1)

Lisätään A osaan luku seuraavasti:

”A.25   DISSOSIAATIOVAKIOT VEDESSÄ (TITRAUSMENETELMÄ – SPEKTROFOTOMETRINEN MENETELMÄ – KONDUKTOMETRINEN MENETELMÄ)

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 112 (1981)

Edellytykset

Ohjeet

Testimenetelmää koskevat lausumat

Vakioasiakirjat

Tämä testimenetelmä perustuu menetelmiin, jotka annetaan osassa ”Lähdekirjallisuus” mainituissa lähteissä ja asiakirjassa Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA, 18. elokuuta 1978.

MENETELMÄ – JOHDANTO, TARKOITUS, SOVELTAMISALA, SOVELTAMINEN JA TESTIN KÄYTTÖ JA RAJAT

Aineen dissosiaatiolla vedessä on sen ympäristövaikutuksen arvioinnin kannalta merkitystä. Se ohjaa aineen muotoa, joka puolestaan määrittää sen toiminnan ja kulkeutumisen. Se voi vaikuttaa kemikaalin adsorptioon maaperään ja sedimentteihin sekä absorptioon biologisiin soluihin.

Määritelmät ja yksiköt

Dissosiaatio on reversiibeli jakautuminen kahteen tai useampaan kemialliseen aineeseen, jotka voivat olla ionisia. Tämä prosessi esitetään yleisesti seuraavasti

RX ⇌ R ++ X –

ja reaktiota koskeva tasapainopitoisuuden vakio on

Esimerkiksi erityistapauksessa, jossa R on vety (aine on happo), vakio on

tai

Vertailuaineet

Seuraavia vertailuaineita ei tarvitse käyttää kaikissa tapauksissa uutta ainetta tutkittaessa. Ne mainitaan ensisijaisesti siksi, jotta menetelmän kalibrointi voidaan suorittaa ajoittain ja jotta tarjotaan mahdollisuus vertailla tuloksia toista menetelmää sovellettaessa.

On hyödyllistä käyttää ainetta, jolla on useita pK-arvoja, kuten esitetään jäljempänä kappaleessa ’Testimenetelmän periaate’. Tällainen aine voi olla

Testimenetelmän periaate

Kuvattu kemiallinen prosessi on ainoastaan jonkin verran lämpötilariippuvainen ympäristön kannalta merkityksellisellä lämpötila-alueella. Dissosiaatiovakion määrittäminen edellyttää kemiallisen aineen liukenevien ja liukenemattomien muotojen pitoisuuksien mittaamista. Edellä kappaleessa ’Määritelmät ja yksiköt’ ilmoitetun dissosiaatioreaktion stoikiometrian tietämyksen perusteella voidaan määrittää asiaankuuluva vakio. Tässä testimenetelmässä kuvatussa erityistapauksessa aine käyttäytyy hapon tai emäksen tavoin, ja määritys tehdään helpoiten määrittämällä aineen ionisoitujen ja ei-ionisoitujen muotojen suhteelliset pitoisuudet ja liuoksen pH-arvo. Näiden termien välinen suhde annetaan edellä kappaleessa ’Määritelmät ja yksiköt’ esitetyssä pKa -yhtälössä. Joillain aineilla on enemmän kuin yksi dissosiaatiovakio, ja vastaavia yhtälöitä voidaan laatia. Jotkut tässä kuvatuista menetelmistä ovat myös sopivia ei-happamille/emäksisille dissosiaatioille.

Laatuperusteet

Toistettavuus

Dissosiaatiovakio on toistettava (vähintään kolme määritystä) ± 0,1 log-yksikön puitteisiin.

TESTIMENETELMIEN KUVAUS

Arvon pKa määrittämiseen voidaan käyttää kahta lähestymistapaa. Ensimmäisessä tunnettua määrää ainetta titrataan tarvittaessa hapolla tai emäksellä; toisessa määritetään ionisoitujen ja ionisoitumattomien muotojen suhteellinen pitoisuus ja sen pH-riippuvuus.

Valmisteet

Näihin periaatteisiin perustuvat menetelmät voidaan luokitella titraus-, spektrofotometrisiksi ja konduktometrisiksi menetelmiksi.

Testiliuokset

Kemiallista ainetta tulee liuottaa tislattuun veteen titrausmenetelmässä ja konduktometrisessä menetelmässä. Spektrofotometrisessä ja muissa menetelmissä käytetään puskuriliuoksia. Testiaineen pitoisuus ei saisi olla yli 0,01 M tai yli puolet kyllästymispitoisuudesta, ja liuoksen valmistamisessa on käytettävä aineen puhtainta saatavilla olevaa muotoa. Jos aine on ainoastaan huonosti liukenevaa, sitä voidaan liuottaa pieneen määrään veteen sekoittuvaa liuotinta ennen kuin edellä mainittuja pitoisuuksia lisätään.

Tyndallin sirontaa käytetään tarkistamaan emulsioiden esiintyminen liuoksissa, erityisesti jos liukoisuuden parantamiseksi on käytetty tukiliuotinta. Jos käytetään puskuriliuoksia, puskurin pitoisuus ei saisi ylittää arvoa 0,05 M.

Testiolosuhteet

Lämpötila

Lämpötila on säädettävä ainakin ± 1 °C:n tarkkuudella. Määritys tulisi mieluiten suorittaa lämpötilassa 20 °C.

Jos epäillään merkittävää lämpötilariippuvuutta, määritys on tehtävä ainakin kahdessa muussa lämpötilassa. Lämpötilavälien on oltava tässä tapauksessa 10 °C ja lämpötilan säädön ± 0,1 °C.

Analyysit

Menetelmä määräytyy testattavan aineen luonteen mukaan. Sen on oltava tarpeeksi herkkä, jotta eri lajit voidaan määrittää kussakin testiliuoksen pitoisuudessa.

Testin suorittaminen

Titrausmenetelmä

Testiliuos määritetään titraamalla emäs- tai happoliuoksella ja pH-arvo mitataan jokaisen titrantin lisäyksen jälkeen. Ennen ekvivalenttipistettä on tehtävä ainakin 10 täydentävää lisäystä. Jos ekvivalenssi saavutetaan tarpeeksi nopeasti, voidaan käyttää piirturilla varustettua potentiometriä. Tässä menettelyssä aineen kokonaismäärä ja sen pitoisuus on oltava tarkasti tiedossa. On ryhdyttävä varotoimiin hiilidioksidin poissulkemiseksi. Yksityiskohtia menettelystä, varotoimista ja laskennasta annetaan vakiotesteissä, esim. viitteet (1), (2), (3) ja (4).

Spektrofotometrinen menetelmä

Löydetään aallonpituus, jossa aineen ionisoiduilla ja ionisoitumattomilla muodoilla on huomattavasti erilaiset ekstinktiokertoimet. UV-valon ja näkyvän valon absorptiospektri saadaan liuoksista, joissa on vakiopitoisuus, pH-olosuhteissa, joissa aine on olennaisesti ionisoitumaton ja täysin ionisoitu ja useissa pH-arvojen väliarvoissa. Tämä voidaan tehdä joko lisäämällä väkevää happoa (emästä) suhteellisen suureen määrään testiaineliuosta monikomponenttisessa puskuriliuoksessa aluksi korkealla (matalalla) pH-arvolla (viite 5), tai lisäämällä yhtä suuret tilavuudet aineen kantaliuosta esim. veteen, metanoliin, erilaisten puskuriliuosten, jotka kattavat halutun pH-välin, vakiotilavuuteen. Valitun aallonpituuden pH- ja absorbanssiarvoista lasketaan riittävä määrä arvoja pKa:lle käyttäen tietoja ainakin viidestä pH-arvosta, joissa aine on vähintään 10- ja korkeintaan 90-prosenttisesti ionisoitu. Lisätietoja kokeellisista yksityiskohdista ja laskentamenetelmästä annetaan viitteessä 1.

Konduktometrinen menetelmä

Käyttämällä pienen tunnetun kennovakion mittakennoa mitataan aineen noin 0,1 M liuoksen johtokykyä vedessä. Myös tämän liuoksen useiden tarkasti valmistettujen laimennuksien johtavuutta mitataan. Konsentraatiota puolitetaan kullakin kerralla ja sarjan tulisi kattaa ainakin konsentraatioiden suuruusjärjestys. Rajoittava johtuvuus äärettömässä laimennuksessa löydetään suorittamalla samanlainen koe Na-suolan kanssa ja ekstrapoloimalla. Dissosiaatioaste voidaan sen jälkeen laskea kunkin liuoksen johtavuudesta käyttämällä Onsagerin yhtälöä, ja näin ollen, Ostwaldin laimennuslakia soveltaen, dissosiaatiovakio voidaan laskea K = α2C/(1 – α), jossa C on konsentraatio mooleina litraa kohti ja α dissosioitunut osa. On ryhdyttävä varotoimiin hiilidioksidin poissulkemiseksi. Lisätietoja kokeellisista yksityiskohdista ja laskentamenetelmästä annetaan vakioasiakirjoissa ja viitteessä (1), (6) ja (7).

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten käsittely

Titrausmenetelmä

Kymmenelle mitatulle pisteelle titrauskäyrällä lasketaan pKa-arvo. Tällaisten pKa-arvojen keskiarvo ja keskihajonta lasketaan. Luonnos pH-arvoista vakioemäksen tai -hapon tilavuuden osalta samoin kuin taulukkomuotoinen esitys pitäisi sisällyttää tähän.

Spektrofotometriset menetelmät

Absorbanssi ja pH esitetään taulukkoina jokaisesta spektristä. Ainakin viisi pKa -arvoa lasketaan spektrin datapisteistä, ja lisäksi lasketaan näiden tulosten keskiarvo ja standardipoikkeama.

Konduktometrinen menetelmä

Ekvivalenttijohtokyky Λ lasketaan kullekin hapon konsentraatiolle ja kullekin sellaisen seoksen konsentraatiolle, jossa on vastaava määrä happoa, plus 0,98 vastaava määrä karbonaatitonta natriumhydroksidia. Hapon määrä on korkeampi, jotta estetään hydrolyysista johtuva liika OH–. 1/Λ esitetään Ö_C ja suolan Λo voidaan löytää ekstrapoloimalla nollaväkevyyteen.

Hapon Λo voidaan laskea käyttämällä H+:n ja Na+:n kirjallisuusarvoja, ja pKa-arvo voidaan laskea α = Λi /Λo ja Ka = α2C/(1 – α) kullekin konsentraatiolle. Paremmat arvot Ka:lle voidaan saada tekemällä korjauksia liikkuvuuden ja aktiivisuuden osalta. On laskettava pKa-arvojen keskiarvot ja keskihajonta.

Testiraportti

Kaikki raakadata ja pKa-arvot on toimitettava yhdessä laskentamenetelmän (mieluiten taulukkomuodossa, kuten ehdotetaan viitteessä 1, samoin kuin edellä mainittujen tilastollisten parametrien kanssa. Titrausmenetelmien osalta on esitettävä yksityiskohdat titranttien standardoinnista.

Spektrofotometrisen menetelmän osalta on esitettävä kaikki spektrit. Konduktometrisen menetelmän osalta on esitettävä yksityiskohdat kennovakion määrityksestä. Tiedot käytetystä tekniikasta, analyyttisistä menetelmistä ja kaikkien puskuriaineiden erityispiirteistä on annettava.

Testilämpötilat on ilmoitettava.

LÄHDEKIRJALLISUUS

2)

Korvataan B osassa oleva B.5 luku seuraavasti:

”B.5   AKUUTTI SILMÄN ÄRSYTTÄVYYS/SYÖVYTTÄVYYS

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 405 (2012). OECD:n testiohjeita kemikaalien testaamiseksi on tarkistettava säännöllisesti, jotta ne heijastavat parhaita käytettävissä olevia tieteellisiä menetelmiä. Tämän testimenetelmän aikaisemmissa päivityksissä kiinnitettiin erityistä huomiota mahdollisiin parannuksiin arvioimalla kaikkia testikemikaalista aiemmin saatuja tietoja, jotta vältettäisiin tarpeettomat eläinkokeet ja siten vastattaisiin eläinten hyvinvointia koskeviin näkökohtiin. Testiohjeeseen 405 (joka hyväksyttiin vuonna 1981 ja jota päivitettiin vuosina 1987, 2002 ja 2012) sisältyy suositus, jonka mukaan ennen tässä kuvatun, aineen ärsyttävyyttä/syövyttävyyttä tutkivan in vivo -testin toteuttamista on arvioitava aiempien relevanttien tutkimustulosten painoarvo (1). Jos saatavissa olevat tiedot ovat puutteellisia, niitä voidaan täydentää vaiheittaisen menettelyn avulla (2) (3). Suositeltavaan testausstrategiaan, joka on selostettu tämän menetelmän täydennysosassa, sisältyy validoitujen ja hyväksyttyjen in vitro -testien suorittaminen. Kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH) annetun asetuksen (EY) N:o 1907/2006 (2) mukaisesti integroitu testimenettely sisältyy myös asiaankuuluviin Euroopan kemikaaliviraston ohjeisiin (21). Eläinkokeita tulisi tehdä ainoastaan, jos niitä pidetään välttämättöminä sen jälkeen, kun on tarkasteltu käytettävissä olevia vaihtoehtoisia menetelmiä ja kun niiden käyttöä pidetään asianmukaisena. Tämän päivitetyn testimenetelmän valmistelun aikana on tullut esiin tapauksia, jolloin tämän testimenetelmän soveltamista pidetään edelleen tarpeellisena tai sitä edellytetään joidenkin sääntelyjärjestelmien perusteella.

Viimeisimmässä päivityksessä keskityttiin pääasiassa kipulääkkeiden ja anestesia-aineiden käyttöön muuttamatta testiohjeen perusajatusta ja rakennetta. ICCVAM (3) ja riippumaton kansainvälinen tieteellinen vertaisarviointiryhmä arvioivat pintapuudutteiden rutiinikäytön käyttökelpoisuutta, systeemisiä kipulääkkeitä ja inhimillisiä päätepisteitä silmänärsytyksen in vivo -testauksen aikana (12). Arvioinnissa päädyttiin siihen, että pintapuudutteiden ja systeemisten kipulääkkeiden käytöllä voitaisiin välttää kokonaan tai suurin osa kivusta ja kärsimyksestä testin tulokseen vaikuttamatta, ja suositeltiin, että näitä aineita käytettäisiin aina. Tämä arviointi otetaan huomioon tässä testimenetelmässä. Pintapuudutteita ja systeemisiä kipulääkkeitä on käytettävä ja inhimillisiä päätepisteitä sovellettava akuuttia silmän ärsytystä ja syövyttävyyttä tutkivassa in vivo-testauksessa. Poikkeukset niiden käyttöön on perusteltava. Tässä menetelmässä kuvatuilla tarkennuksilla vähennetään merkittävästi tai vältetään eläinten kipu ja kärsimys useimmissa testaustilanteissa, joissa in vivo-silmätestaus on edelleen tarpeen.

Tasapainoiseen ennaltaehkäisevään kivunhoitoon tulisi sisältyä (i) rutiininomainen esikäsittely pintapuudutteella (esim. proparakaiini ja tetrakaiini) ja systeemisellä kipulääkkeellä (kuten buprenorfiini); (ii) rutiininomainen jälkikäsittely systeemisellä kivunlievityksellä (kuten buprenorfiini ja meloksikaami); (iii) eläinten kivun ja/tai kärsimyksen kliinisten merkkien suunniteltu havainnointi, seuranta ja rekisteröinti; ja (iv) kaikkien silmävammojen luonteen, vakavuuden ja etenemisen suunniteltu havainnointi, seuranta ja rekisteröinti. Tarkempia tietoja annetaan jäljempänä kuvatuissa päivitetyissä menettelyissä. Testikemikaalin annostelun jälkeen mitään muita pintapuudutteita tai kipulääkkeitä ei tulisi käyttää, jotta tutkimukseen ei vaikuteta. Kipulääkkeitä, joilla on anti-inflammatorinen vaikutus (esim. meloksikaami), ei pitäisi käyttää paikallisesti, ja systeemisesti käytettyjen annoksien ei pitäisi häiritä silmävaikutuksia.

Määritelmät annetaan tämän testimenetelmän lisäyksessä.

ALUSTAVAT HUOMIOT

Sekä järkevien tieteellisten menettelytapojen että eläinten hyvinvoinnin vuoksi in vivo -testiä ei pidä suorittaa ennen kuin kaikkien saatavissa olevien kemikaalin mahdolliseen silmä-ärsyttävyyteen/syövyttävyyteen liittyvien tietojen painoarvo on arvioitu. Tällaisia tietoja ovat todisteet aiemmista ihmisille ja/tai koe-eläimille tehdyistä tutkimuksista, todisteet yhden tai usean rakenteellisesti samankaltaisen aineen tai ainetta sisältävän seoksen silmä-ärsyttävyydestä/syövyttävyydestä, kemikaalin voimakasta happamuutta tai emäksisyyttä osoittavat tulokset (4) (5) sekä validoidut ja hyväksytyt in vitro- tai ex vivo -ihoärsyttävyys-/-syövyttävyystestit (6) (13) (14) (15) (16) (17). Tutkimukset voivat olla painoarvoanalyysia aiemmin tehtyjä tai sen tuloksena syntyneitä.

Joidenkin kemikaalien kohdalla painoarvoanalyysi voi osoittaa, että in vivo -testi on tarpeen kemikaalin mahdollisen silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden selvittämiseksi. Kaikissa näissä tapauksissa, ennen kuin tarkastellaan in vivo -silmätestin käyttöä, olisi mieluiten tehtävä tutkimus in vitro ja/tai in vivo -testeissä siitä, mitä ihon syöpymisen vaikutuksia kemikaali aiheuttaa, ja tätä olisi arvioitava testimenetelmän B.4 vaiheittaisen testimenettelyn (7) tai kemikaaliviraston toimintaohjeissa kuvatun integroidun testimenettelyn (21) mukaisesti.

Vaiheittainen testimenetelmä, johon sisältyvät validoidut silmän ärsyttävyyden/syövyttävyyden in vivo tai ex vivo -testit, sisällytetään liitteenä tähän testimenetelmään ja REACH-asetuksen nojalla Euroopan kemikaaliviraston ohjeisiin (21). Tällaisen testimenetelmän käyttöä suositellaan ennen in vivo -testin suorittamista. Uusia kemikaaleja testattaessa on suositeltavaa soveltaa vaiheittaista testimenettelyä, jonka avulla voidaan saada tieteellisesti päteviä tuloksia kemikaalin ärsyttävyydestä/syövyttävyydestä. Sellaisten kemikaalien tapauksessa, joiden iho- ja silmä-ärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä ei ole riittävästi tietoja, menettelytapaa voidaan käyttää puuttuvien tietojen hankkimiseen. Päätös käyttää jotain muuta menettelytapaa tai olla käyttämättä vaiheittaista menettelytapaa on perusteltava.

IN VIVO -TESTIN PERIAATE

Systeemisellä kipulääkkeellä ja asianmukaisella pintapuudutteella annettavan esikäsittelyn jälkeen testiaine annostellaan yhtenä annoksena koe-eläimen toiseen silmään. Käsittelemätön silmä toimii kontrollina. Silmän ärtymisen/syöpymisen aste arvioidaan pisteyttämällä sidekalvon, sarveiskalvon ja värikalvon vammat tietyin väliajoin. Muut silmään kohdistuvat vaikutukset ja koko elimistöön kohdistuvat haittavaikutukset kuvataan myös, jotta vaikutuksia voidaan arvioida kokonaisuudessaan. Testin on kestettävä niin pitkään, että havaittujen vaikutusten korjautuvuus tai korjautumattomuus voidaan arvioida.

Eläimet, joissa havaitaan merkkejä jatkuvasta vakavasta stressistä ja/tai tuskista missä tahansa testin vaiheessa tai vammoja, jotka ovat yhdenmukaisia tässä testimenetelmässä kuvattujen inhimillisten päätepisteiden kanssa (ks. 26 kohta), on lopetettava inhimillisellä tavalla, ja tämä on otettava huomioon kemikaalin arvioinnissa. Kuolevien ja kärsivien eläinten lopettamiskriteereihin sovelletaan OECD:n ohjeasiakirjaa (8).

IN VIVO -TESTIN VALMISTELU

Lajin valinta

Suositeltava koe-eläinlaji on albiinokaniini. Kokeessa käytetään nuoria ja terveitä täysikasvuisia yksilöitä. Muiden lajien käyttö on perusteltava.

Eläinten valmistelu

Kunkin alustavasti testiin valitun koe-eläimen molemmat silmät tutkitaan testin alkua edeltävän 24 tunnin aikana. Eläimiä, joilla esiintyy silmien ärtyneisyyttä, silmävikoja tai aiempia sarveiskalvon vaurioita, ei voi käyttää testissä.

Koe-eläintilat ja ruokinta

Jokaisella eläimellä on oltava oma häkki. Koe-eläinhuoneen lämpötilan on oltava kaniineilla 20 °C (± 3 °C). Vaikka suhteellisen kosteuden pitäisi olla vähintään 30 % eikä mielellään yli 70 % muulloin kuin huoneen puhdistuksen aikana, pitäisi kuitenkin pyrkiä 50–60 %:n suhteelliseen kosteuteen. Huoneessa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa ja 12 tuntia pimeää). Liian voimakasta valoa on vältettävä. Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa.

TESTIMENETTELY

Pintapuudutteiden ja systeemisten kipulääkkeiden käyttö

Seuraavia menetelmiä suositellaan, jotta kipua ja kärsimystä vältetään tai se minimoidaan silmätestausta koskevissa menettelyissä. Vaihtoehtoisia menettelyjä, joiden on todettu välttävän tai lievittävän kipua tai kärsimystä yhtä hyvin tai paremmin, voidaan käyttää niiden sijasta.

Testikemikaalin annostelu

Eläimen alaluomea vedetään varovasti silmämunasta poispäin ja testikemikaali annostellaan eläimen toisen silmän sidekalvopussiin. Sen jälkeen luomia pidetään varovasti yhdessä sekunnin ajan, jotta aine ei valuisi ulos silmästä. Toinen silmä, jota ei käsitellä, toimii kontrollina.

Kosteutus

Koe-eläinten silmiä ei saa pestä vähintään 24 tuntiin testikemikaalin annostelun jälkeen, paitsi jos kyseessä on kiinteä aine (ks. 18 kohta) tai välitön ärsyttävä tai syövyttävä vaikutus. Silmät voidaan pestä 24 tunnin kuluttua, jos se katsotaan tarpeelliseksi.

Pesemisen vaikutuksen selvittämiseksi ei suositella kontrolliryhmää, paitsi jos sille on tieteellisiä perusteita. Jos kontrolliryhmä tarvitaan, käytetään kahta kaniinia. Pesuolosuhteet on dokumentoitava tarkasti, esimerkiksi pesuaika, pesuliuoksen koostumus ja lämpötila, pesun kesto, nesteen tilavuus ja virtausnopeus.

Annostaso

(1)   Nesteiden testaus

Testattaessa nesteitä testiannos on 0,1 ml. Kemikaalia ei saa annostella suoraan suihkepumpusta silmään. Nestesuihke on ensin kerättävä astiaan ennen 0,1 ml:n annostelua silmään.

(2)   Kiinteiden kemikaalien testaus

Testattaessa kiinteitä kemikaaleja, tahnoja ja hiukkasmaisia aineita annoksen tilavuuden on oltava 0,1 ml tai painon enintään 100 mg. Testikemikaali jauhetaan hienoksi pölyksi. Kiinteän aineen tilavuus mitataan, kun aine on ensin kevyesti tiivistetty esimerkiksi naputtamalla mitta-astiaa. Jos kiinteä testikemikaali ei ole poistunut koe-eläimen silmästä fysiologisten mekanismien seurauksena ensimmäiseen havainnointiaikaan mennessä eli tunnin kuluttua käsittelystä, silmä voidaan huuhdella fysiologisella suolaliuoksella tai tislatulla vedellä.

