28.4.2017   

PL

Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej

L 112/1


ROZPORZĄDZENIE KOMISJI (UE) 2017/735

z dnia 14 lutego 2017 r.

zmieniające, w celu dostosowania do postępu technicznego, załącznik do rozporządzenia (WE) nr 440/2008 ustalającego metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH)

(Tekst mający znaczenie dla EOG)

KOMISJA EUROPEJSKA,

uwzględniając Traktat o funkcjonowaniu Unii Europejskiej,

uwzględniając rozporządzenie (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady z dnia 18 grudnia 2006 r. w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH) i utworzenia Europejskiej Agencji Chemikaliów, zmieniające dyrektywę 1999/45/WE oraz uchylające rozporządzenie Rady (EWG) nr 793/93 i rozporządzenie Komisji (WE) nr 1488/94, jak również dyrektywę Rady 76/769/EWG i dyrektywy Komisji 91/155/EWG, 93/67/EWG, 93/105/WE i 2000/21/WE (1), w szczególności jego art. 13 ust. 2,

a także mając na uwadze, co następuje:

(1)

Rozporządzenie Komisji (WE) nr 440/2008 (2) zawiera metody badań służące określaniu właściwości fizykochemicznych, toksyczności oraz ekotoksyczności substancji chemicznych, które to metody należy stosować do celów rozporządzenia (WE) nr 1907/2006.

(2)

Należy uaktualnić rozporządzenie (WE) nr 440/2008 w celu uwzględnienia nowych i zaktualizowanych metod badawczych przyjętych niedawno przez Organizację Współpracy Gospodarczej i Rozwoju (OECD), w celu uwzględnienia postępu technicznego oraz zmniejszenia liczby zwierząt wykorzystywanych do celów doświadczalnych zgodnie z dyrektywą Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE (3). Projekt ten był przedmiotem konsultacji z zainteresowanymi stronami.

(3)

Proces dostosowania do postępu technicznego obejmuje dwadzieścia metod badawczych: jedną nową metodę oznaczania właściwości fizykochemicznych, pięć nowych metod badawczych i jedną zaktualizowaną metodę badawczą na potrzeby oceny ekotoksyczności, dwie zaktualizowane metody badawcze na potrzeby oceny losów i zachowania się w środowisku oraz cztery nowe metody badawcze i siedem zaktualizowanych metod badawczych na potrzeby ustalania skutków dla zdrowia ludzkiego.

(4)

OECD dokonuje regularnych przeglądów swoich wytycznych dotyczących badań, aby identyfikować te metody badawcze, które są przestarzałe z naukowego punktu widzenia. W niniejszym dostosowaniu do postępu technicznego usuwa się sześć metod badawczych, w odniesieniu do których anulowano odpowiednie wytyczne OECD dotyczące badań.

(5)

Należy zatem odpowiednio zmienić rozporządzenie (WE) nr 440/2008.

(6)

Środki przewidziane w niniejszym rozporządzeniu są zgodne z opinią komitetu ustanowionego na mocy art. 133 rozporządzenia (WE) nr 1907/2006,

PRZYJMUJE NINIEJSZE ROZPORZĄDZENIE:

Artykuł 1

W załączniku do rozporządzenia (WE) nr 440/2008 wprowadza się zmiany zgodnie z załącznikiem do niniejszego rozporządzenia.

Artykuł 2

Niniejsze rozporządzenie wchodzi w życie dwudziestego dnia po jego opublikowaniu w Dzienniku Urzędowym Unii Europejskiej.

Niniejsze rozporządzenie wiąże w całości i jest bezpośrednio stosowane we wszystkich państwach członkowskich.

Sporządzono w Brukseli dnia 14 lutego 2017 r.

W imieniu Komisji

Jean-Claude JUNCKER

Przewodniczący


(1)  Dz.U. L 396 z 30.12.2006, s. 1.

(2)  Rozporządzenie Komisji (WE) nr 440/2008 z dnia 30 maja 2008 r. ustalające metody badań zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 1907/2006 Parlamentu Europejskiego i Rady w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH) (Dz.U. L 142 z 31.5.2008, s. 1).

(3)  Dyrektywa Parlamentu Europejskiego i Rady 2010/63/UE z dnia 22 września 2010 r. w sprawie ochrony zwierząt wykorzystywanych do celów naukowych (Dz.U. L 276 z 20.10.2010, s. 33).


ZAŁĄCZNIK

W załączniku do rozporządzenia (WE) nr 440/2008 wprowadza się następujące zmiany:

1)

w części A dodaje się rozdział w brzmieniu:

„A.25   STAŁE DYSOCJACJI W WODZIE (METODA MIARECZKOWA – METODA SPEKTROFOTOMETRYCZNA – METODA KONDUKTOMETRYCZNA)

WPROWADZENIE

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 112 (1981).

Warunki wstępne

odpowiednia metoda analityczna;

rozpuszczalność w wodzie.

Wytyczne

wzór strukturalny;

przewodność elektryczna dla metody konduktometrycznej.

Oświadczenia kwalifikujące

wszystkie metody badawcze można przeprowadzić na substancjach czystych lub substancjach o jakości handlowej. Należy rozważyć ewentualny wpływ zanieczyszczeń na wyniki;

metoda miareczkowa nie jest odpowiednia w przypadku substancji o niskiej rozpuszczalności (zob. poniższa sekcja poświęcona roztworom do badań);

metodę spektrofotometryczną stosuje się wyłącznie w odniesieniu do substancji o znacząco różniących się widmach absorpcyjnych UV/VIS dla form zdysocjowanych i niezdysocjowanych. Metoda ta jest również odpowiednia w przypadku substancji o niskiej rozpuszczalności i w przypadku dysocjacji bez użycia kwasów / z użyciem zasad, np. tworzenia kompleksów;

w sytuacjach, w których ma zastosowanie równanie Onsagera, można wykorzystać metodę konduktometryczną nawet przy umiarkowanie niskich stężeniach i nawet w przypadkach równowagi niekwasowej/zasadowej.

Dokumenty standardowe

Niniejsza metoda badawcza opiera się na metodach podanych w źródłach wymienionych w sekcji „Bibliografia” oraz na wstępnym projekcie wytycznych dotyczących zgłoszenia przedprodukcyjnego EPA z 18 sierpnia 1978 r.

METODA – WPROWADZENIE, CEL, ZAKRES, ISTOTNOŚĆ, ZASTOSOWANIE I OGRANICZENIA BADANIA

Dysocjacja substancji w wodzie ma znaczenie dla oceny jej wpływu na środowisko. Określa ona formę substancji, która z kolei determinuje jej zachowanie i transport. Może wpływać na adsorpcję substancji chemicznej na glebach i osadach oraz absorpcję w komórkach biologicznych.

Definicje i jednostki

Dysocjacja to odwracalny proces rozpadu na co najmniej dwa związki chemiczne, które mogą być jonowe. Proces oznacza się na ogół za pomocą wzoru:

RXR ++ X

a stała równowagi stężenia determinująca reakcję to:

Formula

Na przykład w sytuacji gdy R oznacza wodór (substancja jest kwasem), stała wynosi:

Formula

lub

Formula

Substancje odniesienia

Poniższe substancje odniesienia nie muszą być stosowane za każdym razem, gdy badana jest nowa substancja. Podaje się je przede wszystkim w tym celu, aby okresowo można było wykonać wzorcowanie metody oraz aby umożliwić porównanie wyników w przypadku zastosowania innej metody.

 

pKa  (1)

Temp. w °C

p-Nitrofenol

7,15

251

Kwas benzoesowy

4,12

20

p-Chloroanilina

3,93

20

Korzystne byłoby zastosowanie substancji z kilkoma pK, jak wskazano w przedstawionej poniżej zasadzie metody. Taką substancją mógłby być:

Kwas cytrynowy

pKa (8)

Temp. w °C

 

1) 3,14

20

 

2) 4,77

20

 

3) 6,39

20

Zasada metody badawczej

Opisany proces chemiczny jest na ogół tylko nieznacznie zależny od temperatury w zakresie temperatur występujących w środowisku naturalnym. Do wyznaczenia stałej dysocjacji wymagany jest pomiar stężeń zdysocjowanych i niezdysocjowanych form substancji chemicznej. Korzystając z wiedzy o stechiometrii reakcji dysocjacji, o której mowa w sekcji „Definicje i jednostki” powyżej, można wyznaczyć odpowiednią stałą. W konkretnym przypadku opisanym w niniejszej metodzie badawczej substancja zachowuje się jak kwas albo zasada, a najlepszym sposobem na wyznaczenie jest określenie odpowiednich stężeń zjonizowanych i niezjonizowanych form substancji oraz pH roztworu. Zależność między tymi terminami przedstawiono na równaniu dla pKa w sekcji „Definicje i jednostki” powyżej. Niektóre substancje wykazują więcej niż jedną stałą dysocjacji i możliwe jest opracowanie podobnych równań. Niektóre z metod opisanych w niniejszym dokumencie można również zastosować w odniesieniu do dysocjacji bez użycia kwasów / z użyciem zasad.

Kryteria jakości

Powtarzalność

Stała dysocjacji powinna być powtarzana (minimum trzy oznaczenia) w zakresie ± 0,1 jednostek logarytmicznych.

OPIS PROCEDUR BADAWCZYCH

Istnieją dwa podstawowe podejścia do wyznaczania pKa. Jedno polega na miareczkowaniu znanej ilości substancji odpowiednio mianowanym roztworem kwasu lub mianowanym roztworem zasady; drugie polega na określeniu względnego stężenia zjonizowanych i niezjonizowanych form oraz jego zależności od pH.

Przygotowania

Metody oparte na tych zasadach można zaklasyfikować jako procedury miareczkowe, spektrofotometryczne i konduktometryczne.

Roztwory do badań

W przypadku metody miareczkowej i metody konduktometrycznej substancję chemiczną należy rozpuścić w wodzie destylowanej. W przypadku metody spektrofotometrycznej i innych metod stosuje się roztwory buforowe. Stężenie substancji badanej nie powinno przekraczać niższej spośród następujących wartości: 0,01 M albo połowy stężenia w stanie nasycenia, a do sporządzania roztworów należy stosować najczystszą dostępną formę substancji. Jeżeli substancja jest tylko częściowo rozpuszczalna, można ją rozpuścić w niewielkiej ilości rozpuszczalnika mieszalnego z wodą przed dodaniem do wskazanych powyżej stężeń.

Roztwory należy sprawdzić pod kątem obecności emulsji za pomocą stożka Tyndalla, zwłaszcza jeżeli w celu zwiększenia rozpuszczalności użyto współrozpuszczalnika. W przypadku stosowania roztworów buforowych stężenie buforowe nie powinno przekraczać 0,05 M.

Warunki badania

Temperatura

Należy wyregulować temperaturę do co najmniej ± 1 °C. Preferowana temperatura oznaczenia wynosi 20 °C.

Jeżeli podejrzewa się znaczną zależność od temperatury, oznaczenia należy dokonywać w co najmniej dwóch różnych temperaturach. W takim przypadku temperaturę należy ustawić w odstępach co 10 °C, a regulacja temperatury powinna wynosić ± 0,1 °C.

Analizy

Zastosowana metoda będzie zależała od charakteru badanej substancji. Musi ona być na tyle czuła, aby umożliwić oznaczenie różnych gatunków przy każdym stężeniu roztworu do badań.

Przeprowadzenie badania

Metoda miareczkowa

Roztwór do badań określa się poprzez miareczkowanie odpowiednio mianowanym roztworem zasady lub kwasu, mierząc pH po każdym dodaniu titrantu. Należy przyrostowo dodać titrant co najmniej 10 razy przed osiągnięciem punktu równoważnikowego miareczkowania. Jeżeli równowaga zostanie osiągnięta dostatecznie szybko, można skorzystać z potencjometru rejestrującego. W przypadku tej metody konieczne są dokładne informacje na temat całkowitej ilości substancji i jej stężenia. Należy podjąć środki ostrożności, aby wykluczyć dwutlenek węgla. Szczegółowe informacje na temat procedury, środków ostrożności i obliczeń podano w badaniach standardowych, np. w pozycjach (1), (2), (3), (4) bibliografii.

Metoda spektrofotometryczna

Długość fali ustala się wówczas, gdy zjonizowane i niezjonizowane formy substancji mają wyraźnie różne współczynniki ekstynkcji. Widmo absorpcyjne UV/VIS uzyskuje się z roztworów o stałym stężeniu, w warunkach pH, w których substancja jest zasadniczo niezjonizowana i w pełni zjonizowana, oraz w szeregu pośrednich pH. W tym celu można albo dodawać przyrostowo stężony kwas (stężoną zasadę) do stosunkowo dużej objętości roztworu substancji w wieloskładnikowym roztworze buforowym, początkowo przy wysokim (niskim) pH (pozycja (5) bibliografii), albo dodawać jednakowe objętości roztworu podstawowego substancji w np. wodzie czy metanolu do stałych objętości różnych roztworów buforowych obejmujących pożądany zakres pH. Na podstawie wartości pH i absorbancji przy wybranej długości fali oblicza się wystarczającą liczbę wartości dla pKa, korzystając z danych uzyskanych przy co najmniej 5 pH, w których substancja jest zjonizowana w co najmniej 10 % i mniej niż 90 %. Więcej informacji szczegółowych na temat doświadczenia i metodę obliczania można znaleźć w pozycji (1) bibliografii.

Metoda konduktometryczna

Przy użyciu komórki o niskiej znanej stałej komórkowej mierzy się przewodność roztworu substancji o stężeniu około 0,1 M w wodzie do pomiarów przewodności. Mierzy się także przewodność szeregu dokładnie wykonanych rozcieńczeń tego roztworu. Za każdym razem stężenie zmniejsza się o połowę, a serie powinny obejmować co najmniej rząd wielkości stężenia. Przewodność graniczną przy rozcieńczeniu nieskończenie wielkim ustala się, przeprowadzając podobne doświadczenie z użyciem soli sodowej, a następnie dokonując ekstrapolacji. Stopień dysocjacji można wówczas obliczyć na podstawie przewodności każdego roztworu za pomocą równania Onsagera i stąd stałą dysocjacji można obliczyć zgodnie z prawem rozcieńczeń Ostwalda jako K = α2C/(1 – α), gdzie C oznacza stężenie w molach na litr, a α oznacza frakcję zdysocjowaną. Należy podjąć środki ostrożności, aby wykluczyć CO2. Więcej informacji szczegółowych na temat doświadczenia i metodę obliczania można znaleźć w standardowej literaturze i pozycjach (1), (6) i (7) bibliografii.

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Opracowanie wyników

Metoda miareczkowa

Wartość pKa oblicza się dla 10 punktów mierzonych na krzywej miareczkowania. Oblicza się średnią i odchylenie standardowe takich wartości pKa. Należy je przestawić na wykresie zestawiającym pH z objętością mianowanego roztworu zasady lub kwasu oraz w postaci tabeli.

Metody spektrofotometryczne

Absorbancję i pH zestawia się w tabeli dla każdego widma. Na podstawie pośrednich punktów danych widma oblicza się co najmniej pięć wartości pKa, a także średnią i odchylenie standardowe tych wyników.

Metoda konduktometryczna

Przewodność równoważnikową Λ oblicza się dla każdego stężenia kwasu i dla każdego stężenia mieszaniny złożonej z jednego równoważnika kwasu oraz równoważnika wodorotlenku sodu niezawierającego węglanów w ilości 0,98. Kwas jest w nadmiarze, aby zapobiec nadmiarowi OH w wyniku hydrolizy. 1/Λ zestawia się na wykresie z C, a Λo soli można otrzymać przez ekstrapolację do stężenia zerowego.

Λo kwasu można obliczyć, korzystając z dostępnych w literaturze wartości H+ i Na+. Wartość pKa można wyliczyć ze wzoru α = Λio i Ka = α2C/(1 – α) dla każdego stężenia. Lepsze wartości Ka można uzyskać, dokonując korekt o ruchliwość i aktywność. Należy obliczyć średnią i odchylenia standardowe wartości pKa.

Sprawozdanie z badania

Wszystkie dane pierwotne i obliczone wartości pKa należy przedłożyć wraz z metodą obliczania (najlepiej w formie tabeli, jak zasugerowano w pozycji (1) bibliografii), podobnie jak opisane powyżej parametry statystyczne. W przypadku metod miareczkowych należy przedstawić szczegółowe informacje na temat mianowania titrantów.

W przypadku metody spektrofotometrycznej należy przedstawić wszystkie widma. W przypadku metody konduktometrycznej należy przedstawić szczegółowe informacje na temat wyznaczania stałej komórkowej. Należy przedstawić informacje na temat zastosowanej techniki, metod analitycznych i charakteru wszelkich wykorzystywanych roztworów buforowych.

Należy podać temperaturę(-y) przeprowadzania badania.

BIBLIOGRAFIA

(1)

Albert, A. i Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., Nowy Jork, 1962.

(2)

Nelson, N.H. i Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, s. 1186–1188 (1969).

(3)

ASTM D 1293 – Annual ASTM Standards, Filadelfia, 1974.

(4)

Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, wydanie 14., Amerykańskie Stowarzyszenie Zdrowia Publicznego, Waszyngton, 1976.

(5)

Clark, J. i Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (Londyn) 281, (marzec 1973 r.).

(6)

ASTM D 1125 – Annual ASTM Standards, Filadelfia, 1974.

(7)

Standard Method 205 – APHA/AWWA/NPCF (zob. Powyżej (4)).

(8)

Handbook of Chemistry and Physics, wydanie 60. CRC-Press, Boca Raton, Floryda, 33431 (1980).”

2)

w części B rozdział B.5 otrzymuje brzmienie:

„B.5   DZIAŁANIE ŻRĄCE / SILNIE DRAŻNIĄCE NA OCZY

WPROWADZENIE

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD (TG) nr 405 (2012). Okresowo dokonuje się przeglądu wytycznych OECD dotyczących badania substancji chemicznych w celu zagwarantowania, że odzwierciedlają one najlepszą dostępną wiedzę naukową. W poprzednich przeglądach przedmiotowej wytycznej dotyczącej badań szczególną uwagę poświęcono możliwym ulepszeniom, dokonując oceny wszystkich dostępnych informacji na temat badanej substancji chemicznej w celu uniknięcia niepotrzebnych badań na zwierzętach laboratoryjnych i tym samym usunięcia wątpliwości związanych z dobrostanem zwierząt. Wytyczna TG nr 405 (przyjęta w 1981 r. i zaktualizowana w latach 1987, 2002 i 2012) obejmuje zalecenie, aby przed rozpoczęciem opisywanego badania działania żrącego / silnie drażniącego na oczy in vivo przeprowadzić analizę wagi dowodów (1) na istniejących odpowiednich danych. Jeżeli dostępne dane są niewystarczające, zaleca się opracowanie takich danych za pomocą badań sekwencyjnych (2)(3). Strategia takich badań obejmuje przeprowadzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vitro i stanowi dodatek do niniejszej metody badawczej. Do celów rozporządzenia (WE) nr 1907/2006 w sprawie rejestracji, oceny, udzielania zezwoleń i stosowanych ograniczeń w zakresie chemikaliów (REACH) (2) w odnośnym poradniku ECHA uwzględnia się również zintegrowaną strategię badań (21). Badania na zwierzętach należy przeprowadzać tylko wtedy, gdy zostaną uznane za konieczne po rozważeniu dostępnych metod alternatywnych, a korzystanie z nich zostanie uznane za właściwe. W momencie sporządzania niniejszej zaktualizowanej metody badawczej istnieją przypadki, w których zastosowanie tej metody jest nadal konieczne lub wymagane zgodnie z niektórymi ramami regulacyjnymi.

Najnowsza aktualizacja dotyczyła głównie wykorzystania leków przeciwbólowych i środków znieczulających i nie miała wpływu na podstawowe założenia i strukturę wytycznej dotyczącej badań. ICCVAM (3) oraz niezależny międzynarodowy panel naukowy ds. wzajemnej oceny dokonały przeglądu przydatności i ograniczeń związanych z rutynowym stosowaniem środków znieczulających miejscowo, leków przeciwbólowych o działaniu ogólnoustrojowym, a także humanitarnego zakończenia procedur podczas badań działania drażniącego na oczy in vivo (12). W wyniku przeglądu stwierdzono, że stosowanie środków znieczulających miejscowo i leków przeciwbólowych o działaniu ogólnoustrojowym mogłoby pozwolić częściowo lub całkowicie wyeliminować ból i stres, nie wpływając na wyniki badania, oraz zalecono, aby substancje te były zawsze stosowane. W niniejszej metodzie badawczej uwzględniono ten przegląd. Należy rutynowo stosować środki znieczulające miejscowo, leki przeciwbólowe o działaniu ogólnoustrojowym i humanitarne zakończenie procedur w trakcie badania działania żrącego i silnie drażniącego na oczy in vivo. Wyjątki od ich stosowania należy uzasadnić. Udoskonalenia opisane w niniejszej metodzie znacząco zmniejszą lub wyeliminują ból i stres zwierząt podczas większości badań w przypadkach, w których badania bezpieczeństwa dla oczu in vivo są nadal konieczne.

Zrównoważone prewencyjne przeciwdziałanie bólowi powinno obejmować (i) rutynowe podawanie środku znieczulającego miejscowo (np. proparakainy lub tetrakainy) i leku przeciwbólowego o działaniu ogólnoustrojowym (np. buprenorfiny) przed podaniem substancji chemicznej, (ii) rutynowe podawanie środka przeciwbólowego o działaniu ogólnoustrojowym (np. buprenorfiny i meloksykamu) po podaniu substancji chemicznej, (iii) zaplanowane obserwacje, monitorowanie i nagrywanie zwierząt w celu zaobserwowania klinicznych objawów bólu lub stresu oraz (iv) zaplanowane obserwacje, monitorowanie i odnotowywanie charakteru, dotkliwości i postępowania wszystkich urazów oczu. Więcej szczegółowych informacji przedstawiono w zaktualizowanych procedurach opisanych poniżej. Po podaniu badanej substancji chemicznej nie należy podawać żadnych dodatkowych środków znieczulających miejscowo ani leków przeciwbólowych w celu uniknięcia zakłócenia badania. Nie należy stosować miejscowo leków przeciwbólowych o działaniu przeciwzapalnym (np. meloksykamu), a stosowane dawki leków o działaniu ogólnoustrojowym nie powinny zakłócać skutków dla oczu.

Definicje zamieszczono w dodatku do metody badawczej.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE

Z uwagi na dobrze pojęty interes nauki i dobrostan zwierząt nie należy rozważać przeprowadzania badań in vivo, dopóki wszystkie dostępne dane na temat potencjalnego żrącego/drażniącego działania substancji chemicznej na oczy nie zostaną ocenione w ramach analizy wagi dowodów. Tego rodzaju dane obejmują dowody z badań wykonanych na ludziach lub zwierzętach laboratoryjnych, dowody na działanie żrące/drażniące na oczy jednej substancji lub większej liczby strukturalnie powiązanych substancji lub mieszanin takich substancji, dane wskazujące na silną kwasowość lub zasadowość substancji chemicznej (4) (5) oraz wyniki zweryfikowanych i zaakceptowanych badań działania żrącego na skórę i działania żrącego/drażniącego na oczy in vitro lub ex vivo (6) (13) (14) (15) (16) (17). Takie badania mogą zostać przeprowadzone przed analizą wagi dowodów lub w jej następstwie.

W przypadku niektórych substancji chemicznych taka analiza może wskazywać na potrzebę przeprowadzenia badań potencjału działania żrącego/drażniącego substancji chemicznej na oczy in vivo. We wszystkich takich przypadkach, przed rozważeniem zastosowania badania na oczach in vivo, najlepszym rozwiązaniem byłoby przeprowadzenie w pierwszej kolejności badania działania żrącego substancji chemicznej na skórę in vitro lub in vivo oraz przeprowadzenie oceny zgodnie ze strategią badań sekwencyjnych określoną w metodzie badawczej B.4 (7) lub zintegrowaną strategią badań opisaną w poradniku ECHA (21).

Strategię badań sekwencyjnych, która obejmuje przeprowadzenie zweryfikowanych badań działania żrącego/drażniącego na oczy in vitro lub ex vivo, załączono jako dodatek do niniejszej metody badawczej oraz, do celów rozporządzenia REACH, w poradniku ECHA (21). Zaleca się realizację takiej strategii badań przed podjęciem badań in vivo. W przypadku nowych substancji chemicznych zaleca się zastosowanie strategii badań sekwencyjnych do celów opracowania uzasadnionych naukowo danych na temat żrącego/drażniącego działania substancji chemicznej. W odniesieniu do istniejących substancji chemicznych, na temat których brak jest wystarczających danych co do ich działania żrącego/drażniącego na skórę i oczy, strategia ta może zostać wykorzystana w celu uzupełnienia luk w danych. Użycie innej strategii lub procedury badawczej bądź podjęcie decyzji o niezastosowaniu strategii badań sekwencyjnych wymaga uzasadnienia.

ZASADA BADANIA IN VIVO

Po wcześniejszym podaniu leku przeciwbólowego o działaniu ogólnoustrojowym i odpowiedniego znieczulenia miejscowego aplikuje się substancję chemiczną, która ma być badana, w pojedynczej dawce na jedno oko zwierzęcia doświadczalnego; drugie oko, na które nie podano substancji chemicznej, służy jako próba kontrolna. Stopień działania drażniącego/żrącego na oczy ocenia się poprzez ocenę zmian patologicznych spojówki, rogówki oraz tęczówki w określonych odstępach czasu. Inne zmiany w oku i niepożądane skutki ogólnoustrojowe są również opisywane w celu uzyskania kompletnej oceny skutków. Czas trwania badania powinien być wystarczający do oceny odwracalności lub nieodwracalności obserwowanych skutków.

Zwierzęta wykazujące oznaki silnego stresu lub bólu na którymkolwiek etapie badań lub oznaki zmian patologicznych kwalifikujące się do humanitarnego zakończenia procedury opisanego w niniejszej metodzie badawczej (zob. pkt 26) należy uśmiercić w sposób humanitarny, a substancję chemiczną należy odpowiednio ocenić. Kryteria podejmowania decyzji o uśmiercaniu zwierząt w stanie agonalnym lub cierpiących silny ból zostały określone w wytycznych OECD (8).

PRZYGOTOWANIA DO BADANIA IN VIVO

Wybór gatunku

Królik albinos jest preferowanym gatunkiem zwierząt laboratoryjnych. Wykorzystywane są zdrowe młode dorosłe króliki. W przypadku wykorzystania innych szczepów lub gatunków należy podać uzasadnienie.

Przygotowanie zwierząt

Obydwoje oczu zwierzęcia doświadczalnego wstępnie wybranego do badania należy zbadać na 24 godziny przed przystąpieniem do badań. Zwierzęta z objawami podrażnienia oczu, wad wzroku lub istniejących uszkodzeń rogówki nie powinny być wykorzystywane w badaniu.

Warunki utrzymywania i karmienia

Zwierzęta należy utrzymywać oddzielnie. Temperatura w pomieszczeniu dla zwierząt doświadczalnych powinna wynosić 20 °C (± 3 °C) w przypadku królików. Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 30 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza czasem czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne z zachowaniem cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Należy unikać nadmiernego natężenia światła. Do żywienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne z nieograniczonym dostępem do wody do picia.

PROCEDURA BADAWCZA

Stosowanie środków znieczulających miejscowo i leków przeciwbólowych o działaniu ogólnoustrojowym

Zaleca się stosowanie poniższych procedur w celu uniknięcia lub zminimalizowania bólu i stresu podczas procedur badania bezpieczeństwa dla oczu. Można skorzystać z procedur alternatywnych, które opracowano w celu zapewnienia tak samo dobrych, a nawet lepszych sposobów na uniknięcie bólu i stresu lub ich uśmierzenie.

Sześćdziesiąt minut przed podaniem badanej substancji chemicznej za pomocą wstrzyknięcia podskórnego podaje się buprenorfinę w ilości 0,01 mg/kg w celu uzyskania terapeutycznego poziomu ogólnoustrojowego działania przeciwbólowego. Z dostępnych danych wynika, że buprenorfina i inne podobne opioidowe leki przeciwbólowe podawane ogólnoustrojowo nie powodują zmiany reakcji oczu ani nie oczekuje się, że spowodują taką zmianę (12).

Pięć minut przed podaniem badanej substancji chemicznej na każde oko podaje się jedną kroplę lub dwie krople środka znieczulającego miejscowo (np. 0,5-proc. chlorowodorku proparakainy lub 0,5-proc. chlorowodorku tetrakainy). Aby uniknąć możliwego zakłócenia badania, zaleca się stosowanie środka znieczulającego miejscowo, który nie zawiera konserwantów. Oko każdego zwierzęcia, na które zamiast badanej substancji chemicznej podaje się środek znieczulający miejscowo, służy jako próba kontrolna. Jeżeli przewiduje się, że badana substancja chemiczna spowoduje silny ból i stres, danego zwierzęcia nie należy zasadniczo poddawać badaniu in vivo. W przypadku wątpliwości lub gdy badanie jest konieczne, należy rozważyć jednak dodatkowe zastosowania środka znieczulającego miejscowo w odstępach pięciominutowych przed podaniem badanej substancji chemicznej. Użytkownicy powinni mieć świadomość, że wielokrotne zastosowania środków znieczulających miejscowo mogą potencjalnie spowodować nieznaczne spotęgowanie działania drażniącego lub wydłużenie czasu potrzebnego do ustąpienia zmian patologicznych wywołanych substancją chemiMetodę badawczą BCOP można wykorzystać do identyfikowania substancji chemicznychczną.

Osiem godzin po podaniu badanej substancji chemicznej za pomocą wstrzyknięcia podskórnego podaje się buprenorfinę w dawce 0,01 mg/kg i meloksykam w dawce 0,5 mg/kg w celu zapewnienia ciągłego terapeutycznego poziomu ogólnoustrojowego działania przeciwbólowego. Chociaż brakuje danych wskazujących, że meloksykam ma działanie przeciwzapalne na oczy, gdy jest podawany raz dziennie przez wstrzyknięcie podskórne, nie należy podawać go co najmniej 8 godzin po podaniu badanej substancji chemicznej w celu uniknięcia ewentualnego możliwego zakłócenia badania (12).

Po ośmiu godzinach od podania badanej substancji chemicznej co 12 godzin należy wstrzykiwać podskórnie buprenorfinę w dawce 0,01 mg/kg w połączeniu z meloksykamem w dawce 0,5 mg/kg podawanym co 24 godziny do czasu ustąpienia zmian patologicznych oczu oraz klinicznych objawów bólu i stresu. Dostępne są leki przeciwbólowe o przedłużonym uwalnianiu, których stosowanie można rozważyć w celu zmniejszenia częstotliwości dawkowania leków przeciwbólowych.

Analgezję „ratunkową” należy zastosować niezwłocznie po podaniu badanej substancji chemicznej, jeżeli analgezja prewencyjna i znieczulenie miejscowe są niewystarczające. Jeżeli zwierzę wykazuje objawy bólu i stresu w trakcie badania, należy niezwłocznie wstrzyknąć podskórnie „ratunkową” dawkę buprenorfiny w ilości 0,03 mg/kg, a następnie powtarzać w razie potrzeby nawet co 8 godzin zamiast dawki 0,01 mg/kg wstrzykiwanej podskórnie co 12 godzin. Meloksykam w dawce 0,5 mg/kg wstrzykuje się podskórnie co 24 godziny w połączeniu z „ratunkową” dawką buprenorfiny, ale nie wcześniej niż po upływie co najmniej 8 godzin od podania badanej substancji chemicznej.

Podawanie badanej substancji chemicznej

Badaną substancję chemiczną należy umieścić na spojówce jednego oka każdego ze zwierząt po delikatnym odsunięciu dolnej powieki z gałki ocznej. Następnie powieki łagodnie przytrzymuje się zamknięte przez mniej więcej jedną sekundę, aby zapobiec utracie materiału. Drugie oko, na które nie podano substancji chemicznej, służy jako próba kontrolna.

Nawilżanie

Oczu zwierząt doświadczalnych nie należy przepłukiwać przez co najmniej 24 godziny po wkropleniu badanej substancji chemicznej, z wyjątkiem badania substancji stałych (zob. pkt 18) i przypadków natychmiastowego działania żrącego lub drażniącego. W stosownych przypadkach po 24 godzinach można przepłukać oczy.

Nie zaleca się stosowania grupy satelitarnej zwierząt w celu zbadania wpływu przepłukiwania, chyba że ma to uzasadnienie naukowe. Jeżeli grupa satelitarna jest potrzebna, należy użyć dwóch królików. Warunki przepłukiwania powinny być dokładnie dokumentowane, np. czas przepłukiwania; skład i temperatura roztworu do przepłukiwania; czas trwania, objętość i szybkość aplikowania.

Poziom dawki

1)   Badanie cieczy

W badaniu cieczy stosuje się dawkę o objętości 0,1 ml. Nie należy stosować urządzenia rozpylającego do aplikowania substancji chemicznej bezpośrednio na oko. W przypadku aerozolu ciecz należy najpierw rozpylić i zebrać w zbiorniku przed zaaplikowaniem jej na oko w ilości 0,1 ml.

2)   Badanie substancji stałych

W badaniu substancji stałych, past i cząstek substancji chemicznych stosowana ilość powinna mieć objętość 0,1 ml lub wagę nie większą niż 100 mg. Badaną substancję chemiczną należy zmielić do uzyskania postaci sproszkowanej. Objętość substancji stałej należy mierzyć po delikatnym zbiciu, np. poprzez ostukanie pojemnika pomiarowego. Jeżeli badana substancja chemiczna w postaci stałej nie została usunięta z oka zwierzęcia doświadczalnego w wyniku działania mechanizmów fizjologicznych w pierwszym punkcie czasowym obserwacji po upływie godziny od jej podania, oko można przepłukać roztworem soli fizjologicznej lub wodą destylowaną.

3)   Badanie aerozoli

Zaleca się, aby wszystkie urządzenia rozpylające i aerozole zostały zebrane przed rozpoczęciem wkraplania do oka. Wyjątek stanowią substancje chemiczne w aerozolach znajdujące się w pojemnikach pod ciśnieniem, których nie można zebrać z powodu parowania. W takich przypadkach należy przytrzymać oko w pozycji otwartej i zaaplikować badaną substancję chemiczną do oka jednym psiknięciem trwającym około sekundy z odległości 10 cm prostopadle do oka. Odległość ta może się różnić w zależności od ciśnienia w rozpylaczu i jego zawartości. Należy uważać, aby nie doszło do uszkodzenia oka z powodu ciśnienia w rozpylaczu. W odpowiednich przypadkach może być niezbędna ocena możliwości potencjalnego „mechanicznego” uszkodzenia oka spowodowanego siłą rozpylacza.

Oszacowac dawkę aerozolu można, wykonując następującą symulację badania: substancja chemiczna jest rozpylana na papierku wagowym przez otwór o rozmiarze oka królika znajdujący się bezpośrednio przed papierkiem. Przyrost wagi papierka wykorzystuje się do określenia przybliżonej ilości rozpylonej na oko. W przypadku lotnych substancji chemicznych wielkość dawki można oszacować poprzez zważenie pojemnika odbiorczego przed usunięciem i po usunięciu badanej substancji chemicznej.

Badanie wstępne (badanie działania drażniącego/żrącego na oczy in vivo z wykorzystaniem jednego zwierzęcia)

Zaleca się, aby badanie in vivo wstępnie wykonywano z wykorzystaniem jednego zwierzęcia (zob. dodatek do niniejszej metody badawczej: Strategia badań sekwencyjnych działania drażniącego i żrącego na oczy). Obserwacje powinny umożliwić określenie dotkliwości i odwracalności zmian przed przystąpieniem do badania potwierdzającego na drugim zwierzęciu.

Jeżeli wyniki tego badania wskazują, że substancja chemiczna jest żrąca lub silnie drażniąca dla oka przy zastosowaniu opisanej procedury, należy zaprzestać dalszego badania działania drażniącego na oczy.

Badanie potwierdzające (badanie działania drażniącego na oczy in vivo z wykorzystaniem dodatkowych zwierząt)

W przypadku niezaobserwowania działania żrącego lub silnie drażniącego na oczyw badaniu wstępnym reakcję w postaci działania drażniącego lub reakcję ujemną należy potwierdzić przy wykorzystaniu maksymalnie dwóch dodatkowych zwierząt. W przypadku stwierdzenia działania drażniącego w badaniu wstępnym zaleca się przeprowadzenie badania potwierdzającego w sposób sekwencyjny na każdym ze zwierząt z osobna, a nie narażanie obu dodatkowych zwierząt na działanie badanej substancji jednocześnie. Jeżeli badanie na drugim zwierzęciu ujawni działanie żrące lub silnie drażniące na oczy, badanie nie będzie kontynuowane. Jeżeli wyniki badania drugiego zwierzęcia są wystarczające, aby ustalić klasyfikację pod względem zagrożeń, wówczas nie należy prowadzić żadnych dalszych badań.

Okres obserwacji

Okres obserwacji powinien być wystarczająco długi, aby można było w pełni ocenić siłę i odwracalność obserwowanych skutków. Należy jednak przerwać doświadczenie w momencie, gdy zwierzę wykazuje objawy silnego bólu lub stresu (8). W celu określenia odwracalności skutków zwierzęta należy co do zasady obserwować przez 21 dni po podaniu badanej substancji chemicznej. Jeżeli odwracalność zostanie zaobserwowana przed upływem 21 dni, doświadczenie należy przerwać w tym momencie.

Obserwacje kliniczne i ocena punktowa reakcji oka

Oczy należy dokładnie ocenić pod kątem wystąpienia lub braku zmian patologicznych oczu godzinę po podaniu badanej substancji chemicznej, a następnie należy przeprowadzać takie oceny co najmniej raz dziennie. Zwierzęta należy oceniać kilka razy dziennie przez pierwsze trzy dni, aby upewnić się, że decyzje o przerwaniu badania zostaną podjęte w odpowiednim momencie. Zwierzęta doświadczalne są rutynowo poddawane ocenie przez cały czas trwania badania pod kątem klinicznych objawów bólu lub stresu (np. powtarzające się drapanie lub pocieranie oka, nadmierne mruganie, nadmierne łzawienie) (9) (10) (11), co najmniej dwa razy dziennie, z minimum sześciogodzinnym odstępem między obserwacjami lub częściej w razie potrzeby. Jest to konieczne, aby (i) właściwie ocenić zwierzęta pod kątem wystąpienia bólu i stresu w celu podjęcia świadomych decyzji dotyczących konieczności zwiększenia dawki leków przeciwbólowych oraz aby (ii) ocenić zwierzęta pod kątem dowodów na ustalone humanitarne zakończenie procedury w celu podjęcia świadomych decyzji, czy humanitarne uśmiercenie zwierząt jest właściwym rozwiązaniem, oraz w celu zapewnienia podejmowania takich decyzji w odpowiednim momencie. Wybarwienie fluoresceiną należy stosować rutynowo, a biomikroskop z lampą szczelinową należy stosować w odpowiednich przypadkach (np. przy ocenianiu dotkliwości obrażenia w sytuacji wystąpienia owrzodzenia rogówki) jako wsparcie w wykrywaniu i mierzeniu uszkodzenia oka oraz w celu oceny, czy ustalone kryteria zakończenia procedury w odniesieniu do humanitarnego uśmiercania zostały spełnione. Cyfrowe fotografie zaobserwowanych zmian patologicznych można gromadzić w celach informacyjnych oraz aby zapewnić stałe rejestrowanie skali uszkodzenia oka. Zwierzęta nie powinny być poddawane badaniu dłużej niż to konieczne po uzyskaniu ostatecznych informacji. Zwierzęta wykazujące objawy silnego bólu lub stresu należy bezzwłocznie uśmiercić w sposób humanitarny, a substancję chemiczną należy odpowiednio ocenić.

Zwierzęta, u których po podaniu substancji chemicznej wystąpiły następujące zmiany patologiczne oczu, należy uśmiercić w sposób humanitarny (opis stopni zmian patologicznych znajduje się w tabeli 1): perforacja lub znaczące owrzodzenie rogówki, w tym garbiak; krwawienie z przedniej komory oka; zmętnienia rogówki stopnia 4; brak reakcji na światło (zmiany w tęczówce stopnia 2) utrzymujący się przez 72 godziny; owrzodzenie błony spojówkowej; martwica spojówek lub fałdu półksiężycowatego spojówki; lub tworzenie się strzępów tkanki martwiczej. Wynika to z faktu, że tego typu zmiany patologiczne są na ogół nieodwracalne. Ponadto zaleca się, aby w przypadku wystąpienia zmian patologicznych oczu stosowano humanitarne zakończenie procedury w celu przerwania badań przed zakończeniem planowanego 21-dniowego okresu obserwacji. Uznaje się, że następujące zmiany patologiczne są sygnałem uszkodzeń oka w wyniku działania silnie drażniącego lub żrącego na oczy oraz uszkodzeń, co do których nie oczekuje się, że całkowicie ustąpią do końca 21-dniowego okresu obserwacji: poważne uszkodzenie (np. owrzodzenie rogówki wykraczające poza powierzchniowe warstwy podskórne), zniszczenie rąbka spojówki >50 % (o czym świadczy zbielenie tkanki spojówkowej) oraz poważne zakażenie oka (ropna wydzielina). Połączenie: unaczynienia powierzchni rogówki (tj. łuszczki); powierzchni wybarwienia fluoresceiną, która nie zmniejsza się z czasem na podstawie codziennej oceny; lub braku ponownego nabłonkowania po upływie 5 dni od podania badanej substancji chemicznej także można uznać za potencjalnie użyteczne kryteria, które wpływają na decyzję kliniczną w sprawie wcześniejszego zakończenia badania. Powyższe ustalenia z osobna są jednak niewystarczające do uzasadnienia wcześniejszego zakończenia badania. Po zidentyfikowaniu poważnych skutków dla oczu należy skonsultować się z uczestniczącym w badaniu lub wykwalifikowanym lekarzem weterynarii zajmującym się zwierzętami laboratoryjnymi lub z personelem przeszkolonym w identyfikowaniu klinicznych zmian patologicznych, aby przeprowadzić badanie kliniczne w celu ustalenia, czy połączenie tych skutków uzasadnia wcześniejsze zakończenie badania. Należy określić i odnotować stopnie reakcji oka (spojówki, rogówki i tęczówki) po upływie 1, 24, 48 i 72 godzin od podania badanej substancji chemicznej (tabela 1). Zwierzęta, u których nie wystąpiły zmiany patologiczne oczu, mogą zostać uśmiercone nie wcześniej niż po upływie 3 dni od zaaplikowania substancji. Zwierzęta, u których wystąpiły zmiany patologiczne oczu, które nie są poważne, powinny przebywać pod obserwacją do czasu ustąpienia zmian lub przez 21 dni, po upływie których badanie zostaje zakończone. Obserwacje należy prowadzić i odnotowywać co najmniej po upływie 1, 24, 48 i 72 godzin oraz 7, 14 i 21 dni w celu określenia statusu zmian patologicznych oraz ich odwracalności lub nieodwracalności. W razie konieczności należy prowadzić częstsze obserwacje w celu określenia, czy zwierzę doświadczalne należy uśmiercić ze względów humanitarnych lub wykluczyć z badania z powodu wyników ujemnych.

Po każdym badaniu należy zapisać oceny punktowe zmian patologicznych oczu (tabela 1). Należy również odnotowywać wszelkie inne zmiany patologiczne oczu (np. łuszczka, wybarwienie, zmiany w przedniej komorze) lub niepożądane skutki ogólnoustrojowe.

Badanie reakcji można ułatwić dzięki zastosowaniu lupy dwuokularowej, ręcznej lampy szczelinowej, biomikroskopu lub innego odpowiedniego narzędzia. Po odnotowaniu obserwacji przeprowadzonych po upływie 24 godzin oczy można poddawać dalszym badaniom za pomocą fluoresceiny.

Ocena punktowa reakcji oka jest z konieczności subiektywna. Aby ujednolicić ocenę punktową reakcji oka oraz pomóc laboratoriom badawczym i osobom biorącym udział w przeprowadzaniu i interpretowaniu obserwacji, należy odpowiednio przeszkolić personel przeprowadzający obserwacje w zakresie stosowanego systemu oceny punktowej reakcji.

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Ocena wyników

Oceny punktowe działania drażniącego na oczy należy analizować w połączeniu z charakterem i dotkliwością zmian patologicznych oraz ich odwracalnością lub brakiem odwracalności. Poszczególne oceny punktowe nie stanowią normy bezwzględnej właściwości drażniących danej substancji chemicznej, ponieważ ocenie poddawane są również inne skutki działania badanej substancji chemicznej. Ewentualnie poszczególne oceny punktowe należy postrzegać jako wartości odniesienia, które mają znaczenie tylko wtedy, gdy są poparte pełnym opisem i oceną wszystkich obserwacji.

Sprawozdanie z badania

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:

 

Uzasadnienie badań in vivo: analiza wagi dowodów dotycząca istniejących już danych na temat badania, w tym wyniki badań sekwencyjnych:

opis odpowiednich danych dostępnych z uprzednio przeprowadzonych badań;

dane uzyskane na każdym etapie strategii badań;

opis przeprowadzonych badań in vitro, w tym szczegółowe dane na temat procedur, wyników otrzymanych z zastosowaniem badanych substancji chemicznych / substancji chemicznych odniesienia;

opis przeprowadzonych badań działania drażniącego/żrącego na skórę in vivo, wraz z otrzymanymi wynikami;

analiza wagi dowodów dla celów przeprowadzenia badania in vivo.

 

Badana substancja chemiczna:

dane identyfikacyjne (np. nazwa systematyczna i, jeżeli jest dostępny, numer CAS, czystość, znane zanieczyszczenia, źródło, numer partii);

stan skupienia i właściwości fizykochemiczne (np. pH, lotność, rozpuszczalność, stabilność, reaktywność w kontakcie z wodą);

w przypadku mieszaniny należy określić składniki, w tym dane identyfikacyjne składowych substancji (np. nazwy systematyczne oraz, jeżeli są dostępne, numery CAS) i ich stężenia;

stosowana dawka.

 

Nośnik:

dane identyfikacyjne, stężenie (w stosownych przypadkach), użyta objętość;

uzasadnienie wyboru nośnika.

 

Zwierzęta doświadczalne:

wykorzystany gatunek/szczep, uzasadnienie wykorzystania zwierząt innych niż królik albinos;

wiek każdego zwierzęcia na początku badania;

liczba zwierząt każdej płci w grupie badanej i grupach kontrolnych (jeżeli są wymagane);

masa ciała każdego zwierzęcia na początku i na końcu badania;

źródło, warunki utrzymywania, pasza itp.

 

Środki znieczulające i leki przeciwbólowe

dawki i godziny podawania środków znieczulających miejscowo i leków przeciwbólowych o działaniu ogólnoustrojowym;

jeżeli zastosowano środek znieczulający miejscowo – dane identyfikacyjne, czystość, rodzaj i potencjalne interakcje z badaną substancją chemiczną.

 

Wyniki:

opis metody zastosowanej do oceny punktowej działania drażniącego w każdym punkcie czasowym obserwacji (np. ręczna lampa szczelinowa, biomikroskop, fluoresceina);

tabela danych dotyczących wywołania działania drażniącego/żrącego dla każdego zwierzęcia w każdym punkcie czasowym obserwacji aż do momentu usunięcia każdego zwierzęcia z badania;

opis stopnia i charakteru obserwowanego działania drażniącego lub żrącego;

opis wszelkich innych zmian patologicznych zaobserwowanych w oku (np. unaczynienie, formowanie łuszczki, zrosty, wybarwienie);

opis miejscowych i ogólnoustrojowych niekorzystnych skutków niezwiązanych z oczami, zapis klinicznych objawów bólu i stresu, fotografie cyfrowe i wyniki ewentualnego badania histopatologicznego.

 

Omówienie wyników

Interpretacja wyników

Ekstrapolacja wyników badań działania drażniącego na oczy zwierząt laboratoryjnych na ludzi jest zasadna tylko w ograniczonym stopniu. W wielu przypadkach królik albinos jest bardziej wrażliwy niż ludzie na działanie drażniące lub żrące na oczy.

Przy interpretacji danych należy pamiętać o wykluczeniu działania drażniącego na oczy będącego wynikiem infekcji wtórnej.

BIBLIOGRAFIA

(1)

Barratt, M.D., et al. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, sprawozdanie nr 8 z warsztatów ECVAM, ATLA 23, 410–429.

(2)

de Silva, O., et al. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35, 159–164.

(3)

Worth A.P. i Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161–177.

(4)

Young, J.R., et al. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.

(5)

Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.

(6)

Fentem, J.H., et al. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, s. 483–524.

(7)

Rozdział B.4 niniejszego załącznika, Ostre działanie drażniące/żrące na skórę.

(8)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, seria OECD dotycząca badań i oceny nr 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

(9)

Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, maj/czerwiec, 20–36.

(10)

Krajowa Rada ds. Badań (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Waszyngton, D.C.: The National Academies Press.

(11)

Krajowa Rada ds. Badań (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Waszyngton, D.C.: The National Academies Press.

(12)

ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, publikacja NIH nr 10-7514, Research Triangle Park, Karolina Północna, Stany Zjednoczone Ameryki: National Institute of Environmental Health Sciences.

http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm

(13)

Rozdział B.40 niniejszego załącznika, Badanie działania żrącego na skórę in vitro: test przezskórnej oporności elektrycznej (TER)

(14)

Rozdział B.40a niniejszego załącznika, Badanie działania żrącego na skórę in vitro: badanie modelu skóry ludzkiej.

