentamenetelmästä annetaan viitteessä 1.

Konduktometrinen menetelmä

Käyttämällä pienen tunnetun kennovakion mittakennoa mitataan aineen noin 0,1 M liuoksen johtokykyä vedessä. Myös tämän liuoksen useiden tarkasti valmistettujen laimennuksien johtavuutta mitataan. Konsentraatiota puolitetaan kullakin kerralla ja sarjan tulisi kattaa ainakin konsentraatioiden suuruusjärjestys. Rajoittava johtuvuus äärettömässä laimennuksessa löydetään suorittamalla samanlainen koe Na-suolan kanssa ja ekstrapoloimalla. Dissosiaatioaste voidaan sen jälkeen laskea kunkin liuoksen johtavuudesta käyttämällä Onsagerin yhtälöä, ja näin ollen, Ostwaldin laimennuslakia soveltaen, dissosiaatiovakio voidaan laskea K = α2C/(1 – α), jossa C on konsentraatio mooleina litraa kohti ja α dissosioitunut osa. On ryhdyttävä varotoimiin hiilidioksidin poissulkemiseksi. Lisätietoja kokeellisista yksityiskohdista ja laskentamenetelmästä annetaan vakioasiakirjoissa ja viitteessä (1), (6) ja (7).

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten käsittely

Titrausmenetelmä

Kymmenelle mitatulle pisteelle titrauskäyrällä lasketaan pKa-arvo. Tällaisten pKa-arvojen keskiarvo ja keskihajonta lasketaan. Luonnos pH-arvoista vakioemäksen tai -hapon tilavuuden osalta samoin kuin taulukkomuotoinen esitys pitäisi sisällyttää tähän.

Spektrofotometriset menetelmät

Absorbanssi ja pH esitetään taulukkoina jokaisesta spektristä. Ainakin viisi pKa -arvoa lasketaan spektrin datapisteistä, ja lisäksi lasketaan näiden tulosten keskiarvo ja standardipoikkeama.

Konduktometrinen menetelmä

Ekvivalenttijohtokyky Λ lasketaan kullekin hapon konsentraatiolle ja kullekin sellaisen seoksen konsentraatiolle, jossa on vastaava määrä happoa, plus 0,98 vastaava määrä karbonaatitonta natriumhydroksidia. Hapon määrä on korkeampi, jotta estetään hydrolyysista johtuva liika OH–. 1/Λ esitetään Ö_C ja suolan Λo voidaan löytää ekstrapoloimalla nollaväkevyyteen.

Hapon Λo voidaan laskea käyttämällä H+:n ja Na+:n kirjallisuusarvoja, ja pKa-arvo voidaan laskea α = Λio ja Ka = α2C/(1 – α) kullekin konsentraatiolle. Paremmat arvot Ka:lle voidaan saada tekemällä korjauksia liikkuvuuden ja aktiivisuuden osalta. On laskettava pKa-arvojen keskiarvot ja keskihajonta.

Testiraportti

Kaikki raakadata ja pKa-arvot on toimitettava yhdessä laskentamenetelmän (mieluiten taulukkomuodossa, kuten ehdotetaan viitteessä 1, samoin kuin edellä mainittujen tilastollisten parametrien kanssa. Titrausmenetelmien osalta on esitettävä yksityiskohdat titranttien standardoinnista.

Spektrofotometrisen menetelmän osalta on esitettävä kaikki spektrit. Konduktometrisen menetelmän osalta on esitettävä yksityiskohdat kennovakion määrityksestä. Tiedot käytetystä tekniikasta, analyyttisistä menetelmistä ja kaikkien puskuriaineiden erityispiirteistä on annettava.

Testilämpötilat on ilmoitettava.

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.

(2)

Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, a. 1186–1188 (1969).

(3)

ASTM D 1293 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(4)

Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.

(5)

Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).

(6)

ASTM D 1125 – Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(7)

Standard Method 205 – APHA/AWWA/NPCF (ks. edellä 4 kohta).

(8)

Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).”

2)

Korvataan B osassa oleva B.5 luku seuraavasti:

”B.5   AKUUTTI SILMÄN ÄRSYTTÄVYYS/SYÖVYTTÄVYYS

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 405 (2012). OECD:n testiohjeita kemikaalien testaamiseksi on tarkistettava säännöllisesti, jotta ne heijastavat parhaita käytettävissä olevia tieteellisiä menetelmiä. Tämän testimenetelmän aikaisemmissa päivityksissä kiinnitettiin erityistä huomiota mahdollisiin parannuksiin arvioimalla kaikkia testikemikaalista aiemmin saatuja tietoja, jotta vältettäisiin tarpeettomat eläinkokeet ja siten vastattaisiin eläinten hyvinvointia koskeviin näkökohtiin. Testiohjeeseen 405 (joka hyväksyttiin vuonna 1981 ja jota päivitettiin vuosina 1987, 2002 ja 2012) sisältyy suositus, jonka mukaan ennen tässä kuvatun, aineen ärsyttävyyttä/syövyttävyyttä tutkivan in vivo -testin toteuttamista on arvioitava aiempien relevanttien tutkimustulosten painoarvo (1). Jos saatavissa olevat tiedot ovat puutteellisia, niitä voidaan täydentää vaiheittaisen menettelyn avulla (2) (3). Suositeltavaan testausstrategiaan, joka on selostettu tämän menetelmän täydennysosassa, sisältyy validoitujen ja hyväksyttyjen in vitro -testien suorittaminen. Kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun asetuksen (EY) N:o 1907/2006 (2) mukaisesti integroitu testimenettely sisältyy myös asiaankuuluviin Euroopan kemikaaliviraston ohjeisiin (21). Eläinkokeita tulisi tehdä ainoastaan, jos niitä pidetään välttämättöminä sen jälkeen, kun on tarkasteltu käytettävissä olevia vaihtoehtoisia menetelmiä ja kun niiden käyttöä pidetään asianmukaisena. Tämän päivitetyn testimenetelmän valmistelun aikana on tullut esiin tapauksia, jolloin tämän testimenetelmän soveltamista pidetään edelleen tarpeellisena tai sitä edellytetään joidenkin sääntelyjärjestelmien perusteella.

Viimeisimmässä päivityksessä keskityttiin pääasiassa kipulääkkeiden ja anestesia-aineiden käyttöön muuttamatta testiohjeen perusajatusta ja rakennetta. ICCVAM (3) ja riippumaton kansainvälinen tieteellinen vertaisarviointiryhmä arvioivat pintapuudutteiden rutiinikäytön käyttökelpoisuutta, systeemisiä kipulääkkeitä ja inhimillisiä päätepisteitä silmänärsytyksen in vivo -testauksen aikana (12). Arvioinnissa päädyttiin siihen, että pintapuudutteiden ja systeemisten kipulääkkeiden käytöllä voitaisiin välttää kokonaan tai suurin osa kivusta ja kärsimyksestä testin tulokseen vaikuttamatta, ja suositeltiin, että näitä aineita käytettäisiin aina. Tämä arviointi otetaan huomioon tässä testimenetelmässä. Pintapuudutteita ja systeemisiä kipulääkkeitä on käytettävä ja inhimillisiä päätepisteitä sovellettava akuuttia silmän ärsytystä ja syövyttävyyttä tutkivassa in vivo-testauksessa. Poikkeukset niiden käyttöön on perusteltava. Tässä menetelmässä kuvatuilla tarkennuksilla vähennetään merkittävästi tai vältetään eläinten kipu ja kärsimys useimmissa testaustilanteissa, joissa in vivo-silmätestaus on edelleen tarpeen.

Tasapainoiseen ennaltaehkäisevään kivunhoitoon tulisi sisältyä (i) rutiininomainen esikäsittely pintapuudutteella (esim. proparakaiini ja tetrakaiini) ja systeemisellä kipulääkkeellä (kuten buprenorfiini); (ii) rutiininomainen jälkikäsittely systeemisellä kivunlievityksellä (kuten buprenorfiini ja meloksikaami); (iii) eläinten kivun ja/tai kärsimyksen kliinisten merkkien suunniteltu havainnointi, seuranta ja rekisteröinti; ja (iv) kaikkien silmävammojen luonteen, vakavuuden ja etenemisen suunniteltu havainnointi, seuranta ja rekisteröinti. Tarkempia tietoja annetaan jäljempänä kuvatuissa päivitetyissä menettelyissä. Testikemikaalin annostelun jälkeen mitään muita pintapuudutteita tai kipulääkkeitä ei tulisi käyttää, jotta tutkimukseen ei vaikuteta. Kipulääkkeitä, joilla on anti-inflammatorinen vaikutus (esim. meloksikaami), ei pitäisi käyttää paikallisesti, ja systeemisesti käytettyjen annoksien ei pitäisi häiritä silmävaikutuksia.

Määritelmät annetaan tämän testimenetelmän lisäyksessä.

ALUSTAVAT HUOMIOT

Sekä järkevien tieteellisten menettelytapojen että eläinten hyvinvoinnin vuoksi in vivo -testiä ei pidä suorittaa ennen kuin kaikkien saatavissa olevien kemikaalin mahdolliseen silmä-ärsyttävyyteen/syövyttävyyteen liittyvien tietojen painoarvo on arvioitu. Tällaisia tietoja ovat todisteet aiemmista ihmisille ja/tai koe-eläimille tehdyistä tutkimuksista, todisteet yhden tai usean rakenteellisesti samankaltaisen aineen tai ainetta sisältävän seoksen silmä-ärsyttävyydestä/syövyttävyydestä, kemikaalin voimakasta happamuutta tai emäksisyyttä osoittavat tulokset (4) (5) sekä validoidut ja hyväksytyt in vitro- tai ex vivo -ihoärsyttävyys-/-syövyttävyystestit (6) (13) (14) (15) (16) (17). Tutkimukset voivat olla painoarvoanalyysia aiemmin tehtyjä tai sen tuloksena syntyneitä.

Joidenkin kemikaalien kohdalla painoarvoanalyysi voi osoittaa, että in vivo -testi on tarpeen kemikaalin mahdollisen silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden selvittämiseksi. Kaikissa näissä tapauksissa, ennen kuin tarkastellaan in vivo -silmätestin käyttöä, olisi mieluiten tehtävä tutkimus in vitro ja/tai in vivo -testeissä siitä, mitä ihon syöpymisen vaikutuksia kemikaali aiheuttaa, ja tätä olisi arvioitava testimenetelmän B.4 vaiheittaisen testimenettelyn (7) tai kemikaaliviraston toimintaohjeissa kuvatun integroidun testimenettelyn (21) mukaisesti.

Vaiheittainen testimenetelmä, johon sisältyvät validoidut silmän ärsyttävyyden/syövyttävyyden in vivo tai ex vivo -testit, sisällytetään liitteenä tähän testimenetelmään ja REACH-asetuksen nojalla Euroopan kemikaaliviraston ohjeisiin (21). Tällaisen testimenetelmän käyttöä suositellaan ennen in vivo -testin suorittamista. Uusia kemikaaleja testattaessa on suositeltavaa soveltaa vaiheittaista testimenettelyä, jonka avulla voidaan saada tieteellisesti päteviä tuloksia kemikaalin ärsyttävyydestä/syövyttävyydestä. Sellaisten kemikaalien tapauksessa, joiden iho- ja silmä-ärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä ei ole riittävästi tietoja, menettelytapaa voidaan käyttää puuttuvien tietojen hankkimiseen. Päätös käyttää jotain muuta menettelytapaa tai olla käyttämättä vaiheittaista menettelytapaa on perusteltava.

IN VIVO -TESTIN PERIAATE

Systeemisellä kipulääkkeellä ja asianmukaisella pintapuudutteella annettavan esikäsittelyn jälkeen testiaine annostellaan yhtenä annoksena koe-eläimen toiseen silmään. Käsittelemätön silmä toimii kontrollina. Silmän ärtymisen/syöpymisen aste arvioidaan pisteyttämällä sidekalvon, sarveiskalvon ja värikalvon vammat tietyin väliajoin. Muut silmään kohdistuvat vaikutukset ja koko elimistöön kohdistuvat haittavaikutukset kuvataan myös, jotta vaikutuksia voidaan arvioida kokonaisuudessaan. Testin on kestettävä niin pitkään, että havaittujen vaikutusten korjautuvuus tai korjautumattomuus voidaan arvioida.

Eläimet, joissa havaitaan merkkejä jatkuvasta vakavasta stressistä ja/tai tuskista missä tahansa testin vaiheessa tai vammoja, jotka ovat yhdenmukaisia tässä testimenetelmässä kuvattujen inhimillisten päätepisteiden kanssa (ks. 26 kohta), on lopetettava inhimillisellä tavalla, ja tämä on otettava huomioon kemikaalin arvioinnissa. Kuolevien ja kärsivien eläinten lopettamiskriteereihin sovelletaan OECD:n ohjeasiakirjaa (8).

IN VIVO -TESTIN VALMISTELU

Lajin valinta

Suositeltava koe-eläinlaji on albiinokaniini. Kokeessa käytetään nuoria ja terveitä täysikasvuisia yksilöitä. Muiden lajien käyttö on perusteltava.

Eläinten valmistelu

Kunkin alustavasti testiin valitun koe-eläimen molemmat silmät tutkitaan testin alkua edeltävän 24 tunnin aikana. Eläimiä, joilla esiintyy silmien ärtyneisyyttä, silmävikoja tai aiempia sarveiskalvon vaurioita, ei voi käyttää testissä.

Koe-eläintilat ja ruokinta

Jokaisella eläimellä on oltava oma häkki. Koe-eläinhuoneen lämpötilan on oltava kaniineilla 20 °C (± 3 °C). Vaikka suhteellisen kosteuden pitäisi olla vähintään 30 % eikä mielellään yli 70 % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa ja 12 tuntia pimeää). Liian voimakasta valoa on vältettävä. Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.

TESTIMENETTELY

Pintapuudutteiden ja systeemisten kipulääkkeiden käyttö

Seuraavia menetelmiä suositellaan, jotta kipua ja kärsimystä vältetään tai se minimoidaan silmätestausta koskevissa menettelyissä. Vaihtoehtoisia menettelyjä, joiden on todettu välttävän tai lievittävän kipua tai kärsimystä yhtä hyvin tai paremmin, voidaan käyttää niiden sijasta.

Kuusikymmentä minuuttia ennen testikemikaalin antoa buprenorfiini 0,01 mg/kg annetaan ihonalaisena injektiona, ja sillä tarjotaan oikean hoitotason mukainen systeeminen kivunlievitys. Buprenorfiinin ja muiden vastaavien systeemisesti annosteltavien opioidianalgeettien ei tiedetä tai odoteta muuttavan silmävasteita (12)

Viisi minuuttia ennen testikemikaalin annostelua yksi tai kaksi tippaa silmiin käytettävä paikallispuudutetta (esim. 0,5 %:n proparakaiinihydrokloridi tai 0,5 %:n tetrakaiinihydrokloridi) annostellaan kuhunkin silmään. Tutkimukselle aiheutuvien häiriöiden välttämiseksi suositellaan paikallispuudutetta, joka ei sisällä säilöntäaineita. Kontrollina toimii kunkin eläimen osalta se silmä, jota ei käsitellä testikemikaalilla, mutta joka käsitellään pintapuudutteella. Jos kemikaalin ennakoidaan aiheuttavan merkittävää kipua ja kärsimystä, sitä ei pitäisi normaalisti testata in vivo. Kuitenkin, mikäli epäilyjä esiintyy tai kun testaus on tarpeen, on harkittava, että paikallispuudutetta annetaan täydentäviä annoksia viiden minuutin välein ennen testikemikaalin annostelua. Käyttäjien on tiedettävä, että useat pintapuuduteannokset saattaa aiheuttaa lievää vaikeusasteen lisääntymistä ja/tai lisätä kemikaalien aiheuttamien vammojen korjaantumisaikaa

Kahdeksan tuntia testikemikaalin annon jälkeen annostellaan buprenorfiinia 0,01 mg/kg ihonalaisena injektiona ja meloksikaamia 0,5 mg/kg ihonalaisena injektiona oikean hoitotason mukaiseksi systeemiseksi kivunlievitykseksi. Vaikka ei ole tietoa siitä, että meloksikaamilla on tulehdusta estävä vaikutus silmiin, kun sitä annetaan ihon alle kerran vuorokaudessa, meloksikaamia ei tulisi antaa ennen kuin vähintään 8 tuntia testikemikaalin annostuksen jälkeen, jotta mahdolliset häiriöt tutkimuksessa vältetään (12)

Kun on kulunut ensimmäinen kahdeksan tuntia testikemikaalin annostuksen jälkeen, buprenorfiinia 0,01 mg/kg (ihonalaisena injektiona) tulisi antaa 12 tunnin välein yhdessä meloksikaamin 0,5 mg/kg (ihonalaisena injektiona) kanssa 24 tunnin välein kunnes silmävauriot korjaantuvat ja mitään kliinisiä merkkejä kivusta ja kärsimyksestä ei esiinny. On saatavilla pitkävaikutteisia kipulääkevalmisteita, joiden kohdalla voidaan harkita kipulääkkeiden annostustiheyden harventamista

Välittömästi testikemikaalin annostelun jälkeen on annettava nopeaa kivunlievitystä, jos ehkäisevä kivunlievitys ja pintapuudutus eivät riitä. Jos eläin osoittaa merkkejä kivusta ja kärsimyksestä tutkimuksen aikana, on annettava välittömästi annos buprenorfiinia 0,03 mg/kg ihonalaisena injektiona ja sitä on toistettava tarvittaessa 8 tunnin välein, sen sijaan, että sitä annetaan 0,01 mg/kg 12 tunnin välein. Meloksikaami 0,5 mg/kg (ihonalainen injektio) annetaan 24 tunnin välein yhdessä nopeasti annettavan buprenorfiinin kanssa, mutta vasta vähintään 8 tunnin kuluttua testikemikaalin annostelun jälkeen.

Testikemikaalin annostelu

Eläimen alaluomea vedetään varovasti silmämunasta poispäin ja testikemikaali annostellaan eläimen toisen silmän sidekalvopussiin. Sen jälkeen luomia pidetään varovasti yhdessä sekunnin ajan, jotta aine ei valuisi ulos silmästä. Toinen silmä, jota ei käsitellä, toimii kontrollina.

Kosteutus

Koe-eläinten silmiä ei saa pestä vähintään 24 tuntiin testikemikaalin annostelun jälkeen, paitsi jos kyseessä on kiinteä aine (ks. 18 kohta) tai välitön ärsyttävä tai syövyttävä vaikutus. Silmät voidaan pestä 24 tunnin kuluttua, jos se katsotaan tarpeelliseksi.

Pesemisen vaikutuksen selvittämiseksi ei suositella kontrolliryhmää, paitsi jos sille on tieteellisiä perusteita. Jos kontrolliryhmä tarvitaan, käytetään kahta kaniinia. Pesuolosuhteet on dokumentoitava tarkasti, esimerkiksi pesuaika, pesuliuoksen koostumus ja lämpötila, pesun kesto, nesteen tilavuus ja virtausnopeus.

Annostaso

(1)   Nesteiden testaus

Testattaessa nesteitä testiannos on 0,1 ml. Kemikaalia ei saa annostella suoraan suihkepumpusta silmään. Nestesuihke on ensin kerättävä astiaan ennen 0,1 ml:n annostelua silmään.

(2)   Kiinteiden kemikaalien testaus

Testattaessa kiinteitä kemikaaleja, tahnoja ja hiukkasmaisia aineita annoksen tilavuuden on oltava 0,1 ml tai painon enintään 100 mg. Testikemikaali jauhetaan hienoksi pölyksi. Kiinteän aineen tilavuus mitataan, kun aine on ensin kevyesti tiivistetty esimerkiksi naputtamalla mitta-astiaa. Jos kiinteä testikemikaali ei ole poistunut koe-eläimen silmästä fysiologisten mekanismien seurauksena ensimmäiseen havainnointiaikaan mennessä eli tunnin kuluttua käsittelystä, silmä voidaan huuhdella fysiologisella suolaliuoksella tai tislatulla vedellä.

(3)   Aerosolien testaus

On suositeltavaa kerätä kaikki pumpattavat suihkeet ja aerosolit ennen niiden annostelua silmään. Ainoa poikkeus ovat paineistetuissa aerosolisäiliöissä olevat kemikaalit, joita ei voida kerätä höyrystymisen takia. Sellaisessa tapauksessa silmää pidellään auki ja testikemikaali annostellaan silmään yhtenä sekunnin kestävänä purskauksena 10 cm:n etäisyydeltä suoraan silmän edestä. Välimatka voi vaihdella suihkesäiliön paineen ja sisällön mukaan. On varottava, ettei suihkesäiliön paine vahingoita silmää. Joissakin tapauksissa voi olla syytä arvioida suihkeen voimakkuuden silmälle mahdollisesti aiheuttamat ”mekaaniset” vauriot.

Aerosoliannoksen suuruus voidaan arvioida simuloimalla testiä seuraavalla tavalla. Testikemikaali suihkutetaan punnituspaperille suoraan paperin edessä olevasta kaniinin silmän kokoisesta aukosta. Paperin painon lisäyksen avulla arvioidaan silmään suihkutettu määrä. Haihtuvien kemikaalien tapauksessa annoksen suuruus voidaan arvioida punnitsemalla keräysastia testikemikaalin poistamista ennen ja sen jälkeen.

Alkutesti (in vivo -silmä-ärsyttävyys/syövyttävyystesti yhdelle eläimelle)

On erittäin suositeltavaa suorittaa aluksi yhdelle eläimelle in vivo -testi (ks. tämän testimenetelmän täydennysosa: silmä-ärsyttävyyden ja -syövyttävyyden vaiheittainen testaus). Havainnoilla on voitava määrittää vakavuus ja korjautuvuus ennen kuin tehdään varmistustesti toisella eläimellä.

Jos testitulos osoittaa, että kemikaali on silmää syövyttävä tai vakavasti ärsyttävä kuvattua menettelyä käytettäessä, silmän ärtymistä ei pidä enää testata.

Vahvistustesti (in vivo -silmä-ärsyttävyystesti useille eläimille)

Jos alkutestissä ei havaita syöpymisoireita tai vakavia ärsytysoireita, ärsyttävyys tai negatiivinen vaste on vahvistettava testaamalla vielä enintään kaksi eläintä. Jos alkutestissä todetaan voimakas ärsyttävä vaikutus, on suositeltavampaa tehdä vahvistustesti vaiheittaisen menettelyn mukaan yhdelle eläimelle kerrallaan kuin altistaa kaksi eläintä samalla kertaa. Jos toisella eläimellä esiintyy syöpymisoireita tai vakavia ärsytysoireita, testiä ei jatketa. Jos toisesta eläimestä saadaan tarpeeksi tuloksia vaaraluokituspäätöksen tekemiseksi, muita testejä ei pitäisi enää tehdä.

Havainnointijakso

Tarkkailujakson on oltava riittävän pitkä, jotta havaittujen vaikutusten voimakkuus ja korjautuvuus arvioidaan täydellisesti. Testi on kuitenkin lopetettava heti, jos eläin osoittaa merkkejä kovista tuskista tai stressistä (8). Vaikutusten korjautuvuuden määrittämiseksi eläimiä on tarkkailtava tavallisesti 21 päivän ajan testikemikaalin antamisen jälkeen. Jos korjautuvuus todetaan ennen kuin 21 päivää on kulunut, testi on lopetettava silloin.

Kliiniset havainnot ja silmäreaktioiden pisteytys

Silmiä on arvioitava kattavasti silmävaurioiden esiintymisen tai puuttumisen osalta tunnin kuluttua testikemikaalin antamisesta ja tämän jälkeen ainakin kerran päivässä. Eläimiä on arvioitava useita kertoja päivässä ensimmäisen kolmen päivän aikana, jotta varmistetaan, että lopettamispäätökset tehdään ajoissa. Koe-eläimiä on rutiininomaisesti arvioitava koko tutkimuksen keston ajan kivun ja/tai kärsimyksen kliinisten merkkien varalta (esim. silmien toistuva raapiminen tai hankaaminen, ylenmääräinen silmien räpyttely tai vuotaminen) (9) (10) (11) vähintään kaksi kertaa päivittäin, vähintään 6 tuntia havainnointien välillä, tai tarvittaessa useammin. Tämä on tarpeen, jotta (i) eläimiä arvioidaan asianmukaisesti kivun ja kärsimyksen merkkien varalta, jotta tehdään perusteltuja päätöksiä tarpeesta lisätä kipulääkkeiden annostusta ja (ii) eläimiä arvioidaan vakiintuneiden inhimillisten päätepisteiden osalta, jotta tehdään perusteltuja päätöksiä siitä, onko tarkoituksenmukaista lopettaa eläin humaanisti ja varmistaa, että tällaiset päätökset tehdään ajoissa. Fluoreseiinivärjäystä on käytettävä rutiininomaisesti ja rakolamppu- biomikroskopiaa käytetään tarpeen vaatiessa (esimerkiksi arvioitaessa sarveiskalvon haavauman yhteydessä vamman vakavuutta) havainnointivälineenä okulaarivaurion mittaamisessa ja arvioitaessa, onko humaanin lopettamisen osalta vahvistetut päätepistettä koskevat perusteet täytetty. Digitaalivalokuvia havaituista vaurioista voidaan kerätä viitteeksi ja tarjoamaan pysyvä aineisto okulaarivaurion laajuudesta. Eläintä ei saa pitää testattavana sen jälkeen kun lopulliset tiedot on saatu. Eläimet, jotka osoittavat stressin tai vakavien tuskien merkkejä, on viipymättä lopetettava inhimillisellä tavalla, ja tämä on otettava huomioon testikemikaalin vaikutusten arvioinnissa.

Inhimillisellä tavalla on lopetettava eläimet, joilla esiintyy testiaineen annostelun jälkeen seuraavia silmävammoja (ks. taulukko 1 vaurioiden asteista): sarveiskalvon puhkeaminen tai huomattava sarveiskalvon haavauma mukaan luettuna pullistuma, verta silmän etukammiossa, asteen 4 sarveiskalvosamentuma, valorefleksin puuttuminen (värikalvon vaste 2), joka jatkuu 72 tuntia, sidekalvon haavauma, sidekalvon tai vilkkukalvon kuolio tai arpeutuminen. Näin menetellään siksi, että kyseiset vauriot ovat yleensä korjautumattomia. Lisäksi suositellaan, että seuraavia silmävammoja käytetään inhimillisinä päätepisteinä tutkimusten lopettamiseksi ennen suunniteltua 21 päivän tarkkailujaksoa. Näiden vaurioiden katsotaan osoittavan, että vamma aiheutuu vakavasti ärsyttävistä tai syövyttävistä kemikaaleista johtuvista vaurioista, joiden ei odoteta täysin poistuvan 21 päivän tarkkailujakson loppuun mennessä: vamman ulottuminen vakavaan syvyyteen (esim. sarveiskalvon haavauma, joka ulottuu strooman pintakerroksiin), sarveiskalvon rajan tuhoutuminen > 50 % (jota osoittaa sidekalvokudoksen vaalentuminen), ja vakava silmätulehdus (märkivä, rähmäinen silmä). Seuraavaa yhdistelmää voidaan pitää potentiaalisesti hyödyllisinä kriteereinä, jotka vaikuttavat kliiniseen päätökseen tutkimuksen ennenaikaisesta päättämisestä: sarveiskalvon pinnan verisuonittuminen (eli pannus); fluoreseiinivärjätty alue, jonka ala ei pienene ajan mittaan päivittäisen arvioinnin perusteella; ja re-epitelisaation puuttuminen viiden päivän kuluttua testikemikaalin antamisesta. Nämä havainnot eivät kuitenkaan riitä yksittäin perusteiksi tutkimuksen ennenaikaiselle päättämiselle. Kun vakavia silmävaikutuksia on havaittu, tarkkailijana olevaa/pätevää laboratorion eläinlääkäriä tai henkilöstöä, joka on koulutettu havaitsemaan kliiniset vammat, on kuultava kliinisessä tutkimuksessa, jossa määritetään, antaako näiden vaikutusten yhdistelmä aiheen päättää tutkimus varhaisessa vaiheessa. Silmänreaktioiden pisteytys (sidekalvo, sarveiskalvo ja värikalvo) on otettava ja kirjattava 1, 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua testikemikaalin annostuksesta (taulukko 1). Eläimet, joille ei kehity silmävammoja, voidaan lopettaa aikaisintaan kolme päivää testikemikaalin annostelun jälkeen. Eläimiä, joilla esiintyy muita kuin vakavia vaurioita, on tarkkailtava, kunnes vauriot häviävät, tai 21 päivää, jolloin koe päätetään. Havainnot on tehtävä ja kirjattava vähintään 1 tunnin, 24 tunnin, 48 tunnin, 72 tunnin, 7 päivän, 14 päivän ja 21 päivän kuluttua, jotta voidaan määrittää vaurioiden tila ja niiden korjautuvuus tai korjautumattomuus. Havaintoja on tehtävä tarvittaessa tiheämmin, jotta määritetään, pitääkö koe-eläin lopettaa inhimillisistä syistä tai poistaa tutkimuksesta negatiivisten tulosten vuoksi.

Silmävaurioiden pisteytys (taulukko 1) on kirjattava kussakin tarkastelussa. Kaikki muut silmävauriot (esimerkiksi sarveiskalvoverho, värjäytyminen, etukammion muutokset) tai koko elimistöön kohdistuvat haittavaikutukset on myös raportoitava.

Reaktioiden tutkimista helpottaa luuppilasien, lampun, biomikroskoopin tai muiden sopivien laitteiden käyttö. Kun havainnot on kirjattu 24 tunnin jälkeen, silmiä voidaan edelleen tutkia fluoreskeiinin avulla.

Silmävasteiden pisteytys on väistämättä subjektiivista. Silmävasteiden pisteytyksen yhdenmukaistamiseksi sekä testilaboratorion ja havaintoja tekevien ja tulkitsevien henkilöiden työn helpottamiseksi havaintoja tekevän henkilöstön on oltava riittävän perehtynyttä pisteytysjärjestelmään.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten arviointi

Silmä-ärsytyspisteet on arvioitava yhdessä vammojen luonteen ja vakavuuden sekä niiden korjautuvuuden tai korjautumattomuuden kanssa. Yksittäiset pisteet eivät edusta kemikaalin ärsyttävyysominaisuuksien absoluuttista tasoa, koska testikemikaalin muutkin vaikutukset ovat arvioinnissa mukana. Sen sijaan yksittäisiä pisteitä pitäisi tarkastella viitearvoina, jotka ovat merkitseviä vain, kun kaikki muut havainnot ja niiden arviointi tukevat pisteiden antamaa tietoa.

Testiraportti

Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:

 

Perustelut in vivo -testin tekemiselle: aiemmista tutkimuksista saatujen testitulosten painoarvon analyysi, mukaan luettuna vaiheittaisen menettelyn tulokset:

aiemmista testeistä saatujen relevanttien tulosten kuvaus

testimenettelyn kustakin vaiheesta saadut tulokset

kuvaus tehdyistä in vitro -testeistä, mukaan luettuna niiden suorittamistapa ja testi-/viitekemikaalista saadut tulokset

kuvaus tehdyistä in vivo -ihoärsyttävyys/-syövyttävyystesteistä sekä niiden tulokset

painoarvoanalyysi in vivo -testiä varten.

 

Testikemikaali:

tunnistetiedot (esim. kemikaalin nimi ja CAS-numero, jos se tiedetään, puhtaus, tunnetut epäpuhtaudet, alkuperä, erän numero)

fysikaalinen olomuoto ja fysikokemialliset ominaisuudet (esimerkiksi pH, haihtuvuus, liukoisuus, stabiilius, reaktiivisuus veden kanssa)

jos kyseessä on seos, aineet on tunnistettava mukaan lukien tunnistetiedot ainesosista (esim. kemialliset nimet ja CAS-numerot, jos ne tiedetään) ja niiden pitoisuudet

käytetty annos.

 

Kantaja-aine:

tunnistetiedot, konsentraatio (tilanteen mukaan), käytetty tilavuus

perustelut kantaja-aineen valinnalle.

 

Koe-eläimet:

käytetty laji ja kanta, perustelut muiden eläinten kuin albiinokaniinien käytölle

eläinten ikä testin alussa

uros- ja naaraseläinten määrä testi- ja kontrolliryhmissä (jos tarpeen)

eläinyksilöiden paino testin alussa ja lopussa

eläinten alkuperä, häkkijärjestelyt, ruokavalio ja niin edelleen.

 

Puudutusaineet ja kipulääkkeet

annokset ja ajat, jolloin pintapuudutteita ja systeemisiä kipulääkkeitä annettiin

jos on käytetty paikallispuudutusainetta, sen tunnistetiedot, puhtaus, laji ja mahdollinen yhdysvaikutus testikemikaalin kanssa.

 

Tulokset:

kuvaus ärsytyksen pisteytyksessä käytetystä välineestä kullakin havaintokerralla (esimerkiksi lamppu, biomikroskooppi, fluoreskeiini)

taulukkomuotoiset tiedot kunkin eläimen ärsytys-/syöpymisvasteesta kullakin havaintokerralla siihen asti, kun eläin on poistettu testistä

sanallinen kuvaus havaitun ärsytyksen/syöpymisen luonteesta ja asteesta

kuvaus kaikista silmässä havaituista vaurioista (esimerkiksi verisuonittuminen, sarveiskalvoverhon muodostus, umpeen muurautuminen, värjäytyminen)

kuvaus muualle kuin silmään kohdistuvista vaurioista sekä koko elimistöön kohdistuvista haittavaikutuksista, kivun ja kärsimyksen kliinisten merkkien kirjaaminen, digitaalivalokuvat ja mahdolliset histopatologiset löydökset.

 

Tulosten pohdinta

Tulosten tulkinta

Koe-eläimille tehtyjen silmä-ärsytystestien tulosten ekstrapolointi ihmisiä koskeviksi on vain rajoitetusti pätevää. Monissa tapauksissa albiinokaniini on ihmistä herkempi silmää ärsyttäville tai syövyttäville aineille.

Tulosten tulkinnassa on huolellisesti erotettava sekundäärisestä tulehduksesta johtuva ärsytys.

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

Barratt, M.D., et al. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8, ATLA 23, 410–429.

(2)

de Silva, O., et al. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35, 159–164.

(3)

Worth A.P. and Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177.

(4)

Young, J.R., et al. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In vitro, 2, 19–26.

(5)

Neun, D. J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.

(6)

Fentem, J.H., et al. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, s. 483–524.

(7)

Tässä liitteessä oleva B.4 luku, Akuutti toksisuus: ihoärsyttävyys/-syövyttävyys.

(8)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

(9)

Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20–36.

(10)

National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.

(11)

National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.

(12)

ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences.

http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm

(13)

Tässä liittessä oleva B.40 luku: In vitro -ihosyövyttävyys: ihon sähkövastusmääritystesti (TER).

(14)

Tässä liitteessä oleva B.40 a luku: In vitro -ihosyövyttävyys: Ihmisihomallitesti.

(15)

OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.

(16)

Tässä liitteessä oleva B.47 luku: Naudan sarveiskalvon sameuden ja läpäisevyyden testimenetelmä, jolla voidaan määrittää i) vakavia silmävaurioita aiheuttavat kemikaalit ja ii) kemikaalit, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta.

(17)

Tässä liitteessä oleva B.48 luku: Eristetyn kanan silmän käyttöön perustuva testimenetelmä, jolla tunnistetaan i) vakavia silmävaurioita aiheuttavat kemikaalit ja ii) kemikaalit, joita ei tarvitse luokitella silmä-ärsytyksen tai vakavien silmävaurioiden osalta.

(18)

U.S. EPA (2003), Label Review Manual: 3. painos, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.

(19)

YK (2011). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). 4. tarkistettu painos. United Nations Publications.

(20)

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, annettu 16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/45/EY muuttamisesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) N:o 1907/2006 muuttamisesta. Euroopan unionin virallinen lehti L 353, s. 1-1355.

(21)

ECHA:n ohjeet tietovaatimuksista ja kemikaaliturvallisuusarvioinnista, R.7a luku: Päätepisteitä koskevat erityisohjeet (Endpoint specific guidance)

http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf

Taulukko 1

Silmävaurioiden pisteytys

Sarveiskalvo

Pisteytys

Samentuma: tiheysaste (mittausarvot otettava tiheimmästä kohdasta) (*1)

 

Ei haavaumia tai samentumaa

0

Yksittäisiä tai hajanaisia samentuma-alueita (muu kuin lievä normaalin kiillon himmentyminen); värikalvon yksityiskohdat selvästi nähtävissä

1

Selvästi erottuva läpinäkyvä alue; värikalvon yksityiskohdat hiukan peittyneet

2

Helmiäishohtoinen alue; värikalvon yksityiskohtia ei erotu lainkaan; pupilli tuskin erottuva

3

Samea sarveiskalvo; värikalvo ei erotu samentuman läpi

4

Suurin mahdollinen pistemäärä: 4

 

Värikalvo

 

Tavanomainen

0

Selvästi syventyneet poimut, verentungosta, turvotusta, keskinkertaista verekkyyttä sarveiskalvon ympärillä tai injektio; värikalvon reagoiminen valoon (viivästynyt reaktio katsotaan testiaineen vaikutukseksi

1

Verenvuoto, vakavasti tuhoutunut värikalvo tai ei reaktiota valoon

2

Suurin mahdollinen pistemäärä: 2

 

Sidekalvo

 

Punaisuus (viittaa luomen ja silmämunan sidekalvoon; pois lukien sarveiskalvo ja värikalvo)

 

Tavanomainen

0

Joitakin hypereemisiä verisuonia (injektoitu)

1

Laajalle levinnyt helakka punaisuus; yksittäiset suonet eivät erotu selvästi

2

Laajalle levinnyt voimakas punaisuus

3

Suurin mahdollinen pistemäärä: 3

 

Sidekalvopöhö

 

Turvotus (viittaa luomiin ja/tai vilkkukalvoon)

 

Tavanomainen

0

Hiukan normaalia enemmän turvotusta

1

Selvää turvotusta, luomet osittain kääntyneet ympäri

2

Turvotusta, luomet puoliksi muurautuneet umpeen

3

Turvotusta, luomet enemmän kuin puoliksi muurautuneet umpeen

4

Suurin mahdollinen pistemäärä: 4

 

Lisäys

MÄÄRITELMÄT

Ei-ärsyttävä : Aineita, joita ei ole luokiteltu EPA-järjestelmän kategoriaan I, II tai III silmää ärsyttäviksi aineiksi; tai GHS:n kategoriaan 1, 2, 2A tai 2B; tai EU-kategoriaan 1 tai 2 (17) (18) (19).

Happo-/emäsreservi : Kun kyse on happamista valmisteista, tämä on määrä (grammaa) natriumhydroksidia/100 g valmistetta, jota tarvitaan tietyn pH-arvon tuottamiseen. Kun kyse on emäksisistä valmisteista, tämä on määrä (grammaa) natriumhydroksidia, joka vastaa (grammaa) rikkihappoa/100 g valmistetta, jota tarvitaan tietyn pH-arvon tuottamiseen (Young et al. 1988).

Kemikaali : Aine tai aineiden seos.

Porrastettu menettely : Vaiheittainen testausstrategia, jossa kaikkia testikemikaalia koskevia olemassa olevia tietoja tarkastellaan tietyssä järjestyksessä käyttäen todistusnäyttöprosessia kussakin vaiheessa sen määrittämiseksi, onko käytettävissä riittävästi tietoja vaaraluokituspäätöstä varten, ennen kuin siirrytään seuraavaan vaiheeseen. Lisätestausta ei tarvita, jos testikemikaalin ärsytyskyky voidaan määrittää olemassa olevien tietojen perusteella. Jos testikemikaalin ärsytyskykyä ei voida määrittää olemassa olevien tietojen perusteella, toteutetaan vaiheittainen testaus eläimillä, kunnes luokitus voidaan määritellä aukottomasti.

Silmää syövyttävä aine : a) Kemikaali, joka aiheuttaa silmään palautumatonta kudosvauriota; b) kemikaalit, jotka on luokiteltu GHS:n kategoriaan 1, EPA-järjestelmän kategoriaan I silmää ärsyttäviksi aineiksi tai EU:n kategoriaan 1 (17) (18) (19).

Silmää vakavasti ärsyttävä aine : a) Kemikaali, joka aiheuttaa silmälle kudosvauriota, joka ei korjaudu 21 päivän kuluessa annostelusta tai joka aiheuttaa näkökyvyn vakavaa fyysistä rappiota; b) kemikaalit, jotka on luokiteltu GHS:n kategoriaan 1 silmää ärsyttäviksi aineiksi tai EPAn kategoriaan I silmää ärsyttäviksi aineiksi tai EU:n kategoriaan 1 (17) (18) (19).

Silmää ärsyttävä aine : a) Kemikaali, joka aiheuttaa silmään palautuvan muutoksen; b) kemikaalit, jotka on luokiteltu EPA-järjestelmän kategoriaan II tai III silmää ärsyttäviksi aineiksi; tai GHS:n kategoriaan 2, 2A tai 2B silmää ärsyttäviksi aineiksi; tai EU:n kategoriaan 2 (17) (18) (19).