(3)   Aerosolien testaus

On suositeltavaa kerätä kaikki pumpattavat suihkeet ja aerosolit ennen niiden annostelua silmään. Ainoa poikkeus ovat paineistetuissa aerosolisäiliöissä olevat kemikaalit, joita ei voida kerätä höyrystymisen takia. Sellaisessa tapauksessa silmää pidellään auki ja testikemikaali annostellaan silmään yhtenä sekunnin kestävänä purskauksena 10 cm:n etäisyydeltä suoraan silmän edestä. Välimatka voi vaihdella suihkesäiliön paineen ja sisällön mukaan. On varottava, ettei suihkesäiliön paine vahingoita silmää. Joissakin tapauksissa voi olla syytä arvioida suihkeen voimakkuuden silmälle mahdollisesti aiheuttamat ”mekaaniset” vauriot.

Aerosoliannoksen suuruus voidaan arvioida simuloimalla testiä seuraavalla tavalla. Testikemikaali suihkutetaan punnituspaperille suoraan paperin edessä olevasta kaniinin silmän kokoisesta aukosta. Paperin painon lisäyksen avulla arvioidaan silmään suihkutettu määrä. Haihtuvien kemikaalien tapauksessa annoksen suuruus voidaan arvioida punnitsemalla keräysastia testikemikaalin poistamista ennen ja sen jälkeen.

Alkutesti (in vivo -silmä-ärsyttävyys/syövyttävyystesti yhdelle eläimelle)

On erittäin suositeltavaa suorittaa aluksi yhdelle eläimelle in vivo -testi (ks. tämän testimenetelmän täydennysosa: silmä-ärsyttävyyden ja -syövyttävyyden vaiheittainen testaus). Havainnoilla on voitava määrittää vakavuus ja korjautuvuus ennen kuin tehdään varmistustesti toisella eläimellä.

Jos testitulos osoittaa, että kemikaali on silmää syövyttävä tai vakavasti ärsyttävä kuvattua menettelyä käytettäessä, silmän ärtymistä ei pidä enää testata.

Vahvistustesti (in vivo -silmä-ärsyttävyystesti useille eläimille)

Jos alkutestissä ei havaita syöpymisoireita tai vakavia ärsytysoireita, ärsyttävyys tai negatiivinen vaste on vahvistettava testaamalla vielä enintään kaksi eläintä. Jos alkutestissä todetaan voimakas ärsyttävä vaikutus, on suositeltavampaa tehdä vahvistustesti vaiheittaisen menettelyn mukaan yhdelle eläimelle kerrallaan kuin altistaa kaksi eläintä samalla kertaa. Jos toisella eläimellä esiintyy syöpymisoireita tai vakavia ärsytysoireita, testiä ei jatketa. Jos toisesta eläimestä saadaan tarpeeksi tuloksia vaaraluokituspäätöksen tekemiseksi, muita testejä ei pitäisi enää tehdä.

Havainnointijakso

Tarkkailujakson on oltava riittävän pitkä, jotta havaittujen vaikutusten voimakkuus ja korjautuvuus arvioidaan täydellisesti. Testi on kuitenkin lopetettava heti, jos eläin osoittaa merkkejä kovista tuskista tai stressistä (8). Vaikutusten korjautuvuuden määrittämiseksi eläimiä on tarkkailtava tavallisesti 21 päivän ajan testikemikaalin antamisen jälkeen. Jos korjautuvuus todetaan ennen kuin 21 päivää on kulunut, testi on lopetettava silloin.

Kliiniset havainnot ja silmäreaktioiden pisteytys

Silmiä on arvioitava kattavasti silmävaurioiden esiintymisen tai puuttumisen osalta tunnin kuluttua testikemikaalin antamisesta ja tämän jälkeen ainakin kerran päivässä. Eläimiä on arvioitava useita kertoja päivässä ensimmäisen kolmen päivän aikana, jotta varmistetaan, että lopettamispäätökset tehdään ajoissa. Koe-eläimiä on rutiininomaisesti arvioitava koko tutkimuksen keston ajan kivun ja/tai kärsimyksen kliinisten merkkien varalta (esim. silmien toistuva raapiminen tai hankaaminen, ylenmääräinen silmien räpyttely tai vuotaminen) (9) (10) (11) vähintään kaksi kertaa päivittäin, vähintään 6 tuntia havainnointien välillä, tai tarvittaessa useammin. Tämä on tarpeen, jotta (i) eläimiä arvioidaan asianmukaisesti kivun ja kärsimyksen merkkien varalta, jotta tehdään perusteltuja päätöksiä tarpeesta lisätä kipulääkkeiden annostusta ja (ii) eläimiä arvioidaan vakiintuneiden inhimillisten päätepisteiden osalta, jotta tehdään perusteltuja päätöksiä siitä, onko tarkoituksenmukaista lopettaa eläin humaanisti ja varmistaa, että tällaiset päätökset tehdään ajoissa. Fluoreseiinivärjäystä on käytettävä rutiininomaisesti ja rakolamppu- biomikroskopiaa käytetään tarpeen vaatiessa (esimerkiksi arvioitaessa sarveiskalvon haavauman yhteydessä vamman vakavuutta) havainnointivälineenä okulaarivaurion mittaamisessa ja arvioitaessa, onko humaanin lopettamisen osalta vahvistetut päätepistettä koskevat perusteet täytetty. Digitaalivalokuvia havaituista vaurioista voidaan kerätä viitteeksi ja tarjoamaan pysyvä aineisto okulaarivaurion laajuudesta. Eläintä ei saa pitää testattavana sen jälkeen kun lopulliset tiedot on saatu. Eläimet, jotka osoittavat stressin tai vakavien tuskien merkkejä, on viipymättä lopetettava inhimillisellä tavalla, ja tämä on otettava huomioon testikemikaalin vaikutusten arvioinnissa.

Inhimillisellä tavalla on lopetettava eläimet, joilla esiintyy testiaineen annostelun jälkeen seuraavia silmävammoja (ks. taulukko 1 vaurioiden asteista): sarveiskalvon puhkeaminen tai huomattava sarveiskalvon haavauma mukaan luettuna pullistuma, verta silmän etukammiossa, asteen 4 sarveiskalvosamentuma, valorefleksin puuttuminen (värikalvon vaste 2), joka jatkuu 72 tuntia, sidekalvon haavauma, sidekalvon tai vilkkukalvon kuolio tai arpeutuminen. Näin menetellään siksi, että kyseiset vauriot ovat yleensä korjautumattomia. Lisäksi suositellaan, että seuraavia silmävammoja käytetään inhimillisinä päätepisteinä tutkimusten lopettamiseksi ennen suunniteltua 21 päivän tarkkailujaksoa. Näiden vaurioiden katsotaan osoittavan, että vamma aiheutuu vakavasti ärsyttävistä tai syövyttävistä kemikaaleista johtuvista vaurioista, joiden ei odoteta täysin poistuvan 21 päivän tarkkailujakson loppuun mennessä: vamman ulottuminen vakavaan syvyyteen (esim. sarveiskalvon haavauma, joka ulottuu strooman pintakerroksiin), sarveiskalvon rajan tuhoutuminen > 50 % (jota osoittaa sidekalvokudoksen vaalentuminen), ja vakava silmätulehdus (märkivä, rähmäinen silmä). Seuraavaa yhdistelmää voidaan pitää potentiaalisesti hyödyllisinä kriteereinä, jotka vaikuttavat kliiniseen päätökseen tutkimuksen ennenaikaisesta päättämisestä: sarveiskalvon pinnan verisuonittuminen (eli pannus); fluoreseiinivärjätty alue, jonka ala ei pienene ajan mittaan päivittäisen arvioinnin perusteella; ja re-epitelisaation puuttuminen viiden päivän kuluttua testikemikaalin antamisesta. Nämä havainnot eivät kuitenkaan riitä yksittäin perusteiksi tutkimuksen ennenaikaiselle päättämiselle. Kun vakavia silmävaikutuksia on havaittu, tarkkailijana olevaa/pätevää laboratorion eläinlääkäriä tai henkilöstöä, joka on koulutettu havaitsemaan kliiniset vammat, on kuultava kliinisessä tutkimuksessa, jossa määritetään, antaako näiden vaikutusten yhdistelmä aiheen päättää tutkimus varhaisessa vaiheessa. Silmänreaktioiden pisteytys (sidekalvo, sarveiskalvo ja värikalvo) on otettava ja kirjattava 1, 24, 48 ja 72 tunnin kuluttua testikemikaalin annostuksesta (taulukko 1). Eläimet, joille ei kehity silmävammoja, voidaan lopettaa aikaisintaan kolme päivää testikemikaalin annostelun jälkeen. Eläimiä, joilla esiintyy muita kuin vakavia vaurioita, on tarkkailtava, kunnes vauriot häviävät, tai 21 päivää, jolloin koe päätetään. Havainnot on tehtävä ja kirjattava vähintään 1 tunnin, 24 tunnin, 48 tunnin, 72 tunnin, 7 päivän, 14 päivän ja 21 päivän kuluttua, jotta voidaan määrittää vaurioiden tila ja niiden korjautuvuus tai korjautumattomuus. Havaintoja on tehtävä tarvittaessa tiheämmin, jotta määritetään, pitääkö koe-eläin lopettaa inhimillisistä syistä tai poistaa tutkimuksesta negatiivisten tulosten vuoksi.

Silmävaurioiden pisteytys (taulukko 1) on kirjattava kussakin tarkastelussa. Kaikki muut silmävauriot (esimerkiksi sarveiskalvoverho, värjäytyminen, etukammion muutokset) tai koko elimistöön kohdistuvat haittavaikutukset on myös raportoitava.

Reaktioiden tutkimista helpottaa luuppilasien, lampun, biomikroskoopin tai muiden sopivien laitteiden käyttö. Kun havainnot on kirjattu 24 tunnin jälkeen, silmiä voidaan edelleen tutkia fluoreskeiinin avulla.

Silmävasteiden pisteytys on väistämättä subjektiivista. Silmävasteiden pisteytyksen yhdenmukaistamiseksi sekä testilaboratorion ja havaintoja tekevien ja tulkitsevien henkilöiden työn helpottamiseksi havaintoja tekevän henkilöstön on oltava riittävän perehtynyttä pisteytysjärjestelmään.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten arviointi

Silmä-ärsytyspisteet on arvioitava yhdessä vammojen luonteen ja vakavuuden sekä niiden korjautuvuuden tai korjautumattomuuden kanssa. Yksittäiset pisteet eivät edusta kemikaalin ärsyttävyysominaisuuksien absoluuttista tasoa, koska testikemikaalin muutkin vaikutukset ovat arvioinnissa mukana. Sen sijaan yksittäisiä pisteitä pitäisi tarkastella viitearvoina, jotka ovat merkitseviä vain, kun kaikki muut havainnot ja niiden arviointi tukevat pisteiden antamaa tietoa.

Testiraportti

Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:

Tulosten tulkinta

Koe-eläimille tehtyjen silmä-ärsytystestien tulosten ekstrapolointi ihmisiä koskeviksi on vain rajoitetusti pätevää. Monissa tapauksissa albiinokaniini on ihmistä herkempi silmää ärsyttäville tai syövyttäville aineille.

Tulosten tulkinnassa on huolellisesti erotettava sekundäärisestä tulehduksesta johtuva ärsytys.

LÄHDEKIRJALLISUUS

Taulukko 1

Silmävaurioiden pisteytys

TESTIMENETELMÄN B.5 TÄYDENNYS  (4)

SILMÄ-ÄRSYTTÄVYYDEN JA -SYÖVYTTÄVYYDEN VAIHEITTAINEN TESTAUS

Yleisiä huomautuksia

Sekä järkevien tieteellisten menettelytapojen että eläinten hyvinvoinnin vuoksi on tärkeää välttää tarpeettomia eläinkokeita ja tehdä mahdollisimman vähän sellaisia testejä, jotka todennäköisesti aiheuttavat elämissä vakavia vasteita. Ennen in vivo -testin suunnittelemista on arvioitava kaikki tiedot testikemikaalin mahdollisesta silmä-ärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä. Riittävät todisteet testikemikaalin silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden luokittelemiseksi voivat jo olla olemassa, jolloin koe-eläintestejä ei tarvita. Painoarvoanalyysin ja vaiheittaisen menettelyn käyttö vähentää in vivo -testien tarvetta, erityisesti jos on todennäköistä, että testikemikaali aiheuttaa vakavia reaktioita.

On suositeltavaa arvioida aineiden silmä-ärsyttävyydestä/-syövyttävyydestä saatavissa olevien tietojen painoarvo, jotta voidaan päättää, tarvitaanko kemikaalin silmä-ärsyttävyyspotentiaalin määrittämiseksi muita testejä kuin in vivo -silmätesti. Jos muita testejä tarvitaan, on suositeltavaa käyttää vaiheittaista menettelyä relevanttien koetulosten hankkimiseksi. Jos ainetta ei ole testattu aikaisemmin, vaiheittaisen menettelyn avulla voidaan hankkia silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden arviointiin tarvittavat tulokset. Tässä täydennyksessä kuvattu alkuperäinen testimenetelmä kehitettiin OECD:n työryhmässä (1). Se on vahvistettu ja laajennettu myöhemmin järjestelmässä Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, sellaisena kuin se vahvistettiin kemikaalikomitean ja kemikaalityöryhmän 28. yhteisessä kokouksessa marraskuussa 1998 (2) ja kuten OECD:n asiantuntijatyöryhmä päivitti sitä vuonna 2011.

Vaikka tämä vaiheittainen testausstrategia ei ole olennainen osa testimenetelmää B.5, siinä kuvataan suositeltavaa lähestymistapaa aineen silmä-ärsyttävyys-/-syövyttävyysominaisuuksien määrittämiseen. Tämä lähestymistapa edustaa sekä parhaita käytäntöjä että eettistä vertailukohdetta silmä-ärsyttävyyden/-syövyttävyyden in vivo -testauksessa. Siinä annetaan ohjeita in vivo -testin suorittamiseen ja esitetään yhteenveto tekijöistä, jotka on käsiteltävä ennen testin aloittamista. Strategia tarjoaa lähestymistavan aiemmin saatujen tulosten arviointiin testiaineen silmä-ärsyttävyys-/-syövyttävyysominaisuuksien selvittämiseksi, ja sen avulla voidaan vaihe vaiheelta tuottaa merkitseviä tuloksia kemikaaleista, joista tarvitaan lisätietoja tai joita ei ole aikaisemmin tutkittu. Strategiassa suositellaan myös käyttämään ensin validoituja ja hyväksyttyjä in vitro- tai ex vivo -testejä ja sen jälkeen tietyissä tapauksissa testimenetelmän B.4 tutkimuksia (3) (4).

Vaiheittaisen testausstrategian kuvaus

Ennen vaiheittaiseen menettelyyn sisältyvien testien suorittamista (kaavio) on analysoitava kaikki saatavissa olevat tiedot, jotta in vivo -silmätestauksen tarve voidaan määrittää. Vaikka yksittäisistä parametreista (esimerkiksi äärimmäiset pH-arvot) voidaan saada merkitseviä tietoja, on syytä ottaa huomioon tulokset kokonaisuudessaan. Kaikkien kyseessä olevan kemikaalin tai sitä rakenteeltaan vastaavan kemikaalin vaikutustietojen painoarvo on arvioitava testauspäätöksen yhteydessä, ja päätökselle on esitettävä perustelut. Ensisijaisesti on painotettava sekä ihmis- että eläintesteillä kemikaalista aiemmin saatuja tuloksia ja seuraavaksi in vitro- tai ex vivo -testien tuloksia. Syövyttävien kemikaalien in vivo -testejä on vältettävä aina kun se on mahdollista. Testimenettelyssä on otettava huomioon seuraavat asiat:

SILMÄ-ÄRSYTTÄVYYDEN/-SYÖVYTTÄVYYDEN TESTAUS- JA ARVIOINTIMENETTELY

LÄHDEKIRJALLISUUS

3)

Korvataan B osassa oleva B.10 luku seuraavasti:

”B.10    In vitro-kromosomipoikkeavuustesti nisäkässoluilla

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 473 (2016). Se on osa geneettisen toksikologian testimenetelmiä. On laadittu OECD:n asiakirja, jossa ytimekkäitä tietoja geneettistä toksikologiaa koskevista testeistä sekä katsaus näihin testimenetelmiin tehtyihin viimeaikaisiin muutoksiin (1).

In vitro -kromosomipoikkeavuustestin tarkoituksena on tunnistaa kemikaalit, jotka aiheuttavat rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia viljellyissä nisäkässoluissa (2) (3) (4). Rakenteelliset poikkeavuudet jakautuvat kahteen tyyppiin, kromosomi- ja kromatidipoikkeavuuksiin. Polyploidiaa (mukaan lukien endoreduplikaatio) voi aiheutua kromosomipoikkeavuutta koskevissa määritysmenetelmissä in vitro. Aneugeenit voivat aiheuttaa polyploidiaa; polyploidia ei yksinään osoita aneugeenistä mahdollisuutta, se voi yksinkertaisesti osoittaa solysyklin häiriön tai sytotoksisuuden (5). Tätä testiä ei ole suunniteltu mittaamaan aneuploidiaa, vaan aneuploidian havaitsemiseen on suositeltavaa käyttää in vitro -mikrotumatestiä (6).

In vitro -kromosomipoikkeavuustestissä voidaan käyttää ihmisen tai jyrsijän pysyvien solulinjojen tai solukantojen viljelmiä. Käytettävät solut on valittava sen mukaan, mikä on solujen kasvukyky viljelmässä, karyotyypin pysyvyys, (mukaan lukien kromosomiluku) ja kromosomipoikkeavuuksien spontaanifrekvenssi (7). Tällä hetkellä käytettävissä olevien tietojen perusteella ei voida esittää vankkoja suosituksia, vaan todeta, että kemiallisten vaarojen arvioinnissa on tärkeää ottaa huomioon p53-status, geneettinen (karyotyypin) pysyvyys, DNA:n korjaantumiskapasiteetti ja testaukseen valittujen solujen alkuperä (jyrsijä tai ihminen). Tämän testimenetelmän käyttäjiä kehotetaan siten harkitsemaan näiden ja muiden solujen ominaisuuksien vaikutusta solulinjan kykyyn havaita kromosomipoikkeavuuksien induktio, kun tietoa saadaan lisää tällä alalla.

Sovellettavat määritelmät esitetään lisäyksessä 1.

ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT JA RAJOITUKSET

In vitro -testit edellyttävät yleensä eksogeenista metabolista aktivaatiojärjestelmää, ellei solujen metabolia sovellu kyseisiin testikemikaaleihin. Eksogeeninen metabolinen aktivaatiojärjestelmä ei täysin jäljittele in vivo -olosuhteita. On huolehdittava, että vältetään olosuhteet, jotka voisivat johtaa vääriin positiivisiin tuloksiin, toisin sanoen kromosomivaurioihin, jotka eivät johdu testikemikaalien ja kromosomien suorasta vuorovaikutuksesta; tällaisiin olosuhteisiin sisältyvät pH:n tai osmolaalisuuden muutokset (8) (9) (10), yhdysvaikutus väliaineen komponenttien kanssa (11) (12) tai liian korkeat sytotoksisuustasot (13) (14) (15) (16).

Tätä testiä käytetään havaitsemaan klastogeenisistä tapahtumista mahdollisesti johtuvat kromosomipoikkeavuudet. Kromosomipoikkeavuuden induktion analyysi on tehtävä metafaasissa olevia soluja käyttämällä. Siksi on tärkeää, että solujen pitäisi edetä mitoosiin sekä käsitellyissä että käsittelemättömissä viljelmissä. Valmistettujen nanomateriaalien osalta tähän testimenetelmään voidaan joutua tekemään erityisiä mukautuksia, mutta niitä ei ole kuvattu tässä testimenetelmässä.

Ennen kuin testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen tietojen tuottamiseksi aiottuun sääntelytarkoitukseen, on harkittava, antaako se asianmukaiset tulokset tämän tavoitteen kannalta, ja jos antaa, miksi. Tällaista harkintaa ei tarvita, jos seoksen testaamista edellytetään sääntelyvaatimuksissa.

TESTIN PERIAATE

Ihmis- tai muut nisäkäsperäiset soluviljelmät altistetaan testikemikaalille sekä eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän kanssa että ilman sitä, paitsi jos testissä käytetään soluja, joiden metabolointikyky on riittävä (ks. 13 kohta). Sen jälkeen kun soluviljelmien altistus testikemikaalille aloitetaan, ne käsitellään sopivin etukäteen määrätyin välein metafaasin pysäyttävällä kemikaalilla (esim. colcemidilla tai kolkisiinilla), solut kerätään ja värjätään, ja metafaasissa olevat solut analysoidaan mikroskooppisesti kromatidityyppisten ja kromosomityyppisten poikkeavuuksien havaitsemiseksi.

MENETELMÄN KUVAUS

Valmisteet

Solut

Testissä voidaan käyttää erilaisia solulinjoja (esim. kiinanhamsterin munasarjat (CHO), kiinanhamsterin keuhkot V79, kiinanhamsterin keuhkot (CHL)/IU, TK6) tai primaarisia soluviljelmiä, myös ihmisen tai muun nisäkkään perifeerisen veren lymfosyyttejä (7). Käytettyjen solulinjojen valintaa on perusteltava tieteellisesti. Kun primaarisoluja käytetään, on käytettävä mahdollisuuksien mukaan ihmisestä peräisin olevia primaarisoluja, ja näytteet on otettava humaanien eettisten periaatteiden ja sääntöjen mukaisesti. Ihmisen perifeerisen veren lymfosyytit on saatava nuorilta (noin 18–35-vuotiailta), terveiltä ja tupakoimattomilta henkilöiltä, joiden ei tiedetä altistuneen äskettäin genotoksisille aineille (esim. kemikaaleille tai ionisoivalle säteilylle) sellaisilla tasoilla, jotka lisäisivät kromosomaalisten poikkeavuuksien taustaesiintyvyyttä. Tällä varmistetaan, että kromosomaalisten poikkeavuuksien taustaesiintyvyys on matala ja johdonmukainen. Kromosomaalisten poikkeavuuksien esiintyminen perustasolla lisääntyy iän myötä, ja tämä suuntaus on naisilla selvempi kuin miehillä (17) (18). Jos soluja kerätään useammalta kuin yhdeltä luovuttajalta, luovuttajien lukumäärä on ilmoitettava. On osoitettava, että solut ovat jakaantuneet testikemikaalilla käsittelyn aloittamisen ja solujen keräämisen välillä. Soluviljelmät pidetään eksponentiaalisessa kasvuvaiheessa (solulinjat) tai niitä stimuloidaan jakaantumaan (lymfosyyttien primaariset viljelmät), jotta solut altistetaan solusyklin eri vaiheissa, koska soluasteiden herkkyys testikemikaaleille ei ole ehkä tiedossa. Primaarisolut, joita on stimuloitava jakaantumaan mitogeenisilla aineilla, eivät yleensä ole enää synkronoituja testikemikaalille altistamisen aikana (esim. ihmisen lymfosyytit 48 tuntia kestävän mitogeenisen stimulaation jälkeen). Synkronoitujen solujen käyttöä käsittelyn aikana ei suositella, mutta se voidaan perustelluissa tapauksissa hyväksyä.

Kasvatusväliaineet ja viljelyolosuhteet

Soluviljelmiä on viljeltävä soveltuvassa kasvatusväliaineessa ja inkubaatio-olosuhteissa (kasvatusastiat, tarvittaessa kosteutettu ilma, jonka CO2-pitoisuus on 5 prosenttia, 37 °C:n inkubointilämpötila). Solulinjoista on tarkistettava ajoittain modaalisen kromosomimäärän pysyvyys ja varmistettava, ettei mykoplasmakontaminaatiota esiinny (7) (19); soluja ei pidä käyttää, jos ne ovat kontaminoituneet tai jos modaalinen kromosomimäärä on muuttunut. Normaali solusyklin kesto testauslaboratoriossa käytetyissä solulinjoissa tai primaarisissa soluviljelmissä on määritettävä ja sen on oltava solujen julkaistujen ominaisuuksien mukainen (20).

Soluviljelmien valmistelu

Solulinjat: solut kasvatetaan kantaviljelmistä ja kylvetään kasvatusväliaineeseen sellaiseen tiheyteen, että suspensiossa tai yksikerrosviljelmässä olevat solut kasvavat eksponentiaalisesti keräämisajankohtaan asti (esimerkiksi konfluenssia on vältettävä yksikerrosviljelmissä kasvavien solujen osalta).