(15)

OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, Wytyczne OECD dotyczące badania substancji chemicznych, sekcja 4, OECD Paryż.

(16)

Rozdział B.47 niniejszego załącznika, Metoda badania zmętnienia i przepuszczalności rogówki u bydła do celów identyfikacji (i) substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu oraz (ii) substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania jako substancje drażniące oczy lub powodujące poważne uszkodzenie oczu.

(17)

Rozdział B.48 niniejszego załącznika, Metoda badania na izolowanym oku kurzym do celów identyfikacji (i) substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu oraz (ii) substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania jako substancje drażniące oczy lub powodujące poważne uszkodzenie oczu.

(18)

Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych (2003). Label Review Manual: wyd. III. EPA737-B-96-001, Waszyngton, D.C.: Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych.

(19)

ONZ (2011), Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS), wydanie czwarte zmienione, Nowy Jork i Genewa: publikacje Organizacji Narodów Zjednoczonych.

(20)

WE (2008), rozporządzenie Parlamentu Europejskiego i Rady (WE) nr 1272/2008 z dnia 16 grudnia 2008 r. w sprawie klasyfikacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin, zmieniające i uchylające dyrektywy 67/548/EWG i 1999/45/WE oraz zmieniające rozporządzenie (WE) nr 1907/2006. Dziennik Urzędowy Unii Europejskiej L 353, s. 1–1355.

(21)

Poradnik ECHA dotyczący wymagań w zakresie informacji i oceny bezpieczeństwa chemicznego, rozdział R.7a: Wytyczne dotyczące punktów końcowych.

http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf

Tabela 1

Ocena punktowa zmian patologicznych oka

Rogówka

Ocena punktowa

Zmętnienie: Stopień gęstości (odczyt powinien dotyczyć obszaru o największej gęstości) (*1)

 

Brak owrzodzenia lub zmętnienia

0

Rozrzucone lub rozmyte obszary zmętnienia (inne niż lekkie zmatowienie normalnego połysku); wyraźnie widoczne elementy tęczówki

1

Łatwo zauważalny obszar półprzezroczysty; lekko zaciemnione elementy tęczówki

2

Obszary o kolorze perłowym; brak widocznych elementów tęczówki; rozmiar źrenicy zwierzęcia trudny do określenia

3

Zmatowienie rogówki; tęczówka niewidoczna z powodu zmętnienia

4

Maksymalna możliwa liczba punktów: 4

 

Tęczówka

 

w normie

0

Znacząco pogłębiona fałda, przekrwienie, opuchlizna, umiarkowane przekrwienie okołorogówkowe; lub wstrzyknięcie; tęczówka reaguje na światło (przyjmuje się, że powolna reakcja stanowi skutek)

1

Krwotok, silne zniszczenia, lub brak reakcji na światło

2

Maksymalna możliwa liczba punktów: 2

 

Spojówka

 

Zaczerwienienie (dotyczy spojówki powiekowej i gałkowej; wyłączając rogówkę i tęczówkę)

 

w normie

0

Niektóre naczynia krwionośne przekrwione (po wstrzyknięciu)

1

Rozmycie, kolor karmazynowy; pojedyncze naczynia trudno widoczne

2

Rozmycie, kolor mięsa czerwonego

3

Maksymalna możliwa liczba punktów: 3

 

Obrzęk spojówki

 

Opuchlizna (dotyczy powiek i/lub fałdu półksiężycowatego spojówki)

 

w normie

0

Niewielka opuchlizna powyżej normy

1

Widoczna opuchlizna z częściowym wywinięciem powieki

2

Opuchlizna, z powiekami zamkniętymi w połowie

3

Opuchlizna, z powiekami zamkniętymi więcej niż w połowie

4

Maksymalna możliwa liczba punktów: 4

 

Dodatek

DEFINICJE

Rezerwa kwasowo/zasadow : w przypadku preparatów kwasowych jest to ilość (w g) wodorotlenku sodu na 100 g preparatu wymagana do osiągnięcia określonego pH. W przypadku preparatów zasadowych jest to ilość (w g) wodorotlenku sodu odpowiadająca ilości kwasu siarkowego (w g) na 100 g preparatu wymagana do osiągnięcia określonego pH (Young et al. 1988).

Substancja chemiczna : substancja albo mieszanina.

Substancje niewykazujące działania drażniącego : substancje, które nie zostały zaklasyfikowane do kategorii I, II lub III EPA jako drażniące dla oczu; ani do kategorii 1, 2, 2A lub 2B wg GHS jako substancje drażniące dla oczu; lub do unijnej kategorii 1 lub 2 (17) (18) (19).

Substancja żrąca dla oczu : a) substancja chemiczna powodująca nieodwracalne uszkodzenie tkanki oka; b) substancje chemiczne zaklasyfikowane do kategorii 1 wg GHS jako drażniące dla oczu lub do kategorii I EPA jako drażniące dla oczu lub do unijnej kategorii 1 (17) (18) (19).

Substancja drażniąca dla oczu : a) substancja chemiczna, która powoduje odwracalną zmianę w oku; b) substancje chemiczne zaklasyfikowane do kategorii II lub III EPA jako drażniące dla oczu; lub do kategorii 2, 2A lub 2B wg GHS jako substancje drażniące dla oczu; lub do unijnej kategorii 2 (17) (18) (19).

Substancja silnie drażniąca dla oczu : a) substancja chemiczna powodująca uszkodzenie tkanki oka, które nie ustępuje w ciągu 21 dni od podania, lub powodująca poważne fizyczne pogorszenie widzenia; b) substancje chemiczne zaklasyfikowane do kategorii 1 wg GHS jako drażniące dla oczu lub do kategorii I EPA jako drażniące dla oczu lub do unijnej kategorii 1 (17) (18) (19).

Badana substancja chemiczna : dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.

Podejście zintegrowane : strategia badań sekwencyjnych, w ramach której wszystkie istniejące informacje na temat badanej substancji chemicznej są analizowane na każdym poziomie w określonym porządku z zastosowaniem procesu uwzględniającego wagę dowodów w celu określenia, czy dostępna jest wystarczająca ilość informacji do podjęcia decyzji o klasyfikacji zagrożenia, przed przejściem do następnego poziomu. Jeżeli na podstawie dostępnych informacji można przypisać badanej substancji chemicznej potencjał w zakresie wywołania podrażnienia, dodatkowe badania nie są wymagane. Jeżeli na podstawie dostępnych informacji nie można przypisać badanej substancji chemicznej potencjału w zakresie wywołania podrażnień, przeprowadza się procedurę badań sekwencyjnych na zwierzętach do momentu, w którym będzie można dokonać jednoznacznej klasyfikacji.

Waga dowodów (proces) : mocne i słabe strony zgromadzonych informacji wykorzystuje się jako podstawę do wyciągnięcia wniosku, który może nie wynikać ewidentnie z poszczególnych danych.

DODATEK DO METODY BADAWCZEJ B.5  (4)

STRATEGIA BADAŃ SEKWENCYJNYCH DZIAŁANIA DRAŻNIĄCEGO I ŻRĄCEGO NA OCZY

Uwagi ogólne

Zarówno w dobrze pojętym interesie nauki, jak i z uwagi na dobrostan zwierząt istotne jest uniknięcie niepotrzebnego wykorzystywania zwierząt oraz minimalizacja badań mogących powodować silne reakcje u zwierząt. Wszystkie informacje na temat substancji chemicznej istotne z punktu widzenia jej potencjalnego działania drażniącego lub żrącego na oczy powinny zostać poddane ocenie przed podjęciem badań in vivo. Możliwe jest, że istnieją wystarczające dowody pozwalające na sklasyfikowanie badanej substancji chemicznej jako potencjalnie drażniącej lub żrącej dla oczu, co sprawia, że przeprowadzanie badań na zwierzętach laboratoryjnych jest zbyteczne. Dlatego wykorzystanie analizy wagi dowodów oraz strategii badań sekwencyjnych zminimalizuje potrzebę prowadzenia badań in vivo, zwłaszcza jeżeli substancja chemiczna może powodować silne reakcje.

Zaleca się wykorzystanie analizy wagi dowodów celem oceny istniejących informacji dotyczących działania drażniącego i żrącego na oczy przez substancje chemiczne, a także celem stwierdzenia, czy należy przeprowadzić dodatkowe badania, inne niż badania oka in vivo, aby scharakteryzować takie potencjalne działanie substancji. Jeżeli niezbędne są dalsze badania, zaleca się realizowanie strategii badań sekwencyjnych celem uzyskania odpowiednich danych doświadczalnych. W odniesieniu do substancji, które nie posiadają historii badań, należy zastosować strategię badań sekwencyjnych w celu uzyskania danych potrzebnych do oceny ich działania żrącego/drażniącego na oczy. Strategię badań wstępnych opisaną w niniejszym dodatku opracowano podczas warsztatów OECD (1). Następnie została ona potwierdzona i rozszerzona w zharmonizowanym systemie klasyfikacji substancji chemicznych pod względem zagrożeń dla zdrowia ludzi i środowiska oraz zatwierdzona podczas 28. wspólnego posiedzenia Komitetu ds. Substancji Chemicznych i Grupy Roboczej ds. Substancji Chemicznych, które odbyło się w listopadzie 1998 r. (2), i zaktualizowana przez grupę ekspertów OECD w 2011 r.

Pomimo że niniejsza strategia badań nie jest integralną częścią metody badawczej B.5, utożsamia ona zalecane podejście do określania właściwości odpowiadających za działanie drażniące/żrące na oczy. Wspomniane podejście reprezentuje zarówno najlepszą praktykę, jak i wzorzec etyczny dla badań działania drażniącego/żrącego na oczy in vivo. Niniejsza metoda badawcza stanowi wytyczne dotyczące prowadzenia badań in vivo i określa czynniki, jakim należy poświęcić uwagę przed rozpoczęciem takich badań. Strategia badań sekwencyjnych określa podejście w zakresie wagi dowodów do oceny istniejących danych na temat właściwości substancji chemicznych odpowiadających za działanie drażniące/żrące na oczy oraz zintegrowane podejście do generowania odpowiednich danych dotyczących substancji chemicznych wymagających dodatkowych badań, lub takich, w odniesieniu do których nie przeprowadzono jak dotąd żadnych badań. W ramach tej strategii zaleca się przeprowadzenie zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vivo lub ex vivo, a dopiero w następnej kolejności zastosowanie metody badawczej B.4 w określonych okolicznościach (3) (4).

Opis strategii badań sekwencyjnych

Przed podjęciem badań w ramach strategii badań sekwencyjnych (rysunek) należy poddać ocenie wszystkie dostępne informacje w celu określenia potrzeby prowadzenia badań in vivo na oku. Chociaż z oceny pojedynczych parametrów (np. wartości skrajnych pH) można uzyskać istotne informacje, należy wziąć pod uwagę ogół istniejących informacji. Przy podejmowaniu decyzji dotyczącej wagi dowodów należy poddać ocenie wszystkie dane dotyczące skutków działania danej substancji chemicznej lub substancji analogicznych oraz należy przedstawić uzasadnienie podjętej decyzji. W pierwszej kolejności należy położyć nacisk na istniejące dane na temat działania substancji chemicznej na ludzi i zwierzęta, a następnie na wyniki badań in vitro lub ex vivo. O ile to możliwe, należy unikać badań in vivo substancji chemicznych o działaniu żrącym. Czynniki uwzględniane w omawianej strategii badań obejmują:

 

ocenę istniejących danych na temat ludzi lub zwierząt lub danych z badania in vitro uzyskanych na podstawie zweryfikowanych i zaakceptowanych na szczeblu międzynarodowym metod (etap 1).

W pierwszej kolejności należy wziąć pod uwagę istniejące dane dotyczące działania na ludzi, np. badania kliniczne lub analizy zawodowe, a także sprawozdania ze studiów przypadków lub dane pochodzące z badań przeprowadzonych na zwierzętach dotyczących działania na oczy lub dane pochodzące ze zweryfikowanych i zaakceptowanych na szczeblu międzynarodowym metod badań działania drażniącego/żrącego na oczy in vitro, ponieważ dostarczają informacji bezpośrednio związanych z oddziaływaniem na oczy. Następnie należy poddać ocenie dostępne dane uzyskane w wyniku badań prowadzonych na ludziach lub zwierzętach dotyczących działania żrącego/drażniącego na skórę lub badań in vitro opartych na zweryfikowanych i zaakceptowanych na szczeblu międzynarodowym metodach dotyczących działania żrącego na skórę. Substancje chemiczne, o których wiadomo, że wykazują działanie żrące lub silnie drażniące na oko, nie powinny być aplikowane do oczu zwierząt, podobnie jak substancje chemiczne o działaniu żrącym lub silnie drażniącym na skórę; takie substancje chemiczne należy również uznać za żrące lub drażniące dla oczu. Substancje chemiczne, wobec których istnieją wystarczające dowody, uzyskane w poprzednich badaniach okulistycznych, świadczące o braku działania żrącego i drażniącego, również nie powinny być poddawane badaniu in vivo na oku;

 

analizę zależności struktura-aktywność (SAR) (etap 2).

Należy uwzględnić wyniki badań strukturalnie powiązanych substancji chemicznych, o ile są one dostępne. W przypadku dostępności wystarczających danych na temat oddziaływania na ludzi lub zwierzęta substancji strukturalnie powiązanych lub mieszanin takich substancji, wskazujących na potencjał działania żrącego/drażniącego na oczy, można domniemywać, że badana substancja chemiczna spowoduje taką samą reakcję. W takich przypadkach badanie takiej substancji chemicznej może nie być konieczne. Wyniki ujemne badań dotyczących strukturalnie powiązanych substancji lub mieszanin takich substancji nie są wystarczającym dowodem na brak działania żrącego/drażniącego danej substancji chemicznej w świetle strategii badań sekwencyjnych. Ze zweryfikowanych i zaakceptowanych podejść SAR należy korzystać w celu zidentyfikowania potencjału działania żrącego i drażniącego na skórę i oczy;

 

właściwości fizykochemiczne i reaktywność chemiczną (etap 3).

Substancje chemiczne charakteryzujące się skrajnym pH, takim jak ≤ 2,0 lub ≥ 11,5, mogą mieć silne działanie miejscowe. Jeżeli takie skrajne pH jest podstawą do identyfikacji substancji chemicznej jako żrącej lub drażniącej dla oczu, wówczas można również uwzględnić jej rezerwę kwasowo/zasadową (tj. pojemność buforową) (5)(6)(7). Jeżeli pojemność buforowa wskazuje na to, że substancja chemiczna może nie być szkodliwa dla oka (tj. substancje chemiczne ze skrajnym pH i niską rezerwą kwasowo/zasadowa), należy przeprowadzić dalsze badania w celu potwierdzenia tej cechy, najlepiej przy użyciu zweryfikowanych i zaakceptowanych badań in vitro lub ex vivo (zob. pkt 10);

 

uwzględnienie innych istniejących informacji (etap 4).

Na tym etapie należy ocenić wszystkie dostępne informacje na temat toksyczności ogólnoustrojowej w kontakcie ze skórą. Ponadto należy uwzględnić ostrą toksyczność skórną powodowaną przez badaną substancję chemiczną. Jeżeli wykazano, że badana substancja chemiczna jest bardzo toksyczna w kontakcie ze skórą, badanie na oku może okazać się zbyteczne. Pomimo że zależność między ostrą toksycznością skórną a działaniem drażniącym/żrącym na oczy nie zawsze jest oczywista, można założyć, że jeśli czynnik jest bardzo toksyczny w kontakcie ze skórą, będzie wykazywał wysoką toksyczność po zaaplikowaniu na oko. Dane na ten temat mogą również zostać rozpatrzone pomiędzy etapami 2 i 3;

 

ocenę działania żrącego na skórę substancji chemicznej, o ile jest to wymagane do celów regulacyjnych (etap 5).

W pierwszej kolejności potencjał działania żrącego i silnie drażniącego na skórę należy ocenić zgodnie z metodą badawczą B.4 (4) i towarzyszącym jej dodatkiem (8), w tym z wykorzystaniem zweryfikowanych i zaakceptowanych na szczeblu międzynarodowym metod badania działania żrącego na skórę in vitro (9) (10) (11). Jeżeli okaże się, że substancja chemiczna ma działanie żrące lub silne drażniące na skórę, można również uznać, że jest żrąca lub silnie drażniąca dla oka. W związku z powyższym dalsze badania nie będą wymagane. Jeżeli substancja chemiczna nie działa żrąco ani silnie drażniąco na skórę, należy przeprowadzić badania na oku in vitro lub ex vivo;

 

wyniki uzyskane z badań in vitro lub ex vivo (etap 6).

Substancje chemiczne wykazujące właściwości żrące lub silnie drażniące w badaniach in vitro lub ex vivo (12) (13), które zostały zweryfikowane i zaakceptowane na szczeblu międzynarodowym na potrzeby oceny działania żrącego/drażniącego na skórę lub oko, nie muszą być badane na zwierzętach. Można założyć, że takie substancje chemiczne spowodują podobnie silne reakcje in vivo. Jeżeli zweryfikowane i zaakceptowane badania in vitro/ex vivo nie są dostępne, należy pominąć etap 6 i przejść bezpośrednio do etapu 7;

 

badania na królikach in vivo (etap 7 i 8):

badania na oczach in vivo powinny rozpoczynać się od badań wstępnych z wykorzystaniem jednego zwierzęcia. Jeżeli wyniki tych badań wskazują, że substancja chemiczna jest silnie drażniąca lub żrąca dla oczu, dalsze badania powinny zostać wstrzymane. Jeżeli badanie nie wykazuje żadnego działania żrącego ani silnie drażniącego, należy przeprowadzić badanie potwierdzające z wykorzystaniem dwóch dodatkowych zwierząt. W zależności od wyników badania potwierdzającego konieczne może być przeprowadzenie dalszych badań [zob. metoda badawcza B.5].

STRATEGIA BADAŃ I OCENY DZIAŁANIA DRAŻNIĄCEGO I ŻRĄCEGO NA OCZY

 

Działanie

Ustalenie

Wniosek

1

Istniejące dane na temat ludzi lub zwierząt lub dane z badania in vitro uzyskane na podstawie zweryfikowanych i zaakceptowanych na szczeblu międzynarodowym metod, które przedstawiają skutki dla oczu

Poważne uszkodzenie oczu

Szczytowy punkt końcowy; uznać substancję za żrącą dla oczu. Nie wymaga badań.

Działanie drażniące na oczy

Szczytowy punkt końcowy; uznać substancję za drażniącą dla oczu. Nie wymaga badań.

Brak działania żrącego/drażniącego na oczy

Szczytowy punkt końcowy; uznać brak działania żrącego i drażniącego dla oczu. Nie wymaga badań.

Istniejące dane na temat ludzi lub zwierząt lub dane z badania in vitro uzyskane na podstawie zweryfikowanych i zaakceptowanych na szczeblu międzynarodowym metod, które przedstawiają działanie żrące na skórę

Działanie żrące na skórę

Założyć działanie żrące na oczy. Nie wymaga badań.

Istniejące dane na temat ludzi lub zwierząt lub dane z badania in vitro uzyskane na podstawie zweryfikowanych i zaakceptowanych na szczeblu międzynarodowym metod, które przedstawiają działanie silnie drażniące na skórę

Silne działanie drażniące na skórę

Założyć działanie drażniące na oczy. Nie wymaga badań.

 

 

Brak dostępnych informacji lub dostępne informacje są niejednoznaczne

 

 

 

 

2

Przeprowadzić SAR pod kątem działania żrącego/drażniącego na oczy

Przewidzieć poważne uszkodzenie oczu

Założyć działanie żrące na oczy. Nie wymaga badań.

Przewidzieć działanie drażniące na oczy

Założyć działanie drażniące na oczy. Nie wymaga badań.

Rozważyć SAR w odniesieniu do działania żrącego na skórę

Przewidzieć działanie żrące na skórę

Założyć działanie żrące na oczy. Nie wymaga badań.

 

 

Nie można dokonać żadnych prognoz albo prognozy nie są jednoznaczne ani ujemne

 

 

 

 

3

Zmierzyć pH (uwzględnić pojemność buforową, w stosownych przypadkach)

pH ≤ 2 lub ≥ 11,5 (przy wysokiej pojemności buforowej, w stosownych przypadkach)

Założyć działanie żrące na oczy. Nie wymaga badań.

 

 

2 < pH < 11,5, or pH ≤ 2,0 lub ≥ 11,5 przy niskiej/braku pojemności buforowej, w stosownych przypadkach

 

 

 

 

4

Uznać istniejące dane na temat toksyczności ogólnoustrojowej w kontakcie ze skórą

Wysoka toksyczność przy stężeniach, które byłyby testowane na oku.

Substancja chemiczna byłaby zbyt toksyczna, aby przeprowadzić badanie. Nie wymaga badań.

 

 

Brak informacji na ten temat lub substancja chemiczna nie jest wysoce toksyczna.

 

 

 

 

5

Ocenić w doświadczeniu potencjał działania żrącego na skórę zgodnie ze strategią badań opisaną w rozdziale B.4 niniejszego załącznika, jeżeli jest to wymagane również do celów regulacyjnych

Reakcja w postaci działania żrącego lub silnie drażniącego

Założyć działanie żrące na oczy. Nie wymaga dalszych badań.

 

 

Substancja chemiczna nie działa żrąco ani silnie drażniąco na skórę

 

 

 

 

6

Przeprowadzić zweryfikowane i zaakceptowane badania na oku in vitro lub ex vivo

Reakcja w postaci działania żrącego lub silnie drażniącego

Założyć działanie żrące lub silnie drażniące na oczy, pod warunkiem że przeprowadzone badanie(-a) można wykorzystać do identyfikacji substancji żrących/silnie drażniących, a substancja chemiczna wchodzi w zakres dziedziny zastosowania badania lub badań. Nie wymaga dalszych badań.

Reakcja w postaci działania drażniącego

Założyć działanie drażniące na oczy, pod warunkiem że przeprowadzone badanie(-a) można wykorzystać do prawidłowej identyfikacji substancji żrących, silnie drażniących i drażniących, a substancja chemiczna wchodzi w zakres dziedziny zastosowania badania lub badań. Nie wymaga dalszych badań.

Reakcja w postaci działania niedrażniącego

Założyć brak działania drażniącego na oczy, pod warunkiem że przeprowadzone badanie(-a) można wykorzystać do prawidłowej identyfikacji substancji żrących, silnie drażniących lub drażniących dla oczu, a substancja chemiczna wchodzi w zakres dziedziny zastosowania badania. Nie wymaga dalszych badań.

 

 

Zweryfikowanych i zaakceptowanych badań na oku in vitro lub ex vivo nie można wykorzystać do sformułowania wniosku

 

 

 

 

7

Przeprowadzić badanie wstępne na oku królika in vivo z wykorzystaniem jednego zwierzęcia

Poważne uszkodzenie oczu

Uznać substancję za żrącą dla oczu. Nie wymaga dalszych badań.

 

 

Brak poważnych uszkodzeń lub brak reakcji

 

 

 

 

8

Przeprowadzić badanie potwierdzające z wykorzystaniem jednego dodatkowego zwierzęcia lub dwóch dodatkowych zwierząt.

Działanie żrące lub drażniące

Uznać substancję za żrącą lub drażniącą dla oczu. Nie wymaga dalszych badań.

Brak działania żrącego lub drażniącego

Uznać brak działania drażniącego i żrącego dla oczu. Nie wymaga dalszych badań.;

BIBLIOGRAFIA

(1)

OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Sprawozdanie końcowe z warsztatów OECD na temat harmonizacji kryteriów weryfikowania i akceptowania w odniesieniu do alternatywnych toksykologicznych metod badawczych. Warsztaty odbyły się w Solnej w Szwecji w dniach 22–24 stycznia 1996 r. (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, zatwierdzony podczas 28. wspólnego posiedzenia Komitetu ds. Substancji Chemicznych i Grupy Roboczej ds. Substancji Chemicznych, które odbyło się w listopadzie 1998 r. (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3)

Worth, A.P. i Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161–177.

(4)

Rozdział B.4 niniejszego załącznika, Ostre działanie drażniące/żrące na skórę.

(5)

Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19–26.

(6)

Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. i Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, s. 483–524.

(7)

Neun, D.J. (1993) Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH. J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227–231.

(8)

Dodatek do rozdziału B.4 niniejszego załącznika – Strategia badań sekwencyjnych działania drażniącego i żrącego na oczy.

(9)

Rozdział B.40 niniejszego załącznika, Badanie działania żrącego na skórę in vitro: test przezskórnej oporności elektrycznej (TER).

(10)

Rozdział B.40a niniejszego załącznika, Badanie działania żrącego na skórę in vitro: badanie modelu skóry ludzkiej.

(11)

OECD (2006), badanie nr 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, Wytyczne OECD dotyczące badania substancji chemicznych, sekcja 4, OECD Paryż.

(12)

Rozdział B.47 niniejszego załącznika, Metoda badania zmętnienia i przepuszczalności rogówki u bydła do celów identyfikacji substancji żrących i silnie drażniących dla oczu.

(13)

Rozdział B.48 niniejszego załącznika, Metoda badania na izolowanym oku kurzym do celów identyfikacji substancji żrących i silnie drażniących dla oczu.”

3)

w części B rozdział B.10 otrzymuje brzmienie:

„B.10   Badanie aberracji chromosomowej w komórkach ssaków in vitro

WPROWADZENIE

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 473 (2016). Stanowi ona część cyklu metod badawczych dotyczących toksykologii genetycznej. Opracowany został dokument OECD, który zawiera zwięzłe informacje na temat badań w zakresie toksykologii genetycznej oraz przegląd ostatnich zmian, jakie wprowadzono do wytycznych dotyczących badań (1).

Celem badania aberracji chromosomowej in vitro jest zidentyfikowanie substancji chemicznych, które powodują strukturalne aberracje chromosomowe w hodowanych komórkach ssaków (2) (3) (4). Strukturalne aberracje mogą występować w dwóch typach – chromosomowym lub chromatydowym. W trakcie przeprowadzania testów aberracji chromosomowych in vitro może wystąpić poliploidalność (w tym endoreduplikacja). Mimo że aneugeny mogą powodować poliploidalność, sama poliploidalność nie musi jednak świadczyć o właściwościach aneugenicznych i może stanowić po prostu skutek zaburzenia cyklu komórkowego lub cytotoksyczności (5). Celem niniejszego testu nie jest pomiar aneuploidii. W celu wykrycia aneuploidii zalecane będzie przeprowadzenie testu mikrojądrowego in vitro (6).

W badaniu aberracji chromosomowej w komórkach ssaków in vitro można wykorzystywać kultury ustanowionych linii komórkowych lub pierwotne hodowle komórek pochodzących od człowieka lub od gryzoni. Wykorzystywane komórki należy dobierać na podstawie ich zdolności do wzrostu w kulturach, stabilności kariotypu (w tym liczby chromosomów) oraz spontanicznych częstości występowania aberracji chromosomowych (7). W chwili obecnej dostępne dane nie pozwalają na opracowanie konkretnych zaleceń, ale wynika z nich, że istotne jest, aby podczas oceny zagrożeń stwarzanych przez substancje chemiczne wziąć pod uwagę status białka p53, stabilność genetyczną (kariotypową), zdolność do naprawy DNA oraz pochodzenie (od gryzoni lub od człowieka) komórek wybranych do badania. Zachęca się zatem użytkowników niniejszej metody badawczej do uwzględniania wpływu tych oraz innych właściwości komórek na zachowanie linii komórkowej przy wykrywaniu indukcji aberracji chromosomowych w miarę rozwoju wiedzy w tej dziedzinie.

Stosowane definicje znajdują się w dodatku 1.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE I OGRANICZENIA

Badania przeprowadzane in vitro wymagają zazwyczaj wykorzystania egzogennego źródła aktywacji metabolicznej, chyba że komórki są metabolicznie wydolne w odniesieniu do badanych substancji chemicznych. Egzogenny układ metabolizujący nie jest w stanie całkowicie naśladować warunków in vivo. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć wystąpienia warunków, które mogą doprowadzić do zniekształconych wyników dodatnich, tj. uszkodzenia chromosomu niespowodowanego bezpośrednią interakcją między badanymi substancjami chemicznymi a chromosomami; do takich warunków zalicza się zmiany pH lub osmolalność (8) (9) (10), interakcje z elementami podłoża (11) (12) bądź zbyt wysokie poziomy cytotoksyczności (13) (14) (15) (16).

Test ten wykorzystuje się do wykrywania aberracji chromosomowych, które mogą wynikać ze zdarzeń klastogennych. Analizę indukcji aberracji chromosomowej należy przeprowadzić przy użyciu komórek w metafazie. Dlatego istotne jest, aby komórki przeszły mitozę zarówno w kulturach poddanych, jak i niepoddanych działaniu substancji chemicznej. W przypadku wytworzonych nanomateriałów konieczne może być specjalne dostosowanie niniejszej metody badawczej, które jednak nie zostało tu opisane.

Przed zastosowaniem niniejszej metody badawczej z użyciem mieszaniny w celu zgromadzenia danych na potrzeby założonego celu regulacyjnego należy zastanowić się, czy zastosowanie niniejszej metody może doprowadzić do uzyskania wyników odpowiednich z punktu widzenia tego celu, a jeżeli tak – dlaczego. Przeprowadzenie takiej analizy nie jest konieczne, jeżeli ustanowiono wymóg regulacyjny dotyczący badania danej mieszaniny.

ZASADA BADANIA

Kultury komórkowe pochodzące od ludzi lub od innych ssaków poddaje się działaniu badanej substancji chemicznej zarówno z zastosowaniem egzogennego źródła aktywacji metabolicznej, jak i bez takiego źródła, pod warunkiem że nie wykorzystuje się komórek o odpowiednich zdolnościach metabolicznych (zob. pkt 13). W odpowiednich z góry określonych odstępach czasu po rozpoczęciu poddawania kultur komórkowych działaniu badanej substancji chemicznej są one poddawane działaniu substancji chemicznej zatrzymującej metafazę (np. colcemidu lub kolchicyny), następnie pobierane i barwione, a komórki w metafazie są analizowane pod mikroskopem na obecność aberracji typu chromatydowego i chromosomowego.

OPIS METODY

Przygotowania

Komórki

Można korzystać z różnych linii komórkowych (np. komórek jajnika chomika chińskiego (CHO), komórek płucnych chomika chińskiego V79, komórek płucnych chomika chińskiego (CHL)/IU, TK6) lub pierwotnych hodowli komórek, w tym limfocytów krwi obwodowej ludzi lub innych ssaków (7). Należy przedstawić naukowe uzasadnienie wyboru linii komórkowych. Jeżeli stosowane są komórki pierwotne, ze względu na dobrostan zwierząt należy rozważyć użycie komórek pierwotnych pochodzących od ludzi, jeżeli jest to możliwe; należy je pobrać w zgodzie z zasadami etycznymi i przepisami mającymi zastosowanie do ludzi. Ludzkie limfocyty krwi obwodowej należy pozyskiwać od młodych (w wieku około 18–35 lat) niepalących osób, u których nie stwierdzono żadnych schorzeń oraz które nie były narażone w ostatnim czasie na czynniki genotoksyczne (tj. substancje chemiczne, promieniowanie jonizujące) w stopniu, który mógłby zwiększyć podstawową częstość występowania aberracji chromosomowych. Zagwarantuje to niską i stałą podstawową częstość występowania aberracji chromosomowych. Wyjściowa częstość występowania aberracji chromosomowych wzrasta wraz z wiekiem, a tendencja ta jest bardziej widoczna u kobiet niż u mężczyzn (17) (18). Jeżeli dla celów stosowania łączy się komórki pochodzące od większej liczby dawców niż jeden, należy wskazać liczbę dawców. Należy wykazać, że komórki uległy podziałowi w okresie od rozpoczęcia poddawania ich działaniu badanej substancji chemicznej do momentu pobrania próbek. Kultury komórkowe utrzymuje się w fazie wzrostu wykładniczego (linie komórkowe) bądź stymuluje się ich podział (pierwotne kultury limfocytów) celem narażenia komórek na działanie badanej substancji chemicznej w różnych stadiach cyklu komórkowego, ponieważ czułość stadiów komórek na badaną substancję chemiczną może być nieznana. Komórki pierwotne, które wymagają stymulacji mitogenami, aby się podzielić, zasadniczo nie podlegają synchronizacji podczas narażenia na działanie badanej substancji chemicznej (np. limfocyty ludzkie po 48-godzinnej stymulacji mitogenami). Wykorzystywanie zsynchronizowanych komórek podczas podawania badanej substancji chemicznej nie jest zalecane, ale może zostać zaakceptowane w uzasadnionych przypadkach.

Podłoża i warunki hodowli

W celu utrzymania kultur należy zastosować odpowiednie podłoże oraz warunki inkubacji (naczynia do hodowli komórkowych, wilgotne środowisko o zawartości CO2 5 %, w stosownych przypadkach, oraz temperatura inkubacji w wysokości 37 °C). Linie komórkowe powinny być rutynowo sprawdzane pod kątem stabilności zmiennej liczby chromosomów oraz nieobecności zanieczyszczenia mykoplazmą (7) (19), a komórki nie powinny być wykorzystywane, jeżeli są zanieczyszczone lub w przypadku, gdy zmienna liczba chromosomów uległa zmianie. Należy ustalić normalny czas trwania cyklu komórkowego linii komórkowych lub pierwotnych kultur wykorzystywanych w laboratorium badawczym, który powinien być zgodny z opublikowanymi właściwościami komórek (20).

Przygotowanie kultur

Linie komórkowe: komórki są rozmnażane z kultur wyjściowych i wysiewane na podłoże w takiej gęstości, by komórki w zawiesinie lub w jednowarstwowej hodowli komórek mogły nadal rosnąć wykładniczo aż do czasu pobrania (np. należy unikać konfluencji w przypadku komórek rosnących w jednowarstwowej hodowli komórek).

Limfocyty: krew pełną z antykoagulantem (np. heparyną) lub oddzielone limfocyty hoduje się (np. przez 48 godzin dla limfocytów ludzkich) w obecności mitogenu [np. fitohemaglutyniny (PHA) dla limfocytów ludzkich] w celu indukcji podziału komórek przed ich narażeniem na działanie badanej substancji chemicznej.

Aktywacja metaboliczna

Egzogenne układy metabolizujące należy stosować w przypadku, gdy stosuje się komórki o nieodpowiedniej endogennej wydolności metabolicznej. Najpowszechniej stosowanym układem, który jest domyślnie zalecany, jeżeli nie jest uzasadnione zastosowanie innego systemu, jest frakcja postmitochondrialna suplementowanego kofaktora (S9) przygotowywana z wątroby gryzoni (najczęściej szczurów) otrzymujących czynniki pobudzające enzymy takie jak Aroclor 1254 (21) (22) (23) lub kombinacja fenobarbitalu i β-naftoflawonu (24) (25) (26) (27) (28) (29). Ta ostatnia kombinacja nie pozostaje w sprzeczności z Konwencją sztokholmską w sprawie trwałych zanieczyszczeń organicznych (30) i okazała się równie skuteczna jak Aroclor 1254 w wywoływaniu oksydaz wieloczynnościowych (24) (25) (26) (28). Frakcja S9 jest zazwyczaj wykorzystywana w stężeniach w zakresie 1–2 % (objętościowo), ale stężenie to może być zwiększone do 10 % (obj.) w końcowym podłożu użytym do badania. Podczas poddawania zwierzęcia czynnikom należy unikać stosowania produktów, które zmniejszają indeks mitotyczny, a zwłaszcza czynników wiążących wapń (31). Klasa badanych substancji chemicznej może mieć wpływ na wybór rodzaju i stężenia egzogennego układu metabolizującego lub czynnika pobudzającego metabolizm.

Przygotowanie badanej substancji chemicznej

Badane substancje chemiczne w stanie stałym należy rozpuścić w odpowiednich rozpuszczalnikach oraz rozcieńczyć, jeżeli jest to odpowiednie, przed poddaniem komórek ich działaniu (zob. pkt 23). Ciekłe substancje chemiczne można dodać do układu badawczego bezpośrednio lub rozcieńczyć przed podaniem do układu badawczego. Gazowe lub lotne substancje chemiczne należy badać za pomocą odpowiednich modyfikacji standardowych protokołów, takich jak poddawanie komórek działaniu substancji badanej w szczelnie zamkniętych naczyniach do hodowli komórkowych (32) (33) (34). Preparaty badanej substancji chemicznej należy przygotowywać tuż przed poddaniem komórek jej działaniu, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują, iż dopuszczalne jest składowanie substancji.

Warunki badania

Rozpuszczalniki

Rozpuszczalnik należy wybrać tak, aby zoptymalizować rozpuszczalność badanych substancji chemicznych, unikając niepożądanego wpływu na przeprowadzenie badania, np. zmiany wzrostu komórek, wpływu na spójność badanej substancji chemicznej, reakcji z naczyniami do hodowli komórkowych czy zakłócenia układu metabolizującego. Zaleca się, aby w miarę możliwości w pierwszej kolejności rozważyć zastosowanie wodnego rozpuszczalnika (lub podłoża). Sprawdzonymi rozpuszczalnikami są woda lub sulfotlenek dimetylu. Zasadniczo zawartość rozpuszczalników organicznych nie powinna przekraczać 1 % (obj.) a zawartość rozpuszczalników wodnych (soli fizjologicznej lub wody) w końcowym podłożu użytym do badania nie powinna przekroczyć 10 % (obj.). Jeżeli używane są niesprawdzone rozpuszczalniki (np. etanol czy aceton), ich użycie powinno być uzasadnione danymi, które potwierdzają ich zgodność z badanymi substancjami chemicznymi, układem badawczym oraz brak toksyczności genetycznej w zastosowanym stężeniu. W razie braku takich danych potwierdzających należy uwzględnić próby kontrolne niepoddawane działaniu substancji (zob. dodatek 1) w celu wykazania, że wybrany rozpuszczalnik nie wywołuje skutków szkodliwych lub klastogennych.

Pomiar proliferacji komórek i cytotoksyczności oraz wybór badanych stężeń

Przy ustalaniu najwyższego stężenia badanej substancji chemicznej należy unikać stężeń, które mogą dawać zniekształcone wyniki dodatnie, np. stężeń powodujących nadmierną cytotoksyczność (zob. pkt 22), strącanie substancji w podłożu (zob. pkt 23) i znaczne zmiany pH lub osmolalności (zob. pkt 5). Jeżeli badana substancja chemiczna powoduje znaczną zmianę pH podłoża w momencie dodania, pH może zostać dopasowane poprzez buforowanie końcowego podłoża użytego do badania, aby uniknąć zniekształconych wyników dodatnich i utrzymać odpowiednie warunki hodowli.

Dokonuje się pomiaru proliferacji komórek, aby upewnić się, że odpowiednia liczba komórek poddanych działaniu substancji przeszła mitozę podczas testu oraz że substancja chemiczna jest podawana przy odpowiednim poziomie cytotoksyczności (zob. pkt 18 i 22). Cytotoksyczność powinna zostać określona w ramach głównego doświadczenia z użyciem aktywacji metabolicznej lub bez niej, przy wykorzystaniu odpowiedniego wskazania dotyczącego śmierci i wzrostu komórek. Chociaż ocena cytotoksyczności w badaniu wstępnym może być przydatna w lepszym określeniu stężeń, które mają zostać użyte w głównym doświadczeniu, badanie wstępne nie jest obowiązkowe. Jeżeli taka ocena zostanie przeprowadzona, nie może ona zastąpić pomiaru cytotoksyczności w głównym doświadczeniu.

Względne podwojenie populacji (RPD) lub względny wzrost liczby komórek (RICC) to odpowiednie metody oszacowania cytotoksyczności w badaniach cytogenetycznych (13) (15) (35) (36) (55) (zob. wzory w dodatku 2). W przypadku długoterminowego poddania działaniu substancji chemicznej i pobierania próbek po rozpoczęciu podawania substancji chemicznej w czasie dłuższym niż 1,5-krotność normalnego czasu trwania cyklu komórkowego (tj. w sumie dłużej niż 3-krotność czasu trwania cyklu komórkowego) RPD może prowadzić do niedoszacowania cytotoksyczności (37). W takich warunkach RICC może być lepszą miarą; pomocne oszacowanie z wykorzystaniem RPD może również zapewnić ocena cytotoksyczności po 1,5-krotności normalnego czasu trwania cyklu komórkowego.

W przypadku limfocytów z pierwotnych hodowli chociaż indeks mitotyczny jest miarą skutków cytotoksycznych/cytostatycznych, może mieć na niego wpływ czas po podaniu substancji chemicznej, wykorzystany mitogen i ewentualne zakłócenie cyklu komórkowego. Indeks mitotyczny jest jednak akceptowalny, ponieważ inne miary cytotoksyczności mogą być niewiarygodne i niepraktyczne oraz mogą nie mieć zastosowania do docelowej populacji limfocytów zwiększającej się w reakcji na stymulację PHA.

Chociaż RICC i RPD dla linii komórkowych i indeks mitotyczny pierwotnej hodowli limfocytów są zalecanymi parametrami cytotoksyczności, inne wskaźniki (np. integralność komórek, apoptoza, martwica, cykl komórkowy) mogą zapewnić przydatne informacje dodatkowe.

Należy ocenić co najmniej trzy badane stężenia (poza kontrolami z rozpuszczalnikiem i kontrolami dodatnimi), które spełniają kryteria dopuszczalności (odpowiednia cytotoksyczność, liczba komórek itp.). Bez względu na rodzaj komórek (linie komórkowe bądź pierwotne kultury limfocytów) przy każdym badanym stężeniu można stosować zarówno zduplikowane, jak i pojedyncze kultury poddane działaniu substancji. Mimo że zalecane jest stosowanie zduplikowanych kultur, dopuszczalne jest również stosowane pojedynczych kultur, pod warunkiem że policzono taką samą całkowitą liczbę komórek w przypadków zarówno kultur pojedynczych, jak i zduplikowanych. Zastosowanie pojedynczych kultur jest szczególnie uzasadnione, jeżeli ocenie poddaje się więcej niż 3 stężenia (zob. pkt 31). Wyniki uzyskane na podstawie niezależnych zduplikowanych kultur przy danym stężeniu można łączyć na potrzeby analizy danych (38). W przypadku badanych substancji chemicznych wykazujących niewielką cytotoksyczność lub niewykazujących żadnej cytotoksyczności na ogół odpowiednie będzie zastosowanie 2–3-krotnych przedziałów stężenia. W przypadku wystąpienia cytotoksyczności wybrane badane stężenia powinny obejmować zakres rozpoczynający się od stężenia, które wykazuje cytotoksyczność, jak opisano w pkt 22, oraz uwzględniający stężenia, w których wystąpiła umiarkowana i niewielka cytotoksyczność lub nie wystąpiła żadna cytotoksyczność. Wiele badanych substancji chemicznych wykazuje gwałtowny wzrost krzywych stężenie-odpowiedź, w związku z czym aby uzyskać dane przy niskiej i umiarkowanej cytotoksyczności lub aby szczegółowo zbadać zależność dawka-odpowiedź, konieczne będzie zastosowanie stężeń o bardziej zbliżonych wartościach lub więcej niż trzech stężeń (kultury pojedyncze lub zduplikowane), w szczególności w sytuacjach, w których wymagane jest powtórzenie doświadczenia (zob. pkt 47).

Jeżeli maksymalne stężenie opiera się na cytotoksyczności, najwyższe stężenie powinno dążyć do osiągnięcia cytotoksyczności na poziomie 55 ± 5 % przy wykorzystaniu zalecanych parametrów cytotoksyczności (tj. zmniejszenie RICC i RPD dla linii komórkowych i zmniejszenie indeksu mitotycznego pierwotnych hodowli limfocytów do poziomu 45 ± 5 % jednoczesnej kontroli ujemnej). Należy zachować ostrożność w interpretowaniu wyników dodatnich, które wystąpiły wyłącznie w górnym przedziale tego zakresu cytotoksyczności 55 ± 5 % (13).

Dla słabo rozpuszczalnych badanych substancji chemicznych, które nie wykazują cytotoksyczności w stężeniach niższych od najniższego stężenia nierozpuszczalnego, najwyższe badane stężenie powinno spowodować mętność lub osad widoczny gołym okiem lub przez mikroskop w układzie odwróconym pod koniec podawania badanej substancji chemicznej. Nawet jeżeli cytotoksyczność wystąpi dla stężeń powyżej najniższego stężenia nierozpuszczalnego, zaleca się przeprowadzenie testu tylko dla jednego stężenia powodującego mętność bądź wytrącenie się widocznego osadu, ponieważ osad może spowodować pojawienie się wyników zniekształconych. W przypadku stężenia powodującego powstanie osadu należy zadbać o to, aby pojawienie się osadu nie zakłóciło przebiegu testu (np. barwienia lub oceny). Pomocne może się okazać określenie rozpuszczalności podłoża przed wykonaniem doświadczenia.

Jeżeli nie zaobserwowano żadnego osadu ani ograniczenia cytotoksyczności, najwyższe badane stężenie powinno odpowiadać 10 mM, 2 mg/ml lub 2 μl/ml w zależności od tego, która z tych wartości jest najniższa (39) (40) (41). Jeżeli badana substancja chemiczna nie ma określonego składu, np. substancje o nieznanym lub zmiennym składzie, złożone produkty reakcji lub materiały biologiczne (UVCB) (42), wyciągi pochodzące ze środowiska itp., może być konieczne podwyższenie (np. do 5 mg/ml) najwyższego stężenia w przypadku braku dostatecznej cytotoksyczności, tak aby zwiększyć stężenie każdego ze składników. Należy jednak zwrócić uwagę na fakt, że wymagania te mogą się różnić w przypadku produktów leczniczych przeznaczonych dla ludzi (43).

Kontrole

Dla każdego czasu pobrania należy włączyć jednoczesną kontrolę ujemną (zob. pkt 15), obejmującą sam rozpuszczalnik w podłożu użytym do badania, w ramach której test przeprowadza się w identyczny sposób, jak w przypadku kultur poddanych działaniu substancji.

Jednoczesna kontrola dodatnia jest konieczna, aby wykazać zdolność laboratorium do zidentyfikowania klastogenów w warunkach określonych w stosowanym protokole badania oraz skuteczność egzogennego układu metabolizującego, w stosownych przypadkach. Przykładowe substancje służące do kontroli dodatniej są przedstawione poniżej w tabeli 1. W uzasadnionych przypadkach dopuszcza się zastosowanie alternatywnych substancji chemicznych służących do kontroli dodatniej. Ponieważ testy na komórkach ssaków in vitro pod kątem toksyczności genetycznej są w dostatecznym stopniu ustandaryzowane, zastosowanie kontroli dodatniej można ograniczyć do klastogenu wymagającego aktywacji metabolicznej. W tym przypadku pojedyncza reakcja klastogenna w ramach kontroli dodatniej wykaże zarówno aktywność układu metabolizującego, jak i reaktywność układu badawczego, pod warunkiem że odbywa się jednocześnie z nieaktywowanym testem o takim samym czasie podawania badanej substancji. W przypadku długoterminowego poddawania działaniu substancji chemicznej (bez S9) należy zastosować jednak oddzielną kontrolę dodatnią, ponieważ czas podawania badanej substancji chemicznej będzie się różnił od czasu w badaniu z wykorzystaniem aktywacji metabolicznej. Każdą kontrolę dodatnią należy zastosować przy co najmniej jednym stężeniu, od którego oczekuje się wytworzenia odtwarzalnego oraz wykrywalnego wzrostu wykraczającego poza poziom wyjściowy, w celu wykazania czułości układu badawczego (tj. efekty są jasne, ale nie ujawniają badającemu bezpośrednio tożsamości zakodowanych szkiełek mikroskopowych), a reakcja nie powinna być zakłócona cytotoksycznością wykraczającą poza limity określone w niniejszej metodzie badawczej.

Tabela 1

Chemiczne substancje odniesienia zalecane do oceny biegłości laboratorium oraz do wyboru substancji do kontroli dodatniej

Kategoria

Substancja chemiczna

Numer CAS

1.   

Klastogeny aktywne bez aktywacji metabolicznej

 

Metanosulfonian metylu

66-27-3

 

Mitomycyna C

50-07-7

 

N-tlenek 4-nitrochinoliny

56-57-5

 

Arabinozyd cytozyny

147-94-4

2.   

Klastogeny wymagające aktywacji metabolicznej

 

Benzo[a]piren

50-32-8

 

Cyklofosfamid

50-18-0

PROCEDURA

Poddanie działaniu substancji chemicznej

Rozmnażające się komórki są poddawane działaniu badanej substancji chemicznej w obecności układu metabolizującego oraz przy jego braku.

Czas pobrania kultury komórkowej

W celu gruntownej oceny, która jest niezbędna do potwierdzenia wyniku ujemnego, należy przeprowadzić doświadczenie we wszystkich trzech następujących warunkach z zastosowaniem krótkoterminowego poddawania działaniu substancji chemicznej z aktywacją metaboliczną i bez niej oraz długoterminowego poddawania działaniu substancji bez aktywacji metabolicznej (zob. pkt 43, 44 i 45):

komórki należy poddawać działaniu badanej substancji chemicznej bez aktywacji metabolicznej przez 3–6 godzin, a następnie należy pobrać próbki w czasie równoważnym około 1,5-krotności normalnego czasu trwania cyklu komórkowego po rozpoczęciu poddawania działaniu substancji (18);

komórki należy poddawać działaniu badanej substancji chemicznej z użyciem aktywacji metabolicznej przez 3–6 godzin, a następnie należy pobrać próbki w czasie równoważnym około 1,5–2-krotności normalnego czasu trwania cyklu komórkowego po rozpoczęciu poddawania działaniu substancji (18);

komórki powinny być nieprzerwanie poddawane działaniu badanej substancji chemicznej bez aktywacji metabolicznej aż do pobrania próbek w czasie równoważnym około 1,5-krotności normalnego czasu trwania cyklu komórkowego. Niektóre substancje chemiczne (np. analogi nukleozydowe) mogą być łatwiej wykryte w okresie podawania substancji chemicznej/pobierania próbek, który jest dłuższy niż 1,5-krotność normalnego czasu trwania cyklu komórkowego (24).