Testikemikaali : Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

Todistusnäyttö (todistusnäyttöprosessi) : Tiedon kokoamisen vahvuuksia ja heikkouksia käytetään perustana päättelylle, joka ei välttämättä käy ilmi yksittäisistä tiedoista.

TESTIMENETELMÄN B.5 TÄYDENNYS  (4)

SILMÄ-ÄRSYTTÄVYYDEN JA -SYÖVYTTÄVYYDEN VAIHEITTAINEN TESTAUS

Yleisiä huomautuksia

Sekä järkevien tieteellisten menettelytapojen että eläinten hyvinvoinnin vuoksi on tärkeää välttää tarpeettomia eläinkokeita ja tehdä mahdollisimman vähän sellaisia testejä, jotka todennäköisesti aiheuttavat elämissä vakavia vasteita. Ennen in vivo -testin suunnittelemista on arvioitava kaikki tiedot testikemikaalin mahdollisesta silmä-ärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä. Riittävät todisteet testikemikaalin silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden luokittelemiseksi voivat jo olla olemassa, jolloin koe-eläintestejä ei tarvita. Painoarvoanalyysin ja vaiheittaisen menettelyn käyttö vähentää in vivo -testien tarvetta, erityisesti jos on todennäköistä, että testikemikaali aiheuttaa vakavia reaktioita.

On suositeltavaa arvioida aineiden silmä-ärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä saatavissa olevien tietojen painoarvo, jotta voidaan päättää, tarvitaanko kemikaalin silmä-ärsyttävyyspotentiaalin määrittämiseksi muita testejä kuin in vivo -silmätesti. Jos muita testejä tarvitaan, on suositeltavaa käyttää vaiheittaista menettelyä relevanttien koetulosten hankkimiseksi. Jos ainetta ei ole testattu aikaisemmin, vaiheittaisen menettelyn avulla voidaan hankkia silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden arviointiin tarvittavat tulokset. Tässä täydennyksessä kuvattu alkuperäinen testimenetelmä kehitettiin OECD:n työryhmässä (1). Se on vahvistettu ja laajennettu myöhemmin järjestelmässä Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, sellaisena kuin se vahvistettiin kemikaalikomitean ja kemikaalityöryhmän 28. yhteisessä kokouksessa marraskuussa 1998 (2) ja kuten OECD:n asiantuntijatyöryhmä päivitti sitä vuonna 2011.

Vaikka tämä vaiheittainen testausstrategia ei ole olennainen osa testimenetelmää B.5, siinä kuvataan suositeltavaa lähestymistapaa aineen silmä-ärsyttävyys-/-syövyttävyysominaisuuksien määrittämiseen. Tämä lähestymistapa edustaa sekä parhaita käytäntöjä että eettistä vertailukohdetta silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden in vivo -testauksessa. Siinä annetaan ohjeita in vivo -testin suorittamiseen ja esitetään yhteenveto tekijöistä, jotka on käsiteltävä ennen testin aloittamista. Strategia tarjoaa lähestymistavan aiemmin saatujen tulosten arviointiin testiaineen silmä-ärsyttävyys-/-syövyttävyysominaisuuksien selvittämiseksi, ja sen avulla voidaan vaihe vaiheelta tuottaa merkitseviä tuloksia kemikaaleista, joista tarvitaan lisätietoja tai joita ei ole aikaisemmin tutkittu. Strategiassa suositellaan myös käyttämään ensin validoituja ja hyväksyttyjä in vitro- tai ex vivo -testejä ja sen jälkeen tietyissä tapauksissa testimenetelmän B.4 tutkimuksia (3) (4).

Vaiheittaisen testausstrategian kuvaus

Ennen vaiheittaiseen menettelyyn sisältyvien testien suorittamista (kaavio) on analysoitava kaikki saatavissa olevat tiedot, jotta in vivo -silmätestauksen tarve voidaan määrittää. Vaikka yksittäisistä parametreista (esimerkiksi äärimmäiset pH-arvot) voidaan saada merkitseviä tietoja, on syytä ottaa huomioon tulokset kokonaisuudessaan. Kaikkien kyseessä olevan kemikaalin tai sitä rakenteeltaan vastaavan kemikaalin vaikutustietojen painoarvo on arvioitava testauspäätöksen yhteydessä, ja päätökselle on esitettävä perustelut. Ensisijaisesti on painotettava sekä ihmis- että eläintesteillä kemikaalista aiemmin saatuja tuloksia ja seuraavaksi in vitro- tai ex vivo -testien tuloksia. Syövyttävien kemikaalien in vivo -testejä on vältettävä aina kun se on mahdollista. Testimenettelyssä on otettava huomioon seuraavat asiat:

 

Arviointi olemassa olevista ihmistä ja/tai eläintä koskevista tiedoista ja/tai in vitro -tiedoista validoiduissa ja kansainvälisesti hyväksytyissä menetelmissä (Vaihe 1).

Aiemmat ihmisillä saadut tulokset, esimerkiksi kliiniset tai työperäiseen altistukseen liittyvät tutkimustulokset ja tapausselostukset ja/tai eläinkokeiden tulokset silmätesteistä ja/tai in vitro -tiedoista validoiduissa ja kansainvälisesti hyväksytyissä silmä-ärsyttävyyttä/syövyttävyyttä koskevissa menetelmissä, on otettava ensiksi huomioon, koska niistä saadaan suoraan aineen silmävaikutuksiin liittyviä tietoja. Sen jälkeen on arvioitavia saatavissa olevat tiedot ihmisillä ja/tai eläimillä tehdyistä ihoärsyttävyys/-syövyttävyystesteistä ja/tai validoiduista ja kansainvälisesti hyväksyttävistä ihosyövyttävyyttä koskevista in vitro -tutkimuksista. Eläinten silmiin ei saa annostella kemikaaleja, joiden tiedetään olevan syövyttäviä tai voimakkaasti ärsyttäviä, eikä kemikaaleja, joilla on ihoa ärsyttävä/syövyttävä vaikutus; tällaisten kemikaalien voidaan katsoa vaikuttavan myös silmiin. In vivo -testejä ei tehdä kemikaaleista, joiden silmä-ärsyttävyys tai -syövyttävyys tiedetään, eikä aineista, joista on selvästi todistettu, etteivät ärsyttäviä tai syövyttäviä.

 

Rakenne-aktiivisuusanalyysi (SAR) (vaihe 2).

Jos saatavilla on rakenteellisesti samankaltaisten aineiden testituloksia, ne on otettava huomioon. Kun rakenteellisesti samankaltaisista aineista tai niitä sisältävistä seoksista on saatavilla riittävästi ihmisille tehtyjen testien ja eläinkokeiden tuloksia, jotka osoittavat niiden silmä-ärsyttävyys/-syövyttävyyspotentiaalin, voidaan olettaa, että arvioitava testikemikaali tuottaa samanlaiset vasteet. Tällaisessa tapauksessa kemikaalia ei kenties tarvitse testata. Negatiiviset tulokset rakenteellisesti samankaltaisten aineiden tai sellaisista aineista koostuvien seosten tutkimuksista eivät vaiheittaisessa menettelyssä ole riittävä todiste siitä, ettei kemikaali ole ärsyttävä tai syövyttävä. Sekä silmä- että ihoärsyttävyys ja -syövyttävyys on selvitettävä validoitujen ja hyväksyttyjen SAR-menettelytapojen avulla.

 

Fysikokemialliset ominaisuudet ja kemiallinen reaktiivisuus (vaihe 3).

Kemikaalilla, jolla esiintyy äärimmäisiä pH-arvoja, kuten ≤ 2,0 tai ≥ 11,5, voi olla voimakkaita paikallisvaikutuksia. Jos kemikaali määritetään silmää syövyttäväksi äärimmäisen pH-arvon perusteella, sen happo-/emäsreservi (eli puskurointikyky) voidaan myös ottaa huomioon (5) (6) (7). Jos puskurointikyky viittaa siihen, ettei kemikaali ole silmää syövyttävä (eli kemikaalit, joilla on äärimmäinen pH-arvo ja alhainen happo/emäsreservi), tämän vahvistamiseksi on tehtävä jatkotesti, jonka on ensisijaisesti oltava validoitu ja hyväksytty in vitro- tai ex vivo -testi (ks. 10 kohta).

 

Muiden aiempien tietojen ottaminen huomioon (vaihe 4).

Kaikki saatavissa olevat tiedot koko elimistöön ihon kautta kohdistuvasta toksisuudesta on arvioitava tässä vaiheessa. Testikemikaalin akuutti toksisuus ihon kautta saatuna on myös otettava huomioon. Jos testikemikaali on osoitettu erittäin toksiseksi ihon kautta saatuna, sitä ei kenties tarvitse testata silmille. Vaikkakaan akuutin ihotoksisuuden ja silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden välillä ei välttämättä ole suhdetta, voidaan olettaa, että jos aine on erittäin toksinen ihon kautta saatuna, se on erittäin toksinen myös silmään annosteltuna. Tällaiset tiedot voidaan ottaa huomioon myös vaiheiden 2 ja 3 välissä.

 

Kemikaalin ihosyövyttävyyden arviointi, jos sitä edellytetään myös sääntelytarkoituksiin (vaihe 5).

Ihosyövyttävyyttä ja voimakasta ärsytystä koskevaa mahdollisuutta on arvioitava ensin testimenetelmän B.4 (4) ja sen liitteen (8) mukaisesti, mukaan lukien validoidut ja kansainvälisesti hyväksytyt in vitro -testimenetelmät ihosyövyttävyyden toteamiseksi (9) (10) (11). Jos kemikaalin osoitetaan aiheuttavan ihon syöpymistä tai vakavaa ärsytystä, sitä on syytä pitää syövyttävänä ja silmä-ärsytystä aiheuttavana. Lisäkokeet eivät ole näin ollen tarpeen. Jos kemikaali ei ole ihoa syövyttävä tai vakavasti ärsyttävä, on tehtävä in vivo tai ex vivo -silmätesti.

 

In vitro- tai ex vivo -testien tulokset (vaihe 6).

Kemikaaleja, joilla on todettu olevan syövyttäviä tai vakavasti ärsyttäviä ominaisuuksia validoiduissa ja kansainvälisesti hyväksytyissä, nimenomaan silmä- ja ihoärsyttävyyden/-syövyttävyyden mittaamista varten kehitetyissä in vitro- tai ex vivo -testeissä (12) ( 13), ei tarvitse testata eläimillä. Voidaan olettaa, että tällaiset kemikaalit aiheuttavat samoja vaikutuksia in vivo -testeissä. Jos validoituja ja hyväksyttyjä in vitro-/ex vivo -testejä ei ole saatavissa, vaiheet 5 ja 6 ohitetaan ja siirrytään suoraan vaiheeseen 7.

 

In vivo -testi kaniineilla (vaiheet 7 ja 8).

In vivo -silmätesti on aloitettava testaamalla ensin yksi eläin. Jos tämän testin tulokset osoittavat, että kemikaali on silmiä vakavasti ärsyttävä tai syövyttävä, jatkotestiä ei pidä tehdä. Jos alkutestissä ei todeta vakavasti ärsyttävää tai syövyttävää vaikutusta, ärsyttävyys tai negatiivinen vaste on vahvistettava testaamalla vielä enintään kaksi eläintä. Vahvistavan testin tuloksista riippuen voidaan tarvita täydentäviä testejä. [ks. testimenetelmä B.5].

SILMÄ-ÄRSYTTÄVYYDEN/-SYÖVYTTÄVYYDEN TESTAUS- JA ARVIOINTIMENETTELY

 

Toiminta

Havainto

Päätelmät

1

Olemassa olevat ihmistä ja/tai eläintä koskevat tiedot ja/tai in vitro -tiedot validoiduista ja kansainvälisesti hyväksytyistä menetelmistä, jotka osoittavat vaikutuksen silmiin

Vakavia silmävaurioita

Apikaalinen päätepiste; katsotaan, että aine syövyttää silmiä. Testiä ei tarvita.

Silmiä ärsyttävä

Apikaalinen päätepiste; katsotaan, että aine ärsyttää silmiä. Testiä ei tarvita.

Ei silmiä syövyttävä eikä ärsyttävä

Apikaalinen päätepiste; katsotaan, että aine ei ole silmiä syövyttävä eikä ärsyttävä. Testiä ei tarvita.

Olemassa olevat ihmistä ja/tai eläintä koskevat tiedot ja/tai in vitro -tiedot validoiduista ja kansainvälisesti hyväksytyistä menetelmistä, jotka osoittavat syövyttävän vaikutuksen ihoon

Ihoa syövyttävä

Oletetaan silmiä syövyttäväksi. Testiä ei tarvita.

Olemassa olevat ihmistä ja/tai eläintä koskevat tiedot ja/tai in vitro -tiedot validoiduista ja kansainvälisesti hyväksytyistä menetelmistä, jotka osoittavat voimakkaasti ärsyttävän vaikutuksen ihoon

Vakavaa ihoärsytystä aiheuttava

Oletetaan silmiä ärsyttäväksi. Testiä ei tarvita.

 

 

Tietoja ei saatavilla tai saatavat tiedot eivät mahdollista lopullista johtopäätöstä

 

 

 

 

2

Suorita silmäsyövyttävyyden/-ärsyttävyyden SAR-arviointi

Ennustaa vakavia silmävaurioita

Oletetaan silmiä syövyttäväksi. Testiä ei tarvita.

Ennustaa silmä-ärsytystä

Oletetaan silmiä ärsyttäväksi. Testiä ei tarvita.

Harkitse ihoärsyttävyyden SAR-arviointia

Ennustaa ihosyövyttävyyttä

Oletetaan silmiä syövyttäväksi. Testiä ei tarvita.

 

 

Ennusteita ei voida tehdä tai ennusteet ovat negatiivisia tai eivät mahdollista lopullista johtopäätöstä

 

 

 

 

3

Mittaa pH (puskurointikyky tarpeen mukaan)

pH ≤ 2 tai ≥ 11,5 (suuri puskurointikyky, jos relevanttia)

Oletetaan silmiä syövyttäväksi. Testiä ei tarvita.

 

 

2 < pH < 11,5, tai pH ≤ 2,0 tai ≥ 11,5 ja puskurointikyky alhainen tai olematon, jos relevanttia

 

 

 

 

4

Tarkastele olemassa olevia ihon kautta saatuun systeemiseen toksisuuteen liittyviä tietoja

Erittäin toksinen silmätestauksissa käytettävinä pitoisuuksina.

Kemikaali on liian toksinen testattavaksi. Testiä ei tarvita.

 

 

Mainittuja tietoja ei ole saatavilla tai kemikaali ei ole erittäin toksinen

 

 

 

 

5

Arvioi kokeellisesti ihosyövyttävyyden mahdollisuutta tässä liitteessä olevan B.4 luvun testimenetelmän mukaisesti, jos tätä tarvitaan sääntelytarkoituksiin

Syöpymisvaste tai vakava ärsytysvaste

Oletetaan silmiä syövyttäväksi. Jatkotestiä ei tarvita.

 

 

Aine ei ole syövyttävä tai vakavasti ihoa ärsyttävä

 

 

 

 

6

Suorita validoituja ja hyväksyttyjä in vitro tai ex vivo -silmätestejä.

Syöpymisvaste tai vakava ärsytysvaste

Oletetaan syövyttäväksi tai vakavasti ärsyttäväksi silmille, mikäli suoritettua testiä voidaan käyttää tunnistamaan oikein syövyttävät/vakavasti ärsyttävät kemikaalit, ja kemikaali on testin sovellusalan piirissä. Jatkotestiä ei tarvita.

Ärsytysvaste

Oletetaan ärsyttäväksi silmille, mikäli suoritettua testiä voidaan käyttää tunnistamaan oikein syövyttävät/vakavasti ärsyttävät ja ärsyttävät kemikaalit, ja kemikaali on testin sovellusalan piirissä. Jatkotestiä ei tarvita.

Ei-ärsyttävä vaste

Oletetaan ei-ärsyttäväksi silmille, mikäli suoritettua testiä voidaan käyttää tunnistamaan oikein ei-ärsyttävät aineet ja erottaa ne oikein kemikaaleista, jotka ovat ärsyttäviä, vakavasti ärsyttäviä tai silmää syövyttäviä aineita, ja kemikaali on testin sovellusalan piirissä. Jatkotestiä ei tarvita.

 

 

Validoituja ja hyväksyttyjä in vitro- tai ex vivo -silmätestejä ei voida käyttää päätelmän tekemiseksi

 

 

 

 

7

Suorita in vivo -alkutesti yhdelle kaniinille silmävaikutuksen toteamiseksi

Vakavia silmävaurioita

Katsotaan silmiä syövyttäväksi. Jatkotestiä ei tarvita.

 

 

Ei vakavia vaurioita tai ei vastetta

 

 

 

 

8

Suorita vahvistustesti vielä yhdelle tai kahdelle eläimelle

Syövyttävä tai ärsyttävä

Katsotaan silmiä syövyttäväksi tai ärsyttäväksi. Jatkotestiä ei tarvita.

Ei syövyttävä eikä ärsyttävä

Katsotaan, että aine ei ole ärsyttävä eikä syövyttävä. Jatkotestiä ei tarvita.

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Pidetty Solnassa, Ruotsissa, 22.–24. tammikuuta 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, marraskuu 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3)

Worth A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, s. 161–177.

(4)

Tässä liitteessä oleva B.4 luku, Akuutti toksisuus: ihoärsyttävyys/-syövyttävyys.

(5)

Young, J. R., How, M. J., Walker, A. P., Worth W. M. H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In vitro, 2, 19–26.

(6)

Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxic. Toxicology in vitro 12, s.483–524.

(7)

Neun, D. J. (1993). Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.

(8)

Tässä liitteessä olevaan B.4 lukuun tehty lisäys, ihoärsyttävyyden ja -syövyttävyyden vaiheittainen tutkimusmenettely.

(9)

Tässä liitteessä oleva B.40 luku, In vitro -ihosyövyttävyys: ihon sähkövastusmääritystesti (TER).

(10)

Tässä liitteessä oleva B.40 a luku, In vitro -ihosyövyttävyys: ihmisihomallitesti.

(11)

OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.

(12)

Tässä liitteessä oleva B.47 luku, naudan sarveiskalvon sameutta ja läpäisevyyttä koskeva testimenetelmä silmää syövyttävien ja silmää vakavasti ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi.

(13)

Tässä liitteessä oleva B.48 luku, eristettyä kanan silmää käyttävä testimenetelmä silmää syövyttävien ja silmää vakavasti ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi.”

3)

Korvataan B osassa oleva B.10 luku seuraavasti:

”B.10    In vitro-kromosomipoikkeavuustesti nisäkässoluilla

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 473 (2016). Se on osa geneettisen toksikologian testimenetelmiä. On laadittu OECD:n asiakirja, jossa ytimekkäitä tietoja geneettistä toksikologiaa koskevista testeistä sekä katsaus näihin testimenetelmiin tehtyihin viimeaikaisiin muutoksiin (1).

In vitro -kromosomipoikkeavuustestin tarkoituksena on tunnistaa kemikaalit, jotka aiheuttavat rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia viljellyissä nisäkässoluissa (2) (3) (4). Rakenteelliset poikkeavuudet jakautuvat kahteen tyyppiin, kromosomi- ja kromatidipoikkeavuuksiin. Polyploidiaa (mukaan lukien endoreduplikaatio) voi aiheutua kromosomipoikkeavuutta koskevissa määritysmenetelmissä in vitro. Aneugeenit voivat aiheuttaa polyploidiaa; polyploidia ei yksinään osoita aneugeenistä mahdollisuutta, se voi yksinkertaisesti osoittaa solysyklin häiriön tai sytotoksisuuden (5). Tätä testiä ei ole suunniteltu mittaamaan aneuploidiaa, vaan aneuploidian havaitsemiseen on suositeltavaa käyttää in vitro -mikrotumatestiä (6).

In vitro -kromosomipoikkeavuustestissä voidaan käyttää ihmisen tai jyrsijän pysyvien solulinjojen tai solukantojen viljelmiä. Käytettävät solut on valittava sen mukaan, mikä on solujen kasvukyky viljelmässä, karyotyypin pysyvyys, (mukaan lukien kromosomiluku) ja kromosomipoikkeavuuksien spontaanifrekvenssi (7). Tällä hetkellä käytettävissä olevien tietojen perusteella ei voida esittää vankkoja suosituksia, vaan todeta, että kemiallisten vaarojen arvioinnissa on tärkeää ottaa huomioon p53-status, geneettinen (karyotyypin) pysyvyys, DNA:n korjaantumiskapasiteetti ja testaukseen valittujen solujen alkuperä (jyrsijä tai ihminen). Tämän testimenetelmän käyttäjiä kehotetaan siten harkitsemaan näiden ja muiden solujen ominaisuuksien vaikutusta solulinjan kykyyn havaita kromosomipoikkeavuuksien induktio, kun tietoa saadaan lisää tällä alalla.

Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.

ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT JA RAJOITUKSET

In vitro -testit edellyttävät yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää, ellei solujen metabolia sovellu kyseisiin testikemikaaleihin. Eksogeeninen metabolinen aktivaatiojärjestelmä ei täysin jäljittele in vivo -olosuhteita. On huolehdittava, että vältetään olosuhteet, jotka voisivat johtaa vääriin positiivisiin tuloksiin, toisin sanoen kromosomivaurioihin, jotka eivät johdu testikemikaalien ja kromosomien suorasta vuorovaikutuksesta; tällaisiin olosuhteisiin sisältyvät pH:n tai osmolaalisuuden muutokset (8) (9) (10), yhdysvaikutus väliaineen komponenttien kanssa (11) (12) tai liian korkeat sytotoksisuustasot (13) (14) (15) (16).

Tätä testiä käytetään havaitsemaan klastogeenisistä tapahtumista mahdollisesti johtuvat kromosomipoikkeavuudet. Kromosomipoikkeavuuden induktion analyysi on tehtävä metafaasissa olevia soluja käyttämällä. Siksi on tärkeää, että solujen pitäisi edetä mitoosiin sekä käsitellyissä että käsittelemättömissä viljelmissä. Valmistettujen nanomateriaalien osalta tähän testimenetelmään voidaan joutua tekemään erityisiä mukautuksia, mutta niitä ei ole kuvattu tässä testimenetelmässä.

Ennen kuin testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen tietojen tuottamiseksi aiottuun sääntelytarkoitukseen, on harkittava, antaako se asianmukaiset tulokset tämän tavoitteen kannalta, ja jos antaa, miksi. Tällaista harkintaa ei tarvita, jos seoksen testaamista edellytetään sääntelyvaatimuksissa.

TESTIN PERIAATE

Ihmis- tai muut nisäkäsperäiset soluviljelmät altistetaan testikemikaalille sekä eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän kanssa että ilman sitä, paitsi jos testissä käytetään soluja, joiden metabolointikyky on riittävä (ks. 13 kohta). Sen jälkeen kun soluviljelmien altistus testikemikaalille aloitetaan, ne käsitellään sopivin etukäteen määrätyin välein metafaasin pysäyttävällä kemikaalilla (esim. colcemidilla tai kolkisiinilla), solut kerätään ja värjätään, ja metafaasissa olevat solut analysoidaan mikroskooppisesti kromatidityyppisten ja kromosomityyppisten poikkeavuuksien havaitsemiseksi.

MENETELMÄN KUVAUS

Valmisteet

Solut

Testissä voidaan käyttää erilaisia solulinjoja (esim. kiinanhamsterin munasarjat (CHO), kiinanhamsterin keuhkot V79, kiinanhamsterin keuhkot (CHL)/IU, TK6) tai primaarisia soluviljelmiä, myös ihmisen tai muun nisäkkään perifeerisen veren lymfosyyttejä (7). Käytettyjen solulinjojen valintaa on perusteltava tieteellisesti. Kun primaarisoluja käytetään, on käytettävä mahdollisuuksien mukaan ihmisestä peräisin olevia primaarisoluja, ja näytteet on otettava humaanien eettisten periaatteiden ja sääntöjen mukaisesti. Ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit on saatava nuorilta (noin 18–35-vuotiailta), terveiltä ja tupakoimattomilta henkilöiltä, joiden ei tiedetä altistuneen äskettäin genotoksisille aineille (esim. kemikaaleille tai ionisoivalle säteilylle) sellaisilla tasoilla, jotka lisäisivät kromosomaalisten poikkeavuuksien taustaesiintyvyyttä. Tällä varmistetaan, että kromosomaalisten poikkeavuuksien taustaesiintyvyys on matala ja johdonmukainen. Kromosomaalisten poikkeavuuksien esiintyminen perustasolla lisääntyy iän myötä, ja tämä suuntaus on naisilla selvempi kuin miehillä (17) (18). Jos soluja kerätään useammalta kuin yhdeltä luovuttajalta, luovuttajien lukumäärä on ilmoitettava. On osoitettava, että solut ovat jakaantuneet testikemikaalilla käsittelyn aloittamisen ja solujen keräämisen välillä. Soluviljelmät pidetään eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa (solulinjat) tai niitä stimuloidaan jakaantumaan (lymfosyyttien primaariset viljelmät), jotta solut altistetaan solusyklin eri vaiheissa, koska soluasteiden herkkyys testikemikaaleille ei ole ehkä tiedossa. Primaarisolut, joita on stimuloitava jakaantumaan mitogeenisilla aineilla, eivät yleensä ole enää synkronoituja testikemikaalille altistamisen aikana (esim. ihmisen lymfosyytit 48 tuntia kestävän mitogeenisen stimulaation jälkeen). Synkronoitujen solujen käyttöä käsittelyn aikana ei suositella, mutta se voidaan perustelluissa tapauksissa hyväksyä.

Kasvatusväliaineet ja viljelyolosuhteet

Soluviljelmiä on viljeltävä soveltuvassa kasvatusväliaineessa ja inkubaatio-olosuhteissa (kasvatusastiat, tarvittaessa kosteutettu ilma, jonka CO2-pitoisuus on 5 prosenttia, 37 °C:n inkubointilämpötila). Solulinjoista on tarkistettava ajoittain modaalisen kromosomimäärän pysyvyys ja varmistettava, ettei mykoplasmakontaminaatiota esiinny (7) (19); soluja ei pidä käyttää, jos ne ovat kontaminoituneet tai jos modaalinen kromosomimäärä on muuttunut. Normaali solusyklin kesto testauslaboratoriossa käytetyissä solulinjoissa tai primaarisissa soluviljelmissä on määritettävä ja sen on oltava solujen julkaistujen ominaisuuksien mukainen (20).

Soluviljelmien valmistelu

Solulinjat: solut kasvatetaan kantaviljelmistä ja kylvetään kasvatusväliaineeseen sellaiseen tiheyteen, että suspensiossa tai yksikerrosviljelmässä olevat solut kasvavat eksponentiaalisesti keräämisajankohtaan asti (esimerkiksi konfluenssia on vältettävä yksikerrosviljelmissä kasvavien solujen osalta).

Lymfosyytit: antikoagulantilla (esimerkiksi hepariinilla) käsiteltyä kokoverta tai erotettuja lymfosyyttejä viljellään (esim. 48 tunnin ajan ihmisen lymfosyyttien osalta) mitogeenin [esim. fytohemagglutiniini (PHA), kun kyse on ihmisen lymfosyyteistä] kanssa, solunjakautumisen aikaansaamiseksi ennen testikemikaalille altistamista.

Metabolinen aktivaatio

Jos solujen endogeeninen metabolointikyky ei ole riittävä, on käytettävä eksogeenisia metabolisia järjestelmiä Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjestelmä, jota suositellaan oletusarvoisesti, ellei toisin toimiminen ole perusteltua, on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten Aroclor 1254:llä (21) (22) (23) tai fenobarbitaalin ja ß-naftoflavonin (24) (25) (26) (27) (28) (29) yhdistelmällä käsiteltyjen jyrsijöiden (yleensä rottien) maksasta eristetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria. Jälkimmäisenä mainittu yhdistelmä ei ole ristiriidassa pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskevan Tukholman yleissopimuksen kanssa (30), ja sen on osoitettu indusoivan sekaoksidaasia yhtä tehokkaasti kuin Aroclor 1254 (24) (25) (26) (28). S9-jakeen yleisesti käytetty pitoisuusalue on 1–2 tilavuusprosenttia, mutta sen pitoisuutta voidaan nostaa 10 tilavuusprosenttiin lopullisessa testiväliaineessa. Mitoosi-indeksiä vähentäviä tuotteita, erityisesti kalsiumiakomplekseja aiheuttavia tuotteita (31) on vältettävä käsittelyn aikana. Testattavien kemikaalien luokka saattaa vaikuttaa siihen, mitä eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän tai metabolisen indusoijan tyyppiä ja pitoisuutta päätetään käyttää.

Testikemikaalin valmistus

Kiinteät testikemikaalit on valmistettava sopivissa liuottimissa ja tarvittaessa laimennettava ennen solujen käsittelyä (ks. 23 kohta). Nestemäiset kemikaalit voidaan lisätä suoraan koejärjestelmiin ja/tai laimentaa ennen testijärjestelmän käsittelyä. Kaasujen tai haituvien kemikaalien testauksessa standardimenettelyihin on tehtävä asianmukaisia mukautuksia. Kyseiset kaasut tai kemikaalit on esimerkiksi käsiteltävä suljetuissa astioissa (32) (33) (34). Testikemikaali on valmisteltava juuri ennen käsittelyä, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä.

Testiolosuhteet

Liuottimet

Liuotin on valittava siten, että testikemikaalien liukoisuus on mahdollisimman hyvä eikä se haittaa testin suorittamista esimerkiksi muuttamalla solukasvua, vaikuttamalla testikemikaalin eheyteen, reagoimalla viljelyastioiden kanssa tai haittaamalla metabolista aktivaatiojärjestelmää. Vesipitoisen liuottimen (tai viljelynesteen) käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Vakiintuneita liuottimia ovat esimerkiksi vesi tai dimetyylisulfoksidi. Yleensä orgaanisten liuottimien osuus ei saa ylittää yhtä ja vesipitoisten liuottimien (suolaliuos tai vesi) kymmentä tilavuusprosenttia lopullisessa kasvatusväliaineessa. Jos käytetään muita kuin vakiintuneita liuottimia (esim. etanolia tai asetonia), niiden käyttö on perusteltava tiedoilla, joilla osoitetaan, että ne ja testikemikaali sekä testijärjestelmä sopivat yhteen ja etteivät ne ole genotoksisia käytettyinä pitoisuuksina. Tällaisten perustelevien tietojen puuttuessa on tärkeää käyttää käsittelemättömiä kontrolleja (ks. lisäys 1), jotka osoittavat, ettei valittu liuotin aiheuta mitään haitallisia tai klastogeenisiä vaikutuksia.

Solujen proliferaation ja sytotoksisuuden mittaaminen ja käsittelypitoisuuksien valitseminen

Päätettäessä suurimmasta testikemikaalin pitoisuudesta on vältettävä pitoisuuksia, jotka voivat aiheuttaa vääriä positiivisia vasteita, kuten liian voimakasta sytotoksisuutta (ks. 22 kohta), saostumista väliaineeseen (ks. 23 kohta) tai pH-arvon tai osmolaliteetin merkittävää muuttumista (ks. 5 kohta). Jos testikemikaali aiheuttaa sitä lisättäessä väliaineen pH-arvon merkittävän muutoksen, pH-arvoa voidaan mukauttaa puskuroimalla lopullinen käsittelyväliaine väärien myönteisten tulosten välttämiseksi ja asianmukaisten viljelyolosuhteiden säilyttämiseksi.

Solujen proliferaation mittauksella varmistetaan, että riittävässä määrässä käsiteltyjä soluja on tapahtunut mitoosi testin aikana ja että käsittelyissä on käytetty asianmukaisia sytotoksisuustasoja (ks. 18 ja 22 kohta). Sytotoksisuus on määritettävä pääasiallisessa kokeessa sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä käyttäen asianmukaisia solukuoleman ja solukasvun indikaattoreita. Vaikka sytotoksisuuden arviointi alustavassa testissä saattaa olla hyödyllinen, jotta voidaan määrittää pääasiallisessa kokeessa käytettävät pitoisuudet, alustava testi ei ole pakollinen. Jos se tehdään, se ei saa korvata sytotoksisuuden mittausta pääasiallisessa kokeessa.

Populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen (PSK) tai solumäärän suhteellinen lisääntyminen (SMSL) ovat sopivia menetelmiä sytotoksisuuden arviointiin sytogeneettisissä testeissä (13) (15) (35) (36) (55) (ks. kaavojen osalta lisäys 2). Mikäli kyse on pitkäaikaisesta käsittelystä ja näytteenottoajoista sen jälkeen kun on aloitettu käsittely, joka on pidempi kuin 1,5 normaalin solusyklin kesto (ts. yhteensä yli 3 solusykliä), PSK:ssa voidaan aliarvioida sytotoksisuus (37). Tällaisissa olosuhteissa SLSM saattaa olla parempi mittari, tai sytotoksisuuden arviointi 1,5 normaalia solusyklia vastaavan ajan jälkeen on hyödyllinen arvio PSK:ta käyttäen.

Kun kyse on lymfosyyteistä primaariviljelmissä, vaikka mitoosi-indeksi (MI) on sytotoksisten/sytostaattisten vaikutusten mitta, siihen vaikuttavat käsittelyn jälkeinen mittausaika, käytetty mitogeeni ja mahdolliset solusyklin häiriöt. MI on kuitenkin hyväksyttävä, koska muut sytotoksisuuden mitat saattavat olla hankalia ja epäkäytännöllisiä ja niitä ei mahdollisesti voida soveltaa PHA-stimulaation vaikutuksesta kasvavien lymfosyyttien kohdepopulaatioon.

Vaikka SMSL ja PSK solulinjojen tapauksessa ja MI primaarisissa lymfosyyttiviljelmissä ovat suositeltuja sytotoksisuuden parametrejä, muillakin indikaattoreilla (esim. solujen eheys, apoptoosi, nekroosi, solusykli) voidaan antaa hyödyllistä lisätietoa.

Vähintään kolmea hyväksyttävyysperusteet (asianmukainen sytotoksisuus, solumäärä jne.) täyttävää testipitoisuutta (pois lukien liuotinkontrolli ja positiiviset kontrollit) on arvioitava. Solujen tyypistä riippumatta (solulinjat tai primaariset lymfosyyttiviljelmät) kullekin testattavalle pitoisuudelle voidaan altistaa kaksi rinnakkaista viljelmää tai vain yksi viljelmä. Vaikka rinnakkaisten viljelmien käyttö on suositeltavaa, vain yhden viljelmän käyttö on myös hyväksyttävää edellyttäen, että yksittäisestä viljelmästä tai rinnakkaisviljelmistä lasketaan sama kokonaismäärä soluja. Yhden viljelmän käyttö on erityisen merkityksellistä, kun arvioidaan useampaa kuin kolmea pitoisuutta (ks. 31 kohta). Riippumattomista rinnakkaisviljelmistä tietyllä pitoisuudella saadut tulokset voidaan yhdistää analyysia varten (38). Sellaisten testikemikaalien kohdalla, jotka osoittavat vähän tai eivät lainkaan sytotoksisuutta, sopiva pitoisuuksien välinen kerroin on yleensä 2–3. Jos sytotoksisuutta esiintyy, valittujen testipitoisuuksien on katettava vaihteluväli 22 kohdassa kuvatusta sytotoksisuudesta vähäiseen sytotoksisuuteen tai tasoon, jolla sytotoksisuutta ei esiinny lainkaan. Monien testikemikaalien pitoisuus-vastekäyrä on jyrkkä, ja tietojen saamiseksi vähäisestä ja keskitason sytotoksisuustasosta tai annosvastesuhteen tutkimiseksi tarkasti on käytettävä pitoisuuksia, jotka ovat lähempänä toisiaan, ja/tai useampaa kuin kolmea pitoisuutta (yksittäisiä viljelmiä tai rinnakkaisviljelmiä) erityisesti tilanteissa, joissa tarvitaan toistettuja kokeita (ks. 47 kohta).

Jos enimmäispitoisuus perustuu sytotoksisuuteen, suurimmassa pitoisuudessa sytotoksisuuden on oltava 55 ± 5 % käyttäen suositeltuja sytotoksisuuden parametrejä (solulinjojen SMSL:n ja PSK:n pieneneminen ja MI:n pieneneminen lymfosyyttien primaariviljelmissä 45 ± 5 %:iin rinnakkaisesta negatiivisesta kontrollista). On tulkittava varovaisesti positiivisia tuloksia, jotka on havaittu ainoastaan tämän sytotoksisuuden 55 ± 5 %:n vaihteluvälin yläpäässä (13).

Sellaisten huonosti liukenevien testikemikaalien kohdalla, jotka eivät ole sytotoksisia pienintä liukenematonta pitoisuutta pienemmissä pitoisuuksissa, suurimmassa analysoitavassa pitoisuudessa on esiinnyttävä testikemikaalilla käsittelyn päättyessä silmin tai käänteismikroskoopilla nähtävää sameutta tai saostumista. Vaikka sytotoksisuutta esiintyy pienintä liukenematonta pitoisuutta pienemmissä pitoisuuksissa, on suositeltavaa testata ainoastaan yksi sameutta tai näkyvää saostumista tuottava pitoisuus, koska saostuminen saattaa aiheuttaa vääriä vasteita. Saostumista aiheuttavissa pitoisuuksissa on huolehdittava siitä, ettei saostuminen vaikuta testin suorittamiseen (esim. värjäykseen tai pisteytykseen). Ennen koetta saattaa olla hyödyllistä määrittää liukoisuus soluviljelmän elatusaineeseen.

Jos ei havaita saostumista tai rajoittavaa sytotoksisuutta, suurimman testipitoisuuden on vastattava tasoa 10 mM, 2 mg/ml tai 2 μl/ml sen mukaan, mikä pitoisuuksista on pienin (39) (40) (41). Jos testikemikaalin koostumusta ei ole määritelty eli se on esimerkiksi koostumukseltaan tuntematon tai vaihteleva aine, kompleksien reaktiotuote tai biologinen materiaali (UVCB) (42) taikka ympäristöstä otettu näyte, suurimman pitoisuuden on riittävän sytotoksisuuden puuttuessa ehkä oltava suurempi (esim 5 mg/ml) kunkin osan pitoisuuden lisäämiseksi. On kuitenkin huomattava, että nämä vaatimukset voivat vaihdella ihmisille tarkoitettujen lääkkeiden osalta (43).

Kontrollit

Jokaisena solujen keräämisajankohtana on otettava rinnakkaiset negatiiviset kontrollit (ks. 15 kohta), jotka koostuvat pelkästään tutkittavaa ainetta sisältävässä kasvatusväliaineessa olevasta liuottimesta ja joita on käsitelty samalla tavoin kuin altistettuja viljelmiä.

Samanaikaisia positiivisia kontrolleja tarvitaan osoittamaan laboratorion kyky tunnistaa klastogeenejä käytetyn testisuunnitelman olosuhteissa sekä eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän tehokkuus, kun tämä on tarpeen. Esimerkkejä positiivisista kontrolleista esitetään alla olevassa taulukossa 1. Vaihtoehtoisia positiivisia kontrollikemikaaleja voidaan käyttää perustelluissa tapauksissa. Koska nisäkässoluilla tehtävät in vitro -geenimutaatiotestit ovat riittävän standardoidut, positiivisten kontrollien käyttö voi rajoittua klastogeeniin, joka vaatii metabolista aktivaatiota. Jos tämä tehdään samanaikaisesti ei-aktivoidun testin kanssa samaa annostelukestoa soveltaen, tämä yksittäinen positiivinen kontrollivaste osoittaa sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän aktiivisuuden että testausjärjestelmän herkkyyden. Pitkäaikaisessa käsittelyssä (ilman S9-jaetta) on kuitenkin oltava oma positiivinen kontrollinsa, koska käsittelyn kesto poikkeaa testistä, jossa käytetään metabolista aktivointia. Kutakin positiivista kontrollikemikaalia on käytettävä yhtenä tai useampana pitoisuutena, joiden voidaan odottaa aiheuttavan toistettavissa ja havaittavissa oleva lisääntyminen taustaan verrattuna. Näin voidaan osoittaa testausjärjestelmän herkkyys (vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen objektilasien identiteettiä), ja tässä testimenetelmässä määritetyt raja-arvot ylittävä sytotoksisuustaso ei saa vaarantaa vasteen luotettavuutta.

Taulukko 1

Vertailukemikaalit, joita suositellaan laboratorion pätevyyden arvioimiseksi ja positiivisten kontrollien valintaan

Luokka

Kemikaali

CAS-nro

1.   

Klastogeenit, jotka ovat aktiivisia ilman metabolista aktivaatiota

 

Metyylimetaanisulfonaatti

66-27-3

 

Mitomysiini C

50-07-7

 

4-nitrokinoliini-N-oksidi

56-57-5

 

Sytosiiniarabinosidi

147-94-4

2.   