Lymfosyytit: antikoagulantilla (esimerkiksi hepariinilla) käsiteltyä kokoverta tai erotettuja lymfosyyttejä viljellään (esim. 48 tunnin ajan ihmisen lymfosyyttien osalta) mitogeenin [esim. fytohemagglutiniini (PHA), kun kyse on ihmisen lymfosyyteistä] kanssa, solunjakautumisen aikaansaamiseksi ennen testikemikaalille altistamista.

Metabolinen aktivaatio

Jos solujen endogeeninen metabolointikyky ei ole riittävä, on käytettävä eksogeenisia metabolisia järjestelmiä Yleisimmin käytetty aktivaatiojärjestelmä, jota suositellaan oletusarvoisesti, ellei toisin toimiminen ole perusteltua, on entsyymejä indusoivilla aineilla, kuten Aroclor 1254:llä (21) (22) (23) tai fenobarbitaalin ja ß-naftoflavonin (24) (25) (26) (27) (28) (29) yhdistelmällä käsiteltyjen jyrsijöiden (yleensä rottien) maksasta eristetty postmitokondriaalinen jae (S9), johon on lisätty kofaktoria. Jälkimmäisenä mainittu yhdistelmä ei ole ristiriidassa pysyviä orgaanisia yhdisteitä koskevan Tukholman yleissopimuksen kanssa (30), ja sen on osoitettu indusoivan sekaoksidaasia yhtä tehokkaasti kuin Aroclor 1254 (24) (25) (26) (28). S9-jakeen yleisesti käytetty pitoisuusalue on 1–2 tilavuusprosenttia, mutta sen pitoisuutta voidaan nostaa 10 tilavuusprosenttiin lopullisessa testiväliaineessa. Mitoosi-indeksiä vähentäviä tuotteita, erityisesti kalsiumiakomplekseja aiheuttavia tuotteita (31) on vältettävä käsittelyn aikana. Testattavien kemikaalien luokka saattaa vaikuttaa siihen, mitä eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän tai metabolisen indusoijan tyyppiä ja pitoisuutta päätetään käyttää.

Testikemikaalin valmistus

Kiinteät testikemikaalit on valmistettava sopivissa liuottimissa ja tarvittaessa laimennettava ennen solujen käsittelyä (ks. 23 kohta). Nestemäiset kemikaalit voidaan lisätä suoraan koejärjestelmiin ja/tai laimentaa ennen testijärjestelmän käsittelyä. Kaasujen tai haituvien kemikaalien testauksessa standardimenettelyihin on tehtävä asianmukaisia mukautuksia. Kyseiset kaasut tai kemikaalit on esimerkiksi käsiteltävä suljetuissa astioissa (32) (33) (34). Testikemikaali on valmisteltava juuri ennen käsittelyä, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä.

Testiolosuhteet

Liuottimet

Liuotin on valittava siten, että testikemikaalien liukoisuus on mahdollisimman hyvä eikä se haittaa testin suorittamista esimerkiksi muuttamalla solukasvua, vaikuttamalla testikemikaalin eheyteen, reagoimalla viljelyastioiden kanssa tai haittaamalla metabolista aktivaatiojärjestelmää. Vesipitoisen liuottimen (tai viljelynesteen) käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Vakiintuneita liuottimia ovat esimerkiksi vesi tai dimetyylisulfoksidi. Yleensä orgaanisten liuottimien osuus ei saa ylittää yhtä ja vesipitoisten liuottimien (suolaliuos tai vesi) kymmentä tilavuusprosenttia lopullisessa kasvatusväliaineessa. Jos käytetään muita kuin vakiintuneita liuottimia (esim. etanolia tai asetonia), niiden käyttö on perusteltava tiedoilla, joilla osoitetaan, että ne ja testikemikaali sekä testijärjestelmä sopivat yhteen ja etteivät ne ole genotoksisia käytettyinä pitoisuuksina. Tällaisten perustelevien tietojen puuttuessa on tärkeää käyttää käsittelemättömiä kontrolleja (ks. lisäys 1), jotka osoittavat, ettei valittu liuotin aiheuta mitään haitallisia tai klastogeenisiä vaikutuksia.

Solujen proliferaation ja sytotoksisuuden mittaaminen ja käsittelypitoisuuksien valitseminen

Päätettäessä suurimmasta testikemikaalin pitoisuudesta on vältettävä pitoisuuksia, jotka voivat aiheuttaa vääriä positiivisia vasteita, kuten liian voimakasta sytotoksisuutta (ks. 22 kohta), saostumista väliaineeseen (ks. 23 kohta) tai pH-arvon tai osmolaliteetin merkittävää muuttumista (ks. 5 kohta). Jos testikemikaali aiheuttaa sitä lisättäessä väliaineen pH-arvon merkittävän muutoksen, pH-arvoa voidaan mukauttaa puskuroimalla lopullinen käsittelyväliaine väärien myönteisten tulosten välttämiseksi ja asianmukaisten viljelyolosuhteiden säilyttämiseksi.

Solujen proliferaation mittauksella varmistetaan, että riittävässä määrässä käsiteltyjä soluja on tapahtunut mitoosi testin aikana ja että käsittelyissä on käytetty asianmukaisia sytotoksisuustasoja (ks. 18 ja 22 kohta). Sytotoksisuus on määritettävä pääasiallisessa kokeessa sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnä ollessa että ilman sitä käyttäen asianmukaisia solukuoleman ja solukasvun indikaattoreita. Vaikka sytotoksisuuden arviointi alustavassa testissä saattaa olla hyödyllinen, jotta voidaan määrittää pääasiallisessa kokeessa käytettävät pitoisuudet, alustava testi ei ole pakollinen. Jos se tehdään, se ei saa korvata sytotoksisuuden mittausta pääasiallisessa kokeessa.

Populaation suhteellinen kaksinkertaistuminen (PSK) tai solumäärän suhteellinen lisääntyminen (SMSL) ovat sopivia menetelmiä sytotoksisuuden arviointiin sytogeneettisissä testeissä (13) (15) (35) (36) (55) (ks. kaavojen osalta lisäys 2). Mikäli kyse on pitkäaikaisesta käsittelystä ja näytteenottoajoista sen jälkeen kun on aloitettu käsittely, joka on pidempi kuin 1,5 normaalin solusyklin kesto (ts. yhteensä yli 3 solusykliä), PSK:ssa voidaan aliarvioida sytotoksisuus (37). Tällaisissa olosuhteissa SLSM saattaa olla parempi mittari, tai sytotoksisuuden arviointi 1,5 normaalia solusyklia vastaavan ajan jälkeen on hyödyllinen arvio PSK:ta käyttäen.

Kun kyse on lymfosyyteistä primaariviljelmissä, vaikka mitoosi-indeksi (MI) on sytotoksisten/sytostaattisten vaikutusten mitta, siihen vaikuttavat käsittelyn jälkeinen mittausaika, käytetty mitogeeni ja mahdolliset solusyklin häiriöt. MI on kuitenkin hyväksyttävä, koska muut sytotoksisuuden mitat saattavat olla hankalia ja epäkäytännöllisiä ja niitä ei mahdollisesti voida soveltaa PHA-stimulaation vaikutuksesta kasvavien lymfosyyttien kohdepopulaatioon.

Vaikka SMSL ja PSK solulinjojen tapauksessa ja MI primaarisissa lymfosyyttiviljelmissä ovat suositeltuja sytotoksisuuden parametrejä, muillakin indikaattoreilla (esim. solujen eheys, apoptoosi, nekroosi, solusykli) voidaan antaa hyödyllistä lisätietoa.

Vähintään kolmea hyväksyttävyysperusteet (asianmukainen sytotoksisuus, solumäärä jne.) täyttävää testipitoisuutta (pois lukien liuotinkontrolli ja positiiviset kontrollit) on arvioitava. Solujen tyypistä riippumatta (solulinjat tai primaariset lymfosyyttiviljelmät) kullekin testattavalle pitoisuudelle voidaan altistaa kaksi rinnakkaista viljelmää tai vain yksi viljelmä. Vaikka rinnakkaisten viljelmien käyttö on suositeltavaa, vain yhden viljelmän käyttö on myös hyväksyttävää edellyttäen, että yksittäisestä viljelmästä tai rinnakkaisviljelmistä lasketaan sama kokonaismäärä soluja. Yhden viljelmän käyttö on erityisen merkityksellistä, kun arvioidaan useampaa kuin kolmea pitoisuutta (ks. 31 kohta). Riippumattomista rinnakkaisviljelmistä tietyllä pitoisuudella saadut tulokset voidaan yhdistää analyysia varten (38). Sellaisten testikemikaalien kohdalla, jotka osoittavat vähän tai eivät lainkaan sytotoksisuutta, sopiva pitoisuuksien välinen kerroin on yleensä 2–3. Jos sytotoksisuutta esiintyy, valittujen testipitoisuuksien on katettava vaihteluväli 22 kohdassa kuvatusta sytotoksisuudesta vähäiseen sytotoksisuuteen tai tasoon, jolla sytotoksisuutta ei esiinny lainkaan. Monien testikemikaalien pitoisuus-vastekäyrä on jyrkkä, ja tietojen saamiseksi vähäisestä ja keskitason sytotoksisuustasosta tai annosvastesuhteen tutkimiseksi tarkasti on käytettävä pitoisuuksia, jotka ovat lähempänä toisiaan, ja/tai useampaa kuin kolmea pitoisuutta (yksittäisiä viljelmiä tai rinnakkaisviljelmiä) erityisesti tilanteissa, joissa tarvitaan toistettuja kokeita (ks. 47 kohta).

Jos enimmäispitoisuus perustuu sytotoksisuuteen, suurimmassa pitoisuudessa sytotoksisuuden on oltava 55 ± 5 % käyttäen suositeltuja sytotoksisuuden parametrejä (solulinjojen SMSL:n ja PSK:n pieneneminen ja MI:n pieneneminen lymfosyyttien primaariviljelmissä 45 ± 5 %:iin rinnakkaisesta negatiivisesta kontrollista). On tulkittava varovaisesti positiivisia tuloksia, jotka on havaittu ainoastaan tämän sytotoksisuuden 55 ± 5 %:n vaihteluvälin yläpäässä (13).

Sellaisten huonosti liukenevien testikemikaalien kohdalla, jotka eivät ole sytotoksisia pienintä liukenematonta pitoisuutta pienemmissä pitoisuuksissa, suurimmassa analysoitavassa pitoisuudessa on esiinnyttävä testikemikaalilla käsittelyn päättyessä silmin tai käänteismikroskoopilla nähtävää sameutta tai saostumista. Vaikka sytotoksisuutta esiintyy pienintä liukenematonta pitoisuutta pienemmissä pitoisuuksissa, on suositeltavaa testata ainoastaan yksi sameutta tai näkyvää saostumista tuottava pitoisuus, koska saostuminen saattaa aiheuttaa vääriä vasteita. Saostumista aiheuttavissa pitoisuuksissa on huolehdittava siitä, ettei saostuminen vaikuta testin suorittamiseen (esim. värjäykseen tai pisteytykseen). Ennen koetta saattaa olla hyödyllistä määrittää liukoisuus soluviljelmän elatusaineeseen.

Jos ei havaita saostumista tai rajoittavaa sytotoksisuutta, suurimman testipitoisuuden on vastattava tasoa 10 mM, 2 mg/ml tai 2 μl/ml sen mukaan, mikä pitoisuuksista on pienin (39) (40) (41). Jos testikemikaalin koostumusta ei ole määritelty eli se on esimerkiksi koostumukseltaan tuntematon tai vaihteleva aine, kompleksien reaktiotuote tai biologinen materiaali (UVCB) (42) taikka ympäristöstä otettu näyte, suurimman pitoisuuden on riittävän sytotoksisuuden puuttuessa ehkä oltava suurempi (esim 5 mg/ml) kunkin osan pitoisuuden lisäämiseksi. On kuitenkin huomattava, että nämä vaatimukset voivat vaihdella ihmisille tarkoitettujen lääkkeiden osalta (43).

Kontrollit

Jokaisena solujen keräämisajankohtana on otettava rinnakkaiset negatiiviset kontrollit (ks. 15 kohta), jotka koostuvat pelkästään tutkittavaa ainetta sisältävässä kasvatusväliaineessa olevasta liuottimesta ja joita on käsitelty samalla tavoin kuin altistettuja viljelmiä.

Samanaikaisia positiivisia kontrolleja tarvitaan osoittamaan laboratorion kyky tunnistaa klastogeenejä käytetyn testisuunnitelman olosuhteissa sekä eksogeenisen metabolisen aktivaatiojärjestelmän tehokkuus, kun tämä on tarpeen. Esimerkkejä positiivisista kontrolleista esitetään alla olevassa taulukossa 1. Vaihtoehtoisia positiivisia kontrollikemikaaleja voidaan käyttää perustelluissa tapauksissa. Koska nisäkässoluilla tehtävät in vitro -geenimutaatiotestit ovat riittävän standardoidut, positiivisten kontrollien käyttö voi rajoittua klastogeeniin, joka vaatii metabolista aktivaatiota. Jos tämä tehdään samanaikaisesti ei-aktivoidun testin kanssa samaa annostelukestoa soveltaen, tämä yksittäinen positiivinen kontrollivaste osoittaa sekä metabolisen aktivaatiojärjestelmän aktiivisuuden että testausjärjestelmän herkkyyden. Pitkäaikaisessa käsittelyssä (ilman S9-jaetta) on kuitenkin oltava oma positiivinen kontrollinsa, koska käsittelyn kesto poikkeaa testistä, jossa käytetään metabolista aktivointia. Kutakin positiivista kontrollikemikaalia on käytettävä yhtenä tai useampana pitoisuutena, joiden voidaan odottaa aiheuttavan toistettavissa ja havaittavissa oleva lisääntyminen taustaan verrattuna. Näin voidaan osoittaa testausjärjestelmän herkkyys (vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti lukijalle koodattujen objektilasien identiteettiä), ja tässä testimenetelmässä määritetyt raja-arvot ylittävä sytotoksisuustaso ei saa vaarantaa vasteen luotettavuutta.

Taulukko 1

Vertailukemikaalit, joita suositellaan laboratorion pätevyyden arvioimiseksi ja positiivisten kontrollien valintaan

MENETTELY

Käsittely testikemikaalilla

Lisääntyvät solut altistetaan testikemikaalille metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa ja ilman sitä.

Näytteiden keräämisajankohdat

Negatiivisen tuloksen vahvistamiseksi tarvittavaa perusteellista arviointia varten testi on kuitenkin suoritettava kaikissa seuraavissa kolmessa testiolosuhteissa käyttäen lyhytaikaista käsittelyä metabolisen aktivointijärjestelmän kanssa ja ilman sitä sekä pitkäaikaista käsittelyä ilman metabolista aktivointia (ks. 43, 44 ja 45 kohta):

Jos jokin edellä mainituista testiolosuhteista johtaa positiiviseen vasteeseen, muita altistusohjelmia ei ole välttämättä tarpeen tutkia.

Kromosomipreparaattien valmistus

Soluviljelmiä käsitellään colcemidilla tai kolkisiinilla yleensä 1–3 tunnin ajan ennen näytteiden keräämistä. Jokaisen viljelmän näytteet kerätään ja käsitellään erikseen kromosomipreparaattien valmistusta varten. Kromosomipreparaattien valmistukseen kuuluu solujen hypotoninen käsittely, fiksointi ja värjäys. Yhden solun vahvuisissa kerroksissa voi esiintyä mitoosissa olevia soluja (pyöreitä, irtoavat pinnasta) 3–6 tuntia kestävän käsittelyn päättyessä. Koska mitoosissa olevat solut irtoavat helposti, ne voivat hävitä testikemikaalia sisältävän väliaineen mukana, kun se kaadetaan pois. Jos mitoosissa olevien solujen määrän havaitaan lisääntyvän huomattavasti kontrolleihin verrattuna, mikä viittaa todennäköisesti mitoosin pysähtymiseen, solut on kerättävä sentrifugoimalla ja palautettava viljelmiin, jotta mitoosivaiheessa olevia soluja, joissa kromosomipoikkeavuuksia voi muodostua, ei menetetä keruuvaiheessa.

Analyysi

Kaikki objektilasit, myös positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen mikroskooppitutkimusta kromosomipoikkeavuuksista. Koska fiksaatio johtaa usein joidenkin metafaasissa olevien solujen kromosomien menettämiseen, lasketuissa soluissa tulisi olla sentromeerejä modaalista lukumäärää vastaava määrä ± 2.

Kustakin pitoisuudesta ja kontrollista on laskettava vähintään 300 hyvin levinnyttä metafaasia sen päättelemiseksi, että testikemikaali on selvästi negatiivinen (ks. 45 kohta). Nämä 300 solua jaetaan tasan rinnakkaisnäytteisiin, jos käytetään rinnakkaisviljelmiä. Jos käytetään yhtä viljelmää pitoisuutta kohti (ks. 21 kohta), viljelmästä on laskettava vähintään 300 hyvin levinnyttä metafaasia. Tämän 300 solun laskennan ansiosta testin tilastollista voimaa lisätään ja lisäksi nolla-arvoja havaitaan harvoin (niitä oletetaan olevan vain viisi prosenttia) (44). Laskettujen metafaasien määrää voidaan vähentää, kun havaitaan korkea määrä soluja, joissa on kromosomipoikkeavuuksia ja testikemikaalia pidetään selkeästi positiivisena.

Solut, joissa on rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia mukaan lukien ja ilman aukkoja (gaps), lasketaan. Katkeamiset (breaks) ja aukot määritellään liitteessä 1 lähteiden (45) ja (46) perusteella. Kromatidityyppiset ja kromosomityyppiset poikkeavuudet on kirjattava erikseen ja luokiteltava alatyypin mukaan (katkeamiset, vaihdokset). Laboratoriossa käytettävillä menettelyillä varmistetaan, että kromosomipoikkeavuuden analyysin tekevät hyvin koulutetut laskijat ja niitä vertaisarvioidaan tarvittaessa.

Vaikka testillä pyritään ensisijaisesti toteamaan rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet, on tärkeää rekisteröidä myös polyploidian ja endoreduplikaation esiintymistaajuudet, mikäli näitä esiintyy. (Ks. 2 kohta).

Laboratorion pätevyys

Jotta voidaan vahvistaa riittävä kokemus testin suorittamisesta ennen kuin sitä käytetään rutiinitestaukseen, laboratoriossa on teetettävä sarja kokeita positiivisilla vertailukemikaaleilla, jotka toimivat eri mekanismien kautta, ja erilaisia negatiivisia kontrolleja (käyttäen erilaisia liuottimia/kantaja-aineita). Näiden positiivisten ja negatiivisten kontrollien vasteiden on oltava lähdekirjallisuuden mukaisia. Tätä ei sovelleta laboratorioihin, joilla on kokemusta, eli joista on 37 kohdassa määritelty laboratoriokohtainen tietokanta.

Tiettyjä positiivisia kontrollikemikaaleja (ks. 26 kohdassa oleva taulukko 1) on tutkittava lyhyillä ja pitkillä käsittelyillä ilman metabolista aktivaatiota, ja myös lyhyellä käsittelyllä metabolisen aktivaatiojärjestelmän läsnäollessa, jotta pätevyys havaita klastogeenisia kemikaaleja osoitetaan ja metabolisen aktivaatiojärjestelmän tehokkuus määritetään. Valittujen kemikaalien eri pitoisuudet valitaan siten, että ne aiheuttavat toistettavissa olevia ja pitoisuuteen liittyviä lisääntymisiä taustaan verrattuna, koejärjestelmän herkkyyden ja dynaamisen alueen osoittamiseksi.

Aiemmat kontrollitiedot

Laboratorion on määritettävä:

Kun ensimmäisen kerran saadaan tietoja aiemman negatiivisen kontrollin jakaumasta, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien pitäisi olla julkaistujen kontrollitietojen mukaisia, jos sellaisia on olemassa. Kun kontrollin jakaumaan lisätään enemmän kokeellista tietoa, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien tulisi mieluiten sijoittua kyseisen jakauman 95 %:n kontrollirajojen sisälle (44) (47). Laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokanta on aluksi luotava vähintään 10 kokeelle, mutta sen olisi mieluiten koostuttava vähintään 20 kokeesta, jotka on suoritettu vastaavissa koeolosuhteissa. Laboratorioiden on käytettävä laadunvalvontamenetelmiä, kuten valvontakortteja (esim. C-kortteja tai X-bar-kortteja (48)), positiivisten ja negatiivisten kontrollitietojensa vaihtelevuuden määrittämiseksi ja osoittaakseeen, että laboratorio ”hallitsee” menetelmän (44). Lisäsuosituksia aikaisempien tietojen muodostamisesta ja käytöstä (esimerkiksi perusteet tietojen sisällyttämiseksi aikaisempiin tietoihin tai jättämiseksi pois niistä sekä kokeiden hyväksyttävyysperusteet) annetaan lähdekirjallisuudessa (47).

Mahdollisissa koejärjestelyn muutoksissa on otettava huomioon järjestelyn yhdenmukaisuus laboratorion olemassa olevien aikaisempia kontrolleja koskevan tietokannan kanssa. Jos havaitaan merkittäviä epäjohdonmukaisuuksia, on luotava uusi aikaisempien kontrollien tietokanta.

Negatiivisten kontrollitietojen tulisi koostua kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen esiintymistaajuudesta yhdessä viljelmässä tai rinnakkaisten viljelmien summasta, kuten 21 kohdassa kuvataan. Rinnakkaisten negatiivisten kontrollien olisi mieluiten sijoituttava laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokannan 95 %:n kontrollirajojen sisälle (44) (47). Jos rinnakkaisia negatiivisia kontrolleja koskevat tiedot jäävät 95 %:n kontrollirajojen ulkopuolelle, ne voidaan hyväksyä aikaisemman kontrollien jakaumaan edellyttäen, etteivät ne ole äärimmäisiä harha-arvoja ja on näyttöä siitä, että testijärjestelmä on ”hallinnassa” (ks. 37 kohta), sekä siitä, ettei kyse ole teknisestä tai inhimillisestä virheestä.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten esittäminen

On arvioitava niiden solujen prosenttiosuus, joissa on kromosomipoikkeavuuksia. Kromatidityyppiset ja kromosomityyppiset poikkeavuudet (katkeamiset, vaihdokset) on lueteltava erikseen ja niiden lukumäärät ja esiintymistaajuudet altistetuissa viljelmissä ja kontrolliviljelmissä on mainittava. Aukot (gaps) rekisteröidään erikseen ja raportoidaan, mutta niitä ei lasketa mukaan kromosomipoikkeavuuksien kokonaistaajuuteen. Polyploidian ja/tai endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävien solujen prosenttiosuus raportoidaan, kun tämä havaitaan.

Lisäksi pääasiallisissa kromosomipoikkeavuustesteissä on rekisteröitävä kaikissa testiviljelmissä sekä negatiivisissa ja positiivisissa kontrolliviljelmissä tehdyt samanaikaiset sytotoksisuusmittaukset.

Kustakin viljelmästä on esitettävä tiedot erikseen. Kaikista tiedoista on lisäksi esitettävä yhteenveto taulukkomuodossa.

Hyväksyttävyysperusteet

Testi hyväksytään seuraavilla perusteilla:

Tulosten arviointi ja tulkinta

Mikäli kaikki hyväksyttävyysperusteet täyttyvät, testikemikaali katsotaan selvästi positiiviseksi, jos jossakin tarkastelluista koeolosuhteista (ks. 28 kohta):

Kun kaikki nämä perusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan voivan indusoida kromosomipoikkeavuuksia viljellyissä nisäkässoluissa tässä testijärjestelmässä. Lähdekirjallisuudessa on suosituksia sopivimmille tilastomenetelmille (49) (50) (51).

Mikäli kaikki hyväksyttävyysperusteet täyttyvät, testikemikaali katsotaan selvästi negatiiviseksi, jos kaikissa tarkastelluissa koeolosuhteissa (ks. 28 kohta):

Tällöin katsotaan, ettei testikemikaali voi indusoida kromosomipoikkeavuuksia viljellyissä nisäkässoluissa tässä testijärjestelmässä.

Selvästi positiivista tai negatiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa.