Jeżeli którekolwiek z powyższych warunków doświadczalnych wywołały reakcję dodatnią, badanie któregokolwiek z pozostałych schematów poddawania działaniu substancji chemicznej może okazać się zbędne.

Przygotowanie chromosomów

Kultury komórkowe są poddawane działaniu colcemidu lub kolchicyny zazwyczaj przez 1–3 godzin przed pobraniem komórek. Każda kultura komórkowa jest pobierana oraz poddawana działaniu substancji oddzielnie w celu przygotowania chromosomów. Przygotowanie chromosomów obejmuje hipotoniczne poddawanie komórek działaniu substancji chemicznej, utrwalanie oraz wybarwianie. Po upływie 3–6-godzin poddawania działaniu substancji w jednowarstwowych hodowlach komórek mogą być obecne komórki mitotyczne (można je rozpoznać po okrągłym kształcie i fakcie, że oddzielają się od powierzchni). Z uwagi na łatwość oddzielania się komórek mitotycznych można je utracić w momencie usuwania podłoża zawierającego badaną substancję chemiczną. Jeżeli istnieją dowody na znaczny wzrost liczby komórek mitotycznych w porównaniu z próbami kontrolnymi, co wskazuje na prawdopodobieństwo zatrzymania mitozy, należy zebrać komórki poprzez odwirowanie i dodać je z powrotem do hodowli, aby w czasie poboru uniknąć utraty komórek będących w fazie mitozy i zagrożonych aberracją chromosomową.

Analiza

Wszystkie preparaty, w tym te stanowiące kontrolę dodatnią i ujemną, należy niezależnie zakodować przed przeprowadzeniem analizy mikroskopowej aberracji chromosomowych. Ze względu na fakt, że procedury utrwalania często skutkują odsetkiem komórek w metafazie, które utraciły chromosomy, zliczone komórki powinny zatem zawierać liczbę centromerów równą liczbie modalnej +/-2.

Należy ocenić co najmniej 300 dobrze rozciągniętych metafaz na stężenie oraz grupę kontrolną, aby uznać, że badana substancja chemiczna daje wynik wyraźnie ujemny (zob. pkt 45). Wspomniane 300 komórek należy równo podzielić między kontrpróby w przypadku wykorzystania zduplikowanych kultur. W przypadku stosowania pojedynczych kultur na każde stężenie (zob. pkt 21) w takiej pojedynczej kulturze należy ocenić co najmniej 300 dobrze rozciągniętych metafaz. Ocena 300 komórek przynosi korzyść w postaci zwiększenia mocy statystycznej testu, a ponadto rzadko obserwowane są wartości zerowe (oczekuje się zaledwie 5 %) (44). Liczbę zliczanych metafaz można zmniejszyć w przypadku odnotowania dużej liczby komórek z aberracjami chromosomowymi oraz w przypadku uznania badanej substancji chemicznej za dającą wynik wyraźnie dodatni.

Należy ocenić ilościowo komórki ze strukturalnymi aberracjami chromosomowymi, z uwzględnieniem lub z pominięciem przerw. Terminy „złamanie” i „przerwa” są zdefiniowane w dodatku 1 zgodnie z (45) (46). Aberracje typu chromatydowego i chromosomowego należy odnotowywać oddzielnie i klasyfikować według podtypów (złamania, wymiany). Procedury stosowane w laboratorium powinny zapewniać przeprowadzanie analizy aberracji chromosomowych przez odpowiednio przeszkolonych pracowników odpowiadających za zliczanie oraz – w stosownych przypadkach – poddanie wyników tej analizy wzajemnej ocenie.

Mimo że badanie przeprowadza się w celu wykrycia strukturalnych aberracji chromosomowych, należy pamiętać o konieczności odnotowywania częstości występowania poliploidalności i endoreduplikacji, jeżeli zaobserwowano wystąpienie tych zjawisk. (Zob. pkt 2).

Biegłość laboratorium

Aby ustalić wystarczające doświadczenie laboratorium w zakresie omawianego testu przed zastosowaniem go w rutynowych badaniach, laboratorium powinno wcześniej przeprowadzić szereg doświadczeń z wykorzystaniem substancji chemicznych służących do kontroli dodatniej, działających za pomocą różnych mechanizmów i różnych kontroli ujemnych (z wykorzystaniem różnych rozpuszczalników/nośników). Reakcje otrzymane w wyniku takiej kontroli dodatniej i ujemnej powinny odpowiadać reakcjom opisanym w literaturze. Nie dotyczy to laboratoriów, które dysponują odpowiednim doświadczeniem, tj. laboratoriów prowadzących bazę danych historycznych, o której mowa w pkt 37.

Aby wykazać biegłość w zakresie wykrywania klastogennych substancji chemicznych i określić skuteczność układu metabolizującego, należy zbadać szereg substancji chemicznych służących do kontroli dodatniej (zob. tabela 1 w pkt 26) przy krótkoterminowym i długoterminowym poddawaniu działaniu substancji chemicznej przy braku aktywacji metabolicznej oraz przy krótkoterminowym poddawaniu działaniu substancji chemicznej w obecności aktywacji metabolicznej. Należy dobrać szereg stężeń wybranych substancji chemicznych, tak aby uzyskać powtarzalne i powiązane ze stężeniem wzrosty wykraczające poza poziom wyjściowy w celu wykazania czułości i zakresu oznaczania układu badawczego.

Dane historyczne dotyczące kontroli

Laboratorium powinno ustalić:

zakres i rozkład historycznych wyników kontroli dodatniej,

zakres i rozkład historycznych wyników kontroli ujemnej (bez poddania działaniu substancji chemicznej, z rozpuszczalnikiem).

Przy pierwszym gromadzeniu danych dotyczących rozkładu historycznych wyników kontroli ujemnej wyniki jednoczesnej kontroli ujemnej powinny być zgodne z opublikowanymi danymi dotyczącymi kontroli, o ile takie dane istnieją. W miarę dodawania kolejnych danych doświadczalnych do rozkładu kontroli jednoczesne kontrole ujemne powinny w idealnych warunkach mieścić się w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % dla tego rozkładu (44) (47). Prowadzona przez dane laboratorium baza danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej powinna wyjściowo zawierać dane z co najmniej 10 doświadczeń, a najlepiej z co najmniej 20 doświadczeń przeprowadzonych w porównywalnych warunkach doświadczalnych. Laboratoria powinny stosować metody kontroli jakości, takie jak karty kontrolne (np. karty C lub karty X-średnie (48)) w celu określania stopnia zmienności gromadzonych przez nie danych dotyczących kontroli dodatniej i ujemnej oraz w celu wykazania, że stosowana przez nie metodologia jest „pod kontrolą” (44). Dalsze zalecenia dotyczące sposobu gromadzenia i wykorzystywania danych historycznych (tj. kryteria włączania danych do zbioru danych historycznych i wykluczania danych z tego zbioru oraz kryteria dopuszczalności dla danego doświadczenia) można znaleźć w literaturze (47).

Wszelkie zmiany w protokole doświadczalnym należy rozpatrywać pod kątem ich spójności z dotychczas prowadzonymi przez laboratorium bazami danych historycznych dotyczących kontroli. Wszelkie poważne niespójności powinny skutkować utworzeniem nowej bazy danych historycznych dotyczących kontroli.

Dane dotyczące kontroli ujemnej powinny obejmować częstość występowania komórek z aberracjami chromosomowymi w pojedynczej kulturze lub w ramach sumy zduplikowanych kultur, jak opisano w pkt 21. Jednoczesne kontrole ujemne powinny w idealnych warunkach mieścić się w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % dla rozkładu danych zawartych w prowadzonej przez laboratorium bazie danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej (44) (47). W przypadku gdy dane dotyczące jednoczesnej kontroli ujemnej znajdują się poza granicami kontrolnymi wyznaczającymi przedział 95 %, włączenie ich do rozkładu kontroli historycznej może być dopuszczalne, pod warunkiem że dane te nie stanowią skrajnych obserwacji nietypowych oraz że istnieją dowody świadczące o tym, iż dany układ badawczy znajduje się „pod kontrolą” (zob. pkt 37), a także dowody wykluczające błąd techniczny czy ludzki.

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Przedstawienie wyników

Należy ocenić ilościowo odsetek komórek ze strukturalnymi aberracjami chromosomowymi. Aberracje typu chromosomowego i chromatydowego sklasyfikowane według podtypów (złamania, wymiany) należy wyszczególnić oddzielnie, podając ich liczbę i częstość występowania w kulturach doświadczalnych i kontrolnych. Przerwy odnotowuje się i zgłasza odrębnie, przy czym nie bierze się ich pod uwagę przy ustalaniu ogólnej częstości występowania aberracji. Odsetek komórek, w których odnotowano poliploidalność lub endoreduplikację, zgłasza się, jeżeli zostaną zaobserwowane.

Należy odnotowywać jednoczesne pomiary cytotoksyczności w odniesieniu do wszystkich kultur poddanych działaniu substancji chemicznej, kultur kontroli ujemnej i kultur kontroli dodatniej w ramach głównego doświadczenia lub głównych doświadczeń aberracji.

Należy dostarczyć dane dotyczące poszczególnych kultur. Dodatkowo wszystkie dane należy podsumować w postaci tabeli.

Kryteria dopuszczalności

Dopuszczalność testu ocenia się na podstawie następujących kryteriów:

uznaje się, że dopuszczalne jest włączenie danych dotyczących jednoczesnej kontroli ujemnej do prowadzonej przez laboratorium bazy danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej, jak opisano w pkt 39;

jednoczesne kontrole dodatnie (zob. pkt 26) powinny wywoływać reakcje zgodne z reakcjami odnotowanymi w bazie danych historycznych dotyczących kontroli dodatniej i wykazywać statystycznie istotny wzrost w porównaniu z jednoczesną kontrolą ujemną;

kryteria proliferacji komórek w kontroli z rozpuszczalnikiem powinny zostać spełnione (pkt 17 i 18);

zbadano wszystkie warunki doświadczalne do momentu uzyskania w jednych z nich wyników dodatnich (zob. pkt 28);

można poddać analizie wystarczającą liczbę komórek i stężeń (pkt 31 i 21);

kryteria wyboru najwyższego stężenia są spójne z kryteriami opisanymi w pkt 22, 23 i 24.

Ocena i interpretacja wyników

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik wyraźnie dodatni, jeżeli w dowolnych ze zbadanych warunków doświadczalnych (zob. pkt 28):

a)

co najmniej jedno z badanych stężeń wykazuje statystycznie istotny wzrost w porównaniu z jednoczesną kontrolą ujemną,

b)

ocena przeprowadzona z zastosowaniem odpowiedniego testu tendencji pokazuje, że wzrost jest powiązany z dawką,

c)

którykolwiek wynik znajduje się poza rozkładem danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej (np. poza granicami kontrolnymi wyznaczającymi przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona; zob. pkt 39).

W przypadku gdy wszystkie wspomniane kryteria są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna jest w stanie wywołać aberracje chromosomowe w kulturze komórek ssaków w danym układzie badawczym. Zalecenia dotyczące najodpowiedniejszych metod statystycznych można znaleźć w literaturze (49) (50) (51).

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik wyraźnie ujemny, jeżeli we wszystkich zbadanych warunkach doświadczalnych (zob. pkt 28):

a)

żadne z badanych stężeń nie wykazuje statystycznie istotnego wzrostu w porównaniu z jednoczesną kontrolą ujemną,

b)

ocena przeprowadzona z zastosowaniem odpowiedniego testu tendencji pokazuje, że wzrost nie jest powiązany ze stężeniem,

c)

wszystkie wyniki mieszczą się w rozkładzie danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej (np. w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona; zob. pkt 39).

Badaną substancję chemiczną uznaje się następnie za niezdolną do wywołania aberracji chromosomowych w kulturze komórek ssaków w danym układzie badawczym.

Weryfikacja wyraźnie dodatniej lub ujemnej reakcji nie jest wymagana.

Jeżeli reakcja nie jest ani wyraźnie ujemna, ani wyraźnie dodatnia, jak opisano powyżej, oraz aby ułatwić ustalenie biologicznego znaczenia wyniku, dane powinny zostać ocenione na podstawie opinii eksperta lub wyników dalszych badań. Przydatna może być ocena dodatkowych komórek (w stosownych przypadkach) lub powtórne przeprowadzenie doświadczenia, potencjalnie z zastosowaniem zmienionych warunków doświadczalnych (np. odstępów czasu między stężeniami, innych warunków aktywacji metabolicznej (tj. stężenie S9 lub pochodzenie S9)).

W rzadkich przypadkach nawet po przeprowadzeniu dalszych badań uzyskany zbiór danych uniemożliwi uznanie wyników za dodatnie lub ujemne i w takiej sytuacji reakcja badanej substancji chemicznej zostanie uznana za niejednoznaczną.

Wzrost liczby komórek poliploidalnych może świadczyć o tym, że badane substancje chemiczne mogą potencjalnie hamować procesy mitotyczne oraz indukować aberracje liczby chromosomów (52). Wzrost liczby komórek z endoreduplikowanymi chromosomami może świadczyć o tym, że badane substancje chemiczne mogą potencjalnie hamować przebieg cyklu komórkowego (53) (54) (zob. pkt 2). Dlatego też częstość występowania komórek poliploidalnych i komórek z endoreduplikowanymi chromosomami należy odnotowywać oddzielnie.

Sprawozdanie z badania

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:

 

Badana substancja chemiczna:

źródło, numer partii, data graniczna do użytku, jeżeli jest dostępna;

stabilność badanej substancji chemicznej, jeżeli jest znana;

rozpuszczalność i stabilność badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku, jeżeli są znane;

pomiar pH, osmolalności i osadu w podłożu, do którego dodano badaną substancję chemiczną, w stosownych przypadkach.

 

Substancja jednoskładnikowa:

wygląd fizyczny, rozpuszczalność w wodzie i dodatkowe istotne właściwości fizykochemiczne;

dane identyfikacyjne substancji chemicznej, takie jak: nazwa IUPAC lub CAS, numer CAS, kod SMILES lub InChI, wzór strukturalny, czystość, nazwa chemiczna zanieczyszczeń, w stosownych przypadkach i jeśli jest to praktycznie wykonalne, itp.

 

Substancja wieloskładnikowa, UVCB i mieszaniny:

opisane w miarę możliwości poprzez podanie nazwy systematycznej (zob. powyżej), określenie ilości oraz istotnych właściwości fizykochemicznych składników.

 

Rozpuszczalnik:

uzasadnienie wyboru rozpuszczalnika,

należy wskazać również zawartość procentową rozpuszczalnika w końcowym podłożu.

 

Komórki:

rodzaj i źródło komórek;

cechy kariotypu oraz odpowiedniość wykorzystywanych rodzajów komórek;

nieobecność mykoplazmy w przypadku linii komórkowych;

w przypadku linii komórkowych – informacje na temat czasu trwania cyklu komórkowego, czasu podwojenia lub wskaźnika proliferacji;

płeć, wiek i wszelkie inne istotne informacje na temat dawców krwi, krew pełna lub oddzielone limfocyty, wykorzystany mitogen;

w przypadku linii komórkowych – liczba pasaży, o ile informacje na ten temat są dostępne;

w przypadku linii komórkowych – metody utrzymania kultur komórkowych;

w przypadku linii komórkowych – modalna liczba chromosomów.

 

Warunki badania:

nazwa substancji chemicznej zatrzymującej metafazę, jej stężenie oraz okres narażenia komórek na działanie tej substancji;

stężenie badanej substancji chemicznej wyrażone jako stężenie końcowe w podłożu (np. μg lub mg/mL lub mM podłoża);

uzasadnienie wyboru stężeń oraz liczby kultur, z uwzględnieniem np. danych dotyczących cytotoksyczności oraz granic rozpuszczalności;

skład podłoża, w stosownych przypadkach stężenie CO2, poziom wilgotności;

stężenie (lub objętość) rozpuszczalnika i badanej substancji chemicznej dodanych do podłoża;

temperatura inkubacji;

czas inkubacji;

czas poddawania działaniu substancji chemicznej;

czas pobrania po podaniu substancji chemicznej;

w stosownych przypadkach zagęszczenie komórek w czasie osadzania;

typ oraz skład układu metabolizującego (źródło frakcji S9, metoda przygotowania preparatu frakcji S9, stężenie lub objętość preparatu frakcji S9 i frakcji S9 w końcowym podłożu, kontrole jakości frakcji S9);

substancje chemiczne służące do kontroli dodatniej i ujemnej, stężenia końcowe w poszczególnych warunkach poddawania działaniu substancji chemicznej;

metody przygotowywania preparatów oraz stosowane techniki barwienia;

kryteria dopuszczalności metod oznaczania zawartości;

kryteria oceny aberracji;

liczba przeanalizowanych metafaz;

metody pomiaru cytotoksyczności;

wszelkie informacje uzupełniające istotne w kontekście cytotoksyczności i stosowanej metody;

kryteria uznawania wyników badań za dodatnie, ujemne lub niejednoznaczne;

metody stosowane w celu ustalenia poziomu pH, osmolalności i strącania.

 

Wyniki:

liczba komórek poddanych działaniu substancji chemicznej i liczba komórek pobranych z każdej kultury w przypadku zastosowania linii komórkowych;

wyniki pomiaru cytotoksyczności, np. RPD, RICC, indeks mitotyczny, ewentualne inne obserwacje;

w przypadku linii komórkowych – informacje na temat czasu trwania cyklu komórkowego, czasu podwojenia lub wskaźnika proliferacji;

oznaki strącania i czas oznaczenia;

definicja aberracji, w tym przerw;

liczba ocenionych komórek, liczba komórek z aberracjami chromosomowymi i rodzaj aberracji chromosomowych podany osobno dla każdej hodowli poddanej działaniu substancji chemicznej i dla każdej hodowli kontrolnej, z uwzględnieniem i z pominięciem przerw;

zmiany ploidalności (podane osobno dla komórek poliploidalnych i dla komórek z endoreduplikowanymi chromosomami), jeżeli zaobserwowano takie zmiany;

w stosownych przypadkach zależność stężenie-odpowiedź;

dane dotyczące jednoczesnych kontroli ujemnych (rozpuszczalnik) i dodatnich (stężenia i rozpuszczalniki);

dane historyczne dotyczące kontroli ujemnej (z rozpuszczalnikiem) i dodatniej wraz z zakresami, średnimi oraz odchyleniami standardowymi oraz granice kontrolne wyznaczające przedział 95 % dla rozkładu, uwzględniając ilość danych;

analizy statystyczne, ewentualne p-wartości.

 

Omówienie wyników.

 

Wnioski.

BIBLIOGRAFIA

(1)

OECD, „Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015”, Publikacje OECD na temat środowiska, seria dotycząca badań i oceny, nr 234, OECD, Paryż.

(2)

Evans, H.J. (1976), „Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens”, w: Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, t. 4, Hollaender, A. (red.), Plenum Press, Nowy Jork i Londyn, s. 1–29.

(3)

Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture, w: Progress in Mutation Research, t. 5, Ashby, J. et al. (red.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-Nowy Jork-Oksford, s. 427–432.

(4)

Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosomal abberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 10 / suplement 10, s. 1–175.

(5)

Muehlbauer, P.A. et al. (2008), „Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods”, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 49/4, s. 318–327.

(6)

Rozdział B.49 niniejszego załącznika: Test mikrojądrowy na komórkach ssaków in vitro.

(7)

Opracowanie ILSI (projekt), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.

(8)

Scott, D. et al. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. Sprawozdanie 9. grupy zadaniowej ICMPEMC, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, t. 257/2, s. 147–204.

(9)

Morita, T. et al. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 268/2, s. 297–305.

(10)

Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 8/6, s. 789–886.

(11)

Long, L.H. et al. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 634/1–2, s. 177–183.

(12)

Nesslany, F. et al. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 49/6, s. 439–452.

(13)

Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 35/3, s. 191–201.

(14)

Kirkland, D. et al. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 584/1–2, s. 1–256.

(15)

Greenwood, S. et al. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 43/1, s. 36–44.

(16)

Hilliard, C.A. et al. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 31/4, s. 316–326.

(17)

Hedner K. et al. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, t. 62, s. 305–309.

(18)

Ramsey M.J. et al. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, t. 338, s. 95–106.

(19)

Coecke S. et al. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, t. 33/3, s. 261–287.

(20)

Henderson, L. et al. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, t. 12/3, s. 163–167.

(21)

Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, t. 31/6, s. 347–363.

(22)

Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, t. 113/3–4, s. 173–215.

(23)

Natarajan, A.T. et al. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, t. 37/1, s. 83–90.

(24)

Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, t. 66/3, s. 277–290.

(25)

Ong, T.-m. et al. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, t. 4/1, s. 55–65.

(26)

Elliot, B.M. et al. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, t. 7/3, s. 175–177.

(27)

Matsushima, T. et al. (1976), „A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems”, w In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (red.), Elsevier, North-Holland, s. 85–88.

(28)

Galloway, S.M. et al. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, t. 312/3, s. 241–261.

(29)

Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 28/1, s. 51–59.

(30)

UNEP (2001), Konwencja sztokholmska w sprawie trwałych zanieczyszczeń organicznych, Program Narodów Zjednoczonych ds. Ochrony Środowiska (UNEP). Dostępny na stronie internetowej: http://www.pops.int/.

(31)

Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, t. 190/3, s. 225–8.

(32)

Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), „CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids”, w: Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (red.), Plenum, Nowy Jork, s. 91–103.

(33)

Zamora, P.O. et al. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 5/6, s. 795–801.

(34)

Asakura, M. et al. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, t. 652/2, s. 122–130.

(35)

Lorge, E. et al. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 655/1-2, s. 1–3.

(36)

Galloway, S. et al. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 723/2, s. 77–83.

(37)

Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, t. 724/1-2, s. 86–87.

(38)

Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. W: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (red.) Cambridge University Press, Cambridge, s. 141–154.

(39)

OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (wytyczne dotyczące badań 473, 476 i 487) ENV/JM/TG(2014)17. Dostępny na wniosek.

(40)

Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 741/1-2, s. 32–56.

(41)

Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the in vitro chromosome aberrations assay. In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, t. 54/1, s. 36–43.

(42)

EPA, Urząd ds. Bezpieczeństwa Substancji Chemicznych i Zapobiegania Zanieczyszczeniom (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.

(43)

USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Dostępny na stronie internetowej: https://federalregister.gov/a/2012-13774.

(44)

OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines”, Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, seria OECD dotycząca badań i oceny nr 198, OECD Publishing, Paryż.

(45)

ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (red.), Karger Publishers Inc., Connecticut.

(46)

Scott, D. et al. (1990), Metaphase chromosome aberration assays in vitro, w:Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (red.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 62–86.

(47)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, t. 723/2, s. 87–90.

(48)

Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, wyd. II, John Wiley and Sons, Nowy Jork.

(49)

Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, wyd. III, John Wiley & Sons, Nowy Jork.

(50)

Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 10 / suplement 10, s. 1–175.

(51)

Richardson, C. et al. (1989), „Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays”, w Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (red.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 141–154.

(52)

Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, t. 287/1, s. 29–46.

(53)

Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, t. 119/3, s. 403–413.

(54)

Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin – induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, t. 43/3, s. 1362–1364.

(55)

Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research, t. 312, s. 139–149.

Dodatek 1

DEFINICJE

Aneuploidia : wszelkie odchylenia od zwykłej diploidalnej (lub haploidalnej) liczby chromosomów w pojedynczym chromosomie lub w większej ich liczbie, ale nie w całym zestawie czy całych zestawach chromosomów (poliploidalność).

Apoptoza : zaprogramowana śmierć komórki, na którą składa się szereg etapów prowadzących do rozpadu komórek w cząstki otoczone błoną, które są następnie eliminowane przez fagocytozę lub wydalanie.

Proliferacja komórek : wzrost liczby komórek w wyniku mitotycznego podziału komórek.

Substancja chemiczna : substancja lub mieszanina.

Złamanie chromatydowe : przerwanie ciągłości pojedynczej chromatydy, w której wyraźnie doszło do wypaczenia jednej z chromatyd.

Przerwa chromatydowa : niebarwiący obszar (achromatyczne uszkodzenie) pojedynczej chromatydy, w którym doszło do nieznacznego wypaczenia chromatydy.

Aberracja typu chromatydowego : strukturalne uszkodzenie chromosomu wyrażone jako złamanie pojedynczych chromatyd lub złamanie i ponowne połączenie się chromatyd.

Aberracja typu chromosomowego : strukturalne uszkodzenie chromosomu wyrażone jako złamanie chromatyd lub złamanie i ponowne połączenie się obu chromatyd w tym samym miejscu.

Klastogen : każda substancja chemiczna, która powoduje strukturalne aberracje chromosomowe w populacjach komórek lub organizmów eukariotycznych.

Stężenia : oznaczają stężenia końcowe badanej substancji chemicznej w podłożu.

Cytotoksyczność : w odniesieniu do badań objętych niniejszą metodą badawczą przeprowadzanych z wykorzystaniem linii komórkowych cytotoksyczność określa się jako obniżenie względnego podwojenia populacji (RPD) lub obniżenie względnego wzrostu liczby komórek (RICC) komórek poddanych działaniu substancji w porównaniu z kontrolą ujemną (zob. pkt 17 i dodatek 2). W odniesieniu do badań objętych niniejszą metodą badawczą przeprowadzanych z wykorzystaniem pierwotnych kultur limfocytów cytotoksyczność określa się jako obniżenie indeksu mitotycznego (MI) komórek poddanych działaniu substancji w porównaniu z kontrolą ujemną (zob. pkt 18 i dodatek 2).

Endoreduplikacja : proces, w którym po fazie S replikacji DNA jądro komórkowe nie wchodzi w fazę mitozy, lecz rozpoczyna się kolejna faza S. Wynikiem są chromosomy o 4, 8, 16, ... chromatydach.

Genotoksyczny : ogólny termin odnoszący się do wszelkiego rodzaju uszkodzeń DNA lub chromosomu, w tym złamań, delecji, adduktów, modyfikacji i sprzężeń nukleotydów, rearanżacji, mutacji genowych, aberracji chromosomowych oraz aneuploidii. Nie wszystkie rodzaje efektów genotoksycznych powodują mutacje lub stałe uszkodzenia chromosomu.

Indeks mitotyczny (MI) : stosunek liczby komórek w metafazie do całkowitej liczby komórek zaobserwowanych w populacji komórek; wskazanie stopnia proliferacji tej populacji.

Mitoza : podział jądra komórkowego, na który zazwyczaj składają się profaza, prometafaza, metafaza, anafaza i telofaza.

Mutagenny : tworzący dziedziczne zmiany w sekwencji lub sekwencjach par zasad DNA w genach lub w strukturze chromosomów (aberracje chromosomowe).

Aberracja liczby : zmiana liczby chromosomów względem standardowej liczby chromosomów typowej dla wykorzystywanych komórek.

Poliploidalność : aberracje liczby chromosomów w komórkach lub organizmach, obejmujące cały zestaw lub zestawy chromosomów, a nie pojedynczy chromosom lub chromosomy (aneuploidia).

Status p53 : białko p53 bierze udział w procesie regulacji cyklu komórkowego, apoptozy i naprawy DNA. Komórki, w których odnotowuje się niedobór białka p53 i które są niezdolne do zatrzymania cyklu komórkowego lub do usunięcia uszkodzonych komórek poprzez apoptozę lub inne mechanizmy (np. poprzez zainicjowanie procesu naprawy DNA) powiązane z funkcjami, jakie białko p53 pełni w reakcji na uszkodzenie DNA, powinny teoretycznie być bardziej podatne na mutacje genowe lub aberracje chromosomowe.

Względny wzrost liczby komórek (RICC) : wzrost liczby komórek w kulturach poddanych działaniu substancji chemicznej w zestawieniu ze wzrostem liczby komórek w kulturach, które nie zostały poddane działaniu substancji chemicznej, wyrażony jako odsetek.

Względne podwojenie populacji (RPD) : wzrost liczby podwojeń populacji w kulturach poddanych działaniu substancji chemicznej w zestawieniu ze wzrostem liczby komórek w kulturach, które nie zostały poddane działaniu substancji chemicznej, wyrażony jako odsetek.

Frakcja S9 uzyskana z wątroby : supernatant z homogenatu wątroby po odwirowaniu przy 9 000 g, tj. surowy ekstrakt z wątroby.

Preparat frakcji S9 : preparat złożony z frakcji S9 uzyskanej z wątroby i kofaktorów niezbędnych do aktywności metabolicznej enzymów.

Kontrola z rozpuszczalnikiem : ogólny termin opisujący kultury kontrolne otrzymujące wyłącznie rozpuszczalnik stosowany do rozpuszczenia badanej substancji chemicznej.

Strukturalna aberracja chromosomowa : zmiana w strukturze chromosomu wykrywalna przez badanie mikroskopowe etapu metafazy w cyklu podziału komórki, zaobserwowana jako delecje, fragmenty, zmiany zachodzące między chromosomami lub w obrębie chromosomu.

Badana substancja chemiczna : dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.

Próby kontrolne niepoddawane działaniu substancji : hodowle, które nie są poddawane działaniu żadnej substancji (tj. badanej substancji chemicznej ani rozpuszczalnika), lecz które są równolegle przetwarzane w taki sam sposób jako hodowle otrzymujące badaną substancję chemiczną.

Dodatek 2

WZORY DO OCENY CYTOTOKSYCZNOŚCI

Indeks mitotyczny:

Formula

Zaleca się korzystanie ze wskaźnika względnego wzrostu liczby komórek (RICC) lub względnego podwojenia populacji (RPD), ponieważ oba te wskaźniki uwzględniają odsetek populacji komórek, które uległy podziałowi.

Formula

Formula

gdzie:

Podwojenie populacji = [log (liczba komórek po poddaniu działaniu substancji chemicznej ÷ początkowa liczba komórek)] ÷ log 2

Na przykład RICC lub RPD wynoszący 53 % oznacza, że cytotoksyczność/cytostazę na poziomie 47 %, natomiast cytotoksyczność/cytostaza na poziomie 55 % mierzona za pomocą indeksu mitotycznego oznacza, że faktyczny indeks mitotyczny wynosi 45 % wartości dla grupy kontrolnej.

W każdym razie należy ustalić liczbę komórek przed poddaniem działaniu substancji chemicznej, przy czym liczba ta powinna być taka sama zarówno w przypadku hodowli poddanych działaniu substancji chemicznej, jak i w przypadku hodowli na potrzeby kontroli ujemnej.

Chociaż wskaźnik RCC (tj. liczba komórek w hodowlach poddanych działaniu substancji chemicznej podzielona przez liczbę komórek w hodowlach kontrolnych) był w przeszłości wykorzystywany jako parametr cytotoksyczności, nie zaleca się dalszego korzystania z tego wskaźnika, ponieważ może to skutkować niedoszacowaniem cytotoksyczności.

W przypadku hodowli na potrzeby kontroli ujemnej przy podwajaniu populacji należy zachować zgodność z wymogiem pobierania próbek komórek po poddaniu ich działaniu substancji chemicznej w czasie równoważnym około 1,5-krotności normalnego czasu trwania cyklu komórkowego, przy czym wartość indeksu mitotycznego powinna być na tyle wysoka, aby zapewnić dostateczną liczbę komórek na etapie mitozy i zagwarantować możliwość wiarygodnego wyliczenia wartości 50-procentowej redukcji.”;

”;

4)

w części B rozdział B.11 otrzymuje brzmienie:

„B.11   Test aberracji chromosomowych na szpiku kostnym ssaków

WPROWADZENIE

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 475 (2016). Stanowi ona część cyklu metod badawczych dotyczących toksykologii genetycznej. Opracowany został dokument OECD, który zawiera zwięzłe informacje na temat badań w zakresie toksykologii genetycznej oraz przegląd ostatnich zmian, jakie wprowadzono do wytycznych dotyczących badań (1).

Test aberracji chromosomowej na szpiku kostnym ssaków in vivo ma szczególne znaczenie dla oceny genotoksyczności, ponieważ czynniki związane z metabolizmem, farmakokinetyką oraz procesami naprawy DNA in vivo – choć mogą różnić się w zależności od gatunku – są aktywne i wywierają wpływ na reakcje. Przeprowadzenie testu in vivo jest również przydatne do celów dalszego badania genotoksyczności stwierdzonej w układzie in vitro.

Test aberracji chromosomowej na szpiku kostnym ssaków in vivo przeprowadza się w celu wykrycia strukturalnych aberracji chromosomowych indukowanych badanymi substancjami chemicznymi w komórkach szpiku kostnego zwierząt, zazwyczaj gryzoni (2) (3) (4) (5). Strukturalne aberracje chromosomowe mogą występować w dwóch typach – chromosomowym lub chromatydowym. Choć większość genotoksycznych aberracji indukowanych substancjami chemicznymi ma postać aberracji typu chromatydowego, niekiedy występują również aberracje typu chromosomowego. Aberracje chromosomowe i powiązane z nimi zdarzenia są przyczyną wielu ludzkich chorób genetycznych, a także istnieją istotne dowody wskazujące, że tego rodzaju zmiany patologiczne i powiązane z nimi zdarzenia powodują zmiany w onkogenach oraz w antyonkogenach i przyczyniają się do powstawania zmian nowotworowych u ludzi oraz w układach doświadczalnych. W trakcie przeprowadzania testów aberracji chromosomowych in vivo może wystąpić poliploidalność (w tym endoreduplikacja). Sam fakt wzrostu poliploidalności nie musi jednak świadczyć o właściwościach aneugenicznych i może stanowić po prostu skutek zaburzenia cyklu komórkowego lub cytotoksyczności. Celem niniejszego testu nie jest pomiar aneuploidii. Testy in vivo i in vitro zalecane do wykrywania aneuploidii to, odpowiednio, test mikrojądrowy na erytrocytach ssaków in vivo (rozdział B.12 niniejszego załącznika) lub test mikrojądrowy na komórkach ssaków in vitro (rozdział B.49 niniejszego załącznika).

Definicje stosowanych terminów zamieszczono w dodatku 1.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE

Chociaż niniejszy test przeprowadza się zazwyczaj na gryzoniach, w niektórych przypadkach dopuszcza się również możliwość wykorzystania innych gatunków, jeżeli zostanie to naukowo uzasadnione. Tkanką docelową w tym teście jest szpik kostny, ponieważ jest on wysoce unaczynioną tkanką zawierającą populację komórek o szybkim cyklu podziału, które można w łatwy sposób wyizolować i poddać działaniu substancji chemicznej. W sprawozdaniu powinno się przedstawić naukowe uzasadnienie wykorzystania gatunków innych niż szczury i myszy. W przypadku wykorzystywania zwierząt innych niż gryzonie zaleca się włączenie pomiaru aberracji chromosomowych w szpiku kostnym do innego stosownego badania toksyczności.

Jeżeli istnieją dowody świadczące o tym, że badana(-e) substancja(-e) chemiczna(-e) lub jej (ich) metabolit(y) nie dotrą do tkanki docelowej, przeprowadzenie tego badania może nie być wskazane.

Przed zastosowaniem niniejszej metody badawczej z użyciem mieszaniny w celu zgromadzenia danych na potrzeby założonego celu regulacyjnego należy zastanowić się, czy zastosowanie niniejszej metody może doprowadzić do uzyskania wyników odpowiednich z punktu widzenia tego celu, a jeżeli tak – dlaczego. Przeprowadzenie takiej analizy nie jest konieczne, jeżeli ustanowiono wymóg regulacyjny dotyczący badania danej mieszaniny.

ZASADA METODY BADAWCZEJ

Zwierzęta poddaje się działaniu badanej substancji chemicznej z zastosowaniem odpowiedniej drogi narażenia, a po upływie odpowiedniego czasu od podania substancji chemicznej uśmierca się je w humanitarny sposób. Przed uśmierceniem zwierzętom podaje się substancję chemiczną zawierającą środek zatrzymujący metafazę (np. kolchicynę lub colcemid). Następnie z komórek szpiku kostnego przygotowuje się preparaty chromosomowe, które się barwi, po czym komórki w metafazie bada się pod kątem wystąpienia aberracji chromosomowych.

WERYFIKACJA BIEGŁOŚCI LABORATORIUM

Badanie biegłości

Aby ustalić wystarczające doświadczenie laboratorium w zakresie omawianego testu przed zastosowaniem go w rutynowych badaniach, laboratorium powinno wykazać zdolność do odtworzenia oczekiwanych wyników na podstawie opublikowanych danych (np. (6)) w odniesieniu do częstości występowania aberracji chromosomowych z zastosowaniem co najmniej dwóch substancji chemicznych służących do kontroli dodatniej (uwzględniając słabe reakcje wywołane niskimi dawkami substancji służących do kontroli dodatniej), takich jak substancje wymienione w tabeli 1, oraz z zastosowaniem kontroli ze zgodnym nośnikiem/rozpuszczalnikiem (zob. pkt 22). W tego rodzaju doświadczeniach należy stosować dawki, które prowadzą do powstania możliwych do odtworzenia i powiązanych z wielkością dawki przyrostów i które umożliwiają wykazanie czułości i zakresu oznaczania układu badawczego w odniesieniu do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania (szpik kostny) przy wykorzystaniu metody zliczania, która ma być stosowana w laboratorium. Wymóg ten nie dotyczy laboratoriów, które dysponują odpowiednim doświadczeniem, tj. laboratoriów prowadzących bazę danych historycznych, o której mowa w pkt 10–14.

Dane historyczne dotyczące kontroli

W toku badań biegłości laboratorium powinno ustalić:

zakres i rozkład historycznych wyników kontroli dodatniej oraz

zakres i rozkład historycznych wyników kontroli ujemnej.

Przy pierwszym gromadzeniu danych dotyczących rozkładu historycznych wyników kontroli ujemnej wyniki jednoczesnej kontroli ujemnej powinny być zgodne z opublikowanymi danymi dotyczącymi kontroli, o ile takie dane istnieją. W miarę dodawania kolejnych danych doświadczalnych do rozkładu danych historycznych dotyczących kontroli jednoczesne kontrole ujemne powinny w idealnych warunkach mieścić się w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % dla tego rozkładu. Prowadzona przez dane laboratorium baza danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej powinna być statystycznie istotna, aby zapewnić zdolność laboratorium do oceny rozkładu własnych danych dotyczących kontroli ujemnej. Z literatury przedmiotu wynika, że baza danych powinna zawierać wyniki co najmniej 10 doświadczeń, ale najlepiej co najmniej 20 doświadczeń przeprowadzonych w porównywalnych warunkach doświadczalnych. Laboratoria powinny stosować metody kontroli jakości, takie jak karty kontrolne (np. karty C lub karty X-średnie (7)) w celu określania stopnia zmienności gromadzonych przez nie danych oraz w celu wykazania, że stosowana przez nie metodologia jest „pod kontrolą”. Dalsze zalecenia dotyczące sposobu gromadzenia i wykorzystywania danych historycznych (tj. kryteria włączania danych do zbioru danych historycznych i wykluczania danych z tego zbioru oraz kryteria dopuszczalności dla danego doświadczenia) można znaleźć w literaturze (8).

Jeżeli laboratorium nie przeprowadziło dostatecznie dużej liczby doświadczeń, aby ustalić istotny statystycznie rozkład danych z kontroli ujemnej (zob. pkt 11) w trakcie badań biegłości (opisanych w pkt 9), dopuszcza się możliwość ustalenia rozkładu w trakcie pierwszych rutynowych badań. Takie podejście powinno być zgodne z zaleceniami przedstawionymi w literaturze (8), a wyniki kontroli ujemnej uzyskane w ramach tych doświadczeń powinny pozostać zgodne z opublikowanymi danymi dotyczącymi kontroli ujemnej.

Wszelkie zmiany w protokole doświadczalnym należy rozpatrywać pod kątem tego, czy ich wpływ na otrzymywane dane pozostaje spójny z dotychczas prowadzonymi przez laboratorium bazami danych historycznych dotyczących kontroli. Wyłącznie poważne niespójności powinny skutkować utworzeniem nowej bazy danych historycznych dotyczących kontroli, w przypadku gdy z ekspertyzy wynika, że dane odbiegają od poprzedniego rozkładu (zob. pkt 11). Podczas tworzenia nowej bazy danych utworzenie kompletnej bazy danych dotyczących kontroli ujemnej może nie być konieczne do przeprowadzenia samego badania, o ile laboratorium może wykazać, że wartości uzyskiwane przez nie w ramach jednoczesnej kontroli ujemnej pozostają zgodne z wynikami zawartymi w jego poprzedniej bazie danych albo z odpowiednimi opublikowanymi danymi.

Dane dotyczące kontroli ujemnej powinny obejmować częstość występowania strukturalnych aberracji chromosomowych (w tym przerw) u każdego zwierzęcia. Jednoczesne kontrole ujemne powinny w idealnych warunkach mieścić się w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % dla rozkładu danych zawartych w prowadzonej przez laboratorium bazie danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej. W przypadku gdy dane dotyczące jednoczesnej kontroli ujemnej nie mieszczą się w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 %, włączenie ich do rozkładu kontroli historycznej może być dopuszczalne, pod warunkiem że dane te nie stanowią skrajnych obserwacji nietypowych oraz że istnieją dowody świadczące o tym, iż dany układ badawczy znajduje się „pod kontrolą” (zob. pkt 11), a także nie ma dowodów wskazujących na błąd techniczny lub ludzki.

OPIS METODY

Przygotowania

Wybór gatunku zwierząt

Należy prowadzić badania na zdrowych, młodych, dorosłych zwierzętach pochodzących ze szczepów na ogół wykorzystywanych w badaniach laboratoryjnych. Badania przeprowadza się zazwyczaj na szczurach, choć wykorzystywanie myszy również można uznać za stosowne. Dopuszcza się również możliwość wykorzystania wszelkich innych odpowiednich gatunków ssaków, o ile w sprawozdaniu zostanie przedstawione uzasadnienie naukowe.

Warunki utrzymywania i karmienia

W przypadku gryzoni temperatura w pomieszczeniu dla zwierząt powinna wynosić 22 °C (± 3 °C). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 40 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza okresami czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne z zachowaniem cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Do karmienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne oraz należy zapewnić zwierzętom nieograniczony dostęp do wody do picia. Wybór paszy może zależeć od potrzeby zapewnienia odpowiedniej domieszki badanej substancji chemicznej, jeżeli jest ona podawana tą drogą. Gryzonie należy trzymać w małych grupach (nie więcej niż pięć sztuk) składających się ze zwierząt tej samej płci i należących do tej samej grupy badanej, jeżeli nie przewiduje się, że mogłoby dojść do agresywnego zachowania, najlepiej w klatkach z pełną podłogą, oraz zapewnić im odpowiednie urozmaicenie warunków bytowania. Zwierzęta można utrzymywać pojedynczo tylko wtedy, gdy ma to uzasadnienie naukowe.

Przygotowanie zwierząt

Zazwyczaj wykorzystuje się zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta (w przypadku gryzoni najlepiej w wieku 6–10 tygodni na początku poddawania działaniu substancji chemicznej, chociaż dopuszcza się również używanie nieco starszych zwierząt), które losowo przydziela się do grup kontrolnych i grup poddawanych działaniu substancji chemicznej. Zwierzęta zostają indywidualnie oznakowane przy użyciu humanitarnej, mało inwazyjnej metody (np. poprzez obrączkowanie, kolczykowanie, wszczepianie mikroukładów i identyfikację biometryczną, ale nie przycinanie uszu lub palców) i aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej pięć dni. Klatki należy rozmieścić w taki sposób, aby zminimalizować potencjalny wpływ ich układu. Należy unikać zanieczyszczenia krzyżowego kontrolą dodatnią i badaną substancją chemiczną. W momencie rozpoczęcia badania różnice w masie ciała zwierząt powinny być minimalne i nie powinny przekraczać ± 20 % średniej masy dla każdej płci.

Przygotowanie dawek

Badane substancje chemiczne w stanie stałym należy rozpuszczać lub przygotowywać w postaci zawiesiny w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach lub dodawać do paszy lub wody do picia przed podaniem dawki zwierzętom. Badane substancje chemiczne w stanie ciekłym mogą być dawkowane bezpośrednio lub można je rozcieńczać przed dawkowaniem. W przypadku narażenia inhalacyjnego badane substancje chemiczne można podawać w postaci gazu, pary lub stałych/ciekłych aerozoli, w zależności od ich właściwości fizykochemicznych. Należy stosować świeże preparaty badanej substancji chemicznej, chyba że z danych dotyczących stabilności wynika, iż przechowywanie tych preparatów jest dopuszczalne, i chyba że w danych tych określono warunki prawidłowego przechowywania takich preparatów.

Kontrola z rozpuszczalnikiem/nośnikiem

Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien wywoływać efektów toksycznych przy stosowanych poziomach dawek oraz nie powinno istnieć ryzyko, że wejdzie on w reakcję chemiczną z badanymi substancjami chemicznymi. Jeśli wykorzystywane są inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki, ich włączenie do doświadczenia powinno być poparte danymi wskazującymi ich zgodność. Zaleca się, aby w miarę możliwości w pierwszej kolejności rozważyć zastosowanie wodnego rozpuszczalnika/nośnika. Wśród przykładów powszechnie wykorzystywanych zgodnych rozpuszczalników/nośników można wymienić wodę, sól fizjologiczną, roztwór metylocelulozy, roztwór soli sodowej karboksymetylocelulozy, oliwę z oliwek i olej kukurydziany. W przypadku braku historycznych lub opublikowanych danych dotyczących kontroli wskazujących, że wybrany nietypowy rozpuszczalnik/nośnik nie indukuje strukturalnych aberracji chromosomowych ani nie powoduje żadnego innego szkodliwego efektu, należy wykonać badanie wstępne w celu ustalenia dopuszczalności stosowania kontroli z rozpuszczalnikiem/nośnikiem.

Kontrole

Kontrole dodatnie

W każdym badaniu należy co do zasady uwzględnić grupę zwierząt otrzymującą substancję chemiczną służącą do kontroli dodatniej. Od tego obowiązku można odstąpić, jeżeli laboratorium badawcze wykaże biegłość w przeprowadzaniu takiego badania i ustanowi zakres historycznych wyników kontroli dodatniej. W przypadku nieuwzględnienia jednoczesnej kontroli dodatniej do każdego doświadczenia należy włączyć kontrolę na potrzeby oceny ilościowej (utrwalone i niebarwione preparaty). Tego rodzaju kontrole można przeprowadzić, włączając do oceny ilościowej wyników badania odpowiednie próbki referencyjne, które zostały pozyskane w trakcie odrębnego przeprowadzanego okresowo (np. co 6–18 miesięcy) doświadczenia z wykorzystaniem kontroli dodatniej i które są przechowywane w laboratorium przeprowadzającym test; na przykład w trakcie badania biegłości i – w stosownych przypadkach – w regularnych odstępach czasu w późniejszym okresie.

Substancje chemiczne służące do kontroli dodatniej powinny w przewidywalny sposób generować zauważalny wzrost częstości występowania komórek ze strukturalnymi aberracjami chromosomowymi w porównaniu z częstością samorzutną. Dawki stosowane do celów kontroli dodatniej należy dobierać w taki sposób, aby efekty były jasne, lecz aby osoba zliczająca nie była w stanie natychmiast zidentyfikować zakodowanych próbek. Dopuszcza się, aby substancja chemiczna służąca do kontroli dodatniej była podawana inną drogą niż badana substancja chemiczna i zgodnie z innym harmonogramem podawania substancji chemicznej, a także aby próbki były pobierane wyłącznie w określonym czasie. Ponadto w stosownych przypadkach można rozważyć możliwość zastosowania substancji chemicznych służących do kontroli dodatniej powiązanych z określoną klasą chemiczną. W tabeli 1 przedstawiono przykładowe substancje chemiczne służące do kontroli dodatniej.

Tabela 1

Przykładowe substancje chemiczne służące do kontroli dodatniej

Substancja chemiczna

Numer CAS

Metanosulfonian etylu

62-50-0

Metanosulfonian metylu

66-27-3

Etylonitrozomocznik

759-73-9

Mitomycyna C

50-07-7

Cyklofosfamid (monohydrat)

50-18-0 (6055-19-2)

Trietylenomelamina

51-18-3

Kontrole ujemne

Od zwierząt z grupy kontrolnej ujemnej należy pobierać próbki w każdym okresie pobierania próbek i należy postępować z nimi w taki sam sposób, jak ze zwierzętami należącymi do grupy badanej, z tym że nie poddaje się ich działaniu badanej substancji chemicznej. Jeżeli do podania badanej substancji chemicznej wykorzystuje się rozpuszczalnik/nośnik, zwierzętom należącym do grupy kontrolnej również należy podać ten rozpuszczalnik/nośnik. Jeżeli jednak dane historyczne dotyczące kontroli ujemnej gromadzone przez laboratorium badawcze przy każdorazowym pobieraniu próbek będą wskazywały na stały poziom zmienności pomiędzy zwierzętami i stałą częstość występowania komórek ze strukturalnymi aberracjami chromosomowymi, konieczne może być tylko jedno pobranie próbek na potrzeby kontroli ujemnej. Jeżeli w ramach kontroli ujemnej przeprowadza się tylko jedno pobieranie próbek, próbki należy pobrać w pierwszym okresie pobierania próbek w ramach badania.