Klastogeenit, jotka edellyttävät metabolista aktivaatiota

 

Bentso(a)pyreeni

50-32-8

 

Syklofosfamidi

50-18-0

MENETTELY

Käsittely testikemikaalilla

Lisääntyvät solut altistetaan testikemikaalille metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa ja ilman sitä.

Näytteiden keräämisajankohdat

Negatiivisen tuloksen vahvistamiseksi tarvittavaa perusteellista arviointia varten testi on kuitenkin suoritettava kaikissa seuraavissa kolmessa testiolosuhteissa käyttäen lyhytaikaista käsittelyä metabolisen aktivointijärjestelmän kanssa ja ilman sitä sekä pitkäaikaista käsittelyä ilman metabolista aktivointia (ks. 43, 44 ja 45 kohta):

soluja on altistettava testikemikaalille sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa että ilman sitä 3–6 tunnin ajan, ja näytteet kerätään suunnilleen 1,5 normaalin solusyklin kuluttua altistuksen aloittamisesta (18)

soluja on altistettava testikemikaalille metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa 3–6 tunnin ajan, ja näytteet kerätään suunnilleen 1,5 normaalin solusyklin kuluttua altistuksen aloittamisesta (18)

soluja on altistettava jatkuvasti ilman metabolista aktivaatiojärjestelmää näytteenottoon saakka, joka tehdään suunnilleen 1,5 normaalin solusyklin kuluttua. Tietyt kemialliset aineet (esim. nulkeosidianalogit) saatetaan havaita helpommin, kun altistus/näytteenottoaika on pitempi kuin 1,5 normaalia solusykliä (24).

Jos jokin edellä mainituista testiolosuhteista johtaa positiiviseen vasteeseen, muita altistusohjelmia ei ole välttämättä tarpeen tutkia.

Kromosomipreparaattien valmistus

Soluviljelmiä käsitellään colcemidilla tai kolkisiinilla yleensä 1–3 tunnin ajan ennen näytteiden keräämistä. Jokaisen viljelmän näytteet kerätään ja käsitellään erikseen kromosomipreparaattien valmistusta varten. Kromosomipreparaattien valmistukseen kuuluu solujen hypotoninen käsittely, fiksointi ja värjäys. Yhden solun vahvuisissa kerroksissa voi esiintyä mitoosissa olevia soluja (pyöreitä, irtoavat pinnasta) 3–6 tuntia kestävän käsittelyn päättyessä. Koska mitoosissa olevat solut irtoavat helposti, ne voivat hävitä testikemikaalia sisältävän väliaineen mukana, kun se kaadetaan pois. Jos mitoosissa olevien solujen määrän havaitaan lisääntyvän huomattavasti kontrolleihin verrattuna, mikä viittaa todennäköisesti mitoosin pysähtymiseen, solut on kerättävä sentrifugoimalla ja palautettava viljelmiin, jotta mitoosivaiheessa olevia soluja, joissa kromosomipoikkeavuuksia voi muodostua, ei menetetä keruuvaiheessa.

Analyysi

Kaikki objektilasit, myös positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen mikroskooppitutkimusta kromosomipoikkeavuuksista. Koska fiksaatio johtaa usein joidenkin metafaasissa olevien solujen kromosomien menettämiseen, lasketuissa soluissa tulisi olla sentromeerejä modaalista lukumäärää vastaava määrä ± 2.

Kustakin pitoisuudesta ja kontrollista on laskettava vähintään 300 hyvin levinnyttä metafaasia sen päättelemiseksi, että testikemikaali on selvästi negatiivinen (ks. 45 kohta). Nämä 300 solua jaetaan tasan rinnakkaisnäytteisiin, jos käytetään rinnakkaisviljelmiä. Jos käytetään yhtä viljelmää pitoisuutta kohti (ks. 21 kohta), viljelmästä on laskettava vähintään 300 hyvin levinnyttä metafaasia. Tämän 300 solun laskennan ansiosta testin tilastollista voimaa lisätään ja lisäksi nolla-arvoja havaitaan harvoin (niitä oletetaan olevan vain viisi prosenttia) (44). Laskettujen metafaasien määrää voidaan vähentää, kun havaitaan korkea määrä soluja, joissa on kromosomipoikkeavuuksia ja testikemikaalia pidetään selkeästi positiivisena.

Solut, joissa on rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia mukaan lukien ja ilman aukkoja (gaps), lasketaan. Katkeamiset (breaks) ja aukot määritellään liitteessä 1 lähteiden (45) ja (46) perusteella. Kromatidityyppiset ja kromosomityyppiset poikkeavuudet on kirjattava erikseen ja luokiteltava alatyypin mukaan (katkeamiset, vaihdokset). Laboratoriossa käytettävillä menettelyillä varmistetaan, että kromosomipoikkeavuuden analyysin tekevät hyvin koulutetut laskijat ja niitä vertaisarvioidaan tarvittaessa.

Vaikka testillä pyritään ensisijaisesti toteamaan rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet, on tärkeää rekisteröidä myös polyploidian ja endoreduplikaation esiintymistaajuudet, mikäli näitä esiintyy. (Ks. 2 kohta).

Laboratorion pätevyys

Jotta voidaan vahvistaa riittävä kokemus testin suorittamisesta ennen kuin sitä käytetään rutiinitestaukseen, laboratoriossa on teetettävä sarja kokeita positiivisilla vertailukemikaaleilla, jotka toimivat eri mekanismien kautta, ja erilaisia negatiivisia kontrolleja (käyttäen erilaisia liuottimia/kantaja-aineita). Näiden positiivisten ja negatiivisten kontrollien vasteiden on oltava lähdekirjallisuuden mukaisia. Tätä ei sovelleta laboratorioihin, joilla on kokemusta, eli joista on 37 kohdassa määritelty laboratoriokohtainen tietokanta.

Tiettyjä positiivisia kontrollikemikaaleja (ks. 26 kohdassa oleva taulukko 1) on tutkittava lyhyillä ja pitkillä käsittelyillä ilman metabolista aktivaatiota, ja myös lyhyellä käsittelyllä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa, jotta pätevyys havaita klastogeenisia kemikaaleja osoitetaan ja metabolisen aktivaatiojärjestelmän tehokkuus määritetään. Valittujen kemikaalien eri pitoisuudet valitaan siten, että ne aiheuttavat toistettavissa olevia ja pitoisuuteen liittyviä lisääntymisiä taustaan verrattuna, koejärjestelmän herkkyyden ja dynaamisen alueen osoittamiseksi.

Aiemmat kontrollitiedot

Laboratorion on määritettävä:

aiempien positiivisten kontrollien vaihteluväli ja jakauma

aiempien negatiivisten kontrollien (käsittelemättömien ja liuotinkontrollien) vaihteluväli ja jakauma.

Kun ensimmäisen kerran saadaan tietoja aiemman negatiivisen kontrollin jakaumasta, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien pitäisi olla julkaistujen kontrollitietojen mukaisia, jos sellaisia on olemassa. Kun kontrollin jakaumaan lisätään enemmän kokeellista tietoa, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien tulisi mieluiten sijoittua kyseisen jakauman 95 %:n kontrollirajojen sisälle (44) (47). Laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokanta on aluksi luotava vähintään 10 kokeelle, mutta sen olisi mieluiten koostuttava vähintään 20 kokeesta, jotka on suoritettu vastaavissa koeolosuhteissa. Laboratorioiden on käytettävä laadunvalvontamenetelmiä, kuten valvontakortteja (esim. C-kortteja tai X-bar-kortteja (48)), positiivisten ja negatiivisten kontrollitietojensa vaihtelevuuden määrittämiseksi ja osoittaakseeen, että laboratorio ”hallitsee” menetelmän (44). Lisäsuosituksia aikaisempien tietojen muodostamisesta ja käytöstä (esimerkiksi perusteet tietojen sisällyttämiseksi aikaisempiin tietoihin tai jättämiseksi pois niistä sekä kokeiden hyväksyttävyysperusteet) annetaan lähdekirjallisuudessa (47).

Mahdollisissa koejärjestelyn muutoksissa on otettava huomioon järjestelyn yhdenmukaisuus laboratorion olemassa olevien aikaisempia kontrolleja koskevan tietokannan kanssa. Jos havaitaan merkittäviä epäjohdonmukaisuuksia, on luotava uusi aikaisempien kontrollien tietokanta.

Negatiivisten kontrollitietojen tulisi koostua kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen esiintymistaajuudesta yhdessä viljelmässä tai rinnakkaisten viljelmien summasta, kuten 21 kohdassa kuvataan. Rinnakkaisten negatiivisten kontrollien olisi mieluiten sijoituttava laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokannan 95 %:n kontrollirajojen sisälle (44) (47). Jos rinnakkaisia negatiivisia kontrolleja koskevat tiedot jäävät 95 %:n kontrollirajojen ulkopuolelle, ne voidaan hyväksyä aikaisemman kontrollien jakaumaan edellyttäen, etteivät ne ole äärimmäisiä harha-arvoja ja on näyttöä siitä, että testijärjestelmä on ”hallinnassa” (ks. 37 kohta), sekä siitä, ettei kyse ole teknisestä tai inhimillisestä virheestä.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten esittäminen

On arvioitava niiden solujen prosenttiosuus, joissa on kromosomipoikkeavuuksia. Kromatidityyppiset ja kromosomityyppiset poikkeavuudet (katkeamiset, vaihdokset) on lueteltava erikseen ja niiden lukumäärät ja esiintymistaajuudet altistetuissa viljelmissä ja kontrolliviljelmissä on mainittava. Aukot (gaps) rekisteröidään erikseen ja raportoidaan, mutta niitä ei lasketa mukaan kromosomipoikkeavuuksien kokonaistaajuuteen. Polyploidian ja/tai endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävien solujen prosenttiosuus raportoidaan, kun tämä havaitaan.

Lisäksi pääasiallisissa kromosomipoikkeavuustesteissä on rekisteröitävä kaikissa testiviljelmissä sekä negatiivisissa ja positiivisissa kontrolliviljelmissä tehdyt samanaikaiset sytotoksisuusmittaukset.

Kustakin viljelmästä on esitettävä tiedot erikseen. Kaikista tiedoista on lisäksi esitettävä yhteenveto taulukkomuodossa.

Hyväksyttävyysperusteet

Testi hyväksytään seuraavilla perusteilla:

rinnakkainen negatiivinen kontrolli katsotaan hyväksyttäväksi laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokantaan 39 kohdan mukaisesti

rinnakkaisten positiivisten kontrollien (ks. 26 kohta) on indusoitava vasteita, jotka ovat yhteensopivia aikaisempien positiivisten kontrollien tietokannan vasteiden kanssa ja tuotettava tilastollisesti merkittävä lisääntyminen verrattuna rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin

solujen proliferaatiota koskevien kriteereiden on täytyttävä liuotinkontrollissa (17 ja 18 kohta)

testi suoritettiin kaikissa kolmessa koeolosuhteessa, ellei jokin niistä tuottanut positiivisia tuloksia (ks. 28 kohta)

riittävä määrä soluja ja pitoisuuksia on analysoitavissa (31 ja 21 kohta)

suurimman pitoisuuden valintaperusteet vastaavat 22, 23 ja 24 kohdassa kuvattuja perusteita.

Tulosten arviointi ja tulkinta

Mikäli kaikki hyväksyttävyysperusteet täyttyvät, testikemikaali katsotaan selvästi positiiviseksi, jos jossakin tarkastelluista koeolosuhteista (ks. 28 kohta):

a)

vähintään yksi testipitoisuuksista aiheuttaa tilastollisesti merkittävän lisääntymisen verrattuna rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin

b)

lisäys riippuu annoksesta, kun sitä arvioidaan asianmukaisella trenditestillä

c)

jokin tuloksista on aikaisempien negatiivisen kontrollin tietojen jakauman ulkopuolella (esim. Poissonin jakaumaan perustuvat 95 prosentin kontrollirajat; ks. 39 kohta).

Kun kaikki nämä perusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan voivan indusoida kromosomipoikkeavuuksia viljellyissä nisäkässoluissa tässä testijärjestelmässä. Lähdekirjallisuudessa on suosituksia sopivimmille tilastomenetelmille (49) (50) (51).

Mikäli kaikki hyväksyttävyysperusteet täyttyvät, testikemikaali katsotaan selvästi negatiiviseksi, jos kaikissa tarkastelluissa koeolosuhteissa (ks. 28 kohta):

a)

mikään testipitoisuuksista ei aiheuta tilastollisesti merkittävää lisääntymistä verrattuna rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin

b)

pitoisuudesta riippuvaa lisääntymistä ei esiinny asianmukaisella trenditestillä arvioituna

c)

kaikki tulokset ovat aikaisempien negatiivisten kontrollitietojen jakauman sisällä (esimerkiksi Poissonin jakaumaan perustuvat 95 prosentin kontrollirajat; ks. 39 kohta).

Tällöin katsotaan, ettei testikemikaali voi indusoida kromosomipoikkeavuuksia viljellyissä nisäkässoluissa tässä testijärjestelmässä.

Selvästi positiivista tai negatiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa.

Jos vaste ei ole selvästi negatiivinen eikä selvästi positiivinen yllä kuvatulla tavalla tai tuloksen biologisen merkityksellisyyden vahvistaminen kaipaa tukea, tietoja tulee arvioida asiantuntija-arviossa ja /tai lisätutkimuksissa. Lisäsolujen laskeminen (tarvittaessa) tai kokeen toistaminen käyttäen mahdollisesti modifioituja koeolosuhteita (esimerkiksi pitoisuusvälit, muut metaboliset aktivaatiojärjestelmät [kuten S9-jakeen pitoisuus tai alkuperä]) saattaa olla hyödyllistä.

Saatujen tietojen pohjalta ei harvinaisissa tapauksissa lisätutkimustenkaan jälkeen voida saada positiivisia tai negatiivisia tuloksia, ja sen vuoksi testikemikaalin vaste jää epäselväksi.

Polyploidisten solujen määrän suureneminen saattaa osoittaa, että testikemikaaleilla pystytään estämään mitoottisia prosesseja ja aiheuttamaan numeerisia kromosomipoikkeavuuksia (52). Endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävien solujen määrän suureneminen saattaa osoittaa, että testikemikaalit kykenevät estämään solusyklin etenemisen (53) (54) (ks. 2 kohta). Siksi polyploidiset solut ja endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävät solut on rekisteröitävä erikseen.

Testiraportti

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

 

Testikemikaali:

alkuperä, erän numero, viimeinen käyttöpäivä, jos saatavilla

testikemikaalin stabiilius, jos tiedossa

testikemikaalin liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa, jos tiedossa

pH-arvon mittaus, osmolaliteetin ja saostumisen mittaus viljelynesteessä, johon testikemikaalia lisättiin, kun tätä tarvitaan.

 

Yhdestä ainesosasta koostuva aine:

ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut merkitykselliset fysikokemialliset ominaisuudet

kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS-nimi, CAS-numero, SMILES- tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, tarvittaessa ja sen mukaan kun on mahdollista, epäpuhtauksien kemikaaliset tunnistetiedot ja niin edelleen.

 

Useista aineosista koostuvat aineet, koostumukseltaan tuntemattomat tai vaihtelevat aineet ja seokset:

luonnehditaan mahdollisimman tarkoin esimerkiksi sen ainesosien kemiallisten tunnistetietojen (ks. edellä), esiintymistaajuuden ja fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien avulla.

 

Liuotin:

liuottimen valintaperusteet

liuottimen osuus lopullisessa viljelynesteessä on myös ilmoitettava.

 

Solut

solujen tyyppi ja lähde

karyotyypin ominaisuudet ja käytetyn solutyypin soveltuvuus

mykoplasman puuttuminen solulinjojen osalta

solulinjojen osalta tiedot solysyklistä, kaksinkertaistumisajasta tai proliferaatioindeksistä

verenluovuttajien sukupuoli, ikä ja kaikki merkitykselliset tiedot luovuttajasta, tieto siitä, onko testissä altistettu kokoverta vai eristettyjä lymfosyyttejä, käytetty mitogeeni

solulinjojen osalta siirrostusten lukumäärä, jos saatavilla

solulinjojen osalta soluviljelymenetelmät

solulinjojen osalta kromosomien modaalinen lukumäärä.

 

Testiolosuhteet:

metafaasin estämiseen käytetty kemikaali, sen pitoisuus ja solujen altistuksen kesto

testikemikaalin pitoisuus ilmaistuna lopullisena pitoisuutena viljelynesteessä (esim. μg tai mg/mL tai mM viljelynesteessä)

pitoisuuksien ja viljelmien lukumäärän valintaperusteet, joihin sisältyvät esim. sytotoksisuustiedot ja liukoisuusrajoitukset

kasvatusväliaineen koostumus, tarvittaessa hiilidioksidipitoisuus, kosteustaso

viljelynesteeseen lisätyn liuottimen ja testikemikaalin pitoisuus (ja/tai tilavuus)

inkubointilämpötila

inkubointiaika

käsittelyn kesto

käsittelyn jälkeinen keräämisajankohta

solutiheys kylvämisen aikana, tarvittaessa

metabolisen aktivaatiojärjestelmän tyyppi ja koostumus, (S9-jakeen alkuperä, S9-seoksen valmistusmenetelmä, S9-seoksen ja S9-jakeen pitoisuus tai tilavuus lopullisessa viljelynesteessä, S9-jakeen laadunvalvonta)

positiivisen ja negatiivisen kontrollin kemikaalit, kunkin käsittelyolosuhteen lopulliset pitoisuudet

objektilasien preparointimenetelmät ja käytetyt värjäystekniikat

määrityksien hyväksyttävyysperusteet

kromosomipoikkeavuuksien laskentaperusteet

analysoitujen metafaasien lukumäärä

sytotoksisuuden mittausmenetelmät

muut sytotoksisuuteen ja käytettyyn menetelmään liittyvät tiedot

tutkimusten positiivisuuden, negatiivisuuden tai epäselvyyden arviointiperusteet

pH-arvon, osmolaliteetin ja saostumisen määritysmenetelmät.

 

Tulokset:

käsiteltyjen solujen määrä ja kutakin viljelmää varten kerättyjen solujen määrä, kun käytetään solulinjoja

sytotoksisuuden mittaaminen, esim. PSK, SMSL, MI, muut huomautukset, jos niitä on

solulinjojen osalta tiedot solysyklistä, kaksinkertaistumisajasta tai proliferaatioindeksistä

saostumisen merkit ja määrittämisajankohta,

kromosomipoikkeavuuksien, myös aukkojen, määrittely (gaps)

laskettujen solujen lukumäärä, kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen lukumäärä ja kromosomipoikkeavuuksien tyyppi ilmoitetaan kunkin altistetun viljelmän ja kontrolliviljelmän osalta erikseen, mukaan lukien ja ilman aukkoja

ploidian (erikseen mainittavat polyploidiset solut ja endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävät solut) muutokset, jos niitä esiintyy

pitoisuus-vastesuhde, jos mahdollista

rinnakkaisten negatiivisten (liuotin) ja positiivisten kontrollien tiedot (pitoisuudet ja liuottimet)

aikaisemman negatiivisen (liuotin) ja positiivisen kontrollin tiedot, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat, 95 %:n kontrollirajat jakaumille sekä tietojen määrä

tilastoanalyysit; mahdolliset p-arvot.

 

Tulosten tarkastelu.

 

Päätelmät

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Evans, H.J. (1976), Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (toim.), Plenum Press, New York and London, s. 1–29.

(3)

Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture teoksessa Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al. (toim.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York- Oxford, s. 427–432.

(4)

Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, s. 1–175.

(5)

Muehlbauer, P.A. et al. (2008), Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/4, s. 318–327.

(6)

Tässä liitteessä oleva B.49 luku. In vitro -mikrotumatesti nisäkässoluilla.

(7)

ILSI paper (luonnos), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.

(8)

Scott, D. et al. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol.257/2, s. 147–204.

(9)

Morita, T. et al. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 268/2, s. 297–305.

(10)

Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 8/6, s. 789–886.

(11)

Long, L.H. et al. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, s. 177–183.

(12)

Nesslany, F. et al. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/6, s. 439–452.

(13)

Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, s. 191–201.

(14)

Kirkland, D. et al. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 584/1-2, s. 1–256.

(15)

Greenwood, S. et al. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 43/1, s. 36–44.

(16)

Hilliard, C.A. et al. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 31/4, s. 316–326.

(17)

Hedner K. et al. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, Vol. 62, s. 305–309.

(18)

Ramsey M.J. et al. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, Vol. 338, s. 95–106.

(19)

Coecke S. et al. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, Vol. 33/3, s. 261–287.

(20)

Henderson, L. et al. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, Vol.12/3, s.163–167.

(21)

Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 31/6, s. 347–363.

(22)

Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 113/3-4, s. 173–215.

(23)

Natarajan, A.T. et al. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, Vol. 37/1, s. 83–90.

(24)

Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 66/3, s. 277–290.

(25)

Ong, T.-m. et al. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, s. 55–65.

(26)

Elliot, B.M. et al. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, Vol. 7/3, s. 175–177.

(27)

Matsushima, T. et al. (1976), A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems, in In vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (toim.), Elsevier, North-Holland, s. 85–88.

(28)

Galloway, S.M. et al. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, s. 241–261.

(29)

Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28/1, s. 51–59.

(30)

UNEP (2001). Pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskeva Tukholman yleissopimus. Saatavilla osoitteessa: http://www.pops.int/.

(31)

Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, Vol. 190/3, s. 225-8.

(32)

Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids, teoksessa Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (toim.), Plenum, New York, s. 91–103.

(33)

Zamora, P.O. et al. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 5/6, s. 795–801.

(34)

Asakura, M. et al. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, Vol. 652/2, s. 122–130.

(35)

Lorge, E. et al. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1-2, s. 1–3.

(36)

Galloway, S. et al. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, s. 77–83.

(37)

Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 724/1-2, s. 86–87.

(38)

Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In vitro Cytogenetic Assays. Teoksessa: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (toim.) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141–154.

(39)

OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (testiohjeet 473, 476 ja 487) ENV/JM/TG(2014)17. Saatavilla pyynnöstä.

(40)

Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 741/1-2, s. 32–56.

(41)

Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, s. 36–43.

(42)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.

(43)

USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Saatavilla osoitteessa: https://federalregister.gov/a/2012-13774.

(44)

OECD (2014), Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.

(45)

ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (toim.), Karger Publishers Inc., Connecticut.

(46)

Scott, D. et al. (1990), Metaphase chromosome aberration assays in vitro, teoksessa Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 62–86.

(47)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, Vol. 723/2, s. 87–90.

(48)

Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.

(49)

Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.

(50)

Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, s. 1–175.

(51)

Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In vitro Cytogenetic Assays, teoksessa Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 141–154.

(52)

Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, Vol. 287/1, s. 29–46.

(53)

Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, Vol. 119/3, s. 403–413.

(54)

Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, Vol. 43/3, s. 1362–1364.

(55)

Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research, Vol. 312, s. 139–149.

Lisäys 1

MÄÄRITELMÄT

Aneuploidia : yksittäisen tai useamman kuin yhden kromosomin mutta ei kuitenkaan koko kromosomiston (polyploidia) poikkeaminen kromosomien tavallisesta diploidisesta (tai haploidisesta) määrästä.

Apoptoosi : ohjelmoitunut solukuolema, jossa tietyt vaiheet johtavat solujen hajoamiseen solukalvon ympäröimiksi rakkuloiksi, jotka myöhemmin häviävät fagosytoosin tai puhkeamisen seurauksena.

Endoreduplikaatio : tapahtumasarja, jossa DNA:n kahdentumisen S-vaiheen jälkeen tuma ei etene mitoosiin vaan aloittaa uuden S-vaiheen. Tämän seurauksena syntyy kromosomeja, joissa on 4, 8, 16, … kromatidia.

Genotoksinen : yleisnimitys kaikentyyppisille DNA- tai kromosomivaurioille, muun muassa katkeamiselle, deleetioille, addukteille, nukleotidien muutoksille ja sidoksille, uudelleenjärjestäytymiselle, geenimutaatioille, kromosomipoikkeavuuksille ja aneuploidialle. Kaikki genotoksiset vaikutukset eivät johda mutaatioihin tai pysyviin kromosomivaurioihin.

Kemikaali : aine tai aineiden seos.

Klastogeeni : kemikaali, joka aiheuttaa rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia solupopulaatioissa tai eukaryoottisten organismien populaatioissa.

Kromatidien aukko (chromatid gap) : yhden kromatidin ei-värjätty alue (akromaattinen leesio), johon liittyy minimaalinen kromatidin siirtymä.

Kromatidien katkeaminen (chromatid break) : yhden kromatidin katko, jossa on yhden kromatidin selvä siirtymä.

Kromatidipoikkeavuus : rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilmenee yksittäisten kromatidien katkeamisena tai kromatidien katkeamisena ja uudelleenyhtymisenä.

Kromosomipoikkeavuus : rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilmenee molempien kromatidien katkeamisena tai katkeamisena ja uudelleenyhtymisenä samassa kohdassa.

Käsittelemättömät kontrollit : viljelmät, joita ei altisteta aineelle (eli niihin ei käytetä testikemikaalia eikä liuotinta) vaan ne käsitellään samanaikaisesti samalla tavalla kuin testikemikaalia saavat viljelmät.

Liuotinkontrolli : yleinen nimitys kontrolliviljelmille, joihin lisätään vain testikemikaalin liuottamiseen käytettyä liuotinta.

Maksasta eristetty S9-jae : maksahomogenaatin supernatantti 9 000 g sentrifugoinnin jälkeen, ts. käsittelemätön maksanäyte.

Mitoosi : solutuman jakautuminen, joka jaotellaan yleensä profaasiin, prometafaasiin, metafaasiin, anafaasiin ja telofaasiin.

Mitoosi-indeksi (MI) : suhdeluku, joka saadaan jakamalla metafaasissa olevien solujen määrä solupopulaatiossa todettujen solujen kokonaismäärällä; ilmoittaa solujen proliferaatioasteen kyseisessä solupopulaatiossa.

Mutageeninen : aiheuttaa periytyvän muutoksen geenien DNA:n emäsparirakenteessa tai kromosomirakenteessa (kromosomipoikkeavuudet).

Numeerinen poikkeavuus : käytetyille soluille tyypillisestä normaalista kromosomimäärästä poikkeava kromosomien lukumäärä.

p53-status : p53-proteiini osallistuu solukierron säätelyyn, apoptoosiin ja DNA:n korjaukseen. Solut, joista puuttuu toimiva p53-proteiini tai jotka eivät pysty pysäyttämään solusykliä tai hävittämään vahingoittuneita soluja apoptoosilla tai muilla p53-proteiinin toimintoihin liittyvillä mekanismeilla (esimerkiksi indusoimalla DNA:n korjautumisen, ovat teoriassa alttiimpia geenimutaatioille tai kromosomipoikkeavuuksille.

Pitoisuudet : viittaa testikemikaalin lopullisiin pitoisuuksiin viljelynesteessä.

Polyploidia : solujen tai organismien kromosomien lukumäärää koskeva poikkeavuus, joka koskee yksittäisen kromosomin tai tiettyjen kromosomien (aneuploidia) sijaan koko kromosomistoa.

Populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen (PSK) : populaation kaksinkertaistumismäärän lisääntyminen kemikaalille altistetuissa viljelmissä verrattuna lisääntymiseen muissa kuin käsitellyissä viljelmissä; suhde ilmaistaan prosentteina.

Rakenteellinen poikkeavuus : kromosomirakenteen muutos, joka voidaan havaita solunjakautumisen metafaasivaiheen mikroskooppitutkimuksella ja joka ilmenee deleetioina ja fragmentteina, kromosomien sisäisinä tai kromosomien välisinä tekijänvaihdoksina.

S9-seos : S9-jakeen ja metabolisen entsyymitoiminnan kannalta välttämättömien kofaktorien seos.

Solujen proliferaatio : solujen määrän kasvaminen solujen mitoottisen jakautumisen seurauksena.

Solumäärän suhteellinen lisääntyminen (SMSL) : solujen määrän lisääntyminen kemikaalille altistetuissa viljelmissä verrattuna lisääntymiseen muissa kuin käsitellyissä viljelmissä; suhde ilmaistaan prosentteina.

Sytotoksisuus : tämän testimenetelmän kattamissa analyyseissä solulinjoja käytettäessä sytotoksisuus määritetään aineelle altistettujen solujen populaation suhteellisen kaksinkertaistumisen vähentymisenä tai solumäärän suhteellisena lisääntymisenä verrattuna negatiiviseen kontrolliin (ks. 17 kohta ja lisäys 2). Tämän testimenetelmän kattamissa analyyseissä primaarisia lymfosyyttiviljelmiä käytettäessä sytotoksisuus määritetään aineelle altistettujen solujen mitoosi-indeksin pienentymisenä verrattuna negatiiviseen kontrolliin (ks. 18 kohta ja lisäys 2).

Testikemikaali : aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

Lisäys 2

KAAVAT SYTOTOKSISUUDEN MÄÄRITYSTÄ VARTEN

Mitoosi-indeksi (MI):

Formula

Solumäärän suhteellista lisääntymistä (SMSL) tai populaation suhteellista kaksinkertaistumista (PSK) suositellaan, koska molemmissa otetaan huomioon jakaantuneen solupopulaation osuus.

Formula

Formula

Jossa

populaation kaksinkertaistuminen = [log (solumäärä käsittelyn jälkeen ÷ alkuperäinen solumäärä)] ÷ log 2

Esimerkiksi jos SMSL tai PSK on 53 %, sytotoksisuus/sytostaasi on 47 % ja mitoosi-indeksillä (MI) mitattu 55 prosentin sytotoksisuus/sytostaasi tarkoittaa, että todellinen MI on 45 prosenttia kontrollista.

Joka tapauksessa solujen määrä ennen käsittelyä on laskettava ja sen on oltava sama käsitellyissä ja negatiivisissa kontrolliviljelmissä.

Vaikka suhteellisia solumääriä (eli solumääriä altistetuissa viljelmissä/solumääriä kontrolliviljelmissä) on käytetty aikaisemmin sytotoksisuuden parametrina, sitä ei enää suositella, koska se voi johtaa sytotoksisuuden aliarviointiin.

Negatiivisissa kontrolliviljelmissä populaation kaksinkertaistumisen on oltava yhteensopiva sen vaatimuksen kanssa, että soluista otetaan näyte ajalla, joka vastaa suunnilleen 1,5 solusykliä, ja mitoosi-indeksin pitäisi olla niin korkea, että saadaan riittävä määrä mitoosissa olevia soluja, jotta voidaan luotettavasti laskea 50 prosentin vähennys.

4)

Korvataan B osassa oleva B.11 luku seuraavasti:

”B.11   Nisäkkäiden luuytimen kromosomipoikkeavuustesti

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 475 (2016). Se on osa geneettisen toksikologian testimenetelmiä. On laadittu OECD:n asiakirja, jossa ytimekkäitä tietoja geneettistä toksikologiaa koskevista testeistä sekä katsaus näihin testimenetelmiin tehtyihin viimeaikaisiin muutoksiin (1).

Nisäkkäillä in vivo tehtävä luuytimen kromosomipoikkeavuustesti on erityisen relevantti genotoksisuuden arvioinnissa, koska vaikka lajien välillä voi olla vaihtelua, in vivo -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja DNA:n korjautumisprosesseihin liittyvät tekijät ovat aktiivisia ja voivat edistää vasteiden saantia. In vivo -analyysi on hyödyllinen myös in vitro -koejärjestelmässä havaitun genotoksisuuden jatkotutkimuksena.

Nisäkkäillä in vivo tehtävää kromosomipoikkeavuustestiä käytetään testikemikaalien aiheuttamien rakenteellisten kromosomipoikkeavuuksien osoittamiseen nisäkkäiden, yleensä jyrsijöiden, luuydinsoluissa (2) (3) (4) (5). Rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet jakautuvat kahteen tyyppiin, kromosomi- ja kromatidipoikkeavuuksiin. Vaikka genotoksisten kemiallisten mutageenien aiheuttamat poikkeavuudet ovat useimmiten kromatidityyppisiä, myös kromosomityyppisiä poikkeavuuksia esiintyy. Kromosomivauriot ja niihin liittyvät tapahtumat ovat syynä moniin ihmisen geneettisiin sairauksiin, ja on saatu vakuuttavia todisteita siitä, että kun nämä vauriot ja niihin liittyvä tapahtumat aiheuttavat muutoksia somaattisten solujen onkogeeneissä ja kasvunrajoitegeeneissä, ne ovat osallisina syövän synnyssä ihmisillä ja koejärjestelmissä. Polyploidiaa (mukaan lukien endoreduplikaatio) voi aiheutua kromosomipoikkeavuutta koskevissa määritysmenetelmissä in vivo. Polyploidian lisääntyminen ei yksinään osoita aneugeenista mahdollisuutta, vaan se voi yksinkertaisesti osoittaa solysyklin häiriön tai sytotoksisuuden. Tätä testiä ei ole suunniteltu mittaamaan aneuploidiaa. Mikrotumatesti nisäkkään punasoluissa in vivo (tässä liitteessä oleva B.12 luku) tai in vitro -mikrotumatesti nisäkässoluilla (tässä liitteessä oleva B.49 luku) ovat in vivo- ja in vitro -testejä, joita suositellaan aneuploidian havainnointiin.

Käytettyjen termien määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.

ALUSTAVAT HUOMIOT

Tässä testissä käytetään yleensä jyrsijöitä, mutta muut lajit voivat olla joissain tapauksissa sopivia, jos tämä on tieteellisesti perusteltua. Luuydin on tämän testin kohdekudos, sillä sen verisuonitus on hyvin runsasta ja se sisältää solupopulaation, jonka solusykli on nopea ja joka on helppo eristää ja prosessoida. Raportissa on esitettävä tieteelliset perustelut muiden lajien kuin rottien ja hiirten käytöstä. Jos käytetään muita lajeja kuin jyrsijöitä, on suositeltavaa, että luuytimen kromosomipoikkeavuuden mittaus sisällytetään toiseen sopivaan toksisuustestiin.

Jos on saatu viitteitä siitä, etteivät testikemikaalit tai niiden metaboliitit pääse kohdekudokseen, tätä testiä ei pidä käyttää.

Ennen kuin testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen tietojen tuottamiseksi aiottuun sääntelytarkoitukseen, on harkittava, antaako se asianmukaiset tulokset tämän tavoitteen kannalta, ja jos antaa, miksi. Tällaista harkintaa ei tarvita, jos seoksen testaamista edellytetään sääntelyvaatimuksissa.

TESTIMENETELMÄN PERIAATE

Eläimet altistetaan testikemikaalille soveltuvaa altistusreittiä käyttäen ja ne lopetetaan humaanisti sopivan ajan kuluttua altistuksesta. Ennen lopettamista eläimille annetaan ainetta, joka pysäyttää solunjakautumisen metafaasiin (esim. kolkisiinia tai colcemidia). Tämän jälkeen luuydinsoluista tehdään kromosomipreparaatit ja ne värjätään, ja metafaasissa olevien solujen kromosomipoikkeavuudet analysoidaan.

LABORATORIOIDEN PÄTEVYYDEN VARMISTAMINEN

Pätevyyttä koskevat tutkimukset

Jotta voidaan vahvistaa riittävä kokemus analyysin suorittamisesta ennen kuin sitä käytetään tavanomaiseen testaukseen, laboratorion on osoitettava, että se voi tuottaa odotettavissa olevat tulokset julkaistuista tiedoista (esim. (6)) kromosomipoikkeavuuden taajuuden mittaamiseen vähintään kahdella positiivisella kontrollikemikaalilla (mukaan lukien heikot vasteet, joita indusoivat pienet määrät positiivista kontrollikemikaalia), kuten ne, jotka luetellaan taulukossa 1 ja yhdessä yhteensopivien kantaja-aine-/liuotinkontrollien kanssa (ks. 22 kappale). Näissä kokeissa pitää käyttää annoksia, joista aiheutuu toistettavissa olevaa ja annoksesta riippuvaa lukumäärän suurenemista, ja niiden on osoitettava testausjärjestelmän herkkyys sekä dynaaminen vaihteluväli kohdekudoksessa (luuydin) ja käyttää laskentamenetelmää, jota voidaan soveltaa laboratoriossa. Tätä vaatimusta ei sovelleta laboratorioihin, joilla on kokemusta, eli joilla on 10–14 kohdassa tarkoitettu aiemmin kerätty tietokanta.

Aiemmat kontrollitiedot

Pätevyyttä koskevissa tutkimuksissa laboratorion on määriteltävä:

aiempi positiivisen kontrollin vaihteluväli ja jakauma, ja

aiempi negatiivisen kontrollin vaihteluväli ja jakauma.

Hankittaessa ensin tietoja aiempien negatiivisten kontrollien jakaumaa varten, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien on oltava yhdenmukaisia julkaistujen kontrollitietojen kanssa, jos sellaisia on olemassa. Kun aikaisempien kontrollien jakaumaan lisätään enemmän kokeellisia tietoja, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien olisi mieluiten sijoituttava kyseisen jakauman 95 %:n kontrollirajojen sisälle. Laboratorion aikaisempia negatiivisia kontrolleja koskevan tietokannan pitäisi olla tilastollisesti vankka, jotta varmistetaan laboratorion kyky arvioida negatiivisten kontrollitietojensa jakaumaa. Lähdekirjallisuuden mukaan voidaan tarvita vähintään 10 koetta, mutta mieluiten olisi tehtävä ainakin 20 koetta vastaavissa koeolosuhteissa. Laboratorioiden on käytettävä laadunvalvontamenetelmiä, kuten valvontakortteja (esim. C-kortteja tai X-bar-kortteja (7)), tunnistamaan kuinka vaihtelevat niiden tiedot ovat, ja osoittaakseen, että laboratorio ”hallitsee” menetelmän. Lisäsuosituksia aikaisempien tietojen muodostamisesta ja käytöstä (esimerkiksi perusteet tietojen sisällyttämiseksi aikaisempiin tietoihin tai jättämiseksi pois niistä sekä kokeiden hyväksyttävyysperusteet) annetaan lähdekirjallisuudessa (8).

Jos laboratorio ei suorita loppuun riittävää määrää kokeita tilastollisesti vankan negatiivisen kontrollin jakauman osoittamiseksi (ks. 11 kohta) pätevyyttä koskevissa tutkimuksissa (kuvataan 9 kohdassa), on hyväksyttävää, että jakauma voidaan luoda ensimmäisten rutiinitutkimuksien aikana. Tässä lähestymistavassa pitäisi noudattaa lähdekirjallisuudessa (8) esitettyjä suosituksia ja negatiivisen kontrollin tuloksia, ja näissä kokeissa saatujen negatiivisten kontrollien tulosten on oltava julkaistujen negatiivisten kontrollien tuloksien mukaisia.

Mahdollisissa koejärjestelyn muutoksissa on otettava huomioon, miten ne vaikuttavat tuloksena olevien tietojen yhdenmukaisuuteen laboratorion olemassa olevan aiempia kontrolleja koskevan tietokannan kanssa. Vain suurien epäjohdonmukaisuuksien vuoksi on luotava uusi aiempien kontrollien tietokanta, jos asiantuntija-arviossa määritetään, että se eroaa edellisestä jakaumasta (ks. 11 kohta). Sen uudelleenluonnin aikana täysimittaista negatiivisten kontrollien tietokantaa ei ehkä tarvita varsinaisen testin suorittamiseen, jos laboratorio voi osoittaa, että sen rinnakkaisen negatiivisen kontrollin arvot ovat yhdenmukaisia aiemman tietokannan tai vastaavien julkistettujen tietojen kanssa.

Negatiivisen kontrollin tietojen tulisi koostua kunkin eläimen rakenteellisten kromosomipoikkeavuuksien (lukuun ottamatta aukkoja [gap]) esiintyvyydestä. Samanaikaisten negatiivisten kontrollien olisi mieluiten sijoituttava laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokannan 95 %:n kontrollirajojen sisälle. Jos rinnakkaisia negatiivisia kontrolleja koskevat tiedot jäävät 95 %:n kontrollirajojen ulkopuolelle, ne voidaan hyväksyä aikaisemman kontrollien jakaumaan edellyttäen, etteivät ne ole äärimmäisiä harha-arvoja ja että on näyttöä siitä, että testijärjestelmä on ”hallinnassa” (ks. 11 kohta), ja ettei ole kyse teknisestä tai inhimillisestä virheestä.

MENETELMÄN KUVAUS

Valmisteet

Eläinlajin valinta

Koe-eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä. Yleisesti käytetään rottia, ja hiirten käyttö voi olla asianmukaista. Kaikkia muita sopivia nisäkäslajeja voidaan käyttää, jos raportissa esitetään tieteellinen perustelu.

Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta

Jyrsijöiden tapauksessa koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C). Vaikka suhteellisen kosteuden olisi mieluiten oltava 50–60 prosenttia, sen olisi oltava ainakin 40 prosenttia eikä mielellään yli 70 prosenttia muulloin kuin tilan puhdistuksen aikana. Tilassa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ravinnon valintaan voi vaikuttaa tarve varmistaa sopiva sekoitus testikemikaalia, kun sitä annetaan tätä reittiä. Jyrsijät on sijoitettava samaa sukupuolta ja käsittelyryhmää edustaviin pienryhmiin (enintään viisi häkkiä kohti), jos mitään aggressiivista käytöstä ei odoteta, mieluiten kiinteisiin lattiahäkkeihin, joissa on asianmukainen virikkeellinen ympäristö. Eläimet voivat olla häkissä yksittäin ainoastaan, jos tämä on tieteellisesti perusteltua.

Eläinten valmistelu

Yleensä käytetään nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä (jyrsijät ovat mieluiten 6–10 viikon ikäisiä käsittelyn alussa, joskin hieman vanhemmat eläimet hyväksytään) ja ne jaetaan satunnaistetusti testi- ja kontrolliryhmiin. Eläimet tunnistetaan yksilöllisesti inhimillisellä minimaalisen invasiivisella toimenpiteellä (esim. rengastamalla, merkitsemällä, mikrosirulla tai biometrisellä tunnuksella, mutta ei korvia tai varpaita leikkaamalla) ja sopeuttamalla laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Ristikontaminaatiota positiivisella kontrollilla ja testikemikaalilla tulisi välttää. Tutkimuksen alkaessa eläinten painonvaihtelun on oltava vähäistä, ja se saa vaihdella korkeintaan ± 20 % kunkin sukupuolen tavanomaisesta keskiarvosta.

Annosten valmistelu

Kiinteät testattavat kemikaalit liuotetaan tai sekoitetaan asianmukaisiin liuottimiin tai kantaja-aineisiin taikka lisätään ravintoon tai juomaveteen, ennen kuin ne annetaan koe-eläimille. Nestemäiset testattavat kemikaalit voidaan antaa suoraan tai laimentaa ennen antamista. Testikemikaaleja voidaan antaa hengitystien kautta tapahtuvan altistamisen osalta kaasuna, höyrynä tai kiinteänä/nestemäisenä aerosolina niiden fysikokemiallisista ominaisuuksista riippuen. Testikemikaali on valmisteltava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä ja asianmukaiset säilytysolosuhteet on määritetty.

Liuotin/kantaja-aine

Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käytetyillä annostasoilla, eikä sen käyttöön saa liittyä epäilyjä mahdollisista kemiallisista reaktioista testikemikaalien kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Esimerkkejä yleisesti käytetyistä yhteensopivista liuottimista/kantaja-aineista ovat vesi, fysiologinen suolaliuos, metyyliselluloosaliuos, natriumkarboksimetyyliselluloosan suolaliuos, oliiviöljy ja maissiöljy. Jos ei ole aikaisempia tai julkaistuja kontrollitietoja siitä, ettei valittu epätyypillinen liuotin/kantaja-aine aiheuta rakenteellisia poikkeavuuksia tai muita haitallisia vaikutuksia, on tehtävä alustava tutkimus, jolla voidaan määrittää liuotin-/kantajakontrollin hyväksyttävyys.

Kontrollit

Positiiviset kontrollit

Kuhunkin testiin pitäisi normaalisti sisällyttää ryhmä eläimiä, joita käsitellään positiivisella kontrollikemikaalilla. Tästä voidaan poiketa, jos testilaboratorio on osoittanut olevansa pätevä tekemään testin ja se on vahvistanut aikaisemman positiivisen kontrollin vaihteluvälin. Kun rinnakkaista positiivisen kontrollin ryhmää ei ole, kuhunkin kokeeseen on sisällytettävä pisteytyskontrollit (kiinteät ja värjätyt objektilasit). Nämä voidaan saada sisällyttämällä tutkimuksen pisteytykseen asianmukaiset vertailunäytteet, jotka on saatu ja joita säilytetään erillisestä määräajoin (esim. 6–18 kuukauden välein) tehtävästä positiivisen kontrollin kokeesta laboratoriossa, jossa koe tehdään; esimerkiksi pätevyyden testaamisen aikana ja säännöllisesti tämän jälkeen, jos tätä tarvitaan.

Positiivisten kontrollikemikaalien pitäisi luotettavasti tuottaa havaittavaa lisääntymistä rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen esiintymistaajuudessa spontaanitasoon verrattuna. Positiivisten kontrolliaineiden annokset on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti laskijoille koodattujen näytteiden identiteettiä. On hyväksyttävää, että positiivinen kontrolliaine annetaan eri reittiä kuin testikemikaali käyttäen eri käsittelyaikataulua, ja näytteet voidaan ottaa vain kerran. Lisäksi positiivisina kontrolleina tulisi käyttää tarvittaessa samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvia aineita. Taulukkoon 1 sisältyy esimerkkejä positiivisista kontrollikemikaaleista.

Taulukko 1

Esimerkkejä positiivisista kontrollikemikaaleista

Kemikaali

CAS-nro

Etyylimetaanisulfonaatti

62-50-0

Metyylimetaanisulfonaatti

66-27-3

Etyylinitrosourea

759-73-9

Mitomysiini C

50-07-7

Syklofosfamidi (monohydraatti)

50-18-0 (6055-19-2)

Trietyleenimelamiini

51-18-3

Negatiiviset kontrollit

Negatiivisen kontrolliryhmän eläimet on sisällytettävä jokaiseen näytteenottokertaan ja niitä tulisi käsitellä aivan samalla tavalla kuin tutkimusryhmiä, paitsi ettei niitä altisteta testikemikaalille. Jos testikemikaalin annostelussa käytetään liuotinta/kantaja-ainetta, kontrolliryhmän pitää saada tätä liuotinta/kantaja-ainetta. Kuitenkin, jos aikaisemmista negatiivisen kontrollin tiedoista kullakin näytteenottokerralla testilaboratoriossa käy ilmi johdonmukaisia eläinten välisiä eroja ja rakenteellisia poikkeavuuksia sisältävien solujen esiintymistaajuutta, negatiivista kontrollia varten voidaan tarvita vain yksi näytteenotto. Kun negatiiviseen kontrolliin käytetään yhtä näytteenottoa, kyse pitäisi olla tutkimuksessa käytetystä ensimmäisestä näytteenottokerrasta.

MENETTELY

Eläinten lukumäärä ja sukupuoli

Mikrotuman vaste on yleensä samanlainen uros- ja naaraspuolisilla eläimillä (9) ja on odotettavissa, että tämä pätee myös rakenteellisiin kromosomipoikkeavuuksiin; tästä syystä useimmat tutkimukset voidaan suorittaa kumpaakin sukupuolta käyttäen. Tiedot, jotka osoittavat merkittäviä eroja urosten ja naaraiden välillä (esim. systeemisen toksisuuden, aineenvaihdunnan, biologisen saatavuuden, luuytimeen liittyvän toksisuuden erot, mukaan lukien esimerkiksi raja-annostutkimus) voisivat kannustaa käyttämään molempia sukupuolia. Tässä tapauksessa voi olla tarkoituksenmukaista tehdä tutkimus molemmilla sukupuolilla esim. osana toistuvan annostelun toksisuustutkimusta. Molempia sukupuolia käytettäessä saattaa olla tarkoituksenmukaista tehdä yhdistelykoe. Tarkempia tietoja siitä, miten tietoja yhdistelykokeessa analysoidaan, annetaan lisäyksessä 2.

Ryhmäkoot varmistetaan tutkimuksen alussa, jotta tarjotaan vähintään viisi tutkimukseen soveltuvaa yhtä sukupuolta edustavaa eläintä, tai kustakin sukupuolesta (jos kumpiakin käytetään) ryhmää kohti. Jos ihmisen altistuminen tutkittavalle kemikaalille voi olla sukupuolesta riippuvaa, kuten joidenkin lääkeaineiden kohdalla, testi on tehtävä asianomaista sukupuolta olevilla eläimillä. Ohjeelliseksi maksimimääräksi eläimiä koskevien vaatimusten osalta annetaan, että luuydintutkimus tehdään kahdella näytteenottokerralla, kolmella annosryhmällä ja rinnakkaisella negatiivisella kontrolliryhmällä (kussakin ryhmässä on viisi samaa sukupuolta edustavaa eläintä), ts. tarvitaan 45 eläintä.

Annostasot

Jos tehdään alustava annoksenmääritystutkimus, koska sopivia tietoja ei ole vielä käytettävissä annoksen valinnan opastukseen, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen samaa lajia, samaa kantaa, samaa sukupuolta olevia eläimiä ja samaa altistusohjelmaa kuin päätutkimuksessa (10). Tutkimuksessa on pyrittävä tunnistamaan suurin siedetty annos, joka määritellään korkeimmaksi annokseksi, jota siedetään ilman näyttöä tutkimusta rajoittavasta toksisuudesta suhteessa tutkimuksen kestoon (esim. se aiheuttaa ruumiinpainon laskua tai vertavuotavan kudoksen sytotoksisuutta), mutta joka ei aiheuta kuolemaa eikä kipua, tuskaa tai kärsimystä, jonka vuoksi eläin on lopetettava inhimillisesti (11).

Suurin annos voidaan määritellä myös annokseksi, joka aiheuttaa joitakin toksisuuteen viittaavia muutoksia luuytimessä.

Kemikaalit, jotka osoittavat toksikokineettisten ominaisuuksien saturaation tai aiheuttavat detoksikaatioprosesseja, jotka voivat johtaa altistuksen vähenemiseen pitkäaikaisen käsittelyn jälkeen, voivat muodostaa poikkeuksen annoksenmäärityskriteereihin, ja niitä on arvioitava tapauskohtaisesti.

Jotta saadaan annosvastetiedot, täydelliseen tutkimukseen on sisällyttävä negatiivisen kontrollin ryhmä ja vähintään kolme annostelutasoa, jotka yleensä erotetaan kertoimella 2, mutta enintään kertoimella 4. Jos testikemikaali ei aiheuta toksisuusvaikutusta annoksenmääritystutkimuksessa tai olemassa olevien tietojen perusteella, suurin annos kerta-annostelulle pitäisi olla 2 000 mg/painokilo. Jos testikemikaali aiheuttaa toksisuusvaikutuksen, suurimman siedetyn annoksen pitäisi olla korkein annettava annos, ja käytettävien annostasojen olisi mieluiten katettava vaihteluväli maksimista annokseen, jonka toksisuusvaikutus on vähäinen tai jolla ei ole toksisuusvaikutusta. Kun kohdekudoksen (luuytimen) toksisuusvaikutus havaitaan kaikilla testatuilla annostasoilla, on suositeltavaa tehdä täydentävä tutkimus ei-toksisilla annoksilla. Tutkimukset, joiden tarkoituksena on kuvata täydellisesti määrällisiä annos-vastetietoja, voivat vaatia täydentäviä annosryhmiä. Nämä rajat voivat vaihdella tietyntyyppisten testikemikaalien osalta (esim. ihmisten lääkkeet), jotka kuuluvat erityisten vaatimusten piiriin.

Raja-annostesti

Jos pitoisuusalueenmäärittelykokeet tai olemassa olevat tiedot vastaavista eläinkannoista osoittavat, että vähintään raja-annokseen (kuvattu jäljempänä) perustuva altistusohjelma ei tuota havaittavia toksisuusvaikutuksia (ei esim. luuytimeen liittyvän proliferaation vähentymistä tai muita todisteita kohdekudoksen sytotoksisuudesta), ja jos genotoksisuuden ei oleteta perustuvan in vitro -genotoksisuustutkimuksiin tai tietoihin rakenteellisesti samankaltaisista kemikaaleista, täydellistä tutkimusta kolmella annostasolla ei ehkä pidetä tarpeellisena, mikäli on osoitettu, että testikemikaalit saavuttavat kohdekudoksen (luuytimen). Tällaisissa tapauksissa yksi annostaso raja-annoksena saattaa riittää. Kun annostelu kestää yli 14 päivää, annos on 1 000 mg/painokiloa/päivä. Kun annostelu kestää korkeintaan 14 päivää, annos on 2 000 mg/painokiloa/päivä.

Antotapa

Testin suunnittelussa on otettava huomioon oletettu ihmisen altistusreitti. Siksi perustelluksi altistusreitiksi voidaan valita esim. ravinto tai juomavesi, ihonalainen, suonensisäinen, oraalinen (letkuruokinnalla), altistus hengitysteitse, henkitorven tai implantaation kautta kulkeva reitti. Joka tapauksessa reitti on valittava, jotta varmistetaan kohdekudosten riittävä altistus. Intraperitoneaalista injektiota ei yleensä suositella, koska se ei ole tarkoitettu ihmisen altistumisreitiksi, ja sitä tulisi käyttää vain erityisten tieteellisten perustelujen nojalla. Jos testikemikaali sekoitetaan ravintoon tai juomaveteen, varsinkin jos kyse on yhdestä annoksesta, vaikutuksien havaitsemiseksi on huolehdittava siitä, että viive ravinnon ja veden kulutuksen ja näytteenoton välillä on riittävä (ks. 33–34 kohta). Suurin letkuruokinnan tai injektion avulla kerralla annettava nestemäärä määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Määrä ei saa normaalisti ylittää 1 ml/100 g painoa. Poikkeuksen muodostavat vesiliuokset, joita käytettäessä enimmäistilavuus voi olla 2 ml/100 g painoa. Tätä suurempien määrien käyttö on perusteltava. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyttäviä testikemikaaleja, joiden vaikutukset yleensä pahenevat korkeammilla pitoisuuksilla, testikemikaalimäärän vaihtelu on minimoitava säätämällä pitoisuutta, jotta annostelun vakiotilavuus suhteessa ruumiinpainoon taataan kaikilla annostasoilla.

Altistusohjelma

Testikemikaalit annetaan yleensä yhtenä annoksena, mutta ne voidaan myös jakaa eri annoksiin (ts. kaksi tai useampaa altistuskertaa samana päivänä korkeintaan 2–3 tunnin välein), mikä helpottaa suurten määrien antamista. Näissä olosuhteissa, tai testikemikaalia hengitysteitse annettaessa, näytteenottoaika tulee ajoittaa edellisen annostelun tai altistuksen päättymisajan perusteella.

On vain vähän tietoa toistuvan annostelun menetelmän soveltuvuudesta tähän testiin. Olosuhteissa, joissa tämä testi halutaan sisällyttää toistuvan annostelun toksisuustutkimukseen, on pyrittävä välttämään kromosomivaurioisten mitoosissa olevien solujen menettäminen, mikä voi sattua toksisia annoksia käytettäessä. Sisällyttäminen on hyväksyttävää, kun korkein annos on suurempi tai yhtä suuri kuin raja-annos (ks. 29 kohta) ja annosryhmälle annetaan raja-annos koko altistusajan. Mikrotumatestiä (testimenetelmä B.12) on pidettävä soveltuvimpana kromosomipoikkeavuuksien in vivo -testinä, kun tällainen halutaan sisällyttää muihin tutkimuksiin.

Luuydinnäytteet on otettava kahtena eri ajankohtana eri altistuskertojen jälkeen. Jyrsijöillä ensimmäisen näytteenottovälin keston pitäisi olla 1,5 normaaliin solusykliin kuluva aika (solusykli on normaalisti 12–18 tuntia altistuksen jälkeen). Koska testikemikaalien soluunottoon ja metaboloitumiseen kuluva aika ja sen vaikutus solusyklin kinetiikkaan voi muuttaa kromosomipoikkeavuuksien optimaalista havaitsemisajankohtaa, myöhempi näyte tulisi kerätä 24 tunnin kuluttua ensimmäisestä näytteestä. Ensimmäisellä näytteenottokerralla kaikkia annosryhmiä on altistettava ja näytteitä on kerättävä analyysiin; myöhemmillä näytteenottokerroilla tarvitsee ainoastaan antaa korkein annos. Jos tutkittavaa ainetta annetaan tieteellisen perusteen nojalla pidempään kuin yhden päivän ajan, yleensä on otettava yksi näyte korkeintaan noin 1,5 normaalin solusyklin kuluttua viimeisestä altistusajankohdasta.

Käsittelyn jälkeen ja ennen näytteenottoa eläimille annetaan injektiona vatsaonteloon sopiva annos ainetta, joka pysäyttää solut metafaasivaiheeseen (esim. colcemidia tai kolkisiinia), ja näytteet kerätään sen jälkeen sopivin välein. Hiirillä väli on noin 3–5 tuntia ennen keräämistä ja rotilla 2–5 tuntia. Solut kerätään luuytimestä, saatetaan turpoamaan, fiksoidaan, värjätään ja analysoidaan kromosomipoikkeavuuksien toteamiseksi (12).

Havainnot

Koe-eläimiä koskevia yleisiä kliinisiä havaintoja tulee tehdä ja kliinisiä oireita tulee kirjata ainakin kerran päivässä, mieluiten samaan aikaan joka päivä ottaen huomioon se, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut vaikutukset ovat suurimmillaan. Kaikkien eläinten sairastuvuutta ja kuolleisuutta on havainnoitava ainakin kahdesti vuorokaudessa annostelun aikana. Eläimet on punnittava tutkimuksen alussa ja vähintään kerran viikossa toistuvan annoksen tutkimuksissa ja lopetettaessa. Vähintään viikon kestävissä tutkimuksissa ravinnonkulutuksen mittaus on tehtävä vähintään viikoittain. Mikäli testikemikaalia annostellaan juomaveteen, veden kulutusta on mitattava, kun vesi vaihdetaan tai ainakin kerran viikossa. Eläimet, joilla ilmenee ei-letaaleja merkkejä liiallisesta myrkytysvaikutuksesta, on lopetettava inhimillisesti ennen tutkimusajan päättymistä (11).

Kohdekudoksen altistaminen

Verinäyte on otettava sopivana ajankohtana, jotta voidaan tutkia testikemikaalien plasmatasot luuytimen altistumisen osoittamiseksi, jos tämä on perusteltua ja jos muita altistustietoja ei ole (ks. 44 kohta).

Luuydin- ja kromosomipreparaatit

Heti inhimillisen lopettamisen jälkeen luuytimen solut otetaan eläinten reisi- tai sääriluista, pannaan hypotoniseen liuokseen ja fiksoidaan. Tämän jälkeen metafaasissa olevat solut levitetään objektilaseille ja värjätään vakiintuneilla menetelmillä (ks. (3) (12)).

Analyysi

Kaikki objektilasit, myös ne, joilla on positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen tutkimusta ja jaettava satunnaisotannalla siten, että laskija ei tiedä altistusolosuhteista.

Mitoosi-indeksi on määritettävä sytotoksisuuden mittana vähintään 1 000 solusta eläintä kohti kaikista tutkittavalle aineelle altistetuista eläimistä (myös positiivisista kontrolleista), käsittelemättömistä tai kantaja-aineen/liuottimen negatiivisen kontrollin eläimistä.

Jokaista eläintä kohti tulisi analysoida vähintään 200 metafaasia rakenteellisista kromosomipoikkeavuuksista mukaan lukien ja ilman aukkoja (gaps) (6). Jos aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokanta kuitenkin osoittaa, että keskimääräisen kromosomipoikkeavuuksien taustaesiintyvyys on < 1 % testilaboratoriossa, on harkittava ylimääräisten solujen pisteytystä. Kromatidityyppiset ja kromosomityyppiset poikkeavuudet on kirjattava erikseen ja luokiteltava alatyypin mukaan (katkeamiset, vaihdokset). Laboratoriossa käytettävillä menettelyillä varmistetaan, että kromosomipoikkeavuuden analyysin tekevät hyvin koulutetut laskijat ja niitä vertaisarvioidaan tarvittaessa. Koska objektilasien valmistelu johtaa usein joidenkin metafaasissa olevien solujen rikkoutumiseen ja siten kromosomien menettämiseen, sentromeerien lukumäärän lasketuissa soluissa on vastattava lukua 2n ± 2, jossa haploidinen kromosomiluku on n kyseisen lajin osalta.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten käsittely

Yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot on esitettävä taulukossa. Jokaisen eläimen osalta on arvioitava mitoosi-indeksi, laskettujen metafaasissa olevien solujen lukumäärä, poikkeavuuksien lukumäärä solua kohti ja niiden solujen prosentuaalinen osuus, joissa on yksi tai useampia rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia. Erityyppiset rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet on lueteltava, ja niiden lukumäärä ja esiintymistaajuus koe- ja kontrolliryhmien osalta on ilmoitettava. Aukot (gaps) sekä polyploidiset solut ja endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävät solut on rekisteröitävä erikseen. Aukkojen esiintymistaajuus ilmoitetaan, mutta sitä ei yleensä sisällytetä rakenteellisten poikkeavuuksien kokonaistaajuuden analyysiin. Ellei viitteitä sukupuolten välisistä vaste-eroista ole havaittavissa, tiedot voidaan yhdistää tilastollista analyysiä tehtäessä. Eläinten toksisuustiedot ja kliiniset oireet on myös raportoitava.

Hyväksyttävyysperusteet

Testin hyväksyttävyys määritetään seuraavilla kriteereillä:

a)

Rinnakkaisten negatiivisten kontrollien tietoja pidetään hyväksyttävinä lisättäviksi laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokantaan (ks. 11–14 kohta).

b)

Rinnakkaisten positiivisten kontrollien tai pisteytysvalvonnan on indusoitava vasteita, jotka ovat yhteensopivia aikaisempien positiivisten kontrollien tietokannan vasteiden kanssa ja tuotettava tilastollisesti merkittävä lisääntyminen verrattuna negatiiviseen kontrolliin (ks. 20–21 kohta).

c)

Asianmukainen määrä annoksia ja soluja on analysoitu.

d)

Perusteet suurimman annoksen valitsemiseksi ovat yhdenmukaisia 25–28 kohdassa kuvattujen perusteiden kanssa.

Tulosten arviointi ja tulkinta

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi positiivinen, mikäli:

a)

ainakin yhdessä tutkimusryhmässä solujen rakenteellisten kromosomimuutoksien (paitsi aukot) taajuus on lisääntynyt tilastollisesti merkittävällä tavalla verrattuna rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin

b)

lisäys riippuu annoksesta ainakin yhdellä näyttöönottokerralla, kun sitä arvioidaan asianmukaisen trenditestin kanssa

c)

jokin tuloksisista on aikaisempien negatiivisen kontrollin tietojen jakauman ulkopuolella (esim. Poissonin jakaumaan perustuvat 95 %:n kontrollirajat).

Jos vain suurinta annosta tutkitaan tietyllä näytteenottokerralla, testikemikaalia pidetään selvästi positiivisena, mikäli esiintyy tilastollisesti merkittävää kasvua rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin verrattuna ja tulokset ovat aikaisempien negatiivisen kontrollin tietojen jakauman ulkopuolella (esim. Poissonin jakaumaan perustuvat 95 %:n kontrollirajat). Lähdekirjallisuudessa on suosituksia sopiville tilastomenetelmille (13). Kun tehdään annos–vaste-analyysi, on analysoitava ainakin kolmea altistettua annosryhmää. Tilastollisissa testeissä kokeellisena yksikkönä on käytettävä eläintä. Kromosomipoikkeavuustestissä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että testikemikaali aiheuttaa rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia testatun lajin luuytimessä.

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi negatiivinen, jos kaikissa tutkituissa koeolosuhteissa:

a)

yhdessäkään tutkimusryhmässä solujen rakenteellisten kromosomimuutoksien (lukuun ottamatta aukkoja [gaps]) taajuus ei ole lisääntynyt tilastollisesti merkittävällä tavalla verrattuna rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin

b)

annoksesta riippuvaa lisääntymistä ei esiinny millään näytteenottokerralla asianmukaisella trenditestillä arvioituna

c)

kaikki tulokset ovat aikaisempien negatiivisen kontrollin tietojen jakauman puitteissa (esim. Poissonin jakaumaan perustuvat 95 %:n kontrollirajat), ja

d)

luuydin on altistunut testikemikaaleille.

Lähdekirjallisuudessa on suosituksia soveltuvimmista tilastollisista menetelmistä (13). Näyttöön luuytimen altistumisesta testikemikaalille voi sisältyä mitoosi-indeksin alentuminen tai testikemikaalien plasman tai veritasojen mittaus. Laskimonsisäisen annostelun tapauksessa näyttöä altistumisesta ei tarvita. Vaihtoehtoisesti luuytimen altistumisen osoittamiseen voidaan käyttää samalla altistustavalla ja samalla eläinlajilla tehdyn riippumattoman tutkimuksen tietoja. Negatiiviset tulokset osoittavat, ettei tutkittava kemikaali aiheuta koeolosuhteissa rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia testatun lajin luuytimessä.

Selvästi positiivista tai negatiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa.

Jos vaste ei ole selvästi negatiivinen eikä selvästi positiivinen tai tuloksen biologisen merkityksellisyyden vahvistaminen kaipaa tukea (esim. heikko tai rajatapaukseksi luokiteltava lisäys), tietoja tulee arvioida asiantuntija-arvioinnissa ja/tai loppuun saatettuihin kokeisiin liittyvissä lisätutkimuksissa. Useampien solujen analysointi tai toistokokeen suorittaminen mahdollisesti käyttämällä mukautettuja koeolosuhteita voi olla joissakin tapauksissa hyödyllistä.

Harvoissa tapauksissa edes lisätutkimusten pohjalta ei voida päätellä, että testikemikaali tuottaa positiivisia tai negatiivisia tuloksia, ja sen vuoksi tutkimusta pidetään epäselvänä.

Polyploidisten ja/tai endoreduplikoituneiden solujen metafaasien esiintymistaajudet metafaasissa olevien solujen kokonaismäärässä on rekisteröitävä erikseen. Polyploidisten/endoreduplikoituneiden solujen määrän suureneminen saattaa osoittaa, että testikemikaaleilla pystytään estämään mitoottisia prosesseja tai solysyklin etenemistä (ks. 3 kohta).

Testiraportti

Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:

Yhteenveto

 

Testikemikaali:

alkuperä, erän numero, viimeinen käyttöpäivä, jos saatavilla

testikemikaalin stabiilius, jos tiedossa.

 

Yhdestä ainesosasta koostuva aine:

ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut asiaankuuluvat fysikokemialliset ominaisuudet

kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS-nimi, CAS-numero, SMILES- tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, tarvittaessa ja sen mukaan kuin on mahdollista, epäpuhtauksien kemikaaliset tunnistetiedot ja niin edelleen.

 

Useista aineosista koostuvat aineet, koostumukseltaan tuntemattomat tai vaihtelevat aineet ja seokset:

luonnehditaan mahdollisimman tarkoin esimerkiksi sen ainesosien kemiallisten tunnistetietojen (ks. edellä), esiintymistaajuuden ja fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien avulla.

 

Testikemikaalin valmistus

kantaja-aineen valintaperusteet

tutkittavan kemikaalin liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa, jos tiedossa

ruoka-aineen, juomaveden tai inhalaatioiden formulointi

formulointien analyyttiset määritelmät (kuten stabiilius, homogeenisyys, nimelliset pitoisuudet), kun niitä käytetään.

 

Koe-eläimet:

käytetty eläinlaji/kanta ja perustelu sen käytölle

eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli

lähde, elinolosuhteet, ravinto jne.

menettely eläinten yksilölliseksi tunnistamiseksi

lyhytkestoisissa tutkimuksissa: kunkin eläimen paino kokeen alkaessa ja päättyessä; yli viikon kestävissä tutkimuksissa: kunkin eläimen paino tutkimuksen aikana ja ravinnonkulutus. Kunkin ryhmän painon vaihteluväli, keskiarvo ja keskihajonta on sisällytettävä kokeeseen.

 

Testiolosuhteet:

positiiviset ja negatiiviset (kantaja-aine/liuotin) kontrollit

mahdolliset raja-annostutkimuksen tulokset

annostasojen valintaperusteet

testikemikaalin valmistelun yksityiskohdat

testikemikaalin annostelun yksityiskohdat

altistustavan ja annostelun keston valintaperusteet

menetelmät, joilla on vahvistettu testikemikaalin pääsy yleiseen verenkiertoon tai luuytimeen

todellinen annos (mg/painokilo/vrk), joka lasketaan ravintoon/juomaveteen sekoitetun testikemikaalin pitoisuudesta (ppm) ja kulutuksesta tarvittaessa

yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta

lopettamistapa

kivunlievitysmenetelmä (jos sitä on käytetty)

yksityiskohtaiset tiedot koe- ja näyteaikataulusta ja perustelut valinnoille

objektilasien valmistusmenetelmät

toksisuuden mittausmenetelmät

metafaasin estämiseen käytetty kemikaali, sen pitoisuus, annos ja altistusaika ennen näytteenottoa

menetelmät eristää ja säilöä näytteitä

kromosomipoikkeavuuksien laskentaperusteet

analysoitujen metafaasissa olevien solujen lukumäärä eläintä kohti ja mitoosi-indeksin määrittelyyn analysoitujen solujen määrä

tutkimuksen hyväksyvyyttä koskevat perusteet

perusteet, joiden perusteella tutkimukset luokiteltiin positiivisiksi, negatiivisiksi tai epäselviksi.

 

Tulokset:

eläimen kunto koeaikaa ennen ja sen aikana, mukaan lukien toksisuusoireet

mitoosi-indeksi jokaisen eläimen osalta erikseen

kromosomipoikkeavuuksien ja aberanttien solujen tyyppi ja lukumäärä, ilmoitettava jokaisen eläimen osalta erikseen

kromosomipoikkeavuuksien kokonaismäärä ryhmää kohti sekä keskiarvot ja keskihajonnat

kromosomipoikkeavuuksia sisältäneiden solujen lukumäärä ryhmää kohti sekä keskiarvot ja keskihajonnat

ploidian muutokset, jos niitä esiintyy, mukaan lukien polyploidian ja/tai endoreduplikoituneiden solujen esiintymistaajuudet

annos-vastesuhde, jos mahdollista

käytetyt tilastolliset analyysit ja menetelmät

tiedot, jotka osoittavat luuytimen altistumisen

rinnakkaisista negatiivisista ja positiivisista kontrolleista saadut tulokset, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat

aikaisemman negatiivisen ja positiivisen kontrollin tiedot, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat, 95 prosentin kontrollirajat jakaumille sekä katettu aika ja havaintojen määrä

perusteet positiiviselle tai negatiiviselle vasteelle.

 

Tulosten tarkastelu.

 

Päätelmät.

 

Viitteet.

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Adler, I.D. (1984), Cytogenetic Tests in Mammals, in Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (toim.), IRL Press, Washington, DC, s. 275–306.

(3)

Preston, R.J. et al. (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, Vol. 189/2, s. 157–165.

(4)

Richold, M. et al. (1990), In vivo Cytogenetics Assays, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 115–141.

(5)

Tice, R.R. et al. (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, Vol. 312/3, s. 305–312.

(6)

Adler, I.D. et al. (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 417/1, s. 19–30.

(7)

Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.

(8)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, s. 87–90.

(9)

Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, s. 293–304.

(10)

Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, s. 313–319.

(11)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.

(12)

Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, s. 147–163.

(13)

Lovell, D.P. et al. (1989), Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 184–232.

Lisäys 1

MÄÄRITELMÄT

Aneuploidia : kaikki yksittäisen tai useamman kuin yhden kromosomin mutta ei kuitenkaan koko kromosomiston (polyploidia) poikkeaminen kromosomien tavallisesta diploidisesta (tai haploidisesta) määrästä.

Endoreduplikaatio : tapahtumasarja, jossa DNA:n kahdentumisen S-vaiheen jälkeen tuma ei etene mitoosiin vaan aloittaa uuden S-vaiheen. Tämän seurauksena syntyy kromosomeja, joissa on 4, 8, 16, … kromatidia.

Gap : gap, akromaattinen leesio, joka on pienempi kuin yhden kromatidin leveys, ja johon liittyy minimaalinen kromatidien siirtymä.

Kemikaali : aine tai seos.

Kromatidipoikkeavuus : rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilmenee yksittäisten kromatidien katkeamisena tai kromatidien katkeamisena ja uudelleenyhtymisenä.

Kromosomipoikkeavuus : rakenteellinen kromosomivaurio, joka ilmenee molempien kromatidien katkeamisena tai katkeamisena ja uudelleenyhtymisenä samassa kohdassa.

Mitoosi-indeksi : suhdeluku, joka saadaan jakamalla mitoosissa olevien solujen luku solupopulaation solujen kokonaismäärällä, joka on kyseisen solupopulaation proliferaatioasteen mitta.

Numeerinen poikkeavuus : testissä käytetyille eläimille tyypillisestä normaalista kromosomimäärästä poikkeava kromosomien lukumäärä (aneuploidia).

Polyploidia : numeerinen kromosomipoikkeavuus, joka liittyy muutokseen koko kromosomiston määrässä, toisin kuin numeerinen muutos osassa kromosomistoa (ks. aneuploidia).

Rakenteellinen kromosomipoikkeavuus : kromosomirakenteen muutos, joka voidaan havaita solunjakautumisen metafaasivaiheen mikroskooppitutkimuksella ja joka ilmenee deleetioina ja fragmentteina, kromosomien sisäisinä tai kromosomien välisinä tekijänvaihdoksina.

Sentromeeri : kromosomin alue (alueita), joihin sukkularihmat ovat kiinnittyneet solunjakautumisen aikana. Tähän perustuu tytärkromosomien järjestäytynyt siirtyminen tytärsolujen napoihin.

Testikemikaali : aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

Lisäys 2

YHDISTELYKOE SUKUPUOLTEN EROJEN TUNNISTAMISEKSI IN VIVO -KROMOSOMIPOIKKEAVUUSTESTISSÄ

Yhdistelykoe ja sen analysointi

Tässä kokeessa vähintään 5 urosta ja 5 naarasta testataan kullakin pitoisuustasolla, mikä johtaa koemalliin, jossa käytetään vähintään 40 eläintä (20 urosta ja 20 naarasta sekä asiaankuuluvat positiiviset kontrollit).

Tämä koe, joka on yksi yksinkertaisimmista yhdistelykokeista, vastaa kaksisuuntaista varianssianalyysia, jossa sukupuoli ja pitoisuustaso ovat tärkeimmät vaikutukset. Tietoja voidaan analysoida käyttäen monia vakiintuneita tilastollisia ohjelmistopaketteja, kuten SPSS, SAS, STATA, Genstat ja R.

Tietoihin liittyvä vaihtelu ositetaan analyysissa sukupuolten ja pitoisuuksien väliseksi sekä sukupuolten ja pitoisuuksien väliseen vuorovaikutukseen liittyväksi vaihteluksi. Kutakin perustetta testataan rinnakkaisten eläinten välisen vaihtelevuuden arvion perusteella samaa sukupuolta edustavissa eläinryhmissä, joille annetaan sama pitoisuus. Täydelliset tiedot menetelmästä annetaan useissa vakiintuneissa tilastollisissa oppikirjoissa (ks. viitteet) ja tilastopakettien tukitoiminnoissa.

Analyysissä tutkitaan sen jälkeen sukupuolen x pitoisuuteen liittyvä yhdysvaikutustermi ANOVA-taulukossa (5). Merkitsevän yhdysvaikutustermin puuttuessa sukupuolten tai pitoisuustasojen yhdistetyt arvot ovat tasojen välisiä valideja tilastollisia testejä ANOVA-taulukon ryhmän sisäisen yhdistetyn vaihtelutekijän pohjalta.

Analyysi jatkuu siten, että arvio pitoisuuksien välisestä vaihtelusta jaetaan kontrasteihin, joista saadaan testi vasteiden lineaarisille ja kvadraattisille kontrasteille eri pitoisuustasoilla.. Kun sukupuolen x pitoisuuteen liittyvä yhdysvaikutus on merkittävä, tämä termi voidaan myös osittaa sukupuoleen x liittyviksi lineaarisiksi ja sukupuoleen x liittyviksi kvadraattisiksi interaktiokontrasteiksi. Näiden tekijöiden perusteella voidaan testata, onko sukupuolten pitoisuusvaste rinnakkainen vai onko sukupuolten välillä vaste-eroa.

Arviota ryhmän sisäisestä yhdistetystä vaihtelusta voidaan käyttää keskiarvojen erotuksen parittaiseen testaukseen. Näitä vertailuja voitaisiin tehdä kummankin sukupuolen keskiarvojen välillä sekä eri pitoisuustasojen keskiarvojen välillä, kuten negatiivisten kontrollitasojen kanssa. Kun yhdysvaikutus on merkitsevä, vertailuja voitaisiin tehdä eri pitoisuuksia saaneen yhden sukupuolen keskiarvojen välillä tai samaa pitoisuutta saaneiden molempien sukupuolten keskiarvojen välillä.

Viitteet

Asiasta on laadittu monia tilastollisia oppikirjoja, joissa käsitellään yhdistelmäkokeiden – jotka vaihtelevat yksinkertaisimmista kaksifaktorianalyyseistä kokeiden suunnittelumetodologiassa käytettyihin monimutkaisimpiin analyyseihin – teoriaa, suunnittelua, metodologiaa, analyysia ja tulkintaa. Seuraava luettelo ei ole tyhjentävä.. Joissain annetaan esimerkkejä vertailukelpoisista malleista ja joissakin tapauksissa annetaan koodit analyysien tekemiseen erilaisia ohjelmistoja hyödyntämällä.

 

Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

 

Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

 

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

 

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

 

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

 

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

 

Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

5)

Korvataan B osassa oleva B.12 luku seuraavasti:

”B.12   Nisäkkäiden erytrosyyttimikrotumatesti

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 474 (2016). Se on osa geneettisen toksikologian testimenetelmiä. On laadittu OECD:n asiakirja, jossa ytimekkäitä tietoja geneettistä toksikologiaa koskevista testeistä sekä katsaus näihin testimenetelmiin tehtyihin viimeaikaisiin muutoksiin (1).

Nisäkkäillä in vivo -mikrotumatesti on erityisen relevantti genotoksisuuden arvioinnissa, koska vaikka lajien välillä voi olla vaihtelua, in vivo -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja DNA:n korjautumisprosesseihin liittyvät tekijät ovat aktiivisia ja voivat vaikuttaa vasteisiin. In vivo -analyysi on hyödyllinen myös in vitro -koejärjestelmässä havaitun genotoksisuuden jatkotutkimuksena.

Nisäkkäiden in vivo -mikrotumatestiä käytetään tutkittavan aineen aiheuttamien kromosomivaurioiden tai mitoosilaitteen vaurioiden toteamiseen erytroblasteissa. Testissä arvioidaan mikrotumien muodostumista erytroblasteissa analysoimalla eläinten, yleensä jyrsijöiden, luuytimen soluja tai perifeerisiä verisoluja.

Mikrotumatestin tarkoituksena on tunnistaa sellaisia sytogeneettisiä vaurioita aiheuttavat kemikaalit, jotka johtavat hitaasti liikkuvia (lagging) kromosomifragmentteja tai kokonaisia kromosomeja sisältävien mikrotumien muodostumiseen.

Kun luuytimen erytroblasti kehittyy punasolun esiasteeksi (johon viitataan joskus polykromaattisena punasoluna tai retikulosyyttinä), päätuma irtoaa solusta, ja mahdollinen muodostunut mikrotuma saattaa jäädä muutoin tumattomaan solulimaan. Päätuman puuttuminen helpottaa mikrotumien havaitsemista näissä soluissa. Mikrotumaisten punasolujen esiasteiden suurentunut esiintymistaajuus altistetuilla eläimillä osoittaa tutkittavan aineen aiheuttaman rakenteellisen tai numeerisen kromosomipoikkeavuuden.

Vasta muodostuneet punasolut tunnistetaan ja kvantifioidaan värjäämällä, mitä seuraa joko visuaalinen pisteytys mikroskooppia käyttäen, tai automaattinen analyysi. Täysikasvuisten eläinten perifeerisessä veressä tai luuytimessä olevien punasolujen esiasteiden riittävän määrän laskentaa helpottaa automaattinen laskentajärjestelmä. Tällaiset järjestelmät ovat hyväksyttäviä vaihtoehtoja manuaaliselle arvioinnille (2). Vertailevat tutkimukset ovat osoittaneet, että tällaisilla menettelyillä, asianmukaisia kalibrointistandardeja käyttämällä, voidaan tarjota parempi toistettavuus ja herkkyys samassa laboratoriossa ja eri laboratorioissa manuaaliseen mikroskooppipisteytykseen verrattuna (3) (4). Automaattiset järjestelmät, joilla voidaan mitata mikrotumaisten punasolujen taajuudet ovat (mutta eivät pelkästään) virtaussytometrit (5), kuva-analyysijärjestelmät (6) (7), ja laserskannaukseen perustuvat sytometrit (8).

Kromosomifragmentit voidaan erottaa kokonaisista kromosomeista useiden perusteiden perusteella, vaikka tätä ei normaalisti tehdä osana testiä. Näitä ovat kinetokorin tai sentromeerisen DNA:n (jotka ovat tyypillisiä ehjille kromosomeille) esiintymisen tai puuttumisen osoittaminen. Kinetokorin tai sentromeerisen DNA:n puuttuminen osoittaa, että mikrotuma sisältää ainoastaan kromosomifragmentteja, ja sen olemassaolo osoittaa kromosomin häviämisen.

Käytettyjen termien määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.