Jos vaste ei ole selvästi negatiivinen eikä selvästi positiivinen yllä kuvatulla tavalla tai tuloksen biologisen merkityksellisyyden vahvistaminen kaipaa tukea, tietoja tulee arvioida asiantuntija-arviossa ja /tai lisätutkimuksissa. Lisäsolujen laskeminen (tarvittaessa) tai kokeen toistaminen käyttäen mahdollisesti modifioituja koeolosuhteita (esimerkiksi pitoisuusvälit, muut metaboliset aktivaatiojärjestelmät [kuten S9-jakeen pitoisuus tai alkuperä]) saattaa olla hyödyllistä.

Saatujen tietojen pohjalta ei harvinaisissa tapauksissa lisätutkimustenkaan jälkeen voida saada positiivisia tai negatiivisia tuloksia, ja sen vuoksi testikemikaalin vaste jää epäselväksi.

Polyploidisten solujen määrän suureneminen saattaa osoittaa, että testikemikaaleilla pystytään estämään mitoottisia prosesseja ja aiheuttamaan numeerisia kromosomipoikkeavuuksia (52). Endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävien solujen määrän suureneminen saattaa osoittaa, että testikemikaalit kykenevät estämään solusyklin etenemisen (53) (54) (ks. 2 kohta). Siksi polyploidiset solut ja endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävät solut on rekisteröitävä erikseen.

Testiraportti

Testiraportissa on esitettävä seuraavat tiedot:

LÄHDEKIRJALLISUUS

4)

Korvataan B osassa oleva B.11 luku seuraavasti:

”B.11   Nisäkkäiden luuytimen kromosomipoikkeavuustesti

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 475 (2016). Se on osa geneettisen toksikologian testimenetelmiä. On laadittu OECD:n asiakirja, jossa ytimekkäitä tietoja geneettistä toksikologiaa koskevista testeistä sekä katsaus näihin testimenetelmiin tehtyihin viimeaikaisiin muutoksiin (1).

Nisäkkäillä in vivo tehtävä luuytimen kromosomipoikkeavuustesti on erityisen relevantti genotoksisuuden arvioinnissa, koska vaikka lajien välillä voi olla vaihtelua, in vivo -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja DNA:n korjautumisprosesseihin liittyvät tekijät ovat aktiivisia ja voivat edistää vasteiden saantia. In vivo -analyysi on hyödyllinen myös in vitro -koejärjestelmässä havaitun genotoksisuuden jatkotutkimuksena.

Nisäkkäillä in vivo tehtävää kromosomipoikkeavuustestiä käytetään testikemikaalien aiheuttamien rakenteellisten kromosomipoikkeavuuksien osoittamiseen nisäkkäiden, yleensä jyrsijöiden, luuydinsoluissa (2) (3) (4) (5). Rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet jakautuvat kahteen tyyppiin, kromosomi- ja kromatidipoikkeavuuksiin. Vaikka genotoksisten kemiallisten mutageenien aiheuttamat poikkeavuudet ovat useimmiten kromatidityyppisiä, myös kromosomityyppisiä poikkeavuuksia esiintyy. Kromosomivauriot ja niihin liittyvät tapahtumat ovat syynä moniin ihmisen geneettisiin sairauksiin, ja on saatu vakuuttavia todisteita siitä, että kun nämä vauriot ja niihin liittyvä tapahtumat aiheuttavat muutoksia somaattisten solujen onkogeeneissä ja kasvunrajoitegeeneissä, ne ovat osallisina syövän synnyssä ihmisillä ja koejärjestelmissä. Polyploidiaa (mukaan lukien endoreduplikaatio) voi aiheutua kromosomipoikkeavuutta koskevissa määritysmenetelmissä in vivo. Polyploidian lisääntyminen ei yksinään osoita aneugeenista mahdollisuutta, vaan se voi yksinkertaisesti osoittaa solysyklin häiriön tai sytotoksisuuden. Tätä testiä ei ole suunniteltu mittaamaan aneuploidiaa. Mikrotumatesti nisäkkään punasoluissa in vivo (tässä liitteessä oleva B.12 luku) tai in vitro -mikrotumatesti nisäkässoluilla (tässä liitteessä oleva B.49 luku) ovat in vivo- ja in vitro -testejä, joita suositellaan aneuploidian havainnointiin.

Käytettyjen termien määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.

ALUSTAVAT HUOMIOT

Tässä testissä käytetään yleensä jyrsijöitä, mutta muut lajit voivat olla joissain tapauksissa sopivia, jos tämä on tieteellisesti perusteltua. Luuydin on tämän testin kohdekudos, sillä sen verisuonitus on hyvin runsasta ja se sisältää solupopulaation, jonka solusykli on nopea ja joka on helppo eristää ja prosessoida. Raportissa on esitettävä tieteelliset perustelut muiden lajien kuin rottien ja hiirten käytöstä. Jos käytetään muita lajeja kuin jyrsijöitä, on suositeltavaa, että luuytimen kromosomipoikkeavuuden mittaus sisällytetään toiseen sopivaan toksisuustestiin.

Jos on saatu viitteitä siitä, etteivät testikemikaalit tai niiden metaboliitit pääse kohdekudokseen, tätä testiä ei pidä käyttää.

Ennen kuin testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen tietojen tuottamiseksi aiottuun sääntelytarkoitukseen, on harkittava, antaako se asianmukaiset tulokset tämän tavoitteen kannalta, ja jos antaa, miksi. Tällaista harkintaa ei tarvita, jos seoksen testaamista edellytetään sääntelyvaatimuksissa.

TESTIMENETELMÄN PERIAATE

Eläimet altistetaan testikemikaalille soveltuvaa altistusreittiä käyttäen ja ne lopetetaan humaanisti sopivan ajan kuluttua altistuksesta. Ennen lopettamista eläimille annetaan ainetta, joka pysäyttää solunjakautumisen metafaasiin (esim. kolkisiinia tai colcemidia). Tämän jälkeen luuydinsoluista tehdään kromosomipreparaatit ja ne värjätään, ja metafaasissa olevien solujen kromosomipoikkeavuudet analysoidaan.

LABORATORIOIDEN PÄTEVYYDEN VARMISTAMINEN

Pätevyyttä koskevat tutkimukset

Jotta voidaan vahvistaa riittävä kokemus analyysin suorittamisesta ennen kuin sitä käytetään tavanomaiseen testaukseen, laboratorion on osoitettava, että se voi tuottaa odotettavissa olevat tulokset julkaistuista tiedoista (esim. (6)) kromosomipoikkeavuuden taajuuden mittaamiseen vähintään kahdella positiivisella kontrollikemikaalilla (mukaan lukien heikot vasteet, joita indusoivat pienet määrät positiivista kontrollikemikaalia), kuten ne, jotka luetellaan taulukossa 1 ja yhdessä yhteensopivien kantaja-aine-/liuotinkontrollien kanssa (ks. 22 kappale). Näissä kokeissa pitää käyttää annoksia, joista aiheutuu toistettavissa olevaa ja annoksesta riippuvaa lukumäärän suurenemista, ja niiden on osoitettava testausjärjestelmän herkkyys sekä dynaaminen vaihteluväli kohdekudoksessa (luuydin) ja käyttää laskentamenetelmää, jota voidaan soveltaa laboratoriossa. Tätä vaatimusta ei sovelleta laboratorioihin, joilla on kokemusta, eli joilla on 10–14 kohdassa tarkoitettu aiemmin kerätty tietokanta.

Aiemmat kontrollitiedot

Pätevyyttä koskevissa tutkimuksissa laboratorion on määriteltävä:

Hankittaessa ensin tietoja aiempien negatiivisten kontrollien jakaumaa varten, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien on oltava yhdenmukaisia julkaistujen kontrollitietojen kanssa, jos sellaisia on olemassa. Kun aikaisempien kontrollien jakaumaan lisätään enemmän kokeellisia tietoja, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien olisi mieluiten sijoituttava kyseisen jakauman 95 %:n kontrollirajojen sisälle. Laboratorion aikaisempia negatiivisia kontrolleja koskevan tietokannan pitäisi olla tilastollisesti vankka, jotta varmistetaan laboratorion kyky arvioida negatiivisten kontrollitietojensa jakaumaa. Lähdekirjallisuuden mukaan voidaan tarvita vähintään 10 koetta, mutta mieluiten olisi tehtävä ainakin 20 koetta vastaavissa koeolosuhteissa. Laboratorioiden on käytettävä laadunvalvontamenetelmiä, kuten valvontakortteja (esim. C-kortteja tai X-bar-kortteja (7)), tunnistamaan kuinka vaihtelevat niiden tiedot ovat, ja osoittaakseen, että laboratorio ”hallitsee” menetelmän. Lisäsuosituksia aikaisempien tietojen muodostamisesta ja käytöstä (esimerkiksi perusteet tietojen sisällyttämiseksi aikaisempiin tietoihin tai jättämiseksi pois niistä sekä kokeiden hyväksyttävyysperusteet) annetaan lähdekirjallisuudessa (8).

Jos laboratorio ei suorita loppuun riittävää määrää kokeita tilastollisesti vankan negatiivisen kontrollin jakauman osoittamiseksi (ks. 11 kohta) pätevyyttä koskevissa tutkimuksissa (kuvataan 9 kohdassa), on hyväksyttävää, että jakauma voidaan luoda ensimmäisten rutiinitutkimuksien aikana. Tässä lähestymistavassa pitäisi noudattaa lähdekirjallisuudessa (8) esitettyjä suosituksia ja negatiivisen kontrollin tuloksia, ja näissä kokeissa saatujen negatiivisten kontrollien tulosten on oltava julkaistujen negatiivisten kontrollien tuloksien mukaisia.

Mahdollisissa koejärjestelyn muutoksissa on otettava huomioon, miten ne vaikuttavat tuloksena olevien tietojen yhdenmukaisuuteen laboratorion olemassa olevan aiempia kontrolleja koskevan tietokannan kanssa. Vain suurien epäjohdonmukaisuuksien vuoksi on luotava uusi aiempien kontrollien tietokanta, jos asiantuntija-arviossa määritetään, että se eroaa edellisestä jakaumasta (ks. 11 kohta). Sen uudelleenluonnin aikana täysimittaista negatiivisten kontrollien tietokantaa ei ehkä tarvita varsinaisen testin suorittamiseen, jos laboratorio voi osoittaa, että sen rinnakkaisen negatiivisen kontrollin arvot ovat yhdenmukaisia aiemman tietokannan tai vastaavien julkistettujen tietojen kanssa.

Negatiivisen kontrollin tietojen tulisi koostua kunkin eläimen rakenteellisten kromosomipoikkeavuuksien (lukuun ottamatta aukkoja [gap]) esiintyvyydestä. Samanaikaisten negatiivisten kontrollien olisi mieluiten sijoituttava laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokannan 95 %:n kontrollirajojen sisälle. Jos rinnakkaisia negatiivisia kontrolleja koskevat tiedot jäävät 95 %:n kontrollirajojen ulkopuolelle, ne voidaan hyväksyä aikaisemman kontrollien jakaumaan edellyttäen, etteivät ne ole äärimmäisiä harha-arvoja ja että on näyttöä siitä, että testijärjestelmä on ”hallinnassa” (ks. 11 kohta), ja ettei ole kyse teknisestä tai inhimillisestä virheestä.

MENETELMÄN KUVAUS

Valmisteet

Eläinlajin valinta

Koe-eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä. Yleisesti käytetään rottia, ja hiirten käyttö voi olla asianmukaista. Kaikkia muita sopivia nisäkäslajeja voidaan käyttää, jos raportissa esitetään tieteellinen perustelu.

Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta

Jyrsijöiden tapauksessa koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C). Vaikka suhteellisen kosteuden olisi mieluiten oltava 50–60 prosenttia, sen olisi oltava ainakin 40 prosenttia eikä mielellään yli 70 prosenttia muulloin kuin tilan puhdistuksen aikana. Tilassa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ravinnon valintaan voi vaikuttaa tarve varmistaa sopiva sekoitus testikemikaalia, kun sitä annetaan tätä reittiä. Jyrsijät on sijoitettava samaa sukupuolta ja käsittelyryhmää edustaviin pienryhmiin (enintään viisi häkkiä kohti), jos mitään aggressiivista käytöstä ei odoteta, mieluiten kiinteisiin lattiahäkkeihin, joissa on asianmukainen virikkeellinen ympäristö. Eläimet voivat olla häkissä yksittäin ainoastaan, jos tämä on tieteellisesti perusteltua.

Eläinten valmistelu

Yleensä käytetään nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä (jyrsijät ovat mieluiten 6–10 viikon ikäisiä käsittelyn alussa, joskin hieman vanhemmat eläimet hyväksytään) ja ne jaetaan satunnaistetusti testi- ja kontrolliryhmiin. Eläimet tunnistetaan yksilöllisesti inhimillisellä minimaalisen invasiivisella toimenpiteellä (esim. rengastamalla, merkitsemällä, mikrosirulla tai biometrisellä tunnuksella, mutta ei korvia tai varpaita leikkaamalla) ja sopeuttamalla laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Ristikontaminaatiota positiivisella kontrollilla ja testikemikaalilla tulisi välttää. Tutkimuksen alkaessa eläinten painonvaihtelun on oltava vähäistä, ja se saa vaihdella korkeintaan ± 20 % kunkin sukupuolen tavanomaisesta keskiarvosta.

Annosten valmistelu

Kiinteät testattavat kemikaalit liuotetaan tai sekoitetaan asianmukaisiin liuottimiin tai kantaja-aineisiin taikka lisätään ravintoon tai juomaveteen, ennen kuin ne annetaan koe-eläimille. Nestemäiset testattavat kemikaalit voidaan antaa suoraan tai laimentaa ennen antamista. Testikemikaaleja voidaan antaa hengitystien kautta tapahtuvan altistamisen osalta kaasuna, höyrynä tai kiinteänä/nestemäisenä aerosolina niiden fysikokemiallisista ominaisuuksista riippuen. Testikemikaali on valmisteltava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä ja asianmukaiset säilytysolosuhteet on määritetty.

Liuotin/kantaja-aine

Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käytetyillä annostasoilla, eikä sen käyttöön saa liittyä epäilyjä mahdollisista kemiallisista reaktioista testikemikaalien kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Esimerkkejä yleisesti käytetyistä yhteensopivista liuottimista/kantaja-aineista ovat vesi, fysiologinen suolaliuos, metyyliselluloosaliuos, natriumkarboksimetyyliselluloosan suolaliuos, oliiviöljy ja maissiöljy. Jos ei ole aikaisempia tai julkaistuja kontrollitietoja siitä, ettei valittu epätyypillinen liuotin/kantaja-aine aiheuta rakenteellisia poikkeavuuksia tai muita haitallisia vaikutuksia, on tehtävä alustava tutkimus, jolla voidaan määrittää liuotin-/kantajakontrollin hyväksyttävyys.

Kontrollit

Positiiviset kontrollit

Kuhunkin testiin pitäisi normaalisti sisällyttää ryhmä eläimiä, joita käsitellään positiivisella kontrollikemikaalilla. Tästä voidaan poiketa, jos testilaboratorio on osoittanut olevansa pätevä tekemään testin ja se on vahvistanut aikaisemman positiivisen kontrollin vaihteluvälin. Kun rinnakkaista positiivisen kontrollin ryhmää ei ole, kuhunkin kokeeseen on sisällytettävä pisteytyskontrollit (kiinteät ja värjätyt objektilasit). Nämä voidaan saada sisällyttämällä tutkimuksen pisteytykseen asianmukaiset vertailunäytteet, jotka on saatu ja joita säilytetään erillisestä määräajoin (esim. 6–18 kuukauden välein) tehtävästä positiivisen kontrollin kokeesta laboratoriossa, jossa koe tehdään; esimerkiksi pätevyyden testaamisen aikana ja säännöllisesti tämän jälkeen, jos tätä tarvitaan.

Positiivisten kontrollikemikaalien pitäisi luotettavasti tuottaa havaittavaa lisääntymistä rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia sisältävien solujen esiintymistaajuudessa spontaanitasoon verrattuna. Positiivisten kontrolliaineiden annokset on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti laskijoille koodattujen näytteiden identiteettiä. On hyväksyttävää, että positiivinen kontrolliaine annetaan eri reittiä kuin testikemikaali käyttäen eri käsittelyaikataulua, ja näytteet voidaan ottaa vain kerran. Lisäksi positiivisina kontrolleina tulisi käyttää tarvittaessa samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvia aineita. Taulukkoon 1 sisältyy esimerkkejä positiivisista kontrollikemikaaleista.

Taulukko 1

Esimerkkejä positiivisista kontrollikemikaaleista

Negatiiviset kontrollit

Negatiivisen kontrolliryhmän eläimet on sisällytettävä jokaiseen näytteenottokertaan ja niitä tulisi käsitellä aivan samalla tavalla kuin tutkimusryhmiä, paitsi ettei niitä altisteta testikemikaalille. Jos testikemikaalin annostelussa käytetään liuotinta/kantaja-ainetta, kontrolliryhmän pitää saada tätä liuotinta/kantaja-ainetta. Kuitenkin, jos aikaisemmista negatiivisen kontrollin tiedoista kullakin näytteenottokerralla testilaboratoriossa käy ilmi johdonmukaisia eläinten välisiä eroja ja rakenteellisia poikkeavuuksia sisältävien solujen esiintymistaajuutta, negatiivista kontrollia varten voidaan tarvita vain yksi näytteenotto. Kun negatiiviseen kontrolliin käytetään yhtä näytteenottoa, kyse pitäisi olla tutkimuksessa käytetystä ensimmäisestä näytteenottokerrasta.

MENETTELY

Eläinten lukumäärä ja sukupuoli

Mikrotuman vaste on yleensä samanlainen uros- ja naaraspuolisilla eläimillä (9) ja on odotettavissa, että tämä pätee myös rakenteellisiin kromosomipoikkeavuuksiin; tästä syystä useimmat tutkimukset voidaan suorittaa kumpaakin sukupuolta käyttäen. Tiedot, jotka osoittavat merkittäviä eroja urosten ja naaraiden välillä (esim. systeemisen toksisuuden, aineenvaihdunnan, biologisen saatavuuden, luuytimeen liittyvän toksisuuden erot, mukaan lukien esimerkiksi raja-annostutkimus) voisivat kannustaa käyttämään molempia sukupuolia. Tässä tapauksessa voi olla tarkoituksenmukaista tehdä tutkimus molemmilla sukupuolilla esim. osana toistuvan annostelun toksisuustutkimusta. Molempia sukupuolia käytettäessä saattaa olla tarkoituksenmukaista tehdä yhdistelykoe. Tarkempia tietoja siitä, miten tietoja yhdistelykokeessa analysoidaan, annetaan lisäyksessä 2.

Ryhmäkoot varmistetaan tutkimuksen alussa, jotta tarjotaan vähintään viisi tutkimukseen soveltuvaa yhtä sukupuolta edustavaa eläintä, tai kustakin sukupuolesta (jos kumpiakin käytetään) ryhmää kohti. Jos ihmisen altistuminen tutkittavalle kemikaalille voi olla sukupuolesta riippuvaa, kuten joidenkin lääkeaineiden kohdalla, testi on tehtävä asianomaista sukupuolta olevilla eläimillä. Ohjeelliseksi maksimimääräksi eläimiä koskevien vaatimusten osalta annetaan, että luuydintutkimus tehdään kahdella näytteenottokerralla, kolmella annosryhmällä ja rinnakkaisella negatiivisella kontrolliryhmällä (kussakin ryhmässä on viisi samaa sukupuolta edustavaa eläintä), ts. tarvitaan 45 eläintä.

Annostasot

Jos tehdään alustava annoksenmääritystutkimus, koska sopivia tietoja ei ole vielä käytettävissä annoksen valinnan opastukseen, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen samaa lajia, samaa kantaa, samaa sukupuolta olevia eläimiä ja samaa altistusohjelmaa kuin päätutkimuksessa (10). Tutkimuksessa on pyrittävä tunnistamaan suurin siedetty annos, joka määritellään korkeimmaksi annokseksi, jota siedetään ilman näyttöä tutkimusta rajoittavasta toksisuudesta suhteessa tutkimuksen kestoon (esim. se aiheuttaa ruumiinpainon laskua tai vertavuotavan kudoksen sytotoksisuutta), mutta joka ei aiheuta kuolemaa eikä kipua, tuskaa tai kärsimystä, jonka vuoksi eläin on lopetettava inhimillisesti (11).

Suurin annos voidaan määritellä myös annokseksi, joka aiheuttaa joitakin toksisuuteen viittaavia muutoksia luuytimessä.

Kemikaalit, jotka osoittavat toksikokineettisten ominaisuuksien saturaation tai aiheuttavat detoksikaatioprosesseja, jotka voivat johtaa altistuksen vähenemiseen pitkäaikaisen käsittelyn jälkeen, voivat muodostaa poikkeuksen annoksenmäärityskriteereihin, ja niitä on arvioitava tapauskohtaisesti.

Jotta saadaan annosvastetiedot, täydelliseen tutkimukseen on sisällyttävä negatiivisen kontrollin ryhmä ja vähintään kolme annostelutasoa, jotka yleensä erotetaan kertoimella 2, mutta enintään kertoimella 4. Jos testikemikaali ei aiheuta toksisuusvaikutusta annoksenmääritystutkimuksessa tai olemassa olevien tietojen perusteella, suurin annos kerta-annostelulle pitäisi olla 2 000 mg/painokilo. Jos testikemikaali aiheuttaa toksisuusvaikutuksen, suurimman siedetyn annoksen pitäisi olla korkein annettava annos, ja käytettävien annostasojen olisi mieluiten katettava vaihteluväli maksimista annokseen, jonka toksisuusvaikutus on vähäinen tai jolla ei ole toksisuusvaikutusta. Kun kohdekudoksen (luuytimen) toksisuusvaikutus havaitaan kaikilla testatuilla annostasoilla, on suositeltavaa tehdä täydentävä tutkimus ei-toksisilla annoksilla. Tutkimukset, joiden tarkoituksena on kuvata täydellisesti määrällisiä annos-vastetietoja, voivat vaatia täydentäviä annosryhmiä. Nämä rajat voivat vaihdella tietyntyyppisten testikemikaalien osalta (esim. ihmisten lääkkeet), jotka kuuluvat erityisten vaatimusten piiriin.

Raja-annostesti

Jos pitoisuusalueenmäärittelykokeet tai olemassa olevat tiedot vastaavista eläinkannoista osoittavat, että vähintään raja-annokseen (kuvattu jäljempänä) perustuva altistusohjelma ei tuota havaittavia toksisuusvaikutuksia (ei esim. luuytimeen liittyvän proliferaation vähentymistä tai muita todisteita kohdekudoksen sytotoksisuudesta), ja jos genotoksisuuden ei oleteta perustuvan in vitro -genotoksisuustutkimuksiin tai tietoihin rakenteellisesti samankaltaisista kemikaaleista, täydellistä tutkimusta kolmella annostasolla ei ehkä pidetä tarpeellisena, mikäli on osoitettu, että testikemikaalit saavuttavat kohdekudoksen (luuytimen). Tällaisissa tapauksissa yksi annostaso raja-annoksena saattaa riittää. Kun annostelu kestää yli 14 päivää, annos on 1 000 mg/painokiloa/päivä. Kun annostelu kestää korkeintaan 14 päivää, annos on 2 000 mg/painokiloa/päivä.

Antotapa

Testin suunnittelussa on otettava huomioon oletettu ihmisen altistusreitti. Siksi perustelluksi altistusreitiksi voidaan valita esim. ravinto tai juomavesi, ihonalainen, suonensisäinen, oraalinen (letkuruokinnalla), altistus hengitysteitse, henkitorven tai implantaation kautta kulkeva reitti. Joka tapauksessa reitti on valittava, jotta varmistetaan kohdekudosten riittävä altistus. Intraperitoneaalista injektiota ei yleensä suositella, koska se ei ole tarkoitettu ihmisen altistumisreitiksi, ja sitä tulisi käyttää vain erityisten tieteellisten perustelujen nojalla. Jos testikemikaali sekoitetaan ravintoon tai juomaveteen, varsinkin jos kyse on yhdestä annoksesta, vaikutuksien havaitsemiseksi on huolehdittava siitä, että viive ravinnon ja veden kulutuksen ja näytteenoton välillä on riittävä (ks. 33–34 kohta). Suurin letkuruokinnan tai injektion avulla kerralla annettava nestemäärä määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Määrä ei saa normaalisti ylittää 1 ml/100 g painoa. Poikkeuksen muodostavat vesiliuokset, joita käytettäessä enimmäistilavuus voi olla 2 ml/100 g painoa. Tätä suurempien määrien käyttö on perusteltava. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyttäviä testikemikaaleja, joiden vaikutukset yleensä pahenevat korkeammilla pitoisuuksilla, testikemikaalimäärän vaihtelu on minimoitava säätämällä pitoisuutta, jotta annostelun vakiotilavuus suhteessa ruumiinpainoon taataan kaikilla annostasoilla.