PROCEDURA

Liczba i płeć zwierząt

Na ogół reakcja mikrojądrowa jest podobna u samców i samic (9) i oczekuje się, że podobnie będzie w przypadku strukturalnych aberracji chromosomowych; dlatego też większość badań można przeprowadzić na zwierzętach dowolnej płci. Dane wskazujące na występowanie istotnych różnic między samcami i samicami (np. różnice w toksyczności ogólnoustrojowej, metabolizmie, biodostępności, toksyczności w szpiku kostnym itd., w tym np. w badaniu ustalającym zakres dawkowania) stanowią przesłankę przemawiającą za przeprowadzaniem badań na zwierzętach obu płci. W takim przypadku właściwe może być przeprowadzenie badania na zwierzętach obu płci, np. w ramach badania toksyczności dawki powtórzonej. Zastosowanie planu czynnikowego może być właściwe, jeżeli do badania używa się zwierząt obu płci. Szczegółowe informacje dotyczące sposobu analizy danych z wykorzystaniem tego planu można znaleźć w dodatku 2.

Na początku badania należy ustalić liczebność grup w celu zapewnienia w każdej grupie co najmniej 5 nadających się do poddania analizie zwierząt jednej płci lub każdej płci, jeżeli wykorzystuje się zwierzęta obu płci. Jeżeli narażenie człowieka na działanie substancji chemicznych może mieć charakter uzależniony od płci, jak to na przykład ma miejsce w przypadku niektórych produktów leczniczych, badanie należy przeprowadzić na zwierzętach odpowiedniej płci. Wskazówka odnośnie do maksymalnych typowych wymagań w zakresie liczby zwierząt – w przypadku badania szpiku kostnego, w ramach którego dwukrotnie pobiera się próbki, z trzema grupami otrzymującymi dawki i jednoczesną kontrolą ujemną i dodatnią (każda grupa złożona z pięciu zwierząt jednej płci) wymagane byłoby użycie 45 zwierząt.

Poziomy dawek

W przypadku przeprowadzenia wstępnego badania ustalającego zakres dawkowania ze względu na brak dostępnych odpowiednich danych umożliwiających dobranie dawki, badanie takie należy wykonać w tym samym laboratorium z wykorzystaniem tego samego gatunku, szczepu, płci i schematu podawania substancji chemicznej, jakie mają być stosowane w badaniu głównym (10). Celem badania powinno być określenie maksymalnej tolerowanej dawki (MTD) zdefiniowanej jako najwyższa dawka tolerowana bez wywoływania objawów toksyczności ograniczającej badanie w stosunku do czasu trwania badania (na przykład dawka wywołująca spadek masy ciała lub cytotoksyczność układu krwiotwórczego, ale niepowodująca śmierci lub objawów bólu, cierpienia lub stresu, które wiązałyby się z koniecznością uśmiercenia zwierzęcia w humanitarny sposób (11)).

Najwyższą dawkę można również zdefiniować jako dawkę, która wywołuje pewne oznaki toksyczności w szpiku kostnym.

Substancje chemiczne wykazujące intensywne parametry toksykokinetyczne lub wywołujące procesy detoksykacji, które mogą prowadzić do zmniejszenia narażenia po długim okresie podawania substancji chemicznej, mogą stanowić wyjątki w odniesieniu do kryteriów ustalania dawki i powinny być oceniane na zasadzie jednostkowych przypadków.

Aby uzyskać informacje na temat zależności dawka-odpowiedź, w kompletnym badaniu należy uwzględnić grupę kontrolną ujemną oraz co najmniej trzy poziomy dawek, przy czym każda kolejna dawka jest większa od poprzedniej na ogół dwukrotnie, ale nie więcej niż czterokrotnie. Jeżeli wyniki badania ustalającego zakres dawkowania lub istniejące dane będą wskazywały, że badana substancja chemiczna nie wywołuje toksyczności, najwyższa dawka w przypadku podania jednorazowego powinna wynosić 2 000 mg/kg masy ciała. Jeżeli jednak badana substancja chemiczna będzie miała działanie toksyczne, maksymalną tolerowaną dawkę należy ustalić na poziomie odpowiadającym najwyższej podanej dawce, przy czym najlepiej byłoby, gdyby zastosowane poziomy dawek obejmowały zakres od dawki maksymalnej do dawki wywołującej toksyczność w niewielkim stopniu lub dawki niewywołującej toksyczności. W przypadku zaobserwowania toksyczności w tkance docelowej (szpiku kostnym) przy wszystkich badanych poziomach dawek zaleca się dalsze badania z wykorzystaniem dawek nietoksycznych. W przypadku badań przeprowadzanych w celu uzyskania bardziej szczegółowych ilościowych informacji na temat zależności dawka-odpowiedź konieczne może okazać się utworzenie dodatkowych grup otrzymujących dawki. Wspomniane wartości graniczne mogą różnić się w przypadku niektórych rodzajów badanych substancji chemicznych (np. produktów leczniczych przeznaczonych dla ludzi), które podlegają szczególnym wymogom.

Badanie graniczne

Jeżeli wyniki badania ustalającego zakres dawkowania lub dostępne dane na temat powiązanych szczepów zwierząt będą wskazywały, że poddanie zwierząt działaniu substancji chemicznej w stężeniu odpowiadającym co najmniej dawce granicznej (o której mowa poniżej) nie wywołuje żadnych możliwych do zaobserwowania efektów toksycznych (w tym spadku tempa dzielenia się komórek szpiku kostnego lub innych oznak świadczących o cytotoksyczności tkanki docelowej), i jeżeli wyniki badań genotoksyczności in vitro lub dane dotyczące strukturalnie powiązanych substancji chemicznych nie będą wskazywały na możliwość wystąpienia genotoksyczności, przeprowadzenie pełnego badania z trzema poziomami dawek może nie być konieczne, o ile wykazano, że badane substancje chemiczne docierają do tkanki docelowej (szpiku kostnego). W takich przypadkach pojedynczy poziom dawki, odpowiadający dawce granicznej, może być wystarczający. Jeżeli okres podawania przekracza 14 dni, dawka graniczna wynosi 1 000 mg/kg masy ciała na dobę. W przypadku okresów podawania wynoszących 14 dni lub mniej dawka graniczna wynosi 2 000 mg/kg masy ciała na dobę.

Podawanie dawek

Planując badanie, należy wziąć pod uwagę przewidywaną drogę narażenia ludzi. W związku z tym można wybrać jako uzasadnione takie drogi podawania, jak: w pokarmie, z wodą do picia, miejscowe, podskórne, dożylne, ustne (przez sondę), przez wdychanie, dotchawicze lub przez implantację. W każdym razie drogę narażenia należy dobrać w taki sposób, aby zapewnić odpowiednie narażenie tkanek docelowych. Nie zaleca się na ogół dokonywania wstrzyknięć dootrzewnowych, ponieważ nie jest to typowa droga narażenia ludzi – taką drogę należy stosować wyłącznie w przypadku wystąpienia konkretnego uzasadnienia naukowego. Jeżeli badaną substancję chemiczną dodaje się do paszy lub wody do picia, w szczególności w przypadku pojedynczej dawki substancji, należy upewnić się, że okres między spożyciem paszy i wody a pobraniem próbki jest wystarczający do tego, aby zapewnić możliwość wykrycia skutków podania substancji (zob. pkt 33–34). Maksymalna objętość płynu, jaką można podać przez sondę lub wstrzyknąć jednorazowo, zależy od wielkości zwierzęcia doświadczalnego. Objętość ta nie powinna co do zasady przekraczać 1 ml/100 g masy ciała, oprócz roztworów wodnych, w przypadku których można zastosować maksymalnie 2 ml/100 g masy ciała. Wykorzystanie objętości wyższych niż podane musi być uzasadnione. Należy ograniczyć zmienność objętości stosowanej w badaniu, dostosowując stężenie w taki sposób, by zapewnić podawanie substancji chemicznej w takiej samej objętości w stosunku do masy ciała przy wszystkich poziomach dawek – nie dotyczy to jednak badanych substancji chemicznych o podrażniającym lub żrącym działaniu, które w normalnych warunkach wywołują poważniejsze skutki w przypadku ich podania w wyższych stężeniach.

Harmonogram podawania substancji chemicznej

Badane substancje chemiczne podaje się zwykle jako pojedynczą dawkę, ale można je również podawać jako dawkę dzieloną (tj. co najmniej dwa podania substancji tego samego dnia w odstępie czasu nie większym niż 2–3 godziny), aby łatwiej było podawać substancję w dużej objętości. W takim przypadku lub przy podawaniu badanej substancji chemicznej drogą wziewną okres pobierania próbek należy zaplanować w oparciu o czas podania ostatniej dawki lub czas ustania narażenia na działanie substancji.

Obecnie dostępnych jest niewiele danych na temat odpowiedniości metody powtarzanego dawkowania w kontekście niniejszego testu. W przypadku jednak, gdy połączenie niniejszego testu z badaniem toksyczności dawki powtórzonej byłoby pożądane, należy dołożyć starań, aby uniknąć utraty komórek mitotycznych z aberracjami chromosomowymi, co może nastąpić w przypadku podania dawek toksycznych. Tego rodzaju połączenie jest dopuszczalne, w przypadku gdy najwyższa dawka jest większa niż dawka graniczna lub równa dawce granicznej (zob. pkt 29), a dawkę graniczną podaje się grupie otrzymującej dawkę przez cały okres podawania substancji chemicznej. Test mikrojądrowy (metoda badawcza B.12) należy postrzegać jako preferowaną metodę badania in vivo pod kątem aberracji chromosomowych, w przypadku gdy pożądane jest połączenie tej metody z innymi metodami badawczymi.

Próbki szpiku kostnego należy pobrać dwukrotnie w różnym czasie po poddaniu pojedynczych dawek substancji. W przypadku gryzoni czas trwania pierwszego okresu pobierania próbek powinien odpowiadać 1,5-krotności normalnego czasu trwania cyklu komórkowego (cykl komórkowy trwa zazwyczaj od 12 do 18 godzin od zakończenia okresu poddawania działaniu substancji chemicznej). Ponieważ czas wymagany na wchłonięcie i metabolizm badanych substancji chemicznych oraz jego skutki dla kinetyki cyklu komórkowego mogą wywierać wpływ na optymalny czas na wykrycie aberracji chromosomowej, zaleca się pobranie próbek w późniejszym terminie, tj. po upływie 24 godzin od pierwszego pobrania próbek. Przy pierwszym pobraniu próbek wszystkie grupy otrzymujące dawki powinny zostać poddane działaniu substancji chemicznej, po czym należy pobrać próbki do analizy; w kolejnych okresach pobierania próbek należy jednak podawać wyłącznie najwyższą dawkę. Jeżeli z uzasadnionych naukowo względów dawki podaje się częściej niż raz dziennie, z reguły powinno się przeprowadzić jedno pobranie próbek po upływie około 1,5-krotności normalnego czasu trwania cyklu komórkowego od ostatniego poddania działaniu substancji chemicznej.

Po poddaniu działaniu substancji chemicznej i przed pobraniem próbki zwierzętom wstrzykuje się dootrzewnowo odpowiednią dawkę środka zatrzymującego metafazę (np. colcemidu lub kolchicyny), a próbki pobiera się po upływie odpowiedniego czasu od wstrzyknięcia tego środka. W przypadku myszy przed pobraniem próbek musi upłynąć 3–5 godzin, a w przypadku szczurów – 2–5 godzin. Komórki pobiera się ze szpiku kostnego, powiększa się je, utrwala i barwi, po czym bada się je pod kątem wystąpienia aberracji chromosomowych (12).

Obserwacje

Ogólne obserwacje kliniczne zwierząt doświadczalnych wraz z rejestrowaniem objawów klinicznych powinny odbywać się co najmniej raz dziennie, najlepiej każdego dnia o tej samej porze oraz z uwzględnieniem szczytowego okresu przewidywanych skutków po dawkowaniu. Co najmniej dwa razy dziennie w trakcie okresu dawkowania wszystkie zwierzęta powinny być obserwowane pod kątem zachorowalności i upadkowości. Wszystkie zwierzęta powinny być ważone na początku badania, co najmniej raz w tygodniu w trakcie badań dawki powtórzonej oraz po uśmierceniu. W przypadku badań trwających co najmniej tydzień co najmniej raz w tygodniu należy dokonywać pomiaru ilości spożytego pokarmu. Jeżeli badana substancja chemiczna jest podawana w wodzie do picia, należy mierzyć spożycie wody przy każdej zmianie wody i co najmniej raz w tygodniu. Zwierzęta, u których stwierdzono oznaki podwyższonej toksyczności nieprowadzące do śmierci, należy uśmiercić w humanitarny sposób przed zakończeniem okresu badania (11).

Narażenie tkanki docelowej

W odpowiednim momencie badania należy pobrać próbkę krwi, aby zbadać poziomy osocza po zastosowaniu badanych substancji chemicznych celem wykazania, że doszło do narażenia szpiku kostnego, jeżeli będzie to zasadne i jeżeli nie ma żadnych innych danych dotyczących narażenia (zob. pkt 44).

Szpik kostny i preparaty chromosomowe

Natychmiast po uśmierceniu zwierząt w humanitarny sposób z ich kości udowych lub piszczelowych pobiera się komórki szpiku kostnego, które są następnie poddawane działaniu roztworu hipotonicznego i utrwalane. Komórki w metafazie rozprowadza się następnie na szkiełkach mikroskopowych i barwi się je, stosując standardowe metody (zob. (3) (12)).

Analiza

Wszystkie preparaty, w tym te stanowiące kontrolę dodatnią i ujemną, należy indywidualnie zakodować i zrandomizować, tak aby osoba zliczająca nie znała warunków podawania substancji chemicznej.

Indeks mitotyczny należy oznaczyć jako miarę cytotoksyczności w przynajmniej 1 000 komórek na zwierzę w odniesieniu do wszystkich zwierząt poddanych działaniu substancji chemicznej (uwzględniając kontrole dodatnie), zwierząt niepoddanych działaniu substancji chemicznej lub zwierząt z grupy kontroli ujemnej z nośnikiem/rozpuszczalnikiem.

W odniesieniu do każdego zwierzęcia należy zbadać co najmniej 200 metafaz pod kątem występowania strukturalnych aberracji chromosomowych, z uwzględnieniem lub z pominięciem przerw (6). Jeżeli informacje przechowywane w bazie danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej wskazują, że średnia podstawowa częstość występowania strukturalnych aberracji chromosomowych w danym laboratorium badawczym jest niższa niż 1 %, należy rozważyć możliwość oceny ilościowej dodatkowych komórek. Aberracje typu chromatydowego i chromosomowego należy odnotowywać oddzielnie i klasyfikować według podtypów (złamania, wymiany). Procedury stosowane w laboratorium powinny zapewniać przeprowadzanie analizy aberracji chromosomowych przez odpowiednio przeszkolonych pracowników odpowiadających za zliczanie oraz – w stosownych przypadkach – poddanie wyników tej analizy wzajemnej ocenie. Z uwagi na fakt, że w trakcie przygotowywania preparatów często dochodzi do złamań w części komórek w metafazie, co prowadzi do utraty chromosomów, zliczane komórki powinny zawierać liczbę centromerów wynoszącą co najmniej 2n± 2, gdzie n stanowi haploidalną liczbę chromosomów dla danego gatunku.

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Opracowanie wyników

Dane dotyczące poszczególnych zwierząt należy przedstawić w postaci tabeli. W odniesieniu do każdego zwierzęcia należy ocenić indeks mitotyczny, liczbę zliczonych komórek w metafazie, liczbę aberracji wykrytych w poszczególnych komórkach metafazy oraz odsetek komórek ze strukturalnymi aberracjami chromosomowymi. Należy wymienić rodzaje strukturalnych aberracji chromosomowych, podając informacje o ich liczbie i częstości występowania u grup poddanych działaniu substancji chemicznej i u grup kontrolnych. Przerwy, jak również komórki poliploidalne i komórki z endoreduplikowanymi chromosomami, odnotowuje się odrębnie. Częstość występowania przerw zgłasza się, lecz zazwyczaj nie bierze się jej pod uwagę do celów analizy ogólnej częstości występowania strukturalnych aberracji chromosomowych. W przypadku braku dowodów na różnicę w reakcji pomiędzy płciami dane można połączyć na potrzeby analizy statystycznej. Należy również zgłosić dane dotyczące toksyczności u zwierząt i objawów klinicznych.

Kryteria dopuszczalności

Dopuszczalność badania ocenia się na podstawie następujących kryteriów:

a)

uznaje się, że dopuszczalne jest włączenie danych dotyczących jednoczesnej kontroli ujemnej do prowadzonej przez laboratorium bazy danych historycznych dotyczących kontroli (zob. pkt 11–14);

b)

jednoczesne kontrole dodatnie lub kontrole na potrzeby oceny ilościowej powinny wywoływać reakcje zgodne z reakcjami odnotowanymi w bazie danych historycznych dotyczących kontroli dodatniej i wykazywać statystycznie istotny wzrost w porównaniu z kontrolą ujemną (zob. pkt 20–21);

c)

objęto analizą odpowiednią liczbę dawek i komórek;

d)

kryteria wyboru najwyższej dawki są spójne z kryteriami opisanymi w pkt 25–28.

Ocena i interpretacja wyników

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik wyraźnie dodatni, jeżeli:

a)

co najmniej jedna z grup badanych wykazuje statystycznie istotny wzrost częstości występowania komórek ze strukturalnymi aberracjami chromosomowymi (z wyjątkiem przerw) w porównaniu z jednoczesną kontrolą ujemną,

b)

ocena przeprowadzona z zastosowaniem odpowiedniego testu tendencji pokazuje, że wzrost jest powiązany z dawką w co najmniej jednym okresie pobierania próbek, oraz

c)

którykolwiek z otrzymanych wyników znajduje się poza rozkładem danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej (np. poza granicami kontrolnymi wyznaczającymi przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona;

Jeżeli w danym okresie pobierania próbek bada się wyłącznie najwyższą dawkę, badaną substancję chemiczną uznaje się za dającą wynik wyraźnie dodatni, jeżeli odnotowano statystycznie istotny wzrost w porównaniu z jednoczesną kontrolą ujemną, a wyniki znajdują się poza rozkładem danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej (np. poza granicami kontrolnymi wyznaczającymi przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona). Zalecenia dotyczące odpowiednich metod statystycznych można znaleźć w literaturze (13). Przy przeprowadzaniu analizy dawka-odpowiedź należy zbadać co najmniej trzy grupy otrzymujące dawkę, które poddano działaniu substancji chemicznej. W badaniach statystycznych należy przyjąć, że jednostką doświadczalną jest zwierzę. Wyniki dodatnie uzyskane w teście aberracji chromosomowej świadczą o tym, że badana substancja chemiczna indukuje strukturalne aberracje chromosomowe w szpiku kostnym badanego gatunku.

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik wyraźnie ujemny, jeżeli we wszystkich zbadanych warunkach doświadczalnych:

a)

w żadnej grupie badanej nie odnotowano statystycznie istotnego wzrostu częstości występowania komórek ze strukturalnymi aberracjami chromosomowymi (z pominięciem przerw) w porównaniu z jednoczesną kontrolą ujemną,

b)

ocena przeprowadzona z zastosowaniem odpowiedniego testu tendencji pokazuje, że wzrost nie jest powiązany z dawką w żadnym okresie pobierania próbek,

c)

wszystkie wyniki mieszczą się w rozkładzie danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej (np. w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona), oraz

d)

doszło do narażenia szpiku kostnego na działanie badanej substancji chemicznej lub badanych substancji chemicznych.

Zalecenia dotyczące najodpowiedniejszych metod statystycznych można znaleźć w literaturze (13). Za dowody świadczące o narażeniu szpiku kostnego na działanie badanej substancji chemicznej można uznać spadek wartości indeksu mitotycznego lub wyniki pomiaru stężenia badanej substancji chemicznej w osoczu lub we krwi. Jeżeli substancję chemiczną podano drogą dożylną, przedstawienie dowodów narażenia na działanie substancji chemicznej nie jest konieczne. Ewentualnie narażenie szpiku kostnego na działanie substancji chemicznej można wykazać w oparciu o dane dotyczące wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i wydalania (ADME) pozyskane w ramach niezależnego badania przeprowadzonego z zastosowaniem tej samej drogi i na tych samych gatunkach. Wyniki ujemne świadczą o tym, że w warunkach badania badana substancja chemiczna nie indukuje strukturalnych aberracji chromosomowych w szpiku kostnym badanego gatunku.

Weryfikacja wyraźnie dodatniej lub ujemnej reakcji nie jest wymagana.

Jeżeli reakcja nie jest ani wyraźnie ujemna, ani wyraźnie dodatnia, oraz aby ułatwić ustalenie biologicznego znaczenia wyniku (np. niewielki lub graniczny wzrost), dane powinny zostać ocenione na podstawie opinii eksperta lub wyników dalszych badań przeprowadzonych w ramach już zakończonych doświadczeń. W niektórych przypadkach warto rozważyć możliwość zbadania większej liczby komórek lub powtórzenia doświadczenia w zmienionych warunkach doświadczalnych.

W rzadkich przypadkach nawet po przeprowadzeniu dalszych badań uzyskane dane uniemożliwią wyciągnięcie wniosku, iż badana substancja chemiczna daje wyniki dodatnie albo ujemne i w takiej sytuacji badanie zostanie uznane za niejednoznaczne.

Informacje na temat częstości występowania metafaz, w których odnotowano wystąpienie poliploidalności i endoreduplikacji, w stosunku do łącznej liczby metafaz należy odnotować osobno. Wzrost liczby komórek poliploidalnych/endoreduplikowanych może świadczyć o tym, że badana substancja chemiczna może potencjalnie hamować procesy mitotyczne lub przebieg cyklu komórkowego (zob. pkt 3).

Sprawozdanie z badania

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:

Podsumowanie

 

Badana substancja chemiczna:

źródło, numer partii, data graniczna do użytku, jeżeli jest dostępna;

stabilność badanej substancji chemicznej, jeżeli jest znana;

 

Substancja jednoskładnikowa:

wygląd fizyczny, rozpuszczalność w wodzie i dodatkowe istotne właściwości fizykochemiczne;

dane identyfikacyjne substancji chemicznej, takie jak: nazwa IUPAC lub CAS, numer CAS, kod SMILES lub InChI, wzór strukturalny, czystość, nazwa chemiczna zanieczyszczeń, w stosownych przypadkach i jeśli jest to praktycznie wykonalne, itp.

 

Substancja wieloskładnikowa, UVCB i mieszaniny:

opisane w miarę możliwości za pomocą nazwy systematycznej (zob. powyżej), określenia ilości oraz istotnych właściwości fizykochemicznych składników.

 

Przygotowanie badanej substancji chemicznej:

uzasadnienie wyboru nośnika;

rozpuszczalność i stabilność badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli są znane;

przygotowanie postaci użytkowych przeznaczonych do spożycia w paszy i z wodą do picia lub w formie wziewnej;

oznaczenie analityczne postaci użytkowych (np. stabilność, homogeniczność, stężenia nominalne), jeżeli jest przeprowadzane.

 

Zwierzęta doświadczalne:

gatunek/szczep wykorzystywany w badaniu wraz z uzasadnieniem jego wyboru;

liczba, wiek i płeć zwierząt;

źródło, warunki utrzymywania, pasza itp.;

metoda indywidualnego znakowania zwierząt;

w przypadku badań krótkoterminowych: masa ciała poszczególnych zwierząt na początku i na końcu badania; w przypadku badań trwających dłużej niż jeden tydzień: masa ciała poszczególnych zwierząt w trakcie badania oraz informacje o spożyciu pokarmu. W odniesieniu do każdej grupy należy uwzględnić informacje o zakresie masy ciała oraz o średniej i odchyleniu standardowym.

 

Warunki badania:

kontrole dodatnie i ujemne (z nośnikiem/rozpuszczalnikiem);

dane zgromadzone w ramach badania ustalającego zakres dawkowania, jeżeli zostało przeprowadzone;

uzasadnienie wyboru poziomu dawkowania;

szczegółowe informacje dotyczące przygotowania badanej substancji chemicznej;

szczegółowe informacje dotyczące podawania badanej substancji chemicznej;

uzasadnienie drogi podawania i długości okresu podawania;

metody stosowane w celu sprawdzenia, czy badane substancje chemiczne dostały się do krwiobiegu lub dotarły do szpiku kostnego;

dawka faktyczna (mg/kg masy ciała na dobę) obliczona w oparciu o stężenie badanej substancji chemicznej w paszy / wodzie do picia (ppm) i spożycie, w stosownych przypadkach;

szczegółowe informacje dotyczące jakości pokarmu i wody;

metoda uśmiercenia;

metoda analgezji (jeżeli jest stosowana);

szczegółowy opis harmonogramów podawania substancji chemicznej i pobierania próbek oraz ich uzasadnienie;

metody przygotowywania preparatów;

metody pomiaru toksyczności;

nazwa substancji chemicznej zatrzymującej metafazę, jej stężenie, dawkowanie i czas podawania przed pobraniem próbek;

procedury izolowania i konserwacji próbek;

kryteria oceny aberracji;

liczba zbadanych komórek w metafazie na zwierzę i liczba komórek zbadanych pod kątem oznaczenia indeksu mitotycznego;

kryteria dopuszczalności badania;

kryteria uznawania wyników badań za dodatnie, ujemne lub niejednoznaczne.

 

Wyniki:

stan zwierząt przed badaniem i podczas całego okresu badania, w tym oznaki toksyczności;

indeks mitotyczny podawany osobno dla każdego zwierzęcia;

rodzaj i liczba aberracji oraz komórek, w których stwierdzono wystąpienie aberracji, podawane osobno dla każdego zwierzęcia;

łączna liczba aberracji na grupę wraz ze średnimi i odchyleniami standardowymi;

liczba komórek z aberracjami na grupę wraz ze średnimi i odchyleniami standardowymi;

zmiany ploidalności, jeżeli zostały zaobserwowane, w tym informacje na temat częstości występowania komórek poliploidalnych lub endoreduplikowanych;

w stosownych przypadkach zależność dawka-odpowiedź;

zastosowane analizy i metody statystyczne;

dane potwierdzające, że doszło do narażenia szpiku kostnego na działanie substancji chemicznej;

dane dotyczące jednoczesnej kontroli ujemnej i jednoczesnej kontroli dodatniej wraz z zakresami, średnimi oraz odchyleniami standardowymi;

dane historyczne dotyczące kontroli ujemnej i dodatniej wraz z zakresami, średnimi i odchyleniami standardowymi oraz granice kontrolne wyznaczające przedział 95 % dla rozkładu, uwzględniając czas objęty obserwacją oraz liczbę obserwacji;

spełnienie kryteriów pozwalających uznać reakcję za dodatnią lub ujemną.

 

Omówienie wyników.

 

Wniosek.

 

Bibliografia.

BIBLIOGRAFIA

(1)

OECD, Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015, publikacje OECD na temat środowiska, seria dotycząca badań i oceny, nr 234, OECD, Paryż.

(2)

Adler, I.D. (1984), „Cytogenetic Tests in Mammals”, w: Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (red.), IRL Press, Waszyngton, D.C., s. 275–306.

(3)

Preston, R.J. et al. (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, t. 189/2, s. 157–165.

(4)

Richold, M. et al. (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays”, w: Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Sprawozdanie. Część I zmieniona, Kirkland, D.J. (red.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 115–141.

(5)

Tice, R.R. et al. (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, t. 312/3, s. 305–312.

(6)

Adler, I.D. et al. (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 417/1, s. 19–30.

(7)

Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, wyd. II, John Wiley and Sons, Nowy Jork.

(8)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, t. 723/2, s. 87–90.

(9)

Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, t. 312/3, s. 293–304.

(10)

Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, t. 7/5, s. 313–319.

(11)

OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, publikacje OECD na temat środowiska zdrowia i bezpieczeństwa, seria dotycząca badań i oceny, nr 19, OECD Publishing, Paryż.

(12)

Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, t. 1044, s. 147–163.

(13)

Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, w: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (red.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 184–232.

Dodatek 1

DEFINICJE

Aneuploidia : wszelkie odchylenia od zwykłej diploidalnej (lub haploidalnej) liczby chromosomów w pojedynczym chromosomie lub w większej ich liczbie, ale nie w całym zestawie czy całych zestawach chromosomów (por. poliploidalność).

Centromer : region(y) chromosomu, w którym(-ch) mikrotubule wrzeciona podziałowego są asocjowane w trakcie podziału komórki, co umożliwia przemieszczenie się chromosomów potomnych do biegunów komórek potomnych.

Substancja chemiczna : substancja lub mieszanina.

Aberracja typu chromatydowego : strukturalne uszkodzenie chromosomu wyrażone jako złamanie pojedynczych chromatyd lub złamanie i ponowne połączenie się chromatyd.

Aberracja typu chromosomowego : strukturalne uszkodzenie chromosomu wyrażone jako złamanie chromatyd lub złamanie i ponowne połączenie się obu chromatyd w tym samym miejscu.

Endoreduplikacja : proces, w którym po fazie S replikacji DNA jądro komórkowe nie wchodzi w fazę mitozy, lecz rozpoczyna się kolejna faza S. Wynikiem są chromosomy o 4, 8, 16, ... chromatydach.

Przerwa : achromatyczne uszkodzenie mniejsze niż szerokość jednej chromatydy prowadzące od minimalnego wypaczenia chromatyd.

Indeks mitotyczny : stosunek liczby komórek w fazie mitozy do całkowitej liczby komórek w populacji będący miarą statusu proliferacji danej populacji komórek.

Aberracja liczby : zmiana liczby chromosomów względem standardowej liczby chromosomów typowej dla wykorzystywanych zwierząt (aneuploidia).

Poliploidalność : aberracja liczby, która skutkuje zmianą liczby chromosomów w całym zestawie chromosomów, w odróżnieniu od zmiany liczby chromosomów w części zestawu chromosomów (por. aneuploidia).

Strukturalna aberracja chromosomowa : zmiana w strukturze chromosomu wykrywalna przez badanie mikroskopowe etapu metafazy w cyklu podziału komórki, zaobserwowana jako delecje, fragmenty, zmiany zachodzące między chromosomami lub w obrębie chromosomu.

Badana substancja chemiczna : dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.

Dodatek 2

PLAN CZYNNIKOWY MAJĄCY NA CELU USTALENIE RÓŻNIC PŁCIOWYCH W BADANIU ABERRACJI CHROMOSOMOWYCH IN VIVO

Plan czynnikowy i jego analiza

W ramach takiego planu poddaje się badaniu co najmniej 5 samców i 5 samic przy każdym poziomie stężenia, co oznacza wykorzystanie co najmniej 40 zwierząt (20 samców i 20 samic oraz odpowiednie kontrole dodatnie).

Plan ten, będący jednym z prostszych planów czynnikowych, jest równoważny dwukierunkowej analizie wariancji, w której płeć i poziom stężenia stanowią efekty główne. Dane te można analizować, stosując wiele standardowych pakietów oprogramowania statystycznego, takich jak SPSS, SAS, STATA i Genstat, a także wykorzystując R.

W ramach analizy dokonuje się podziału zmienności w zbiorze danych na zmienność pomiędzy płciami, zmienność pomiędzy stężeniami oraz na zmienność zależną od interakcji pomiędzy płciami i stężeniami. Każdy z członów porównuje się z szacunkową zmiennością pomiędzy zwierzętami z kontrpróby w ramach grup zwierząt tej samej płci, którym podaje się substancję chemiczną w takim samym stężeniu. Szczegółowe informacje na temat metodyki przeprowadzania tego doświadczenia można znaleźć w wielu standardowych podręcznikach statystycznych (zob. bibliografia) oraz w narzędziach pomocowych dostarczanych razem z pakietami oprogramowania statystycznego.

Analizę rozpoczyna się od sprawdzenia członu interakcji pomiędzy płcią a stężeniem w tabeli ANOVA (5). W przypadku braku członu istotnej interakcji połączone wartości dla poszczególnych płci lub dla poszczególnych poziomów stężeń mogą posłużyć jako ważne testy statystyczne pomiędzy poziomami na podstawie członu zmienności wewnątrzgrupowej w tabeli ANOVA.

Kolejnym etapem analizy jest podział szacunku zmienności pomiędzy stężeniami na kontrasty do celów przeprowadzenia testu reakcji pod kątem kontrastów liniowych i kwadratowych przy poszczególnych poziomach stężeń. W przypadku wystąpienia istotnej interakcji pomiędzy płcią a stężeniem człon ten można również podzielić na kontrasty interakcji pomiędzy efektem liniowym a płcią oraz pomiędzy efektem kwadratowym a płcią. Człony te umożliwiają zbadanie, czy zależność stężenie-odpowiedź przebiega równolegle dla obydwu płci, czy też otrzymuje się różne odpowiedzi dla obu płci.

Szacunek zmienności wewnątrzgrupowej można wykorzystać do przeprowadzenia testów parami w odniesieniu do różnicy między średnimi. Tego rodzaju porównania można przeprowadzać pomiędzy średnimi dla obydwu płci oraz pomiędzy średnimi dla poszczególnych poziomów stężeń, np. w celu porównania z poziomami odnotowanymi w kontrolach ujemnych. W przypadkach, w których występuje istotna interakcja, można dokonać porównań pomiędzy średnimi dla poszczególnych stężeń w ramach danej płci lub pomiędzy średnimi dla poszczególnych płci w ramach danego stężenia.

Bibliografia

Istnieje wiele podręczników statystycznych poświęconych teorii, planowaniu, metodyce, analizie i interpretacji planów czynnikowych – począwszy od najprostszych analiz dwuczynnikowych po bardziej złożone formy wykorzystywane w metodyce planowania doświadczeń. Poniższa lista nie jest wyczerpująca. Niektóre publikacje zawierają praktyczne przykłady porównywalnych planów, niekiedy razem z kodem niezbędnym do przeprowadzenia analiz przy wykorzystaniu różnych pakietów oprogramowania.

 

Box, G.E.P, Hunter, W.G. i Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. Nowy Jork: John Wiley & Sons.

 

Box G.E.P. i Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

 

Doncaster, C.P. i Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

 

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

 

Montgomery, D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

 

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

 

Wu, C.F.J i Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.”;

”;

5)

w części B rozdział B.12 otrzymuje brzmienie:

„B.12   Test mikrojądrowy na erytrocytach ssaków

WPROWADZENIE

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 474 (2016). Stanowi ona część cyklu metod badawczych dotyczących toksykologii genetycznej. Opracowany został dokument OECD, który zawiera zwięzłe informacje na temat badań w zakresie toksykologii genetycznej oraz przegląd ostatnich zmian, jakie wprowadzono do wytycznych dotyczących badań (1).

Test mikrojądrowy na komórkach ssaków in vivo ma szczególne znaczenie dla oceny genotoksyczności, ponieważ czynniki związane z metabolizmem, farmakokinetyką oraz procesami naprawy DNA in vivo – choć mogą różnić się w zależności od gatunku – są aktywne i wywierają wpływ na reakcje. Przeprowadzenie testu in vivo jest również przydatne do celów dalszego badania genotoksyczności stwierdzonej w układzie in vitro.

Test mikrojądrowy na erytrocytach ssaków in vivo przeprowadza się w celu wykrycia indukowanych działaniem badanej substancji chemicznej uszkodzeń chromosomów lub aparatu mitotycznego erytroblastów. W teście ocenia się proces formowania mikrojądra w erytrocytach pobranych ze szpiku kostnego albo z komórek krwi obwodowej zwierząt, zazwyczaj gryzoni.

Celem testu mikrojądrowego jest zidentyfikowanie substancji chemicznych wywołujących uszkodzenia cytogenetyczne, które prowadzą do powstania mikrojąder zawierających opóźnione fragmenty chromosomów opóźnionych albo całe chromosomy.

Jeżeli erytroblast szpiku kostnego przekształci się w niedojrzały erytrocyt (określany również niekiedy jako erytrocyt polichromatyczny lub retikulocyt), główne jądro komórkowe zostaje usunięte; w takim przypadku jakiekolwiek mikrojądro, które powstało w trakcie tego procesu, może pozostać w cytoplazmie. W takich komórkach łatwiej jest wizualizować lub wykrywać mikrojądra, ponieważ nie występuje w nich główne jądro komórkowe. Wzrost częstości występowania erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra u zwierząt poddanych działaniu substancji chemicznej świadczy o tym, że substancja ta przyczyniła się do powstania strukturalnych aberracji chromosomowych lub aberracji liczby.

Nowo powstałe erytrocyty zawierające mikrojądra wykrywa się i ustala się ich liczbę poprzez barwienie, a następnie zlicza się je metodą wzrokową przy wykorzystaniu mikroskopu albo przeprowadza się zautomatyzowaną analizę. Zliczanie dostatecznej liczby niedojrzałych erytrocytów w krwi obwodowej lub szpiku kostnym dorosłych zwierząt znacznie ułatwia zautomatyzowana platforma zliczająca. Tego rodzaju platformy stanowią dopuszczalne rozwiązanie alternatywne wobec ręcznego przeprowadzania oceny (2). Wyniki badań porównawczych wskazują, że metody takie – przy wykorzystaniu odpowiednich wzorców kalibracyjnych – może doprowadzić do uzyskania lepszej odtwarzalności i czułości między- i wewnątrzlaboratoryjnej niż w przypadku ręcznego zliczania pod mikroskopem (3) (4). Wśród zautomatyzowanych systemów, które mogą być wykorzystywane do pomiaru częstości występowania erytrocytów zawierających mikrojądra, należy wymienić m.in. cytometry przepływowe (5), platformy analizy obrazowej (6) (7) oraz cytometry wykorzystujące technologię skaningu laserowego (8).

Fragmenty chromosomów można odróżnić od całych chromosomów, stosując szereg kryteriów, choć zazwyczaj nie dokonuje się tego w trakcie testu. Wśród wspomnianych kryteriów należy wymienić stwierdzenie występowania lub braku kinetochoru lub DNA centromerowego, które stanowią charakterystyczne elementy nienaruszonych chromosomów. Brak kinetochoru lub DNA centromerowego świadczy o tym, że mikrojądro zawiera wyłącznie fragmenty chromosomów, natomiast obecność tych elementów wskazuje na utratę chromosomu.

Definicje stosowanych terminów zamieszczono w dodatku 1.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE

W ramach tego testu tkanką docelową do badania uszkodzeń genetycznych jest szpik kostny młodych dorosłych gryzoni, ponieważ w tej tkance wytwarzane są erytrocyty. Dopuszczalny jest pomiar mikrojąder w niedojrzałych erytrocytach w krwi obwodowej u innych gatunków ssaków, jeżeli wykazano czułość wystarczającą do wykrycia substancji chemicznych, które powodują strukturalne aberracje chromosomowe lub aberracje liczby w tych komórkach (przez indukcję mikrojąder w niedojrzałych erytrocytach) i jeżeli przedstawiono stosowne uzasadnienie naukowe. Głównym punktem końcowym jest częstość występowania erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra. Częstość występowania w krwi obwodowej dojrzałych erytrocytów zawierających mikrojądra może również stanowić punkt końcowy w przypadku gatunku, który nie wykazuje ostrej selekcji komórek z mikrojądrami w śledzionie oraz w przypadku gdy zwierzęta są stale poddawane działaniu substancji chemicznej przez okres dłuższy niż cykl życia erytrocytu u danego gatunku (np. przez co najmniej 4 tygodnie w przypadku myszy).

Jeżeli istnieją dowody świadczące o tym, że badana(-e) substancja(-e) chemiczna(-e) lub jej (ich) metabolit(y) nie dotrą do tkanki docelowej, przeprowadzenie tego badania może nie być właściwe.

Przed zastosowaniem niniejszej metody badawczej z użyciem mieszaniny w celu zgromadzenia danych na potrzeby założonego celu regulacyjnego należy zastanowić się, czy zastosowanie niniejszej metody może doprowadzić do uzyskania wyników odpowiednich z punktu widzenia tego celu, a jeżeli tak – dlaczego. Taka analiza nie jest konieczna, jeżeli ustanowiono wymóg regulacyjny dotyczący badania danej mieszaniny.

ZASADA METODY BADAWCZEJ

Zwierzęta poddaje się działaniu badanej substancji chemicznej z zastosowaniem odpowiedniej drogi narażenia. W przypadku wykorzystania szpiku kostnego zwierzęta uśmierca się w humanitarny sposób po upływie odpowiedniego czasu od podania substancji chemicznej, po czym pobiera się szpik kostny, sporządza się preparaty i barwi się je (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). W przypadku wykorzystania krwi obwodowej krew pobiera się po upływie odpowiedniego czasu od podania substancji chemicznej, po czym sporządza się preparaty i barwi się je (12) (16) (17) (18). Jeżeli substancję chemiczną podaje się w dawce ostrej, istotne jest, aby wybrać taki czas pobrania szpiku kostnego lub krwi, w którym będzie możliwe wykrycie indukcji erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra spowodowanej podaniem substancji chemicznej. W przypadku pobierania próbek krwi obwodowej musi również upłynąć dostateczny czas, aby takie erytrocyty pojawiły się we krwi. Preparaty analizuje się pod kątem obecności mikrojąder, stosując metody wizualizacji mikroskopowej, analizy obrazowej, cytometrii przepływowej albo laserowej cytometrii skaningowej.

WERYFIKACJA BIEGŁOŚCI LABORATORIUM

Badanie biegłości

Aby ustalić wystarczające doświadczenie laboratorium w zakresie omawianego testu przed zastosowaniem go w rutynowych badaniach, laboratorium powinno wykazać zdolność do odtworzenia oczekiwanych wyników na podstawie opublikowanych danych (17) (19) (20) (21) (22) w odniesieniu do częstości występowania mikrojąder z zastosowaniem co najmniej dwóch substancji służących do kontroli dodatniej (uwzględniając słabe reakcje wywołane niskimi dawkami substancji chemicznych służących do kontroli dodatniej), takich jak substancje wymienione w tabeli 1, oraz z zastosowaniem kontroli ze zgodnym nośnikiem/rozpuszczalnikiem (zob. pkt 26). W tego rodzaju doświadczeniach należy stosować dawki, które prowadzą do powstania możliwych do odtworzenia i powiązanych z wielkością dawki przyrostów i które umożliwiają wykazanie czułości i zakresu oznaczania układu badawczego w odniesieniu do tkanki będącej przedmiotem zainteresowania (szpik kostny lub krew obwodowa) przy wykorzystaniu metody zliczania, która ma być stosowana w laboratorium. Wymóg ten nie dotyczy laboratoriów, które dysponują odpowiednim doświadczeniem, tj. laboratoriów prowadzących bazę danych historycznych, o której mowa w pkt 14–18.

Dane historyczne dotyczące kontroli

W toku badań biegłości laboratorium powinno ustalić:

zakres i rozkład historycznych wyników kontroli dodatniej oraz

zakres i rozkład historycznych wyników kontroli ujemnej.

Przy pierwszym gromadzeniu danych dotyczących rozkładu historycznych wyników kontroli ujemnej wyniki jednoczesnej kontroli ujemnej powinny być zgodne z opublikowanymi danymi dotyczącymi kontroli, o ile takie dane istnieją. W miarę dodawania kolejnych danych doświadczalnych do rozkładu danych historycznych dotyczących kontroli jednoczesne kontrole ujemne powinny w idealnych warunkach mieścić się w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % dla tego rozkładu. Prowadzona przez dane laboratorium baza danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej powinna być statystycznie istotna, aby zapewnić zdolność laboratorium do oceny rozkładu własnych danych dotyczących kontroli ujemnej. Z literatury przedmiotu wynika, że baza danych powinna zawierać wyniki co najmniej 10 doświadczeń, ale najlepiej co najmniej 20 doświadczeń przeprowadzonych w porównywalnych warunkach doświadczalnych. Laboratoria powinny stosować metody kontroli jakości, takie jak karty kontrolne (np. karty C lub karty X-średnie (23)) w celu określania stopnia zmienności gromadzonych przez nie danych oraz w celu wykazania, że stosowana przez nie metodologia jest „pod kontrolą”. Dalsze zalecenia dotyczące sposobu gromadzenia i wykorzystywania danych historycznych (tj. kryteria włączania danych do zbioru danych historycznych i wykluczania danych z tego zbioru oraz kryteria dopuszczalności dla danego doświadczenia) można znaleźć w literaturze (24).

Jeżeli laboratorium nie przeprowadziło dostatecznie dużej liczby doświadczeń, aby ustalić istotny statystycznie rozkład danych z kontroli ujemnej (zob. pkt 15) w trakcie badań biegłości (opisanych w pkt 13), dopuszcza się możliwość ustalenia rozkładu w trakcie pierwszych rutynowych badań. Takie podejście powinno być zgodne z zaleceniami przedstawionymi w literaturze (24), a wyniki kontroli ujemnej uzyskane w ramach tych doświadczeń powinny pozostać zgodne z opublikowanymi danymi dotyczącymi kontroli ujemnej.

Wszelkie zmiany w protokole doświadczalnym należy rozpatrywać pod kątem tego, czy ich wpływ na otrzymywane dane pozostaje spójny z dotychczas prowadzonymi przez laboratorium bazami danych historycznych dotyczących kontroli. Wyłącznie poważne niespójności powinny skutkować utworzeniem nowej bazy danych historycznych dotyczących kontroli, w przypadku gdy z ekspertyzy wynika, że dane odbiegają od poprzedniego rozkładu (zob. pkt 15). Podczas tworzenia nowej bazy danych utworzenie kompletnej bazy danych dotyczących kontroli ujemnej może nie być konieczne do przeprowadzenia samego badania, o ile laboratorium może wykazać, że wartości uzyskiwane przez nie w ramach jednoczesnej kontroli ujemnej pozostają zgodne z wynikami zawartymi w jego poprzedniej bazie danych albo z odpowiednimi opublikowanymi danymi.

Dane dotyczące kontroli ujemnej powinny obejmować częstość występowania erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra u każdego zwierzęcia. Jednoczesne kontrole ujemne powinny w idealnych warunkach mieścić się w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % dla rozkładu danych zawartych w prowadzonej przez laboratorium bazie danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej. W przypadku gdy dane dotyczące jednoczesnej kontroli ujemnej nie mieszczą się w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 %, włączenie ich do rozkładu kontroli historycznej może być dopuszczalne, pod warunkiem że dane te nie stanowią skrajnych obserwacji nietypowych oraz że istnieją dowody świadczące o tym, iż dany układ badawczy znajduje się „pod kontrolą” (zob. pkt 15), a także nie ma dowodów wskazujących na błąd techniczny lub ludzki.

OPIS METODY

Przygotowania

Wybór gatunku zwierząt

Należy prowadzić badania na zdrowych, młodych, dorosłych zwierzętach pochodzących ze szczepów na ogół wykorzystywanych w badaniach laboratoryjnych. Można wykorzystać myszy, szczury lub inny odpowiedni gatunek ssaków. W przypadku wykorzystywania krwi obwodowej należy zapewnić, aby usuwanie komórek z mikrojądrami z krwiobiegu przez śledzionę nie zakłócało wykrywania indukowanych mikrojąder u wybranego gatunku. Zostało to wyraźnie wykazane w przypadku krwi obwodowej myszy i szczurów (2). W sprawozdaniu powinno się przedstawić naukowe uzasadnienie wykorzystania gatunków innych niż szczury i myszy. W przypadku wykorzystywania zwierząt innych niż gryzonie zaleca się włączenie pomiaru indukowanych mikrojąder do innego stosownego badania toksyczności.

Warunki utrzymywania i karmienia

W przypadku gryzoni temperatura w pomieszczeniu dla zwierząt powinna wynosić 22 °C (± 3 °C). Chociaż wilgotność względna powinna wynosić co najmniej 40 % i pożądane jest, żeby nie przekraczała 70 % poza okresami czyszczenia pomieszczenia, celem powinno być utrzymywanie jej na poziomie 50–60 %. Oświetlenie powinno być sztuczne z zachowaniem cyklu 12 godzin światła i 12 godzin ciemności. Do karmienia można stosować konwencjonalne pasze laboratoryjne oraz należy zapewnić zwierzętom nieograniczony dostęp do wody do picia. Wybór paszy może zależeć od potrzeby zapewnienia odpowiedniej domieszki badanej substancji chemicznej, jeżeli jest ona podawana tą drogą. Gryzonie należy trzymać w małych grupach (nie więcej niż pięć sztuk) składających się ze zwierząt tej samej płci i należących do tej samej grupy badanej, jeżeli nie przewiduje się, że mogłoby dojść do agresywnego zachowania, najlepiej w klatkach z pełną podłogą, oraz zapewnić im odpowiednie urozmaicenie warunków bytowania. Zwierzęta można utrzymywać pojedynczo tylko wtedy, gdy ma to uzasadnienie naukowe.

Przygotowanie zwierząt

Zazwyczaj wykorzystuje się zdrowe, młode, dorosłe zwierzęta (w przypadku gryzoni najlepiej w wieku 6–10 tygodni na początku poddawania działaniu substancji chemicznej, chociaż dopuszcza się również używanie nieco starszych zwierząt), które losowo przydziela się do grup kontrolnych i grup poddawanych działaniu substancji chemicznej. Zwierzęta zostają indywidualnie oznakowane przy użyciu humanitarnej, mało inwazyjnej metody (np. poprzez obrączkowanie, kolczykowanie, wszczepianie mikroukładów i identyfikację biometryczną, ale nie przycinanie uszu lub palców) i aklimatyzowane do warunków laboratoryjnych przez co najmniej pięć dni. Klatki należy rozmieścić w taki sposób, aby zminimalizować potencjalny wpływ ich układu. Należy unikać zanieczyszczenia krzyżowego kontrolą dodatnią i badaną substancją chemiczną. W momencie rozpoczęcia badania różnice w masie ciała zwierząt powinny być minimalne i nie powinny przekraczać ± 20 % średniej masy dla każdej płci.