ALUSTAVAT HUOMIOT

Nuorten täysikasvuisten jyrsijöiden luuydin on kohdekudos geneettisille vaurioille tässä testissä, koska tässä kudoksessa muodostuvat punasolut. Punasolujen esiasteiden mikrotumien mittaus perifeerisessä veressä on hyväksyttävää muissa nisäkäslajeissa, joiden osalta on osoitettu, että ne ovat riittävän herkkiä havaitsemaan kemikaalit, jotka aiheuttavat rakenteellisia tai numeerisia kromosomipoikkeavuuksia näissä soluissa (indusoimalla mikrotumia punasolujen esiasteissa), ja joiden tapauksessa annetaan tieteelliset perusteet. Mikrotumaisten epäkypsien punasolujen esiintymistaajuus on pääasiallinen päätepiste. Sellaisten kypsien punasolujen taajuus, jotka sisältävät mikrotumia perifeerisessä veressä, voidaan myös käyttää päätepisteenä lajeissa, joilla ei ole vahvaa pernassa tapahtuvaa valintaa mikrotumaisilla soluilla, ja kun eläimet altistetaan yhtäjaksoisesti käytettyjen lajien punasolujen eliniän ylittävän ajan (esim. 4 viikkoa tai enemmän hiirillä).

Jos on saatu viitteitä siitä, etteivät testikemikaalit tai niiden metaboliitit pääse kohdekudokseen, tätä testiä ei pidä käyttää.

Ennen kuin testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen tietojen tuottamiseksi aiottuun sääntelytarkoitukseen, on harkittava, tarjoaako se asianmukaiset tulokset tämän tavoitteen kannalta, ja jos tarjoaa, miksi. Tällaista harkintaa ei tarvita, jos seoksen testaamista edellytetään sääntelyvaatimuksissa.

TESTIMENETELMÄN PERIAATE

Eläimet altistetaan testikemikaalille sopivaa antotapaa käyttäen. Jos käytetään luuydintä, eläimet lopetetaan inhimillisesti sopivan ajan kuluttua altistuksesta, luuytimestä otetaan näyte, ja preparaatit valmistetaan ja värjätään (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Käytettäessä perifeeristä verta verinäytteet otetaan sopivina ajankohtina altistuksen jälkeen, tehdään valmistelut ja värjätään (12) (16) (17) (18). Kun annos annetaan akuutisti, on tärkeää valita luuytimen tai veren näytteenotto aikoina, jolloin mikrotumaisten punasolujen esiasteiden käsittelyyn liittyvä induktio voidaan havaita. Kun kyse on perifeerisen veren näytteenotosta, näiden tapahtumien välillä on myös oltava kulunut tarpeeksi aikaa, jotta ne voidaan havaita kiertävässä veressä. Mikrotumien esiintyminen analysoidaan valmisteista joko havainnoimalla mikroskooppia, kuva-analyysijärjestelmää, virtaussytomeriä käyttäen tai laskerskannaukseen perustuvaa sytometria käyttäen.

LABORATORIOIDEN PÄTEVYYDEN VARMISTAMINEN

Pätevyyttä koskevat tutkimukset

Jotta laboratoriolla voidaan todeta olevan riittävä kokemus testistä ennen sen käyttöä rutiinitestauksessa, laboratorion on osoitettava, että se voi tuottaa odotettavissa olevat tulokset julkaistuista tiedoista (17) (19) (20) (21) (22) mikrotumien taajuuden mittaamiseen vähintään kahdella positiivisella kontrollikemikaalilla (mukaan lukien heikot vasteet, joita indusoivat pienet määrät positiivista kontrollikemikaalia), kuten ne, jotka luetellaan taulukossa 1 ja yhdessä yhteensopivien kantaja-aine-/liuotinkontrollien kanssa (ks. 26 kappale). Näissä kokeissa pitää käyttää annoksia, joista aiheutuu toistettavissa olevia ja annokseen liittyviä lisääntymisiä, ja niiden on osoitettava testausjärjestelmän herkkyys ja dynaaminen vaihteluväli kohdekudoksessa (luuydin tai perifeerinen veri) ja käyttää laskentamenetelmää, jota voidaan soveltaa laboratoriossa. Tätä vaatimusta ei sovelleta laboratorioihin, joilla on kokemusta, eli joilla on 14–18 kohdassa määritelty laboratoriokohtainen tietokanta.

Aiemmat kontrollitiedot

Pätevyyttä koskevissa tutkimuksissa laboratorion on määriteltävä:

aiempi positiivisen kontrollin vaihteluväli ja jakauma, ja

aiempi negatiivisen kontrollin vaihteluväli ja jakauma.

Hankittaessa ensin tietoja aiempien negatiivisten kontrollien jakaumaa varten, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien on oltava yhdenmukaisia julkaistujen kontrollitietojen kanssa, jos sellaisia on olemassa. Kun aikaisempien kontrollien jakaumaan lisätään enemmän kokeellisia tietoja, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien olisi mieluiten sijoituttava kyseisen jakauman 95 %:n kontrollirajojen sisälle. Laboratorion aikaisempia negatiivisia kontrolleja koskevan tietokannan pitäisi olla tilastollisesti vankka, jotta varmistetaan laboratorion kyky arvioida negatiivisten kontrollitietojensa jakaumaa. Lähdekirjallisuuden mukaan voidaan tarvita vähintään 10 koetta, mutta mieluiten olisi tehtävä ainakin 20 koetta vastaavanlaisissa koeolosuhteissa. Laboratorioiden on käytettävä laadunvalvontamenetelmiä, kuten valvontakortteja (esim. C-kortteja tai X-bar-kortteja (23)), kontrollitietojensa vaihtelevuuden määrittämiseksi ja osoittaakseen, että laboratorio ”hallitsee” menetelmän. Lisäsuosituksia aikaisempien tietojen muodostamisesta ja käytöstä (esimerkiksi perusteet tietojen sisällyttämiseksi aikaisempiin tietoihin tai jättämiseksi pois niistä sekä kokeiden hyväksyttävyysperusteet) annetaan lähdekirjallisuudessa (24).

Jos laboratorio ei suorita loppuun riittävää määrää kokeita tilastollisesti vankan negatiivisen kontrollin jakauman osoittamiseksi (ks. 15 kohta) pätevyyttä koskevissa tutkimuksissa (kuvataan 13 kohdassa), on hyväksyttävää, että jakauma voidaan luoda ensimmäisten rutiinitutkimuksien aikana. Tässä lähestymistavassa pitäisi noudattaa lähdekirjallisuudessa (24) esitettyjä suosituksia ja negatiivisen kontrollin tuloksia, ja näissä kokeissa saatujen negatiivisten kontrollien tulosten on oltava julkaistujen negatiivisten kontrollien tuloksien mukaisia.

Mahdollisissa koejärjestelyn muutoksissa on otettava huomioon, miten ne vaikuttavat tuloksena olevien tietojen yhdenmukaisuuteen laboratorion olemassa olevan aiempia kontrolleja koskevan tietokannan kanssa. Vain merkittävien epäjohdonmukaisuuksien perusteella on luotava uusi aiempien kontrollien tietokanta, jos asiantuntija-arviossa määritetään, että se eroaa edellisestä jakaumasta (ks. 15 kohta). Sen uudelleenluonnin aikana täysimittaista negatiivisten kontrollien tietokantaa ei ehkä tarvita varsinaisen testin suorittamiseen, jos laboratorio voi osoittaa, että sen rinnakkaisen negatiivisen kontrollin arvot ovat yhdenmukaisia aiemman tietokannan tai vastaavien julkistettujen tietojen kanssa.

Negatiivisen kontrollin tietojen tulisi koostua kunkin eläimen mikrotumaisten epäkypsien punasolujen esiintyvyydestä. Samanaikaisten negatiivisten kontrollien olisi mieluiten sijoituttava laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokannan 95 %:n kontrollirajojen sisälle. Jos rinnakkaisia negatiivisia kontrolleja koskevat tiedot jäävät 95 %:n kontrollirajojen ulkopuolelle, ne voidaan hyväksyä aikaisemman kontrollien jakaumaan edellyttäen, etteivät ne ole äärimmäisiä harha-arvoja ja että on näyttöä siitä, että testijärjestelmä on ”hallinnassa” (ks. 15 kohta), ja ettei ole kyse teknisestä tai inhimillisestä virheestä.

MENETELMÄN KUVAUS

Valmisteet

Eläinlajin valinta

Koe-eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä. Hiiriä, rottia tai muita soveltuvia nisäkäslajeja voidaan käyttää. Kun käytetään perifeeristä verta, on osoitettava, että mikrotumaisten solujen poistuminen verenkierrosta pernassa ei vaaranna aiheutettujen mikrotumien havaitsemista valitussa lajissa. Tämä on selkeästi osoitettu hiiren ja rotan perifeerisessä veressä (2). Raportissa on esitettävä tieteelliset perustelut muiden lajien kuin rottien ja hiirten käytöstä. Jos käytetään muita lajeja kuin jyrsijöitä, on suositeltavaa, että indusoitujen mikrotumien mittaus sisällytetään toiseen sopivaan toksisuustestiin.

Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta

Jyrsijöiden tapauksessa koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C). Vaikka suhteellisen kosteuden olisi mieluiten oltava 50–60 prosenttia, sen olisi oltava ainakin 40 prosenttia eikä mielellään yli 70 prosenttia muulloin kuin tilan puhdistuksen aikana. Tilassa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ravinnon valintaan voi vaikuttaa tarve varmistaa sopiva sekoitus testikemikaalia, kun sitä annetaan tätä reittiä. Jyrsijät on sijoitettava samaa sukupuolta ja käsittelyryhmää edustaviin pienryhmiin (enintään viisi häkkiä kohti), jos mitään aggressiivista käytöstä ei odoteta, mieluiten kiinteisiin lattiahäkkeihin, joissa on asianmukainen virikkeellinen ympäristö. Eläimet voivat olla häkissä yksittäin ainoastaan, jos tämä on tieteellisesti perusteltua.

Eläinten valmistelu

Yleensä käytetään nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä (jyrsijät ovat mieluiten 6–10 viikon ikäisiä käsittelyn alussa, joskin hieman vanhemmat eläimet hyväksytään) ja ne jaetaan satunnaistetusti testi- ja kontrolliryhmiin. Eläimet tunnistetaan yksilöllisesti inhimillisellä minimaalisen invasiivisella toimenpiteellä (esim. rengastamalla, merkitsemällä, mikrosirulla tai biometrisellä tunnuksella, mutta ei korvia tai varpaita leikkaamalla) ja sopeuttamalla laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Ristikontaminaatiota positiivisella kontrollilla ja testikemikaalilla tulisi välttää. Tutkimuksen alkaessa eläinten painonvaihtelun on oltava vähäistä, ja se saa vaihdella korkeintaan ± 20 % kunkin sukupuolen tavanomaisesta keskiarvosta.

Annosten valmistelu

Kiinteät testikemikaalit liuotetaan tai sekoitetaan asianmukaisiin liuottimiin tai kantaja-aineisiin taikka lisätään ravintoon tai juomaveteen, ennen kuin ne annetaan koe-eläimille. Nestemäiset testikemikaalit voidaan antaa suoraan tai laimentaa ennen antamista. Testikemikaaleja voidaan antaa hengitystien kautta tapahtuvan altistamisen osalta kaasuna, höyrynä tai kiinteänä/nestemäisenä aerosolina niiden fysikokemiallisista ominaisuuksista riippuen. Testikemikaali on valmisteltava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä ja asianmukaiset säilytysolosuhteet on määritetty.

Testiolosuhteet

Liuotin/kantaja-aine

Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käytetyillä annostasoilla, eikä sen käyttö saa aiheuttaa mahdollisia kemiallisia reaktioita testikemikaalien kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Esimerkkejä yleisesti käytetyistä yhteensopivista liuottimista/kantaja-aineista ovat vesi, fysiologinen suolaliuos, metyyliselluloosaliuos, natriumkarboksimetyyliselluloosan suolaliuos, oliiviöljy ja maissiöljy. Jos ei ole aikaisempia tai julkaistuja kontrollitietoja siitä, ettei valittu epätyypillinen liuotin/kantaja-aine aiheuta mitään mikrotumia tai muita haitallisia vaikutuksia, on tehtävä alustava tutkimus, jolla voidaan määrittää liuotin-/kantajakontrollin hyväksyttävyys.

Kontrollit

Positiiviset kontrollit

Kuhunkin testiin pitäisi normaalisti sisällyttää ryhmä eläimiä, joita käsitellään positiivisella kontrollikemikaalilla. Tästä voidaan poiketa, jos testilaboratorio on osoittanut olevansa pätevä tekemään testin ja se on vahvistanut aikaisemman positiivisen kontrollin vaihteluvälin. Kun rinnakkaista positiivisen kontrollin ryhmää ei ole, kuhunkin kokeeseen on sisällytettävä pisteytyskontrollit (kiinteät ja värjätyt objektilasit tai solususpensionäytteet, pisteytysmenetelmän mukaisesti). Nämä voidaan saada sisällyttämällä tutkimuksen pisteytykseen asianmukaiset vertailunäytteet, jotka on saatu ja joita säilytetään erillisestä määräajoin (esim. 6–18 kuukauden välein) tehtävästä positiivisen kontrollin kokeesta; esimerkiksi pätevyyden testaamisen aikana ja säännöllisesti tämän jälkeen, jos tätä tarvitaan.

Positiivisten kontrollikemikaalien pitäisi luotettavasti tuottaa havaittavaa lisääntymistä mikrotumien esiintymistaajuudessa spontaanitasoa enemmän. Kun käytetään manuaalista pisteytystä mikroskoopilla, positiivisten kontrolliaineiden annokset on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti laskijoille koodattujen näytteiden identiteettiä. On hyväksyttävää, että positiivinen kontrolliaine annetaan eri reittiä kuin testikemikaali käyttäen eri käsittelyaikataulua, ja näytteet voidaan ottaa vain kerran. Lisäksi positiivisina kontrolleina tulisi käyttää tarvittaessa samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvia aineita. Taulukkoon 1 sisältyy esimerkkejä positiivisista kontrollikemikaaleista.

Taulukko 1

Esimerkkejä positiivisista kontrollikemikaaleista:

Kemikaalit ja CAS-rekisterinumero

Etyylimetaanisulfonaatti [CAS-numero 62-50-0]

Metyylimetaanisulfonaatti [CAS-numero 66-27-3]

Etyylinitrosourea [CAS-numero 759-73-9]

Mitomysiini C [CAS-numero 50-07-7]

Syklofosfamidi (monohydraatti) [CAS-numero 50-18-0 (CAS-numero 6055-19-2)]

Trietyleenimelamiini [CAS-numero 51-18-3]

Kolkisiini [CAS-numero 64-86-8] tai vinblastiini [CAS-numero 865-21-4] – aneugeeneinä

Negatiiviset kontrollit

Negatiivisen kontrolliryhmän eläimet on sisällytettävä jokaiseen näytteenottokertaan ja niitä tulisi käsitellä aivan samalla tavalla kuin tutkimusryhmiä, paitsi ettei niitä altisteta testikemikaalille. Jos testikemikaalin annostelussa käytetään liuotinta/kantaja-ainetta, kontrolliryhmän pitää saada tätä liuotinta/kantaja-ainetta. Kuitenkin, jos aikaisemmista negatiivisen kontrollin tiedoista kullakin näytteenottokerralla testilaboratoriossa käy ilmi johdonmukaisia eläinten välisiä eroja ja mikrotumia sisältävien solujen esiintymistaajuutta, negatiivista kontrollia varten voidaan tarvita vain yksi näytteenotto. Kun negatiiviseen kontrolliin käytetään yhtä näytteenottoa, kyse pitäisi olla tutkimuksessa käytetystä ensimmäisestä näytteenottokerrasta.

Jos käytetään perifeeristä verta, käsittelyä edeltävä näyte on hyväksyttävä rinnakkaisen negatiivisen kontrollin sijaan lyhyen aikavälin tutkimuksissa, mikäli saadut tulokset ovat testauslaboratorion aikaisempien kontrollien tietokannan mukaisia. Rotilla on osoitettu, että pienten määrien käsittelyä edeltävällä näytteenotolla (esim. alle 100 μl/päivä) on minimaalinen vaikutus mikrotuman taustataajuuteen (25).

MENETTELY

Eläinten lukumäärä ja sukupuoli

Mikrotuman vaste on yleensä samanlainen uros- ja naaraspuolisilla eläimillä ja tästä syystä useimmat tutkimukset voidaan suorittaa jompaakumpaa sukupuolta käyttäen (26). Tiedot, jotka osoittavat merkittäviä urosten ja naaraiden välisiä eroja (esim. systeemisen toksisuuden, aineenvaihdunnan, biologisen saatavuuden, luuytimeen liittyvän toksisuuden erot, mukaan lukien esimerkiksi raja-annostutkimus) voisivat kannustaa käyttämään molempia sukupuolia. Tällaisessa tapauksessa voi olla tarkoituksenmukaista tehdä tutkimus molemmilla sukupuolilla esim. osana toistuvan annostelun toksisuustutkimusta. Molempia sukupuolia käytettäessä saattaa olla tarkoituksenmukaista tehdä yhdistelykoe.. Tarkempia tietoja siitä, miten tietoja yhdistelykokeessa analysoidaan, annetaan lisäyksessä 2.

Ryhmäkoot varmistetaan tutkimuksen alussa, jotta tarjotaan vähintään viisi tutkimukseen soveltuvaa yhtä sukupuolta edustavaa eläintä, tai kustakin sukupuolesta (jos kumpiakin käytetään) ryhmää kohti. Jos ihmisen altistuminen tutkittavalle kemikaalille voi olla sukupuolesta riippuvaa, kuten joidenkin lääkeaineiden kohdalla, testi on tehtävä asianomaista sukupuolta olevilla eläimillä. Ohjeelliseksi maksimimääräksi eläimiä koskevien vaatimusten osalta annetaan, että luuydintutkimus tehdään 37 kohdassa vahvistettujen parametrien mukaan kolmella annosryhmällä ja rinnakkaisella negatiivisella ja positiivisella kontrolliryhmällä (kuhunkin ryhmään kuuluu viisi samaa sukupuolta olevaa eläintä), eli tarvitaan 25–35 eläintä.

Annostasot

Jos tehdään alustava annoksenmääritystutkimus, koska soveltuvia tietoja ei ole vielä käytettävissä annoksen valinnan opastukseen, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen samaa lajia, samaa kantaa, samaa sukupuolta olevia eläimiä ja samaa altistusohjelmaa kuin päätutkimuksessa on tarkoitus käyttää (27). Tutkimuksessa on pyrittävä tunnistamaan suurin siedetty annos, joka määritellään korkeimmaksi annokseksi, jota siedetään ilman näyttöä tutkimusta rajoittavasta toksisuudesta suhteessa tutkimuksen kestoon (esim. se aiheuttaa ruumiinpainon laskua tai vertavuotavan kudoksen sytotoksisuutta, mutta joka ei aiheuta kuolemaa eikä kipua, tuskaa tai kärsimystä, jonka vuoksi eläin on lopetettava inhimillisesti (28)).

Suurin annos voidaan määritellä myös annokseksi, joka aiheuttaa toksisuutta luuytimessä (esim. punasolujen esiasteiden osuuden pieneneminen punasolujen kokonaismäärästä luuytimessä tai perifeerisessä veressä yli 50 prosenttia, mutta vähintään 20 prosenttia vertailuarvosta). Kuitenkin, kun CD71-positiivisia soluja analysoidaan ääreisverenkierrossa (esim. virtaussytometrillä), tämä erittäin varhainen punasolujen esiasteiden fraktio vastaa toksisuuteen nopeammin kuin punasolujen esiasteiden suurempi RNA-positiivinen kohortti. Tästä syystä suurempi näennäinen toksisuus voi olla ilmeinen akuutin altistumisen malleissa, joissa tutkitaan CD71-positiivista punasolun esiasteen fraktiota verrattuna niihin, joissa punasolujen esiasteisiin liittyvä tunnistus perustuu RNA-sisältöön. Tästä syystä, kun kokeissa käytetään enintään viisi altistuspäivää, toksisuutta aiheuttavien testikemikaalien korkeimmaksi annostasoksi voidaan määritellä annos, joka aiheuttaa CD71-positiivisten punasolujen esiasteiden osuuden tilastollisesti merkittävän vähenemisen punasolujen kokonaismäärässä, mutta ei vähemmän kuin viisi prosenttia kontrollin arvosta (29).

Kemikaalit, jotka osoittavat toksikokineettisten ominaisuuksien saturaation tai aiheuttavat detoksikaatioprosesseja, jotka voivat johtaa altistuksen vähenemiseen pitkäaikaisen annostelun jälkeen, voivat muodostaa poikkeuksen annoksenmäärityskriteereihin, ja niitä on arvioitava tapauskohtaisesti.

Jotta saadaan annosvastetiedot, täydelliseen tutkimukseen on sisällyttävä negatiivisen kontrollin ryhmä ja vähintään kolme annostelutasoa, jotka yleensä erotetaan kertoimella 2, mutta enintään kertoimella 4. Jos testikemikaali ei aiheuta toksisuusvaikutusta annoksenmääritystutkimuksessa tai olemassa olevien tietojen perusteella, suurimman annoksen vähintään 14 päivän annostelun aikana pitäisi olla 1 000 mg/painokilo/päivä tai alle 14 päivän annostelun aikana 2 000 mg/painokilo/päivä. Jos testikemikaali aiheuttaa toksisuusvaikutuksen, suurimman siedetyn annoksen pitäisi olla korkein annettava annos, ja käytettävien annostasojen olisi mieluiten katettava vaihteluväli maksimista annokseen, jonka toksisuusvaikutus on vähäinen tai jolla ei ole toksisuusvaikutusta. Kun kohdekudoksen (luuytimen) toksisuusvaikutus havaitaan kaikilla testatuilla annostasoilla, on suositeltavaa tehdä täydentävä tutkimus ei-toksisilla annoksilla. Tutkimukset, joiden tarkoituksena on kuvata täydellisesti määrällisiä annos-vastetietoja, voivat vaatia täydentäviä annosryhmiä. Nämä rajat voivat vaihdella tietyntyyppisten testikemikaalien osalta (esim. ihmisten lääkkeet), jotka kuuluvat erityisvaatimusten piiriin.

Raja-annostesti

Jos pitoisuusalueenmäärittelykokeet tai olemassa olevat tiedot vastaavista eläinkannoista osoittavat, että vähintään raja-annokseen (kuvattu jäljempänä) perustuva altistusohjelma ei tuota havaittavia toksisuusvaikutuksia (ei esim. luuytimeen liittyvän proliferaation vähentymistä tai muita todisteita kohdekudoksen sytotoksisuudesta), ja jos genotoksisuuden ei oleteta perustuvan in vitro -genotoksisuustutkimuksiin tai tietoihin rakenteellisesti samankaltaisista kemikaaleista, täydellistä tutkimusta kolmella annostasolla ei ehkä pidetä tarpeellisena, mikäli on osoitettu, että testikemikaalit saavuttavat kohdekudoksen (luuytimen). Tällaisissa tapauksissa yksi annostaso raja-annoksena saattaa riittää. Kun annostelu kestää vähintään 14 päivää, annos on 1 000 mg/painokiloa/päivä. Kun annostelu kestää alle 14 päivää, annos on 2 000 mg/painokiloa/päivä.

Antotapa

Testin suunnittelussa on otettava huomioon oletettu ihmisen altistusreitti. Siksi perustelluksi altistusreitiksi voidaan valita esim. ravinto tai juomavesi, ihonalainen, suonensisäinen, oraalinen (letkuruokinnalla), altistus hengitysteitse, henkitorven tai implantaation kautta kulkeva reitti. Joka tapauksessa reitti on valittava, jotta varmistetaan kohdekudosten riittävä altistus. Intraperitoneaalista injektiota ei yleensä suositella, koska se ei ole tarkoitettu ihmisen altistumisreitiksi, ja sitä tulisi käyttää vain erityisten tieteellisien perusteiden nojalla. Jos testikemikaali sekoitetaan ravintoon tai juomaveteen, varsinkin jos kyse on yhdestä annoksesta, on huolehdittava siitä, että viive ravinnon ja veden kulutuksen ja näytteenoton välillä on riittävä, jotta vaikutukset voidaan havaita (ks. 37 kohta). Suurin letkuruokinnan tai injektion avulla kerralla annettava nestemäärä määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Määrä ei saa normaalisti ylittää 1 ml/100 g painoa. Poikkeuksen muodostavat vesiliuokset, joita käytettäessä enimmäistilavuus voi olla 2 ml/100 g painoa. Tätä suurempien määrien käyttö on perusteltava. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyttäviä testikemikaaleja, joiden vaikutukset yleensä pahenevat korkeammilla pitoisuuksilla, testikemikaalimäärän vaihtelu on minimoitava säätämällä pitoisuutta, jotta annostelun vakiotilavuus suhteessa ruumiinpainoon taataan kaikilla annostasoilla.

Altistusohjelma

Mieluiten tehdään ainakin kaksi käsittelyä, jolloin annos annetaan 24 tunnin välein erityisesti, kun tämä testi sisällytetään muihin toksisuustutkimuksiin. Vaihtoehtoisesti voidaan antaa yksittäisiä annoksia, jos tämä on tieteellisesti perusteltua (esim. testikemikaalien tiedetään estävän solusyklin). Testikemikaalit voidaan antaa myös eri annoksina, eli kaksi tai useampaa altistuskertaa samana päivänä korkeintaan 2–3 tunnin välein, mikä helpottaa suurten määrien antamista. Näissä olosuhteissa, tai testikemikaalia hengitysteitse annettaessa, näytteenottoaika tulee ajoittaa edellisen annostuksen tai altistuksen päättymisajan perusteella.

Testi voidaan tehdä hiirillä tai rotilla kolmella eri tavalla:

a.

Eläimet altistetaan testikemikaalille yhden kerran. Luuydinnäytteitä otetaan vähintään kaksi kertaa (yksittäisestä eläinryhmästä) siten, että ensimmäinen näyte otetaan aikaisintaan 24 tunnin ja viimeinen viimeistään 48 tunnin kuluttua altistuksesta, ja näytteenottokertojen välillä on sopiva väli, ellei ole tiedossa, että testikemikaalilla on erityisen pitkä puoliintumisaika. Mikäli näytteitä otetaan aikaisemmin kuin 24 tunnin kuluttua, tämä on perusteltava. Perifeerisestä verestä otetaan näytteitä vähintään kaksi kertaa (samasta eläinryhmästä) siten, että ensimmäinen näyte otetaan aikaisintaan 36 tunnin kuluttua altistuksesta ja seuraavat sopivan ajan kuluttua siitä, kuitenkin viimeistään 72 tunnin kuluttua altistuksesta. Ensimmäisellä näytteenottokerralla kaikkia annosryhmiä on altistettava ja näytteitä on kerättävä analyysiin; myöhemmillä näytteenottokerroilla tarvitsee ainoastaan antaa korkein annos. Mikäli positiivinen vaste havaitaan yhden näytteenottokerran jälkeen, lisänäytteitä ei tarvita, ellei tarvita määrällistä annos-vastetietoa. Kuvatut näytteenottoajat johtuvat mikrotumien esiintymistä ja häviämistä koskevasta kinetiikasta näissä kahdessa kudososassa.

b.

Jos päivittäisiä altistuskertoja on kaksi tai useampia (esim. kaksi altistusta 24 tunnin välein), näytteet on otettava luuytimestä kerran 18–24 tunnin kuluttua viimeisestä altistuksesta tai perifeerisestä verestä kerran 36–48 tunnin kuluttua viimeisestä altistuksesta. (30). Kuvatut näytteenottoajat johtuvat mikrotumien esiintymistä ja häviämistä koskevasta kinetiikasta näissä kahdessa kudososassa.

c.

Jos käytetään kolmea tai useampaa päivittäistä käsittelyä (esim. kolmea tai useampaa käsittelyä noin 24 tunnin välein), luuytimen näytteet on otettava viimeistään 24 tunnin kuluessa viimeisestä käsittelystä ja perifeerinen veri on otettava viimeistään 40 tunnin kuluttua viimeisestä käsittelystä (31). Tähän käsittelymalliin sisältyy comet-testin (esim. näytteenotto 2–6 tunnin kuluttua viimeisestä käsittelystä) yhdistäminen mikrotumatestiin sekä mikrotumatestin sisällyttäminen toistuvan annostelun toksisuustutkimuksiin. Kertyneet tiedot osoittavat, että mikrotuman indusoituminen voidaan havaita laajempina aikaväleinä kolmen tai useamman annostelun jälkeen (15).

Muita annostelu- tai näytteenotto-ohjelmia voidaan käyttää tarvittaessa ja tieteellisten perustelujen nojalla ja kun helpotetaan tietojen sisällyttämistä muihin toksisuustutkimuksiin.

Havainnot

Koe-eläimiä koskevia yleisiä kliinisiä havaintoja tulee tehdä ja kliinisiä oireita kirjata ainakin kerran päivässä, mieluiten samaan aikaan joka päivä ottaen huomioon se, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut vaikutukset ovat suurimmillaan. Kaikkien eläinten sairastuvuutta ja kuolleisuutta on havainnoitava ainakin kahdesti vuorokaudessa annostelun aikana. Eläimet on punnittava tutkimuksen alussa ja vähintään kerran viikossa toistuvan annoksen tutkimuksissa ja lopetettaessa. Vähintään viikon kestävissä tutkimuksissa ravinnonkulutuksen mittaus on tehtävä vähintään viikoittain. Mikäli testikemikaalia annostellaan juomaveteen, veden kulutusta on mitattava, kun vesi vaihdetaan tai ainakin kerran viikossa. Eläimet, joilla ilmenee ei-letaaleja merkkejä liiallisesta myrkytysvaikutuksesta, on lopetettava inhimillisesti ennen tutkimusajan päättymistä (28). Tietyissä olosuhteissa eläimen kehon lämpötilaa voidaan tarkkailla, koska käsittelyn aiheuttama hyper- ja hypotermia ovat tuottaneet vääriä tuloksia (32) (33) (34).

Kohdekudoksen altistaminen

Verinäyte on otettava sopivana ajankohtana, jotta voidaan tutkia testikemikaalien plasmatasot luuytimen altistumisen osoittamiseksi, jos tämä on perusteltua ja jos muita altistustietoja ei ole (ks. 48 kohta).

Luuydin-/veripreparaatit

Luuydinsolut otetaan yleensä eläinten reisiluista tai sääriluista heti koe-eläinten inhimillisen lopettamisen jälkeen. Solut poistetaan, niistä tehdään preparaatit ja ne värjätään vakiintuneilla värjäysmenetelmillä. Pieniä määriä perifeerista verta voidaan ottaa asiaankuuluvien eläinten hyvinvointia koskevien vaatimusten perusteella joko käyttämällä menetelmää, joka sallii koe-eläimen selviytymisen, kuten veri häntälaskimosta tai muusta sopivasta verisuonesta, tai sydänpunktio taikka näytteenotto suurikokoisesta suonesta lopettamisen yhteydessä. Kun kyse on luuytimestä tai perifeerisestä verestä peräisin olevista punasoluista, solut voidaan analyysimenetelmästä riippuen värjätä välittömästi supravitaaliväreillä (16) (17) (18) tai niistä tehdään ensin sivelyvalmisteet ja ne värjätään sen jälkeen mikroskooppitutkimukseen tai ne fiksoidaan ja värjätään asianmukaisesti virtaussytometrista tutkimusta varten. DNA-spesifisen väriaineen (esimerkiksi akridiinioranssin (35) tai Hoechst 33258:n plus pyroniini-Y:n (36)) käytöllä voidaan eliminoida joitakin ei-DNA-spesifisen väriaineen käyttöön liittyviä artefakteja. Tämä etu ei sulje pois tavanomaisten väriaineiden (esim. Giemsa mikroskooppitutkimuksessa) käyttöä. Myös muita järjestelmiä [esim. selluloosapylväitä tumallisten solujen poistamiseksi (37) (38)] voidaan käyttää, mikäli nämä menetelmät on laboratoriossa osoitettu yhteensopivaksi näytteen valmistuksen kanssa.

Jos nämä menetelmät ovat sovellettavissa, antikinetokorivasta-aineita (39), fluoresenssi- in situ -hybridisaatiota pansentromeerisillä DNA-koettimilla (40), tai suoraa in situ -merkintää, johon liittyy pansentromeerispesifisiä alukkeita yhdessä sopivan DNA:n vastavärjäyksen (41) kanssa, voidaan käyttää tunnistamaan mikrotumien (kromosomin/kromosomifragmentin) luonne, jotta voidaan määrittää, johtuuko mikrotuman indusoitumismekanismi klastogeenisesta ja/tai aneugeenisesta vaikutuksesta. Muita klastogeenien ja aneugeenien erottelumenetelmiä voidaan käyttää, jos menetelmät on osoitettu tehokkaiksi.

Analyysi (manuaalinen ja automaattinen)

Kaikki objektilasit tai näytteet, myös ne, joilla on positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen minkäänlaista tutkimusta ja jaettava satunnaisotannalla siten, että laskija ei tiedä altistusolosuhteista; tällainen koodaus ei ole tarpeen käytettäessä automaattisia pisteytysjärjestelmiä, jotka eivät ole riippuvaisia silmämääräisestä tarkastuksesta ja joihin eivät vaikuta toimijan ennakkokäsitykset. Punasolujen esiasteiden osuus koko punasolumäärästä (esiasteet + kypsät punasolut) määritetään jokaisen eläimen osalta erikseen laskemalla yhteensä vähintään 500 punasolua luuytimestä ja 2 000 punasolua perifeerisestä verestä (42). Mikrotumaisten punasolujen esiasteiden esiintymistaajuuden määrittämistä varten on laskettava vähintään 4 000 punasolun esiastetta eläintä kohti (43). Jos aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokanta osoittaa, että mikrotumaisten punasolujen esiasteiden taustaesiintyvyys on <0,1 % testilaboratoriossa, on harkittava ylimääräisten solujen laskentaa. Näytteitä analysoitaessa punasolujen esiasteiden osuus testikemikaalia saaneiden eläinten punasolujen kokonaismäärästä pitäisi olla vähintään 20 prosenttia kantaja-aine-/liuotinkontrollin osuudesta, kun laskenta tehdään mikroskoopilla, ja vähintään noin 5 prosenttia kantaja-aine-/liuotinkontrollin osuudesta, kun, CD71+ -punasolujen esiasteita lasketaan sytometrisillä menetelmillä (ks. 31 kohta) (29). Esim. mikroskoopilla laskettavassa luuydinkokeessa, jos punasolujen esiasteen kontrolliosuus luuytimessä on 50 prosenttia, toksisuuden yläraja käsittää 10 prosenttia punasolujen esiasteita.

Koska rotan perna eristää ja tuhoaa mikrotumaisia punasoluja, on suositeltavaa rajoittaa mikrotumaisten punasolujen esiasteiden analyysi varhaisimpaan fraktioon. Siten pidetään yllä määritysmenetelmän korkeaa herkkyyttä rotan perifeerista verta analysoitaessa. Kun käytetään automaattisia analyysijärjestelmiä, punasolujen varhaisimmat esiasteet voidaan määrittää niiden korkean RNA-pitoisuuden tai niiden pinnalla olevan transferiinireseptoreiden (CD71+) korkean tason (31) perustella. Kuitenkin suora vertailu eri värjäysmenetelmien välillä on osoittanut, että tyydyttäviä tuloksia voidaan saada erilaisilla menetelmillä, myös perinteisellä akridiinioranssivärjäyksellä (3) (4).

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten käsittely

Yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot on esitettävä taulukossa. Punasolujen esiasteiden laskettu määrä, mikrotumaisten punasolujen esiasteiden lukumäärä ja punasolujen esiasteiden osuus koko punasolumäärästä on lueteltava kunkin analysoidun eläimen osalta erikseen. Kun hiiriä käsitellään jatkuvasti vähintään neljän viikon ajan, tiedot mikrotumaisten kypsien punasolujen määrästä ja osuudesta on myös annettava, jos tämä kerätään. Eläinten toksisuustiedot ja kliiniset oireet on myös raportoitava.

Hyväksyttävyysperusteet

Testin hyväksyttävyys määritetään seuraavilla kriteereillä:

a.

Rinnakkaisten negatiivisten kontrollien tietoja pidetään hyväksyttävinä lisättäviksi laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokantaan (ks. 15–18 kohta).

b.

Rinnakkaisten positiivisten kontrollien tai pisteytysvalvonnan on indusoitava vasteita, jotka ovat yhteensopivia aikaisempien positiivisten kontrollien tietokannan vasteiden kanssa ja tuotettava tilastollisesti merkittävä lisääntyminen verrattuna rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin (ks. 24-25) kohta.

c.

Asianmukainen määrä annoksia ja soluja on analysoitu.

d.

Perusteet korkeimman pitoisuuden valitsemiseksi ovat yhdenmukaisia 30–33 kohdassa kuvattujen perusteiden kanssa.

Tulosten arviointi ja tulkinta

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi positiivinen, mikäli:

a.

ainakin yhdessä tutkimusryhmässä mikrotumaisten punasolujen esiasteiden taajuus on lisääntynyt tilastollisesti merkittävällä tavalla verrattuna rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin

b.

lisäys riippuu annoksesta ainakin yhdellä näyttöönottokerralla, kun sitä arvioidaan asiaankuuluvalla trenditestillä

c.

jokin tuloksisista on aikaisempien negatiivisen kontrollin tietojen jakauman ulkopuolella (esim. Poissonin jakaumaan perustuvat 95 %:n kontrollirajat).

Jos vain suurinta annosta tutkitaan tietyllä näytteenottokerralla, testikemikaalia pidetään selvästi positiivisena, mikäli esiintyy tilastollisesti merkittävää kasvua rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin verrattuna ja tulokset ovat aikaisempien negatiivisen kontrollin tietojen jakauman ulkopuolella (esim. Poissonin jakaumaan perustuvat 95 %:n kontrollirajat). Lähdekirjallisuudessa on suosituksia soveltuvimmista tilastollisista menetelmistä (44) (45) (46) (47). Kun tehdään annos–vaste-analyysi, on analysoitava ainakin kolmea altistettua annosryhmää. Tilastollisissa testeissä kokeellisena yksikkönä olisi käytettävä eläintä. Mikrotumatestissä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että testikemikaali aiheuttaa mikrotumia, jotka ovat seurausta kromosomivauriosta tai mitoosilaitteen vauriosta testatun lajin erytroblasteissa. Tapauksessa, jossa testi tehtiin sentromeerien havaitsemiseen mikrotumissa, testikemikaali, joka tuottaa sentromeeria sisältäviä mikrotumia (sentromeerinen DNA tai kinetokori, joka indusoi koko kromosomin häviämisen) on osoitus siitä, että testikemikaali on aneugeeni.

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi negatiivinen, jos kaikissa tutkituissa koeolosuhteissa:

a.

yhdessäkään tutkimusryhmässä mikrotumaisten punasolujen esiasteiden taajuus ei ole lisääntynyt tilastollisesti merkittävällä tavalla verrattuna rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin

b.

annoksesta riippuvaa lisääntymistä ei esiinny millään näytteenottokerralla asianmukaisella trenditestillä arvioituna

c.

kaikki tulokset ovat aikaisempien negatiivisen kontrollin tietojen jakauman puitteissa (esim. Poissonin jakaumaan perustuvat 95 %:n kontrollirajat)

d.

luuydin on altistunut testikemikaaleille.

Lähdekirjallisuudessa on suosituksia soveltuvimmista tilastollisista menetelmistä (44) (45) (46) (47). Näyttöön luuytimen altistumisesta testikemikaalille voi sisältyä punasolujen esiasteiden ja kypsien punasolujen suhteen alentuminen tai testikemikaalien plasman tai veritasojen mittaaminen. Laskimonsisäisen annostelun tapauksessa näyttöä altistumisesta ei tarvita. Vaihtoehtoisesti luuytimen altistumisen osoittamiseen voidaan käyttää samalla altistustavalla ja samalla eläinlajilla tehdyn riippumattoman tutkimuksen tietoja. Negatiiviset tulokset osoittavat, ettei tutkittava kemikaali aiheuta koeolosuhteissa mikrotumia testattujen lajien punasolujen esiasteissa.

Selvästi positiivista tai negatiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa.

Tapauksissa, joissa vaste ei ole selvästi negatiivinen tai positiivinen tai tuloksen biologisen merkityksellisyyden vahvistaminen kaipaa tukea (esim. heikko tai rajatapaukseksi luokiteltava lisäys), tietoja tulee arvioida asiantuntija-arvioinnissa ja/tai loppuun saatettuihin kokeisiin liittyvissä lisätutkimuksissa. Joissakin tapauksissa useampien solujen analysointi tai toistokokeen suorittaminen mahdollisesti käyttämällä mukautettuja koeolosuhteita voi olla hyödyllistä.

Harvoissa tapauksissa edes lisätutkimusten pohjalta ei voida päätellä, että testikemikaali tuottaa positiivisia tai negatiivisia tuloksia, ja sen vuoksi tutkimusta pidetään epäselvänä.