Altistusohjelma

Testikemikaalit annetaan yleensä yhtenä annoksena, mutta ne voidaan myös jakaa eri annoksiin (ts. kaksi tai useampaa altistuskertaa samana päivänä korkeintaan 2–3 tunnin välein), mikä helpottaa suurten määrien antamista. Näissä olosuhteissa, tai testikemikaalia hengitysteitse annettaessa, näytteenottoaika tulee ajoittaa edellisen annostelun tai altistuksen päättymisajan perusteella.

On vain vähän tietoa toistuvan annostelun menetelmän soveltuvuudesta tähän testiin. Olosuhteissa, joissa tämä testi halutaan sisällyttää toistuvan annostelun toksisuustutkimukseen, on pyrittävä välttämään kromosomivaurioisten mitoosissa olevien solujen menettäminen, mikä voi sattua toksisia annoksia käytettäessä. Sisällyttäminen on hyväksyttävää, kun korkein annos on suurempi tai yhtä suuri kuin raja-annos (ks. 29 kohta) ja annosryhmälle annetaan raja-annos koko altistusajan. Mikrotumatestiä (testimenetelmä B.12) on pidettävä soveltuvimpana kromosomipoikkeavuuksien in vivo -testinä, kun tällainen halutaan sisällyttää muihin tutkimuksiin.

Luuydinnäytteet on otettava kahtena eri ajankohtana eri altistuskertojen jälkeen. Jyrsijöillä ensimmäisen näytteenottovälin keston pitäisi olla 1,5 normaaliin solusykliin kuluva aika (solusykli on normaalisti 12–18 tuntia altistuksen jälkeen). Koska testikemikaalien soluunottoon ja metaboloitumiseen kuluva aika ja sen vaikutus solusyklin kinetiikkaan voi muuttaa kromosomipoikkeavuuksien optimaalista havaitsemisajankohtaa, myöhempi näyte tulisi kerätä 24 tunnin kuluttua ensimmäisestä näytteestä. Ensimmäisellä näytteenottokerralla kaikkia annosryhmiä on altistettava ja näytteitä on kerättävä analyysiin; myöhemmillä näytteenottokerroilla tarvitsee ainoastaan antaa korkein annos. Jos tutkittavaa ainetta annetaan tieteellisen perusteen nojalla pidempään kuin yhden päivän ajan, yleensä on otettava yksi näyte korkeintaan noin 1,5 normaalin solusyklin kuluttua viimeisestä altistusajankohdasta.

Käsittelyn jälkeen ja ennen näytteenottoa eläimille annetaan injektiona vatsaonteloon sopiva annos ainetta, joka pysäyttää solut metafaasivaiheeseen (esim. colcemidia tai kolkisiinia), ja näytteet kerätään sen jälkeen sopivin välein. Hiirillä väli on noin 3–5 tuntia ennen keräämistä ja rotilla 2–5 tuntia. Solut kerätään luuytimestä, saatetaan turpoamaan, fiksoidaan, värjätään ja analysoidaan kromosomipoikkeavuuksien toteamiseksi (12).

Havainnot

Koe-eläimiä koskevia yleisiä kliinisiä havaintoja tulee tehdä ja kliinisiä oireita tulee kirjata ainakin kerran päivässä, mieluiten samaan aikaan joka päivä ottaen huomioon se, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut vaikutukset ovat suurimmillaan. Kaikkien eläinten sairastuvuutta ja kuolleisuutta on havainnoitava ainakin kahdesti vuorokaudessa annostelun aikana. Eläimet on punnittava tutkimuksen alussa ja vähintään kerran viikossa toistuvan annoksen tutkimuksissa ja lopetettaessa. Vähintään viikon kestävissä tutkimuksissa ravinnonkulutuksen mittaus on tehtävä vähintään viikoittain. Mikäli testikemikaalia annostellaan juomaveteen, veden kulutusta on mitattava, kun vesi vaihdetaan tai ainakin kerran viikossa. Eläimet, joilla ilmenee ei-letaaleja merkkejä liiallisesta myrkytysvaikutuksesta, on lopetettava inhimillisesti ennen tutkimusajan päättymistä (11).

Kohdekudoksen altistaminen

Verinäyte on otettava sopivana ajankohtana, jotta voidaan tutkia testikemikaalien plasmatasot luuytimen altistumisen osoittamiseksi, jos tämä on perusteltua ja jos muita altistustietoja ei ole (ks. 44 kohta).

Luuydin- ja kromosomipreparaatit

Heti inhimillisen lopettamisen jälkeen luuytimen solut otetaan eläinten reisi- tai sääriluista, pannaan hypotoniseen liuokseen ja fiksoidaan. Tämän jälkeen metafaasissa olevat solut levitetään objektilaseille ja värjätään vakiintuneilla menetelmillä (ks. (3) (12)).

Analyysi

Kaikki objektilasit, myös ne, joilla on positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen tutkimusta ja jaettava satunnaisotannalla siten, että laskija ei tiedä altistusolosuhteista.

Mitoosi-indeksi on määritettävä sytotoksisuuden mittana vähintään 1 000 solusta eläintä kohti kaikista tutkittavalle aineelle altistetuista eläimistä (myös positiivisista kontrolleista), käsittelemättömistä tai kantaja-aineen/liuottimen negatiivisen kontrollin eläimistä.

Jokaista eläintä kohti tulisi analysoida vähintään 200 metafaasia rakenteellisista kromosomipoikkeavuuksista mukaan lukien ja ilman aukkoja (gaps) (6). Jos aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokanta kuitenkin osoittaa, että keskimääräisen kromosomipoikkeavuuksien taustaesiintyvyys on < 1 % testilaboratoriossa, on harkittava ylimääräisten solujen pisteytystä. Kromatidityyppiset ja kromosomityyppiset poikkeavuudet on kirjattava erikseen ja luokiteltava alatyypin mukaan (katkeamiset, vaihdokset). Laboratoriossa käytettävillä menettelyillä varmistetaan, että kromosomipoikkeavuuden analyysin tekevät hyvin koulutetut laskijat ja niitä vertaisarvioidaan tarvittaessa. Koska objektilasien valmistelu johtaa usein joidenkin metafaasissa olevien solujen rikkoutumiseen ja siten kromosomien menettämiseen, sentromeerien lukumäärän lasketuissa soluissa on vastattava lukua 2n ± 2, jossa haploidinen kromosomiluku on n kyseisen lajin osalta.

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten käsittely

Yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot on esitettävä taulukossa. Jokaisen eläimen osalta on arvioitava mitoosi-indeksi, laskettujen metafaasissa olevien solujen lukumäärä, poikkeavuuksien lukumäärä solua kohti ja niiden solujen prosentuaalinen osuus, joissa on yksi tai useampia rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia. Erityyppiset rakenteelliset kromosomipoikkeavuudet on lueteltava, ja niiden lukumäärä ja esiintymistaajuus koe- ja kontrolliryhmien osalta on ilmoitettava. Aukot (gaps) sekä polyploidiset solut ja endoreduplikoituneita kromosomeja sisältävät solut on rekisteröitävä erikseen. Aukkojen esiintymistaajuus ilmoitetaan, mutta sitä ei yleensä sisällytetä rakenteellisten poikkeavuuksien kokonaistaajuuden analyysiin. Ellei viitteitä sukupuolten välisistä vaste-eroista ole havaittavissa, tiedot voidaan yhdistää tilastollista analyysiä tehtäessä. Eläinten toksisuustiedot ja kliiniset oireet on myös raportoitava.

Hyväksyttävyysperusteet

Testin hyväksyttävyys määritetään seuraavilla kriteereillä:

Tulosten arviointi ja tulkinta

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi positiivinen, mikäli:

Jos vain suurinta annosta tutkitaan tietyllä näytteenottokerralla, testikemikaalia pidetään selvästi positiivisena, mikäli esiintyy tilastollisesti merkittävää kasvua rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin verrattuna ja tulokset ovat aikaisempien negatiivisen kontrollin tietojen jakauman ulkopuolella (esim. Poissonin jakaumaan perustuvat 95 %:n kontrollirajat). Lähdekirjallisuudessa on suosituksia sopiville tilastomenetelmille (13). Kun tehdään annos–vaste-analyysi, on analysoitava ainakin kolmea altistettua annosryhmää. Tilastollisissa testeissä kokeellisena yksikkönä on käytettävä eläintä. Kromosomipoikkeavuustestissä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että testikemikaali aiheuttaa rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia testatun lajin luuytimessä.

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi negatiivinen, jos kaikissa tutkituissa koeolosuhteissa:

Lähdekirjallisuudessa on suosituksia soveltuvimmista tilastollisista menetelmistä (13). Näyttöön luuytimen altistumisesta testikemikaalille voi sisältyä mitoosi-indeksin alentuminen tai testikemikaalien plasman tai veritasojen mittaus. Laskimonsisäisen annostelun tapauksessa näyttöä altistumisesta ei tarvita. Vaihtoehtoisesti luuytimen altistumisen osoittamiseen voidaan käyttää samalla altistustavalla ja samalla eläinlajilla tehdyn riippumattoman tutkimuksen tietoja. Negatiiviset tulokset osoittavat, ettei tutkittava kemikaali aiheuta koeolosuhteissa rakenteellisia kromosomipoikkeavuuksia testatun lajin luuytimessä.

Selvästi positiivista tai negatiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa.

Jos vaste ei ole selvästi negatiivinen eikä selvästi positiivinen tai tuloksen biologisen merkityksellisyyden vahvistaminen kaipaa tukea (esim. heikko tai rajatapaukseksi luokiteltava lisäys), tietoja tulee arvioida asiantuntija-arvioinnissa ja/tai loppuun saatettuihin kokeisiin liittyvissä lisätutkimuksissa. Useampien solujen analysointi tai toistokokeen suorittaminen mahdollisesti käyttämällä mukautettuja koeolosuhteita voi olla joissakin tapauksissa hyödyllistä.

Harvoissa tapauksissa edes lisätutkimusten pohjalta ei voida päätellä, että testikemikaali tuottaa positiivisia tai negatiivisia tuloksia, ja sen vuoksi tutkimusta pidetään epäselvänä.

Polyploidisten ja/tai endoreduplikoituneiden solujen metafaasien esiintymistaajudet metafaasissa olevien solujen kokonaismäärässä on rekisteröitävä erikseen. Polyploidisten/endoreduplikoituneiden solujen määrän suureneminen saattaa osoittaa, että testikemikaaleilla pystytään estämään mitoottisia prosesseja tai solysyklin etenemistä (ks. 3 kohta).

Testiraportti

Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:

Yhteenveto

LÄHDEKIRJALLISUUS

5)

Korvataan B osassa oleva B.12 luku seuraavasti:

”B.12   Nisäkkäiden erytrosyyttimikrotumatesti

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta 474 (2016). Se on osa geneettisen toksikologian testimenetelmiä. On laadittu OECD:n asiakirja, jossa ytimekkäitä tietoja geneettistä toksikologiaa koskevista testeistä sekä katsaus näihin testimenetelmiin tehtyihin viimeaikaisiin muutoksiin (1).

Nisäkkäillä in vivo -mikrotumatesti on erityisen relevantti genotoksisuuden arvioinnissa, koska vaikka lajien välillä voi olla vaihtelua, in vivo -metaboliaan, farmakokinetiikkaan ja DNA:n korjautumisprosesseihin liittyvät tekijät ovat aktiivisia ja voivat vaikuttaa vasteisiin. In vivo -analyysi on hyödyllinen myös in vitro -koejärjestelmässä havaitun genotoksisuuden jatkotutkimuksena.

Nisäkkäiden in vivo -mikrotumatestiä käytetään tutkittavan aineen aiheuttamien kromosomivaurioiden tai mitoosilaitteen vaurioiden toteamiseen erytroblasteissa. Testissä arvioidaan mikrotumien muodostumista erytroblasteissa analysoimalla eläinten, yleensä jyrsijöiden, luuytimen soluja tai perifeerisiä verisoluja.

Mikrotumatestin tarkoituksena on tunnistaa sellaisia sytogeneettisiä vaurioita aiheuttavat kemikaalit, jotka johtavat hitaasti liikkuvia (lagging) kromosomifragmentteja tai kokonaisia kromosomeja sisältävien mikrotumien muodostumiseen.

Kun luuytimen erytroblasti kehittyy punasolun esiasteeksi (johon viitataan joskus polykromaattisena punasoluna tai retikulosyyttinä), päätuma irtoaa solusta, ja mahdollinen muodostunut mikrotuma saattaa jäädä muutoin tumattomaan solulimaan. Päätuman puuttuminen helpottaa mikrotumien havaitsemista näissä soluissa. Mikrotumaisten punasolujen esiasteiden suurentunut esiintymistaajuus altistetuilla eläimillä osoittaa tutkittavan aineen aiheuttaman rakenteellisen tai numeerisen kromosomipoikkeavuuden.

Vasta muodostuneet punasolut tunnistetaan ja kvantifioidaan värjäämällä, mitä seuraa joko visuaalinen pisteytys mikroskooppia käyttäen, tai automaattinen analyysi. Täysikasvuisten eläinten perifeerisessä veressä tai luuytimessä olevien punasolujen esiasteiden riittävän määrän laskentaa helpottaa automaattinen laskentajärjestelmä. Tällaiset järjestelmät ovat hyväksyttäviä vaihtoehtoja manuaaliselle arvioinnille (2). Vertailevat tutkimukset ovat osoittaneet, että tällaisilla menettelyillä, asianmukaisia kalibrointistandardeja käyttämällä, voidaan tarjota parempi toistettavuus ja herkkyys samassa laboratoriossa ja eri laboratorioissa manuaaliseen mikroskooppipisteytykseen verrattuna (3) (4). Automaattiset järjestelmät, joilla voidaan mitata mikrotumaisten punasolujen taajuudet ovat (mutta eivät pelkästään) virtaussytometrit (5), kuva-analyysijärjestelmät (6) (7), ja laserskannaukseen perustuvat sytometrit (8).

Kromosomifragmentit voidaan erottaa kokonaisista kromosomeista useiden perusteiden perusteella, vaikka tätä ei normaalisti tehdä osana testiä. Näitä ovat kinetokorin tai sentromeerisen DNA:n (jotka ovat tyypillisiä ehjille kromosomeille) esiintymisen tai puuttumisen osoittaminen. Kinetokorin tai sentromeerisen DNA:n puuttuminen osoittaa, että mikrotuma sisältää ainoastaan kromosomifragmentteja, ja sen olemassaolo osoittaa kromosomin häviämisen.

Käytettyjen termien määritelmät on esitetty lisäyksessä 1.

ALUSTAVAT HUOMIOT

Nuorten täysikasvuisten jyrsijöiden luuydin on kohdekudos geneettisille vaurioille tässä testissä, koska tässä kudoksessa muodostuvat punasolut. Punasolujen esiasteiden mikrotumien mittaus perifeerisessä veressä on hyväksyttävää muissa nisäkäslajeissa, joiden osalta on osoitettu, että ne ovat riittävän herkkiä havaitsemaan kemikaalit, jotka aiheuttavat rakenteellisia tai numeerisia kromosomipoikkeavuuksia näissä soluissa (indusoimalla mikrotumia punasolujen esiasteissa), ja joiden tapauksessa annetaan tieteelliset perusteet. Mikrotumaisten epäkypsien punasolujen esiintymistaajuus on pääasiallinen päätepiste. Sellaisten kypsien punasolujen taajuus, jotka sisältävät mikrotumia perifeerisessä veressä, voidaan myös käyttää päätepisteenä lajeissa, joilla ei ole vahvaa pernassa tapahtuvaa valintaa mikrotumaisilla soluilla, ja kun eläimet altistetaan yhtäjaksoisesti käytettyjen lajien punasolujen eliniän ylittävän ajan (esim. 4 viikkoa tai enemmän hiirillä).

Jos on saatu viitteitä siitä, etteivät testikemikaalit tai niiden metaboliitit pääse kohdekudokseen, tätä testiä ei pidä käyttää.

Ennen kuin testimenetelmää käytetään seoksen testaamiseen tietojen tuottamiseksi aiottuun sääntelytarkoitukseen, on harkittava, tarjoaako se asianmukaiset tulokset tämän tavoitteen kannalta, ja jos tarjoaa, miksi. Tällaista harkintaa ei tarvita, jos seoksen testaamista edellytetään sääntelyvaatimuksissa.

TESTIMENETELMÄN PERIAATE

Eläimet altistetaan testikemikaalille sopivaa antotapaa käyttäen. Jos käytetään luuydintä, eläimet lopetetaan inhimillisesti sopivan ajan kuluttua altistuksesta, luuytimestä otetaan näyte, ja preparaatit valmistetaan ja värjätään (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Käytettäessä perifeeristä verta verinäytteet otetaan sopivina ajankohtina altistuksen jälkeen, tehdään valmistelut ja värjätään (12) (16) (17) (18). Kun annos annetaan akuutisti, on tärkeää valita luuytimen tai veren näytteenotto aikoina, jolloin mikrotumaisten punasolujen esiasteiden käsittelyyn liittyvä induktio voidaan havaita. Kun kyse on perifeerisen veren näytteenotosta, näiden tapahtumien välillä on myös oltava kulunut tarpeeksi aikaa, jotta ne voidaan havaita kiertävässä veressä. Mikrotumien esiintyminen analysoidaan valmisteista joko havainnoimalla mikroskooppia, kuva-analyysijärjestelmää, virtaussytomeriä käyttäen tai laskerskannaukseen perustuvaa sytometria käyttäen.

LABORATORIOIDEN PÄTEVYYDEN VARMISTAMINEN

Pätevyyttä koskevat tutkimukset

Jotta laboratoriolla voidaan todeta olevan riittävä kokemus testistä ennen sen käyttöä rutiinitestauksessa, laboratorion on osoitettava, että se voi tuottaa odotettavissa olevat tulokset julkaistuista tiedoista (17) (19) (20) (21) (22) mikrotumien taajuuden mittaamiseen vähintään kahdella positiivisella kontrollikemikaalilla (mukaan lukien heikot vasteet, joita indusoivat pienet määrät positiivista kontrollikemikaalia), kuten ne, jotka luetellaan taulukossa 1 ja yhdessä yhteensopivien kantaja-aine-/liuotinkontrollien kanssa (ks. 26 kappale). Näissä kokeissa pitää käyttää annoksia, joista aiheutuu toistettavissa olevia ja annokseen liittyviä lisääntymisiä, ja niiden on osoitettava testausjärjestelmän herkkyys ja dynaaminen vaihteluväli kohdekudoksessa (luuydin tai perifeerinen veri) ja käyttää laskentamenetelmää, jota voidaan soveltaa laboratoriossa. Tätä vaatimusta ei sovelleta laboratorioihin, joilla on kokemusta, eli joilla on 14–18 kohdassa määritelty laboratoriokohtainen tietokanta.

Aiemmat kontrollitiedot

Pätevyyttä koskevissa tutkimuksissa laboratorion on määriteltävä:

Hankittaessa ensin tietoja aiempien negatiivisten kontrollien jakaumaa varten, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien on oltava yhdenmukaisia julkaistujen kontrollitietojen kanssa, jos sellaisia on olemassa. Kun aikaisempien kontrollien jakaumaan lisätään enemmän kokeellisia tietoja, rinnakkaisten negatiivisten kontrollien olisi mieluiten sijoituttava kyseisen jakauman 95 %:n kontrollirajojen sisälle. Laboratorion aikaisempia negatiivisia kontrolleja koskevan tietokannan pitäisi olla tilastollisesti vankka, jotta varmistetaan laboratorion kyky arvioida negatiivisten kontrollitietojensa jakaumaa. Lähdekirjallisuuden mukaan voidaan tarvita vähintään 10 koetta, mutta mieluiten olisi tehtävä ainakin 20 koetta vastaavanlaisissa koeolosuhteissa. Laboratorioiden on käytettävä laadunvalvontamenetelmiä, kuten valvontakortteja (esim. C-kortteja tai X-bar-kortteja (23)), kontrollitietojensa vaihtelevuuden määrittämiseksi ja osoittaakseen, että laboratorio ”hallitsee” menetelmän. Lisäsuosituksia aikaisempien tietojen muodostamisesta ja käytöstä (esimerkiksi perusteet tietojen sisällyttämiseksi aikaisempiin tietoihin tai jättämiseksi pois niistä sekä kokeiden hyväksyttävyysperusteet) annetaan lähdekirjallisuudessa (24).

Jos laboratorio ei suorita loppuun riittävää määrää kokeita tilastollisesti vankan negatiivisen kontrollin jakauman osoittamiseksi (ks. 15 kohta) pätevyyttä koskevissa tutkimuksissa (kuvataan 13 kohdassa), on hyväksyttävää, että jakauma voidaan luoda ensimmäisten rutiinitutkimuksien aikana. Tässä lähestymistavassa pitäisi noudattaa lähdekirjallisuudessa (24) esitettyjä suosituksia ja negatiivisen kontrollin tuloksia, ja näissä kokeissa saatujen negatiivisten kontrollien tulosten on oltava julkaistujen negatiivisten kontrollien tuloksien mukaisia.

Mahdollisissa koejärjestelyn muutoksissa on otettava huomioon, miten ne vaikuttavat tuloksena olevien tietojen yhdenmukaisuuteen laboratorion olemassa olevan aiempia kontrolleja koskevan tietokannan kanssa. Vain merkittävien epäjohdonmukaisuuksien perusteella on luotava uusi aiempien kontrollien tietokanta, jos asiantuntija-arviossa määritetään, että se eroaa edellisestä jakaumasta (ks. 15 kohta). Sen uudelleenluonnin aikana täysimittaista negatiivisten kontrollien tietokantaa ei ehkä tarvita varsinaisen testin suorittamiseen, jos laboratorio voi osoittaa, että sen rinnakkaisen negatiivisen kontrollin arvot ovat yhdenmukaisia aiemman tietokannan tai vastaavien julkistettujen tietojen kanssa.

Negatiivisen kontrollin tietojen tulisi koostua kunkin eläimen mikrotumaisten epäkypsien punasolujen esiintyvyydestä. Samanaikaisten negatiivisten kontrollien olisi mieluiten sijoituttava laboratorion aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokannan 95 %:n kontrollirajojen sisälle. Jos rinnakkaisia negatiivisia kontrolleja koskevat tiedot jäävät 95 %:n kontrollirajojen ulkopuolelle, ne voidaan hyväksyä aikaisemman kontrollien jakaumaan edellyttäen, etteivät ne ole äärimmäisiä harha-arvoja ja että on näyttöä siitä, että testijärjestelmä on ”hallinnassa” (ks. 15 kohta), ja ettei ole kyse teknisestä tai inhimillisestä virheestä.

MENETELMÄN KUVAUS

Valmisteet

Eläinlajin valinta

Koe-eläinten on oltava yleisesti käytettyä laboratoriokantaa olevia nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä. Hiiriä, rottia tai muita soveltuvia nisäkäslajeja voidaan käyttää. Kun käytetään perifeeristä verta, on osoitettava, että mikrotumaisten solujen poistuminen verenkierrosta pernassa ei vaaranna aiheutettujen mikrotumien havaitsemista valitussa lajissa. Tämä on selkeästi osoitettu hiiren ja rotan perifeerisessä veressä (2). Raportissa on esitettävä tieteelliset perustelut muiden lajien kuin rottien ja hiirten käytöstä. Jos käytetään muita lajeja kuin jyrsijöitä, on suositeltavaa, että indusoitujen mikrotumien mittaus sisällytetään toiseen sopivaan toksisuustestiin.