Przygotowanie dawek

Badane substancje chemiczne w stanie stałym należy rozpuszczać lub przygotowywać w postaci zawiesiny w odpowiednich rozpuszczalnikach lub nośnikach lub dodawać do paszy lub wody do picia przed podaniem dawki zwierzętom. Badane substancje chemiczne w stanie ciekłym mogą być dawkowane bezpośrednio lub można je rozcieńczać przed dawkowaniem. W przypadku narażenia inhalacyjnego badane substancje chemiczne można podawać w postaci gazu, pary lub stałych/ciekłych aerozoli, w zależności od ich właściwości fizykochemicznych. Należy stosować świeże preparaty badanej substancji chemicznej, chyba że z danych dotyczących stabilności wynika, iż przechowywanie tych preparatów jest dopuszczalne, i chyba że w danych tych określono warunki prawidłowego przechowywania takich preparatów.

Warunki badania

Kontrola z rozpuszczalnikiem/nośnikiem

Rozpuszczalnik/nośnik nie powinien wywoływać efektów toksycznych przy stosowanych poziomach dawek oraz nie powinien być w stanie wchodzić w reakcję chemiczną z badanymi substancjami chemicznymi. Jeśli wykorzystywane są inne niż dobrze znane rozpuszczalniki/nośniki, ich włączenie do doświadczenia powinno być poparte danymi wskazującymi ich zgodność. Zaleca się, aby w miarę możliwości w pierwszej kolejności rozważyć zastosowanie wodnego rozpuszczalnika/nośnika. Wśród przykładów powszechnie wykorzystywanych zgodnych rozpuszczalników/nośników można wymienić wodę, sól fizjologiczną, roztwór metylocelulozy, roztwór soli sodowej karboksymetylocelulozy, oliwę z oliwek i olej kukurydziany. W przypadku braku historycznych lub opublikowanych danych dotyczących kontroli wskazujących, że wybrany nietypowy rozpuszczalnik/nośnik nie indukuje mikrojąder ani nie powoduje żadnego innego szkodliwego efektu, należy wykonać badanie wstępne w celu ustalenia dopuszczalności stosowania kontroli z rozpuszczalnikiem/nośnikiem.

Kontrole

Kontrole dodatnie

W każdym badaniu należy co do zasady uwzględnić grupę zwierząt otrzymującą substancję chemiczną służącą do kontroli dodatniej. Od tego obowiązku można odstąpić, jeżeli laboratorium badawcze wykaże biegłość w przeprowadzaniu takiego badania i ustanowi zakres historycznych wyników kontroli dodatniej. W przypadku nieuwzględnienia jednoczesnej kontroli dodatniej do każdego doświadczenia należy włączyć kontrolę na potrzeby oceny ilościowej (utrwalone i niebarwione preparaty lub próbki zawiesiny komórek – stosownie do metody oceny ilościowej). Tego rodzaju kontrole można przeprowadzić, włączając do oceny ilościowej wyników badania odpowiednie próbki referencyjne, które zostały pozyskane w trakcie odrębnego przeprowadzanego okresowo (np. co 6–18 miesięcy) doświadczenia z wykorzystaniem kontroli dodatniej i które są przechowywane; na przykład w trakcie badania biegłości i – w stosownych przypadkach – w regularnych odstępach czasu w późniejszym okresie.

Substancje chemiczne służące do kontroli dodatniej powinny w przewidywalny sposób generować zauważalny wzrost częstości występowania mikrojąder w porównaniu z częstością samorzutną. W przypadku ręcznego zliczania pod mikroskopem dawki stosowane do celów kontroli dodatniej należy dobierać w taki sposób, aby efekty były jasne, lecz aby osoba zliczająca nie była w stanie natychmiast zidentyfikować zakodowanych próbek. Dopuszcza się, aby substancja chemiczna służąca do kontroli dodatniej była podawana inną drogą niż badana substancja chemiczna i zgodnie z innym harmonogramem podawania substancji chemicznej, a także aby próbki były pobierane wyłącznie w określonym czasie. Ponadto w stosownych przypadkach można rozważyć możliwość zastosowania substancji chemicznych służących do kontroli dodatniej powiązanych z określoną klasą chemiczną. W tabeli 1 przedstawiono przykładowe substancje chemiczne służące do kontroli dodatniej.

Tabela 1

Przykładowe substancje chemiczne służące do kontroli dodatniej

Substancje chemiczne i nr CAS

Metanosulfonian etylu [nr CAS 62-50-0]

Metanosulfonian metylu [nr CAS 66-27-3]

Etylonitrozomocznik [nr CAS 759-73-9]

Mitomycyna C [nr CAS 50-07-7]

Cyklofosfamid (monohydrat) [nr CAS 50-18-0 (nr CAS 6055-19-2)]

Trietylenomelamina [nr CAS 51-18-3]

Kolchicyna [nr CAS 64-86-8] lub winblastyna [nr CAS 865-21-4] – jako aneugeny

Kontrole ujemne

Od zwierząt z grupy kontrolnej ujemnej należy pobierać próbki w każdym okresie pobierania próbek i należy postępować z nimi w taki sam sposób, jak ze zwierzętami należącymi do grupy badanej, z tym że nie poddaje się ich działaniu badanej substancji chemicznej. Jeżeli do podania badanej substancji chemicznej wykorzystuje się rozpuszczalnik/nośnik, zwierzętom należącym do grupy kontrolnej również należy podać ten rozpuszczalnik/nośnik. Jeżeli jednak dane historyczne dotyczące kontroli ujemnej gromadzone przez laboratorium badawcze przy każdorazowym pobieraniu próbek będą wskazywały na stały poziom zmienności pomiędzy zwierzętami i stałą częstość występowania komórek z mikrojądrami, konieczne może być tylko jedno pobranie próbek na potrzeby kontroli ujemnej. Jeżeli w ramach kontroli ujemnej przeprowadza się tylko jedno pobieranie próbek, próbki należy pobrać w pierwszym okresie pobierania próbek w ramach badania.

Jeżeli wykorzystywana jest krew obwodowa, w przypadku badań krótkoterminowych dopuszczalna może być również próbka przed podaniem substancji chemicznej zamiast jednoczesnej kontroli ujemnej, jeżeli dane wynikające z badania są spójne z bazą danych historycznych dotyczących kontroli prowadzoną przez dane laboratorium badawcze. W odniesieniu do szczurów wykazano, że pobieranie niewielkich próbek (np. poniżej 100 μl/dzień) przed podaniem substancji chemicznej ma minimalny wpływ na podstawową częstość występowania mikrojąder (25).

PROCEDURA

Liczba i płeć zwierząt

Na ogół reakcja mikrojądrowa jest podobna u samców i samic, w związku z czym większość badań można prowadzić na zwierzętach dowolnej płci (26). Dane wskazujące na występowanie istotnych różnic między samcami i samicami (np. różnice w toksyczności ogólnoustrojowej, metabolizmie, biodostępności, toksyczności w szpiku kostnym itd., w tym np. w badaniu ustalającym zakres dawkowania) stanowią przesłankę przemawiającą za przeprowadzaniem badań na zwierzętach obu płci. W takim przypadku właściwe może być przeprowadzenie badania na zwierzętach obu płci, np. w ramach badania toksyczności dawki powtórzonej. Zastosowanie planu czynnikowego może być wskazane, jeżeli do badania używa się zwierząt obu płci. Szczegółowe informacje dotyczące sposobu analizy danych z wykorzystaniem tego planu można znaleźć w dodatku 2.

Na początku badania należy ustalić liczebność grup w celu zapewnienia w każdej grupie co najmniej 5 nadających się do poddania analizie zwierząt jednej płci lub każdej płci, jeżeli wykorzystuje się zwierzęta obu płci. Jeżeli narażenie człowieka na działanie substancji chemicznych może mieć charakter uzależniony od płci, jak to na przykład ma miejsce w przypadku niektórych produktów leczniczych, badanie należy przeprowadzić na zwierzętach odpowiedniej płci. Wskazówka odnośnie do maksymalnych typowych wymagań w zakresie liczby zwierząt – w przypadku badania szpiku kostnego prowadzonego zgodnie z parametrami ustalonymi w pkt 37 z trzema grupami otrzymującymi dawki i jednoczesną kontrolą ujemną i dodatnią (każda grupa złożona z pięciu zwierząt jednej płci) wymagane byłoby użycie 25–35 zwierząt.

Poziomy dawek

W przypadku przeprowadzenia wstępnego badania ustalającego zakres dawkowania ze względu na brak dostępnych odpowiednich danych umożliwiających dobranie dawki, badanie takie należy wykonać w tym samym laboratorium z wykorzystaniem tego samego gatunku, szczepu, płci i schematu podawania substancji chemicznej, jakie mają być stosowane w badaniu głównym (27). Celem badania powinno być określenie maksymalnej tolerowanej dawki (MTD) zdefiniowanej jako najwyższa dawka tolerowana bez wywoływania objawów toksyczności ograniczającej badanie w stosunku do czasu trwania badania (na przykład dawka wywołująca spadek masy ciała lub cytotoksyczność układu krwiotwórczego, ale niepowodująca śmierci lub objawów bólu, cierpienia lub stresu, które wiązałyby się z koniecznością uśmiercenia zwierzęcia w humanitarny sposób (28)).

Najwyższą dawkę można również zdefiniować jako dawkę, która wywołuje toksyczność w szpiku kostnym (np. redukcję odsetka niedojrzałych erytrocytów wśród erytrocytów ogółem w szpiku kostnym lub krwi obwodowej o ponad 50 %, ale do poziomu nie niższego niż 20 % wartości kontrolnej). Niemniej podczas analizowania komórek CD71-pozytywnych w krążeniu obwodowym (tj. za pomocą cytometrii przepływowej) ta bardzo młoda frakcja niedojrzałych erytrocytów szybciej reaguje na narażenie na substancję toksyczną niż większa RNA-pozytywna kohorta niedojrzałych erytrocytów. Wyższa toksyczność pozorna może być zatem widoczna w planach narażenia ostrego, w których bada się frakcję CD71-pozytywnych niedojrzałych erytrocytów, w porównaniu z planami, w których identyfikuje się niedojrzałe erytrocyty na podstawie zawartości RNA. Dlatego jeżeli w doświadczeniach podaje się substancję chemiczną przez pięć lub mniej dni, najwyższy poziom dawki badanej substancji chemicznej powodujący toksyczność można określić jako dawkę, która wywołuje statystycznie istotny spadek odsetka CD71-pozytywnych niedojrzałych erytrocytów wśród erytrocytów ogółem, ale do poziomu nie niższego niż 5 % wartości kontrolnej (29).

Substancje chemiczne wykazujące intensywne parametry toksykokinetyczne lub wywołujące procesy detoksykacji, które mogą prowadzić do zmniejszenia narażenia po długim okresie podawania substancji chemicznej, mogą stanowić wyjątki w odniesieniu do kryteriów ustalania dawki i powinny być oceniane na zasadzie jednostkowych przypadków.

Aby uzyskać informacje na temat zależności dawka-odpowiedź, w kompletnym badaniu należy uwzględnić grupę kontrolną ujemną oraz co najmniej trzy poziomy dawek, przy czym każda kolejna dawka jest większa od poprzedniej na ogół dwukrotnie, ale nie więcej niż czterokrotnie. Jeżeli wyniki badania ustalającego zakres dawkowania lub istniejące dane będą wskazywały, że badana substancja chemiczna nie wywołuje toksyczności, najwyższa dawka w przypadku okresu podawania wynoszącego 14 dni lub więcej powinna wynosić 1 000 mg/kg masy ciała na dobę, a w przypadku okresów podawania wynoszących mniej niż 14 dni powinna wynosić 2 000 mg/kg masy ciała na dobę. Jeżeli jednak badana substancja chemiczna będzie miała działanie toksyczne, maksymalną tolerowaną dawkę należy ustalić na poziomie odpowiadającym najwyższej podanej dawce, przy czym najlepiej byłoby, gdyby zastosowane poziomy dawek obejmowały zakres od dawki maksymalnej do dawki wywołującej toksyczność w niewielkim stopniu lub dawki niewywołującej toksyczności. W przypadku zaobserwowania toksyczności w tkance docelowej (szpiku kostnym) przy wszystkich badanych poziomach dawek zaleca się dalsze badania z wykorzystaniem dawek nietoksycznych. W przypadku badań przeprowadzanych w celu uzyskania bardziej szczegółowych ilościowych informacji na temat zależności dawka-odpowiedź konieczne może okazać się utworzenie dodatkowych grup otrzymujących dawki. Wspomniane wartości graniczne mogą różnić się w przypadku niektórych rodzajów badanych substancji chemicznych (np. produktów leczniczych przeznaczonych dla ludzi), które podlegają szczególnym wymogom.

Badanie graniczne

Jeżeli wyniki badania ustalającego zakres dawkowania lub dostępne dane na temat powiązanych szczepów zwierząt będą wskazywały, że poddanie zwierząt działaniu substancji chemicznej w stężeniu odpowiadającym co najmniej dawce granicznej (o której mowa poniżej) nie wywołuje żadnych możliwych do zaobserwowania efektów toksycznych (uwzględniając brak spadku tempa dzielenia się komórek szpiku kostnego lub brak innych dowodów świadczących o cytotoksyczności tkanki docelowej), i jeżeli wyniki badań genotoksyczności in vitro lub dane dotyczące strukturalnie powiązanych substancji chemicznych nie będą wskazywały na możliwość wystąpienia genotoksyczności, przeprowadzenie pełnego badania z trzema poziomami dawek może nie być konieczne, o ile wykazano, że badane substancje chemiczne docierają do tkanki docelowej (szpiku kostnego). W takich przypadkach pojedynczy poziom dawki, odpowiadający dawce granicznej, może być wystarczający. Jeżeli okres podawania wynosi co najmniej 14 dni, dawka graniczna wynosi 1 000 mg/kg masy ciała na dobę. W przypadku okresów podawania poniżej 14 dni dawka graniczna wynosi 2 000 mg/kg masy ciała na dobę.

Podawanie dawek

Planując badanie, należy wziąć pod uwagę przewidywaną drogę narażenia ludzi. W związku z tym można wybrać jako uzasadnione takie drogi podawania jak: w pokarmie, z wodą do picia, miejscowe, podskórne, dożylne, ustne (przez sondę), przez wdychanie, dotchawicze lub przez implantację. W każdym razie drogę narażenia należy dobrać w taki sposób, aby zapewnić odpowiednie narażenie tkanek docelowych. Nie zaleca się na ogół dokonywania wstrzyknięć dootrzewnowych, ponieważ nie jest to typowa droga narażenia ludzi – taką drogę należy stosować wyłącznie w przypadku wystąpienia konkretnego uzasadnienia naukowego. Jeżeli badaną substancję chemiczną dodaje się do paszy lub wody do picia, w szczególności w przypadku pojedynczej dawki substancji, należy upewnić się, że okres między spożyciem paszy i wody a pobraniem próbki jest wystarczający do tego, aby zapewnić możliwość wykrycia skutków podania substancji (zob. pkt 37). Maksymalna objętość płynu, jaką można podać przez sondę lub wstrzyknąć jednorazowo, zależy od wielkości zwierzęcia doświadczalnego. Objętość ta nie powinna co do zasady przekraczać 1 ml/100 g masy ciała, oprócz roztworów wodnych, w przypadku których można zastosować maksymalnie 2 ml/100 g masy ciała. Wykorzystanie objętości wyższych niż podane musi być uzasadnione. Należy ograniczyć zmienność objętości stosowanej w badaniu, dostosowując stężenie w taki sposób, by zapewnić podawanie substancji chemicznej w takiej samej objętości w stosunku do masy ciała przy wszystkich poziomach dawek – nie dotyczy to jednak badanych substancji chemicznych o podrażniającym lub żrącym działaniu, które w normalnych warunkach wywołują poważniejsze skutki w przypadku ich podania w wyższych stężeniach.

Harmonogram podawania substancji chemicznej

Najlepiej podawać co najmniej dwie dawki w odstępach 24-godzinnych, szczególnie w przypadku włączenia tego badania do innych badań toksyczności. W innym przypadku można stosować pojedynczą dawkę, jeżeli ma to uzasadnienie naukowe (np. jeżeli wiadomo, że badane substancje chemiczne blokują cykl komórkowy). Badane substancje chemiczne mogą być również podawane jako dawka dzielona, tj. co najmniej dwa podania substancji tego samego dnia w odstępie czasu nie większym niż 2–3 godziny, aby łatwiej było podawać substancję w dużej objętości. W takim przypadku lub przy podawaniu badanej substancji chemicznej drogą wziewną okres pobierania próbek należy zaplanować w oparciu o czas podania ostatniej dawki lub czas ustania narażenia na działanie substancji.

Badanie można przeprowadzić na myszach lub szczurach na jeden z trzech sposobów:

a.

zwierzęta są jednorazowo poddawane działaniu badanej substancji chemicznej. Próbki szpiku kostnego pobiera się przynajmniej dwukrotnie (z odrębnych grup zwierząt), rozpoczynając nie wcześniej niż 24 godziny po podaniu substancji chemicznej, ale nie później niż 48 godzin po podaniu, z zachowaniem odpowiednich odstępów czasu między pobieraniem próbek, chyba że wiadomo, iż badana substancja chemiczna ma wyjątkowo długi okres półtrwania. Pobranie próbek przed upływem 24 godzin po podaniu substancji chemicznej wymaga uzasadnienia. Próbki krwi obwodowej pobiera się przynajmniej dwukrotnie (z tej samej grupy zwierząt), rozpoczynając nie wcześniej niż 36 godzin po podaniu substancji chemicznej, ale nie później niż 72 godziny po podaniu, z zachowaniem odpowiedniego(-ch) odstępu(-ów) po pobraniu pierwszej próbki. Przy pierwszym pobraniu próbek wszystkie grupy otrzymujące dawki powinny zostać poddane działaniu substancji chemicznej, po czym należy pobrać próbki do analizy; w kolejnych okresach pobierania próbek należy jednak podawać wyłącznie najwyższą dawkę. Jeżeli po jednym pobraniu próbek zostanie rozpoznana reakcja dodatnia, dodatkowe pobieranie próbek nie jest wymagane, chyba że potrzebne są ilościowe informacje o zależności dawka-odpowiedź. Opisane czasy pobrania wynikają z kinetyki pojawiania się i zanikania mikrojąder w tych dwóch przedziałach tkanek;

b.

jeżeli substancja chemiczna jest podawana dwa razy dziennie (np. dwie dawki w 24-godzinnych odstępach czasu), próbki należy pobrać jednorazowo między 18 a 24 godziną po ostatnim podaniu substancji chemicznej w przypadku szpiku kostnego lub między 36 a 48 godziną po ostatnim podaniu substancji chemicznej w przypadku krwi obwodowej (30). Opisane czasy pobrania wynikają z kinetyki pojawiania się i zanikania mikrojąder w tych dwóch przedziałach tkanek;

c.

jeżeli substancja chemiczna jest podawana co najmniej trzy razy dziennie (np. co najmniej trzy dawki w około 24-godzinnych odstępach), próbki szpiku kostnego należy pobrać nie później niż 24 godziny po ostatnim podaniu substancji chemicznej, a próbki krwi obwodowej należy pobrać nie później niż 40 godzin po ostatnim podaniu substancji chemicznej (31). Ten wariant podawania substancji chemicznej uwzględnia połączenie testu kometowego (np. pobieranie próbek po 2–6 godzinach od podania ostatniej dawki) z testem mikrojądrowym oraz włączenie testu mikrojądrowego do badania toksyczności dawki powtórzonej. Zgromadzone dane wykazywały, że indukcję mikrojąder można zaobserwować w takich szerszych ramach czasowych, jeżeli substancję podano co najmniej 3-krotnie (15).

Inne schematy dawkowania lub pobierania próbek można wykorzystywać w stosownych przypadkach i jeżeli jest to naukowo uzasadnione, jak również w celu ułatwienia włączenia tego badania do innych badań toksyczności.

Obserwacje

Ogólne obserwacje kliniczne zwierząt doświadczalnych wraz z rejestrowaniem objawów klinicznych powinny odbywać się co najmniej raz dziennie, najlepiej każdego dnia o tej samej porze oraz z uwzględnieniem szczytowego okresu przewidywanych skutków po dawkowaniu. Co najmniej dwa razy dziennie w trakcie okresu dawkowania wszystkie zwierzęta powinny być obserwowane pod kątem zachorowalności i upadkowości. Wszystkie zwierzęta powinny być ważone na początku badania, co najmniej raz w tygodniu w trakcie badań dawki powtórzonej oraz po uśmierceniu. W przypadku badań trwających co najmniej tydzień co najmniej raz w tygodniu należy dokonywać pomiaru ilości spożytego pokarmu. Jeżeli badana substancja chemiczna jest podawana w wodzie do picia, należy mierzyć spożycie wody przy każdej zmianie wody i co najmniej raz w tygodniu. Zwierzęta, u których stwierdzono oznaki podwyższonej toksyczności nieprowadzące do śmierci, należy uśmiercić w humanitarny sposób przed zakończeniem okresu badania (28). W pewnych okolicznościach można monitorować temperaturę ciała zwierząt, ponieważ hipertermia i hipotermia wywołane podaniem substancji chemicznej przyczyniły się do otrzymania błędnych wyników (32) (33) (34).

Narażenie tkanki docelowej

W odpowiednim momencie badania należy pobrać próbkę krwi, aby zbadać poziomy osocza po zastosowaniu badanych substancji chemicznych celem wykazania, że doszło do narażenia szpiku kostnego, jeżeli będzie to zasadne i jeżeli nie istnieją żadne inne dane dotyczące narażenia (zob. pkt 48).

Przygotowanie szpiku kostnego/krwi

Komórki szpiku kostnego pobiera się zazwyczaj z kości udowych lub piszczelowych natychmiast po uśmierceniu zwierząt w humanitarny sposób. Na ogół komórki są usuwane z kości, preparowane i barwione z zastosowaniem uznanych metod. Niewielkie objętości krwi obwodowej można uzyskać, zgodnie z właściwymi standardami w zakresie dobrostanu zwierząt, przy użyciu metody umożliwiającej przeżycie zwierzęcia doświadczalnego, takiej jak spowodowanie krwawienia z żyły ogonowej lub innego odpowiedniego naczynia krwionośnego, albo poprzez nakłucie serca lub pobranie próbek z dużego naczynia krwionośnego podczas uśmiercania zwierzęcia. W przypadku erytrocytów pozyskiwanych zarówno ze szpiku kostnego, jak i z krwi obwodowej, w zależności od metody analizy, komórki można niezwłocznie poddać natychmiastowemu barwieniu (16) (17) (18), można z nich sporządzać preparaty wymazowe, a następnie barwić je do celów analizy mikroskopowej, lub można utrwalać je i barwić odpowiednio do celów analizy opartej na cytometrii przepływowej. Wykorzystanie barwnika specyficznego dla DNA [np. oranżu akrydyny (35) lub Hoechst 33258 plus pyroniny-Y (36)] może wyeliminować niektóre spośród artefaktów związanych ze stosowaniem barwnika niebędącego barwnikiem specyficznym dla DNA. Zaleta ta nie uniemożliwia zastosowania zwykłych barwników (np. metody Giemsy na potrzeby analizy mikroskopowej). Można wykorzystać również dodatkowe systemy [np. kolumny celulozowe mające na celu usunięcie komórek jądrowych (37) (38)], pod warunkiem że wykazano zgodność tych systemów z przygotowywaniem próbek w laboratorium.

Na potrzeby określenia charakteru mikrojąder (chromosom/fragment chromosomu) w celu ustalenia, czy mechanizm indukcji mikrojąder jest spowodowany aktywnością klastogenną czy aneugenną, można zastosować przeciwciała antykinetochorowe (39), FISH z sondami molekularnymi specyficznymi dla pancentromerów (40) lub syntezę in situ przy udziale startera ze starterami specyficznymi dla pancentromerów, wraz z odpowiednim barwieniem kontrastowym DNA (41), w przypadku gdy metody te mają zastosowanie. Inne metody rozróżnienia klastogenów i aneugenów można stosować, o ile okazały się skuteczne.

Analiza (ręczna i automatyczna)

Wszystkie preparaty lub próbki do analizy, w tym te stanowiące kontrolę dodatnią i ujemną, należy indywidualnie zakodować przed rozpoczęciem jakiejkolwiek analizy i zrandomizować, tak aby osoba ręcznie zliczająca nie znała warunków podawania substancji chemicznej; takie kodowanie nie jest koniecznie w przypadku stosowania automatycznych systemów zliczania, które nie opierają się na kontroli wizualnej i nie są podatne na stronniczość osoby przeprowadzającej analizę. Odsetek niedojrzałych erytrocytów wśród ogółu (dojrzałych i niedojrzałych) erytrocytów jest oznaczany w odniesieniu do każdego zwierzęcia poprzez zliczenie ogółem co najmniej 500 erytrocytów w przypadku szpiku kostnego oraz 2 000 erytrocytów w przypadku krwi obwodowej (42). Aby ustalić częstość występowania erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra, należy zliczyć co najmniej 4 000 niedojrzałych erytrocytów na zwierzę (43). Jeżeli informacje przechowywane w bazie danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej wskazują, że średnia podstawowa częstość występowania erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra w danym laboratorium badawczym jest niższa niż 0,1 %, należy rozważyć możliwość oceny ilościowej dodatkowych komórek. W trakcie analizy próbek odsetek niedojrzałych erytrocytów wśród erytrocytów ogółem u zwierząt poddawanych działaniu substancji chemicznej nie powinien być niższy niż 20 % odsetka odnotowanego w kontroli z nośnikiem/rozpuszczalnikiem, w przypadku gdy stosowane jest zliczanie pod mikroskopem, oraz nie powinien być niższy niż około 5 % odsetka odnotowanego w kontroli z nośnikiem/rozpuszczalnikiem, w przypadku gdy stosowane jest zliczanie CD71-pozytywnych niedojrzałych erytrocytów metodami cytometrycznymi (zob. pkt 31) (29). Na przykład jeżeli w przypadku oznaczania erytrocytów w szpiku kostnym pod mikroskopem odsetek niedojrzałych erytrocytów w szpiku kostnym w grupie kontrolnej wynosi 50 %, górna granica toksyczności będzie wynosiła 10 % niedojrzałych erytrocytów.

Ze względu na fakt, że śledziona szczura wchłania i niszczy erytrocyty zawierające mikrojądra, w celu utrzymania wysokiego poziomu czułości badania podczas analizy krwi obwodowej szczura preferowane jest ograniczenie analizy erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra do najmłodszej frakcji. Przy stosowaniu automatycznych metod analizy te najbardziej niedojrzałe erytrocyty można zidentyfikować w oparciu o ich wysoką zawartość RNA, czyli wysoki poziom receptorów transferyny (CD71-pozytywnych) obecnych na ich powierzchni (31). Bezpośrednie porównanie różnych metod barwienia wykazało jednak, że zadowalające wyniki można uzyskać przy użyciu różnych metod, w tym konwencjonalnego barwienia oranżem akrydyny (3) (4).

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Opracowanie wyników

Dane dotyczące poszczególnych zwierząt należy przedstawić w postaci tabeli. Liczbę zliczonych niedojrzałych erytrocytów, liczbę erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra oraz odsetek niedojrzałych erytrocytów wśród erytrocytów ogółem należy wymienić oddzielnie w odniesieniu do każdego zwierzęcia poddanego analizie. Jeżeli myszy są poddawane działaniu substancji chemicznej nieprzerwanie przez co najmniej cztery tygodnie, należy również podać dane dotyczące liczby i odsetka dojrzałych erytrocytów zawierających mikrojądra, jeżeli zgromadzono takie dane. Należy również zgłosić dane dotyczące toksyczności u zwierząt i objawów klinicznych.

Kryteria dopuszczalności

Dopuszczalność badania ocenia się na podstawie następujących kryteriów:

a.

Uznaje się, że dopuszczalne jest włączenie danych dotyczących jednoczesnej kontroli ujemnej do prowadzonej przez laboratorium bazy danych historycznych dotyczących kontroli (zob. pkt 15–18).

b.

jednoczesne kontrole dodatnie lub kontrole na potrzeby oceny ilościowej powinny wywoływać reakcje zgodne z reakcjami odnotowanymi w bazie danych historycznych dotyczących kontroli dodatniej i wykazywać statystycznie istotny wzrost w porównaniu z jednoczesną kontrolą ujemną (zob. pkt 24–25);

c.

objęto analizą odpowiednią liczbę dawek i komórek.

d.

kryteria wyboru najwyższej dawki są spójne z kryteriami opisanymi w pkt 30–33.

Ocena i interpretacja wyników

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik wyraźnie dodatni, jeżeli:

a.

co najmniej jedna z grup badanych wykazuje statystycznie istotny wzrost częstości występowania erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra w porównaniu z jednoczesną kontrolą ujemną,

b.

ocena przeprowadzona z zastosowaniem odpowiedniego testu tendencji pokazuje, że wzrost jest powiązany z dawką w co najmniej jednym okresie pobierania próbek, oraz

c.

którykolwiek z otrzymanych wyników znajduje się poza rozkładem danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej (np. poza granicami kontrolnymi wyznaczającymi przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona;

Jeżeli w danym okresie pobierania próbek bada się wyłącznie najwyższą dawkę, badaną substancję chemiczną uznaje się za dającą wynik wyraźnie dodatni, jeżeli odnotowano statystycznie istotny wzrost w porównaniu z jednoczesną kontrolą ujemną, a wyniki znajdują się poza rozkładem danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej (np. poza granicami kontrolnymi wyznaczającymi przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona). Zalecenia dotyczące najodpowiedniejszych metod statystycznych można znaleźć w literaturze (44) (45) (46) (47). Przy przeprowadzaniu analizy dawka-odpowiedź należy zbadać co najmniej trzy grupy otrzymujące dawkę, które poddano działaniu substancji chemicznej. W badaniach statystycznych należy przyjąć, że jednostką doświadczalną jest zwierzę. Wyniki dodatnie testu mikrojądrowego wskazują, że badana substancja chemiczna indukuje mikrojądra, które są wynikiem aberracji chromosomowej lub uszkodzenia aparatu mitotycznego erytroblastów gatunku doświadczalnego. W przypadku gdy badanie przeprowadzono w celu wykrycia centromerów w mikrojądrach, jeżeli badana substancja chemiczna powoduje tworzenie się mikrojąder zawierających centromery (DNA centromerowe lub kinetochor, co wskazuje na utratę całego chromosomu), stanowi to dowód, że badana substancja chemiczna jest aneugenem.

O ile wszystkie kryteria dopuszczalności są spełnione, uznaje się, że badana substancja chemiczna daje wynik wyraźnie ujemny, jeżeli we wszystkich zbadanych warunkach doświadczalnych:

a.

w żadnej grupie badanej nie odnotowano statystycznie istotnego wzrostu częstości występowania erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra w porównaniu z jednoczesną kontrolą ujemną,

b.

ocena przeprowadzona z zastosowaniem odpowiedniego testu tendencji pokazuje, że wzrost nie jest powiązany z dawką w żadnym okresie pobierania próbek,

c.

wszystkie wyniki mieszczą się w rozkładzie danych historycznych dotyczących kontroli ujemnej (np. w granicach kontrolnych wyznaczających przedział 95 % na podstawie rozkładu Poissona), oraz

d.

doszło do narażenia szpiku kostnego na działanie badanej substancji chemicznej lub badanych substancji chemicznych.

Zalecenia dotyczące najodpowiedniejszych metod statystycznych można znaleźć w literaturze (44) (45) (46) (47). Za dowody świadczące o narażeniu szpiku kostnego na działanie badanej substancji chemicznej można uznać spadek stosunku erytrocytów niedojrzałych do dojrzałych lub wyniki pomiaru stężenia badanej substancji chemicznej w osoczu lub we krwi. Jeżeli substancję chemiczną podano drogą dożylną, przedstawienie dowodów narażenia na działanie substancji chemicznej nie jest konieczne. Ewentualnie narażenie szpiku kostnego na działanie substancji chemicznej można wykazać w oparciu o dane dotyczące wchłaniania, dystrybucji, metabolizmu i wydalania pozyskane w ramach niezależnego badania przeprowadzonego z zastosowaniem tej samej drogi i na tych samych gatunkach. Wyniki ujemne świadczą o tym, że w warunkach badania badana substancja chemiczna nie indukuje mikrojąder w niedojrzałych erytrocytach gatunków doświadczalnych.

Weryfikacja wyraźnie dodatniej lub ujemnej reakcji nie jest wymagana.

Jeżeli reakcja nie jest ani wyraźnie ujemna, ani wyraźnie dodatnia oraz aby ułatwić ustalenie biologicznego znaczenia wyniku (np. niewielki lub graniczny wzrost), dane powinny zostać ocenione w oparciu o opinię eksperta lub wyniki dalszych badań przeprowadzonych w ramach już zakończonych doświadczeń. W niektórych przypadkach warto rozważyć możliwość zbadania większej liczby komórek lub powtórzenia doświadczenia w zmienionych warunkach doświadczalnych.

W rzadkich przypadkach nawet po przeprowadzeniu dalszych badań uzyskane dane uniemożliwią wyciągnięcie wniosku, iż badana substancja chemiczna daje wyniki dodatnie albo ujemne i w takiej sytuacji badanie zostanie uznane za niejednoznaczne.

Sprawozdanie z badania

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje:

 

Podsumowanie

 

Badana substancja chemiczna:

źródło, numer partii, data graniczna do użytku, jeżeli jest dostępna;

stabilność badanej substancji chemicznej, jeżeli jest znana;

 

Substancja jednoskładnikowa:

wygląd fizyczny, rozpuszczalność w wodzie i dodatkowe istotne właściwości fizykochemiczne;

dane identyfikacyjne substancji chemicznej, takie jak: nazwa IUPAC lub CAS, numer CAS, kod SMILES lub InChI, wzór strukturalny, czystość, nazwa chemiczna zanieczyszczeń, w stosownych przypadkach i jeśli jest to praktycznie wykonalne, itp.

 

Substancja wieloskładnikowa, UVCB i mieszaniny:

opisane w miarę możliwości poprzez podanie nazwy chemicznej (zob. powyżej), określenie ilości oraz istotnych właściwości fizykochemicznych składników.

 

Przygotowanie badanej substancji chemicznej:

uzasadnienie wyboru nośnika;

rozpuszczalność oraz stabilność badanej substancji chemicznej w rozpuszczalniku/nośniku, jeżeli są znane;

przygotowanie postaci użytkowych przeznaczonych do spożycia w paszy i z wodą do picia lub w formie wziewnej;

oznaczenie analityczne postaci użytkowych (np. stabilność, jednorodność, stężenia nominalne), jeżeli jest przeprowadzane.

 

Zwierzęta doświadczalne:

gatunek/szczep wykorzystywany w badaniu wraz z uzasadnieniem jego wyboru;

liczba, wiek i płeć zwierząt;

źródło, warunki utrzymywania, pasza itp.;

metoda indywidualnego znakowania zwierząt;

w przypadku badań krótkoterminowych: masa ciała poszczególnych zwierząt na początku i na końcu badania; w przypadku badań trwających dłużej niż jeden tydzień: masa ciała poszczególnych zwierząt w trakcie badania oraz informacje o spożyciu pokarmu. W odniesieniu do każdej grupy należy uwzględnić informacje o zakresie masy ciała oraz o średniej i odchyleniu standardowym.

 

Warunki badania:

dane dotyczące kontroli dodatnich i ujemnych (z rozpuszczalnikiem/nośnikiem);

dane zgromadzone w ramach badania ustalającego zakres dawkowania, jeżeli zostało przeprowadzone;

uzasadnienie wyboru poziomu dawkowania;

szczegółowe informacje dotyczące przygotowania badanej substancji chemicznej;

szczegółowe informacje dotyczące podawania badanej substancji chemicznej;

uzasadnienie drogi podawania i długości okresu podawania;

metody stosowane w celu sprawdzenia, czy badane substancje chemiczne dostały się do krwiobiegu lub dotarły do tkanki docelowej;

dawka faktyczna (mg/kg masy ciała na dobę) obliczona w oparciu o stężenie badanej substancji chemicznej w paszy / wodzie do picia (ppm) i spożycie, w stosownych przypadkach;

szczegółowe informacje dotyczące jakości pokarmu i wody;

metoda uśmiercenia;

metoda analgezji (jeżeli jest stosowana);

szczegółowy opis harmonogramów podawania substancji chemicznej i pobierania próbek oraz ich uzasadnienie;

metody przygotowywania preparatów;

procedury izolowania i konserwacji próbek;

metody pomiaru toksyczności;

kryteria zliczania erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra;

liczba zbadanych komórek na zwierzę w celu ustalenia częstości występowania erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra oraz odsetka niedojrzałych erytrocytów w stosunku do dojrzałych;

kryteria dopuszczalności badania;

metody, takie jak stosowanie przeciwciał antykinetochorowych lub sond molekularnych specyficznych dla centromerów w celu określenia, w stosownych przypadkach, czy mikrojądra zawierają całe chromosomy czy fragmenty chromosomów.

 

Wyniki:

stan zwierząt przed badaniem i podczas całego okresu badania, w tym oznaki toksyczności;

odsetek niedojrzałych erytrocytów wśród erytrocytów ogółem;

liczba erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra podawana osobno dla każdego zwierzęcia;

średnia ± odchylenie standardowe erytrocytów polichromatycznych zawierających mikrojądra na grupę;

w stosownych przypadkach zależność dawka-odpowiedź;

zastosowane analizy i metody statystyczne;

dane dotyczące jednoczesnej kontroli ujemnej i jednoczesnej kontroli dodatniej wraz z zakresami, średnimi oraz odchyleniami standardowymi;

dane historyczne dotyczące kontroli ujemnej i dodatniej wraz z zakresami, średnimi i odchyleniami standardowymi oraz granice kontrolne wyznaczające przedział 95 % dla rozkładu, w tym czas objęty obserwacją oraz liczba punktów danych;

dane potwierdzające, że doszło do narażenia szpiku kostnego na działanie substancji chemicznej;

dane dotyczące cech charakterystycznych wskazujące, czy mikrojądra zawierają całe chromosomy czy fragmenty chromosomów, jeżeli ma to zastosowanie;

spełnione kryteria pozwalające uznać reakcję za dodatnią lub ujemną.

 

Omówienie wyników.

 

Wniosek.

 

Bibliografia.

BIBLIOGRAFIA

(1)

OECD, Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015, Publikacje OECD na temat środowiska, seria dotycząca badań i oceny, nr 234, OECD, Paryż.

(2)

Hayashi, M. et al.(2007), in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 627/1, s. 10–30.

(3)

MacGregor, J.T.et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronucleet al peripheral blood reticulocytes:II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat, Toxicology Sciences, t. 94/1, s. 92–107.

(4)

Dertinger, S.D. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronucleet al peripheral blood reticulocytes:I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring, Toxicological Sciences, t. 94/1, s. 83–91.

(5)

Dertinger, S.D. et al. (2011), Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes:an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage, Mutagenesis, t. 26/1, s. 139–145.

(6)

Parton, J.W., W.P.Hoffman, M.L.Garriott (1996), Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system, Mutation Research, t. 370/1, s. 65–73.

(7)

Asano, N. et al. (1998), An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay:computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, t. 404/1–2, s. 149–154.

(8)

Styles, J.A.et al.(2001), Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry, Cytometry, t. 44/2, s. 153–155.

(9)

Heddle, J.A.(1973), A rapid in vivo test for chromosomal damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, t. 18/2, s. 187–190.

(10)

Schmid, W. (1975), The micronucleus test, Mutation Research, t. 31/1, s. 9–15.

(11)

Heddle, J.A.et al. (1983), The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity.Sprawozdanie amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska dotyczące programu Gene-Tox, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, t. 123/1, s. 61–118.

(12)

Mavournin, K.H.et al.(1990), The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood.Sprawozdanie amerykańskiej Agencji Ochrony Środowiska dotyczące programu Gene-Tox, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, t. 239/1, s. 29–80.

(13)

MacGregor, J.T.et al. (1983), Micronucleet al circulating erythrocytes:a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice, Developments in Toxicology Environmental Science, t. 11, s. 555–558.

(14)

MacGregor, J.T.et al.(1987), Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes, Mutation Research/Genetic Toxicology, t. 189/2, s. 103–112.

(15)

MacGregor, J.T.et al.(1990), The in vivo erythrocyte micronucleus test:measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies, Fundamental and Applied Toxicology, t. 14/3, s. 513–522.

(16)

Hayashi, M. et al.(1990), The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides, Mutation Research/Genetic Toxicology, t. 245/4, s. 245–249.

(17)

CSGMT/JEMS.MMS – The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining:the summary report of the 5th collaborative study, Mutation Research/Genetic Toxicology, t. 278/2–3, s. 83–98.

(18)

CSGMT/JEMS.MMS – The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, t. 10/3, s. 153–159.

(19)

Salamone, M.F., K.H.Mavournin (1994), Bone marrow micronucleus assay:a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 23/4, s. 239–273.

(20)

Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, t. 453/1, s. 45–50.

(21)

Hayes, J. et al.(2009), The rat bone marrow micronucleus test – study design and statistical power, Mutagenesis, t. 24/5, s. 419–424.

(22)

Wakata, A. et al. (1998), Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 32/1, s. 84–100.

(23)

Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, wyd. II, John Wiley and Sons, Nowy Jork.

(24)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, t. 723/2, s. 87–90.

(25)

Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 723/2, s. 108–120.

(26)

Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, t. 312/3, s. 293–304.

(27)

Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, t. 7/5, s. 313–319.

(28)

OECD (2000), „Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, seria OECD dotycząca badań i oceny nr 19, OECD Publishing, Paryż.

(29)

LeBaron, M.J. et al. (2013), Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 54/3, s. 222–228.

(30)

Higashikuni, N., S. Sutou (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 +/- 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, tom 10/4, s. 313–319.

(31)

Hayashi, M. et al. (2000), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring, Environmental and Molecular Mutagenesis, t. 35/3, s. 234–252.

(32)

Asanami, S., K. Shimono (1997), High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 390/1–2, s. 79–83.

(33)

Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), Transient hypothermia induces micronuclei in mice, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 413/1, s. 7–14.

(34)

Spencer, P.J. et al. (2007), Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia, Toxicological Sciences, t. 97/1, s. 120–127.

(35)

Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Research Letters, t. 120/4, s. 241–247.

(36)

MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y, Mutation Research, t. 120/4, s. 269–275.

(37)

Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, t. 213/1, s. 91–104.

(38)

Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure, Mutation Research, t. 439/1, s. 121–126.

(39)

Miller, B.M., I.D. Adler (1990), Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo, Mutagenesis, t. 5/4, s. 411–415.

(40)

Miller, B.M. et al. (1991), Classification of micronucleet al murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, t. 6/4, s. 297–302.

(41)

Russo, A. (2002), PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage, American Journal of Medical Genetics, t. 107/2, s. 99–104.

(42)

Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Research, t. 347/2, s. 97–99.

(43)

OECD (2014), „Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines”, Publikacje OECD na temat środowiska, zdrowia i bezpieczeństwa, seria OECD dotycząca badań i oceny nr 198, OECD Publishing, Paryż.

(44)

Richold, M. et al. (1990), „In Vivo Cytogenetics Assays”, w: Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Sprawozdanie. Część I zmieniona, Kirkland, D.J. (red.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 115–141.

(45)

Lovell, D.P. et al. (1989), „Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, w: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (red.), Cambridge University Press, Cambridge, s. 184–232.

(46)

Hayashi, M. et al. (1994), Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay, Environmental Health Perspectives, t. 102/suplement 1, s. 49–52.

(47)

Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, t. 469/2, s. 233–241.

Dodatek 1

DEFINICJE

Centromer : region(y) chromosomu, w którym(-ch) mikrotubule wrzeciona podziałowego są asocjowane w trakcie podziału komórki, co umożliwia przemieszczenie się chromosomów potomnych do biegunów komórek potomnych.

Substancja chemiczna : substancja lub mieszanina.

Erytroblast : wczesny etap rozwoju erytrocytu, bezpośrednio poprzedzający niedojrzały erytrocyt, na którym komórka nadal posiada jądro komórkowe.

Kinetochor : struktura białkowa tworząca się na centromerze komórek eukariotycznych, która łączy chromosom z polimerami mikrotubul z wrzeciona mitotycznego w trakcie mitozy i mejozy i która podczas podziału komórkowego rozdziela chromatydy siostrzane.

Mikrojądra : małe jądra, oddzielone oraz występujące dodatkowo w stosunku do jądra głównego komórek, wytwarzane w trakcie telofazy mitozy (mejozy) przez fragmenty chromosomów opóźnionych lub całe chromosomy.

Erytrocyt normochromatyczny lub dojrzały : w pełni dojrzały erytrocyt, który utracił pozostałość RNA pozostałą po enukleacji lub utracił inne krótkotrwałe markery komórki, które zwykle znikają po enukleacji w wyniku ostatecznego podziału erytroblastu.

Erytrocyt polichromatyczny lub niedojrzały : nowo powstały erytrocyt na pośrednim etapie rozwoju, barwiący się zarówno niebieskimi, jak i czerwonymi składnikami klasycznych barwników, takich jak barwnik Giemsy w metodzie Wrighta, ze względu na obecność pozostałości RNA w nowo powstałej komórce. Takie nowo powstałe komórki są niemal identyczne z retikulocytami, które wizualizuje się przy użyciu barwnika przyżyciowego, który powoduje zbijanie się pozostałości RNA w siateczkę. Do identyfikacji nowo powstałych czerwonych krwinek obecnie często wykorzystuje się inne metody, w tym monochromatyczne barwienie RNA za pomocą barwników fluorescencyjnych lub znakowanie krótkotrwałych markerów powierzchniowych takich jak CD71 przy użyciu przeciwciał fluorescencyjnych. Erytrocyty polichromatyczne, retikulocyty oraz erytrocyty CD71-pozytywne są erytrocytami niedojrzałymi, chociaż każda z tych grup ma nieco inny rozkład wieku.

Retikulocyt : nowo powstały erytrocyt barwiony barwnikiem przyżyciowym, który powoduje zbijanie się pozostałości RNA komórkowego w charakterystyczną siateczkę. Retikulocyty i erytrocyty polichromatyczne mają podobny rozkład wieku komórkowego.

Badana substancja chemiczna : dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.

Dodatek 2

PLAN CZYNNIKOWY MAJĄCY NA CELU USTALENIE RÓŻNIC PŁCIOWYCH W TEŚCIE KOMETOWYM IN VIVO

Plan czynnikowy i jego analiza

W ramach takiego planu poddaje się badaniu co najmniej 5 samców i 5 samic przy każdym poziomie stężenia, co oznacza wykorzystanie co najmniej 40 zwierząt (20 samców i 20 samic oraz odpowiednie kontrole dodatnie).

Plan ten, będący jednym z prostszych planów czynnikowych, jest równoważny dwukierunkowej analizie wariancji, w której płeć i poziom stężenia stanowią efekty główne. Dane te można analizować, stosując wiele standardowych pakietów oprogramowania statystycznego, takich jak SPSS, SAS, STATA i Genstat, a także wykorzystując R.

W ramach analizy dokonuje się podziału zmienności w zbiorze danych na zmienność pomiędzy płciami, zmienność pomiędzy stężeniami oraz na zmienność zależną od interakcji pomiędzy płciami i stężeniami. Każdy z członów porównuje się z szacunkową zmiennością pomiędzy zwierzętami z kontrpróby w ramach grup zwierząt tej samej płci, którym podaje się substancję chemiczną w takim samym stężeniu. Szczegółowe informacje na temat metodyki przeprowadzania tego doświadczenia można znaleźć w wielu standardowych podręcznikach statystycznych (zob. bibliografia) oraz w narzędziach pomocowych dostarczanych razem z pakietami oprogramowania statystycznego.

Analizę rozpoczyna się od sprawdzenia członu interakcji płci ze stężeniem w tabeli ANOVA (6). W przypadku braku członu istotnej interakcji połączone wartości dla poszczególnych płci lub dla poszczególnych poziomów stężeń mogą posłużyć jako ważne testy statystyczne pomiędzy poziomami na podstawie członu zmienności wewnątrzgrupowej w tabeli ANOVA.

Kolejnym etapem analizy jest podział szacunku zmienności pomiędzy stężeniami na kontrasty do celów przeprowadzenia testu reakcji pod kątem kontrastów liniowych i kwadratowych przy poszczególnych poziomach stężeń. W przypadku wystąpienia istotnej interakcji pomiędzy płcią a stężeniem człon ten można również podzielić na kontrasty interakcji pomiędzy efektem liniowym a płcią oraz pomiędzy efektem kwadratowym a płcią. Człony te umożliwiają zbadanie, czy zależność stężenie-odpowiedź przebiega równolegle dla obydwu płci, czy też otrzymuje się różne odpowiedzi dla obu płci.