Testiraportti

Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:

 

Yhteenveto

 

Testikemikaali:

alkuperä, erän numero, viimeinen käyttöpäivä, jos sellainen on

testikemikaalin stabiilius, jos tiedossa.

 

Yhdestä ainesosasta koostuva aine:

ulkonäkö, vesiliukoisuus ja muut asiaankuuluvat fysikokemialliset ominaisuudet

kemialliset tunnistetiedot, kuten IUPAC- tai CAS-nimi, CAS-numero, SMILES- tai InChI-koodi, rakennekaava, puhtaus, tarvittaessa ja sen mukaan kuin käytännössä on mahdollista, epäpuhtauksien kemikaaliset tunnistetiedot ja niin edelleen.

 

Useista aineosista koostuvat aineet, koostumukseltaan tuntemattomat tai vaihtelevat aineet ja seokset:

luonnehditaan mahdollisimman tarkoin esimerkiksi sen ainesosien kemiallisten tunnistetietojen (ks. edellä), esiintymistaajuuden ja fysikaalis-kemiallisten ominaisuuksien avulla.

 

Testikemikaalin valmistus

kantaja-aineen valintaperusteet

tutkittavan aineen liukoisuus ja stabiliteetti liuottimessa/kantaja-aineessa, jos tiedossa

ruoka-aineen, juomaveden tai inhalaatioiden formulointi

formulointien analyyttiset määritelmät (kuten stabiilius, homogeenisyys, nimelliset pitoisuudet), kun niitä käytetään.

 

Koe-eläimet:

käytetty eläinlaji/kanta ja perustelu sen käytölle

eläinten lukumäärä, ikä ja sukupuoli

lähde, elinolosuhteet, ravinto jne.

menettely eläinten yksilölliseksi tunnistamiseksi

lyhytkestoisissa tutkimuksissa: kunkin eläimen paino kokeen alkaessa ja päättyessä; yli viikon kestävissä tutkimuksissa: kunkin eläimen paino tutkimuksen aikana ja ravinnonkulutus. Kunkin ryhmän painon vaihteluväli, keskiarvo ja keskihajonta on sisällytettävä kokeeseen.

 

Testiolosuhteet:

positiiviset ja negatiiviset (kantaja-aine/liuotin) kontrollitiedot

mahdolliset raja-annostutkimuksen tulokset

annostasojen valintaperusteet

testikemikaalin valmistelun yksityiskohdat

testikemikaalin annostelun yksityiskohdat

altistustavan ja annostelun keston valintaperusteet

menetelmät, joilla on vahvistettu testikemikaalin pääsy yleiseen verenkiertoon tai kohdekudokseen

todellinen annos (mg/painokilo/vrk), joka lasketaan ravintoon/juomaveteen sekoitetun testikemikaalin pitoisuudesta (ppm) ja kulutuksesta tarvittaessa

yksityiskohdat ravinnon ja veden laadusta

lopettamistapa

kivunlievitysmenetelmä (jos sitä on käytetty)

yksityiskohtaiset tiedot koe- ja näyteaikataulusta ja perustelut valinnoille

objektilasien valmistusmenetelmät

menetelmät eristää ja säilöä näytteitä

toksisuuden mittausmenetelmät

mikrotumaisten punasolujen esiasteiden laskentaperusteet

mikrotumaisten punasolujen esiasteiden taajuuden määrittelyyn ja punasolujen esiasteiden ja kypsien punasolujen suhteen määrittelyyn analysoitujen solujen lukumäärä eläintä kohti

tutkimuksen hyväksyvyyttä koskevat perusteet

menetelmät, kuten antikinetokorivasta-aineiden tai sentromeerispesifisten DNA-koettimien käyttö sen määrittämiseen, sisältyykö mikrotumiin kokonaisia kromosomeja tai niiden fragmentteja, tarvittaessa.

 

Tulokset:

eläimen kunto koeaikaa ennen ja sen aikana, mukaan lukien toksisuusoireet

punasolujen esiasteiden osuus punasolujen kokonaismäärästä

mikrotumaisten punasolujen esiasteiden lukumäärä, ilmoitetaan erikseen jokaisesta eläimestä

mikrotumaisten punasolujen esiasteiden keskiarvo ± keskihajonta ryhmää kohti

annos-vastesuhde, jos mahdollista

käytetyt tilastolliset analyysit ja menetelmät

rinnakkaisista negatiivisista ja positiivisista kontrolleista saadut tulokset, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat

aikaisemman negatiivisen ja positiivisen kontrollin tiedot, myös vaihteluvälit, keskiarvot ja keskihajonnat, 95 prosentin kontrollirajat jakaumille sekä katettu aika ja datapisteiden määrä

tiedot, jotka osoittavat luuytimen altistumisen

niiden tietojen luonnehdinta, jotka osoittavat, sisältävätkö mikrotumat kokonaisia kromosomeja tai niiden fragmentteja, tarvittaessa

perusteet positiiviselle tai negatiiviselle vasteelle, jotka on täytetty.

 

Tulosten tarkastelu.

 

Päätelmät.

 

Viitteet.

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Hayashi, M. et al. (2007), in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, s. 10–30.

(3)

MacGregor, J.T. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat, Toxicology Sciences, Vol. 94/1, s. 92–107.

(4)

Dertinger, S.D. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring, Toxicological Sciences, Vol. 94/1, s. 83–91.

(5)

Dertinger, S.D. et al. (2011), Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes: an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage, Mutagenesis, Vol. 26/1, s. 139–145.

(6)

Parton, J.W., W.P. Hoffman, M.L. Garriott (1996), Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system, Mutation Research, Vol. 370/1, s. 65–73.

(7)

Asano, N. et al. (1998), An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 404/1-2, s. 149–154.

(8)

Styles, J.A. et al. (2001), Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry, Cytometry, Vol. 44/2, s. 153–155.

(9)

Heddle, J.A. (1973), A rapid in vivo test for chromosomal damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 18/2, s. 187–190.

(10)

Schmid, W. (1975), The micronucleus test, Mutation Research, Vol. 31/1, s. 9–15.

(11)

Heddle, J.A. et al. (1983), The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 123/1, s. 61–118.

(12)

Mavournin, K.H. et al. (1990), The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 239/1, s. 29–80.

(13)

MacGregor, J.T. et al. (1983), Micronuclei in circulating erythrocytes: a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice, Developments in Toxicology Environmental Science, Vol. 11, s. 555–558.

(14)

MacGregor, J.T. et al. (1987), Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 189/2, s. 103–112.

(15)

MacGregor, J.T. et al. (1990), The in vivo erythrocyte micronucleus test: measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies, Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 14/3, s. 513–522.

(16)

Hayashi, M. et al. (1990), The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 245/4, s. 245–249.

(17)

CSGMT/JEMS.MMS – The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining: the summary report of the 5th collaborative study, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 278/2-3, s. 83–98.

(18)

CSGMT/JEMS.MMS – The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, Vol. 10/3, s. 153–159.

(19)

Salamone, M.F., K.H. Mavournin (1994), Bone marrow micronucleus assay: a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 23/4, s. 239–273.

(20)

Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 453/1, s. 45–50.

(21)

Hayes, J. et al. (2009), The rat bone marrow micronucleus test--study design and statistical power, Mutagenesis, Vol. 24/5, s. 419–424.

(22)

Wakata, A. et al. (1998), Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 32/1, s. 84–100.

(23)

Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.

(24)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, s. 87–90.

(25)

Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, s. 108–120.

(26)

Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, s. 293–304.

(27)

Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, s. 313–319.

(28)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.

(29)

LeBaron, M.J. et al. (2013), Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/3, s. 222–228.

(30)

Higashikuni, N., S. Sutou (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 +/- 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, Vol. 10/4, s. 313–319.

(31)

Hayashi, M. et al. (2000), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, s. 234–252.

(32)

Asanami, S., K. Shimono (1997), High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 390/1-2, s. 79–83.

(33)

Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), Transient hypothermia induces micronuclei in mice, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 413/1, s. 7–14.

(34)

Spencer, P.J. et al. (2007), Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia, Toxicological Sciences, Vol. 97/1, s. 120–127.

(35)

Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Research Letters, Vol. 120/4, s. 241–247.

(36)

MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y, Mutation Research, Vol. 120/4, s. 269–275.

(37)

Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 213/1, s. 91–104.

(38)

Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure, Mutation Research, Vol. 439/1, s. 121–126.

(39)

Miller, B.M., I.D. Adler (1990), Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo, Mutagenesis, Vol. 5/4, s. 411–415.

(40)

Miller, B.M. et al. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, Vol. 6/4, s. 297–302.

(41)

Russo, A. (2002), PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage, American Journal of Medical Genetics, Vol. 107/2, s. 99–104.

(42)

Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Research, Vol. 347/2, s. 97–99.

(43)

OECD (2014), Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.

(44)

Richold, M. et al. (1990), In vivo Cytogenetics Assays, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 115–141.

(45)

Lovell, D.P. et al. (1989), Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (toim.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 184–232.

(46)

Hayashi, M. et al. (1994), Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay, Environmental Health Perspectives, Vol. 102/Suppl 1, s. 49–52.

(47)

Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 469/2, s. 233–241.

Lisäys 1

MÄÄRITELMÄT

Erytroblasti : varhainen vaihe punasolun kehityksessä, joka edeltää välittömästi punasolun esiastetta, jossa soluun sisältyy yhä tuma.

Kemikaali : aine tai seos.

Kinetokori : proteiinirakenne, joka muodostuu eukaryoottisolujen sentometrin päälle ja joka yhdistää kromosomin tumasukkulan mikrotubuluksen sukkularihmoihin mitoosin ja meioosin aikana ja toimii solunjakautumisen aikana ohjaten sisarkromatidit irti toisistaan.

Mikrotumat : pieniä solun päätumasta erillisiä ja niiden rinnalla esiintyviä tumia, jotka muodostuvat mitoosin (meioosin) telofaasin aikana hitaasti liikkuvista (lagging) kromosomikappaleista tai kokonaisista kromosomeista.

Normokromaattinen tai kypsä punasolu : täysin kypsä punasolu, joka on menettänyt enukleaation jälkeen jäljellä olevan RNA:n ja/tai on menettänyt muut lyhytaikaiset solumarkkerit, jotka tyypillisesti häviävät enukleaation jälkeen viimeisen erytroblastin jakautumisen jälkeen.

Polykromaattinen punasolu tai punasolun esiaste : äskettäin muodostunut punasolu kehityksen välivaiheessa, joka värjää siniset ja punaiset komponentit klassisessa veren värjäyksessä (kuten Wrightin-Giemsan värjäys), koska vasta muodostuneeseen soluun sisältyy RNA:ta. Tällaiset äskettäin muodostuneet solut ovat likimain samanlaisia kuin retikulosyytit, joita visualisoidaan käyttämällä vitaalivärjäystä aiheuttaen jäännöksenä olevan solun RNA:n kasautumisen retikulumiksi. Muita menetelmiä, kuten RNA:n yksiväristä värjäystä fluoresoivilla väreillä tai lyhytikäisten pintamarkkereiden, kuten CD71:n merkitsemistä fluoresoivilla vasta-aineilla käytetään tällä hetkellä usein tunnistamaan vasta muodostuneet punasolut. Polykromaattiset punasolut, retikulosyytit ja CD71-positiiviset punasolut ovat punasolujen esiasteita, vaikka jokaisella on hieman erilainen elinaikajakauma.

Retikulosyytti : vasta muodostunut punasolu, joka on värjätty vitaalivärjäyksellä aiheuttaen jäännöksenä olevan solun RNA:n kasautumisen retikulumiksi. Retikulosyyteillä ja polykromaattisilla punasoluilla on samanlainen solun ikäjakauma.

Sentromeeri : kromosomin alue (alueita), joihin sukkularihmat ovat kiinnittyneet solunjakautumisen aikana. Tähän perustuu tytärkromosomien järjestäytynyt siirtyminen tytärsolujen napoihin.

Testikemikaali : Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

Lisäys 2

YHDISTELYKOE SUKUPUOLTEN EROJEN TUNNISTAMISEKSI IN VIVO -MIKROTUMATESTISSÄ

Yhdistelykoe ja sen analysointi

Tässä kokeessa vähintään viisi urosta ja viisi naarasta testataan kullakin pitoisuustasolla. Tämä johtaa koemalliin, jossa on vähintään 40 eläintä (20 urosta ja 20 naarasta sekä asiaankuuluvat positiiviset kontrollit).

Tämä koe, joka on yksi yksinkertaisimmista yhdistelykokeista, vastaa kaksisuuntaista varianssianalyysia, jossa sukupuoli ja pitoisuustaso ovat tärkeimmät vaikutukset. Tietoja voidaan analysoida käyttäen monia vakiintuneita tilastollisia ohjelmistopaketteja, kuten SPSS, SAS, STATA, Genstat ja R.

Tietoihin liittyvä vaihtelu ositetaan analyysissa sukupuolten ja pitoisuuksien väliseksi sekä sukupuolten ja pitoisuuksien väliseen yhdysvaikutukseen liittyväksi vaihteluksi. Kutakin perustetta testataan rinnakkaisten eläinten välisen vaihtelevuuden arvion perusteella samaa sukupuolta edustavissa eläinryhmissä, joille annetaan sama pitoisuus. Täydelliset tiedot menetelmästä annetaan useissa vakiintuneissa tilastollisissa oppikirjoissa (ks. viitteet) ja tilastopakettien tukitoiminnoissa.

Analyysissä tutkitaan sen jälkeen sukupuolen x pitoisuuteen liittyvä yhdysvaikutusyhdysvaikutustermi ANOVA-taulukossa (6). Merkitsevän yhdysvaikutustermin puuttuessa sukupuolten tai pitoisuustasojen yhdistetyt arvot ovat tasojen välisiä valideja tilastollisia testejä ANOVA-taulukon ryhmän sisäisen yhdistetyn vaihtelutekijän pohjalta.

Analyysi jatkuu siten, että arvio pitoisuuksien välisestä vaihtelusta jaetaan kontrasteihin, joista saadaan testi vasteiden lineaarisille ja kvadraattisille kontrasteille eri pitoisuustasoilla. Kun sukupuolen x pitoisuuteen liittyvä yhdysvaikutus on merkittävä, tämä termi voidaan myös osittaa sukupuoleen x liittyviksi lineaarisiksi ja sukupuoleen x liittyviksi kvadraattisiksi interaktiokontrasteiksi. Näiden tekijöiden perusteella voidaan testata, onko sukupuolten pitoisuusvaste rinnakkainen vai onko sukupuolten välillä vaste-eroa.

Arviota ryhmän sisäisestä yhdistetystä vaihtelusta voidaan käyttää keskiarvojen erotuksen parittaiseen testaukseen. Näitä vertailuja voitaisiin tehdä kummankin sukupuolen keskiarvojen välillä sekä eri pitoisuustasojen keskiarvojen välillä, kuten negatiiviisten kontrollitasojen kanssa. Kun yhdysvaikutus on merkitsevä, vertailuja voitaisiin tehdä eri pitoisuuksia saaneen yhden sukupuolen keskiarvojen välillä tai samaa pitoisuutta saaneiden molempien sukupuolten keskiarvojen välillä.

Viitteet

Asiasta on monia tilastollisia oppikirjoja, joissa käsitellään yhdistelmäkokeiden – jotka vaihtelevat yksinkertaisimmista kaksifaktorianalyyseistä kokeiden suunnittelumetodologiassa käytettyihin monimutkaisimpiin analyyseihin – teoriaa, suunnittelua, metodologiaa, analyysia ja tulkintaa. Seuraava luettelo ei ole tyhjentävä. Joissain kirjoissa annetaan esimerkkejä vertailukelpoisista malleista ja joissakin tapauksissa annetaan koodit analyysien tekemiseen erilaisia ohjelmistoja hyödyntämällä.

 

Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

 

Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

 

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

 

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

 

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

 

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

 

Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

6)

Poistetaan B osassa oleva B.15 luku.

7)

Poistetaan B osassa oleva B.16 luku.

8)

Poistetaan B osassa oleva B.18 luku.

9)

Poistetaan B osassa oleva B.19 luku.

10)

Poistetaan B osassa oleva B.20 luku.

11)

Poistetaan B osassa oleva B.24 luku.

12)

Korvataan B osassa oleva B.47 luku seuraavasti:

”B.47   Naudan sarveiskalvon sameuden ja läpäisevyyden testimenetelmä, jolla voidaan määrittää i) vakavia silmävaurioita aiheuttavat kemikaalit ja ii) kemikaalit, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 437 (2013). Naudan sarveiskalvon sameuden ja läpäisevyyden testimenetelmä (BCOP) on arvioitu vaihtoehtoisten menetelmien validoinnin virastojenvälisen koordinointikomitean (ICCVAM, Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) toimesta. Tutkimukseen ovat osallistuneet vaihtoehtoisten menetelmien eurooppalainen validointikeskus (ECVAM) ja Japanin vastaava keskus (JaCVAM) vuosina 2006 ja 2010 (1) (2). Ensimmäisellä kerralla arvioitiin BCOP-testimenetelmän käytettävyyttä vakavan silmävaurion aiheuttavien kemikaalien (aineiden ja seosten) tunnistamisessa (1). Toisella kerralla arvioitiin BCOP-testimenetelmän käytettävyyttä sellaisten kemikaalien (aineiden ja seosten) tunnistamisessa, joita ei luokitella silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta (2). BCOP-validointitietokanta sisälsi yhteensä 113 ainetta ja 100 seosta (2) (3). Arviointien ja niiden vertaisarvioiden perusteella katsottiin, että testimenetelmällä voidaan tunnistaa oikein sekä vakavia silmävaurioita aiheuttavat kemikaalit (aineet ja seokset) (luokka 1) että sellaiset, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavien silmävaurioiden osalta siten, kun se on määritetty Yhdistyneiden kansakuntien (YK) kemikaalien maailmanlaajuisesti yhdenmukaistetussa luokitus- ja merkintäjärjestelmässä (GHS-järjestelmässä) (4) ja aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta annetussa asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 (CLP-asetuksessa) (7), ja menetelmä on siten vahvistettu tieteellisesti päteväksi molempiin tarkoituksiin. Vakava silmävaurio on silmän kudosvaurio tai vakava fyysinen näön rappeutuminen, joka syntyy, kun testiainetta on annosteltu silmän pinnalle, eikä se palaudu täysin 21 päivän kuluessa annostelusta. Vakavan silmävaurion aiheuttavat testikemikaalit on luokiteltu YK:n GHS-luokkaan 1. Kemikaalit, joita ei ole luokiteltu silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta, on määritelty kemikaaleiksi, joita ei voida luokitella YK:n GHS-järjestelmän luokan 1 tai 2 (2A tai 2B) kemikaaleiksi, joten niitä kutsutaan kemikaaleiksi, joilla ei ole YK:n GHS-luokitusta. Tähän testimenetelmään kuuluvat BCOP-testimenetelmän suositeltu käyttö ja rajoitukset, jotka perustuvat BCOP:n arviointeihin. OECD:n testiohjeiden alkuperäisen vuoden 2009 version ja vuoden 2013 päivitetyn version tärkeimmät, mutta eivät ainoat, erot ovat: BCOP-testimenetelmän käyttö sellaisten kemikaalien tunnistamisessa, jotka eivät vaadi YK:n GHS-järjestelmän luokitusta (2 ja 7 kohdat); tarkennukset BCOP-testimenetelmän soveltuvuuteen alkoholien, ketonien ja kiintoaineiden (6 ja 7 kohdat) sekä aineiden ja seosten (8 kohta) testaamisessa; tarkennukset pinta-aktiivisten aineiden ja pinta-aktiivisia aineita sisältävien seosten suositeltavaan testaustapaan (28 kohta); positiivisia kontrolleja koskevat päivitykset ja tarkennukset (39 ja 40 kohdat); BCOP-testimenetelmän päätösperusteiden päivitys (47 kohta); tutkimuksen hyväksymisperusteiden päivitys (48 kohta); testiraportin osien päivitys (49 kohta); lisäyksen 1 määritelmien päivitys; lisäykseen 2 lisätty maininta BCOP-testimenetelmän ennustamiskyvystä eri luokitusjärjestelmissä; lisäyksessä 3 olevan pätevyyden osoittamiseen tarkoitettujen kemikaalien luettelon päivitys sekä lisäyksen 4 päivitys BCOP-testissä käytetyn sarveiskalvotelineen (1 kohta) ja opasitometrin (2 ja 3 kohdat) osalta.

Nykyään on yleisesti hyväksyttyä, että Draizen in vivo -silmätestiä ei lähitulevaisuudessa voida korvata millään yksittäisellä in vitro -silmä-ärsytystestillä, kun halutaan ennakoida kaikki eri kemikaaliluokkien aiheuttamien aiheuttamat ärsytykset. Draizen silmätesti voidaan mahdollisesti kuitenkin korvata käyttämällä monen vaihtoehtoisen testimenetelmän (porrastettua) testausstrategiaa (5). Ylhäältä alaspäin suuntautuva lähestymistapa (5) on tarkoitettu käytettäväksi silloin, kun olemassa olevien tietojen perusteella voidaan olettaa, että kemikaalin ärsytyskyky on korkea. Alhaalta ylöspäin suuntautuva lähestymistapa (5) on taasen tarkoitettu käytettäväksi silloin, kun olemassa olevien tietojen perusteella voidaan olettaa, että kemikaali ei aiheuta niin suurta silmä-ärsytystä, että se olisi luokiteltava. BCOP-testimenetelmä on in vitro -testimenetelmä, jota voidaan käyttää tietyissä olosuhteissa ja tietyin rajoituksin kemikaalien silmävaarallisuuden luokitukseen ja merkintään. Vaikka BCOP-testimenetelmää ei pidetäkään yksinään luotettavana in vivo -kaninsilmätestin korvaavana testinä, sitä suositellaan Scott et al.:n ehdotuksen kaltaisen ylhäältä alaspäin suuntautuvan testausstrategian ensimmäiseksi vaiheeksi (5) käytettäväksi vakavan silmävaurion aiheuttavien kemikaalien eli YK:n GHS-luokkaan 1 luokiteltujen kemikaalien tunnistamisessa ilman lisätestejä (4). BCOP-testimenetelmää suositellaan myös sellaisten kemikaalien tunnistamiseen, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta sellaisena, kuin ne on määritetty YK:n GHS-järjestelmässä (ei YK:n GHS-luokitusta) (4) osana ylhäältä alaspäin suuntautuvan lähestymistavan kaltaista testausstrategiaa (5). Lopullisen luokituksen vahvistamiseksi kemikaali, jonka ei ennusteta aiheuttavan vakavaa silmävaurioita tai jota ei ole luokitettu BCOP-testimenetelmällä silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta, on kuitenkin testattava (in vitro ja/tai in vivo) lisätesteillä.

Tässä testimenetelmässä kuvataan menettelyt, joilla arvioidaan testikemikaalin mahdollinen vaarallisuus silmälle mittaamalla kykyä aiheuttaa sameutta ja läpäisevyyden lisääntymistä eristetyssä naudan sarveiskalvossa. Myrkylliset vaikutukset sarveiskalvoon mitataan seuraavilla menetelmillä: i) valo läpikulun (transmission) vähentyminen (sameus) ja ii) natriumfluoreseiini-väriaineen lisääntynyt siirtyminen silmään (läpäisevyys). Testikemikaalille altistuksen jälkeen tehtyjä sarveiskalvon sameus- ja läpäisevyysarviointeja tarkastellaan yhdessä siten, että voidaan johtaa in vitro -ärsyttävyysarvo (In vitro Irritancy Score, IVIS), jonka avulla luokitellaan testikemikaalin ärsyttävyystaso.

Määritelmät ovat lisäyksessä 1.

ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT JA RAJOITUKSET

Tämä testimenetelmä perustuu ICCVAMin ICE-testimenetelmäprotokollaan (6) (7), joka kehitettiin alun perin In vitro -tieteiden instituutin (IIVS) protokollasta ja INVITTOX-protokollasta 124 saatujen tietojen pohjalta (8). Viimeksi mainittua käytettiin Euroopan yhteisöjen rahoittamassa validointia edeltävässä tutkimuksessa vuosina 1997–1998. Molemmat protokollat perustuivat BCOP-testimenetelmään, jonka raportoivat ensimmäisenä Gautheron et al. (9)

BCOP-testimenetelmää voidaan YK:n GHS-järjestelmän mukaan vakavan silmävaurion aiheuttavaksi kemikaaliksi määritettyjen kemikaalien eli YK:n GHS-luokkaan 1 luokiteltujen kemikaalien tunnistamiseen (4). Tähän käyttötarkoitukseen käytettynä BCOP-testimenetelmän yleinen tarkkuus on 79 % (150/191), väärien positiivisten tulosten osuus 25 % (32/126) ja väärien negatiivisten tulosten osuus 14 % (9/65) verrattuna kanin silmällä tehdyllä in vivo -testimenetelmällä saatuihin tietoihin luokiteltuna YK:n GHS-luokitusjärjestelmän mukaisesti (3) (ks. lisäys 2, taulukko 1). Kun tiettyihin kemiallisiin luokkiin (kuten alkoholit, ketonit) tai fysikaalisiin luokkiin (kuten kiintoaineet) kuuluvat testikemikaalit poistetaan tietokannasta, BCOP-testimenetelmän yleinen tarkkuus on 85 % (111/131), väärien positiivisten tulosten osuus 20 % (16/81) ja väärien negatiivisten tulosten osuus 8 % (4/50) luokiteltuna YK:n GHS-luokitusjärjestelmän mukaisesti (3). BCOP-testimenetelmän mahdolliset puutteet vakavan silmävaurion aiheuttavien kemikaalien tunnistamisessa (YK:n GHS-luokka 1) johtuvat validointitietokannassa havaittujen alkoholien ja ketonien korkeasta väärien positiivisten tulosten määrästä ja kiintoaineiden korkean väärien negatiivisten tulosten määrästä (1) (2) (3). Koska kaikkia alkoholeja ja ketoneja ei kuitenkaan yliennusteta BCOP-testimenetelmässä, ja jotkin tunnistetaan oikein YK:n GHS-luokkaan 1 kuuluviksi, näiden orgaanisten funktionaalisten ryhmien ei katsota olevan testimenetelmän soveltamisalan ulkopuolella. Testimenetelmän käyttäjä voi päättää, onko alkoholien tai ketonien mahdollinen yliedustus hyväksyttävissä vai onko todistusnäytön perusteella tehtävä lisätestejä. Kiintoaineiden väärien negatiivisten tulosten osalta on huomattava, että kiintoaineet voivat aiheuttaa Draizen in vivo -silmä-ärsytystestissä erilaisia vaihtuvia ja äärimmäisiä altistumisolosuhteita, mistä voi aiheutua epäolennaisia johtopäätöksiä niiden todellisesta ärsyttävyydestä (10). On myös syytä huomata, että mikään ICCVAMin validointitietokannassa havaituista vakavan silmävaurion aiheuttavia kemikaaleja (YK:n GHS-luokkaa 1) koskevista vääristä negatiivisista tuloksista (2) (3) ei ollut sellainen, jossa IVIS-arvo olisi ollut ≤ 3, mikä on vaatimus sille, että testikemikaalin luokaksi voidaan määrittää ”ei YK:n GHS-luokitusta”. BCOP-testin väärät negatiiviset tulokset eivät tässä haittaa senkään vuoksi, koska kaikki testikemikaalit, joiden testituloksena on 3 < IVIS ≤ 55 testattaisiin myöhemmin muilla asianmukaisesti validoiduilla in vitro -testeillä tai viimeisenä vaihtoehtona kaneilla sääntömääräisistä vaatimuksista riippuen käyttäen vaiheittaista testausstrategiaa ja todistusnäytön arviointia. Koska jotkin kiinteät kemikaalit tunnistetaan BCOP-testimenetelmässä oikein YK:n GHS-luokkaan 1 kuuluviksi, tämän fysikaalisen olomuodon ei katsota olevan testimenetelmän soveltamisalan ulkopuolella. Tutkijat voisivat kuitenkin harkita tätä testimenetelmää kaikentyyppisille kemikaaleille, jolloin IVIS-arvon > 55 katsottaisiin viittaavan vakavaan silmävaurioon, jolloin kemikaali olisi luokiteltava ilman lisätestausta YK:n GHS-luokkaan 1. Alkoholeilla ja ketoneilla saatuihin positiivisiin tuloksiin olisi kuten sanottu kuitenkin suhtauduttava varovaisesti mahdollisesti yliennustuksen vaaran takia.

BCOP-testimenetelmää voi käyttää myös sellaisten kemikaalien tunnistamiseen, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta sellaisena, kuin ne on määritetty YK:n GHS-järjestelmässä (4). Tähän käyttötarkoitukseen käytettynä BCOP-testimenetelmän yleinen tarkkuus on 69 % (135/196), väärien positiivisten tulosten osuus 69 % (61/89) ja väärien negatiivisten tulosten osuus 0 % (0/107) verrattuna kanin silmällä tehdyllä in vivo -testimenetelmällä saatuihin tietoihin luokiteltuna YK:n GHS-luokitusjärjestelmän mukaisesti (3) (ks. lisäys 2, taulukko 2). Väärien negatiivisten tulosten määrä (in vivo -testin kemikaalit, joilla ei YK:n GHS-luokitusta ja joiden IVIS-arvo on >3, ks. 47 kohta) on huomattavan suuri, mutta se ei haittaa tässä, koska kaikki testikemikaalit, joiden testituloksena on 3 < IVIS ≤ 55 testattaisiin myöhemmin muilla asianmukaisesti validoiduilla in vitro -testeillä tai viimeisenä vaihtoehtona kaneilla sääntömääräisistä vaatimuksista riippuen käyttäen vaiheittaista testausstrategiaa ja todistusnäytön arviointia. BCOP-testimenetelmässä ei ole havaittu erityisiä puutteita alkoholien, ketonien ja kiintoaineiden testauksessa, kun tarkoituksena on tunnistaa kemikaalit, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta sellaisena, kuin ne on määritetty YK:n GHS-järjestelmässä (3). Tutkijat voisivat kuitenkin harkita tätä testimenetelmää kaikentyyppisille kemikaaleille, jolloin negatiivisen tuloksen (IVIS ≤ 3) katsottaisiin viittaavan siihen, että kemikaali ei vaadi luokitusta (”ei YK:n GHS-luokitusta”). Koska BCOP-testimenetelmällä voidaan tunnistaa oikein vain 31 % sellaisista kemikaaleista, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta, tämän testimenetelmän ei pitäisi olla ensisijainen menetelmä alhaalta ylös suuntautuvan lähestymistavan ensimmäisenä testinä (5), jos käytettävissä on muita validoituja ja hyväksyttyjä in vitro -menetelmiä, joiden herkkyys on yhtä korkea ja erittelykyky korkeampi.

BCOP-validointitietokanta sisälsi yhteensä 113 ainetta ja 100 seosta (2) (3). BCOP-testausmenetelmää pidetään siten sopivana sekä aineiden että seosten testaukseen.

BCOP-testimenetelmää ei suositella sellaisten testikemikaalien tunnistamiseen, jotka olisi luokiteltava silmiä ärsyttäväksi (YK:n GHS-luokka 2 tai luokka 2A) tai sellaisten testikemikaalien, jotka olisi luokiteltava lievästi silmiä ärsyttäväksi (YK:n GHS-luokka 2B), koska huomattava määrä YK:n GHS-luokan 1 kemikaaleja luokitellaan liian alhaiseen GHS-luokkaan 2, 2A tai 2B, ja kemikaalit, joille ei ole YK:n GHS-luokitusta, luokitellaan liian korkeaan GHS-luokkaan 2, 2A tai 2B (2),( 3). Tätä varten saattaa olla tarpeen tehdä lisää testejä muilla soveltuvilla menetelmillä.

Kaikissa naudan silmiä ja sarveiskalvoja käyttävissä menettelyissä olisi noudatettava testauslaitoksen määräämiä eläinperäisten materiaalien (muun muassa muttei ainoastaan kudosten ja kudosnesteiden) käsittelyä koskevia sääntöjä. Suositellaan yleismaailmallisia laboratorioissa noudatettavia ennaltavarautumiskäytänteitä (11).

Vaikka BCOP-testimenetelmässä ei tarkastellakaan sidekalvon ja värikalvon vaurioita, siinä tutkitaan vaikutuksia sarveiskalvoon, jotka ovat YK:n GHS-luokituksen kannalta merkittävin in vivo -tekijä. BCOP-testimenetelmässä ei sinänsä voida arvioida sarveiskalvovaurioiden palautuvuutta. Kaninsilmätutkimusten perusteella on myös ehdotettu, että sarveiskalvovaurion alkusyvyyden avulla voidaan tunnistaa jotkin palautumattomat vaikutukset (12). Tarvitaan kuitenkin lisää tieteellistä tietoa siitä, miten syntyvät ne palautumattomat vaikutukset, jotka eivät liity suureen alkuvaurioon. BCOP-testimenetelmällä ei voida myöskään arvioida sitä, missä määrin silmäaltistukseen voi liittyä systeemistä toksisuutta.

Tätä testimenetelmää päivitetään aika ajoin sitä mukaa, kun saadaan uusia tietoja. Esimerkiksi histopatologiset tutkimukset voivat olla hyödyllisiä, jos sarveiskalvon vauriota on luonnehdittava tarkemmin. Kuten OECD:n ohjeasiakirjassa nro 160 (13) esitetään, käyttäjiä kehotetaan säilyttämään sarveiskalvot ja valmistelemaan histopatologisia näytteitä, joiden perusteella voidaan laatia tietokanta ja päätösperusteet, joiden avulla voidaan parantaa tämän testimenetelmän tarkkuutta.

Kun laboratorio alkaa käyttää tätä testimenetelmää, sen olisi käytettävä lisäyksessä 3 mainittuja pätevyyden osoittamiseen tarkoitettuja kemikaaleja. Laboratorio voi käyttää näitä kemikaaleja osoittaakseen teknisen pätevyytensä BCOP-testin suorituksessa ennen kuin se toimittaa BCOP-testimenetelmästä saatuja tietoja sääntömääräistä vaaraluokitusta varten.

TESTIN PERIAATE

BCOP-testimenetelmä on elinmalli, joka mahdollistaa naudan sarveiskalvon tavanomaisten fysiologisten ja biokemiallisten toimintojen lyhytaikaisen ylläpitämisen in vitro -oloissa. Testikemikaalin aiheuttamaa vauriota arvioidaan tässä menetelmässä mittaamalla muutokset sarveiskalvon sameudessa ns. opasitometrillä ja muutokset läpäisevyydessä näkyvää valoa mittaavalla spektrofotometrillä. Molempia mittauksia käytetään IVIS-arvon laskemiseen. IVIS-arvon avulla osoitetaan aineelle in vitro -ärsyttävyyteen perustuva vaaraluokituskategoria, jotta voidaan ennustaa testiaineen in vivo -silmä-ärsytyskyky (ks. päätösperusteet, 48 kohta).

BCOP-testimenetelmässä käytetään vasta teurastetuista naudoista saaduista silmistä eristettyjä sarveiskalvoja. Sarveiskalvon sameus mitataan sinä valomääränä, joka kulkee sarveiskalvon läpi. Läpäisevyys mitataan sinä määränä natriumfluoreseiini-väriainetta, joka imeytyy koko sarveiskalvon läpi ja joka mitataan takakammiossa olevassa mediumissa (väliaineessa). Testikemikaalit annostellaan sarveiskalvon epiteelipinnalle lisäämällä sitä sarveiskalvotelineen etukammioon. Lisäyksessä 4 on kuvaus ja kaavio BCOP-testimenetelmässä käytetystä sarveiskalvotelineestä. Sarveiskalvotelineitä saa kaupallisesti eri lähteistä, tai ne voi rakentaa itse.

Naudan silmien lähde ja eläinten ikä sekä eläinlajin valinta

Teurastamoihin tuodut nautaeläimet teurastetaan useimmiten käytettäväksi ihmisravinnoksi tai muihin kaupallisiin tarkoituksiin. BCOP-testimenetelmään voidaan käyttää vain sarveiskalvoja, jotka on saatu terveistä, ihmisravinnoksi kelpaavista eläimistä. Koska nautaeläinten paino vaihtelee paljon riippuen rodusta, iästä ja sukupuolesta, ei anneta mitään suositusta siitä, minkä painoisia eläinten olisi oltava teurastushetkellä.

Sarveiskalvojen mitat voivat vaihdella käytettäessä eri ikäisistä eläimistä saatuja silmiä. Yli kahdeksan vuoden ikäisistä eläimistä saatujen sarveiskalvojen halkaisija vaakasuunnassa on yleensä >30,5 mm ja sarveiskalvon keskiosan paksuus (CCT) ≥ 1100 μm, kun taas alle viiden vuoden ikäisten sarveiskalvon halkaisija on 28,5 mm ja CCT < 900 μm (14). Tästä syystä ei yleensä käytetä silmiä, jotka on saatu yli 60 kuukauden ikäisistä eläimistä. Perinteisesti ei ole käytetty alle 12 kuukauden ikäisten nautojen silmiä, koska silmien kehitys on vielä kesken ja sarveiskalvo on huomattavasti ohuempi ja sen halkaisija pienempi kuin täysikasvuisten eläinten sarveiskalvon. Nuorista eläimistä (eli 6–12 kuukautta vanhoista) saatuja sarveiskalvoja voidaan käyttää, koska siihen liittyy joitakin etuja. Niitä saa helpommin, ikävaihtelu on pienempi, ja vaara työntekijöiden altistumisesta naudan spongiformiselle enkefalopatialle on pienempi (15). Koska olisi hyödyllistä arvioida lisää sarveiskalvon koon tai paksuuden vaikutusta sarveiskalvon reagoimiseen syövyttäviin ja ärsyttäviin kemikaaleihin, käyttäjiä kehotetaan raportoimaan niiden eläinten arvioitu ikä ja/tai paino, joista tutkimuksessa käytetyt sarveiskalvot on saatu.

Silmien kerääminen ja niiden kuljetus laboratorioon

Teurastamon henkilökunta kerää silmät. Silmien mekaanisten ja muiden vaurioiden ehkäisemiseksi silmät olisi poistettava silmästä mahdollisimman pian kuoleman jälkeen, ja ne olisi pantava jäähdytykseen heti silmämunasta poistamisen jälkeen ja kuljetuksen ajaksi. Jotta silmät eivät altistuisi mahdollisesti ärsyttäville kemikaaleille, teurastamon työntekijät eivät saisi käyttää detergenttejä huuhtoessaan eläimen päätä.

Silmät olisi upotettava kokonaan jäähdytettyyn Hanksin suolaliuokseen (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS) sopivankokoisessa astiassa ja kuljetettava laboratorioon sellaisella tavalla, että bakteerikontaminaatio tai muut vauriot ovat mahdollisimman pieniä. Koska silmät kerätään teurastuksen yhteydessä, niihin saattaa roiskua verta ja muita biologisia aineita, kuten bakteereja ja muita pieneliöitä. Siksi on tärkeää varmistaa, että kontaminaatioriski on mahdollisimman pieni. Esimerkiksi astia, jossa silmät ovat, on pidettävä jäähauteessa, ja kuljetusta varten käytettävään HBSS:ään on lisättävä antibiootteja (esim. penisilliiniä 100 IU/ml ja streptomysiiniä 100 μg/mL]).

Silmien keräämisen ja BCOP-testin tekemisen välisen ajan pitäisi olla mahdollisimman lyhyt (keräys ja käyttö mieluiten samana päivänä), ja pitäisi osoittaa, etteivät määritystulokset ole sen takia epäluotettavia. Nämä tulokset perustuvat silmien valintaperusteisiin sekä positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden vasteisiin. Kaikkien määrityksessä käytettyjen silmien olisi oltava peräisin samasta tiettynä päivänä kerätystä silmäryhmästä.

BCOP-testissä käytettävien silmien valintaperusteet

Heti kun silmät saapuvat laboratorioon, tutkitaan huolellisesti, onko niissä vikoja, kuten lisääntynyttä sameutta, naarmuja ja verisuonittumista. Testissä saa käyttää vain sellaisista silmistä saatuja sarveiskalvoja, joissa ei ole tällaisia vikoja.

Kaikkien sarveiskalvojen laatua arvioidaan myös määrityksen myöhemmissä vaiheissa. Sarveiskalvot, joiden sameus on tunnin tasapainottumisajan jälkeen yli seitsemän sameusyksikköä tai opasitometrin ja sarveiskalvotelineen vastaavaa yksikköä, on hylättävä (HUOMAUTUS: opasitometri olisi kalibroitava sameusyksikköjen määrittelemiseen käytettävien sameusstandardien mukaisesti, ks. lisäys 4).