Koe-eläintilat ja eläinten ruokinta

Jyrsijöiden tapauksessa koe-eläinhuoneen lämpötilan tulee olla 22 °C (± 3 °C). Vaikka suhteellisen kosteuden olisi mieluiten oltava 50–60 prosenttia, sen olisi oltava ainakin 40 prosenttia eikä mielellään yli 70 prosenttia muulloin kuin tilan puhdistuksen aikana. Tilassa tulee käyttää keinovalaistusta 12 tunnin jaksoissa (12 tuntia valoa / 12 tuntia pimeää). Eläinten ruokinnassa voidaan käyttää normaalia laboratorioruokavaliota, eikä juomaveden määrää saa rajoittaa. Ravinnon valintaan voi vaikuttaa tarve varmistaa sopiva sekoitus testikemikaalia, kun sitä annetaan tätä reittiä. Jyrsijät on sijoitettava samaa sukupuolta ja käsittelyryhmää edustaviin pienryhmiin (enintään viisi häkkiä kohti), jos mitään aggressiivista käytöstä ei odoteta, mieluiten kiinteisiin lattiahäkkeihin, joissa on asianmukainen virikkeellinen ympäristö. Eläimet voivat olla häkissä yksittäin ainoastaan, jos tämä on tieteellisesti perusteltua.

Eläinten valmistelu

Yleensä käytetään nuoria terveitä täysikasvuisia eläimiä (jyrsijät ovat mieluiten 6–10 viikon ikäisiä käsittelyn alussa, joskin hieman vanhemmat eläimet hyväksytään) ja ne jaetaan satunnaistetusti testi- ja kontrolliryhmiin. Eläimet tunnistetaan yksilöllisesti inhimillisellä minimaalisen invasiivisella toimenpiteellä (esim. rengastamalla, merkitsemällä, mikrosirulla tai biometrisellä tunnuksella, mutta ei korvia tai varpaita leikkaamalla) ja sopeuttamalla laboratorio-olosuhteisiin vähintään viiden päivän ajan. Häkit on sijoitettava siten, että häkin sijainnista johtuvat vaikutukset ovat mahdollisimman vähäisiä. Ristikontaminaatiota positiivisella kontrollilla ja testikemikaalilla tulisi välttää. Tutkimuksen alkaessa eläinten painonvaihtelun on oltava vähäistä, ja se saa vaihdella korkeintaan ± 20 % kunkin sukupuolen tavanomaisesta keskiarvosta.

Annosten valmistelu

Kiinteät testikemikaalit liuotetaan tai sekoitetaan asianmukaisiin liuottimiin tai kantaja-aineisiin taikka lisätään ravintoon tai juomaveteen, ennen kuin ne annetaan koe-eläimille. Nestemäiset testikemikaalit voidaan antaa suoraan tai laimentaa ennen antamista. Testikemikaaleja voidaan antaa hengitystien kautta tapahtuvan altistamisen osalta kaasuna, höyrynä tai kiinteänä/nestemäisenä aerosolina niiden fysikokemiallisista ominaisuuksista riippuen. Testikemikaali on valmisteltava juuri ennen annostelua, paitsi jos sen säilyvyys on osoitettu stabiliteettitesteillä ja asianmukaiset säilytysolosuhteet on määritetty.

Testiolosuhteet

Liuotin/kantaja-aine

Liuottimella/kantaja-aineella ei saa olla myrkkyvaikutuksia käytetyillä annostasoilla, eikä sen käyttö saa aiheuttaa mahdollisia kemiallisia reaktioita testikemikaalien kanssa. Jos käytetään muita kuin hyvin tunnettuja liuottimia/kantaja-aineita, niiden käyttö on perusteltava yhteensopivuuden osoittavilla tutkimustuloksilla. Vesipitoisen liuottimen/kantaja-aineen käyttöä on harkittava ensisijaisesti aina, kun se on mahdollista. Esimerkkejä yleisesti käytetyistä yhteensopivista liuottimista/kantaja-aineista ovat vesi, fysiologinen suolaliuos, metyyliselluloosaliuos, natriumkarboksimetyyliselluloosan suolaliuos, oliiviöljy ja maissiöljy. Jos ei ole aikaisempia tai julkaistuja kontrollitietoja siitä, ettei valittu epätyypillinen liuotin/kantaja-aine aiheuta mitään mikrotumia tai muita haitallisia vaikutuksia, on tehtävä alustava tutkimus, jolla voidaan määrittää liuotin-/kantajakontrollin hyväksyttävyys.

Kontrollit

Positiiviset kontrollit

Kuhunkin testiin pitäisi normaalisti sisällyttää ryhmä eläimiä, joita käsitellään positiivisella kontrollikemikaalilla. Tästä voidaan poiketa, jos testilaboratorio on osoittanut olevansa pätevä tekemään testin ja se on vahvistanut aikaisemman positiivisen kontrollin vaihteluvälin. Kun rinnakkaista positiivisen kontrollin ryhmää ei ole, kuhunkin kokeeseen on sisällytettävä pisteytyskontrollit (kiinteät ja värjätyt objektilasit tai solususpensionäytteet, pisteytysmenetelmän mukaisesti). Nämä voidaan saada sisällyttämällä tutkimuksen pisteytykseen asianmukaiset vertailunäytteet, jotka on saatu ja joita säilytetään erillisestä määräajoin (esim. 6–18 kuukauden välein) tehtävästä positiivisen kontrollin kokeesta; esimerkiksi pätevyyden testaamisen aikana ja säännöllisesti tämän jälkeen, jos tätä tarvitaan.

Positiivisten kontrollikemikaalien pitäisi luotettavasti tuottaa havaittavaa lisääntymistä mikrotumien esiintymistaajuudessa spontaanitasoa enemmän. Kun käytetään manuaalista pisteytystä mikroskoopilla, positiivisten kontrolliaineiden annokset on valittava siten, että vaikutukset ovat selvät mutta eivät paljasta heti laskijoille koodattujen näytteiden identiteettiä. On hyväksyttävää, että positiivinen kontrolliaine annetaan eri reittiä kuin testikemikaali käyttäen eri käsittelyaikataulua, ja näytteet voidaan ottaa vain kerran. Lisäksi positiivisina kontrolleina tulisi käyttää tarvittaessa samaan kemiallisten aineiden ryhmään kuuluvia aineita. Taulukkoon 1 sisältyy esimerkkejä positiivisista kontrollikemikaaleista.

Taulukko 1

Esimerkkejä positiivisista kontrollikemikaaleista:

Kemikaalit ja CAS-rekisterinumero

Etyylimetaanisulfonaatti [CAS-numero 62-50-0]

Metyylimetaanisulfonaatti [CAS-numero 66-27-3]

Etyylinitrosourea [CAS-numero 759-73-9]

Mitomysiini C [CAS-numero 50-07-7]

Syklofosfamidi (monohydraatti) [CAS-numero 50-18-0 (CAS-numero 6055-19-2)]

Trietyleenimelamiini [CAS-numero 51-18-3]

Kolkisiini [CAS-numero 64-86-8] tai vinblastiini [CAS-numero 865-21-4] – aneugeeneinä

Negatiiviset kontrollit

Negatiivisen kontrolliryhmän eläimet on sisällytettävä jokaiseen näytteenottokertaan ja niitä tulisi käsitellä aivan samalla tavalla kuin tutkimusryhmiä, paitsi ettei niitä altisteta testikemikaalille. Jos testikemikaalin annostelussa käytetään liuotinta/kantaja-ainetta, kontrolliryhmän pitää saada tätä liuotinta/kantaja-ainetta. Kuitenkin, jos aikaisemmista negatiivisen kontrollin tiedoista kullakin näytteenottokerralla testilaboratoriossa käy ilmi johdonmukaisia eläinten välisiä eroja ja mikrotumia sisältävien solujen esiintymistaajuutta, negatiivista kontrollia varten voidaan tarvita vain yksi näytteenotto. Kun negatiiviseen kontrolliin käytetään yhtä näytteenottoa, kyse pitäisi olla tutkimuksessa käytetystä ensimmäisestä näytteenottokerrasta.

Jos käytetään perifeeristä verta, käsittelyä edeltävä näyte on hyväksyttävä rinnakkaisen negatiivisen kontrollin sijaan lyhyen aikavälin tutkimuksissa, mikäli saadut tulokset ovat testauslaboratorion aikaisempien kontrollien tietokannan mukaisia. Rotilla on osoitettu, että pienten määrien käsittelyä edeltävällä näytteenotolla (esim. alle 100 μl/päivä) on minimaalinen vaikutus mikrotuman taustataajuuteen (25).

MENETTELY

Eläinten lukumäärä ja sukupuoli

Mikrotuman vaste on yleensä samanlainen uros- ja naaraspuolisilla eläimillä ja tästä syystä useimmat tutkimukset voidaan suorittaa jompaakumpaa sukupuolta käyttäen (26). Tiedot, jotka osoittavat merkittäviä urosten ja naaraiden välisiä eroja (esim. systeemisen toksisuuden, aineenvaihdunnan, biologisen saatavuuden, luuytimeen liittyvän toksisuuden erot, mukaan lukien esimerkiksi raja-annostutkimus) voisivat kannustaa käyttämään molempia sukupuolia. Tällaisessa tapauksessa voi olla tarkoituksenmukaista tehdä tutkimus molemmilla sukupuolilla esim. osana toistuvan annostelun toksisuustutkimusta. Molempia sukupuolia käytettäessä saattaa olla tarkoituksenmukaista tehdä yhdistelykoe.. Tarkempia tietoja siitä, miten tietoja yhdistelykokeessa analysoidaan, annetaan lisäyksessä 2.

Ryhmäkoot varmistetaan tutkimuksen alussa, jotta tarjotaan vähintään viisi tutkimukseen soveltuvaa yhtä sukupuolta edustavaa eläintä, tai kustakin sukupuolesta (jos kumpiakin käytetään) ryhmää kohti. Jos ihmisen altistuminen tutkittavalle kemikaalille voi olla sukupuolesta riippuvaa, kuten joidenkin lääkeaineiden kohdalla, testi on tehtävä asianomaista sukupuolta olevilla eläimillä. Ohjeelliseksi maksimimääräksi eläimiä koskevien vaatimusten osalta annetaan, että luuydintutkimus tehdään 37 kohdassa vahvistettujen parametrien mukaan kolmella annosryhmällä ja rinnakkaisella negatiivisella ja positiivisella kontrolliryhmällä (kuhunkin ryhmään kuuluu viisi samaa sukupuolta olevaa eläintä), eli tarvitaan 25–35 eläintä.

Annostasot

Jos tehdään alustava annoksenmääritystutkimus, koska soveltuvia tietoja ei ole vielä käytettävissä annoksen valinnan opastukseen, se on tehtävä samassa laboratoriossa käyttäen samaa lajia, samaa kantaa, samaa sukupuolta olevia eläimiä ja samaa altistusohjelmaa kuin päätutkimuksessa on tarkoitus käyttää (27). Tutkimuksessa on pyrittävä tunnistamaan suurin siedetty annos, joka määritellään korkeimmaksi annokseksi, jota siedetään ilman näyttöä tutkimusta rajoittavasta toksisuudesta suhteessa tutkimuksen kestoon (esim. se aiheuttaa ruumiinpainon laskua tai vertavuotavan kudoksen sytotoksisuutta, mutta joka ei aiheuta kuolemaa eikä kipua, tuskaa tai kärsimystä, jonka vuoksi eläin on lopetettava inhimillisesti (28)).

Suurin annos voidaan määritellä myös annokseksi, joka aiheuttaa toksisuutta luuytimessä (esim. punasolujen esiasteiden osuuden pieneneminen punasolujen kokonaismäärästä luuytimessä tai perifeerisessä veressä yli 50 prosenttia, mutta vähintään 20 prosenttia vertailuarvosta). Kuitenkin, kun CD71-positiivisia soluja analysoidaan ääreisverenkierrossa (esim. virtaussytometrillä), tämä erittäin varhainen punasolujen esiasteiden fraktio vastaa toksisuuteen nopeammin kuin punasolujen esiasteiden suurempi RNA-positiivinen kohortti. Tästä syystä suurempi näennäinen toksisuus voi olla ilmeinen akuutin altistumisen malleissa, joissa tutkitaan CD71-positiivista punasolun esiasteen fraktiota verrattuna niihin, joissa punasolujen esiasteisiin liittyvä tunnistus perustuu RNA-sisältöön. Tästä syystä, kun kokeissa käytetään enintään viisi altistuspäivää, toksisuutta aiheuttavien testikemikaalien korkeimmaksi annostasoksi voidaan määritellä annos, joka aiheuttaa CD71-positiivisten punasolujen esiasteiden osuuden tilastollisesti merkittävän vähenemisen punasolujen kokonaismäärässä, mutta ei vähemmän kuin viisi prosenttia kontrollin arvosta (29).

Kemikaalit, jotka osoittavat toksikokineettisten ominaisuuksien saturaation tai aiheuttavat detoksikaatioprosesseja, jotka voivat johtaa altistuksen vähenemiseen pitkäaikaisen annostelun jälkeen, voivat muodostaa poikkeuksen annoksenmäärityskriteereihin, ja niitä on arvioitava tapauskohtaisesti.

Jotta saadaan annosvastetiedot, täydelliseen tutkimukseen on sisällyttävä negatiivisen kontrollin ryhmä ja vähintään kolme annostelutasoa, jotka yleensä erotetaan kertoimella 2, mutta enintään kertoimella 4. Jos testikemikaali ei aiheuta toksisuusvaikutusta annoksenmääritystutkimuksessa tai olemassa olevien tietojen perusteella, suurimman annoksen vähintään 14 päivän annostelun aikana pitäisi olla 1 000 mg/painokilo/päivä tai alle 14 päivän annostelun aikana 2 000 mg/painokilo/päivä. Jos testikemikaali aiheuttaa toksisuusvaikutuksen, suurimman siedetyn annoksen pitäisi olla korkein annettava annos, ja käytettävien annostasojen olisi mieluiten katettava vaihteluväli maksimista annokseen, jonka toksisuusvaikutus on vähäinen tai jolla ei ole toksisuusvaikutusta. Kun kohdekudoksen (luuytimen) toksisuusvaikutus havaitaan kaikilla testatuilla annostasoilla, on suositeltavaa tehdä täydentävä tutkimus ei-toksisilla annoksilla. Tutkimukset, joiden tarkoituksena on kuvata täydellisesti määrällisiä annos-vastetietoja, voivat vaatia täydentäviä annosryhmiä. Nämä rajat voivat vaihdella tietyntyyppisten testikemikaalien osalta (esim. ihmisten lääkkeet), jotka kuuluvat erityisvaatimusten piiriin.

Raja-annostesti

Jos pitoisuusalueenmäärittelykokeet tai olemassa olevat tiedot vastaavista eläinkannoista osoittavat, että vähintään raja-annokseen (kuvattu jäljempänä) perustuva altistusohjelma ei tuota havaittavia toksisuusvaikutuksia (ei esim. luuytimeen liittyvän proliferaation vähentymistä tai muita todisteita kohdekudoksen sytotoksisuudesta), ja jos genotoksisuuden ei oleteta perustuvan in vitro -genotoksisuustutkimuksiin tai tietoihin rakenteellisesti samankaltaisista kemikaaleista, täydellistä tutkimusta kolmella annostasolla ei ehkä pidetä tarpeellisena, mikäli on osoitettu, että testikemikaalit saavuttavat kohdekudoksen (luuytimen). Tällaisissa tapauksissa yksi annostaso raja-annoksena saattaa riittää. Kun annostelu kestää vähintään 14 päivää, annos on 1 000 mg/painokiloa/päivä. Kun annostelu kestää alle 14 päivää, annos on 2 000 mg/painokiloa/päivä.

Antotapa

Testin suunnittelussa on otettava huomioon oletettu ihmisen altistusreitti. Siksi perustelluksi altistusreitiksi voidaan valita esim. ravinto tai juomavesi, ihonalainen, suonensisäinen, oraalinen (letkuruokinnalla), altistus hengitysteitse, henkitorven tai implantaation kautta kulkeva reitti. Joka tapauksessa reitti on valittava, jotta varmistetaan kohdekudosten riittävä altistus. Intraperitoneaalista injektiota ei yleensä suositella, koska se ei ole tarkoitettu ihmisen altistumisreitiksi, ja sitä tulisi käyttää vain erityisten tieteellisien perusteiden nojalla. Jos testikemikaali sekoitetaan ravintoon tai juomaveteen, varsinkin jos kyse on yhdestä annoksesta, on huolehdittava siitä, että viive ravinnon ja veden kulutuksen ja näytteenoton välillä on riittävä, jotta vaikutukset voidaan havaita (ks. 37 kohta). Suurin letkuruokinnan tai injektion avulla kerralla annettava nestemäärä määräytyy koe-eläimen koon mukaan. Määrä ei saa normaalisti ylittää 1 ml/100 g painoa. Poikkeuksen muodostavat vesiliuokset, joita käytettäessä enimmäistilavuus voi olla 2 ml/100 g painoa. Tätä suurempien määrien käyttö on perusteltava. Lukuun ottamatta ärsyttäviä tai syövyttäviä testikemikaaleja, joiden vaikutukset yleensä pahenevat korkeammilla pitoisuuksilla, testikemikaalimäärän vaihtelu on minimoitava säätämällä pitoisuutta, jotta annostelun vakiotilavuus suhteessa ruumiinpainoon taataan kaikilla annostasoilla.

Altistusohjelma

Mieluiten tehdään ainakin kaksi käsittelyä, jolloin annos annetaan 24 tunnin välein erityisesti, kun tämä testi sisällytetään muihin toksisuustutkimuksiin. Vaihtoehtoisesti voidaan antaa yksittäisiä annoksia, jos tämä on tieteellisesti perusteltua (esim. testikemikaalien tiedetään estävän solusyklin). Testikemikaalit voidaan antaa myös eri annoksina, eli kaksi tai useampaa altistuskertaa samana päivänä korkeintaan 2–3 tunnin välein, mikä helpottaa suurten määrien antamista. Näissä olosuhteissa, tai testikemikaalia hengitysteitse annettaessa, näytteenottoaika tulee ajoittaa edellisen annostuksen tai altistuksen päättymisajan perusteella.

Testi voidaan tehdä hiirillä tai rotilla kolmella eri tavalla:

Muita annostelu- tai näytteenotto-ohjelmia voidaan käyttää tarvittaessa ja tieteellisten perustelujen nojalla ja kun helpotetaan tietojen sisällyttämistä muihin toksisuustutkimuksiin.

Havainnot

Koe-eläimiä koskevia yleisiä kliinisiä havaintoja tulee tehdä ja kliinisiä oireita kirjata ainakin kerran päivässä, mieluiten samaan aikaan joka päivä ottaen huomioon se, milloin annoksen antamisen jälkeen odotetut vaikutukset ovat suurimmillaan. Kaikkien eläinten sairastuvuutta ja kuolleisuutta on havainnoitava ainakin kahdesti vuorokaudessa annostelun aikana. Eläimet on punnittava tutkimuksen alussa ja vähintään kerran viikossa toistuvan annoksen tutkimuksissa ja lopetettaessa. Vähintään viikon kestävissä tutkimuksissa ravinnonkulutuksen mittaus on tehtävä vähintään viikoittain. Mikäli testikemikaalia annostellaan juomaveteen, veden kulutusta on mitattava, kun vesi vaihdetaan tai ainakin kerran viikossa. Eläimet, joilla ilmenee ei-letaaleja merkkejä liiallisesta myrkytysvaikutuksesta, on lopetettava inhimillisesti ennen tutkimusajan päättymistä (28). Tietyissä olosuhteissa eläimen kehon lämpötilaa voidaan tarkkailla, koska käsittelyn aiheuttama hyper- ja hypotermia ovat tuottaneet vääriä tuloksia (32) (33) (34).

Kohdekudoksen altistaminen

Verinäyte on otettava sopivana ajankohtana, jotta voidaan tutkia testikemikaalien plasmatasot luuytimen altistumisen osoittamiseksi, jos tämä on perusteltua ja jos muita altistustietoja ei ole (ks. 48 kohta).

Luuydin-/veripreparaatit

Luuydinsolut otetaan yleensä eläinten reisiluista tai sääriluista heti koe-eläinten inhimillisen lopettamisen jälkeen. Solut poistetaan, niistä tehdään preparaatit ja ne värjätään vakiintuneilla värjäysmenetelmillä. Pieniä määriä perifeerista verta voidaan ottaa asiaankuuluvien eläinten hyvinvointia koskevien vaatimusten perusteella joko käyttämällä menetelmää, joka sallii koe-eläimen selviytymisen, kuten veri häntälaskimosta tai muusta sopivasta verisuonesta, tai sydänpunktio taikka näytteenotto suurikokoisesta suonesta lopettamisen yhteydessä. Kun kyse on luuytimestä tai perifeerisestä verestä peräisin olevista punasoluista, solut voidaan analyysimenetelmästä riippuen värjätä välittömästi supravitaaliväreillä (16) (17) (18) tai niistä tehdään ensin sivelyvalmisteet ja ne värjätään sen jälkeen mikroskooppitutkimukseen tai ne fiksoidaan ja värjätään asianmukaisesti virtaussytometrista tutkimusta varten. DNA-spesifisen väriaineen (esimerkiksi akridiinioranssin (35) tai Hoechst 33258:n plus pyroniini-Y:n (36)) käytöllä voidaan eliminoida joitakin ei-DNA-spesifisen väriaineen käyttöön liittyviä artefakteja. Tämä etu ei sulje pois tavanomaisten väriaineiden (esim. Giemsa mikroskooppitutkimuksessa) käyttöä. Myös muita järjestelmiä [esim. selluloosapylväitä tumallisten solujen poistamiseksi (37) (38)] voidaan käyttää, mikäli nämä menetelmät on laboratoriossa osoitettu yhteensopivaksi näytteen valmistuksen kanssa.

Jos nämä menetelmät ovat sovellettavissa, antikinetokorivasta-aineita (39), fluoresenssi- in situ -hybridisaatiota pansentromeerisillä DNA-koettimilla (40), tai suoraa in situ -merkintää, johon liittyy pansentromeerispesifisiä alukkeita yhdessä sopivan DNA:n vastavärjäyksen (41) kanssa, voidaan käyttää tunnistamaan mikrotumien (kromosomin/kromosomifragmentin) luonne, jotta voidaan määrittää, johtuuko mikrotuman indusoitumismekanismi klastogeenisesta ja/tai aneugeenisesta vaikutuksesta. Muita klastogeenien ja aneugeenien erottelumenetelmiä voidaan käyttää, jos menetelmät on osoitettu tehokkaiksi.

Analyysi (manuaalinen ja automaattinen)

Kaikki objektilasit tai näytteet, myös ne, joilla on positiiviset ja negatiiviset kontrollit, on koodattava toisistaan riippumattomasti ennen minkäänlaista tutkimusta ja jaettava satunnaisotannalla siten, että laskija ei tiedä altistusolosuhteista; tällainen koodaus ei ole tarpeen käytettäessä automaattisia pisteytysjärjestelmiä, jotka eivät ole riippuvaisia silmämääräisestä tarkastuksesta ja joihin eivät vaikuta toimijan ennakkokäsitykset. Punasolujen esiasteiden osuus koko punasolumäärästä (esiasteet + kypsät punasolut) määritetään jokaisen eläimen osalta erikseen laskemalla yhteensä vähintään 500 punasolua luuytimestä ja 2 000 punasolua perifeerisestä verestä (42). Mikrotumaisten punasolujen esiasteiden esiintymistaajuuden määrittämistä varten on laskettava vähintään 4 000 punasolun esiastetta eläintä kohti (43). Jos aikaisempien negatiivisten kontrollien tietokanta osoittaa, että mikrotumaisten punasolujen esiasteiden taustaesiintyvyys on <0,1 % testilaboratoriossa, on harkittava ylimääräisten solujen laskentaa. Näytteitä analysoitaessa punasolujen esiasteiden osuus testikemikaalia saaneiden eläinten punasolujen kokonaismäärästä pitäisi olla vähintään 20 prosenttia kantaja-aine-/liuotinkontrollin osuudesta, kun laskenta tehdään mikroskoopilla, ja vähintään noin 5 prosenttia kantaja-aine-/liuotinkontrollin osuudesta, kun, CD71+ -punasolujen esiasteita lasketaan sytometrisillä menetelmillä (ks. 31 kohta) (29). Esim. mikroskoopilla laskettavassa luuydinkokeessa, jos punasolujen esiasteen kontrolliosuus luuytimessä on 50 prosenttia, toksisuuden yläraja käsittää 10 prosenttia punasolujen esiasteita.