Szacunek zmienności wewnątrzgrupowej można wykorzystać do przeprowadzenia testów parami w odniesieniu do różnicy między średnimi. Tego rodzaju porównania można przeprowadzać pomiędzy średnimi dla obydwu płci oraz pomiędzy średnimi dla poszczególnych poziomów stężeń, np. w celu porównania z poziomami odnotowanymi w kontrolach ujemnych. W przypadkach, w których występuje istotna interakcja, można dokonać porównań pomiędzy średnimi dla poszczególnych stężeń w ramach danej płci lub pomiędzy średnimi dla poszczególnych płci w ramach danego stężenia.

Bibliografia

Istnieje wiele podręczników statystycznych poświęconych teorii, planowaniu, metodyce, analizie i interpretacji planów czynnikowych – począwszy od najprostszych analiz dwuczynnikowych po bardziej złożone formy wykorzystywane w metodyce planowania doświadczeń. Poniższa lista nie jest wyczerpująca. Niektóre publikacje zawierają praktyczne przykłady porównywalnych planów, niekiedy razem z kodem niezbędnym do przeprowadzenia analiz przy wykorzystaniu różnych pakietów oprogramowania.

 

Box, G.E.P, Hunter, W.G. i Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. Nowy Jork: John Wiley & Sons.

 

Box G.E.P. i Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

 

Doncaster, C.P. i Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

 

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

 

Montgomery, D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

 

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

 

Wu, C.F.J i Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.”;

”;

6)

w części B skreśla się rozdział B.15;

7)

w części B skreśla się rozdział B.16;

8)

w części B skreśla się rozdział B.18;

9)

w części B skreśla się rozdział B.19;

10)

w części B skreśla się rozdział B.20;

11)

w części B skreśla się rozdział B.24;

12)

w części B rozdział B.47 otrzymuje brzmienie:

„B.47   Metoda badania zmętnienia i przepuszczalności rogówki u bydła do celów identyfikacji (i) substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu oraz (ii) substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania jako substancje drażniące oczy lub powodujące poważne uszkodzenie oczu

WPROWADZENIE

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD (TG) nr 437 (2013). Metoda badania zmętnienia i przepuszczalności rogówki u bydła (BCOP) została oceniona przez Międzyagencyjny Komitet Koordynacyjny ds. Uznawania Metod Alternatywnych (ICCVAM) przy udziale Europejskiego Centrum Uznawania Metod Alternatywnych (ECVAM) i Japońskiego Centrum Uznawania Metod Alternatywnych (JaCVAM) w latach 2006 i 2010 (1)(2). W ramach pierwszej oceny metodę badawczą BCOP oceniono pod kątem użyteczności do celów identyfikowania substancji chemicznych (substancji i mieszanin) powodujących poważne uszkodzenie oczu (1). W ramach drugiej oceny metodę badawczą BCOP oceniono pod kątem użyteczności do celów identyfikowania substancji chemicznych (substancji i mieszanin) niesklasyfikowanych jako powodujące podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu (2). Baza danych służących do walidacji BCOP zawierała łącznie 113 substancji i 100 mieszanin (2) (3). Na podstawie tych ocen oraz ich wzajemnej oceny stwierdzono, że ta metoda badawcza może prawidłowo identyfikować substancje chemiczne (zarówno substancje, jak i mieszaniny) powodujące poważne uszkodzenie oczu (kategoria 1), jak również substancje chemiczne, które nie wymagają zaklasyfikowania jako substancje powodujące podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu, określone przez Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów Organizacji Narodów Zjednoczonych (GHS ONZ) (4) oraz rozporządzenie (WE) nr 1272/2008 w sprawie klasyfikacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin (CLP) (7), w związku z czym została zatwierdzona jako potwierdzona naukowo do obu celów. Poważne uszkodzenie oczu to uszkodzenie tkanki oka lub poważne fizyczne pogorszenie widzenia spowodowane zaaplikowaniem badanej substancji chemicznej na przednią powierzchnię oka, które nie jest w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po zaaplikowaniu. Badane substancje chemiczne powodujące poważne uszkodzenie oczu są zaklasyfikowane do kategorii 1 wg GHS ONZ. Substancje chemiczne niesklasyfikowane jako powodujące podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu, definiuje się jako te substancje, które nie spełniają wymogów zaklasyfikowania jako należące do kategorii 1 lub 2 (2A lub 2B) wg GHS ONZ, tj. określa się je jako nienależące do żadnej kategorii – brak kategorii wg GHS ONZ. Niniejsza metoda badawcza obejmuje zalecane stosowanie i ograniczenia metody badawczej BCOP oparte na jej ocenach. Główne różnice między pierwotną wersją wytycznych OECD dotyczących badań z 2009 r. a zaktualizowaną wersją z 2013 r. odnoszą się m.in. do: stosowania metody badawczej BCOP w celu identyfikowania substancji chemicznych, które nie wymagają sklasyfikowania według GHS ONZ (pkt 2 i 7); wyjaśnień dotyczących stosowania metody badawczej BCOP do badania alkoholi, ketonów i substancji stałych (pkt 6 i 7) oraz substancji i mieszanin (pkt 8); wyjaśnień dotyczących zalecanego sposobu badania środków powierzchniowo czynnych i mieszanin zawierających takie środki (pkt 28); aktualizacji i wyjaśnień dotyczących kontroli dodatniej (pkt 39 i 40); aktualizacji kryteriów podejmowania decyzji w metodzie badawczej BCOP (pkt 47); aktualizacji kryteriów dopuszczalności badania (pkt 48); aktualizacji elementów sprawozdania z badania (pkt 49); aktualizacji dodatku 1 zawierającego definicje; dodania dodatku 2 dotyczącego zdolności predykcyjnej metody badawczej BCOP w różnych systemach klasyfikacji; aktualizacji dodatku 3 zawierającego wykaz substancji chemicznych przeznaczonych do oceny biegłości; oraz aktualizacji dodatku 4 dotyczącego pojemnika na rogówkę w badaniu BCOP (pkt 1) oraz przyrządu do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki (pkt 2 i 3).

Obecnie powszechnie uznaje się, że w dającej się przewidzieć przyszłości żaden pojedynczy test działania drażniącego na oko in vitro nie będzie w stanie zastąpić testu działania drażniącego na oko in vivo wg Draize'a na potrzeby prognozowania pełnego zakresu działania drażniącego różnych klas chemicznych. Strategiczne połączenia kilku alternatywnych metod badawczych w ramach (zintegrowanej) strategii badań mogą jednak być w stanie zastąpić test działania drażniącego na oko wg Draize'a (5). Podejście odgórne (5) ma w założeniu być stosowane wówczas, gdy na podstawie istniejących informacji oczekuje się, że substancja chemiczna będzie miała wysoki potencjał działania drażniącego, podejście oddolne (5) ma być natomiast stosowane wówczas, gdy na podstawie istniejących informacji oczekuje się, że substancja chemiczna nie spowoduje podrażnienia oczu w stopniu wymagającym zaklasyfikowania jej jako substancji drażniącej dla oczu. Metoda badawcza BCOP jest metodą badawczą in vitro, którą można stosować w niektórych okolicznościach i przy określonych ograniczeniach do celów klasyfikacji i oznakowania substancji chemicznych pod względem zagrożeń dla oczu. Chociaż uważa się, że metoda badawcza BCOP nie może samodzielnie zastąpić badania na oku królika in vivo, jest ona zalecana jako pierwszy etap w strategii badań, takiej jak podejście odgórne zaproponowane przez Scotta et al. (5) na potrzeby identyfikacji substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu, tj. substancji chemicznych, które należy zaklasyfikować do kategorii 1 wg GHS ONZ bez dalszych badań (4). Metoda badawcza BCOP jest również zalecana do celów identyfikowania substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania do substancji powodujących podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu zgodnie z GHS ONZ (brak kategorii wg GHS ONZ) (4), w ramach strategii badań takiej jak podejście oddolne (5). Konieczne będzie jednak przeprowadzenie dodatkowego badania (in vitro lub in vivo) w odniesieniu do substancji chemicznej, w przypadku której nie przewiduje się, żeby powodowała poważne uszkodzenie oczu, ani której nie zaklasyfikowano do substancji powodujących podrażnienie/poważne uszkodzenie oczu w ramach metody badawczej BCOP w celu ustanowienia ostatecznej klasyfikacji.

Niniejsza metoda badawcza ma na celu opisanie procedur stosowanych do oceny potencjalnego działania szkodliwego dla oczu badanej substancji chemicznej, określanego na podstawie potencjału wywoływania przez tę substancję zmętnienia i zwiększonej przepuszczalności w izolowanej rogówce bydlęcej. Efekty toksyczne dla rogówki są oceniane na podstawie: (i) zmniejszonej przepuszczalności światła (zmętnienie) oraz (ii) zwiększonej przepuszczalności barwnika na bazie soli sodowej fluoresceiny (przepuszczalność). Oceny zmętnienia i przepuszczalności rogówki w następstwie narażenia rogówki na badaną substancję są łączone w celu wyprowadzenia oceny punktowej działania drażniącego in vitro, którą wykorzystuje się do klasyfikowania stopnia działania drażniącego badanej substancji.

Definicje znajdują się w dodatku 1.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE I OGRANICZENIA

Niniejsza metoda badawcza opiera się na protokole metody badawczej BCOP ICCVAM (6)(7), który pierwotnie opracowano na podstawie informacji uzyskanych z instytutu badań in vitro (Institute for In Vitro Sciences, IIVS) oraz na protokole 124 INVITTOX (8), który został zastosowany w sponsorowanym przez Wspólnotę Europejską badaniu prewalidacyjnym przeprowadzonym w latach 1997–1998. Podstawą dla obydwu powyższych protokołów była metoda badawcza BCOP, o której po raz pierwszy wspomina Gautheron et al. 9).

Metodę badawczą BCOP można wykorzystać do identyfikowania substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu zgodnie z GHS ONZ, tj. substancji chemicznych zaklasyfikowanych do kategorii 1 wg GHS ONZ (4). W przypadku wykorzystywania metody badawczej BCOP do tego celu metoda ta wykazuje ogólną dokładność na poziomie 79 % (150/191), odsetek wyników fałszywie dodatnich na poziomie 25 % (32/126) oraz odsetek wyników fałszywie ujemnych na poziomie 14 % (9/65) w porównaniu do danych uzyskanych w wyniku metody badawczej na oku królika in vivo, sklasyfikowanych zgodnie z systemem klasyfikacji GHS ONZ (3) (zob. dodatek 2, tabela 1). W przypadku wykluczenia z bazy danych badanych substancji chemicznych należących do określonych klas chemicznych (tj. alkohole, ketony) lub fizycznych (tj. substancje stałe) ogólna dokładność metody badawczej BCOP wynosi 85 % (111/131), odsetek wyników fałszywie dodatnich wynosi 20 % (16/81), a odsetek wyników fałszywie ujemnych wynosi 8 % (4/50) zgodnie z systemem klasyfikacji GHS ONZ (3). Potencjalne wady metody badawczej BCOP w przypadku stosowania tej metody do identyfikowania substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu (substancji zaklasyfikowanych do kategorii 1 wg GHS ONZ) opierają się na wysokich odsetkach wyników fałszywie dodatnich w przypadku alkoholi i ketonów oraz na wysokim odsetku wyników fałszywie ujemnych w przypadku substancji stałych, które to wyniki obserwuje się w bazie danych służących do walidacji (1)(2)(3). Ponieważ jednak metoda badawcza BCOP nie prowadzi do zawyżania wyników w odniesieniu do wszystkich alkoholi i ketonów, a niektóre z tych substancji są prawidłowo klasyfikowane na podstawie prognoz jako należące do kategorii 1 wg GHS ONZ, tych dwóch organicznych grup funkcyjnych nie wyklucza się z dziedziny zastosowania tej metody badawczej. To użytkownik niniejszej metody badawczej powinien zdecydować, czy można zaakceptować możliwe zawyżenie wyników dotyczących alkoholu lub ketonu lub czy należy przeprowadzić dalsze badania zgodnie z podejściem opartym na analizie wagi dowodów. Jeżeli chodzi o odsetek wyników fałszywie ujemnych w przypadku substancji stałych, należy zauważyć, że substancje stałe mogą prowadzić do zmiennych i ekstremalnych warunków narażenia w teście działania drażniącego na oko in vivo wg Draize'a, co z kolei może skutkować nietrafnymi prognozami ich rzeczywistego potencjału działania drażniącego (10). Należy również zauważyć, że żaden z wyników fałszywie ujemnych wskazanych w bazie danych służących do walidacji ICCVAM (2)(3) w kontekście identyfikacji substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu (kategoria 1 wg GHS ONZ) nie dał oceny punktowej działania drażniącego in vitro mniejszej niż 3 lub równej 3, co jest kryterium zidentyfikowania badanej substancji chemicznej jako nienależącej do żadnej kategorii wg GHS ONZ. Ponadto w tym kontekście odsetek wyników fałszywie ujemnych w badaniu BCOP nie ma decydującego znaczenia, ponieważ wszystkie badane substancje chemiczne, w przypadku których ocena punktowa działania drażniącego in vitro ma wartość większą niż 3, ale nie większą niż 55, zostaną następnie zbadane za pomocą innych odpowiednio zweryfikowanych badań in vitro lub w ostateczności na królikach, w zależności od wymogów regulacyjnych, przy zastosowaniu testów sekwencyjnych zgodnie z podejściem opartym na analizie wagi dowodów. Ze względu na fakt, że niektóre ze stałych substancji chemicznych są prawidłowo klasyfikowane na podstawie prognoz w ramach metody badawczej BCOP jako należące do kategorii 1 wg GHS ONZ, tego stanu skupienia również nie wyklucza się z dziedziny zastosowania niniejszej metody badawczej. Osoby przeprowadzające badanie mogą rozważyć zastosowanie niniejszej metody badawczej w odniesieniu do wszystkich rodzajów substancji chemicznych, wskutek czego ocenę punktową działania drażniącego in vitro o wartości powyżej 55 należy zaakceptować jako wskazującą na reakcję wywołującą poważne uszkodzenie oczu, w którym to przypadku należy daną substancję zaklasyfikować do kategorii 1 wg GHS ONZ bez dalszych badań. Jak już wspomniano, wyniki dodatnie uzyskane w przypadku alkoholi lub ketonów należy jednak interpretować z ostrożnością ze względu na potencjalne zawyżenie.

Metodę badawczą BCOP można wykorzystać również do identyfikowania substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania do substancji powodujących podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu według systemu klasyfikacji GHS ONZ (4). W przypadku wykorzystywania metody badawczej BCOP do tego celu metoda ta wykazuje ogólną dokładność na poziomie 69 % (135/196), odsetek wyników fałszywie dodatnich na poziomie 69 % (61/89) oraz odsetek wyników fałszywie ujemnych na poziomie 0 % (0/107) w porównaniu do danych uzyskanych w wyniku metody badawczej na oku królika in vivo, sklasyfikowanych zgodnie z systemem klasyfikacji GHS ONZ (3) (zob. dodatek 2, tabela 2). Uzyskany odsetek wyników fałszywie ujemnych (substancji chemicznych nieprzypisanych do żadnej kategorii wg GHS ONZ, które to substancje in vivo dają ocenę punktową działania drażniącego in vitro o wartości większej niż 3, zob. pkt 47) jest wysoki, ale nie ma decydującego znaczenia w tym kontekście, ponieważ wszystkie badane substancje chemiczne, w przypadku których ocena punktowa działania drażniącego in vitro ma wartość większą niż 3, ale mniejszą niż 55 lub równą 55, zostaną następnie zbadane za pomocą innych odpowiednio zweryfikowanych badań in vitro lub w ostateczności na królikach, w zależności od wymogów regulacyjnych, przy zastosowaniu testów sekwencyjnych zgodnie z podejściem opartym na analizie wagi dowodów. Metoda badawcza BCOP nie wykazuje żadnych szczególnych wad w kontekście badania alkoholi, ketonów i substancji stałych, w przypadku gdy jej celem jest identyfikacja substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania do substancji powodujących podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu (brak kategorii wg GHS ONZ) (3). Osoby przeprowadzające badanie mogą rozważyć zastosowanie niniejszej metody badawczej w odniesieniu do wszystkich rodzajów substancji chemicznych, wskutek czego wynik ujemny (ocena punktowa działania drażniącego in vitro ≤ 3) należy zaakceptować jako wskazujący na brak konieczności zaklasyfikowania danej substancji (brak kategorii GHS ONZ). Ponieważ metoda badawcza BCOP umożliwia prawidłową identyfikację jedynie 31 % substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania do substancji powodujących podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu, niniejszej metody badawczej nie należy wybierać w pierwszej kolejności na potrzeby inicjowania podejścia oddolnego (5), jeżeli dostępne są inne zweryfikowane i zaakceptowane metody in vitro o podobnie wysokiej czułości, ale większej swoistości.

Baza danych służących do walidacji BCOP zawierała łącznie 113 substancji i 100 mieszanin (2) (3). Metoda badawcza BCOP uznawana jest zatem za mającą zastosowanie do badania zarówno substancji, jak i mieszanin.

Nie zaleca się stosowania metody badawczej BCOP do identyfikacji badanych substancji chemicznych, które należy uznać za powodujące podrażnienie oczu (kategoria 2 lub 2A wg GHS ONZ), lub badanych substancji chemicznych, które należy uznać za lekko drażniące dla oczu (kategoria 2B wg GHS ONZ), ze względu na zaniżoną klasyfikację znacznej liczby substancji chemicznych należących do kategorii 1 i uznanie ich za należące do kategorii 2, 2A lub 2B wg GHS ONZ oraz ze względu na zawyżoną klasyfikację i uznanie substancji chemicznych nieprzypisanych do żadnej kategorii wg GHS ONZ za substancje z kategorii 2, 2A lub 2B wg GHS ONZ (2) (3). W tym celu konieczne może być przeprowadzenie dodatkowego badania, z wykorzystaniem innej odpowiedniej metody.

Wszystkie procedury przeprowadzane z wykorzystaniem oczu bydlęcych i rogówki bydlęcej powinny przebiegać zgodnie z przepisami i procedurami dotyczącymi postępowania z materiałem pozyskanym od zwierząt, który obejmuje m.in. tkanki i płyny tkankowe, obowiązującymi w placówce przeprowadzającej badanie. Zaleca się przestrzeganie ogólnych środków ostrożności dla laboratoriów (11).

Chociaż w metodzie badawczej BCOP nie uwzględnia się uszkodzeń spojówki i tęczówki, metoda ta odnosi się do oddziaływania na rogówkę, co stanowi główne kryterium klasyfikacji in vivo, w przypadku rozważania klasyfikacji GHS ONZ. W metodzie badawczej BCOP nie można ocenić odwracalności zmian w rogówce jako takich. Na podstawie badań oczu królika zaproponowano możliwość zastosowania oceny początkowego stadium uszkodzenia rogówki w celu określenia niektórych rodzajów nieodwracalnych skutków (12). Konieczna jest jednak dodatkowa wiedza naukowa, pozwalająca zrozumieć sposób powstawania nieodwracalnych skutków niezwiązanych z pierwszym wystąpieniem poważnego uszkodzenia. Metoda badawcza BCOP nie pozwala też na ocenę potencjalnej toksyczności ogólnoustrojowej związanej z narażeniem oczu.

Niniejsza metoda badawcza będzie aktualizowana okresowo w miarę uwzględniania nowych informacji i danych. Na przykład histopatologia może być przydatna, gdy potrzebna jest bardziej szczegółowa charakterystyka uszkodzenia rogówki. Jak określono w wytycznych OECD nr 160 (13), zachęca się użytkowników do zachowywania rogówek i przygotowywania wycinków histopatologicznych, które można wykorzystać do opracowania bazy danych i kryteriów podejmowania decyzji w celu dalszego poprawienia dokładności niniejszej metody badawczej.

Każde laboratorium, które zaczyna stosować niniejszą metodę badawczą, powinno stosować substancje chemiczne przeznaczone do oceny biegłości wymienione w dodatku 3. Laboratorium może stosować te substancje chemiczne w celu wykazania swojej biegłości technicznej w zakresie przeprowadzania metody badawczej BCOP przed przedstawieniem danych z metody badawczej BCOP do celów regulacyjnej klasyfikacji zagrożeń.

ZASADA BADANIA

Metoda badawcza BCOP jest modelem organotypowym, który zapewnia krótkotrwałe zachowanie normalnych funkcji fizjologicznych i biochemicznych rogówki bydlęcej in vitro. Uszkodzenia spowodowane badaną substancją chemiczną ocenia się w ramach niniejszej metody badawczej na podstawie ilościowych pomiarów zmian w zmętnieniu i przepuszczalności rogówki za pomocą odpowiednio przyrządu do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki oraz spektrofotometru światła widzialnego. Obydwa pomiary stosuje się do obliczenia oceny punktowej działania drażniącego in vitro, na postawie której przypisuje się kategorie klasyfikacji zagrożenia podrażnieniem in vitro w celu przewidzenia potencjału działania drażniącego badanej substancji chemicznej na oczy in vivo (zob. kryteria podejmowania decyzji w pkt 48).

W metodzie badawczej BCOP stosuje się izolowaną rogówkę z oczu bydła pozyskaną bezpośrednio po uboju. Zmętnienie rogówki mierzy się ilościowo jako ilość światła przepuszczanego przez rogówkę. Przepuszczalność mierzy się ilościowo jako ilość barwnika na bazie soli sodowej fluoresceiny, jaka przenika przez całą grubość rogówki i jest wykrywana w środku komory tylnej oka. Badane substancje chemiczne aplikuje się na nabłonek rogówki poprzez dodanie ich do komory przedniej pojemnika na rogówkę. Dodatek 4 zawiera opis i rysunek pojemnika na rogówkę stosowanego w metodzie badawczej BCOP. Pojemniki na rogówkę można nabyć z różnych źródeł komercyjnych lub sporządzić samodzielnie.

Pochodzenie i wiek oczu bydlęcych oraz wybór gatunku zwierząt

Bydło wysyłane do rzeźni jest zazwyczaj poddawane ubojowi albo dla celów spożycia przez ludzi, albo dla innych celów komercyjnych. Rogówki stosowane w metodzie badawczej BCOP pochodzą wyłącznie od zdrowych zwierząt, które uznano za odpowiednie do wprowadzenia do łańcucha żywnościowego człowieka. W związku z tym, że masa bydła jest znacznie zróżnicowana w zależności od rasy, wieku i płci, nie ma zalecanej masy zwierzęcia podczas uboju.

Różnice w wymiarach rogówki mogą pojawić się w przypadku gdy stosuje się oczy pochodzące od zwierząt w różnym wieku. Rogówki o średnicy poziomej > 30,5 mm i grubości środkowej części wynoszącej ≥ 1 100 μm uzyskuje się zazwyczaj od bydła w wieku powyżej ośmiu lat, natomiast rogówki o średnicy poziomej < 28,5 mm i grubości środkowej części wynoszącej < 900 μm uzyskuje się zazwyczaj od bydła w wieku poniżej pięciu lat (14). W związku z powyższym zazwyczaj nie stosuje się oczu pochodzących od bydła w wieku powyżej 60 miesięcy. Zasadniczo nie stosuje się oczu pochodzących od bydła w wieku poniżej 12 miesięcy, ponieważ są one jeszcze w fazie rozwoju, przez co grubość i średnica rogówki są znacznie mniejsze niż w przypadku oczu dorosłego bydła. Stosowanie rogówek pochodzących od młodych zwierząt (tj. w wieku 6–12 miesięcy) jest jednak dozwolone, ponieważ wiążą się z tym pewne korzyści, na przykład: większa dostępność, wąski przedział wiekowy oraz mniejsze zagrożenie związane z potencjalnym narażeniem pracowników na gąbczastą encefalopatię bydła (15). Ze względu na to, że przydatne byłoby przeprowadzenie dalszej oceny wpływu rozmiaru lub grubości rogówki na stopień reakcji na substancje chemiczne żrące i drażniące, zachęca się użytkowników do zgłaszania szacowanego wieku lub szacowanej masy zwierząt, od których pobrano rogówki stosowane w badaniu.

Pobieranie oczu i ich transport do laboratorium

Oczy pobierają pracownicy rzeźni. Aby zminimalizować uszkodzenia mechaniczne i inne rodzaje uszkodzeń oczu, enukleację oczu należy przeprowadzać jak najszybciej po śmierci zwierzęcia, po czym oczy należy natychmiast schłodzić i utrzymywać w chłodzie podczas transportu. Aby zapobiec narażeniu oczu na potencjalnie drażniące substancje chemiczne, podczas opłukiwania głowy zwierzęcia pracownicy rzeźni nie powinni używać detergentów.

Oczy należy w całości zanurzyć w schłodzonym zbuforowanym roztworze soli Hanksa w pojemniku o odpowiednich rozmiarach i przetransportować do laboratorium w taki sposób, żeby zminimalizować możliwość pogorszenia stanu oczu lub skażenia bakteriami. Ponieważ oczy pobiera się w trakcie procesu uboju, mogą one być narażone na kontakt z krwią i innym materiałem biologicznym, w tym z bakteriami i innymi mikroorganizmami. Ważne jest zatem, aby zminimalizować ryzyko skażenia (np. umieszczając pojemnik zawierający oczy w lodzie podczas pobierania i transportowania oraz dodając antybiotyki do zbuforowanego roztworu soli Hanksa używanego do przechowywania oczu podczas transportu [np. penicyliny w ilości 100 j.m./ml i streptomycyny w ilości 100 μg/ml]).

Należy zminimalizować odstęp czasu między pobraniem oczu a użyciem rogówek w metodzie badawczej BCOP (zazwyczaj pobranie i użycie następuje tego samego dnia) oraz wykazać, że nie wpłynie on negatywnie na wyniki badania. Wyniki badania opierają się na kryteriach doboru oczu, jak również na reakcjach w ramach kontroli dodatniej i ujemnej. Wszystkie oczy wykorzystane w badaniu powinny pochodzić z tej samej grupy oczu pobranych danego dnia.

Kryteria doboru oczu wykorzystywanych w metodzie badawczej BCOP

Po dostarczeniu do laboratorium oczy są dokładnie badane pod kątem wad, m.in. zwiększonego zmętnienia, zadrapań i tworzenia nowych naczyń. Wyłącznie rogówki pochodzące z oczu niewykazujących takich wad mogą zostać wykorzystane w badaniu.

Jakość każdej rogówki jest również oceniana na późniejszych etapach badania. Należy odrzucić te rogówki, których zmętnienie po wstępnym, jednogodzinnym okresie wyrównania stężeń przekracza siedem jednostek zmętnienia lub równoważną wartość przy badaniu przyrządem do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki, oraz użyte pojemniki na rogówkę (UWAGA: przyrząd do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki należy poddać wzorcowaniu według norm zmętnienia, które stosuje się do ustalania jednostek zmętnienia, zob. dodatek 4).

Każda grupa badana (otrzymująca badaną substancję chemiczną, stanowiąca jednoczesną kontrolę dodatnią i jednoczesną kontrolę ujemną) składa się z co najmniej trzech gałek ocznych. Trzy rogówki należy wykorzystać do kontroli ujemnej w metodzie badawczej BCOP. Ponieważ wszystkie rogówki są wycinane z całej gałki ocznej i umieszczane w komorach do przechowywania rogówki, istnieje możliwość powstania artefaktów wynikających z obróbki w odniesieniu do wartości zmętnienia i przepuszczalności poszczególnych rogówek (włączając kontrolę ujemną). Ponadto wartości zmętnienia i przepuszczalności uzyskane z rogówek służących do kontroli ujemnej są stosowane w celu skorygowania wartości zmętnienia i przepuszczalności rogówki uzyskanych w wyniku działania badanej substancji chemicznej i kontroli dodatniej w obliczeniach oceny punktowej działania drażniącego in vitro.

PROCEDURA

Przygotowanie oczu

Rogówki niewykazujące nieprawidłowości wycina się wraz z obwódką twardówki o szerokości 2–3 mm w celu ułatwienia dalszej obróbki, przy czym dokłada się starań, by uniknąć uszkodzenia nabłonka i śródbłonka rogówki. Izolowane rogówki umieszcza się w specjalnie zaprojektowanych pojemnikach na rogówkę, składających się z komory przedniej i tylnej, które stykają się odpowiednio z nabłonkiem i śródbłonkiem rogówki. Obydwie komory są maksymalnie wypełniane wcześniej podgrzanym podłożem Eagle'a bez czerwieni fenolowej (najpierw komora tylna), przy czym należy zapewnić, aby nie utworzyły się żadne pęcherzyki powietrza. Następnie urządzenie utrzymuje się w temperaturze 32 ± 1 °C przez co najmniej godzinę w celu zrównoważenia rogówek w pożywce i uzyskania ich normalnej aktywności metabolicznej w zakresie, w jakim jest to możliwe (temperatura na powierzchni rogówki in vivo wynosi w przybliżeniu 32 °C).

Po okresie wyrównania stężeń do obydwu komór dodaje się świeże, wcześniej podgrzane podłoże Eagle'a bez czerwieni fenolowej oraz pobiera się wyjściowe odczyty zmętnienia dla każdej rogówki. Odrzuca się każdą rogówkę, która wykazuje makroskopowe uszkodzenia tkanki (np. zadrapania, przebarwienia, tworzenie nowych naczyń) lub zmętnienie przekraczające siedem jednostek zmętnienia lub równoważną wartość przy badaniu przyrządem do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki, oraz użyte pojemniki na rogówkę. Co najmniej trzy rogówki wybiera się jako rogówki do kontroli ujemnej (lub kontroli z rozpuszczalnikiem). Pozostałe rogówki trafiają następnie do grupy poddawanej działaniu badanej substancji i do grupy kontrolnej dodatniej.

Ze względu na to, że pojemność cieplna wody jest wyższa od pojemności cieplnej powietrza, woda zapewnia stabilniejsze warunki temperatury dla inkubacji. Zaleca się zatem stosowanie kąpieli wodnej w celu utrzymania pojemnika na rogówkę i jego zawartości w temperaturze 32 ± 1 °C. Można jednak również zastosować inkubatory powietrzne, pod warunkiem że podejmie się środki ostrożności w celu utrzymania stabilnej temperatury (np. poprzez wcześniejsze podgrzewanie pojemników i pożywek).

Podawanie badanej substancji chemicznej

Stosuje się dwa różne protokoły poddawania działaniu substancji – jeden dla cieczy i środków powierzchniowo czynnych (stałych lub ciekłych), a drugi dla substancji stałych niebędących środkami powierzchniowo czynnymi.

Ciecze bada się w stanie nierozcieńczonym. Ciała półstałe, kremy i woski są zazwyczaj badane tak jak ciecze. Czyste środki powierzchniowo czynne bada się w stężeniu 10 % w/v w roztworze chlorku sodu o stężeniu 0,9 %, w wodzie destylowanej lub innym rozpuszczalniku, w odniesieniu do którego wykazano, że nie wpływa negatywnie na układ badawczy. Zastosowanie innych stężeń należy odpowiednio uzasadnić. Mieszaniny zawierające środki powierzchniowo czynne mogą być badane w stanie nierozcieńczonym lub po rozcieńczeniu do odpowiedniego stężenia – w zależności od stosownego scenariusza narażenia in vivo. Zastosowanie badanych stężeń należy odpowiednio uzasadnić. Narażenie rogówek na działanie cieczy i środków powierzchniowo czynnych trwa 10 minut. Zastosowanie innego czasu narażenia wymaga odpowiedniego uzasadnienia naukowego. Zob. definicja środka powierzchniowo czynnego i mieszaniny zawierającej środek powierzchniowo czynny podana w dodatku 1.

Substancje stałe niebędące środkami powierzchniowo czynnymi bada się zazwyczaj jako roztwory lub zawiesiny w stężeniu 20 % w/v w roztworze chlorku sodu o stężeniu 0,9 %, w wodzie destylowanej lub innym rozpuszczalniku, w odniesieniu do którego wykazano, że nie wpływa negatywnie na układ badawczy. W niektórych okolicznościach i po przedstawieniu odpowiedniego uzasadnienia naukowego substancje stałe również można badać w postaci czystej poprzez bezpośrednią aplikację na powierzchnię rogówki z zastosowaniem metody „otwartej komory” (zob. pkt 32). Narażenie rogówek na działanie substancji stałych trwa cztery godziny, ale podobnie jak w przypadku cieczy i środków powierzchniowo czynnych możliwe jest zastosowanie innego czasu narażenia pod warunkiem przedstawienia odpowiedniego uzasadnienia naukowego.

Można zastosować różne metody podawania badanej substancji chemicznej w zależności od jej stanu skupienia i właściwości chemicznych (np. od tego, czy jest ona substancją stałą, cieczą, cieczą lepką czy cieczą nielepką). Decydujące znaczenie ma dopilnowanie, aby nabłonek został pokryty badaną substancją chemiczną w odpowiedni sposób oraz aby odpowiednio ją usunięto w trakcie płukania. Metodę „zamkniętej komory” stosuje się zwykle w przypadku badanych substancji chemicznych będących cieczami nielepkimi i cieczami lekko lepkimi, natomiast metodę „otwartej komory” stosuje się zwykle w przypadku badanych substancji chemicznych będących cieczami częściowo lepkimi i lepkimi oraz czystymi substancjami stałymi.

W przypadku metody „zamkniętej komory” badaną substancję chemiczną w ilości wystarczającej (750 μl) do pokrycia nabłonka rogówki wprowadza się do komory przedniej przez otwory do dawkowania znajdujące się w górnej części komory, które następnie w trakcie narażenia uszczelnia się specjalnymi zatyczkami. Należy zapewnić odpowiedni czas narażenia każdej rogówki na działanie badanej substancji chemicznej.

W przypadku metody „otwartej komory” przed rozpoczęciem badania z komory przedniej usuwa się pierścień zabezpieczający okienko i szklane okienko. Kontrolna lub badana substancja chemiczna (w ilości 750 μl lub w ilości wystarczającej do całkowitego pokrycia rogówki) jest aplikowana bezpośrednio na nabłonek rogówki za pomocą mikropipety. Jeżeli trudno jest zaaplikować badaną substancję chemiczną za pomocą pipety, można tę substancję wprowadzić pod ciśnieniem do pipety wyporowej, aby ułatwić dawkowanie. Końcówkę pipety wyporowej umieszcza się w końcówce dawkującej strzykawki w celu wprowadzenia substancji do końcówki pipety wyporowej pod ciśnieniem. W miarę naciskania tłoka strzykawki tłok pipety podnosi się. Jeżeli w końcówce pipety pojawią się pęcherzyki powietrza, usuwa się badaną substancję chemiczną i proces jest powtarzany, dopóki końcówka nie zostanie napełniona bez pęcherzyków powietrza. W razie potrzeby można zastosować normalną strzykawkę (bez igły), ponieważ umożliwia ona dokładne zmierzenie ilości badanej substancji chemicznej oraz ułatwia jej aplikację na nabłonek rogówki. Po podaniu substancji szklane okienko z powrotem umieszcza się w komorze przedniej, aby przywrócić układ zamknięty.

Inkubacja po zakończeniu narażenia

Po okresie narażenia usuwa się badaną substancję chemiczną, substancję służącą do kontroli ujemnej lub substancję służącą do kontroli dodatniej z komory przedniej, zaś nabłonek przedni przemywa się co najmniej trzykrotnie (lub dopóki nie znikną wszystkie widoczne ślady badanej substancji chemicznej) przy użyciu podłoża Eagle'a (zawierającego czerwień fenolową). Do spłukiwania stosuje się pożywkę zawierającą czerwień fenolową, ponieważ na podstawie zmiany barwy czerwieni fenolowej można określić skuteczność spłukiwania badanych substancji kwasowych lub zasadowych. Rogówki przemywa się więcej niż trzy razy, jeżeli czerwień fenolowa ma w dalszym ciągu zmienioną barwę (żółtą lub fioletową) lub jeśli badana substancja chemiczna jest w dalszym ciągu widoczna. Po oczyszczeniu pożywki z badanej substancji chemicznej rogówki opłukuje się po raz ostatni podłożem Eagle'a (bez czerwieni fenolowej). Podłoże Eagle'a (bez czerwieni fenolowej) jest używane do ostatniego opłukania, aby zapewnić usunięcie czerwieni fenolowej z przedniej komory oka przed rozpoczęciem pomiaru zmętnienia. Następnie ponownie wypełnia się komorę przednią świeżym podłożem Eagle'a bez czerwieni fenolowej.

W przypadku cieczy lub środków powierzchniowo czynnych rogówki są inkubowane przez kolejne dwie godziny w temperaturze 32 ± 1 °C. W niektórych sytuacjach przydatne może być zastosowanie dłuższego czasu po narażeniu; należy to rozważyć indywidualnie w każdym przypadku. Rogówki wystawione na działanie substancji stałych poddaje się dokładnemu płukaniu po zakończeniu czterogodzinnego narażenia, ale nie wymagają one dodatkowej inkubacji.

Pod koniec okresu dodatkowej inkubacji w przypadku cieczy i środków powierzchniowo czynnych oraz pod koniec czterogodzinnego narażenia w przypadku substancji stałych niebędących środkami powierzchniowo czynnymi dokonuje się pomiaru zmętnienia i przepuszczalności każdej rogówki. Każdą rogówkę obserwuje się również wzrokowo i zapisuje się istotne obserwacje (np. łuszczenie się tkanki, pozostałości badanej substancji chemicznej, niejednolite zmętnienie). Powyższe obserwacje mogą mieć istotne znaczenie, ponieważ mogą znaleźć odzwierciedlenie w zmienności odczytów przyrządu do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki.

Kontrolne substancje chemiczne

Każde doświadczenie obejmuje jednoczesną kontrolę ujemną lub kontrolę z rozpuszczalnikiem/nośnikiem i kontrolę dodatnią.

W przypadku badania substancji ciekłej o stężeniu 100 % w metodzie badawczej BCOP uwzględnia się jednoczesną kontrolę ujemną (np. roztwór chlorku sodu o stężeniu 0,9 % lub woda destylowana) w celu wykrycia niespecyficznych zmian w układzie badawczym i zapewnienia punktu odniesienia dla punktów końcowych badania. Dzięki uwzględnieniu kontroli ujemnej warunki badania nie powodują nieprawidłowej reakcji w postaci działania drażniącego.

W przypadku badania cieczy rozcieńczonej, środka powierzchniowo czynnego lub substancji stałej w metodzie badawczej BCOP uwzględnia się jednoczesną grupę kontrolną z rozpuszczalnikiem/nośnikiem w celu wykrycia niespecyficznych zmian w układzie badawczym i zapewnienia punktu odniesienia dla punktów końcowych badania. Stosować można jedynie rozpuszczalnik/nośnik, w odniesieniu do którego wykazano, że nie wpływa negatywnie na układ badawczy.

W każdym doświadczeniu uwzględnia się substancję chemiczną, o której wiadomo, że wywołuje reakcję dodatnią, jako jednoczesną kontrolę dodatnią w celu zweryfikowania integralności układu badawczego i prawidłowości jego działania. Aby zapewnić jednak możliwość oceny zmienności reakcji w kontroli dodatniej w czasie, siła reakcji w postaci działania drażniącego nie powinna być nadmierna.

Przykładowymi substancjami służącymi do kontroli dodatniej dla badanych substancji chemicznych w stanie ciekłym są etanol w stężeniu 100 % lub dimetyloformamid w stężeniu 100 %. Przykładem substancji służących do kontroli dodatniej dla badanych substancji chemicznych w stanie stałym jest imidazol o stężeniu 20 % w/v w roztworze chlorku sodu o stężeniu 0,9 %.

Wzorcowe substancje chemiczne są przydatne do oceny potencjalnego działania drażniącego na oczy nieznanych substancji chemicznych z określonej klasy chemicznej lub produktowej lub do oceny względnego potencjalnego działania drażniącego substancji drażniącej dla oczu w określonym zakresie reakcji w postaci działania drażniącego.

Pomiar punktów końcowych

Zmętnienie określa się na podstawie ilości światła przepuszczanego przez rogówkę. Zmętnienie rogówki mierzy się ilościowo za pomocą przyrządu do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki, w wyniku czego otrzymuje się wartości zmętnienia mierzone na skali ciągłej.

Przepuszczalność określa się na podstawie ilości barwnika na bazie soli sodowej fluoresceiny, jaka przenika przez wszystkie warstwy rogówki (tj. przez nabłonek na zewnętrznej powierzchni rogówki po śródbłonek na wewnętrznej powierzchni rogówki). Do przedniej komory pojemnika na rogówkę, która styka się z nabłonkiem rogówki, dodaje się roztwór 1 ml soli sodowej fluoresceiny (odpowiednio 4 lub 5 mg/ml w przypadku badania cieczy i środków powierzchniowo czynnych lub substancji stałych niebędących środkami powierzchniowo czynnymi), natomiast tylną komorę oka, która styka się ze śródbłonkiem rogówki, wypełnia się świeżym podłożem Eagle'a. Następnie pojemnik inkubuje się w pozycji poziomej przez 90 ± 5 min w temperaturze 32 ± 1 °C. Ilość soli sodowej fluoresceiny, jaka przedostaje się do tylnej komory, jest mierzona ilościowo za pomocą spektrofotometrii UV/VIS. Pomiary spektrofotometryczne przy długości fali 490 nm rejestruje się jako wartości gęstości optycznej (OD490) lub absorbancji mierzone na skali ciągłej. Wartości przepuszczalności fluoresceiny określa się przy użyciu wartości OD490 otrzymanych w wyniku zastosowania spektrofotometru światła widzialnego, w którym stosuje się standardową 1-centymetrową drogę optyczną.

Można ewentualnie zastosować czytnik płytek 96-dołkowych, pod warunkiem że: (i) można ustalić zakres liniowy czytnika płytek w celu określenia wartości OD490 fluoresceiny oraz (ii) odpowiednia liczba próbek fluoresceiny zostanie użyta w płytce 96-dołkowej, aby otrzymać wartości OD490 równoważne standardowej 1-centymetrowej drodze optycznej (konieczne może być całkowite wypełnienie dołków [zwykle 360μl]).

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Ocena danych

Po skorygowaniu wartości zmętnienia i średniej przepuszczalności (OD490) względem wartości zmętnienia i ujemnej kontroli wartości przepuszczalności OD490, średnie wartości zmętnienia i przepuszczalności OD490 dla każdej badanej grupy należy połączyć w wyprowadzony empirycznie wzór w celu obliczenia oceny punktowej działania drażniącego in vitro (IVIS) w odniesieniu do każdej grupy badanej w następujący sposób:

IVIS = średnia wartość zmętnienia + (15 × średnia wartość przepuszczalności OD490)

Sina et al. (16) podaje, że powyższy wzór wyprowadzono w trakcie badań wewnętrznych i międzylaboratoryjnych. Dane otrzymane dla serii 36 związków w badaniu międzylaboratoryjnym poddano analizie wielowymiarowej w celu wyznaczenia równania, które najlepiej opisuje zależność między danymi in vivo a danymi in vitro. Analizę przeprowadzili naukowcy w dwóch odrębnych przedsiębiorstwach i wyprowadzili niemalże identyczne równania.

Wartości zmętnienia i przepuszczalności również należy oceniać niezależnie, aby stwierdzić, czy badana substancja chemiczna wywoływała działanie żrące lub silnie drażniące wyłącznie w jednym z dwóch punktów końcowych (zob. kryteria podejmowania decyzji).

Kryteria podejmowania decyzji

Wartości graniczne oceny punktowej działania drażniącego in vitro (IVIS) służące do identyfikowania badanych substancji chemicznych jako powodujące poważne uszkodzenie oczu (kategoria 1 wg GHS ONZ) oraz badanych substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania do substancji powodujących podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu (brak kategorii wg GHS ONZ), podano poniżej:

IVIS

GHS ONZ

≤3

Brak kategorii

>3; ≤55

Nie można przewidzieć działania

>55

Kategoria 1

Kryteria dopuszczalności badania

Badanie uznaje się za dopuszczalne, jeżeli kontrola dodatnia daje wskaźnik IVIS mieszczący się w ramach dwóch odchyleń standardowych od obecnej historycznej średniej, którą należy aktualizować co najmniej co trzy miesiące lub za każdym razem, gdy dopuszczalne badanie przeprowadza się w laboratoriach, w których rzadko przeprowadza się badania (tj. rzadziej niż raz na miesiąc). Wartości zmętnienia i przepuszczalności otrzymane w wyniku reakcji otrzymanych w kontroli ujemnej lub kontroli z rozpuszczalnikiem/nośnikiem powinny być niższe do ustalonych górnych limitów wartości zmętnienia i przepuszczalności tła dla rogówek bydlęcych poddanych odpowiedniej kontroli ujemnej lub kontroli z rozpuszczalnikiem/nośnikiem. Pojedyncza seria badań, w skład której wchodzą co najmniej trzy rogówki, powinna wystarczyć dla badanej substancji chemicznej, jeśli otrzymana klasyfikacja jest jednoznaczna. W przypadku wyników granicznych otrzymanych podczas pierwszej serii badań należy jednak rozważyć przeprowadzenie drugiej serii badań (nie jest to konieczne) oraz trzeciej w przypadku niezgodnych średnich wyników IVIS między pierwszymi dwiema seriami badań. W związku z tym wynik pierwszej serii badań uznaje się za wynik graniczny, jeżeli prognozy dotyczące trzech rogówek były niezgodne, tj.:

dwie z trzech rogówek dały niezgodne prognozy odbiegające od średniej dla wszystkich trzech rogówek ALBO

jedna z trzech rogówek dała niezgodną prognozę odbiegającą od średniej dla wszystkich trzech rogówek ORAZ niezgodny wynik był większy o 10 jednostek IVIS od progu granicznego wynoszącego 55;

jeżeli powtórzona seria badań potwierdzi prognozy serii badań wstępnych (na podstawie średniej wartości wskaźnika IVIS), wówczas można podjąć ostateczną decyzję bez dalszych badań. Jeżeli powtórzona seria badań będzie skutkowała prognozą niezgodną z serią badań wstępnych (na podstawie średniej wartości wskaźnika IVIS), wówczas należy przeprowadzić trzecią i ostatnią serię badań w celu przeanalizowania niejednoznacznych prognoz oraz zaklasyfikowania badanej substancji chemicznej. Dopuszczalne może być odstąpienie od dalszych badań na potrzeby klasyfikacji i oznakowania, w przypadku gdy każda seria badań prowadzi do prognozy dotyczącej zaliczenia do kategorii 1 wg GHS ONZ.

Sprawozdanie z badania

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje, o ile są one istotne dla przebiegu badania:

 

Badane i kontrolne substancje chemiczne

nazwa chemiczna (nazwy chemiczne), np. nazwa strukturalna używana przez Chemical Abstracts Service (CAS), po której następują inne nazwy, jeżeli są znane; numer CAS, jeżeli jest znany;

czystość i skład badanej substancji chemicznej lub kontrolnej substancji chemicznej (jako wartość procentowa masy), w zakresie, w jakim te informacje są dostępne;

właściwości fizykochemiczne istotne dla przebiegu badania, np. stan skupienia, lotność, pH, stabilność, klasa chemiczna, rozpuszczalność w wodzie;

postępowanie z badanymi/kontrolnymi substancjami chemicznymi przed rozpoczęciem badań, w stosownych przypadkach (np. podgrzewanie, mielenie);

stabilność, jeżeli jest znana.

 

Informacje dotyczące sponsora i placówki przeprowadzającej badanie

nazwa i adres sponsora i placówki przeprowadzającej badanie oraz dane kierownika badań.

 

Warunki metody badawczej

opis stosowanego przyrządu do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki (np. model i specyfikacja) oraz ustawień urządzenia;

informacje na temat wzorcowania urządzeń zastosowanych do pomiaru zmętnienia i przepuszczalności (np. przyrząd do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki i spektrofotometr) w celu zapewnienia liniowości pomiarów;

rodzaj zastosowanego pojemnika na rogówkę (np. model i specyfikacja);

opis innych wykorzystanych urządzeń;

procedura zastosowana w celu zapewnienia integralności (tj. dokładności i wiarygodności) metody badawczej w czasie (np. okresowe badanie substancji chemicznych przeznaczonych do oceny biegłości).

 

Kryteria dotyczące badania dopuszczalnego

dopuszczalne zakresy jednoczesnej kontroli dodatniej i ujemnej na podstawie danych historycznych;

w stosownych przypadkach dopuszczalny zakres jednoczesnej kontroli odniesienia na podstawie danych historycznych.

 

Pobieranie oczu i ich przygotowywanie

identyfikacja źródła oczu (tj. zakład, z którego je pobrano);

średnica rogówki jako miernik wieku zwierzęcia źródłowego i przydatności do analizy;

warunki przechowywania i transportu oczu (np. data i czas pobrania oczu, odstęp czasu między pobraniem oczu a rozpoczęciem badania, środek transportu i temperatura, wszelkie podane antybiotyki);

przygotowanie i umieszczenie rogówek bydła, w tym oświadczenia dotyczące ich jakości, temperatury pojemników na rogówkę oraz kryteria dotyczące wyboru rogówek do badania.

 

Procedura badawcza

liczba użytych kontrprób;

nazwa wykorzystanej kontroli ujemnej i dodatniej (w stosownych przypadkach, także kontrole z zastosowaniem rozpuszczalnika i kontrole odniesienia);

stężenie badanej substancji chemicznej, zastosowanie, czas narażenia i czas inkubacji po narażeniu na działanie substancji;

opis zastosowanych kryteriów oceny i podejmowania decyzji;

opis zastosowanych kryteriów dopuszczalności badania;

opis wszelkich modyfikacji procedury badawczej;

opis zastosowanych kryteriów podejmowania decyzji.