Kussakin käsittelyryhmässä (testikemikaali, samaan aikaan tehtävät negatiiviset ja positiiviset kontrollit) on oltava vähintään kolme silmää. BCOP-testauksessa pitäisi negatiiviseen kontrolliin käyttää kolme sarveiskalvoa. Koska kaikki sarveiskalvot leikataan kokonaisesta silmämunasta ja asetetaan sarveiskalvokammioihin, voi käsittelystä aiheutua vahinkoa, joka vaikuttaa yksittäisen sarveiskalvon sameuteen ja läpäisevyyteen (myös negatiivisessa kontrollissa). Negatiivisista kontrollisarveiskalvoista saatuja sameus- ja läpäisevyysarvoja käytetään lisäksi IVIS-laskelmissa korjaamaan testikemikaalilla käsiteltyjen ja positiivisella kontrollilla käsiteltyjen sarveiskalvojen sameus- ja läpäisevyysarvoja.

MENETTELY

Silmien valmistelu

Virheettömät sarveiskalvot leikataan siten, että niihin jää 2–3 mm:n reuna kovakalvoa, mikä helpottaa myöhempää käsittelyä. Varotaan vahingoittamasta sarveiskalvon epiteeliä ja endoteeliä. Eristetyt sarveiskalvot asetetaan erikoistelineisiin, joissa on etu- ja takaosasto. Nämä ovat kosketuksissa sarveiskalvon epiteelipuoleen (etukammio) ja endoteelipuoleen (takakammio). Molemmat kammiot täytetään ylimäärin esilämmitetyllä Eaglen Minimum Essential Medium (EMEM) -viljelynesteellä (mediumilla), jossa ei ole fenolipunaa (takakammio ensin) ja varmistetaan, ettei muodostu kuplia. Laitteen annetaan tasapainottua 32 ± 1 celsiusasteessa vähintään tunnin, jotta sarveiskalvot tasapainottuvat mediumin kanssa ja niiden metabolinen toiminta palautuu normaaliksi (mikäli mahdollista). Sarveiskalvon pinnan lämpötila in vivo on noin 32 °C.

Tasapainottumisjakson jälkeen molempiin kammioihin lisätään tuoretta esilämmitettyä EMEM:iä, jossa ei ole fenolipunaa, ja kustakin sarveiskalvosta otetaan sameuden perustasolukema. Sarveiskalvot, joissa ilmenee makroskooppista kudosvauriota (kuten naarmuja, pigmentaatiota tai verisuonittumista) tai joiden sameus on yli seitsemän sameusyksikköä tai opasitometrin ja sarveiskalvotelineen vastaavaa yksikköä, on hylättävä. Negatiiviseksi kontrolliryhmäksi (tai liuotinkontrolliryhmäksi) valitaan vähintään kolme sarveiskalvoa. Muut sarveiskalvot jaetaan käsittelyryhmään ja positiivisen kontrollin ryhmään.

Koska veden lämpökapasiteetti on suurempi kuin ilman, vedellä saadaan tasaisempi inkubaatiolämpötila. Siksi suositellaan vesihauteen käyttöä sarveiskalvotelineen ja sen sisällön pitämiseksi 32 ± 1 celsiusasteessa. Kuitenkin myös ilmainkubaattoreita voidaan käyttää, kunhan huolehditaan siihen, että lämpötila pysyy vakaana (esimerkiksi esilämmittämällä telineet ja mediumit).

Testikemikaalin annostelu

Käsittelyä varten on kaksi eri protokollaa, toinen nesteille ja pinta-aktiivisille aineille (kiinteät tai nestemäiset) ja toinen kiinteille aineille, jotka eivät ole pinta-aktiivisia.

Nesteet testataan laimentamattomina. Puoliksi kiinteät aineet, voiteet ja vahat testataan tavallisesti kuten nesteet. Pinta-aktiiviset aineet testataan 10-prosenttisena liuoksena (w/v) 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa, tislatussa vedessä tai muussa liuottimessa, josta on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestelmää. Jos laimennuksia muutetaan, on ne perusteltava. Pinta-aktiivisia aineita sisältävät teokset voidaan testata laimentamattomina tai sopivaksi pitoisuudeksi laimennettuna riippuen kysymykseen tulevasta in vivo -altistusskenaariosta. Jos pitoisuuksia muutetaan, on ne perusteltava. Sarveiskalvot altistetaan nesteille ja pinta-aktiivisille aineille 10 minuutin ajan. Jos altistusaikaa muutetaan, olisi se perusteltava tieteellisesti. Lisäyksessä 1 on pinta-aktiivisen aineen ja pinta-aktiivista ainetta sisältävän seoksen määritelmät.

Kiinteät aineet, jotka eivät ole pinta-aktiivisia, testataan tavallisesti 20-prosenttisena liuoksena (w/v) tai suspensiona 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa, tislatussa vedessä tai muussa liuottimessa, josta on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestelmää. Joissakin olosuhteissa ja asianmukaisesti tieteellisesti perusteltuna kiinteitä aineita voidaan testata myös sellaisenaan annostelemalla niitä suoraan sarveiskalvon pinnalle avoimen kammion menetelmässä (ks. 32 kohta). Sarveiskalvot altistetaan kiinteille aineille neljän tunnin ajan. Kuten nesteiden ja pinta-aktiivisten aineiden tapauksessa, altistusajan muuttaminen on perusteltava tieteellisesti.

Käsittely voi olla erilaista riippuen testattavan aineen fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista, esimerkiksi siitä, onko kyseessä kiinteä aine, neste, viskoosi tai ei-viskoosi neste. Tärkeintä on varmistaa, että testikemikaali peittää riittävästi epiteelin pinnan ja että se voidaan huuhtelemalla poistaa riittävästi. Suljetun kammion menetelmää käytetään tavallisesti testattaville nestemäisille kemikaaleille, jotka vaihtelevat ei-viskoosista lievästi viskoosiin, kun taas avoimen kammion menetelmää käytetään tavallisesti puoliksi viskooseille ja viskooseille nestemäisille testikemikaaleille ja kiinteille aineille.

Suljetun kammion menetelmässä annostellaan etukammioon niin paljon testikemikaalia (750 μl), että se peittää sarveiskalvon epiteelipuolen. Annostelu tapahtuu kammion yläosassa olevien aukkojen kautta. Aukot suljetaan sitten tulpilla altistuksen ajaksi. On tärkeää varmistaa, että kukin sarveiskalvo altistetaan testiaineelle niin pitkäksi aikaa kuin on asianmukaista.

Avoimen kammion menetelmässä ikkunan lukitusrengas ja etukammion lasi-ikkuna poistetaan ennen käsittelyä. Kontrollia tai testikemikaalia (750 μl tai niin paljon, että testikemikaali peittää sarveiskalvon kokonaan) annostellaan suoraan sarveiskalvon epiteelipinnalle mikropipetillä. Jos testikemikaalia on vaikea annostella pipetillä, annostelua voidaan helpottaa siirtämällä testikemikaali positive displacement -pipettiin paineen avulla. Positive displacement -pipetin kärki työnnetään ruiskun annostelukärkeen niin, että aine voidaan siirtää displacement-pipetin kärkeen paineen avulla. Ruiskun mäntää painetaan samalla kun pipetin mäntää vedetään ylöspäin. Jos pipetin kärkeen ilmestyy ilmakuplia, testiaine puhalletaan ulos ja prosessi toistetaan, kunnes kärki saadaan täytettyä ilman ilmakuplia. Jos on tarpeen, voidaan käyttää tavallista ruiskua (ilman neulaa), koska sillä voidaan mitata tarkka tilavuus testikemikaalia, ja annostelu sarveiskalvon epiteelipinnalle on helpompaa. Annostelun jälkeen lasi-ikkuna pannaan paikalleen etukammion päälle, jotta järjestelmä on jälleen suljettu.

Inkubointi altistuksen jälkeen

Altistusajan jälkeen testikemikaali, negatiivinen kontrollikemikaali tai positiivinen kontrollikemikaali poistetaan etukammiosta ja epiteeli pestään vähintään kolmesti (tai kunnes testikemikaalia ei näy) EMEM:illä (jossa on fenolipunaa). Huuhteluun käytetään fenolipunaa sisältävää mediumia, koska fenolipunan värin vaihtumista voidaan seurata, kun halutaan määrittää happamien tai emäksisten testikemikaalien huuhtelun tehokkuus. Sarveiskalvoja pestään enemmän kuin kolme kertaa, jos fenolipuna on edelleen vääränvärinen (keltainen tai purppuranvärinen) tai jos testikemikaalia on vielä näkyvillä. Kun mediumissa ei ole enää testikemikaalia, sarveiskalvot pestään vielä kerran EMEM:illä (jossa ei ole fenolipunaa). EMEM-huuhtelua (ilman fenolipunaa) käytetään viimeiseksi sen varmistamiseksi, että fenolipuna on poistunut etukammiosta ennen sameusmittausta. Etukammio täytetään sitten uudelleen tuoreella EMEM:illä (ilman fenolipunaa).

Kun testikemikaali on neste tai pinta-aktiivinen aine, sarveiskalvoja inkuboidaan huuhtelun jälkeen vielä kaksi tuntia 32 ± 1 celsiusasteessa. Tietyissä olosuhteissa voi pitempi aika altistuksen jälkeen olla hyödyksi. Sitä voidaan harkita tapauskohtaisesti. Kiinteillä aineilla käsitellyt sarveiskalvot huuhdellaan perusteellisesti neljän tunnin altistuksen päätteeksi, mutta niitä ei tarvitse enää inkuboida enempää.

Kunkin sarveiskalvon sameus ja läpäisevyys kirjataan nesteille ja pinta-aktiivisille aineille altistuksen jälkeisen inkubaation jälkeen ja kiinteille aineille, jotka eivät ole pinta-aktiivisia aineita, neljän tunnin altistuksen jälkeen. Kutakin sarveiskalvoa tarkastellaan myös silmämääräisesti ja kirjataan merkitykselliset havainnot (esimerkiksi kudoksen kuoriutuminen, testikemikaalin jäämät, epätasainen sameusjakauma). Tällaiset havainnot voivat olla tärkeitä, sillä ne voivat näkyä opasitometrin lukemien vaihteluna.

Kontrollikemikaalit

Kussakin kokeessa on mukana samanaikaisesti määritettävät negatiiviset eli liuotin/kantaja-ainekontrollit ja positiiviset kontrollit.

Kun testataan 100-prosenttista nestemäistä ainetta, otetaan BCOP-määritykseen samanaikaisesti määritettävä negatiivinen kontrolli (esimerkiksi 0,9-prosenttinen natriumkloridiliuos tai tislattu vesi) sitä varten, että epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä voidaan havaita ja määrityksen päätepisteille saadaan perustaso. Näin varmistetaan myös, etteivät määritysolosuhteet aiheuta ärsytysvastetta tahattomasti.

Kun testataan laimennettua nestettä, pinta-aktiivista ainetta tai kiinteää ainetta, otetaan BCOP-määritykseen samanaikaisesti määritettävä liuotin/kantaja-ainekontrolliryhmä sitä varten, että epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä voidaan havaita ja määrityksen päätepisteille saadaan perustaso. Liuotinta/kantaja-ainetta saa käyttää vain, jos on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestelmää.

Kuhunkin kokeeseen otetaan mukaan positiivisena kontrollina kemikaali, jonka tiedetään aiheuttavan positiivisen vasteen, jotta voidaan varmistaa testijärjestelmän vahingoittumattomuus ja sen moitteeton toiminta. Ärsytysvaste ei kuitenkaan saisi olla liian voimakas, jotta positiivisen kontrollivasteen vaihtelu ajan funktiona voidaan määrittää.

Esimerkkejä nestemäisten testikemikaalien positiivisista kontrolleista ovat 100-prosenttinen etanoli tai 100-prosenttinen dimetyyliformamidi. Esimerkki kiinteiden testikemikaalien positiivisesta kontrollista on 20-prosenttisena liuoksena (w/v) oleva imitsadoli 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa.

Vertailukemikaalit ovat hyödyllisiä, kun arvioidaan tiettyyn kemikaali- tai tuoteryhmään kuuluvien tuntemattomien kemikaalien silmä-ärsytyskykyä tai silmää ärsyttävän aineen suhteellista ärsytyskykyä tietyllä ärsytysvastealueella.

Mitatut päätepisteet

Sarveiskalvon sameus mitataan sinä valomääränä, joka kulkee sarveiskalvon läpi. Sarveiskalvon sameus mitataan kvantitatiivisesti opasitometrillä, jolla saadaan jatkuvalla asteikolla mitattuja sameusarvoja.

Läpäisevyys mitataan sinä määränä natriumfluoreseiini-väriainetta, joka imeytyy kaikkien sarveiskalvon solukerrosten (ts. sarveiskalvon ulkopinnan epiteelin ja sisäpinnan endoteelin) läpi. 1 ml natriumfluoreseiiniliuosta (4 mg/ml testattaessa nesteitä tai pinta-aktiivisia aineita tai 5 mg/ml testattaessa kiinteitä aineita, jotka eivät ole pinta-aktiivisia) lisätään sarveiskalvotelineen etukammioon, joka on kosketuksissa sarveiskalvon epiteelipuolen kanssa. Takakammiossa, joka on kosketuksissa sarveiskalvon endoteelipuolen kanssa, on tuoretta EMEM:iä. Telinettä inkuboidaan vaakasuorassa 90 ± 5 min 32 ± 1 celsiusasteessa. Takakammioon siirtyvän natriumfluoreseiinin määrä mitataan UV/VIS-spektrofotometrillä. 490 nanometrin aallonpituudella mitatut spektrofotometrin lukemat kirjataan optisena tiheytenä (OD490) tai absorbanssiarvoina, jotka mitataan jatkuvalla asteikolla. Fluoreseiiniläpäisevyysarvot määritetään käyttäen OD490-arvoja, jotka on mitattu spektrofotometrillä tavanomaisella 1 senttimetrin valotiellä.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää 96 kuopan kuoppalevyjen lukulaitetta, jos i) laitteen fluoreseiinin OD490 -arvojen mittausalue on lineaarinen; ja ii) 96 kuopan levyissä käytetään sellaista fluoreseiininäytteiden tilavuutta, jolla saadaan 1 cm:n valotiellä saatuja arvoja vastaavat OD490 -arvot (tämä saattaa edellyttää, että kuoppa täytetään kokonaan [tavallisesti 360 μl).

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tietojen arviointi

Kun sameusarvot ja keskimääräiset läpäisevyysarvot (OD490) on korjattu taustan sameuden ja negatiivisen kontrollin läpäisevyyden OD490-arvojen suhteen, yhdistetään kunkin käsittelyryhmän sameuden keskiarvot ja läpäisevyyden keskimääräiset OD490-arvot kokemusperäiseen kaavaan, josta lasketaan kullekin käsittelyryhmälle in vitro -ärsytysaste (IVIS) seuraavasti:

IVIS = sameuden keskiarvo + (15 × keskimääräinen läpäisevyyden OD490-arvo)

Sina et al. (16) ovat raportoineet, että tämä kaava on johdettu heidän laboratoriossaan ja laboratorioidenvälisissä tutkimuksissa. Monilaboratoriotutkimuksessa 36 yhdisteen sarjalle saaduille tuloksille tehtiin monimuuttuja-analyysi, jossa määritettiin paras yhtälö in vivo ja in vitro saatujen tuloksien välille. Kahden eri yhtiön tutkijat toistivat analyysin ja saivat lähes samat yhtälöt.

Sameus- ja läpäisevyysarvoja olisi arvioitava myös erikseen, jotta nähdään, aiheuttaako testikemikaali syövytystä tai vakavaa ärsytystä vain yhden päätepisteen määrityksessä (ks. päätösperusteet).

Päätösperusteet

Seuraavassa on esitetty IVIS-raja-arvot, joiden avulla voidaan tunnistaa sellaiset kemikaalit, jotka aiheuttavat vakavia silmävaurioita (YK:n GHS-luokka 1), sekä kemikaalit, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta (kemikaalit, joilla ei ole YK:n GHS-luokitusta):

IVIS

YK:n GHS

≤ 3

Ei luokitusta

> 3; ≤ 55

Ennusteita ei voida tehdä

> 55

Luokka 1

Tutkimuksen hyväksymisperusteet

Testiä pidetään hyväksyttävänä, jos positiivisella kontrollilla saadaan IVIS-arvo, joka on kahden standardipoikkeaman sisällä senhetkisestä pitkän aikavälin keskiarvosta, joka on päivitettävä vähintään kolmen kuukauden välein tai joka kerta kun sellaisissa laboratorioissa, joissa testejä tehdään vain harvoin (eli vähemmän kuin kerran kuussa) saadaan hyväksytty testi. Negatiivisista tai liuotin/kantaja-ainevasteista saatujen sameus- ja läpäisevyysarvojen pitäisi olla pienemmät kuin vahvistetut sameuden ja läpäisevyyden taustaraja-arvot naudan sarveiskalvolle, jota on käsitelty negatiivisilla tai liuotin/kantaja-ainekontrolleilla. Kun testikemikaalin luokittelu on yksiselitteinen, se voidaan testata yhdessä vähintään kolme sarveiskalvoa käsittävässä testiajossa. Jos ensimmäisen testiajon tulokset ovat moniselitteisiä, on harkittava toista testiajoa (se ei kuitenkaan ole välttämätöntä) ja kolmatta, jos ensimmäisen ja toisen testiajon keskimääräiset IVIS-tulokset ovat ristiriitaisia. Ensimmäisen testiajon tuloksia pidetään moniselitteisinä, jos kolmen sarveiskalvon ennusteet ovat ristiriitaisia, kuten

jos kaksi kolmesta sarveiskalvosta tuotti kaikkien kolmen sarveiskalvon keskiarvosta poikkeavia ennusteita TAI

jos yksi kolmesta sarveiskalvosta tuotti kaikkien kolmen sarveiskalvon keskiarvosta poikkeavan ennusteen JA poikkeava ennuste oli > 10 IVIS-yksikköä kynnysarvosta 55.

Jos uusi testiajo vahvistaa alkuperäisen testiajon (keskimääräiseen IVIS-arvoon pohjautuvan) ennusteen, lopullinen päätös voidaan tehdä ilman lisätestejä. Jos uusi testiajo tuottaa alkuperäisestä testiajosta poikkeavan (keskimääräiseen IVIS-arvoon pohjautuvan) ennusteen, yksiselitteisten ennusteiden saamiseksi ja testikemikaalin luokittelemiseksi olisi tehtävä kolmas ja viimeinen testiajo. Jos jokin testiajo tuottaa YK:n GHS-luokan 1 ennusteen, luokitus ja merkintä voidaan tehdä ilman lisätestejä.

Testiraportti

Testiraportissa olisi annettava seuraavat tiedot, jos ne ovat merkityksellisiä tutkimuksen suorittamiselle:

 

Testi- ja kontrollikemikaalit

kemiallinen nimi (nimet), kuten CAS:n (Chemical Abstracts Service) käyttämä rakennetta kuvaava nimi, jonka jälkeen annetaan muut nimet, jos ne tunnetaan CAS-numero, jos se tunnetaan

testi/kontrollikemikaalin puhtausaste tai koostumus (painoprosentteina), jos tieto on saatavilla

testin suorittamisen kannalta merkitykselliset fysikokemialliset ominaisuudet, kuten olomuoto, haihtuvuus, pH, stabiilius, kemiallinen luokka ja vesiliukoisuus

tarvittaessa testi- tai kontrollikemikaalien käsittely ennen testiä (esimerkiksi lämmittäminen tai jauhaminen)

stabiilius, jos se tiedetään.

 

Tutkimuksen teettäjää ja testauslaitosta koskevat tiedot:

Tutkimuksen teettäjän nimi ja osoite, testauslaitos ja tutkimusjohtaja.

 

Testiolosuhteet:

käytetty opasitometri (esim. malli ja erittelyt) ja välineiden kokoonpano

sameuden ja läpäisevyyden mittaukseen käytettyjen laitteiden (esimerkiksi opasitometrin ja spektrofotometrin) kalibrointitiedot, jotta voidaan varmistaa mittausten lineaarisuus

käytettyjen sarveiskalvotelineiden tyyppi (esim. malli ja erittelyt)

kuvaus muista käytetyistä laitteista

menettely, jolla testimenetelmän integriteetti (eli tarkkuus ja luotettavuus) ajan suhteen varmistetaan (esimerkiksi pätevöittämiseen käytettyjen aineiden säännöllinen testaus).

 

Hyväksyttävän testin perusteet

hyväksyttävät aiempiin tuloksiin perustuvat samaan aikaan tehtyjen positiivisten ja negatiivisten kontrollien vaihteluvälit

tapauksen mukaan hyväksyttävät aiempiin tuloksiin perustuvat samaan aikaan tehtyjen vertailukontrollien vaihteluvälit.

 

Silmien kerääminen ja valmistelu

silmien lähteen tunnistustiedot (esim. laitos, josta ne on kerätty)

sarveiskalvon halkaisija, jonka perusteella määritetään sen eläimen ikä, josta se on peräisin, sekä sen soveltuvuus testiin

silmien säilytys- ja kuljetusolosuhteet (kuten (kuten silmien keräyspäivä ja kellonaika, aika siihen asti kun testi aloitettiin, kuljetuksessa käytetty medium ja lämpötilaolot, mahdollisesti käytetyt antibiootit)

naudan sarveiskalvojen valmistelu ja paikalleen asettaminen, myös niiden laatua koskeva lausuma, sarveiskalvotelineen lämpötila ja testauksessa käytettävien sarveiskalvojen valintaperusteet.

 

Testimenettely

rinnakkaisnäytteiden määrä

käytetyt negatiiviset ja positiiviset kontrollit (ja mahdolliset liuotin- ja vertailukontrollit)

käytettyjen testikemikaalien pitoisuus (pitoisuudet), annostelu, altistusaika ja altistuksen jälkeinen inkubaatioaika

kuvaus käytetyistä arviointi- ja päätöskriteereistä

kuvaus tutkimuksen hyväksymiskriteereistä

kuvaus testimenettelyjen mahdollisista muutoksista

kuvaus käytetyistä päätöskriteereistä.

 

Tulokset

taulukko tuloksista, jotka on saatu yksittäisistä testinäytteistä (esimerkiksi sameus ja OD490-arvot ja lasketut IVIS-arvot testikemikaaleille sekä positiivisille, negatiivisille ja vertailukontrolleille [jos mukana] taulukkomuodossa, myös tulokset toistetuista kaksoismäärityksistä tapauksen mukaan, sekä keskiarvot ± standardipoikkeamat kullekin kokeelle

kuvaus muista havaituista vaikutuksista

mahdollinen in vitro -testillä laskettu YK:n GHS-järjestelmän mukainen luokitus.

 

Tulosten tarkastelu

 

Päätelmät

LÄHDEKIRJALLISUUS

(1)

ICCVAM (2006). Test Method Evaluation Report – In vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.

(2)

ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report. Current Validation Status of In vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. NIH Publication No.10-7553. Research Triangle Park, NC:National Institute of Environmental Health Sciences. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(3)

OECD (2013). Streamlined Summary Document supporting the Test Guideline 437 for eye irritation/corrosion. Series on Testing and Assessment, No.189, OECD, Paris.

(4)

YK (2011). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30 Rev 4, New York and Geneva: United Nations. Saatavilla osoitteessa http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.

(5)

Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P., and Zuang, V. (2010). A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicol. in vitro 24:1-9.

(6)

ICCVAM (2006). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report – in vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.

(7)

ICCVAM (2010). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Validation Status of In vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(8)

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

(9)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

(10)

Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicol. in vitro 20:78-81.

(11)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L. ja the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Saatavilla osoitteessa http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf.

(12)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Toxicol. 36:106-117.

(13)

OECD (2011). Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants. Series on Testing and Assessment, nro 160. Adopted October 25, 2011. Paris: Organisation for Economic Co-operation and Development.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. ja Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

(15)

Collee, J. ja Bradley, R. (1997). BSE: A decade on – Part I. The Lancet 349: 636-641.

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D. ja Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20-31.

(17)

Tässä liitteessä oleva B.5 kappale Acute eye irritation/corrosion.

(18)

ICCVAM (2006). Current Status of In vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Saatavilla osoitteessa http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm.

(19)

OECD (1998) Series on Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. No. 1: OECD Principles on Good Laboratory Practice (tarkistettu 1997).

Saatavilla osoitteessa http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html

Lisäys 1

MÄÄRITELMÄT

Aine : Alkuaineet ja niiden yhdisteet sellaisina kuin ne esiintyvät luonnossa tai tuotantomenetelmin valmistettuina, jotka sisältävät kaikki pysyvyyden säilyttämiseksi tarvittavat lisäaineet ja tuotantotoiminnassa muodostuvat epäpuhtaudet lukuun ottamatta liuottimia, jotka voidaan erottaa vaikuttamatta aineen pysyvyyteen tai muuttamatta sen koostumusta (4).

Ei luokiteltu : Kemikaalit, joita ei ole luokiteltu silmä-ärsytyksen (YK:n GHS-luokka 2, 2A tai 2B) tai vakavan silmävaurion (YK:n GHS-luokka 1) osalta. Sama kuin ”Ei YK:n GHS-luokitusta”.

Ei YK:n GHS-luokitusta : Kemikaalit, joita ei voida luokitella YK:n GHS-järjestelmän luokan 1 tai 2 (2A tai 2B) kemikaaleiksi. Sama kuin ”Ei luokiteltu”.

In vitro ärsytysarvo (In vitro Irritancy Score, IVIS) : BCOP-testimenetelmässä käytetty empiirisesti johdettu kaava, jossa kunkin käsittelyryhmän sameuden keskiarvot ja läpäisevyyden keskiarvot yhdistetään yhteen in vitro -arvoon. IVIS = sameuden keskiarvo + (15 × keskimääräinen läpäisevyysarvo)

Jäsentävä lähestymistapa : Vaiheittainen lähestymistapa, jota käytetään oletettaessa, että kemikaali aiheuttaa vakavia silmävaurioita. Se aloitetaan määrittämällä vakavia silmävaurioita aiheuttavat kemikaalit (positiivinen tulos) ja muut kemikaalit (negatiivinen tulos).

Kemikaali : Aine tai aineiden seos.

Kokoava lähestymistapa : Vaiheittainen lähestymistapa, jota käytetään oletettaessa, että kemikaalia ei tarvitse luokitella silmä-ärsytyksen tai vakavien silmävaurioiden osalta. Se aloitetaan määrittämällä kemikaalit, joita ei tarvitse luokitella (negatiivinen tulos) ja muut kemikaalit (positiivinen tulos).

Korjautuvat vaikutukset silmiin : Ks. ”Silmä-ärsytys”.

Liuotin/kantaja-ainekontrolli : Käsittelemätön näyte, jossa on kaikki testijärjestelmän osat, mukaan luettuina liuotin tai kantaja-aine, ja joka prosessoidaan testikemikaalilla käsiteltyjen ja muiden kontrollinäytteiden kanssa perusvastetason määrittämiseksi näytteille, joissa testikemikaali on liuotettu samaan liuottimeen tai kantaja-aineeseen. Kun tällainen näyte testataan samanaikaisesti negatiivisen kontrollin kanssa, se osoittaa myös, reagoiko liuotin tai kantaja-aine testijärjestelmän kanssa.

Luotettavuus : Laajuus, jolla testimenetelmä on toistettavissa samassa laboratoriossa tai eri laboratorioissa pidemmällä aikavälillä käytettäessä samaa menettelyä. Arvo määritetään laskemalla laboratorionsisäinen ja laboratorioidenvälinen uusittavuus ja laboratorionsisäinen toistettavuus.

Negatiivinen kontrolli : Käsittelemätön näyte, jossa on kaikki testijärjestelmän osat. Negatiivinen kontrolli prosessoidaan testikemikaalilla käsiteltyjen näytteiden ja muiden kontrollinäytteiden kanssa, jotta voidaan määrittää, reagoiko liuotin testijärjestelmän kanssa.

Opasitometri : Laite, jolla mitataan sarveiskalvon sameutta arvioimalla kvantitatiivisesti valon kulkeminen sarveiskalvon läpi. Opasitometrissä on tyypillisesti kaksi osastoa, joista kussakin on oma valonlähde ja valokenno. Toista osastoa käytetään käsitellylle sarveiskalvolle ja toista laitteen kalibrointiin ja nollaamiseen. Halogeenilampun valoa lähetetään kontrolliosaston läpi (tyhjä kammio, jossa ei ole ikkunaa eikä nestettä) valokennoon ja verrataan valoon, joka on lähetetty näytteelle käytetyn osaston (jossa on sarveiskalvon sisältävä kammio) läpi valokennoon. Valokennoista saadun valon transmissioita verrataan, ja numeronäytöllä näytetään numeerinen sameuden arvo.

Pinta-aktiivinen aine : Aine, esimerkiksi detergentti, joka voi vähentää nesteen pintajännitettä ja saada sen siten vaahtoamaan tai läpäisemään kiinteitä aineita; tunnetaan myös vettymistä edistävänä aineena.

Pinta-aktiivista ainetta sisältävä seos : Tämän testimenetelmän yhteydessä seos, joka sisältää yhden tai useamman pinta-aktiivisen aineen, jonka lopullinen pitoisuus on > 5 %.

Positiivinen kontrolli : Näyte, jossa on kaikki testijärjestelmän osat ja joka on käsitelty kemikaalilla, jonka tiedetään aiheuttavan positiivisen vasteen. Positiivinen vaste ei kuitenkaan saisi olla liian voimakas, jotta positiivisen kontrollivasteen vaihtelu ajan funktiona voidaan arvioida.

Pysyvät vaikutukset silmiin : Ks. ”Vakava silmävaurio”.

Sarveiskalvo : Silmämunan etuosan läpinäkyvä osa, joka peittää värikalvon ja silmäterän ja päästää valoa sisäosiin.

Sarveiskalvon läpäisevyys : Sarveiskalvon epiteelin vaurion mitta, jota varten määritetään kaikkien sarveiskalvon solukerrosten läpi menneen fluoreseiini-väriaineen määrä.

Sarveiskalvon sameus : Sarveiskalvon sameuden mitta, kun sarveiskalvo on altistettu testikemikaalille. Sarveiskalvon sameuden lisääntyminen merkitsee sarveiskalvon vauriota. Sameus voidaan arvioida subjektiivisesti Draizen kaninsilmätestillä tai objektiivisesti jollain laitteella, kuten ”opasitometrillä”.

Seos : Seos tai liuos, joka koostuu kahdesta tai useammasta aineesta, jotka eivät reagoi keskenään (4).

Silmä-ärsytys : Silmän muutokset, jotka syntyvät, kun testikemikaalia on annosteltu silmän etupinnalle, ja korjautuvat täysin 21 päivän kuluessa annostelusta. Sama kuin ”Korjautuvat vaikutukset silmiin” ja ”YK:n GHS-luokka 2” (4).

Tarkkuus : Testimenetelmän tulosten ja hyväksyttyjen vertailuarvojen välinen ero. Se on testimenetelmän suorituskyvyn mitta ja yksi merkityksellisyyden osa-alueista. Tarkkuutta ja vastaavuutta käytetään usein toisiaan korvaavasti tarkoittamaan testimenetelmällä saatujen oikeiden tulosten osuutta.

Testikemikaali : Aine tai seos, jota testataan tällä testimenetelmällä.

Todistusnäyttö : Prosessi, jossa tarkastellaan erilaisten tietojen vahvuuksia ja heikkouksia, kun niiden avulla on tarkoitus päättää testikemikaalin vaarallisuutta koskevasta päätelmästä tai kun tietojen on määrä tukea kyseistä päätelmää.

Vaara : Vaikuttavan tekijän (’agentin’) tai tilanteen sisäinen ominaisuus, jolla on kyky aiheuttaa haitallisia vaikutuksia, kun organismi, järjestelmä tai (ala)populaatio altistuu kyseiselle aineelle.

Vaiheittainen testausstrategia : Vaiheittainen testausstrategia, jossa kaikkia testikemikaalia koskevia olemassa olevia tietoja tarkastellaan tietyssä järjestyksessä käyttäen todistusnäyttöprosessia kussakin vaiheessa sen määrittämiseksi, onko käytettävissä riittävästi tietoja vaaraluokituspäätöstä varten, ennen kuin siirrytään seuraavaan vaiheeseen. Jos testikemikaalin ärsytyskyky voidaan määrittää olemassa olevien tietojen perusteella, ei lisätestausta tarvita. Jos testikemikaalin ärsytyskykyä ei voida määrittää olemassa olevien tietojen perusteella, toteutetaan vaiheittainen testaus eläimillä, kunnes luokitus voidaan määritellä aukottomasti.

Vakava silmävaurio : Silmän kudosvaurio tai vakava fyysinen näön rappeutuminen, joka on seurausta testikemikaalin annostelusta silmän etupinnalle eikä korjaudu täysin 21 päivän kuluessa annostelusta. Sama kuin ”Pysyvät vaikutukset silmiin” ja ”YK:n GHS-luokka 1” (4).

Validoitu testimenetelmä : Testimenetelmä, jolle on tehty validointitutkimukset sen merkityksellisyyden (myös tarkkuuden) ja luotettavuuden määrittämiseksi tiettyä tarkoitusta varten. On tärkeää huomata, että validoitu testi ei ehkä ole riittävän tarkka ja luotettava, jotta se voitaisiin hyväksyä ehdotettuun tarkoitukseen.

Vertailukemikaali : Kemikaali, johon testikemikaalia verrataan. Vertailuaineella olisi oltava seuraavat ominaisuudet: i) se saadaan vakaana pysyvästä ja luotettavasta lähteestä; ii) sen rakenne ja toiminta ovat samankaltaisia testattavan aineryhmän kanssa; iii) sen fysikaalis-kemialliset ominaisuudet tunnetaan; iv) se tukee tunnetuista vaikutuksista saatuja tietoja, ja v) sen vaikutuskyky halutun vasteen vaihtelualueella tunnetaan.

Väärien negatiivisten tulosten osuus : Niiden positiivisten kemikaalien osuus, jotka testimenetelmä yksilöi virheellisesti negatiivisiksi. Väärien negatiivisten tulosten osuus on eräs testimenetelmän suorituskyvyn indikaattori.

Väärien positiivisten tulosten osuus : Kaikkien negatiivisten kemikaalien osuus, jotka testimenetelmä yksilöi virheellisesti positiivisiksi. Väärien positiivisten tulosten osuus on eräs testimenetelmän suorituskyvyn indikaattori.

YK:n GHS-luokka 1 : Ks. ”Vakava silmävaurio”.

YK:n GHS-luokka 2 : Ks. ”Silmä-ärsytys”.

YK:n kemikaalien maailmanlaajuisesti yhdenmukaistettu luokitus- ja merkintäjärjestelmä (United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals, UN GHS) : Tässä järjestelmässä kemikaalit (aineet ja seokset) luokitellaan vakioitujen fysikaalisten sekä terveys- ja ympäristövaarojen tyyppien ja -tasojen mukaisesti, ja niille osoitetaan vaaraviestinnän tunnukset, kuten kuvamerkit, huomiosanat, vaaralausekkeet, turvalausekkeet ja turvatiedotteet, jotta voidaan välittää tietoa kemikaalien haittavaikutuksista ihmisten ja ympäristön suojelemiseksi (esimerkiksi työnantajille, työntekijöille, kuljetushenkilökunnalle, kuluttajille ja pelastushenkilöstölle) (4).

Lisäys 2

BCOP-TESTIMENETELMÄN ENNUSTAMISKYKY

Taulukko 1

BCOP-menetelmän ennustamiskyky vakavan silmävaurion aiheuttavien kemikaalien tunnistamisessa [YK:n GHS-luokka / EU:n CLP-asetuksen luokka 1 vs Ei-luokiteltu 1 (luokka 2 + ei luokiteltu); US EPA -luokka I vs Ei-luokiteltu I (luokka II + luokka III + luokka IV)]

Luokitus Järjestelmä

Nro

Tarkkuus

Herkkyys

Väärä negatiivinen

Spesifisyys

Väärä positiivinen

%

Nro

%

Nro

%

Nro

%

Nro

%

Nro

YK:n GHS

EU CLP

191

78,53

150/191

86,15

56/65

13,85

9/65

74,60

94/126

25,40

32/126

US EPA

190

78,95

150/190

85,71

54/63

14,29

9/63

75,59

96/127

24,41

31/127


Taulukko 2

BCOP-menetelmän ennustamiskyky sellaisten kemikaalien tunnistamisessa, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta (”ei-ärsyttävät”) [YK:n GHS-luokka / EU:n CLP-asetuksen luokka Ei-luokiteltu vs Ei ei-luokiteltu (luokka 1 + luokka 2); US EPA -luokka IV vs Ei luokiteltu IV (luokka I + luokka II + luokka III)]

Luokitus Järjestelmä

Nro

Tarkkuus

Herkkyys

Väärä negatiivinen

Spesifisyys

Väärä positiivinen

%

Nro

%

Nro

%

Nro

%

Nro

%

Nro

YK:n GHS

EU CLP

196

68,88

135/196

100

107/107

0

0/107

31,46

28/89

68,54

61/89

US EPA

190

82,11

156/190

93,15

136/146

6,85

10/146

45,45

20/44

54,55

24/44

Lisäys 3

PÄTEVYYDEN OSOITTAMISEEN TARKOITETUT KEMIKAALIT BCOP-TESTIMENETELMÄLLE

Ennen kuin laboratorio alkaa käyttää tähän testimenetelmään perustuvaa menetelmää rutiininomaisesti, sen olisi osoitettava teknisen pätevyytensä määrittämällä oikein taulukossa 1 suositeltujen 13 kemikaalin silmävaarallisuusluokitus. Kemikaalit valittiin sen mukaan, että ne edustavat erilaisia vasteita silmävaaroihin perustuen tuloksiin, jotka on saatu kanin silmällä tehdyllä in vivo -testillä (TG 405) (17) ja YK:n GHS-luokitusjärjestelmää (eli luokkia 1, 2A, 2B tai ei luokiteltu) (4). Muita valintaperusteita olivat kemikaalien kaupallinen saatavuus, korkealaatuisten in vivo -tutkimustulosten saatavuus ja BCOP-testimenetelmällä saatujen korkealaatuisten in vitro -tulosten saatavuus. Tutkimustulokset ovat nähtävissä asiakirjoista Streamlined Summary Document (3) ja in the ICCVAM Background Review Document for the BCOP test method (2) (18).

Taulukko 1

Teknisen pätevyyden osoittamiseen tarkoitetut suositellut kemikaalit BCOP-testimenetelmälle

Kemikaali

CAS-nro

Kemiallinen luokka (8)

Fysikaalinen olomuoto:

In vivo -luokitus (9)

BCOP-luokitus

Bentsalkoniumkloridi (5 %)

8001-54-5

Oniumyhdiste

Neste

Luokka 1

Luokka 1

Klooriheksidiini

55-56-1

Amiini, amidiini

Kiinteä

Luokka 1

Luokka 1

Dibentsoyyli-L-viinihappo

2743-38-6

Karboksyylihappo, esteri

Kiinteä

Luokka 1

Luokka 1

Imidatsoli

288-32-4

Heterosyklinen

Kiinteä

Luokka 1

Luokka 1

Trikloorietikkahappo (30 %)

76-03-9

Karboksyylihapot

Neste

Luokka 1

Luokka 1

2,6-Diklooribentsoyylikloridi

4659-45-4

Asyylihalidi

Neste

Kategoria 2A

Tarkkoja/luotettavia ennusteita ei voida tehdä

Etyyli-2-metyyliasotoasetaatti

609-14-3

Ketoni, esteri

Neste

Luokka 2B

Tarkkoja/luotettavia ennusteita ei voida tehdä

Ammoniumnitraatti

6484-52-2

Epäorgaaninen suola

Kiinteä

Luokka 2 (10)

Tarkkoja/luotettavia ennusteita ei voida tehdä

EDTA, dikaliumsuola

25102-12-9

Amiinit, karboksyylihappo (suola)

Kiinteä

Ei luokiteltu

Ei luokiteltu

Tween 20

9005-64-5

Esteri, polyeetteri

Neste

Ei luokiteltu

Ei luokiteltu

2-merkaptopyrimidiini

1450-85-7

Asyylihalidi

Kiinteä

Ei luokiteltu

Ei luokiteltu

Fenyylibutatsoni

50-33-9

Heterosyklinen

Kiinteä

Ei luokiteltu

Ei luokiteltu

Polyoksietyleeni-23-lauryylieetteri (BRIJ-35) (10 %)

9002-92-0

Alkoholi

Neste

Ei luokiteltu

Ei luokiteltu

Lyhenteet: CAS-nro = Chemical Abstracts Service -rekisterinumero.