Koska rotan perna eristää ja tuhoaa mikrotumaisia punasoluja, on suositeltavaa rajoittaa mikrotumaisten punasolujen esiasteiden analyysi varhaisimpaan fraktioon. Siten pidetään yllä määritysmenetelmän korkeaa herkkyyttä rotan perifeerista verta analysoitaessa. Kun käytetään automaattisia analyysijärjestelmiä, punasolujen varhaisimmat esiasteet voidaan määrittää niiden korkean RNA-pitoisuuden tai niiden pinnalla olevan transferiinireseptoreiden (CD71+) korkean tason (31) perustella. Kuitenkin suora vertailu eri värjäysmenetelmien välillä on osoittanut, että tyydyttäviä tuloksia voidaan saada erilaisilla menetelmillä, myös perinteisellä akridiinioranssivärjäyksellä (3) (4).

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tulosten käsittely

Yksittäisiä eläimiä koskevat tiedot on esitettävä taulukossa. Punasolujen esiasteiden laskettu määrä, mikrotumaisten punasolujen esiasteiden lukumäärä ja punasolujen esiasteiden osuus koko punasolumäärästä on lueteltava kunkin analysoidun eläimen osalta erikseen. Kun hiiriä käsitellään jatkuvasti vähintään neljän viikon ajan, tiedot mikrotumaisten kypsien punasolujen määrästä ja osuudesta on myös annettava, jos tämä kerätään. Eläinten toksisuustiedot ja kliiniset oireet on myös raportoitava.

Hyväksyttävyysperusteet

Testin hyväksyttävyys määritetään seuraavilla kriteereillä:

Tulosten arviointi ja tulkinta

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi positiivinen, mikäli:

Jos vain suurinta annosta tutkitaan tietyllä näytteenottokerralla, testikemikaalia pidetään selvästi positiivisena, mikäli esiintyy tilastollisesti merkittävää kasvua rinnakkaiseen negatiiviseen kontrolliin verrattuna ja tulokset ovat aikaisempien negatiivisen kontrollin tietojen jakauman ulkopuolella (esim. Poissonin jakaumaan perustuvat 95 %:n kontrollirajat). Lähdekirjallisuudessa on suosituksia soveltuvimmista tilastollisista menetelmistä (44) (45) (46) (47). Kun tehdään annos–vaste-analyysi, on analysoitava ainakin kolmea altistettua annosryhmää. Tilastollisissa testeissä kokeellisena yksikkönä olisi käytettävä eläintä. Mikrotumatestissä saadut positiiviset tulokset osoittavat, että testikemikaali aiheuttaa mikrotumia, jotka ovat seurausta kromosomivauriosta tai mitoosilaitteen vauriosta testatun lajin erytroblasteissa. Tapauksessa, jossa testi tehtiin sentromeerien havaitsemiseen mikrotumissa, testikemikaali, joka tuottaa sentromeeria sisältäviä mikrotumia (sentromeerinen DNA tai kinetokori, joka indusoi koko kromosomin häviämisen) on osoitus siitä, että testikemikaali on aneugeeni.

Jos kaikki hyväksymisperusteet täyttyvät, testikemikaalin katsotaan olevan selvästi negatiivinen, jos kaikissa tutkituissa koeolosuhteissa:

Lähdekirjallisuudessa on suosituksia soveltuvimmista tilastollisista menetelmistä (44) (45) (46) (47). Näyttöön luuytimen altistumisesta testikemikaalille voi sisältyä punasolujen esiasteiden ja kypsien punasolujen suhteen alentuminen tai testikemikaalien plasman tai veritasojen mittaaminen. Laskimonsisäisen annostelun tapauksessa näyttöä altistumisesta ei tarvita. Vaihtoehtoisesti luuytimen altistumisen osoittamiseen voidaan käyttää samalla altistustavalla ja samalla eläinlajilla tehdyn riippumattoman tutkimuksen tietoja. Negatiiviset tulokset osoittavat, ettei tutkittava kemikaali aiheuta koeolosuhteissa mikrotumia testattujen lajien punasolujen esiasteissa.

Selvästi positiivista tai negatiivista vastetta ei tarvitse vahvistaa.

Tapauksissa, joissa vaste ei ole selvästi negatiivinen tai positiivinen tai tuloksen biologisen merkityksellisyyden vahvistaminen kaipaa tukea (esim. heikko tai rajatapaukseksi luokiteltava lisäys), tietoja tulee arvioida asiantuntija-arvioinnissa ja/tai loppuun saatettuihin kokeisiin liittyvissä lisätutkimuksissa. Joissakin tapauksissa useampien solujen analysointi tai toistokokeen suorittaminen mahdollisesti käyttämällä mukautettuja koeolosuhteita voi olla hyödyllistä.

Harvoissa tapauksissa edes lisätutkimusten pohjalta ei voida päätellä, että testikemikaali tuottaa positiivisia tai negatiivisia tuloksia, ja sen vuoksi tutkimusta pidetään epäselvänä.

Testiraportti

Testiraporttiin on sisällytettävä seuraavat tiedot:

LÄHDEKIRJALLISUUS

6)

Poistetaan B osassa oleva B.15 luku.

7)

Poistetaan B osassa oleva B.16 luku.

8)

Poistetaan B osassa oleva B.18 luku.

9)

Poistetaan B osassa oleva B.19 luku.

10)

Poistetaan B osassa oleva B.20 luku.

11)

Poistetaan B osassa oleva B.24 luku.

12)

Korvataan B osassa oleva B.47 luku seuraavasti:

”B.47   Naudan sarveiskalvon sameuden ja läpäisevyyden testimenetelmä, jolla voidaan määrittää i) vakavia silmävaurioita aiheuttavat kemikaalit ja ii) kemikaalit, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta

JOHDANTO

Tämä testimenetelmä vastaa OECD:n testiohjetta (TG) nro 437 (2013). Naudan sarveiskalvon sameuden ja läpäisevyyden testimenetelmä (BCOP) on arvioitu vaihtoehtoisten menetelmien validoinnin virastojenvälisen koordinointikomitean (ICCVAM, Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods) toimesta. Tutkimukseen ovat osallistuneet vaihtoehtoisten menetelmien eurooppalainen validointikeskus (ECVAM) ja Japanin vastaava keskus (JaCVAM) vuosina 2006 ja 2010 (1) (2). Ensimmäisellä kerralla arvioitiin BCOP-testimenetelmän käytettävyyttä vakavan silmävaurion aiheuttavien kemikaalien (aineiden ja seosten) tunnistamisessa (1). Toisella kerralla arvioitiin BCOP-testimenetelmän käytettävyyttä sellaisten kemikaalien (aineiden ja seosten) tunnistamisessa, joita ei luokitella silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta (2). BCOP-validointitietokanta sisälsi yhteensä 113 ainetta ja 100 seosta (2) (3). Arviointien ja niiden vertaisarvioiden perusteella katsottiin, että testimenetelmällä voidaan tunnistaa oikein sekä vakavia silmävaurioita aiheuttavat kemikaalit (aineet ja seokset) (luokka 1) että sellaiset, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavien silmävaurioiden osalta siten, kun se on määritetty Yhdistyneiden kansakuntien (YK) kemikaalien maailmanlaajuisesti yhdenmukaistetussa luokitus- ja merkintäjärjestelmässä (GHS-järjestelmässä) (4) ja aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta annetussa asetuksessa (EY) N:o 1272/2008 (CLP-asetuksessa) (7), ja menetelmä on siten vahvistettu tieteellisesti päteväksi molempiin tarkoituksiin. Vakava silmävaurio on silmän kudosvaurio tai vakava fyysinen näön rappeutuminen, joka syntyy, kun testiainetta on annosteltu silmän pinnalle, eikä se palaudu täysin 21 päivän kuluessa annostelusta. Vakavan silmävaurion aiheuttavat testikemikaalit on luokiteltu YK:n GHS-luokkaan 1. Kemikaalit, joita ei ole luokiteltu silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta, on määritelty kemikaaleiksi, joita ei voida luokitella YK:n GHS-järjestelmän luokan 1 tai 2 (2A tai 2B) kemikaaleiksi, joten niitä kutsutaan kemikaaleiksi, joilla ei ole YK:n GHS-luokitusta. Tähän testimenetelmään kuuluvat BCOP-testimenetelmän suositeltu käyttö ja rajoitukset, jotka perustuvat BCOP:n arviointeihin. OECD:n testiohjeiden alkuperäisen vuoden 2009 version ja vuoden 2013 päivitetyn version tärkeimmät, mutta eivät ainoat, erot ovat: BCOP-testimenetelmän käyttö sellaisten kemikaalien tunnistamisessa, jotka eivät vaadi YK:n GHS-järjestelmän luokitusta (2 ja 7 kohdat); tarkennukset BCOP-testimenetelmän soveltuvuuteen alkoholien, ketonien ja kiintoaineiden (6 ja 7 kohdat) sekä aineiden ja seosten (8 kohta) testaamisessa; tarkennukset pinta-aktiivisten aineiden ja pinta-aktiivisia aineita sisältävien seosten suositeltavaan testaustapaan (28 kohta); positiivisia kontrolleja koskevat päivitykset ja tarkennukset (39 ja 40 kohdat); BCOP-testimenetelmän päätösperusteiden päivitys (47 kohta); tutkimuksen hyväksymisperusteiden päivitys (48 kohta); testiraportin osien päivitys (49 kohta); lisäyksen 1 määritelmien päivitys; lisäykseen 2 lisätty maininta BCOP-testimenetelmän ennustamiskyvystä eri luokitusjärjestelmissä; lisäyksessä 3 olevan pätevyyden osoittamiseen tarkoitettujen kemikaalien luettelon päivitys sekä lisäyksen 4 päivitys BCOP-testissä käytetyn sarveiskalvotelineen (1 kohta) ja opasitometrin (2 ja 3 kohdat) osalta.

Nykyään on yleisesti hyväksyttyä, että Draizen in vivo -silmätestiä ei lähitulevaisuudessa voida korvata millään yksittäisellä in vitro -silmä-ärsytystestillä, kun halutaan ennakoida kaikki eri kemikaaliluokkien aiheuttamien aiheuttamat ärsytykset. Draizen silmätesti voidaan mahdollisesti kuitenkin korvata käyttämällä monen vaihtoehtoisen testimenetelmän (porrastettua) testausstrategiaa (5). Ylhäältä alaspäin suuntautuva lähestymistapa (5) on tarkoitettu käytettäväksi silloin, kun olemassa olevien tietojen perusteella voidaan olettaa, että kemikaalin ärsytyskyky on korkea. Alhaalta ylöspäin suuntautuva lähestymistapa (5) on taasen tarkoitettu käytettäväksi silloin, kun olemassa olevien tietojen perusteella voidaan olettaa, että kemikaali ei aiheuta niin suurta silmä-ärsytystä, että se olisi luokiteltava. BCOP-testimenetelmä on in vitro -testimenetelmä, jota voidaan käyttää tietyissä olosuhteissa ja tietyin rajoituksin kemikaalien silmävaarallisuuden luokitukseen ja merkintään. Vaikka BCOP-testimenetelmää ei pidetäkään yksinään luotettavana in vivo -kaninsilmätestin korvaavana testinä, sitä suositellaan Scott et al.:n ehdotuksen kaltaisen ylhäältä alaspäin suuntautuvan testausstrategian ensimmäiseksi vaiheeksi (5) käytettäväksi vakavan silmävaurion aiheuttavien kemikaalien eli YK:n GHS-luokkaan 1 luokiteltujen kemikaalien tunnistamisessa ilman lisätestejä (4). BCOP-testimenetelmää suositellaan myös sellaisten kemikaalien tunnistamiseen, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta sellaisena, kuin ne on määritetty YK:n GHS-järjestelmässä (ei YK:n GHS-luokitusta) (4) osana ylhäältä alaspäin suuntautuvan lähestymistavan kaltaista testausstrategiaa (5). Lopullisen luokituksen vahvistamiseksi kemikaali, jonka ei ennusteta aiheuttavan vakavaa silmävaurioita tai jota ei ole luokitettu BCOP-testimenetelmällä silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta, on kuitenkin testattava (in vitro ja/tai in vivo) lisätesteillä.

Tässä testimenetelmässä kuvataan menettelyt, joilla arvioidaan testikemikaalin mahdollinen vaarallisuus silmälle mittaamalla kykyä aiheuttaa sameutta ja läpäisevyyden lisääntymistä eristetyssä naudan sarveiskalvossa. Myrkylliset vaikutukset sarveiskalvoon mitataan seuraavilla menetelmillä: i) valo läpikulun (transmission) vähentyminen (sameus) ja ii) natriumfluoreseiini-väriaineen lisääntynyt siirtyminen silmään (läpäisevyys). Testikemikaalille altistuksen jälkeen tehtyjä sarveiskalvon sameus- ja läpäisevyysarviointeja tarkastellaan yhdessä siten, että voidaan johtaa in vitro -ärsyttävyysarvo (In vitro Irritancy Score, IVIS), jonka avulla luokitellaan testikemikaalin ärsyttävyystaso.

Määritelmät ovat lisäyksessä 1.

ALUSTAVAT NÄKÖKOHDAT JA RAJOITUKSET

Tämä testimenetelmä perustuu ICCVAMin ICE-testimenetelmäprotokollaan (6) (7), joka kehitettiin alun perin In vitro -tieteiden instituutin (IIVS) protokollasta ja INVITTOX-protokollasta 124 saatujen tietojen pohjalta (8). Viimeksi mainittua käytettiin Euroopan yhteisöjen rahoittamassa validointia edeltävässä tutkimuksessa vuosina 1997–1998. Molemmat protokollat perustuivat BCOP-testimenetelmään, jonka raportoivat ensimmäisenä Gautheron et al. (9)

BCOP-testimenetelmää voidaan YK:n GHS-järjestelmän mukaan vakavan silmävaurion aiheuttavaksi kemikaaliksi määritettyjen kemikaalien eli YK:n GHS-luokkaan 1 luokiteltujen kemikaalien tunnistamiseen (4). Tähän käyttötarkoitukseen käytettynä BCOP-testimenetelmän yleinen tarkkuus on 79 % (150/191), väärien positiivisten tulosten osuus 25 % (32/126) ja väärien negatiivisten tulosten osuus 14 % (9/65) verrattuna kanin silmällä tehdyllä in vivo -testimenetelmällä saatuihin tietoihin luokiteltuna YK:n GHS-luokitusjärjestelmän mukaisesti (3) (ks. lisäys 2, taulukko 1). Kun tiettyihin kemiallisiin luokkiin (kuten alkoholit, ketonit) tai fysikaalisiin luokkiin (kuten kiintoaineet) kuuluvat testikemikaalit poistetaan tietokannasta, BCOP-testimenetelmän yleinen tarkkuus on 85 % (111/131), väärien positiivisten tulosten osuus 20 % (16/81) ja väärien negatiivisten tulosten osuus 8 % (4/50) luokiteltuna YK:n GHS-luokitusjärjestelmän mukaisesti (3). BCOP-testimenetelmän mahdolliset puutteet vakavan silmävaurion aiheuttavien kemikaalien tunnistamisessa (YK:n GHS-luokka 1) johtuvat validointitietokannassa havaittujen alkoholien ja ketonien korkeasta väärien positiivisten tulosten määrästä ja kiintoaineiden korkean väärien negatiivisten tulosten määrästä (1) (2) (3). Koska kaikkia alkoholeja ja ketoneja ei kuitenkaan yliennusteta BCOP-testimenetelmässä, ja jotkin tunnistetaan oikein YK:n GHS-luokkaan 1 kuuluviksi, näiden orgaanisten funktionaalisten ryhmien ei katsota olevan testimenetelmän soveltamisalan ulkopuolella. Testimenetelmän käyttäjä voi päättää, onko alkoholien tai ketonien mahdollinen yliedustus hyväksyttävissä vai onko todistusnäytön perusteella tehtävä lisätestejä. Kiintoaineiden väärien negatiivisten tulosten osalta on huomattava, että kiintoaineet voivat aiheuttaa Draizen in vivo -silmä-ärsytystestissä erilaisia vaihtuvia ja äärimmäisiä altistumisolosuhteita, mistä voi aiheutua epäolennaisia johtopäätöksiä niiden todellisesta ärsyttävyydestä (10). On myös syytä huomata, että mikään ICCVAMin validointitietokannassa havaituista vakavan silmävaurion aiheuttavia kemikaaleja (YK:n GHS-luokkaa 1) koskevista vääristä negatiivisista tuloksista (2) (3) ei ollut sellainen, jossa IVIS-arvo olisi ollut ≤ 3, mikä on vaatimus sille, että testikemikaalin luokaksi voidaan määrittää ”ei YK:n GHS-luokitusta”. BCOP-testin väärät negatiiviset tulokset eivät tässä haittaa senkään vuoksi, koska kaikki testikemikaalit, joiden testituloksena on 3 < IVIS ≤ 55 testattaisiin myöhemmin muilla asianmukaisesti validoiduilla in vitro -testeillä tai viimeisenä vaihtoehtona kaneilla sääntömääräisistä vaatimuksista riippuen käyttäen vaiheittaista testausstrategiaa ja todistusnäytön arviointia. Koska jotkin kiinteät kemikaalit tunnistetaan BCOP-testimenetelmässä oikein YK:n GHS-luokkaan 1 kuuluviksi, tämän fysikaalisen olomuodon ei katsota olevan testimenetelmän soveltamisalan ulkopuolella. Tutkijat voisivat kuitenkin harkita tätä testimenetelmää kaikentyyppisille kemikaaleille, jolloin IVIS-arvon > 55 katsottaisiin viittaavan vakavaan silmävaurioon, jolloin kemikaali olisi luokiteltava ilman lisätestausta YK:n GHS-luokkaan 1. Alkoholeilla ja ketoneilla saatuihin positiivisiin tuloksiin olisi kuten sanottu kuitenkin suhtauduttava varovaisesti mahdollisesti yliennustuksen vaaran takia.

BCOP-testimenetelmää voi käyttää myös sellaisten kemikaalien tunnistamiseen, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta sellaisena, kuin ne on määritetty YK:n GHS-järjestelmässä (4). Tähän käyttötarkoitukseen käytettynä BCOP-testimenetelmän yleinen tarkkuus on 69 % (135/196), väärien positiivisten tulosten osuus 69 % (61/89) ja väärien negatiivisten tulosten osuus 0 % (0/107) verrattuna kanin silmällä tehdyllä in vivo -testimenetelmällä saatuihin tietoihin luokiteltuna YK:n GHS-luokitusjärjestelmän mukaisesti (3) (ks. lisäys 2, taulukko 2). Väärien negatiivisten tulosten määrä (in vivo -testin kemikaalit, joilla ei YK:n GHS-luokitusta ja joiden IVIS-arvo on >3, ks. 47 kohta) on huomattavan suuri, mutta se ei haittaa tässä, koska kaikki testikemikaalit, joiden testituloksena on 3 < IVIS ≤ 55 testattaisiin myöhemmin muilla asianmukaisesti validoiduilla in vitro -testeillä tai viimeisenä vaihtoehtona kaneilla sääntömääräisistä vaatimuksista riippuen käyttäen vaiheittaista testausstrategiaa ja todistusnäytön arviointia. BCOP-testimenetelmässä ei ole havaittu erityisiä puutteita alkoholien, ketonien ja kiintoaineiden testauksessa, kun tarkoituksena on tunnistaa kemikaalit, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta sellaisena, kuin ne on määritetty YK:n GHS-järjestelmässä (3). Tutkijat voisivat kuitenkin harkita tätä testimenetelmää kaikentyyppisille kemikaaleille, jolloin negatiivisen tuloksen (IVIS ≤ 3) katsottaisiin viittaavan siihen, että kemikaali ei vaadi luokitusta (”ei YK:n GHS-luokitusta”). Koska BCOP-testimenetelmällä voidaan tunnistaa oikein vain 31 % sellaisista kemikaaleista, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta, tämän testimenetelmän ei pitäisi olla ensisijainen menetelmä alhaalta ylös suuntautuvan lähestymistavan ensimmäisenä testinä (5), jos käytettävissä on muita validoituja ja hyväksyttyjä in vitro -menetelmiä, joiden herkkyys on yhtä korkea ja erittelykyky korkeampi.

BCOP-validointitietokanta sisälsi yhteensä 113 ainetta ja 100 seosta (2) (3). BCOP-testausmenetelmää pidetään siten sopivana sekä aineiden että seosten testaukseen.

BCOP-testimenetelmää ei suositella sellaisten testikemikaalien tunnistamiseen, jotka olisi luokiteltava silmiä ärsyttäväksi (YK:n GHS-luokka 2 tai luokka 2A) tai sellaisten testikemikaalien, jotka olisi luokiteltava lievästi silmiä ärsyttäväksi (YK:n GHS-luokka 2B), koska huomattava määrä YK:n GHS-luokan 1 kemikaaleja luokitellaan liian alhaiseen GHS-luokkaan 2, 2A tai 2B, ja kemikaalit, joille ei ole YK:n GHS-luokitusta, luokitellaan liian korkeaan GHS-luokkaan 2, 2A tai 2B (2),( 3). Tätä varten saattaa olla tarpeen tehdä lisää testejä muilla soveltuvilla menetelmillä.

Kaikissa naudan silmiä ja sarveiskalvoja käyttävissä menettelyissä olisi noudatettava testauslaitoksen määräämiä eläinperäisten materiaalien (muun muassa muttei ainoastaan kudosten ja kudosnesteiden) käsittelyä koskevia sääntöjä. Suositellaan yleismaailmallisia laboratorioissa noudatettavia ennaltavarautumiskäytänteitä (11).

Vaikka BCOP-testimenetelmässä ei tarkastellakaan sidekalvon ja värikalvon vaurioita, siinä tutkitaan vaikutuksia sarveiskalvoon, jotka ovat YK:n GHS-luokituksen kannalta merkittävin in vivo -tekijä. BCOP-testimenetelmässä ei sinänsä voida arvioida sarveiskalvovaurioiden palautuvuutta. Kaninsilmätutkimusten perusteella on myös ehdotettu, että sarveiskalvovaurion alkusyvyyden avulla voidaan tunnistaa jotkin palautumattomat vaikutukset (12). Tarvitaan kuitenkin lisää tieteellistä tietoa siitä, miten syntyvät ne palautumattomat vaikutukset, jotka eivät liity suureen alkuvaurioon. BCOP-testimenetelmällä ei voida myöskään arvioida sitä, missä määrin silmäaltistukseen voi liittyä systeemistä toksisuutta.

Tätä testimenetelmää päivitetään aika ajoin sitä mukaa, kun saadaan uusia tietoja. Esimerkiksi histopatologiset tutkimukset voivat olla hyödyllisiä, jos sarveiskalvon vauriota on luonnehdittava tarkemmin. Kuten OECD:n ohjeasiakirjassa nro 160 (13) esitetään, käyttäjiä kehotetaan säilyttämään sarveiskalvot ja valmistelemaan histopatologisia näytteitä, joiden perusteella voidaan laatia tietokanta ja päätösperusteet, joiden avulla voidaan parantaa tämän testimenetelmän tarkkuutta.

Kun laboratorio alkaa käyttää tätä testimenetelmää, sen olisi käytettävä lisäyksessä 3 mainittuja pätevyyden osoittamiseen tarkoitettuja kemikaaleja. Laboratorio voi käyttää näitä kemikaaleja osoittaakseen teknisen pätevyytensä BCOP-testin suorituksessa ennen kuin se toimittaa BCOP-testimenetelmästä saatuja tietoja sääntömääräistä vaaraluokitusta varten.