 

Wyniki

Tabelaryczne zestawienie danych dotyczących pojedynczych badanych próbek (np. wartości zmętnienia i OD490 oraz obliczony wskaźnik IVIS dla badanej substancji chemicznej oraz kontroli dodatniej, ujemnej i odniesienia [jeżeli została uwzględniona], przedstawione w postaci tabeli, w stosownych przypadkach z uwzględnieniem danych z powtórzeń doświadczenia z kontrpróbą oraz średnich ± odchylenie standardowe dla każdego doświadczenia);

opis innych zaobserwowanych skutków;

otrzymana klasyfikacja GHS ONZ in vitro, w stosownych przypadkach.

 

Omówienie wyników

 

Wniosek

BIBLIOGRAFIA

(1)

ICCVAM (2006). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Międzyagencyjny Komitet Koordynacyjny ds. Uznawania Metod Alternatywnych (ICCVAM) oraz Amerykański Krajowy Program Toksykologiczny (NTP) Międzyagencyjnego Centrum Oceny Alternatywnych Metod Toksykologicznych (NICEATM). Publikacja NIH nr: 07-4517. Dostępne na stronie internetowej: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.

(2)

ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report: Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. Publikacja NIH nr 10-7553. Research Triangle Park, NC:National Institute of Environmental Health Sciences. Dostępne na stronie internetowej: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(3)

OECD (2013). Streamlined Summary Document supporting the Test Guideline 437 for eye irritation/corrosion. Seria OECD dotycząca badań i oceny nr 189, OECD, Paryż.

(4)

ONZ (2011). Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS) ONZ, ST/SG/AC.10/30 Rev 4, Nowy Jork i Genewa: Organizacja Narodów Zjednoczonych: Dostępne na stronie internetowej: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.

(5)

Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P. i Zuang, V. (2010). A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicol. in Vitro 24: 1–9.

(6)

ICCVAM (2006). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. W: ICCVAM Test Method Evaluation Report – in vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Międzyagencyjny Komitet Koordynacyjny ds. Uznawania Metod Alternatywnych (ICCVAM) oraz Amerykański Krajowy Program Toksykologiczny (NTP) Międzyagencyjnego Centrum Oceny Alternatywnych Metod Toksykologicznych (NICEATM). Publikacja NIH nr: 07-4517. Dostępne na stronie internetowej: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.

(7)

ICCVAM (2010). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. W: ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. Międzyagencyjny Komitet Koordynacyjny ds. Uznawania Metod Alternatywnych (ICCVAM) oraz Amerykański Krajowy Program Toksykologiczny (NTP) Międzyagencyjnego Centrum Oceny Alternatywnych Metod Toksykologicznych (NICEATM). Publikacja NIH nr: 10-7553A. Dostępne na stronie internetowej: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(8)

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Włochy: Europejskie Centrum Uznawania Metod Alternatywnych (ECVAM).

(9)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. i Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442–449.

(10)

Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicol. in Vitro 20:78–81.

(11)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L. i Komitet Doradczy ds. Praktyk w zakresie Kontroli Zakażeń w Opiece Zdrowotnej (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Dostępne na stronie internetowej: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(12)

Maurer, J.K., Parker, R.D. i Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106–117.

(13)

OECD (2011). Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants. Seria dotycząca badań i oceny nr 160. Przyjęto w dniu 25 października 2011 r. Paryż: Organizacja Współpracy Gospodarczej i Rozwoju.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. i Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159–2165.

(15)

Collee, J. i Bradley, R. (1997). BSE: A decade on – Part I. The Lancet 349: 636–641.

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D. i Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20–31.

(17)

Rozdział B.5 niniejszego załącznika, Działanie żrące / silnie drażniące na oczy.

(18)

ICCVAM (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. Publikacja NIH nr: 06-4512. Research Triangle Park: Amerykański Krajowy Program Toksykologiczny. Dostępne na stronie internetowej: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].

(19)

OECD (1998). Seria dotycząca zasad dobrej praktyki laboratoryjnej i monitorowania zgodności. Nr 1: OECD Principles on Good Laboratory Practice (revised in 1997).

Dostępne na stronie: http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html

Dodatek 1

DEFINICJE

Dokładność : stopień zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody badawczej a przyjętymi wartościami odniesienia. Jest to miara efektywności metody badawczej i jeden z aspektów jej istotności. Pojęcia tego często używa się zamiennie z pojęciem „zgodność” na oznaczenie odsetka prawidłowych wyników uzyskiwanych przy użyciu metody badawczej.

Wzorcowa substancja chemiczna : substancja chemiczna używana jako wzorzec do porównań z badaną substancją chemiczną. Wzorcowa substancja chemiczna powinna mieć następujące cechy: (i) stałe i wiarygodne źródło(-a); (ii) podobieństwo strukturalne i funkcjonalne do badanej klasy substancji chemicznych; (iii) znane właściwości fizyczne i chemiczne; (iv) dane potwierdzające występowanie znanych skutków oraz (v) znany potencjał w zakresie pożądanych reakcji.

Podejście oddolne : stopniowe podejście stosowane w odniesieniu do substancji chemicznej, w przypadku której podejrzewa się, że nie wymaga zaklasyfikowania jako substancja powodująca podrażnienie lub poważne uszkodzenie oka; takie podejście polega na odróżnieniu substancji chemicznych niewymagających zaklasyfikowania (wynik ujemny) od pozostałych substancji chemicznych (wynik dodatni).

Substancja chemiczna : substancja albo mieszanina.

Rogówka : przezroczysta warstwa w przedniej części gałki ocznej, która okrywa tęczówkę i źrenicę oraz wpuszcza światło do wnętrza oka.

Zmętnienie rogówki : pomiar stopnia zmętnienia rogówki wskutek narażenia na badaną substancję chemiczną. Zwiększone zmętnienie rogówki wskazuje na jej uszkodzenie. Zmętnienie można ocenić subiektywnie, jak w przypadku testu Draize'a wykonywanego na oku królika, lub obiektywnie przy użyciu odpowiedniego narzędzia np. „przyrządu do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki”.

Przepuszczalność rogówki : ilościowy pomiar szkody wyrządzonej w nabłonku rogówki poprzez określenie, jaka ilość barwnika na bazie soli sodowej fluoresceiny przenika przez wszystkie warstwy rogówki.

Podrażnienie oka : zmiany w oku spowodowane zaaplikowaniem badanej substancji chemicznej na wierzchnią warstwę oka, które są w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po zaaplikowaniu. Określenie używane zamiennie z określeniem „odwracalne skutki działania na oczy” oraz ze sformułowaniem „kategoria 2 GHS ONZ” (4).

Odsetek wyników fałszywie ujemnych : odsetek wszystkich substancji chemicznych dających wynik dodatni fałszywie zidentyfikowanych po zastosowaniu metody badawczej jako dające wynik ujemny. Jest to jeden ze wskaźników efektywności metody badawczej.

Odsetek wyników fałszywie dodatnich : odsetek wszystkich substancji chemicznych dających wynik ujemny fałszywie zidentyfikowanych po zastosowaniu metody badawczej jako dające wynik dodatni. Jest to jeden ze wskaźników efektywności metody badawczej.

Zagrożenie : nieodłączna właściwość czynnika lub sytuacja, która może potencjalnie doprowadzić do niekorzystnych skutków w przypadku narażenia organizmu, systemu lub (sub)populacji na taki czynnik.

Ocena punktowa działania drażniącego in vitro (IVIS) : wyprowadzony empirycznie wzór stosowany w metodzie badawczej BCOP, zgodnie z którym średnie wartości zmętnienia i przepuszczalności dla każdej grupy badanej są łączone w jedną ocenę punktową działania drażniącego in vitro dla każdej grupy badanej. IVIS = średnia wartość zmętnienia + (15 x średnia wartość przepuszczalności).

Nieodwracalne skutki działania na oczy : zob. „Poważne uszkodzenie oczu”.

Mieszanina : mieszanina lub roztwór, które składają się z co najmniej dwóch substancji niewchodzących ze sobą w reakcję (4).

Kontrola ujemna : kontrpróba niepoddana działaniu badanej substancji chemicznej zawierająca wszystkie składniki układu badawczego. Próbka ta jest przetwarzana razem z próbkami poddanymi działaniu badanej substancji chemicznej oraz z innymi próbkami kontrolnymi w celu określenia, czy rozpuszczalnik wchodzi w reakcję z układem badawczym.

Niesklasyfikowane : substancje chemiczne, które nie zostały zaklasyfikowane jako substancje podrażniające oczy (kategoria 2 2A lub 2B wg GHS ONZ) ani substancje powodujące poważne uszkodzenie oczu (kategoria 1 wg GHS ONZ). Określenie używane zamiennie ze sformułowaniem „brak kategorii GHS ONZ”.

Przyrząd do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki : narzędzie stosowane do pomiaru stopnia „zmętnienia rogówki” poprzez ilościową ocenę przepuszczalności światła przez rogówkę. Typowe urządzenie posiada dwie komory, z których każda ma własne źródło światła i fotokomórkę. W jednej z komór znajduje się badana rogówka, natomiast druga jest używana do wzorcowania i zerowania urządzenia. Światło z lampy halogenowej jest kierowane na fotokomórkę przez komorę kontrolną (pustą komorę bez okien i płynu), a następnie porównywane ze światłem kierowanym na fotokomórkę przez komorę doświadczalną, w której znajduje się komora zawierająca rogówkę. Porównuje się różnicę w przepuszczalności światła między fotokomórkami i na wyświetlaczu cyfrowym przedstawiana jest wartość liczbowa zmętnienia.

Kontrola dodatnia : kontrpróba zawierająca wszystkie składniki układu badawczego, poddana działaniu substancji chemicznej, o której wiadomo, że wywołuje reakcję dodatnią. Aby zapewnić możliwość oceny zmienności reakcji w kontroli dodatniej w czasie, stopień reakcji dodatniej nie powinien być nadmierny.

Odwracalne skutki działania na oczy : zob. „Działanie drażniące na oczy”.

Wiarygodność : miary zakresu, w jakim metoda badawcza może być przeprowadzana w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomiędzy laboratoriami na przestrzeni czasu w przypadku jej przeprowadzania przy użyciu tego samego protokołu. Ocenia się ją, obliczając odtwarzalność wewnątrz- i międzylaboratoryjną oraz powtarzalność wewnątrzlaboratoryjną.

Poważne uszkodzenie oczu : uszkodzenie tkanki oka lub poważne fizyczne pogorszenie widzenia spowodowane zaaplikowaniem badanej substancji chemicznej na przednią powierzchnię oka, które nie jest w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po zaaplikowaniu. Określenie używane zamiennie z określeniem „nieodwracalne skutki działania na oczy” oraz ze sformułowaniem „kategoria 1 wg GHS ONZ” (4).

Kontrola z rozpuszczalnikiem/nośnikiem : próbka niepoddana działaniu badanej substancji, zawierająca wszystkie składniki układu badawczego, w tym rozpuszczalnik lub nośnik, która jest przetwarzana razem z próbkami poddanymi działaniu badanej substancji oraz z innymi próbkami kontrolnymi w celu określenia wyjściowej reakcji dla próbek poddanych działaniu badanej substancji chemicznej rozpuszczonej w tym samym rozpuszczalniku lub nośniku. W przypadku badania z jednoczesną kontrolą ujemną próbka ta wykazuje również, czy rozpuszczalnik lub nośnik wchodzi w reakcję z układem badawczym.

Substancja : pierwiastki chemiczne i ich związki w stanie naturalnym lub uzyskane w wyniku dowolnego procesu produkcyjnego, w tym wszelkie dodatki konieczne do zachowania trwałości produktu i wszelkie zanieczyszczenia powstałe w wyniku zastosowanego procesu, z wyłączeniem wszelkich rozpuszczalników, które można oddzielić bez wpływu na stabilność substancji i bez zmiany jej składu (4).

Środek powierzchniowo czynny : zwany także surfaktantem, jest to substancja, np. detergent, która może zmniejszać napięcie powierzchniowe cieczy, umożliwiając tym samym jej pienienie lub przenikanie w ciała stałe; substancja ta jest także zwana środkiem zwilżającym.

Mieszanina zawierająca środek powierzchniowo czynny : w kontekście niniejszej metody badawczej jest to mieszania zawierająca jeden lub większą ilość środków powierzchniowo czynnych w stężeniu końcowym >5 %.

Podejście odgórne : stopniowe podejście stosowane w odniesieniu do substancji chemicznej, w przypadku której podejrzewa się, że powoduje poważne uszkodzenie oczu; takie podejście polega na odróżnieniu substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu (wynik dodatni) od pozostałych substancji chemicznych (wynik ujemny).

Badana substancja chemiczna : dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.

Wielopoziomowa strategia badań : strategia badań sekwencyjnych, w ramach której wszystkie istniejące informacje na temat badanej substancji chemicznej są analizowane na każdym poziomie w określonym porządku z zastosowaniem procesu uwzględniającego wagę dowodów w celu określenia, czy dostępna jest wystarczająca ilość informacji do podjęcia decyzji o klasyfikacji zagrożenia przed przejściem do następnego poziomu. Jeżeli na podstawie dostępnych informacji można przypisać badanej substancji chemicznej potencjał w zakresie wywołania podrażnienia, dodatkowe badania nie są wymagane. Jeżeli na podstawie dostępnych informacji nie można przypisać badanej substancji chemicznej potencjału wywołania podrażnień, przeprowadza się procedurę badań sekwencyjnych na zwierzętach do momentu, w którym będzie można dokonać jednoznacznej klasyfikacji.

Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów Organizacji Narodów Zjednoczonych (GHS ONZ) : system, w ramach którego proponuje się klasyfikację substancji chemicznych (substancji i mieszanin) według znormalizowanych rodzajów i poziomów zagrożeń fizycznych, zdrowotnych i środowiskowych oraz omawia się odpowiednie elementy komunikacyjne, takie jak: piktogramy, hasła ostrzegawcze, zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia, zwroty wskazujące środki ostrożności i karty charakterystyki substancji i produktów niebezpiecznych, aby przekazać informacje na temat ich szkodliwego działania w celu zapewnienia ochrony ludzi (w tym pracowników, robotników, przewoźników, konsumentów i ratowników) i środowiska (4).

Kategoria 1 wg GHS ONZ : zob. „Poważne uszkodzenie oczu”.

Kategoria 2 wg GHS ONZ : zob. „Działanie drażniące na oczy”.

Brak kategorii wg GHS ONZ : substancje chemiczne, które nie spełniają wymogów w zakresie zaklasyfikowania jako należące do kategorii 1 lub 2 (2A lub 2B) wg GHS ONZ. Określenie używane zamiennie ze sformułowaniem „niesklasyfikowane”.

Zweryfikowana metoda badawcza : metoda badawcza, w odniesieniu do której zakończono badania walidacyjne w celu określenia jej istotności (w tym dokładności) i wiarygodności w odniesieniu do konkretnego celu. Należy zauważyć, że zweryfikowana metoda badawcza może nie wykazywać dostatecznej efektywności z punktu widzenia dokładności i wiarygodności, aby można było ją uznać za dopuszczalną w odniesieniu do danego celu.

Waga dowodów : proces analizowania mocnych i słabych stron różnych informacji podczas formułowania wniosku dotyczącego potencjalnego zagrożenia stwarzanego przez badaną substancję chemiczną oraz uzasadnienia takiego wniosku.

Dodatek 2

ZDOLNOŚĆ PREDYKCYJNA METODY BADAWCZEJ BCOP

Tabela 1

Zdolność predykcyjna BCOP w zakresie identyfikowania substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu [kategoria 1 wg GHS ONZ / unijnego rozporządzenia CLP a brak kategorii 1 (kategoria 2 + brak kategorii)]; kategoria I Agencji Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych a brak kategorii I (kategoria II + kategoria III + kategoria IV)]

System klasyfikacyjny

Liczba

Dokładność

Czułość

Wyniki fałszywie ujemne

Swoistość

Wyniki fałszywie dodatnie

%

Liczba

%

Liczba

%

Liczba

%

Liczba

%

Liczba

GHS ONZ

unijne rozporządzenie CLP

191

78,53

150/191

86,15

56/65

13,85

9/65

74,60

94/126

25,40

32/126

Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych

190

78,95

150/190

85,71

54/63

14,29

9/63

75,59

96/127

24,41

31/127


Tabela 2

Zdolność predykcyjna BCOP w zakresie identyfikowania substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania jako substancje powodujące podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu („substancje niewykazujące działania drażniącego”) [brak kategorii wg GHS ONZ / unijnego rozporządzenia CLP a brak kategorii (kategoria 1 + kategoria 2)]; kategoria IV Agencji Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych a brak kategorii IV (kategoria I + kategoria II + kategoria III)]

System klasyfikacyjny

Liczba

Dokładność

Czułość

Wyniki fałszywie ujemne

Swoistość

Wyniki fałszywie dodatnie

%

Liczba

%

Liczba

%

Liczba

%

Liczba

%

Liczba

GHS ONZ

unijne rozporządzenie CLP

196

68,88

135/196

100

107/107

0

0/107

31,46

28/89

68,54

61/89

Agencja Ochrony Środowiska Stanów Zjednoczonych

190

82,11

156/190

93,15

136/146

6,85

10/146

45,45

20/44

54,55

24/44

Dodatek 3

SUBSTANCJE CHEMICZNE PRZEZNACZONE DO OCENY BIEGŁOŚCI W ODNIESIENIU DO METODY BADAWCZEJ BCOP

Przed przystąpieniem do rutynowego stosowania niniejszej metody badawczej laboratoria powinny wykazać swoją biegłość techniczną, prawidłowo ustalając klasyfikację 13 substancji chemicznych wskazanych w tabeli 1 pod względem działania niebezpiecznego dla oczu. Wspomniane substancje chemiczne zostały dobrane w taki sposób, by reprezentowały zakres reakcji na działanie niebezpieczne dla oczu oparty na wynikach badania na oku królika in vivo (wytyczna TG 405) (17) oraz na systemie klasyfikacji GHS ONZ (tj. kategorie 1, 2A, 2B lub niesklasyfikowane) (4). Przy wyborze substancji kierowano się również następującymi kryteriami: dostępnością handlową tych substancji, dostępnością wysokiej jakości danych referencyjnych z badań in vivo oraz istnieniem wysokiej jakości danych uzyskanych dzięki zastosowaniu metody BCOP in vitro. Dane referencyjne można znaleźć w poprawionym dokumencie zbiorczym (3) oraz w dokumentach przeglądowych ICCVAM dla metody badawczej BCOP (2) (18).

Tabela 1

Substancje chemiczne zalecane do wykazania biegłości technicznej w odniesieniu do metody badawczej BCOP

Substancja chemiczna

Numer CAS

Klasa chemiczna (8)

Stan skupienia

Klasyfikacja in vivo  (9)

Klasyfikacja BCOP

Chlorek benzalkoniowy (5 %)

8001-54-5

Związek oniowy

Ciecz

Kategoria 1

Kategoria 1

Chloroheksydyna

55-56-1

Amina, amidyna

Substancja stała

Kategoria 1

Kategoria 1

Kwas dibenzoilo-L-winowy

2743-38-6

Kwas karboksylowy, ester

Substancja stała

Kategoria 1

Kategoria 1

Imidazol

288-32-4

Związek heterocykliczny

Substancja stała

Kategoria 1

Kategoria 1

Kwas trichlorooctowy (30 %)

76-03-9

Kwas karboksylowy

Ciecz

Kategoria 1

Kategoria 1

Chlorek 2,6-dichlorobenzoilu

4659-45-4

Halogenek acylu

Ciecz

Kategoria 2A

Nie można przewidzieć w sposób dokładny / wiarygodny

2-metyloacetylooctan etylu

609-14-3

Keton, ester

Ciecz

Kategoria 2B

Nie można przewidzieć w sposób dokładny / wiarygodny

Azotan amonu

6484-52-2

Sól nieorganiczna

Substancja stała

Kategoria 2 (10)

Nie można przewidzieć w sposób dokładny / wiarygodny

EDTA, sól dipotasowa

25102-12-9

Amina, kwas karboksylowy (sól)

Substancja stała

Niesklasyfikowany

Niesklasyfikowany

Tween 20

9005-64-5

Ester, polieter

Ciecz

Niesklasyfikowany

Niesklasyfikowany

2-Mercaptopyrimidine

1450-85-7

Halogenek acylu

Substancja stała

Niesklasyfikowany

Niesklasyfikowany

Fenylobutazon

50-33-9

Związek heterocykliczny

Substancja stała

Niesklasyfikowany

Niesklasyfikowany

Polioksyetylenowany eter laurylu 23 (BRIJ-35) (10 %)

9002-92-0

Alkohol

Ciecz

Niesklasyfikowany

Niesklasyfikowany

Skróty: Nr CAS = numer w rejestrze Chemical Abstracts Service.

Dodatek 4

POJEMNIK NA ROGÓWKĘ W BADANIU BCOP

Pojemniki na rogówkę stosowane w badaniu BCOP wykonane są z obojętnego materiału (np. polipropylenu). Pojemniki składają się z dwóch połówek (komory przedniej i tylnej) i mają dwie podobne do siebie komory wewnętrzne o cylindrycznym kształcie. Każdą komorę skonstruowano tak, aby pomieściła 5 ml cieczy i kończyła się szklanym okienkiem, poprzez które można dokonać pomiaru zmętnienia. Każda z komór wewnętrznych ma 1,7 cm średnicy i 2,2 cm głębokości (11). Pierścień uszczelniający typu „O” umieszczony na komorze tylnej ma zapobiegać wyciekom. Rogówki umieszcza się stroną ze śródbłonkiem do dołu na pierścieniu tylnych komór, zaś komory przednie umieszcza się na stronie z nabłonkiem. Komory utrzymywane są w miejscu przez trzy śruby ze stali nierdzewnej umieszczone na zewnętrznych krawędziach komory. Na końcu każdej komory znajduje się szklane okienko, które można zdemontować w celu uzyskania łatwego dostępu do rogówki. Pomiędzy szklanym okienkiem a komorą umieszczony jest również pierścień uszczelniający typu „O” zapobiegający wyciekom. Dwa otwory na szczycie każdej komory umożliwiają wprowadzanie i usuwanie podłoża i badanych substancji. Otwory te są zamknięte gumowymi korkami w czasie podawania substancji chemicznej i w okresie inkubacji. Przepuszczalność światła przez pojemniki na rogówkę może potencjalnie ulec zmianie, ponieważ skutki zużycia lub nagromadzenia określonych pozostałości substancji chemicznej w otworach komory wewnętrznej oraz na szklanych okienkach może wpłynąć na rozpraszanie światła lub odbicie. W rezultacie może dojść do zwiększenia lub zmniejszenia podstawowej przepuszczalności światła (i odwrotnie, odczytów zmętnienia podstawowego) przez pojemniki na rogówkę oraz może być widoczne jako znaczące zmiany oczekiwanych podstawowych pomiarów początkowego zmętnienia rogówki w pojedynczych komorach (tj. wartości początkowego zmętnienia rogówki w określonych pojedynczych pojemnikach na rogówkę mogą rutynowo różnić się o ponad dwie lub trzy jednostki zmętnienia od oczekiwanych wartości podstawowych). Każde laboratorium powinno rozważyć ustanowienie programu oceny zmian w przepuszczalności światła przez pojemniki na rogówkę, w zależności od rodzaju badanych substancji chemicznych i częstotliwości wykorzystania komór. Aby ustanowić wartości podstawowe, pojemniki na rogówkę można sprawdzać przed rutynowym wykorzystaniem przez zmierzenie podstawowych wartości zmętnienia (lub przepuszczalności światła) komór wypełnionych w całości substancją biogenną, bez rogówek. Pojemniki na rogówkę są następnie okresowo kontrolowane pod kątem zmian w przepuszczalności światła w okresach użytkowania. Każde laboratorium może ustalić częstotliwość kontroli pojemników na rogówkę na podstawie badanych substancji chemicznych, częstotliwości stosowania i zaobserwowanych zmian w podstawowych wartościach zmętnienia rogówki. W przypadku zaobserwowania zmian w przepuszczalności światła przez pojemniki na rogówkę należy wziąć pod uwagę odpowiednie procedury czyszczenia lub polerowania wewnętrznej powierzchni pojemników na rogówkę lub ich wymianę.

Pojemnik na rogówkę: widok zespołu rozebranego

Image

Dodatek 5

PRZYRZĄD DO POMIARU STOPNIA ZMĘTNIENIA ROGÓWKI

Przyrząd do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki jest to urządzenie służące do pomiaru przepuszczalności światła. Na przykład w przypadku sprzętu OP-KIT z Electro Design (Riom, Francja) wykorzystywanego podczas walidacji metody badawczej BCOP światło z lampy halogenowej jest kierowane na fotokomórkę przez komorę kontrolną (pustą komorę bez okien lub płynu), a następnie porównywane ze światłem kierowanym na fotokomórkę przez komorę doświadczalną, w której znajduje się komora zawierająca rogówkę. Porównuje się różnicę w przepuszczalności światła między fotokomórkami i na wyświetlaczu cyfrowym przedstawiana jest wartość liczbowa zmętnienia. Ustala się jednostki zmętnienia. Można wykorzystać inne rodzaje przyrządu do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki o różnej konfiguracji (np. niewymagające równoległych pomiarów kontroli i komór doświadczalnych), jeżeli zostanie udowodnione, że dają podobne wyniki co zatwierdzony sprzęt.

Przyrząd do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki powinien dawać linearną odpowiedź złożoną z pojedynczych odczytów zmętnienia obejmujących punkty odcięcia stosowane w różnych klasyfikacjach opisanych w modelu prognozowania (tj. do punktu odcięcia wskazującego na działanie żrące/silnie drażniące). W celu zapewnienia dokładnych linearnych odczytów do 75–80 jednostek zmętnienia konieczne jest przeprowadzenie kalibracji przyrządu do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki przy użyciu kilku kalibratorów. Kalibratory umieszcza się w komorze kalibracyjnej (komorze na rogówkę przeznaczonej do umieszczenia kalibratorów) i odczytuje na przyrządzie do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki. Komora kalibracyjna jest przeznaczona do umieszczenia kalibratorów w przybliżeniu w takiej samej odległości od źródła światła i fotokomórki, w jakiej zlokalizowane będą rogówki podczas pomiaru zmętnienia. Wartości odniesienia i wstępne ustawienia zależą od rodzaju stosowanego sprzętu. Liniowość pomiarów zmętnienia należy zapewnić poprzez odpowiednie procedury (typowe dla konkretnego przyrządu). Na przykład w odniesieniu do sprzętu OP-KIT z Electro Design (Riom, Francja) przyrząd do pomiaru stopnia zmętnienia rogówki wzorcuje się najpierw na 0 jednostek zmętnienia przy użyciu komory wzorcującej bez kalibratora. Następnie w komorze kalibracyjnej umieszcza się pojedynczo trzy różne kalibratory i dokonuje pomiaru zmętnienia. Kalibratory 1, 2 i 3 powinny dawać odczyty zmętnienia równe ich ustalonym wartościom odpowiednio 75, 150 i 225 jednostek zmętnienia, ± 5 %.”;

”;

13)

w części B rozdział B.48 otrzymuje brzmienie:

„B.48   Metoda badania na izolowanym oku kurzym do celów identyfikacji (i) substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu oraz (ii) substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania jako substancje drażniące oczy lub powodujące poważne uszkodzenie oczu.

WPROWADZENIE

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD (TG) nr 438 (2013). Metoda badania na izolowanym oku kurzym (ICE) została oceniona przez Międzyagencyjny Komitet Koordynacyjny ds. Uznawania Metod Alternatywnych (ICCVAM) przy udziale Europejskiego Centrum Uznawania Metod Alternatywnych (ECVAM) i Japońskiego Centrum Uznawania Metod Alternatywnych (JaCVAM) w latach 2006 i 2010 (1) (2) (3). W ramach pierwszej oceny ICE zatwierdzono jako potwierdzoną naukową metodę badawczą do stosowania jako badanie przesiewowe w celu identyfikacji substancji chemicznych (substancji i mieszanin) powodujących poważne uszkodzenie oczu (kategoria 1) określonych przez Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów Organizacji Narodów Zjednoczonych (GHS ONZ) (1) (2) (4) oraz rozporządzenie (WE) nr 1272/2008 w sprawie klasyfikacji, oznakowania i pakowania substancji i mieszanin (rozporządzenie CLP) (12). W ramach drugiej oceny metodę badawczą ICE oceniono pod kątem wykorzystania jako badanie przesiewowe do celów identyfikowania substancji chemicznych niesklasyfikowanych jako powodujące podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu, określonych przez GHS ONZ (3) (4). Wyniki badania walidacyjnego i zalecenia panelu naukowego ds. wzajemnej oceny utrzymały pierwotne zalecenie dotyczące stosowania ICE do celów klasyfikowania substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu (kategoria 1 wg GHS ONZ), ponieważ dostępna baza danych pozostała niezmieniona od czasu pierwotnego zatwierdzenia przez ICCVAM. Na tym etapie nie zasugerowano żadnych dodatkowych zaleceń dotyczących rozszerzenia dziedziny zastosowania ICE w celu uwzględnienia również innych kategorii. Przeprowadzono ponowną ocenę zbioru danych dotyczących in vitro i in vivo wykorzystywanych w badaniu walidacyjnym ze szczególnym uwzględnieniem oceny przydatności ICE do identyfikowania substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania do substancji powodujących podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu (5). W ramach tej ponownej oceny stwierdzono, że metodę badawczą ICE można wykorzystać również do identyfikowania substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania do substancji powodujących podrażnienie i poważne uszkodzenie oczu zgodnie z GHS ONZ (4) (5). Niniejsza metoda badawcza obejmuje zalecane stosowanie i ograniczenia metody badawczej ICE oparte na tych ocenach. Główne różnice między pierwotną wersją wytycznych OECD dotyczących badań z 2009 r. a zaktualizowaną wersją z 2013 r. odnoszą się m.in. do: wykorzystania metody badawczej ICE do identyfikowania substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania według systemu klasyfikacji GHS ONZ, aktualizacji elementów sprawozdania z badania, aktualizacji dodatku 1 zawierającego definicje oraz aktualizacji dodatku 2 zawierającego substancje chemiczne zalecane do oceny biegłości.

Obecnie powszechnie uznaje się, że w dającej się przewidzieć przyszłości żaden pojedynczy test działania drażniącego na oko in vitro nie będzie w stanie zastąpić testu działania drażniącego na oko in vivo wg Draize'a na potrzeby prognozowania pełnego zakresu działania drażniącego różnych klas chemicznych. Strategiczne połączenia kilku alternatywnych metod badawczych w ramach (zintegrowanej) strategii badań mogą jednak być w stanie zastąpić test działania drażniącego na oko wg Draize'a (6). Podejście odgórne (7) ma w założeniu być stosowane wówczas, gdy na podstawie istniejących informacji oczekuje się, że substancja chemiczna będzie miała wysoki potencjał działania drażniącego, podejście oddolne (7) ma być natomiast stosowane wówczas, gdy na podstawie istniejących informacji oczekuje się, że substancja chemiczna nie spowoduje podrażnienia oczu w stopniu wymagającym zaklasyfikowania jej jako substancji drażniącej dla oczu. Metoda badawcza ICE jest metodą badawczą in vitro, którą można stosować w niektórych okolicznościach i przy określonych ograniczeniach, jak opisano w pkt 8–10 do celów klasyfikacji i oznakowania substancji chemicznych pod względem zagrożeń dla oczu. Chociaż uważa się, że metoda badawcza ICE nie może samodzielnie zastąpić badania na oku królika in vivo, jest ona zalecana jako pierwszy etap w strategii badań takiej jak podejście odgórne zaproponowane przez Scotta et al. (7) na potrzeby identyfikacji substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu, tj. substancji chemicznych, które należy zaklasyfikować do kategorii 1 wg GHS ONZ bez dalszych badań (4). Metoda badawcza ICE jest również zalecana do celów identyfikowania substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania do substancji powodujących podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu zgodnie z GHS ONZ (brak kategorii) (4), i można ją w związku z tym stosować jako pierwszy etap w strategii badań zakładającej podejście oddolne (7). Konieczne będzie jednak przeprowadzenie dodatkowego badania (in vitro lub in vivo) w odniesieniu do substancji chemicznej, w przypadku której nie przewidziano, że spowoduje poważne uszkodzenie oczu lub której nie zaklasyfikowano do substancji powodujących podrażnienie/poważne uszkodzenie oczu w ramach metody badawczej ICE, w celu ustanowienia ostatecznej klasyfikacji. Ponadto przed zastosowaniem metody badawczej ICE w ramach podejścia oddolnego należy skonsultować się z odpowiednimi organami regulacyjnymi zgodnie z systemami klasyfikacji innymi niż GHS ONZ.

Niniejsza metoda badawcza ma na celu opisanie procedur stosowanych do oceny potencjalnego działania szkodliwego dla oczu badanej substancji chemicznej, określanego na podstawie jej potencjału oddziaływania toksycznego na oko kurze poddane enukleacji. Toksyczne oddziaływanie na rogówkę mierzy się przy zastosowaniu (i) jakościowej oceny zmętnienia, (ii) jakościowej oceny uszkodzenia nabłonka poprzez zaaplikowanie fluoresceiny na oko (zatrzymanie fluoresceiny), (iii) ilościowego pomiaru zwiększonej grubości (obrzęku) oraz (iv) jakościowej oceny makroskopowych uszkodzeń morfologicznych powierzchni. Oceny zmętnienia rogówki, obrzęku i uszkodzeń po narażeniu na działanie badanej substancji chemicznej dokonuje się indywidualnie, a następnie łączy się je w celu otrzymania klasyfikacji działania drażniącego dla oczu.

Definicje znajdują się w dodatku 1.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE I OGRANICZENIA

Niniejsza metoda badawcza opiera się na protokole zaproponowanym w wytycznych OECD 160 (8), który opracowano po przeprowadzeniu przez ICCVAM międzynarodowego badania walidacyjnego (1) (3) (9), przy udziale Europejskiego Centrum Uznawania Metod Alternatywnych, Japońskiego Centrum Uznawania Metod Alternatywnych oraz Departamentu Jakości Życia Działu Toksykologii i Farmakologii Stosowanej TNO (Niderlandy). Protokół opiera się na informacjach uzyskanych z opublikowanych protokołów oraz bieżących protokołów stosowanych przez TNO (10) (11) (12) (13) (14).

Zbadano szeroki zakres substancji chemicznych w ramach walidacji leżącej u podstaw niniejszej metody badawczej, a empiryczna baza danych z badania walidacyjnego objęła 152 substancje chemiczne, w tym 72 substancje i 80 mieszanin (5). Metoda badawcza ma zastosowanie do ciał stałych, cieczy, emulsji i żeli. Płyny mogą być wodne lub niewodne; substancje stałe mogą być rozpuszczalne lub nierozpuszczalne w wodzie. Gazów i aerozoli nie oceniano jeszcze w badaniu walidacyjnym.

Metodę badawczą ICE można wykorzystać do identyfikacji substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu, tj. substancji chemicznych zaklasyfikowanych do kategorii 1 wg GHS ONZ (4). W przypadku wykorzystywania jej do tego celu zidentyfikowane ograniczenia metody badawczej ICE opierają się na wysokich odsetkach wyników fałszywie dodatnich w przypadku alkoholi i wysokim odsetku wyników fałszywie ujemnych w przypadku ciał stałych i środków powierzchniowo czynnych (1) (3) (9). W tym kontekście odsetek wyników fałszywie ujemnych (substancje chemiczne należące do kategorii 1 wg GHS ONZ, lecz niezidentyfikowane jako takie) nie ma decydującego znaczenia, ponieważ wszystkie badane substancje chemiczne, które okazały się ujemne zostaną następnie zbadane za pomocą innych odpowiednio zweryfikowanych badań in vitro lub jako ostatni wariant na królikach, w zależności od wymogów regulacyjnych, przy zastosowaniu strategii badań sekwencyjnych zgodnie z podejściem opartym na analizie wagi dowodów. Należy zauważyć, że substancje stałe mogą prowadzić do zmiennych i ekstremalnych warunków narażenia w teście działania drażniącego na oko in vivo wg Draize'a, co z kolei może skutkować nietrafnymi prognozami ich rzeczywistego potencjału działania drażniącego (15). Osoby przeprowadzające badanie mogą rozważyć zastosowanie niniejszej metody badawczej w odniesieniu do wszystkich rodzajów substancji chemicznych, wskutek czego wynik dodatni należy zaakceptować jako wskazujący na poważne uszkodzenie oczu, tj. zaklasyfikować go do kategorii 1 wg GHS ONZ bez dalszych badań. Wyniki dodatnie uzyskane w przypadku alkoholi należy jednak interpretować z ostrożnością ze względu na ryzyko ich zawyżenia.

W przypadku wykorzystania metody badawczej ICE do identyfikacji substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu (kategoria 1 wg GHS ONZ) metoda ta wykazuje ogólną dokładność na poziomie 86 % (120/140), odsetek wyników fałszywie dodatnich na poziomie 6 % (7/113) oraz odsetek wyników fałszywie ujemnych na poziomie 48 % (13/27) w porównaniu do danych uzyskanych w wyniku metody badań na oku królika in vivo, sklasyfikowanych zgodnie z systemem klasyfikacji GHS ONZ (4) (5).

Metodę badawczą ICE można wykorzystać również do identyfikowania substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania do substancji powodujących podrażnienie lub poważne uszkodzenie oczu według systemu klasyfikacji GHS ONZ (4). Przed zastosowaniem metody badawczej ICE w ramach podejścia oddolnego należy skonsultować się z odpowiednimi organami regulacyjnymi zgodnie z innymi systemami klasyfikacji. Niniejszą metodę badawczą można zastosować w odniesieniu do wszystkich rodzajów substancji chemicznych, wskutek czego wynik ujemny należy zaakceptować, aby nie uznawać substancji chemicznej za powodującą podrażnienie i poważne uszkodzenie oczu. Bazowanie na jednym wyniku z bazy danych z badania walidacyjnego może jednak doprowadzić do zaniżenia prognoz dotyczących farb przeciwporostowych zawierających rozpuszczalnik organiczny (5).

W przypadku wykorzystania metody badawczej ICE do identyfikowania substancji chemicznych, które nie wymagają zaklasyfikowania do substancji powodujących podrażnienie i poważne uszkodzenie oczu metoda ta wykazuje ogólną dokładność na poziomie 82 % (125/152), odsetek wyników fałszywie dodatnich na poziomie 33 % (26/79) oraz odsetek wyników fałszywie ujemnych na poziomie 1 % (1/73) w porównaniu do danych uzyskanych w wyniku metody badań na oku królika in vivo, sklasyfikowanych zgodnie z GHS ONZ (4) (5). W przypadku wykluczenia z bazy danych badanych substancji chemicznych należących do określonych klas (tj. farb przeciwporostowych zawierających rozpuszczalnik organiczny), dokładność metody badawczej ICE wynosi 83 % (123/149), odsetek wyników fałszywie dodatnich wynosi 33 % (26/78) a odsetek wyników fałszywie ujemnych 0 % (0/71) zgodnie z systemem klasyfikacji GHS ONZ (4) (5).

Nie zaleca się stosowania metody badawczej ICE do identyfikacji badanych substancji chemicznych, które należy uznać za powodujące podrażnienie oczu (tj. zaklasyfikować do kategorii 2 lub 2A wg GHS ONZ) lub badanych substancji chemicznych, które należy uznać za lekko drażniące dla oczu (kategoria 2B wg GHS ONZ), ze względu na zaniżoną klasyfikację znacznej liczby substancji chemicznych należących do kategorii 1 i uznanie ich za należące do kategorii 2, 2A lub 2B wg GHS ONZ oraz ze względu na zawyżoną klasyfikację i uznanie substancji chemicznych nieprzypisanych do żadnej kategorii wg GHS ONZ za substancje z kategorii 2, 2A lub 2B wg GHS ONZ. W tym celu konieczne może być przeprowadzenie dodatkowego badania, z wykorzystaniem innej odpowiedniej metody.

Wszystkie procedury przeprowadzane z wykorzystaniem oczu kurzych powinny przebiegać zgodnie z przepisami i procedurami dotyczącymi postępowania z materiałem pozyskanym od ludzi lub zwierząt, który obejmuje m.in. tkanki i płyny tkankowe, obowiązującymi w placówce przeprowadzającej badanie. Zaleca się przestrzeganie ogólnych środków ostrożności dla laboratoriów (16).

Chociaż w metodzie badawczej ICE nie uwzględnia się uszkodzeń spojówki i tęczówki ocenionych w ramach metody badawczej dotyczącej podrażnienia oczu królika, metoda ta odnosi się do oddziaływania na rogówkę, co stanowi główne kryterium klasyfikacji in vivo, w przypadku rozważania klasyfikacji GHS ONZ. Ponadto, chociaż w metodzie badawczej ICE nie można ocenić odwracalności zmian w rogówce jako takich, zaproponowano, na podstawie badań oczu królika, możliwość zastosowania oceny początkowego stadium uszkodzenia rogówki w celu określenia niektórych rodzajów nieodwracalnych skutków (17). W szczególności konieczna jest dodatkowa wiedza naukowa, aby zrozumieć sposób powstawania nieodwracalnych skutków niezwiązanych z pierwszym wystąpieniem poważnego uszkodzenia. Metoda badawcza ICE nie pozwala też na ocenę potencjalnej toksyczności ogólnoustrojowej związanej z narażeniem oczu.

Niniejsza metoda badawcza będzie aktualizowana okresowo w miarę uwzględniania nowych informacji i danych. Na przykład histopatologia może być potencjalnie przydatna, gdy potrzebna będzie bardziej szczegółowa charakterystyka uszkodzenia rogówki. Aby ocenić tę możliwość, użytkowników zachęca się do zachowywania oczu i przygotowywania wycinków histopatologicznych, które można wykorzystać do opracowania bazy danych i kryteriów podejmowania decyzji w celu dalszego poprawienia dokładności niniejszej metody badawczej. OECD opracowała wytyczne dotyczące stosowania metod badawczych in vitro toksyczności dla oczu, które zawierają szczegółowe procedury gromadzenia wycinków histopatologicznych i informacje na temat miejsca dostarczenia wycinków lub danych histopatologicznych (8).

W każdym laboratorium zaczynającym przeprowadzanie tego badania należy zastosować substancje chemiczne przeznaczone do oceny biegłości wymienione w dodatku 2. Laboratorium może stosować te substancje chemiczne w celu wykazania swojej biegłości technicznej w zakresie przeprowadzania metody badawczej ICE przed przedstawieniem danych z badania ICE do celów regulacyjnej klasyfikacji zagrożeń.

ZASADA BADANIA

Metoda badawcza ICE jest modelem organotypowym, który zapewnia krótkotrwałe zachowanie oka kurzego in vitro. Uszkodzenia spowodowane badaną substancją chemiczną ocenia się w ramach niniejszej metody badawczej na podstawie obrzęku i zmętnienia rogówki oraz zatrzymania fluoresceiny. Podczas gdy dwa ostatnie parametry wymagają oceny jakościowej, analiza obrzęku rogówki stanowi ocenę ilościową. Każdy pomiar przelicza się na wynik ilościowy stosowany do obliczania ogólnego wskaźnika podrażnienia albo przypisuje się mu kategorię jakościową stosowaną do przypisania kategorii w klasyfikacji in vitro pod względem zagrożeń dla oczu – kategoria 1 wg GHS ONZ albo niesklasyfikowana wg GHS ONZ. Każdy z tych wyników można następnie zastosować do przewidzenia potencjalnego poważnego uszkodzenia oczu in vivo lub braku wymogu zaklasyfikowania badanej substancji chemicznej do substancji powodujących uszkodzenie oczu (zob. kryteria podejmowania decyzji). Nie opracowano jednak żadnego systemu klasyfikacji substancji chemicznych, w przypadku których nie przewidziano, że spowodują poważne uszkodzenie oczu lub których nie zaklasyfikowano w ramach metody badawczej ICE (zob. pkt 11).

Pochodzenie i wiek oczu kurzych

Dotychczas oczy do niniejszej analizy pobierano od kurcząt uzyskiwanych z rzeźni, w której poddawano je ubojowi na potrzeby spożycia przez ludzi, co eliminowało konieczność wykorzystywania zwierząt laboratoryjnych. Stosuje się wyłącznie oczy zwierząt zdrowych, które uznano za odpowiednie do wprowadzenia do łańcucha żywnościowego człowieka.

Chociaż nie przeprowadzono badania z grupą kontrolną w celu oceny optymalnego wieku kurcząt, wiek i masa kurcząt wykorzystywanych dotychczas w niniejszej metodzie badawczej odpowiadają młodym kurczętom tradycyjnie przetwarzanym przez rzeźnie drobiu (tzn. ok. 7 tygodni, 1,5–2,5 kg).

Pobieranie oczu i ich transport do laboratorium

Głowy należy usunąć natychmiast po sedacji kurcząt (najczęściej przy użyciu wstrząsu elektrycznego) i nacięciu szyi w celu wywołania krwawienia. Należy zapewnić lokalne źródło kurcząt, zlokalizowane blisko laboratorium, tak by głowy zwierząt mogły zostać przetransportowane z rzeźni do laboratorium na tyle szybko, żeby zminimalizować możliwość pogorszenia stanu oczu lub skażenia bakteriami. Należy zminimalizować odstęp czasu między pobraniem głów kurcząt a umieszczeniem oczu w komorze do przepłukiwania po enukleacji oczu (zwykle do dwóch godzin) w celu zapewnienia spełnienia kryteriów dopuszczalności analizy. Wszystkie oczy wykorzystane w badaniu powinny pochodzić z tej samej grupy oczu pobranych danego dnia.

Ponieważ oczy wycina się w laboratorium, głowy w stanie nienaruszonym są transportowane z rzeźni w temperaturze otoczenia (zwykle w temp. od 18 °C do 25 °C), w plastikowych pojemnikach nawilżanych chusteczkami zmoczonymi w soli fizjologicznej.

Kryteria doboru oczu i liczba oczu zastosowanych w badaniu ICE

Odrzuca się oczy wykazujące po enukleacji wysoki poziom wybarwienia fluoresceiną (tzn. > 0,5) lub zmętnienia rogówki (tzn. > 0,5).

Każda grupa badana oraz grupa jednoczesnej kontroli dodatniej składa się z co najmniej tryech gałek ocznych. Grupa kontrolna ujemna lub grupa kontrolna z rozpuszczalnikiem (w przypadku stosowania rozpuszczalnika innego niż roztwór soli) składa się z co najmniej jednego oka.

W przypadku substancji stałych prowadzących do uzyskania wyniku w postaci braku kategorii wg GHS zaleca się przeprowadzenie drugiej serii badań na trzech gałkach ocznych w celu potwierdzenia lub odrzucenia wyniku ujemnego.

PROCEDURA

Przygotowanie oczu

Powieki wycina się ostrożnie, tak aby nie uszkodzić rogówki. Szybkiej oceny, czy rogówka jest nienaruszona, dokonuje się poprzez wkroplenie soli sodowej fluoresceiny o stężeniu 2 % (w/v) na powierzchnię rogówki na kilka sekund, a następnie przemycie rogówki solą fizjologiczną. Oczy poddane działaniu fluoresceiny bada się następnie przy użyciu biomikroskopu w celu zagwarantowania, że rogówka nie jest uszkodzona (tzn. że wyniki zatrzymania fluoresceiny oraz zmętnienia rogówki wynoszą ≤ 0,5).

Jeżeli oko nie jest uszkodzone, wycina się je całkowicie z czaszki, starając się nie uszkodzić rogówki. Gałkę oczną wyciąga się z oczodołu, przytrzymując mocno fałd półksiężycowaty spojówki szczypczykami chirurgicznymi, zaś mięśnie oka odcina się przy użyciu zagiętych tępo zakończonych nożyczek. Nie można dopuścić do powstania uszkodzeń rogówki poprzez wywieranie na nią nadmiernego nacisku (tj. stosowania urządzeń kompresyjnych).

Po wyjęciu gałki ocznej z oczodołu należy pozostawić przyczepioną widoczną część nerwu wzrokowego. Po wyjęciu z oczodołu oko umieszcza się na podkładce chłonnej i odcina się fałd półksiężycowaty spojówki i inne tkanki łączne.

Poddane enukleacji oko umieszcza się w uchwycie ze stali nierdzewnej, przy rogówce ustawionej pionowo. Uchwyt przenosi się następnie do komory urządzenia do przepłukiwania (18). Uchwyty należy umieścić w urządzeniu do przepłukiwania w taki sposób, by na całą rogówkę kapała sól fizjologiczna (3–4 krople na minutę lub 0,1–0,15 ml/min). Komory urządzenia do przepłukiwania powinny utrzymywać temperaturę 32 ± 1,5 °C. Dodatek 3 zawiera schemat budowy typowego urządzenia do przepłukiwania i uchwytów na oczy, które można nabyć na rynku lub zbudować samodzielnie. Urządzenie można zmodyfikować, tak by spełniało potrzeby konkretnego laboratorium (np. poprzez dostosowanie liczby oczu).

Po umieszczeniu w urządzeniu do przepłukiwania oczy bada się ponownie przy użyciu biomikroskopu w celu sprawdzenia, czy nie zostały one uszkodzone podczas procedury wycinania. W tym momencie należy również zmierzyć grubość rogówki na jej wierzchołku przy zastosowaniu urządzenia do pomiaru głębokości połączonego z biomikroskopem. Należy wymienić oczy (i) o wyniku zatrzymania fluoresceiny >0,5; (ii) o zmętnieniu rogówki > 0,5; lub (iii) posiadające jakiekolwiek ślady uszkodzenia. Oczy, których nie odrzucono ze względu na jedno z powyższych kryteriów, należy odrzucić, jeżeli grubość ich rogówki różni się o ponad 10 % od średniej wartości dla wszystkich oczu. Użytkownicy powinni być świadomi, że biomikroskopy mogą dawać różne wyniki pomiaru grubości rogówki, jeżeli stosuje się różne ustawienia szerokości szczeliny. Szerokość szczeliny powinna wynosić 0,095 mm.