Lisäys 4

BCOP-TESTISSÄ KÄYTETTY SARVEISKALVOTELINE

BCOP-testissä käytetyt sarveiskalvotelineet valmistetaan reagoimattomasta aineesta (esimerkiksi polypropyleenistä). Telineissä on kaksi puolta (etu- ja takakammio) ja kaksi samanlaista lieriönmuotoista sisäkammiota. Kukin kammio on suunniteltu sellaiseksi, että siihen mahtuu noin 5 ml; kammion päässä on lasi-ikkuna, josta sameusmittaukset kirjataan. Kunkin sisäkammion halkaisija on 1,7 cm ja syvyys 2,2 cm (11). Takakammiossa on tiivisterengas vuotojen estämiseksi. Sarveiskalvo asetetaan endoteelipuoli alaspäin takakammion tiivisterenkaan päälle, ja etukammio asetetaan sarveiskalvon epiteelipuolen päälle. Kammiot kiinnitetään paikoilleen kolmella ruostumattomasta teräksestä valmistetulla ruuvilla, jotka sijaitsevat kammion ulkoreunoilla. Kunkin kammion päässä on lasi-ikkuna, joka voidaan poistaa, että sarveiskalvoon päästään helposti käsiksi. Lasi-ikkunan ja kammion välissä on tiivisterengas vuotojen estämiseksi. Medium ja testikemikaalit lisätään kammioon (ja poistetaan siitä) niiden yläosassa olevien kahden aukon kautta. Aukot suljetaan kumitulpilla käsittelyn ja inkubaation ajaksi. Sarveiskalvotelineen läpi kulkevan valon määrä saattaa muuttua, koska sisäkammioon reikiin tai lasi-ikkunoihin kerääntyvien tai niistä poistuvien kemiallisten jäämien voi vaikuttaa valon sirontaan ja heijastumiseen. Seurauksena voi olla sarveiskalvotelineen läpi kulkevan valon määrän perustason (ja vastaavasti sameuden perustasolukeman) kasvaminen ja väheneminen, mikä voi ilmetä odotettavien sarveiskalvon sameuden perustason alkumittausten huomattavina muutoksina (eli alussa mitattavat yksittäisissä sarveiskalvotelineissä olevan sarveiskalvojen sameusarvot voivat säännöllisesti poiketa yli kaksi tai kolme sameusyksikköä odotettavista perustasoarvoista). Kunkin laboratorion olisi harkittava tarkastusohjelman laatimista sarveiskalvotelineen läpi kulkevan valon muutosten arvioimiseksi testattavien kemikaalien luonteen ja kammioiden käyttötiheyden mukaan. Perustasoarvojen määrittämiseksi sarveiskalvotelineet voidaan ennen rutiinikäytön aloittamista tarkastaa mittaamalla sameuden perustasoarvot kammioista, jotka on täytetty mediumilla ja joissa ei ole sarveiskalvoja. Sarveiskalvotelineen läpi kulkevan valon määrä tarkastetaan säännöllisesti käyttöjaksojen aikana. Laboratorio voi määrittää testattavien kemikaalien, käyttötiheyden ja sarveiskalvon sameusarvojen perustasossa tapahtuvien muutosten perusteella itse, miten usein sarveiskalvoteline tarkastetaan. Jos sarveiskalvotelineen läpikulkevan valon määrässä ilmenee huomattavia muutoksia, sarveiskalvotelineen sisäpinta on aiheellista puhdistaa ja/tai kiillottaa tai vaihtaa uuteen.

Sarveiskalvoteline: räjäytyskuva

Image

Lisäys 5

OPASITOMETRI

Opasitometri on laite, jolla mitataan valon läpikulkua. Esimerkiksi BCOP-testimenetelmän validoinnissa käytettävän Electro Designin (Riom, Ranska) OP-KIT-laitteen halogeenilampusta lähetetään valoa kontrolliosaston läpi (tyhjä kammio, jossa ei ole ikkunaa eikä nestettä) valokennoon ja verrataan valoon, joka on lähetetty näytteelle käytetyn osaston (jossa on sarveiskalvon sisältävä kammio) läpi valokennoon. Valokennoista saadun valon transmissioita verrataan, ja numeronäytöllä näytetään numeerinen sameuden arvo. Sameusyksiköt määritetään. Muun tyyppisiä ja rakenteisia opasitometrejä (esimerkiksi sellaisia, joissa ei tarvitse mitata samanaikaisesti kontrolliosastoa ja näytteelle käytettyä osastoa) voidaan käyttää, jos ne antavat validoiduille laitteille todistetusti samanlaisia tuloksia.

Opasitometrillä pitäisi saada lineaarinen vaste sellaisella sameuslukema-alueella, joka kattaa ennustemallissa kuvatuille eri luokituksille käytetyt raja-arvot (ts. siihen arvoon saakka, joka määrittää syövyttävyyden ja/tai vakavan ärsyttävyyden). Jotta voidaan varmistaa, että lukemat ovat lineaarisia ja tarkkoja 75–80 sameusyksikköön saakka, on opasitometri kalibroitava sarjalla kalibraattoreita. Kalibraattorit asetetaan kalibrointikammioon (sarveiskalvokammion, joka on tarkoitettu kalibraattoreiden pitämiseen), ja ne luetaan opasitometrillä. Kalibrointikammio on suunniteltu sellaiseksi, että kalibraattorit ovat siinä suunnilleen samalla etäisyydellä valosta ja valokennosta kuin mihin sarveiskalvot asetettaisiin sameusmittausten ajaksi. Vertailuarvot ja alkuvaiheen asetuspisteet riippuvat käytettävästä laitteesta. Sameusmittausten lineaarisuus olisi vahvistettava soveltuvin (välinekohtaisin) menettelyin. Esimerkiksi Electro Designin (Riom, Ranska) OP-KIT-laitteessa opasitometri kalibroidaan ensin arvoon 0 sameusyksikköä käyttämällä kalibrointikammiota ilman kalibraattoria. Kalibrointikammioon asetetaan sitten peräkkäin kolme erilaista kalibraattoria ja mitataan sameudet. Kalibraattoreilla 1, 2 ja 3 pitäisi saada 5 prosentin tarkkuudella samat sameuslukemat kuin asetetut arvot 75, 150 ja 225 sameusyksikköä.

13)

Korvataan B osassa oleva B.48 luku seuraavasti:

”B.48   Eristetyn kanan silmän käyttöön perustuva testimenetelmä, jolla tunnistetaan i) vakavia silmävaurioita aiheuttavat kemikaalit ja ii) kemikaalit, joita ei tarvitse luokitella silmä-ärsytyksen tai vakavien silmävaurioiden osalta

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 438 (2013). Eristetyn kanan silmän käyttöön perustuva testimenetelmä (Isolated Chicken Eye, ICE) arvioitiin ICCVAMissa (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, vaihtoehtoisten menetelmien validoinnin virastojenvälinen koordinointikomitea) yhdessä Euroopan vaihtoehtoisten tutkimusmenetelmien keskuksen (ECVAM) ja Japanin vastaavan keskuksen (JaCVAM) kanssa vuosina 2006 ja 2010 (1) (2) (3). Ensimmäisessä arvioinnissa ICE-menetelmä vahvistettiin tieteellisesti päteväksi testimenetelmäksi, jota voidaan käyttää seulontatestinä sellaisten kemikaalien (aineiden ja seosten) tunnistamiseksi, jotka aiheuttavat vakavia silmävaurioita (luokka 1), kuten Yhdistyneiden kansakuntien (YK) kemikaalien maailmanlaajuisesti yhdenmukaistetussa luokitus- ja merkintäjärjestelmässä (GHS) (1) (2) (4) sekä aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta annetussa asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 (CLP-asetus) on määritelty (12). Toisessa arvioinnissa käsiteltiin ICE-menetelmän käyttöä seulontatestinä sellaisten kemikaalien tunnistamiseksi, joita ei ole YK:n GHS-järjestelmän (3) (4) nojalla luokiteltu silmä-ärsytystä tai vakavia silmävaurioita aiheuttaviksi. Validointitutkimuksen tulosten ja vertaisarviointilautakunnan suositusten perusteella pitäydyttiin alkuperäisessä suosituksessa, jonka mukaan ICE-menetelmää käytetään vakavia silmävaurioita aiheuttavien kemikaalien luokittelemiseen (YK:n GHS-järjestelmän luokka 1), koska käytettävissä olevaa tietokantaa ei ole muutettu ICCVAMin alkuperäisen validoinnin jälkeen. Siinä vaiheessa ei annettu muita suosituksia ICE-menetelmän soveltamisalan laajentamiseksi myös muihin kategorioihin. Validointitutkimuksessa käytettyjen in vitro- ja in vivo -tulosjoukkojen uudelleenarvioinnissa keskityttiin arvioimaan ICE-menetelmän käytettävyyttä sellaisten kemikaalien tunnistamiseen, joita ei tarvitse luokitella silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta (5). Uudelleenarvioinnin tuloksena oli, että ICE-menetelmää voidaan käyttää myös sellaisten kemikaalien tunnistamiseen, joita ei tarvitse luokitella YK:n GHS-järjestelmässä määritettyjen silmä-ärsytyksen ja vakavan silmävaurion osalta (4) (5). Testimenetelmä sisältää ICE-menetelmän käyttösuositukset ja -rajoitukset, jotka perustuvat näihin arviointeihin. OECD:n testiohjeen alkuperäisen vuoden 2009 version ja päivitetyn vuoden 2013 version väliset suurimmat erot ovat muun muassa ICE-menetelmän käyttö sellaisten kemikaalien tunnistamiseen, joita ei tarvitse luokitella YK:n GHS-järjestelmän mukaisesti, testiselosteen osien päivitys, lisäyksen 1 määritelmien päivitys ja lisäyksen 2 pätevyyden osoittamiseen tarkoitettujen kemikaalien päivitys.

On yleisesti tunnustettu, että lähitulevaisuudessa millään yksittäisellä silmä-ärsytystä mittaavalla in vitro -testillä tuskin voidaan korvata Draizen in vivo -silmätestiä, jolla pystytään ennustamaan kaikenlainen ärsytys, jota eri luokkiin kuuluvat kemikaalit voivat aiheuttaa. Draizen silmätesti saatetaan kuitenkin voida korvata yhdistelemällä strategisesti useita vaihtoehtoisia testimenetelmiä niin, että niistä muodostuu (vaiheittainen) testausstrategia (6). Jäsentävää lähestymistapaa (7) on tarkoitus käyttää silloin, kun kemikaalin odotetaan käytettävissä olevien tietojen perusteella olevan erittäin ärsyttävä, kun taas kokoavaa lähestymistapaa (7) käytetään silloin, kun kemikaalin odotetaan käytettävissä olevien tietojen perusteella aiheuttavan niin vähän silmä-ärsytystä, että sitä ei tarvitse luokitella. ICE-menetelmä on in vitro -testi, jota voidaan käyttää 8–10 kohdan mukaisesti tietyissä olosuhteissa ja tietyin rajoituksin kemikaalien luokittelemiseksi ja merkitsemiseksi silmiin kohdistuvien vaarojen osalta. Vaikka ICE-menetelmän ei katsota sellaisenaan korvaavan in vivo -kaninsilmätestiä, sitä suositellaan käytettävän ensimmäisenä testinä Scottin ja muiden (7) suositteleman jäsentävän lähestymistavan kaltaisissa testausstrategioissa tunnistamaan vakavia silmävaurioita aiheuttavia kemikaaleja. Nämä kemikaalit luokitellaan ilman lisätestausta YK:n GHS-järjestelmän luokkaan 1 (4). ICE-menetelmää suositellaan käytettävän myös sellaisten kemikaalien tunnistamiseen, joita ei tarvitse luokitella silmä-ärsytyksen tai vakavien silmävaurioiden osalta YK:n GHS-järjestelmässä (ei luokitusta) (4), ja siksi sitä voidaan käyttää ensimmäisenä testinä kokoavaa lähestymistapaa soveltavassa testausstrategiassa (7). Lopullisen luokituksen määrittämiseksi sellaisille kemikaaleille, joiden ei ennusteta aiheuttavan vakavia silmävaurioita tai joita ei ole luokiteltu silmä-ärsytyksen / vakavien silmävaurioiden osalta, on kuitenkin suoritettava lisätestejä (in vitro ja/tai in vivo). Lisäksi toimivaltaisilta sääntelyviranomaisilta tulisi pyytää ohjeita, ennen kuin ICE-menetelmää käytetään kokoavan lähestymistavan testausstrategiassa jonkin muun luokitusjärjestelmän kuin YK:n GHS-järjestelmän puitteissa.

Tässä testimenetelmässä kuvataan menettelyt, joilla arvioidaan testattavan kemikaalin vaarallisuus silmälle mittaamalla sen kykyä aiheuttaa toksisuutta irrotetussa kanan silmässä. Sarveiskalvoon kohdistuneet toksisuusvaikutukset mitataan i) määrittämällä sameus kvalitatiivisesti, ii) määrittämällä epiteelivaurio kvalitatiivisesti, kun silmään annostellaan fluoreseiiniä (fluoreseiinin retentio), iii) mittaamalla paksuuntuminen (turpoaminen) kvantitatiivisesti ja iv) arvioimalla pinnan makroskooppiset morfologiset vauriot kvalitatiivisesti. Sarveiskalvon sameus, turpoaminen ja vauriot arvioidaan testattavalle kemikaalille altistuksen jälkeen erikseen, minkä jälkeen ne yhdistetään, jotta niistä voidaan johtaa silmä-ärsytysluokitus.

Määritelmät ovat lisäyksessä 1.

ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT JA RAJOITUKSET

Tämä testimenetelmä perustuu OECD:n ohjeasiakirjassa 160 (8) ehdotettuun protokollaan, joka kehitettiin ICCVAMin kansainvälisen validointitutkimuksen perusteella (1) (3) (9). Tutkimukseen ovat osallistuneet vaihtoehtoisten menetelmien eurooppalainen validointikeskus ECVAM, Japanin vastaava keskus ja Alankomaiden sovelletun luonnontieteen tutkimuslaitoksen (TNO) toksikologian ja sovelletun farmakologian elämän laatu -osasto. Protokolla perustuu julkaistuista protokollista ja TNO:n nykyisin käyttämästä protokollasta saatuihin tietoihin (10) (11) (12) (13) (14).

Tämän menetelmän validoinnin yhteydessä on testattu useita erilaisia kemikaaleja. Validointitutkimuksen empiirisessä tietokannassa on 152 kemikaalia, joista 72 on aineita ja 80 seoksia (5). Testimenetelmää voidaan soveltaa kiinteisiin aineisiin, nesteisiin, emulsioihin ja geeleihin. Nesteet voivat olla vesiliuoksia tai orgaanisia liuoksia; kiinteät aineet voivat olla joko veteen liukenevia tai veteen liukenemattomia. Kaasuja ja aerosoleja ei ole vielä arvioitu validointitutkimuksessa.

ICE-menetelmää voidaan käyttää vakavia silmävaurioita aiheuttavien kemikaalien tunnistamisessa. Niitä ovat YK:n GHS-järjestelmän luokkaan 1 luokiteltavat kemikaalit (4). Kyseisessä käytössä on havaittu, että ICE-menetelmän haittana ovat alkoholien testauksessa saadut useat väärät positiiviset tulokset sekä kiinteiden aineiden ja pinta-aktiivisten aineiden testauksessa saadut useat väärät negatiiviset tulokset (1) (3) (9). Tässä yhteydessä vääristä negatiivisista tuloksista (eli YK:n GHS-järjestelmän luokkaa 1 ei tunnisteta YK:n GHS-järjestelmän luokaksi 1) ei kuitenkaan ole haittaa, koska kaikki negatiivisen tuloksen saaneet testikemikaalit testataan tämän jälkeen vähintään yhdellä muulla yhtä pätevällä in vitro -testillä tai viimeisenä vaihtoehtona sääntelyvaatimuksista riippuen kaneilla käyttäen vaiheittaista testausstrategiaa, jossa sovelletaan todistusnäyttöön perustuvaa lähestymistapaa. On syytä panna merkille, että kiinteät aineet voivat johtaa Draizen in vivo -silmä-ärsyttävyystestissä vaihteleviin ja äärimmäisiin altistusolosuhteisiin, minkä vuoksi niiden todellisesta ärsyttävyydestä voidaan saada käyttökelvoton ennuste (15). Tutkijat voisivat harkita tämän testimenetelmän käyttöä kaiken tyyppisiin kemikaaleihin, ja positiivisen tuloksen tulisi tällöin katsoa viittaavan vakavaan silmävaurioon, mikä tarkoittaisi YK:n GHS-järjestelmän luokkaa 1 ilman lisätestausta. Alkoholeilla saatuihin positiivisiin tuloksiin olisi kuitenkin suhtauduttava varovaisesti yliennustuksen vaaran takia.

Vakavia silmävaurioita aiheuttavien kemikaalien (YK:n GHS-järjestelmän luokka 1) tunnistamiseen käytettäessä ICE-menetelmän yleinen tarkkuus on 86 prosenttia (120/140), väärien positiivisten tulosten osuus on 6 prosenttia (7/113) ja väärien negatiivisten tulosten osuus 48 prosenttia (13/27) verrattuna YK:n GHS-järjestelmän mukaan luokiteltuihin in vivo -kaninsilmätestistä saatuihin tietoihin (4) (5).

ICE-menetelmää voidaan käyttää myös sellaisten kemikaalien tunnistamiseen, joita ei tarvitse luokitella YK:n GHS-järjestelmän mukaisesti silmä-ärsytyksen ja vakavien silmävaurioiden osalta (4). Toimivaltaisilta sääntelyviranomaisilta tulisi pyytää ohjeita, ennen kuin ICE-menetelmää käytetään kokoavan lähestymistavan testausstrategiassa jonkin muun luokitusjärjestelmän puitteissa. Tällä menetelmällä voidaan testata kaiken tyyppisiä kemikaaleja. Negatiivisen tuloksen perusteella kemikaali voitaisiin jättää luokittelematta silmä-ärsytyksen ja vakavien silmävaurioiden osalta. Validointitietokannan yhden tuloksen perusteella orgaanisia liuottimia sisältävien eliönestomaalien vaikutus saatetaan kuitenkin aliennustaa (5).

Kun ICE-menetelmää käytetään sellaisten kemikaalien tunnistamiseen, joita ei tarvitse luokitella silmä-ärsytyksen ja vakavien silmävaurioiden osalta, sen yleinen tarkkuus on 82 prosenttia (125/152), väärien positiivisten tulosten osuus on 33 prosenttia (26/79) ja väärien negatiivisten tulosten osuus 1 prosentti (1/73) verrattuna YK:n GHS-järjestelmän mukaan luokiteltuihin in vivo -kaninsilmätestistä saatuihin tietoihin (4) (5). Kun tietokannan ulkopuolelle jätetään tiettyihin luokkiin kuuluvat testikemikaalit (eli orgaanisia liuottimia sisältävät eliönestomaalit), ICE-menetelmän tarkkuus on 83 prosenttia (123/149), väärien positiivisten tulosten osuus on 33 prosenttia (26/78) ja väärien negatiivisten tulosten osuus 0 prosenttia (0/71) YK:n GHS-järjestelmässä (4) (5).

ICE-menetelmää ei suositella käytettävän sellaisten testikemikaalien tunnistamiseen, jotka tulisi luokitella silmiä ärsyttäviksi (eli YK:n GHS-järjestelmän luokkaan 2 tai 2A), tai testikemikaaleja, jotka tulisi luokitella lievästi silmiä ärsyttäviksi (YK:n GHS-järjestelmän luokka 2B), koska suuri määrä YK:n GHS-järjestelmän luokan 1 mukaisia kemikaaleja on luokiteltu liian alhaisiin YK:n GHS-järjestelmän luokkiin 2, 2A tai 2B ja YK:n GHS-järjestelmän mukaisia ”ei luokitusta” -kemikaaleja on luokiteltu liian korkeisiin YK:n GHS-järjestelmän luokkiin 2, 2A tai 2B. Tätä varten saattaa olla tarpeen tehdä lisää testejä muilla soveltuvilla menetelmillä.

Kaikissa kanan silmiä käyttävissä menettelyissä olisi noudatettava testauslaitoksen määräämiä ihmis- tai eläinperäisten materiaalien (muun muassa kudosten ja kudosnesteiden) käsittelyä koskevia sääntöjä ja menettelyjä. Suositeltavia ovat yleiset laboratorioissa noudatettavat ennaltavarautumiskäytänteet (16).

Vaikka ICE-menetelmässä ei oteta huomioon kaninsilmätestissä arvioituja sidekalvon ja värikalvon vaurioita, siinä käsitellään vaikutuksia sarveiskalvoon, jotka ovat in vivo -testeissä suurin luokittelun peruste YK:n GHS-järjestelmästä puhuttaessa. Kaninsilmätutkimusten perusteella on ehdotettu, että vaikka ICE-testissä ei sinänsä voida arvioida sarveiskalvovaurioiden palautuvuutta, sarveiskalvovaurion alkusyvyyden perusteella voidaan kuitenkin tunnistaa tietyt palautumattomat vaikutukset (17). Erityisesti tarvitaan enemmän tieteellistä tietoa sen ymmärtämiseksi, miten ensimmäisenä syntyviin suuriin vaurioihin liittymättömät palautumattomat vaikutukset syntyvät. ICE-menetelmällä ei voida myöskään arvioida sitä, missä määrin silmäaltistukseen voi liittyä systeemistä toksisuutta.

Tätä testimenetelmää päivitetään aika ajoin sitä mukaa, kun saadaan uusia tietoja. Esimerkiksi histopatologiasta saattaa olla hyötyä, jos sarveiskalvon vauriota on tarpeen luonnehtia tarkemmin. Tämän mahdollisuuden arvioimiseksi käyttäjiä kehotetaan säilyttämään silmät ja ottamaan histopatologisia näytteitä, joita voidaan käyttää tietokannan luomiseen ja päätösperusteiden laatimiseen, jotta menetelmän tarkkuutta voidaan parantaa. OECD on kehittänyt ohjeasiakirjan silmätoksisuuden in vitro -testimenetelmien käytöstä. Ohjeessa kuvataan yksityiskohtaisesti histopatologisten näytteiden ottaminen ja annetaan tiedot siitä, mihin näytteet ja/tai histopatologiset tiedot tulee toimittaa (8).

Kun laboratorio alkaa käyttää tätä määritysmenetelmää, sen olisi käytettävä lisäyksessä 2 mainittuja pätevyyden osoittamiseen tarkoitettuja kemikaaleja. Laboratorio voi käyttää näitä kemikaaleja osoittaakseen teknisen pätevyytensä ICE-menetelmän käytössä ennen kuin se toimittaa ICE-määritystuloksia sääntömääräistä vaaraluokitusta varten.

TESTIN PERIAATE

ICE-menetelmä on elinmalli, joka mahdollistaa kanan silmän lyhytaikaisen ylläpitämisen in vitro. Tässä testimenetelmässä testikemikaalin aiheuttama vaurio arvioidaan määrittämällä sarveiskalvon turpoaminen, sameus ja fluoreseiinin retentio. Kaksi jälkimmäistä muuttujaa arvioidaan kvalitatiivisesti, kun taas sarveiskalvon turpoaminen määritetään kvantitatiivisesti. Kukin mittaus joko muunnetaan kvantitatiiviseksi arvoksi, josta lasketaan yleinen ärsyttävyysindeksi, tai sille osoitetaan kvalitatiivinen luokka, jonka perusteella määritetään in vitro silmän vaaraluokitus, joko YK:n GHS-järjestelmän luokka 1 tai YK:n GHS-järjestelmän ”Ei luokitusta”. Kummankin tuloksen avulla voidaan ennustaa, kuinka todennäköisesti testikemikaali aiheuttaa vakavia silmävaurioita in vivo tai voidaanko se jättää luokittelematta silmän vaaraluokituksessa (ks. päätösperusteet). Sellaisia kemikaaleja ei voida luokitella lainkaan, joiden mahdollisuutta aiheuttaa vakavia silmävaurioita ei ole ennustettu tai joita ei ole luokiteltu ICE-menetelmässä (ks. 11 kohta).

Kanansilmien alkuperä ja kanojen ikä

Tässä määrityksessä on tavanomaisesti käytetty teurastamossa elintarviketuotantoa varten teurastetuista kanoista saatuja silmiä, jolloin ei ole tarvittu laboratorioeläimiä. Testiin voidaan käyttää vain silmiä, jotka on saatu terveistä, ihmisravinnoksi kelpaavista eläimistä.

Parasta kanan ikää ei ole arvioitu kontrolloidussa tutkimuksessa. Testimenetelmässä on yleensä käytetty sen ikäisiä ja painoisia kanoja kuin siipikarjateurastamossa tavanomaisesti teurastetut kevätkananpojat ovat (eli noin seitsemän viikon ikäisiä, paino 1,5–2,5 kg).

Silmien kerääminen ja niiden kuljetus laboratorioon

Päät tulisi irrottaa heti sen jälkeen, kun kanat on tainnutettu, mikä tehdään tavallisesti sähkösokilla, ja kaula on viilletty verenlaskua varten. Laboratorion läheisyydestä tulisi etsiä paikallinen kanojen teurastamo, jotta kanojen päät voidaan kuljettaa teurastamosta laboratorioon riittävän nopeasti. Näin pilaantuminen ja/tai bakteerikontaminaatio voidaan pitää mahdollisimman vähäisinä. Kananpäiden keräämisestä ja silmien poistamisesta silmien tiputuslaitteen (superfuusiolaitteen) kammioon asettamiseen kuluvan ajan tulisi olla mahdollisimman lyhyt (yleensä enintään kaksi tuntia), jotta näytteiden määrittämisen hyväksymisperusteet täyttyvät. Kaikkien määrityksessä käytettyjen silmien olisi oltava peräisin samasta, tiettynä päivänä kerätystä silmäryhmästä.

Koska silmät dissekoidaan laboratoriossa, koskemattomat päät kuljetetaan teurastamosta ympäristön lämpötilassa (yleensä 18–25 °C) muovilaatikoissa kosteutettuina isotonisella fysiologisella keittosuolaliuoksella kostutetuilla liinoilla.

ICE-testissä käytettävien silmien valintaperusteet ja määrä

Hylätyksi tulevat sellaiset silmät, jotka värjäytyvät voimakkaasti fluoreseiinillä (> 0,5) tai joiden sarveiskalvon sameusarvo on suuri (> 0,5) silmämunan poistamisen jälkeen.

Kussakin käsitellyssä ryhmässä ja samanaikaisesti määritettävässä positiivisessa kontrollissa on oltava vähintään kolme silmää. Negatiivisessa kontrolliryhmässä tai liuotinkontrollissa (jos käytetään muuta liuotinta kuin fysiologista keittosuolaliuosta) on oltava vähintään yksi silmä.

Jos kiinteitä aineita testattaessa tulokseksi tulee YK:n GHS-järjestelmän ”Ei luokitusta”, suositellaan testin uusimista vielä kolmella silmällä, jotta tulokselle saadaan vahvistus tai se voidaan hylätä.

MENETTELY

Silmien valmistelu

Silmäluomet leikataan huolellisesti pois varoen vahingoittamasta sarveiskalvoa. Sarveiskalvon eheys arvioidaan nopeasti lisäämällä tippa 2-prosenttista (w/v) natriumfluoreseiiniä sarveiskalvon pinnalle muutamaksi sekunniksi, minkä jälkeen pinta huuhdotaan fysiologisella keittosuolaliuoksella. Fluoreseiinillä käsiteltyjä silmiä tarkastellaan rakovalomikroskoopilla, jotta voidaan varmistaa, ettei sarveiskalvo ole vahingoittunut (eli fluoreseiinin retentio ja sarveiskalvon sameusarvo ovat enintään 0,5).

Jos silmä on vahingoittumaton, se dissekoidaan kallosta varoen vahingoittamasta sarveiskalvoa. Silmämuna vedetään irti silmäkuopasta pitäen tiukasti vilkkukalvosta kiinni kirurgisilla pihdeillä, ja silmän lihakset leikataan käyrillä, tylppäkärkisillä saksilla. On tärkeää, ettei sarveiskalvoa vahingoiteta liialla paineella (kompressioartefakta).

Kun silmää poistetaan silmäkuopasta, pitäisi osa näköhermoa jättää kiinni ja näkyville. Kun silmä on poistettu silmäkuopasta, se asetetaan imupaperialustalle, ja vilkkukalvo ja muu sidekudos leikataan pois.

Poistettu silmä kiinnitetään ruostumattomasta teräksestä valmistettuun pitimeen siten, että sarveiskalvo on pystysuorassa. Pidin siirretään tiputuslaitteen kammioon (18). Pidin asetetaan tiputuslaitteeseen niin, että tiputettava fysiologinen keittosuolaliuos kastelee koko sarveiskalvon (3–4 tippaa minuutissa tai 0,1–0,15 ml/min). Tiputuslaitteen kammioiden lämpötila on pidettävä arvossa 32 ± 1,5 °C. Lisäyksessä 3 esitetään kaavio tyypillisestä tiputuslaitteesta ja silmänpitimistä. Niitä voi ostaa tai ne voi rakentaa itse. Laite voidaan mukauttaa yksittäisen laboratorion tarpeisiin (esimerkiksi eri silmämäärille).

Kun silmät on asetettu tiputuslaitteeseen, niitä tarkastellaan jälleen rakovalomikroskoopilla, jotta voidaan varmistaa, etteivät ne ole vahingoittuneet dissektiossa. Sarveiskalvon huippukohdan paksuus olisi myös mitattava rakovalomikroskooppiin kuuluvalla syvyydenmittauslaitteella. Jos i) fluoreseiinin retentioarvo on yli 0,5, ii) sarveiskalvon sameus on yli 0,5 tai iii) silmissä on muita vahingoittumisen merkkejä, silmät on vaihdettava toisiin. Niistä silmistä, joita ei ole hylätty edellä mainittujen perusteiden perusteella, hylätään sellaiset, joiden sarveiskalvon paksuus poikkeaa yli 10 prosenttia kaikkien silmien keskiarvosta. Käyttäjien on syytä panna merkille, että rakovalomikroskoopeilla voi saada erilaisia arvoja sarveiskalvon paksuudelle, jos raon leveyden asetus on eri. Raon leveys olisi asetettava arvoon 0,095 mm.

Kun kaikki silmät on tutkittu ja hyväksytty, silmiä inkuboidaan noin 45–60 min, jotta ne tasapainottuvat testijärjestelmässä ennen annostelua. Tasapainottumisjakson jälkeen sarveiskalvon paksuudelle ja sameudelle otetaan lukema perusarvoa varten (nolla-arvo ajanhetkellä 0). Dissektion yhteydessä määritettyä fluoreseiiniarvoa käytetään fluoreseiinin retention perusarvona.

Testikemikaalin annostelu

Välittömästi nolla-arvojen mittausten jälkeen silmä (telineineen) poistetaan tiputuslaitteesta, asetetaan vaakasuoraan, ja testikemikaali annostellaan sarveiskalvolle.

Nestemäiset testikemikaalit testataan tavallisesti laimentamattomina, mutta ne voidaan laimentaa tarvittaessa (esimerkiksi jos se kuuluu tutkimussuunnitelmaan). Testikemikaalit laimennetaan mieluiten fysiologisella keittosuolaliuoksella. Muitakin liuottimia voidaan käyttää valvotuissa olosuhteissa, mutta muiden liuottimien kuin fysiologisen keittosuolaliuoksen käyttökelpoisuus olisi osoitettava.

Nestemäiset testikemikaalit annostellaan sarveiskalvolle siten, että testiaine peittää kokonaan ja tasaisesti sarveiskalvon pinnan; tavanomainen tilavuus on 0,03 ml.

Kiinteät aineet olisi mahdollisuuksien mukaan jauhettava mahdollisimman hienoksi morttelissa survimella tai vastaavassa jauhamislaitteessa. Jauhe annostellaan sarveiskalvolle siten, että testiaine peittää pinnan tasaisesti; tavanomainen määrä on 0,03 g.

Testiaineen (nesteen tai kiinteän aineen) annetaan vaikuttaa 10 sekunnin ajan, minkä jälkeen se huuhdellaan silmästä fysiologisella keittosuolaliuoksella (noin 20 ml) huoneenlämpötilassa. Telineessä oleva silmä asetetaan uudelleen tiputuslaitteeseen pystysuoraan. Tarvittaessa silmää voidaan huuhdella lisää 10 sekunnin vaikutusajan jälkeen sekä myös myöhemmin (esimerkiksi silloin, kun sarveiskalvolla havaitaan testikemikaalin jäänteitä). Yleensä lisähuuhtelussa käytettävän keittosuolaliuoksen määrällä ei ole merkitystä, mutta kemikaalin tarttumista sarveiskalvolle on ehdottomasti tarkkailtava.

Kontrollikemikaalit

Kussakin kokeessa on oltava mukana negatiiviset eli liuotin-/kantaja-ainekontrollit ja positiiviset kontrollit.

Testattaessa 100-prosenttisia nesteitä tai kiinteitä aineita käytetään ICE-testissä negatiivisena kontrollina fysiologista keittosuolaliuosta, jotta voidaan havaita epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä ja varmistaa, etteivät määritysolosuhteet aiheuta tahattomasti ärsytysvastetta.

Testattaessa laimennettuja nesteitä testissä käytetään samanaikaisesti liuotin-/kantaja-ainekontrolliryhmää, jotta voidaan havaita epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä ja varmistaa, etteivät määritysolosuhteet aiheuta tahattomasti ärsytysvastetta. Kuten kohdassa 31 mainitaan, liuotinta/kantaja-ainetta saa käyttää vain, jos on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestelmää.

Kuhunkin kokeeseen otetaan mukaan tunnettu silmiä ärsyttävä kemikaali positiivisena kontrollina, jotta voidaan varmistaa, että saadaan asianmukainen vaste. Koska ICE-määritystä käytetään tässä testimenetelmässä syövyttävien tai vakavasti ärsyttävien kemikaalien tunnistamiseksi, positiivisen kontrollin olisi mielellään oltava vertailukemikaali, joka aiheuttaa tässä testimenetelmässä vakavan vasteen. Vakava ärsytysvaste ei kuitenkaan saisi olla liian voimakas, jotta positiivisen kontrollivasteen vaihtelu ajan funktiona voidaan arvioida. Positiivisesta kontrollista olisi hankittava riittävästi in vitro -tuloksia, jotta positiiviselle kontrollille voidaan laskea tilastollisesti määritelty hyväksyttävä alue. Jos tietylle positiiviselle kontrollille ei ole saatavilla riittävästi aiempia ICE-testimenetelmällä saatuja tuloksia, on tietojen saamiseksi mahdollisesti tehtävä lisätutkimuksia.

Nestemäisten testikemikaalien positiivisina kontrolleina voidaan käyttää esimerkiksi 10-prosenttista etikkahappoa tai 5-prosenttista bentsalkoniumkloridia, ja kiinteiden testikemikaalien positiivisina kontrolleina voidaan käyttää esimerkiksi natriumhydroksidia tai imidatsolia.

Vertailukemikaalit ovat hyödyllisiä, kun arvioidaan tiettyyn kemikaali- tai tuoteryhmään kuuluvien tuntemattomien kemikaalien silmä-ärsytyskykyä tai silmää ärsyttävän aineen suhteellista ärsytyskykyä tietyllä ärsytysvastealueella.

Mitatut päätepisteet

Käsitellyt sarveiskalvot arvioidaan ennen käsittelyä ja 30, 75, 120, 180 ja 240 minuuttia (± 5 minuuttia) käsittelyn jälkeen tehdyn huuhtelun jälkeen. Näillä ajanhetkillä saadaan riittävä määrä mittauksia neljän tunnin käsittelyn aikana, ja mittauksien välillä on riittävästi aikaa tehdä kaikista silmistä tarvittavat havainnot.

Arvioidut päätepisteet ovat sarveiskalvon sameus, turpoaminen, fluoreseiinin retentio ja morfologiset vaikutukset (esimerkiksi epiteelin pistemäinen syöpyminen tai irtoaminen). Kaikki määritykset (lukuun ottamatta fluoreseiinin retentiota, joka määritetään vain ennen käsittelyä ja 30 minuutin kuluttua testikemikaalin annostelusta) tehdään kullakin mainitulla ajanhetkellä.

On suositeltavaa ottaa valokuvia osoitukseksi sarveiskalvon sameudesta, fluoreseiinin retentiosta, morfologisista muutoksista ja histopatologiasta (jos sellaisia tutkimuksia on tehty).

Kun viimeinen tutkimus on tehty neljän tunnin kohdalla, silmät suositellaan säilytettävän sopivassa kiinnitysaineessa (esimerkiksi neutraalissa puskuroidussa formaliinissa) mahdollisia histopatologisia tutkimuksia varten (lisätietoja on kohdassa 14 ja lähteessä 8).

Sarveiskalvon turpoaminen arvioidaan sarveiskalvon paksuuden mittauksista, jotka tehdään rakovalomikroskooppiin kuuluvalla optisella paksuudenmittauslaitteella. Turpoaminen ilmoitetaan prosenttilukuna, ja se lasketaan sarveiskalvon paksuuden mittauksista seuraavalla kaavalla:

Formula

Kaikkien testattujen silmien sarveiskalvon turpoamisen prosenttikeskiarvo lasketaan kaikille havaintoajanhetkille. Kullekin testikemikaalille annetaan yleinen luokkaa koskeva arvo sarveiskalvon turpoamiselle saadun korkeimman (millä tahansa ajanhetkellä havaitun) keskimääräisen arvon perusteella (ks. 51 kohta).

Sarveiskalvon sameus lasketaan käyttäen sitä sarveiskalvon kohtaa, joka antaa suurimman sameusarvon (ks. taulukko 1). Kaikkien testattujen silmien sarveiskalvon keskimääräinen sameusarvo lasketaan kaikille havaintoajanhetkille. Kullekin testikemikaalille annetaan yleinen luokkaa koskeva arvo sarveiskalvon sameudelle saadun korkeimman (minä tahansa ajanhetkenä havaitun) keskimääräisen arvon perusteella (ks. 51 kohta).

Taulukko 1

Sarveiskalvon sameusarvot

Arvo

Havainto

0

Ei sameutta

0,5

Hyvin heikkoa sameutta

1

Hajanaisia sameita alueita; värikalvon yksityiskohdat selvästi nähtävissä

2

Selvästi erottuva läpinäkyvä alue; värikalvon yksityiskohdat hiukan peittyneet

3

Vakavaa sarveiskalvon sameutta; värikalvosta ei ole näkyvillä erityisiä yksityiskohtia; silmäterän kokoa voi tuskin erottaa

4

Täysin samea sarveiskalvo; silmäterää ei näy

Fluoreseiinin retentio arvioidaan ainoastaan 30 minuutin ajanhetkelle (ks. taulukko 2). Kaikkien testattujen silmien fluoreseiinin retention keskiarvo lasketaan tämän jälkeen 30 minuutin ajanhetkelle. Sitä käytetään kullekin testikemikaalille annettavaan yleiseen luokka-arvoon (ks. 51 kohta).

Taulukko 2

Fluoreseiinin retention arvot

Arvo

Havainto

0

Ei fluoreseiinin retentiota

0,5

Hyvin vähäistä yksittäisten solujen värjääntymistä

1

Yksittäisiä värjääntyneitä soluja on hajaantuneena sarveiskalvon käsitellylle alueelle

2

Tiiviitä ja tiheitä yksittäisten värjääntyneiden solujen rykelmiä

3

Laajoja sarveiskalvon alueita, joilla esiintyy tiheää fluoreseiinivärjääntymistä

Morfologisia vaikutuksia ovat esimerkiksi sarveiskalvon epiteelisolujen ”pistemäinen syöpyminen”, epiteelin ”irtoaminen”, sarveiskalvon pinnan ”karhentuminen” ja testikemikaalin ”takertuminen” sarveiskalvoon. Näiden löydösten vakavuus voi vaihdella, ja ne voivat esiintyä samanaikaisesti. Näiden löydösten luokittelu riippuu tutkijan tulkinnasta.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tietojen arviointi

Sarveiskalvon sameutta, turpoamista ja fluoreseiinin retentiota koskevat tulokset olisi arvioitava erikseen, jotta kullekin päätepisteelle voidaan muodostaa ICE-luokka. Tämän jälkeen kutakin päätepistettä koskevat ICE-luokat yhdistetään ärsytysluokituksen muodostamiseksi kullekin testikemikaalille.

Päätösperusteet

Kun kukin päätepiste on arvioitu, voidaan ICE-luokat osoittaa ennalta määrätyn vaihteluvälin perusteella. Sarveiskalvon turpoaminen (taulukko 3), sameus (taulukko 4) ja fluoreseiinin retentio (taulukko 5) käyttäen neljää ICE-luokkaa tulkitaan alla olevien asteikkojen mukaisesti. On syytä panna merkille, että taulukossa 3 esitettyjä sarveiskalvon turpoamisarvoja voi soveltaa vain, jos paksuus on mitattu rakovalomikroskoopilla (esim. Haag-Streit BP900), jossa on syvyydenmittauslaite nro 1 ja jonka raon leveys on 9Formula, mikä vastaa 0,095 mm:iä. Käyttäjien on muistettava, että rakovalomikroskoopeilla voi saada erilaisia arvoja sarveiskalvon paksuudelle, jos raon leveyden asetus on eri.

Taulukko 3

ICE-luokitusperusteet sarveiskalvon turpoamiselle

Keskimääräinen sarveiskalvon turpoaminen (%) (*2)

ICE-luokka

0–5

I

> 5–12

II

> 12–18 (> 75 min käsittelyn jälkeen)

II