TESTIN PERIAATE

BCOP-testimenetelmä on elinmalli, joka mahdollistaa naudan sarveiskalvon tavanomaisten fysiologisten ja biokemiallisten toimintojen lyhytaikaisen ylläpitämisen in vitro -oloissa. Testikemikaalin aiheuttamaa vauriota arvioidaan tässä menetelmässä mittaamalla muutokset sarveiskalvon sameudessa ns. opasitometrillä ja muutokset läpäisevyydessä näkyvää valoa mittaavalla spektrofotometrillä. Molempia mittauksia käytetään IVIS-arvon laskemiseen. IVIS-arvon avulla osoitetaan aineelle in vitro -ärsyttävyyteen perustuva vaaraluokituskategoria, jotta voidaan ennustaa testiaineen in vivo -silmä-ärsytyskyky (ks. päätösperusteet, 48 kohta).

BCOP-testimenetelmässä käytetään vasta teurastetuista naudoista saaduista silmistä eristettyjä sarveiskalvoja. Sarveiskalvon sameus mitataan sinä valomääränä, joka kulkee sarveiskalvon läpi. Läpäisevyys mitataan sinä määränä natriumfluoreseiini-väriainetta, joka imeytyy koko sarveiskalvon läpi ja joka mitataan takakammiossa olevassa mediumissa (väliaineessa). Testikemikaalit annostellaan sarveiskalvon epiteelipinnalle lisäämällä sitä sarveiskalvotelineen etukammioon. Lisäyksessä 4 on kuvaus ja kaavio BCOP-testimenetelmässä käytetystä sarveiskalvotelineestä. Sarveiskalvotelineitä saa kaupallisesti eri lähteistä, tai ne voi rakentaa itse.

Naudan silmien lähde ja eläinten ikä sekä eläinlajin valinta

Teurastamoihin tuodut nautaeläimet teurastetaan useimmiten käytettäväksi ihmisravinnoksi tai muihin kaupallisiin tarkoituksiin. BCOP-testimenetelmään voidaan käyttää vain sarveiskalvoja, jotka on saatu terveistä, ihmisravinnoksi kelpaavista eläimistä. Koska nautaeläinten paino vaihtelee paljon riippuen rodusta, iästä ja sukupuolesta, ei anneta mitään suositusta siitä, minkä painoisia eläinten olisi oltava teurastushetkellä.

Sarveiskalvojen mitat voivat vaihdella käytettäessä eri ikäisistä eläimistä saatuja silmiä. Yli kahdeksan vuoden ikäisistä eläimistä saatujen sarveiskalvojen halkaisija vaakasuunnassa on yleensä >30,5 mm ja sarveiskalvon keskiosan paksuus (CCT) ≥ 1100 μm, kun taas alle viiden vuoden ikäisten sarveiskalvon halkaisija on 28,5 mm ja CCT < 900 μm (14). Tästä syystä ei yleensä käytetä silmiä, jotka on saatu yli 60 kuukauden ikäisistä eläimistä. Perinteisesti ei ole käytetty alle 12 kuukauden ikäisten nautojen silmiä, koska silmien kehitys on vielä kesken ja sarveiskalvo on huomattavasti ohuempi ja sen halkaisija pienempi kuin täysikasvuisten eläinten sarveiskalvon. Nuorista eläimistä (eli 6–12 kuukautta vanhoista) saatuja sarveiskalvoja voidaan käyttää, koska siihen liittyy joitakin etuja. Niitä saa helpommin, ikävaihtelu on pienempi, ja vaara työntekijöiden altistumisesta naudan spongiformiselle enkefalopatialle on pienempi (15). Koska olisi hyödyllistä arvioida lisää sarveiskalvon koon tai paksuuden vaikutusta sarveiskalvon reagoimiseen syövyttäviin ja ärsyttäviin kemikaaleihin, käyttäjiä kehotetaan raportoimaan niiden eläinten arvioitu ikä ja/tai paino, joista tutkimuksessa käytetyt sarveiskalvot on saatu.

Silmien kerääminen ja niiden kuljetus laboratorioon

Teurastamon henkilökunta kerää silmät. Silmien mekaanisten ja muiden vaurioiden ehkäisemiseksi silmät olisi poistettava silmästä mahdollisimman pian kuoleman jälkeen, ja ne olisi pantava jäähdytykseen heti silmämunasta poistamisen jälkeen ja kuljetuksen ajaksi. Jotta silmät eivät altistuisi mahdollisesti ärsyttäville kemikaaleille, teurastamon työntekijät eivät saisi käyttää detergenttejä huuhtoessaan eläimen päätä.

Silmät olisi upotettava kokonaan jäähdytettyyn Hanksin suolaliuokseen (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS) sopivankokoisessa astiassa ja kuljetettava laboratorioon sellaisella tavalla, että bakteerikontaminaatio tai muut vauriot ovat mahdollisimman pieniä. Koska silmät kerätään teurastuksen yhteydessä, niihin saattaa roiskua verta ja muita biologisia aineita, kuten bakteereja ja muita pieneliöitä. Siksi on tärkeää varmistaa, että kontaminaatioriski on mahdollisimman pieni. Esimerkiksi astia, jossa silmät ovat, on pidettävä jäähauteessa, ja kuljetusta varten käytettävään HBSS:ään on lisättävä antibiootteja (esim. penisilliiniä 100 IU/ml ja streptomysiiniä 100 μg/mL]).

Silmien keräämisen ja BCOP-testin tekemisen välisen ajan pitäisi olla mahdollisimman lyhyt (keräys ja käyttö mieluiten samana päivänä), ja pitäisi osoittaa, etteivät määritystulokset ole sen takia epäluotettavia. Nämä tulokset perustuvat silmien valintaperusteisiin sekä positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden vasteisiin. Kaikkien määrityksessä käytettyjen silmien olisi oltava peräisin samasta tiettynä päivänä kerätystä silmäryhmästä.

BCOP-testissä käytettävien silmien valintaperusteet

Heti kun silmät saapuvat laboratorioon, tutkitaan huolellisesti, onko niissä vikoja, kuten lisääntynyttä sameutta, naarmuja ja verisuonittumista. Testissä saa käyttää vain sellaisista silmistä saatuja sarveiskalvoja, joissa ei ole tällaisia vikoja.

Kaikkien sarveiskalvojen laatua arvioidaan myös määrityksen myöhemmissä vaiheissa. Sarveiskalvot, joiden sameus on tunnin tasapainottumisajan jälkeen yli seitsemän sameusyksikköä tai opasitometrin ja sarveiskalvotelineen vastaavaa yksikköä, on hylättävä (HUOMAUTUS: opasitometri olisi kalibroitava sameusyksikköjen määrittelemiseen käytettävien sameusstandardien mukaisesti, ks. lisäys 4).

Kussakin käsittelyryhmässä (testikemikaali, samaan aikaan tehtävät negatiiviset ja positiiviset kontrollit) on oltava vähintään kolme silmää. BCOP-testauksessa pitäisi negatiiviseen kontrolliin käyttää kolme sarveiskalvoa. Koska kaikki sarveiskalvot leikataan kokonaisesta silmämunasta ja asetetaan sarveiskalvokammioihin, voi käsittelystä aiheutua vahinkoa, joka vaikuttaa yksittäisen sarveiskalvon sameuteen ja läpäisevyyteen (myös negatiivisessa kontrollissa). Negatiivisista kontrollisarveiskalvoista saatuja sameus- ja läpäisevyysarvoja käytetään lisäksi IVIS-laskelmissa korjaamaan testikemikaalilla käsiteltyjen ja positiivisella kontrollilla käsiteltyjen sarveiskalvojen sameus- ja läpäisevyysarvoja.

MENETTELY

Silmien valmistelu

Virheettömät sarveiskalvot leikataan siten, että niihin jää 2–3 mm:n reuna kovakalvoa, mikä helpottaa myöhempää käsittelyä. Varotaan vahingoittamasta sarveiskalvon epiteeliä ja endoteeliä. Eristetyt sarveiskalvot asetetaan erikoistelineisiin, joissa on etu- ja takaosasto. Nämä ovat kosketuksissa sarveiskalvon epiteelipuoleen (etukammio) ja endoteelipuoleen (takakammio). Molemmat kammiot täytetään ylimäärin esilämmitetyllä Eaglen Minimum Essential Medium (EMEM) -viljelynesteellä (mediumilla), jossa ei ole fenolipunaa (takakammio ensin) ja varmistetaan, ettei muodostu kuplia. Laitteen annetaan tasapainottua 32 ± 1 celsiusasteessa vähintään tunnin, jotta sarveiskalvot tasapainottuvat mediumin kanssa ja niiden metabolinen toiminta palautuu normaaliksi (mikäli mahdollista). Sarveiskalvon pinnan lämpötila in vivo on noin 32 °C.

Tasapainottumisjakson jälkeen molempiin kammioihin lisätään tuoretta esilämmitettyä EMEM:iä, jossa ei ole fenolipunaa, ja kustakin sarveiskalvosta otetaan sameuden perustasolukema. Sarveiskalvot, joissa ilmenee makroskooppista kudosvauriota (kuten naarmuja, pigmentaatiota tai verisuonittumista) tai joiden sameus on yli seitsemän sameusyksikköä tai opasitometrin ja sarveiskalvotelineen vastaavaa yksikköä, on hylättävä. Negatiiviseksi kontrolliryhmäksi (tai liuotinkontrolliryhmäksi) valitaan vähintään kolme sarveiskalvoa. Muut sarveiskalvot jaetaan käsittelyryhmään ja positiivisen kontrollin ryhmään.

Koska veden lämpökapasiteetti on suurempi kuin ilman, vedellä saadaan tasaisempi inkubaatiolämpötila. Siksi suositellaan vesihauteen käyttöä sarveiskalvotelineen ja sen sisällön pitämiseksi 32 ± 1 celsiusasteessa. Kuitenkin myös ilmainkubaattoreita voidaan käyttää, kunhan huolehditaan siihen, että lämpötila pysyy vakaana (esimerkiksi esilämmittämällä telineet ja mediumit).

Testikemikaalin annostelu

Käsittelyä varten on kaksi eri protokollaa, toinen nesteille ja pinta-aktiivisille aineille (kiinteät tai nestemäiset) ja toinen kiinteille aineille, jotka eivät ole pinta-aktiivisia.

Nesteet testataan laimentamattomina. Puoliksi kiinteät aineet, voiteet ja vahat testataan tavallisesti kuten nesteet. Pinta-aktiiviset aineet testataan 10-prosenttisena liuoksena (w/v) 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa, tislatussa vedessä tai muussa liuottimessa, josta on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestelmää. Jos laimennuksia muutetaan, on ne perusteltava. Pinta-aktiivisia aineita sisältävät teokset voidaan testata laimentamattomina tai sopivaksi pitoisuudeksi laimennettuna riippuen kysymykseen tulevasta in vivo -altistusskenaariosta. Jos pitoisuuksia muutetaan, on ne perusteltava. Sarveiskalvot altistetaan nesteille ja pinta-aktiivisille aineille 10 minuutin ajan. Jos altistusaikaa muutetaan, olisi se perusteltava tieteellisesti. Lisäyksessä 1 on pinta-aktiivisen aineen ja pinta-aktiivista ainetta sisältävän seoksen määritelmät.

Kiinteät aineet, jotka eivät ole pinta-aktiivisia, testataan tavallisesti 20-prosenttisena liuoksena (w/v) tai suspensiona 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa, tislatussa vedessä tai muussa liuottimessa, josta on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestelmää. Joissakin olosuhteissa ja asianmukaisesti tieteellisesti perusteltuna kiinteitä aineita voidaan testata myös sellaisenaan annostelemalla niitä suoraan sarveiskalvon pinnalle avoimen kammion menetelmässä (ks. 32 kohta). Sarveiskalvot altistetaan kiinteille aineille neljän tunnin ajan. Kuten nesteiden ja pinta-aktiivisten aineiden tapauksessa, altistusajan muuttaminen on perusteltava tieteellisesti.

Käsittely voi olla erilaista riippuen testattavan aineen fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista, esimerkiksi siitä, onko kyseessä kiinteä aine, neste, viskoosi tai ei-viskoosi neste. Tärkeintä on varmistaa, että testikemikaali peittää riittävästi epiteelin pinnan ja että se voidaan huuhtelemalla poistaa riittävästi. Suljetun kammion menetelmää käytetään tavallisesti testattaville nestemäisille kemikaaleille, jotka vaihtelevat ei-viskoosista lievästi viskoosiin, kun taas avoimen kammion menetelmää käytetään tavallisesti puoliksi viskooseille ja viskooseille nestemäisille testikemikaaleille ja kiinteille aineille.

Suljetun kammion menetelmässä annostellaan etukammioon niin paljon testikemikaalia (750 μl), että se peittää sarveiskalvon epiteelipuolen. Annostelu tapahtuu kammion yläosassa olevien aukkojen kautta. Aukot suljetaan sitten tulpilla altistuksen ajaksi. On tärkeää varmistaa, että kukin sarveiskalvo altistetaan testiaineelle niin pitkäksi aikaa kuin on asianmukaista.

Avoimen kammion menetelmässä ikkunan lukitusrengas ja etukammion lasi-ikkuna poistetaan ennen käsittelyä. Kontrollia tai testikemikaalia (750 μl tai niin paljon, että testikemikaali peittää sarveiskalvon kokonaan) annostellaan suoraan sarveiskalvon epiteelipinnalle mikropipetillä. Jos testikemikaalia on vaikea annostella pipetillä, annostelua voidaan helpottaa siirtämällä testikemikaali positive displacement -pipettiin paineen avulla. Positive displacement -pipetin kärki työnnetään ruiskun annostelukärkeen niin, että aine voidaan siirtää displacement-pipetin kärkeen paineen avulla. Ruiskun mäntää painetaan samalla kun pipetin mäntää vedetään ylöspäin. Jos pipetin kärkeen ilmestyy ilmakuplia, testiaine puhalletaan ulos ja prosessi toistetaan, kunnes kärki saadaan täytettyä ilman ilmakuplia. Jos on tarpeen, voidaan käyttää tavallista ruiskua (ilman neulaa), koska sillä voidaan mitata tarkka tilavuus testikemikaalia, ja annostelu sarveiskalvon epiteelipinnalle on helpompaa. Annostelun jälkeen lasi-ikkuna pannaan paikalleen etukammion päälle, jotta järjestelmä on jälleen suljettu.

Inkubointi altistuksen jälkeen

Altistusajan jälkeen testikemikaali, negatiivinen kontrollikemikaali tai positiivinen kontrollikemikaali poistetaan etukammiosta ja epiteeli pestään vähintään kolmesti (tai kunnes testikemikaalia ei näy) EMEM:illä (jossa on fenolipunaa). Huuhteluun käytetään fenolipunaa sisältävää mediumia, koska fenolipunan värin vaihtumista voidaan seurata, kun halutaan määrittää happamien tai emäksisten testikemikaalien huuhtelun tehokkuus. Sarveiskalvoja pestään enemmän kuin kolme kertaa, jos fenolipuna on edelleen vääränvärinen (keltainen tai purppuranvärinen) tai jos testikemikaalia on vielä näkyvillä. Kun mediumissa ei ole enää testikemikaalia, sarveiskalvot pestään vielä kerran EMEM:illä (jossa ei ole fenolipunaa). EMEM-huuhtelua (ilman fenolipunaa) käytetään viimeiseksi sen varmistamiseksi, että fenolipuna on poistunut etukammiosta ennen sameusmittausta. Etukammio täytetään sitten uudelleen tuoreella EMEM:illä (ilman fenolipunaa).

Kun testikemikaali on neste tai pinta-aktiivinen aine, sarveiskalvoja inkuboidaan huuhtelun jälkeen vielä kaksi tuntia 32 ± 1 celsiusasteessa. Tietyissä olosuhteissa voi pitempi aika altistuksen jälkeen olla hyödyksi. Sitä voidaan harkita tapauskohtaisesti. Kiinteillä aineilla käsitellyt sarveiskalvot huuhdellaan perusteellisesti neljän tunnin altistuksen päätteeksi, mutta niitä ei tarvitse enää inkuboida enempää.

Kunkin sarveiskalvon sameus ja läpäisevyys kirjataan nesteille ja pinta-aktiivisille aineille altistuksen jälkeisen inkubaation jälkeen ja kiinteille aineille, jotka eivät ole pinta-aktiivisia aineita, neljän tunnin altistuksen jälkeen. Kutakin sarveiskalvoa tarkastellaan myös silmämääräisesti ja kirjataan merkitykselliset havainnot (esimerkiksi kudoksen kuoriutuminen, testikemikaalin jäämät, epätasainen sameusjakauma). Tällaiset havainnot voivat olla tärkeitä, sillä ne voivat näkyä opasitometrin lukemien vaihteluna.

Kontrollikemikaalit

Kussakin kokeessa on mukana samanaikaisesti määritettävät negatiiviset eli liuotin/kantaja-ainekontrollit ja positiiviset kontrollit.

Kun testataan 100-prosenttista nestemäistä ainetta, otetaan BCOP-määritykseen samanaikaisesti määritettävä negatiivinen kontrolli (esimerkiksi 0,9-prosenttinen natriumkloridiliuos tai tislattu vesi) sitä varten, että epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä voidaan havaita ja määrityksen päätepisteille saadaan perustaso. Näin varmistetaan myös, etteivät määritysolosuhteet aiheuta ärsytysvastetta tahattomasti.

Kun testataan laimennettua nestettä, pinta-aktiivista ainetta tai kiinteää ainetta, otetaan BCOP-määritykseen samanaikaisesti määritettävä liuotin/kantaja-ainekontrolliryhmä sitä varten, että epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä voidaan havaita ja määrityksen päätepisteille saadaan perustaso. Liuotinta/kantaja-ainetta saa käyttää vain, jos on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestelmää.

Kuhunkin kokeeseen otetaan mukaan positiivisena kontrollina kemikaali, jonka tiedetään aiheuttavan positiivisen vasteen, jotta voidaan varmistaa testijärjestelmän vahingoittumattomuus ja sen moitteeton toiminta. Ärsytysvaste ei kuitenkaan saisi olla liian voimakas, jotta positiivisen kontrollivasteen vaihtelu ajan funktiona voidaan määrittää.

Esimerkkejä nestemäisten testikemikaalien positiivisista kontrolleista ovat 100-prosenttinen etanoli tai 100-prosenttinen dimetyyliformamidi. Esimerkki kiinteiden testikemikaalien positiivisesta kontrollista on 20-prosenttisena liuoksena (w/v) oleva imitsadoli 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa.

Vertailukemikaalit ovat hyödyllisiä, kun arvioidaan tiettyyn kemikaali- tai tuoteryhmään kuuluvien tuntemattomien kemikaalien silmä-ärsytyskykyä tai silmää ärsyttävän aineen suhteellista ärsytyskykyä tietyllä ärsytysvastealueella.

Mitatut päätepisteet

Sarveiskalvon sameus mitataan sinä valomääränä, joka kulkee sarveiskalvon läpi. Sarveiskalvon sameus mitataan kvantitatiivisesti opasitometrillä, jolla saadaan jatkuvalla asteikolla mitattuja sameusarvoja.

Läpäisevyys mitataan sinä määränä natriumfluoreseiini-väriainetta, joka imeytyy kaikkien sarveiskalvon solukerrosten (ts. sarveiskalvon ulkopinnan epiteelin ja sisäpinnan endoteelin) läpi. 1 ml natriumfluoreseiiniliuosta (4 mg/ml testattaessa nesteitä tai pinta-aktiivisia aineita tai 5 mg/ml testattaessa kiinteitä aineita, jotka eivät ole pinta-aktiivisia) lisätään sarveiskalvotelineen etukammioon, joka on kosketuksissa sarveiskalvon epiteelipuolen kanssa. Takakammiossa, joka on kosketuksissa sarveiskalvon endoteelipuolen kanssa, on tuoretta EMEM:iä. Telinettä inkuboidaan vaakasuorassa 90 ± 5 min 32 ± 1 celsiusasteessa. Takakammioon siirtyvän natriumfluoreseiinin määrä mitataan UV/VIS-spektrofotometrillä. 490 nanometrin aallonpituudella mitatut spektrofotometrin lukemat kirjataan optisena tiheytenä (OD490) tai absorbanssiarvoina, jotka mitataan jatkuvalla asteikolla. Fluoreseiiniläpäisevyysarvot määritetään käyttäen OD490-arvoja, jotka on mitattu spektrofotometrillä tavanomaisella 1 senttimetrin valotiellä.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää 96 kuopan kuoppalevyjen lukulaitetta, jos i) laitteen fluoreseiinin OD490 -arvojen mittausalue on lineaarinen; ja ii) 96 kuopan levyissä käytetään sellaista fluoreseiininäytteiden tilavuutta, jolla saadaan 1 cm:n valotiellä saatuja arvoja vastaavat OD490 -arvot (tämä saattaa edellyttää, että kuoppa täytetään kokonaan [tavallisesti 360 μl).

TIEDOT JA RAPORTOINTI

Tietojen arviointi

Kun sameusarvot ja keskimääräiset läpäisevyysarvot (OD490) on korjattu taustan sameuden ja negatiivisen kontrollin läpäisevyyden OD490-arvojen suhteen, yhdistetään kunkin käsittelyryhmän sameuden keskiarvot ja läpäisevyyden keskimääräiset OD490-arvot kokemusperäiseen kaavaan, josta lasketaan kullekin käsittelyryhmälle in vitro -ärsytysaste (IVIS) seuraavasti:

IVIS = sameuden keskiarvo + (15 × keskimääräinen läpäisevyyden OD490-arvo)

Sina et al. (16) ovat raportoineet, että tämä kaava on johdettu heidän laboratoriossaan ja laboratorioidenvälisissä tutkimuksissa. Monilaboratoriotutkimuksessa 36 yhdisteen sarjalle saaduille tuloksille tehtiin monimuuttuja-analyysi, jossa määritettiin paras yhtälö in vivo ja in vitro saatujen tuloksien välille. Kahden eri yhtiön tutkijat toistivat analyysin ja saivat lähes samat yhtälöt.

Sameus- ja läpäisevyysarvoja olisi arvioitava myös erikseen, jotta nähdään, aiheuttaako testikemikaali syövytystä tai vakavaa ärsytystä vain yhden päätepisteen määrityksessä (ks. päätösperusteet).

Päätösperusteet

Seuraavassa on esitetty IVIS-raja-arvot, joiden avulla voidaan tunnistaa sellaiset kemikaalit, jotka aiheuttavat vakavia silmävaurioita (YK:n GHS-luokka 1), sekä kemikaalit, jotka eivät vaadi luokitusta silmä-ärsytyksen tai vakavan silmävaurion osalta (kemikaalit, joilla ei ole YK:n GHS-luokitusta):

Tutkimuksen hyväksymisperusteet

Testiä pidetään hyväksyttävänä, jos positiivisella kontrollilla saadaan IVIS-arvo, joka on kahden standardipoikkeaman sisällä senhetkisestä pitkän aikavälin keskiarvosta, joka on päivitettävä vähintään kolmen kuukauden välein tai joka kerta kun sellaisissa laboratorioissa, joissa testejä tehdään vain harvoin (eli vähemmän kuin kerran kuussa) saadaan hyväksytty testi. Negatiivisista tai liuotin/kantaja-ainevasteista saatujen sameus- ja läpäisevyysarvojen pitäisi olla pienemmät kuin vahvistetut sameuden ja läpäisevyyden taustaraja-arvot naudan sarveiskalvolle, jota on käsitelty negatiivisilla tai liuotin/kantaja-ainekontrolleilla. Kun testikemikaalin luokittelu on yksiselitteinen, se voidaan testata yhdessä vähintään kolme sarveiskalvoa käsittävässä testiajossa. Jos ensimmäisen testiajon tulokset ovat moniselitteisiä, on harkittava toista testiajoa (se ei kuitenkaan ole välttämätöntä) ja kolmatta, jos ensimmäisen ja toisen testiajon keskimääräiset IVIS-tulokset ovat ristiriitaisia. Ensimmäisen testiajon tuloksia pidetään moniselitteisinä, jos kolmen sarveiskalvon ennusteet ovat ristiriitaisia, kuten

Testiraportti

Testiraportissa olisi annettava seuraavat tiedot, jos ne ovat merkityksellisiä tutkimuksen suorittamiselle:

LÄHDEKIRJALLISUUS