Po zbadaniu i dopuszczeniu wszystkich oczu inkubuje się je przez ok. 45 do 60 minut w celu zrównoważenia ich z układem badawczym przed dawkowaniem substancji. Po okresie wyrównania stężeń rejestruje się zerowy pomiar referencyjny grubości rogówki i jej zmętnienia, który służy jako punkt odniesienia (tj. czas = 0). Wynik pomiaru fluoresceiny określony w momencie wycinania stosuje się jako pomiar odniesienia dla tego punktu końcowego.

Podawanie badanej substancji chemicznej

Natychmiast po dokonaniu zerowych pomiarów referencyjnych oko (w pojemniku) wyjmuje się z urządzenia do przepłukiwania i ustawia w pozycji poziomej, a na rogówkę aplikuje się badaną substancję chemiczną.

Badane substancje chemiczne w stanie ciekłym bada się zwykle w stanie nierozcieńczonym, można je jednak w razie potrzeby rozcieńczyć (np. w ramach schematu badania). Preferowanym rozpuszczalnikiem do rozcieńczania badanych substancji chemicznych jest sól fizjologiczna. Można stosować również alternatywne rozpuszczalniki w kontrolowanych warunkach badania, należy jednak udowodnić zasadność zastosowania rozpuszczalników innych niż sól fizjologiczna.

Badane substancje chemiczne w stanie ciekłym aplikuje się na rogówkę w taki sposób, by cała powierzchnia rogówki była równomiernie pokryta badaną substancją chemiczną; standardowa ilość wynosi 0,03 ml.

Badane substancje chemiczne w stanie stałym należy w miarę możliwości jak najdokładniej rozdrobnić za pomocą moździerza i tłuczka lub podobnego urządzenia rozdrabniającego. Proszek należy zaaplikować na rogówkę w taki sposób, by jej powierzchnia była równomiernie pokryta badaną substancją chemiczną; standardowa ilość wynosi 0,03 g.

Badaną substancję chemiczną (ciecz lub substancja stała) nakłada się na 10 sekund, a następnie zmywa z oka solą fizjologiczną (ok. 20 ml) w temperaturze otoczenia. Następnie oko (w pojemniku) umieszcza się ponownie w urządzeniu do przepłukiwania w pierwotnej pozycji pionowej. W razie potrzeby można ponownie przemyć oko po pozostawieniu substancji przez 10 sekund i w kolejnych punktach czasowych (np. po odkryciu pozostałości badanej substancji chemicznej na rogówce). Na ogół ilość soli fizjologicznej dodatkowo zastosowanej do przemycia oka nie jest krytyczna, jednak istotne jest obserwowanie przyczepności substancji chemicznej do rogówki.

Kontrolne substancje chemiczne

Każde doświadczenie powinno obejmować jednoczesną kontrolę ujemną lub kontrolę z rozpuszczalnikiem/nośnikiem i kontrolę dodatnią.

W przypadku badania cieczy o stężeniu 100 % lub substancji stałych w ramach metody badawczej ICE jako jednoczesną kontrolę ujemną stosuje się sól fizjologiczną w celu wykrycia niespecyficznych zmian w układzie badawczym i zapewnienia, aby warunki badania nie prowadziły nieprawidłowo do reakcji w postaci działania drażniącego.

W przypadku badania cieczy rozcieńczonych w metodzie badawczej uwzględnia się jednoczesną grupę kontrolną z rozpuszczalnikiem/nośnikiem w celu wykrycia niespecyficznych zmian w układzie badawczym i zapewnienia, aby warunki badania nie prowadziły nieprawidłowo do reakcji w postaci działania drażniącego. Jak stwierdzono w pkt. 31 można stosować jedynie rozpuszczalnik/nośnik, w odniesieniu do którego wykazano, że nie wpływa niekorzystnie na układ badawczy.

W każdym doświadczeniu uwzględnia się substancję o znanym działaniu drażniącym dla oczu jako jednoczesną kontrolę dodatnią w celu zweryfikowania, czy wywołana została właściwa reakcja. Ponieważ w niniejszej metodzie badawczej stosuje się badanie ICE w celu zidentyfikowania substancji żrących lub silnie drażniących, do kontroli dodatniej należy użyć substancji chemicznej odniesienia, która wywołuje silną reakcję w niniejszej metodzie badawczej. Aby zapewnić możliwość oceny zmienności reakcji w kontroli dodatniej w czasie, siła reakcji w postaci silnego działania drażniącego nie może być zbyt duża. Należy wyprodukować wystarczające dane in vitro do kontroli dodatniej, aby można było obliczyć określony statystycznie dopuszczalny zakres kontroli dodatniej. Jeżeli dla konkretnej kontroli dodatniej nie istnieją odpowiednie dane historyczne z metody badawczej ICE, może zajść konieczność przeprowadzenia badań w celu dostarczenia tych informacji.

Przykładowymi substancjami służącymi do kontroli dodatniej dla badanych substancji chemicznych w stanie ciekłym są 10-procentowy roztwór kwasu octowego lub 5-procentowy roztwór chlorku bezalkoniowego, zaś przykładowymi substancjami służącymi do kontroli dodatniej dla badanych substancji chemicznych w stanie stałym są wodorotlenek sodu lub imidazol.

Wzorcowe substancje chemiczne są przydatne do oceny potencjalnego działania drażniącego na oczy nieznanych substancji chemicznych z określonej klasy chemicznej lub produktowej lub do oceny względnego potencjalnego działania drażniącego substancji drażniącej dla oczu w określonym zakresie reakcji w postaci działania drażniącego.

Pomiar punktów końcowych

Rogówki poddane działaniu substancji chemicznej ocenia się przed podaniem tej substancji, a następnie po 30, 75, 120, 180 i 240 minutach (± 5 minut) od płukania po podaniu substancji chemicznej. Te punkty czasowe zapewniają odpowiednią liczbę pomiarów w trakcie czterogodzinnego okresu od podania substancji chemicznej, pozostawiając jednocześnie odpowiednią ilość czasu pomiędzy pomiarami na dokonanie koniecznych obserwacji wszystkich oczu.

Oceniane punkty końcowe to zmętnienie rogówki, obrzęk, zatrzymanie fluoresceiny i zmiany morfologiczne (np. wżery lub rozluźnienie nabłonka). Wszystkie punkty końcowe, z wyjątkiem zatrzymania fluoresceiny (które określa się wyłącznie przed poddaniem materiału działaniu badanej substancji chemicznej oraz 30 minut po nim) ustalane są we wszystkich powyższych punktach czasowych.

Zaleca się wykonanie fotografii celem udokumentowania zmętnienia rogówki, zatrzymania fluoresceiny, zmian morfologicznych oraz histopatologii, jeśli jest przeprowadzana.

Zachęca się użytkowników, aby po ostatniej ocenie po czterech godzinach utrwalili oczy w odpowiednim środku utrwalającym (np. obojętnej buforowanej formalinie) na potrzeby ewentualnego badania histopatologicznego (szczegółowe informacje można znaleźć w pkt 14 i pozycji (8) bibliografii).

Obrzęk rogówki określa się na podstawie pomiaru grubości rogówki dokonywanego przy użyciu grubościomierza optycznego w biomikroskopie. Wartość tę wyraża się procentowo i oblicza na podstawie pomiarów grubości rogówki według poniższego wzoru:

Formula

Średnią wartość procentowa obrzęku rogówki we wszystkich oczach poddanych badaniu oblicza się w oparciu o wszystkie punkty czasowe obserwacji. W oparciu o najwyższy średni wynik obrzęku rogówki zaobserwowany w dowolnym punkcie czasowym podaje się ogólny wynik dla kategorii w odniesieniu do każdej badanej substancji chemicznej (zob. pkt 51).

Zmętnienie rogówki oblicza się przy zastosowaniu powierzchni rogówki, która jest najbardziej zmętniała, jak przedstawiono na tabeli 1. Średnią wartość procentową zmętnienia rogówki we wszystkich oczach poddanych badaniu oblicza się w oparciu o wszystkie punkty czasowe obserwacji. W oparciu o najwyższy średni wynik obrzęku rogówki zaobserwowany w dowolnym punkcie czasowym podaje się ogólny wynik dla kategorii w odniesieniu do każdej badanej substancji chemicznej (zob. pkt 51).

Tabela 1

Wyniki oceny zmętnienia rogówki

Wynik oceny

Obserwacja

0

Brak zmętnienia

0,5

Nieznaczne zmętnienie

1

Obszary pojedyncze lub rozproszone; wyraźnie widoczne elementy tęczówki

2

Łatwo zauważalny obszar półprzezroczysty; nieco zamazane elementy tęczówki

3

Poważne zmętnienie rogówki; nie są widoczne żadne konkretne elementy tęczówki; bardzo trudno jest określić wielkość źrenicy zwierzęcia

4

Całkowite zmętnienie rogówki; niewidoczna tęczówka

Zatrzymanie fluoresceiny ocenia się w punkcie czasowym obserwacji po 30 minutach, jak przedstawiono w tabeli 2. Średni poziom zatrzymania fluoresceiny we wszystkich badanych oczach oblicza się wyłącznie w punkcie czasowym obserwacji po 30 minutach; wartość tę stosuje się do określenia ogólnego wyniku dla kategorii w odniesieniu do każdej badanej substancji chemicznej (zob. pkt 51).

Tabela 2

Wyniki zatrzymania fluoresceiny

Wynik oceny

Obserwacja

0

Brak zatrzymania fluoresceiny

0,5

Nieznaczne wybarwienie pojedynczych komórek

1

Wybarwienie pojedynczych komórek rozproszone na całej powierzchni rogówki poddanej działaniu substancji

2

Ogniskowe lub łączące się zwarte wybarwienie pojedynczych komórek

3

Łączące się duże obszary rogówki zatrzymują fluoresceinę

Zmiany morfologiczne obejmują „wżery” komórek nabłonka, „rozluźnienie” nabłonka, „stwardnienie” powierzchni rogówki oraz „przyleganie” badanej substancji chemicznej do rogówki. Ustalenia te mogą się różnić miedzy sobą stopniem zaawansowania i mogą występować jednocześnie. Klasyfikacja tych ustaleń jest subiektywna i zależna od interpretacji osoby przeprowadzającej badanie.

DANE I SPRAWOZDAWCZOŚĆ

Ocena danych

Wyniki badania zmętnienia rogówki, obrzęku rogówki i zatrzymania fluoresceiny należy oceniać osobno, tak aby wygenerować klasę ICE dla każdego punktu końcowego. Klasy ICE w odniesieniu do każdego punktu końcowego są następnie łączone w celu uzyskania klasyfikacji działania drażniącego dla oczu dla każdej badanej substancji chemicznej.

Kryteria podejmowania decyzji

Po dokonaniu oceny każdego punktu końcowego można przypisać klasy ICE w oparciu o wcześniej ustalony zakres. Interpretacji wyników dotyczących obrzęku rogówki (tabela 3), zmętnienia (tabela 4) i zatrzymania fluoresceiny (tabela 5) z zastosowaniem czterech klas ICE dokonuje się na podstawie skali przedstawionej poniżej. Należy zauważyć, że wyniki dotyczące obrzęku rogówki przedstawione w tabeli 3 mają zastosowanie wyłącznie w przypadku gdy jej grubość mierzy się przy użyciu biomikroskopu (np. Haag-Streit BP900) z urządzeniem do pomiaru głębokości nr 1, przy ustawieniu szczeliny na szerokość 9Formula, co odpowiada 0,095 mm. Użytkownicy powinni być świadomi, że biomikroskopy mogą dawać różne wyniki pomiaru grubości rogówki, jeżeli stosuje się różne ustawienia szerokości szczeliny.

Tabela 3

Kryteria klasyfikacji ICE w odniesieniu do obrzęku rogówki

Średni obrzęk rogówki (%) (*2)

Klasa ICE

0–5

I

> 5–12

II

> 12–18 (> 75 min po podaniu substancji)

II

> 12–18 (≤75 min po podaniu substancji)

III

> 18–26

III

> 26–32 (> 75 min po podaniu substancji)

III

> 26–32 (≤ 75 min po podaniu substancji)

IV

> 32

IV


Tabela 4

Kryteria klasyfikacji ICE w odniesieniu do zmętnienia

Maksymalna średnia wartość zmętnienia (*3)

Klasa ICE

0,0–0,5

I

0,6–1,5

II

1,6–2,5

III

2,6–4,0

IV


Tabela 5

Kryteria klasyfikacji ICE w odniesieniu do średniego poziomu zatrzymania fluoresceiny

Średni wynik zatrzymania fluoresceiny 30 minut po podaniu substancji (*4)

Klasa ICE

0,0–0,5

I

0,6–1,5

II

1,6–2,5

III

2,6–3,0

IV

Klasyfikację in vitro badanej substancji chemicznej ocenia się poprzez odczyt klasyfikacji GHS odpowiadającej połączeniu kategorii otrzymanych w odniesieniu do obrzęku rogówki, zmętnienia rogówki i zatrzymania fluoresceiny, jak opisano w tabeli 6.

Tabela 6

Ogólne klasyfikacje in vitro

Klasyfikacja GHS ONZ

Kombinacja 3 punktów końcowych

Brak kategorii

3 × I

2 × I, 1 × II

Nie można przewidzieć działania

Inne kombinacje

Kategoria 1

3 × IV

2 × IV, 1 × III

2 × IV, 1 × II (*5)

2 × IV, 1 × I (*5)

Zmętnienie rogówki ≥ 3 po 30 min (w co najmniej 2 oczach)

Zmętnienie rogówki = 4 w dowolnym punkcie czasowym (w co najmniej 2 oczach)

Znaczne rozluźnienie nabłonka (w co najmniej 1 oku)

Kryteria dopuszczalności badania

Badanie uznaje się za dopuszczalne, jeżeli jednoczesną kontrolę ujemną lub kontrolę z rozpuszczalnikiem/nośnikiem oraz jednoczesną kontrolę dodatnią zidentyfikowano odpowiednio jako niesklasyfikowane zgodnie z GHS i należące do kategorii 1 wg GHS.

Sprawozdanie z badania

Sprawozdanie z badania powinno zawierać następujące informacje, o ile są one istotne dla przebiegu badania:

 

Badane i kontrolne substancje chemiczne

nazwa chemiczna (nazwy chemiczne), np. nazwa strukturalna używana przez Chemical Abstracts Service (CAS), po której następują inne nazwy, jeżeli są znane;

numer CAS, jeżeli jest znany;

czystość i skład badanych substancji chemicznych lub kontrolnych substancji chemicznych (jako wartość procentowa masy), w zakresie, w jakim te informacje są dostępne;

właściwości fizykochemiczne istotne dla przebiegu badania, np. stan skupienia, lotność, pH, stabilność, klasa chemiczna, rozpuszczalność w wodzie;

postępowanie z badaną/kontrolną substancja chemiczną przed rozpoczęciem badań, w stosownych przypadkach (np. podgrzewanie, mielenie);

stabilność, jeżeli jest znana;

 

Informacje dotyczące sponsora i placówki przeprowadzającej badanie

nazwa i adres sponsora i placówki przeprowadzającej badanie oraz dane kierownika badań;

identyfikacja źródła oczu (np. zakład, w którym je pobrano);

 

Warunki metody badawczej

opis zastosowanego układu badawczego;

zastosowany biomikroskop (np. model) i zastosowane ustawienia biomikroskopu;

odniesienie do historycznych wyników kontroli ujemnej i dodatniej oraz, w stosownych przypadkach, danych historycznych wykazujących dopuszczalny zakres jednoczesnej kontroli odniesienia;

procedura zastosowana w celu zapewnienia integralności (tj. dokładności i wiarygodności) metody badawczej w czasie (np. okresowe badanie substancji chemicznych przeznaczonych do oceny biegłości)).

 

Pobieranie oczu i ich przygotowywanie

wiek i masa zwierzęcia dawcy oraz, w miarę dostępności, inne szczegółowe dane na temat zwierząt, od których pobrano oczy (np. płeć, szczep);

warunki przechowywania i transportu oczu (np. data i czas pobrania oczu, odstęp czasu między zebraniem głów kurcząt a umieszczeniem oczu poddanych enukleacji w komorze do przepłukiwania);

przygotowanie i umieszczenie oczu, w tym oświadczenia dotyczące ich jakości, temperatury komór na oczy oraz kryteria dotyczące wyboru oczu wykorzystywanych do badania.

 

Procedura badawcza

liczba użytych kontrprób;

nazwa wykorzystanej kontroli ujemnej i dodatniej (w stosownych przypadkach, także kontrole z zastosowaniem rozpuszczalnika i kontrole odniesienia);

dawka badanej substancji chemicznej, zastosowanie i czas narażenia;

punkty czasowe obserwacji (przed i po podaniu substancji chemicznej);

opis zastosowanych kryteriów oceny i podejmowania decyzji;

opis zastosowanych kryteriów dopuszczalności badania;

opis wszelkich modyfikacji procedury badawczej.

 

Wyniki

zestawienie tabelaryczne wyników dotyczących obrzęku i zmętnienia rogówki oraz zatrzymania fluoresceiny otrzymanych dla każdego oka, w każdym punkcie czasowym obserwacji, w tym średnie wyniki podczas każdej obserwacji wszystkich badanych oczu;

najwyższe zaobserwowane średnie wyniki dotyczące obrzęku i zmętnienia rogówki oraz zatrzymania fluoresceiny (od dowolnego punktu czasowego), a także ich powiązana klasa ICE.

opis wszelkich, innych zaobserwowanych skutków;

otrzymana klasyfikacja GHS ONZ in vitro;

w razie potrzeby fotografie oka;

 

Omówienie wyników

 

Wniosek

BIBLIOGRAFIA

(1)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report – In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Międzyagencyjny Komitet Koordynacyjny ds. Uznawania Metod Alternatywnych (ICCVAM) oraz Amerykański Krajowy Program Toksykologiczny (NTP) Międzyagencyjnego Centrum Oceny Alternatywnych Metod Toksykologicznych (NICEATM). Publikacja NIH nr: 07-4517. Dostępne na stronie internetowej: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm

(2)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Dostępne na stronie internetowej: http://ecvam.jrc.it/index.htm.

(3)

ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report – Current Status of in vitro Test Methods for Identifying Mild/Moderate Ocular Irritants: The Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Międzyagencyjny Komitet Koordynacyjny ds. Uznawania Metod Alternatywnych (ICCVAM) oraz Amerykański Krajowy Program Toksykologiczny (NTP) Międzyagencyjnego Centrum Oceny Alternatywnych Metod Toksykologicznych (NICEATM). Publikacja NIH nr: 10-7553A. Dostępne na stronie internetowej: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(4)

Organizacja Narodów Zjednoczonych (ONZ) (2011). Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów (GHS), wydanie czwarte zmienione, ONZ, Nowy Jork i Genewa, 2011. Dostępne na stronie internetowej: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html

(5)

Streamlined Summary Document Supporting OECD Test Guideline 438 on the Isolated Chicken Eye for Eye Irritation/Corrosion. Seria OECD dotycząca badań i oceny nr 188 (części 1 i 2), OECD, Paryż.

(6)

Rozdział B.5 niniejszego załącznika, Działanie żrące / silnie drażniące na oczy.

(7)

Scott L, Eskes C, Hoffman S, Adriaens E, Alepee N, Bufo M, Clothier R, Facchini D, Faller C, Guest R, Hamernik K, Harbell J, Hartung T, Kamp H, Le Varlet B, Meloni M, Mcnamee P, Osborn R, Pape W, Pfannenbecker U, Prinsen M, Seaman C, Spielmann H, Stokes W, Trouba K, Vassallo M, Van den Berghe C, Van Goethem F, Vinardell P, Zuang V (2010). A proposed Eye Irritation Testing Strategy to Reduce and Replace in vivo Studies Using Bottom-up and Top-down Approaches. Toxicology In Vitro 24, 1–9.

(8)

Wytyczne OECD (2011): „The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-Severe Irritants”. Seria OECD dotycząca badań i oceny nr 160, OECD, Paryż.

(9)

ICCVAM. (2006). Background review document: Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. Publikacja NIH nr: 06-4513. Research Triangle Park: Amerykański Krajowy Program Toksykologiczny. Dostępne na stronie internetowej: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm

(10)

Prinsen, M.K. i Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69–76.

(11)

DB-ALM (INVITTOX) (2009). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET) / Isolated Chicken Eye Test, 13 s. Dostępne na stronie internetowej: http://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/.

(12)

Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. i Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871–929.

(13)

Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291–296.

(14)

Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. i Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23–37.

(15)

Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicology in Vitro 20,78–81.

(16)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L. i Komitet Doradczy ds. Praktyk w zakresie Kontroli Zakażeń w Opiece Zdrowotnej (2007).Guideline for Isolation Precautions:Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Dostępne na stronie internetowej: http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf.

(17)

Maurer, J.K., Parker, R.D. i Jester J.V.(2002).Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation:key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox.Pharmacol.36:106–117.

(18)

Burton, A.B.G., M. York i R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471–480.

Dodatek 1

DEFINICJE

Dokładność : stopień zgodności pomiędzy wynikami zastosowania metody badawczej a przyjętymi wartościami odniesienia. Jest to miara efektywności metody badawczej i jeden z aspektów jej istotności. Pojęcia tego często używa się zamiennie z pojęciem „zgodność” na oznaczenie odsetka prawidłowych wyników uzyskiwanych przy użyciu metody badawczej.

Wzorcowa substancja chemiczna : substancja chemiczna używana jako wzorzec do porównań z badaną substancją chemiczną. Wzorcowa substancja chemiczna powinna mieć następujące cechy: (i) stałe i wiarygodne źródło(-a); (ii) podobieństwo strukturalne i funkcjonalne do badanej klasy substancji chemicznych; (iii) znane właściwości fizyczne i chemiczne; (iv) dane potwierdzające znane skutki; oraz (v) znaną siłę działania w zakresie pożądanych reakcji.

Podejście oddolne : stopniowe podejście stosowane w odniesieniu do substancji chemicznej, w przypadku której podejrzewa się, że nie wymaga zaklasyfikowania jako substancja powodująca podrażnienie lub poważne uszkodzenie oka; takie podejście polega na odróżnieniu substancji chemicznych niewymagających zaklasyfikowania (wynik ujemny) od pozostałych substancji chemicznych (wynik dodatni).

Substancja chemiczna : substancja albo mieszanina.

Rogówka : przezroczysta warstwa w przedniej części gałki ocznej, która okrywa tęczówkę i źrenicę oraz wpuszcza światło do wnętrza oka.

Zmętnienie rogówki : pomiar stopnia zmętnienia rogówki wskutek narażenia na badaną substancję chemiczną. Zwiększone zmętnienie rogówki wskazuje na jej uszkodzenie.

Obrzęk rogówki : obiektywny pomiar stopnia rozdęcia rogówki w następstwie narażenia na badaną substancję chemiczną w badaniu ICE. Obrzęk rogówki wyraża się procentowo i oblicza się go na podstawie wyjściowych pomiarów grubości rogówki (sprzed podania dawki) i grubości mierzonej w równych odstępach czasu po narażeniu na badaną substancję chemiczną w badaniu ICE. Stopień obrzęku rogówki wskazuje na jej uszkodzenie.

Podrażnienie oka : zmiany w oku spowodowane zaaplikowaniem badanej substancji chemicznej na wierzchnią warstwę oka, które są w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po zaaplikowaniu. Określenie używane zamiennie z określeniem „odwracalne skutki działania na oczy” oraz ze sformułowaniem „kategoria 2 GHS ONZ” (4).

Odsetek wyników fałszywie ujemnych : odsetek wszystkich substancji chemicznych dających wynik dodatni fałszywie zidentyfikowanych po zastosowaniu metody badawczej jako dające wynik ujemny. Jest to jeden ze wskaźników efektywności metody badawczej.

Odsetek wyników fałszywie dodatnich : odsetek wszystkich substancji chemicznych dających wynik ujemny fałszywie zidentyfikowanych po zastosowaniu metody badawczej jako dające wynik dodatni. Jest to jeden ze wskaźników efektywności metody badawczej.

Zatrzymanie fluoresceiny : subiektywny pomiar ilości fluoresceiny zatrzymanej w komórkach nabłonka rogówki w następstwie narażenia na substancję badaną w badaniu ICE. Stopień zatrzymania fluoresceiny wskazuje na uszkodzenie nabłonka rogówki.

Zagrożenie : nieodłączna właściwość czynnika lub sytuacja, która może potencjalnie doprowadzić do niekorzystnych skutków w przypadku narażenia organizmu, systemu lub (sub)populacji na taki czynnik.

Nieodwracalne skutki działania na oczy : zob. „poważne uszkodzenie oczu” i „kategoria 1 wg GHS ONZ”.

Mieszanina : mieszanina lub roztwór, które składają się z co najmniej dwóch substancji niewchodzących ze sobą w reakcję (4).

Kontrola ujemna : kontrpróba niepoddana działaniu badanej substancji chemicznej zawierająca wszystkie składniki układu badawczego. Próbka ta jest przetwarzana razem z próbkami poddanymi działaniu badanej substancji chemicznej oraz z innymi próbkami kontrolnymi w celu określenia, czy rozpuszczalnik wchodzi w reakcję z układem badawczym.

Niesklasyfikowane : substancje chemiczne, które nie zostały zaklasyfikowane jako substancje podrażniające oczy (kategoria 2 wg GHS ONZ) ani substancje powodujące poważne uszkodzenie oczu (kategoria 1 wg GHS ONZ). Określenie używane zamiennie ze sformułowaniem „brak kategorii wg GHS ONZ”.

Kontrola dodatnia : kontrpróba zawierająca wszystkie składniki układu badawczego, poddana działaniu substancji chemicznej, o której wiadomo, że wywołuje reakcję dodatnią. Aby zapewnić możliwość oceny zmienności reakcji w kontroli dodatniej w czasie, siła reakcji w postaci silnego działania drażniącego nie może być zbyt duża.

Wiarygodność : miary zakresu, w jakim metoda badawcza może być przeprowadzana w sposób odtwarzalny w jednym laboratorium i pomiędzy laboratoriami na przestrzeni czasu w przypadku jej przeprowadzania przy użyciu tego samego protokołu. Ocenia się ją, obliczając odtwarzalność wewnątrz- i międzylaboratoryjną oraz powtarzalność wewnątrzlaboratoryjną.

Odwracalne skutki działania na oczy : zob. „podrażnienie oka” i „kategoria 2 wg GHS ONZ”.

Poważne uszkodzenie oczu : uszkodzenie tkanki oka lub poważne fizyczne pogorszenie widzenia spowodowane zaaplikowaniem badanej substancji chemicznej na przednią powierzchnię oka, które nie są w pełni odwracalne w ciągu 21 dni po zaaplikowaniu. Określenie używane zamiennie z określeniem „nieodwracalne skutki działania na oczy” oraz ze sformułowaniem„kategoria 1 wg GHS ONZ” (4).

Biomikroskop : narzędzie używane do bezpośredniego badania oka w powiększeniu pod mikroskopem dwuokularowym poprzez uzyskanie prostego obrazu stereoskopowego. W metodzie badawczej ICE narzędzie to stosuje się do oglądania przednich struktur oka kurzego, jak również do obiektywnego pomiaru grubości rogówki za pomocą urządzenia do pomiaru grubości połączonego z mikroskopem.

Kontrola z rozpuszczalnikiem/nośnikiem : próbka niepoddana działaniu badanej substancji, zawierająca wszystkie składniki układu badawczego, w tym rozpuszczalnik lub nośnik, która jest przetwarzana razem z próbkami poddanymi działaniu badanej substancji oraz z innymi próbkami kontrolnymi w celu określenia wyjściowej reakcji dla próbek poddanych działaniu badanej substancji chemicznej rozpuszczonej w tym samym rozpuszczalniku lub nośniku. W przypadku badania z jednoczesną kontrolą ujemną próbka ta wykazuje również, czy rozpuszczalnik lub nośnik wchodzi w reakcję z układem badawczym.

Substancja : pierwiastki chemiczne i ich związki w stanie naturalnym lub uzyskane w wyniku dowolnego procesu produkcyjnego, w tym wszelkie dodatki konieczne do zachowania trwałości produktu i wszelkie zanieczyszczenia powstałe w wyniku zastosowanego procesu, z wyłączeniem wszelkich rozpuszczalników, które można oddzielić bez wpływu na stabilność substancji i bez zmiany jej składu (4).

Środek powierzchniowo czynny : zwany także surfaktantem, jest to substancja, np. detergent, która może zmniejszać napięcie powierzchniowe cieczy, umożliwiając tym samym jej pienienie lub przenikanie w ciała stałe; substancja ta jest także zwana środkiem zwilżającym.

Podejście odgórne : stopniowe podejście stosowane w odniesieniu do substancji chemicznej, w przypadku której podejrzewa się, że powoduje poważne uszkodzenie oczu; takie podejście polega na odróżnieniu substancji chemicznych powodujących poważne uszkodzenie oczu (wynik dodatni) od pozostałych substancji chemicznych (wynik ujemny).

Badana substancja chemiczna : dowolna substancja lub mieszanina badana za pomocą niniejszej metody badawczej.

Wielopoziomowa strategia badań : strategia badań sekwencyjnych, w ramach której wszystkie istniejące informacje na temat badanej substancji chemicznej są analizowane na każdym poziomie w określonym porządku z zastosowaniem procesu uwzględniającego wagę dowodów w celu określenia, czy dostępna jest wystarczająca ilość informacji do podjęcia decyzji o klasyfikacji zagrożenia, przed przejściem do następnego poziomu. Jeżeli na podstawie dostępnych informacji można przypisać badanej substancji chemicznej potencjał w zakresie wywołania podrażnienia, dodatkowe badania nie są wymagane. Jeżeli na podstawie dostępnych informacji nie można przypisać badanej substancji chemicznej potencjału w zakresie wywołania podrażnień, przeprowadza się procedurę badań sekwencyjnych na zwierzętach do momentu, w którym będzie można dokonać jednoznacznej klasyfikacji.

Globalnie Zharmonizowany System Klasyfikacji i Oznakowania Chemikaliów Organizacji Narodów Zjednoczonych (GHS ONZ) : system, w ramach którego proponuje się klasyfikację substancji chemicznych (substancji i mieszanin) według znormalizowanych rodzajów i poziomów zagrożeń fizycznych, zdrowotnych i środowiskowych oraz omawia się odpowiednie elementy komunikacyjne, takie jak: piktogramy, hasła ostrzegawcze, zwroty wskazujące rodzaj zagrożenia, zwroty wskazujące środki ostrożności i karty charakterystyki substancji i produktów niebezpiecznych, aby przekazać informacje na temat ich szkodliwego działania w celu zapewnienia ochrony ludzi (w tym pracowników, robotników, przewoźników, konsumentów i ratowników) i środowiska (4).

Kategoria 1 wg GHS ONZ : zob. „poważne uszkodzenie oczu” lub „nieodwracalne skutki działania na oczy”.

Kategoria 2 wg GHS ONZ : zob. „podrażnienie oka” lub „odwracalne skutki działania na oczy”.

Brak kategorii GHS ONZ : substancje, które nie spełniają wymogów w zakresie zaklasyfikowania jako należące do kategorii 1 lub 2 (2A lub 2B) wg GHS ONZ. Określenie używane zamiennie ze sformułowaniem „niesklasyfikowane”.

Zweryfikowana metoda badawcza : metoda badawcza, w odniesieniu do której zakończono badania walidacyjne w celu określenia jej istotności (w tym dokładności) i wiarygodności w odniesieniu do konkretnego celu. Należy zauważyć, że zweryfikowana metoda badawcza może nie wykazywać dostatecznej efektywności z punktu widzenia dokładności i wiarygodności, aby można było ją uznać za dopuszczalną w odniesieniu do danego celu.

Waga dowodów : proces analizowania mocnych i słabych stron różnych informacji podczas formułowania wniosku dotyczącego potencjalnego zagrożenia stwarzanego przez daną substancję chemiczną oraz uzasadnienia takiego wniosku.

Dodatek 2

SUBSTANCJE CHEMICZNE PRZEZNACZONE DO OCENY BIEGŁOŚCI W ODNIESIENIU DO METODY BADAWCZEJ ICE

Przed przystąpieniem do rutynowego stosowania metody badawczej zgodnej z niniejszą metodą badawczą laboratoria powinny wykazać swoją biegłość techniczną, prawidłowo ustalając klasyfikację 13 substancji chemicznych wskazanych w tabeli 1 pod względem działania niebezpiecznego dla oczu. Wspomniane substancje chemiczne zostały dobrane w taki sposób, by reprezentowały zakres reakcji na działanie niebezpieczne dla oczu oparty na wynikach badania na oku królika in vivo (wytyczna TG 405) oraz na systemie klasyfikacji GHS ONZ (tj. kategorie 1, 2A, 2B lub brak kategorii zgodnie z GHS ONZ) (4) (6). Przy wyborze substancji kierowano się również następującymi kryteriami: dostępnością handlową tych substancji, dostępnością wysokiej jakości danych referencyjnych z badań in vivo oraz istnieniem wysokiej jakości danych uzyskanych dzięki zastosowaniu metody ICE in vitro. Dane referencyjne można znaleźć w SSD (5) oraz w dokumentach przeglądowych ICCVAM dla metody badawczej ICE (9).

Tabela 1

Substancje chemiczne zalecane do wykazania biegłości technicznej w odniesieniu do metody badawczej ICE

Substancja chemiczna

Numer CAS

Klasa chemiczna (13)

Stan skupienia

Klasyfikacja in vivo  (14)

Klasyfikacja in vitro  (15)

Chlorek benzalkoniowy (5 %)

8001-54-5

Związek oniowy

Ciecz

Kategoria 1

Kategoria 1

Chloroheksydyna

55-56-1

Amina, amidyna

Substancja stała

Kategoria 1

Kategoria 1

Kwas dibenzoilo-L-winowy

2743-38-6

Kwas karboksylowy, ester

Substancja stała

Kategoria 1

Kategoria 1

Imidazol

288-32-4

Związek heterocykliczny

Substancja stała

Kategoria 1

Kategoria 1

Kwas trichlorooctowy (30 %)

76-03-9

Kwas karboksylowy

Ciecz

Kategoria 1

Kategoria 1

Chlorek 2,6-dichlorobenzoilu

4659-45-4

Halogenek acylu

Ciecz

Kategoria 2A

Nie można dokonać żadnych prognoz (16)

Azotan amonu

6484-52-2

Sól nieorganiczna

Substancja stała

Kategoria 2A (17)

Nie można dokonać żadnych prognoz (16)

2-metyloacetylooctan etylu

609-14-3

Keton, ester

Ciecz

Kategoria 2B

Nie można dokonać żadnych prognoz (16)

Sulfotlenek dimetylu

67-68-5

Organiczny związek siarki

Ciecz

Brak kategorii

Brak kategorii

Glicerol

56-81-5

Alkohol

Ciecz

Brak kategorii

Brak kategorii (wynik graniczny)

Metylocyklopentan

96-37-7

Węglowodór (cykliczny)

Ciecz

Brak kategorii

Brak kategorii

n-heksan

110-54-3

Węglowodór (acykliczny)

Ciecz

Brak kategorii

Brak kategorii

Trójoctan glicerolu

102-76-1

Lipid

Ciecz

Niesklasyfikowany

Brak kategorii

Skróty: Nr CAS = numer w rejestrze Chemical Abstracts Service.

Dodatek 3

SCHEMATY BUDOWY URZĄDZENIA DO PRZEPŁUKIWANIA I UCHWYTÓW NA OCZY STOSOWANYCH W BADANIU ICE

(dodatkowe, ogólne opisy urządzenia do przepłukiwania i uchwytu na oko – zob. Burton et al. (18))

Image

Pozycja nr

Opis

Pozycja nr

Opis

1

Wylot ciepłej wody

9

Komora

2

Przesuwane drzwiczki

10

Uchwyt na oko

3

Urządzenie do przepłukiwania

11

Oko kurczaka

4

Miernik optyczny

12

Wylot roztworu soli

5

Wlot ciepłej wody

13

Śruba dociskowa

6

Roztwór soli

14

Regulowane ramię górne

7

Ciepła woda

15

Nieregulowane ramię dolne

8

Wlot roztworu soli

 

14)

w części B rozdział B.49 otrzymuje brzmienie:

„B.49   Test mikrojądrowy na komórkach ssaków in vitro

WPROWADZENIE

Niniejsza metoda badawcza jest równoważna metodzie opisanej w dotyczącej badań wytycznej OECD nr 487 (2016). Stanowi ona część cyklu metod badawczych dotyczących toksykologii genetycznej. Opracowany został dokument OECD, który zawiera zwięzłe informacje na temat badań w zakresie toksykologii genetycznej oraz przegląd ostatnich zmian, jakie wprowadzono do wytycznych dotyczących badań (1).

Test mikrojądrowy in vitro (MNvit) jest badaniem genotoksyczności służącym wykrywaniu mikrojąder (MN) w cytoplazmie komórek w interfazie. Mikrojądra mogą pochodzić odpowiednio z acentrycznych fragmentów chromosomów (tj. niezawierających centromeru) lub z całych chromosomów, które nie są w stanie migrować do biegunów w stadium anafazy podziału komórek. Test MNvit jest zatem metodą in vitro, która dostarcza kompleksowych podstaw do badania in vitro potencjalnego działania powodującego uszkodzenia chromosomowe, ponieważ w komórkach, w których doszło do podziału komórek podczas narażenia na działanie badanej substancji chemicznej lub po nim, można wykryć zarówno aneugeny, jak i klastogeny (2) (3) (więcej szczegółów podano w pkt 13). Mikrojądra stanowią uszkodzenie, które zostało przekazane do komórek potomnych, podczas gdy aberracje chromosomowe znalezione w komórkach w metafazie nie mogą być przekazywane. W obu przypadkach zmiany mogą nie pokrywać się z przeżywaniem komórek.

Niniejsza metoda badawcza dopuszcza stosowanie protokołów z inhibitorem polimeryzacji aktyny cytochalazyną B i bez niego. Dodatek cytochalazyny B przed mitozą skutkuje powstawaniem komórek dwujądrowych i tym samym umożliwia identyfikację i analizę mikrojąder tylko w tych komórkach, które przeszły jedną mitozę (4) (5). Niniejsza metoda badawcza pozwala również na stosowanie protokołów bez zahamowania cytokinezy, pod warunkiem że istnieją dowody na to, że badana populacja komórek przeszła mitozę.

Oprócz testu MNvit wykorzystywanego do identyfikowania substancji chemicznych, które powodują powstawanie mikrojąder, dodatkowych informacji na temat mechanizmów uszkadzania chromosomów i powstawania mikrojąder może dostarczyć również wykorzystanie immunochemicznego oznakowania kinetochorów lub hybrydyzacji z sondami centromerowymi/telomerowymi (fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH)) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17). Wspomniane procedury oznaczania i hybrydyzacji mogą być wykorzystywane w przypadku, gdy następuje intensyfikacja procesu powstawania mikrojąder i osoba przeprowadzająca badanie zamierza ustalić, czy intensyfikacja ta jest skutkiem jest skutkiem zdarzeń klastogennych lub aneugennych.

Ponieważ mikrojądra w komórkach w interfazie można ocenić stosunkowo obiektywnie, pracownicy laboratorium muszą jedynie ustalić liczbę komórek dwujądrowych w przypadku użycia cytochalazyny B oraz częstość występowania komórek mikrojądrowych we wszystkich przypadkach. W rezultacie można stosunkowo szybko ocenić szkiełka mikroskopowe i zautomatyzować analizę. Dzięki temu można ocenić nie setki, a tysiące komórek na jedno podanie substancji chemicznej, co zwiększa wydajność testu. Wreszcie, ponieważ mikrojądra mogą tworzyć się z chromosomów opóźnionych, istnieje możliwość wykrycia czynników wywołujących aneuploidię, które trudno badać w konwencjonalnych testach aberracji chromosomowych, np. rozdział B.10 niniejszego załącznika (18). Test MNvit opisany w niniejszej metodzie badawczej nie pozwala jednak na odróżnienie substancji chemicznych wywołujących zmiany w liczbie chromosomów lub ploidalności od substancji wywołujących klastogenność bez zastosowania specjalnych technik, takich jak badanie FISH, o którym mowa w pkt 4.

Test MNvit jest rzetelny i można go przeprowadzić na różnych rodzajach komórek oraz w obecności lub przy braku cytochalazyny B. Istnieją obszerne dane, które potwierdzają wiarygodność testu MNvit z wykorzystaniem różnych rodzajów komórek (kultury linii komórkowych lub pierwotnych hodowli komórek) (19) (20) (21) (22) (23) (24) (25) (26) (27) (28) (29) (30) (31) (32) (33) (34) (35) (36). Obejmują one w szczególności międzynarodowe badania walidacyjne koordynowane przez Société Française de Toxicologie Génétique (SFTG) (19) (20) (21) (22) (23) i sprawozdania z International Workshop on Genotoxicity Testing (międzynarodowych warsztatów poświęconych badaniu genotoksyczności) (5) (17). Dostępne dane zostały również poddane ponownej ocenie w retrospektywnym badaniu walidacyjnym opartym na analizie wagi dowodów, przeprowadzonym przez Europejskie Centrum Uznawania Metod Alternatywnych (ECVAM) Komisji Europejskiej (KE), zaś niniejsza metoda badawcza została zatwierdzona jako potwierdzona naukowo przez Naukowy Komitet Doradczy ECVAM (ESAC) (37) (38) (39).

W teście MNvit na komórkach ssaków można wykorzystać kultury linii komórkowych lub pierwotne hodowle komórek pochodzących od człowieka lub od gryzoni. Ponieważ podstawowa częstość występowania mikrojąder będzie miała wpływ na czułość badania, zaleca się wykorzystywanie rodzajów komórek o stałej i określonej częstości powstawania mikrojąder. Wykorzystywane komórki dobiera się na podstawie ich zdolności do wzrostu w kulturach, stabilności kariotypu (w tym liczby chromosomów) oraz spontanicznych częstości występowania mikrojąder (40). W chwili obecnej dostępne dane nie pozwalają na opracowanie konkretnych zaleceń, ale wynika z nich, że istotne jest, aby podczas oceny zagrożeń stwarzanych przez substancje chemiczne wziąć pod uwagę status białka p53, stabilność genetyczną (kariotypową), zdolność do naprawy DNA oraz pochodzenie (od gryzoni lub od człowieka) komórek wybranych do badania. Zachęca się zatem użytkowników niniejszej metody badawczej do uwzględniania wpływu tych oraz innych właściwości komórek na zachowanie linii komórkowej przy wykrywaniu indukcji mikrojąder w miarę rozwoju wiedzy w tej dziedzinie.

Stosowane definicje znajdują się w dodatku 1.

ZAŁOŻENIA WSTĘPNE I OGRANICZENIA

Badania przeprowadzane in vitro wymagają zazwyczaj wykorzystania egzogennego źródła aktywacji metabolicznej, chyba że komórki są metabolicznie wydolne w odniesieniu do badanych substancji chemicznych. Egzogenny układ metabolizujący nie jest w stanie całkowicie naśladować warunków in vivo. Należy zachować ostrożność, aby uniknąć wystąpienia warunków, które mogą doprowadzić do zniekształconych wyników dodatnich, które nie odzwierciedlają genotoksyczności badanych substancji chemicznych. Do takich warunków zalicza się zmiany pH (41) (42) (43) lub osmolalność, interakcje z podłożem do hodowli komórkowych (44) (45) bądź zbyt wysokie poziomy cytotoksyczności (zob. pkt 29).

Dla celów analizy indukcji mikrojąder istotne jest, aby mitoza zachodziła zarówno w kulturach poddanych działaniu badanej substancji, jak i w kulturach niepoddanych takiemu działaniu. Najpełniejsze informacje w zakresie zliczania mikrojąder można uzyskać na podstawie komórek, które przeszły jedną mitozę w trakcie poddawania ich działaniu badanej substancji chemicznej lub po nim. W przypadku wytworzonych nanomateriałów konieczne jest specjalne dostosowanie niniejszej metody badawczej, nie zostało to jednak opisane w niniejszej metodzie badawczej.

Przed zastosowaniem niniejszej metody badawczej z użyciem mieszaniny w celu zgromadzenia danych na potrzeby założonego celu regulacyjnego należy zastanowić się nad tym, czy zastosowanie niniejszej metody może doprowadzić do uzyskania wyników odpowiednich z punktu widzenia tego celu, a jeżeli tak – dlaczego. Przeprowadzenie takiej analizy nie jest konieczne, jeżeli ustanowiono wymóg regulacyjny dotyczący badania danej mieszaniny.

ZASADA BADANIA

Kultury komórkowe pochodzące od ludzi lub od innych ssaków poddaje się działaniu badanej substancji chemicznej zarówno z zastosowaniem egzogennego źródła aktywacji metabolicznej, jak i bez takiego źródła, pod warunkiem że nie wykorzystuje się komórek o odpowiednich zdolnościach metabolicznych (zob. pkt 19).

Komórki są hodowane w trakcie narażenia na działanie badanej substancji chemicznej lub po zakończeniu takiego narażenia przez okres wystarczający do uszkodzenia chromosomów lub wystąpienia innego wpływu na cykl komórkowy lub podział komórek, tak aby doprowadzić do powstawania mikrojąder w komórkach w interfazie. Do celów indukcji aneuploidii badana substancja chemiczna powinna być co do zasady obecna w trakcie mitozy. Zebrane i zabarwione komórki w interfazie są analizowane pod kątem obecności mikrojąder. W warunkach idealnych mikrojądra powinny być zliczane tylko w tych komórkach, które przeszły mitozę podczas narażenia na badaną substancję chemiczną lub w okresie po poddaniu ich działaniu tej substancji, jeżeli taki okres jest stosowany. W kulturach, którym podano inhibitor cytokinezy, można to łatwo osiągnąć poprzez liczenie jedynie komórek dwujądrowych. W przypadku braku inhibitora cytokinezy ważne jest, aby wykazać, że w poddanych analizie komórkach prawdopodobnie doszło do podziału komórek, co wynika ze zwiększenia liczebności populacji komórek, podczas narażenia na działanie badanej substancji chemicznej lub po nim. Dla wszystkich protokołów ważne jest, aby wykazać, że proliferacja komórek zaszła zarówno w hodowlach kontrolnych, jak i w hodowlach poddanych działaniu substancji, a także należy oszacować zakres cytotoksyczności wywołanej przez badaną substancję chemiczną lub cytostazy we wszystkich kulturach, które analizuje się pod kątem występowania mikrojąder.

OPIS METODY

Komórki

Można wykorzystać pierwotne hodowle limfocytów krwi obwodowej pochodzących od ludzi lub od innych ssaków (7) (20) (46) (47) oraz szereg linii komórkowych pochodzących od gryzoni, takich jak CHO, V79, CHL/IU i L5178Y, lub linie komórkowe pochodzące od ludzi, np. (19) (20) (21) (22) (23) (26) (27) (28) (29) (31) (33) (34) (35) (36) (zob. pkt 6). Do celów testów mikrojądrowych wykorzystywano również inne linie komórkowe, takie jak HT29 (48), Caco-2 (49), HepaRG (50) (51), komórki HepG2 (52) (53), A549 oraz pierwotne komórki zarodka chomika syryjskiego (54), jednak na chwilę obecną nie zostały one poddane walidacji w szerszym zakresie. Stosowanie tych linii komórkowych i rodzajów komórek powinno być zatem uzasadnione na podstawie ich wykazanej efektywności w badaniu, jak opisano w sekcji poświęconej kryteriom dopuszczalności. Jak donoszono, cytochalazyna B może potencjalnie wpływać na wzrost komórek L5178Y, dlatego też nie zaleca się jej stosowania z tą linią komórkową (23). Jeżeli stosowane są komórki pierwotne, ze względu na dobrostan zwierząt należy rozważyć użycie komórek pochodzących od ludzi, jeżeli jest to możliwe; należy je pobrać w zgodzie z zasadami etycznymi i przepisami mającymi zastosowanie do ludzi.

Ludzkie limfocyty krwi obwodowej należy pozyskiwać od młodych (w wieku około 18–35 lat) niepalących osób, u których nie stwierdzono żadnych schorzeń oraz które nie były narażone w ostatnim czasie na czynniki genotoksyczne (tj. substancje chemiczne, promieniowanie jonizujące) w stopniu, który mógłby zwiększyć podstawową częstość występowania komórek mikrojądrowych. Zagwarantuje to niską i stałą podstawową częstość występowania komórek mikrojądrowych. Wyjściowa częstość występowania komórek mikrojądrowych wzrasta wraz z wiekiem, a tendencja ta jest bardziej widoczna u kobiet niż u mężczyzn (55). Jeżeli dla celów stosowania łączy się komórki pochodzące od większej liczby dawców niż jeden, należy wskazać liczbę dawców. Należy wykazać, że komórki uległy podziałowi w okresie od rozpoczęcia poddawania ich działaniu badanej substancji chemicznej do momentu pobrania próbek. Kultury komórkowe utrzymuje się w fazie wzrostu wykładniczego (linie komórkowe) bądź stymuluje się ich podział (pierwotne kultury limfocytów) celem narażenia komórek na działanie badanej substancji chemicznej w różnych stadiach cyklu komórkowego, ponieważ czułość stadiów komórek na badaną substancję chemiczną może być nieznana. Komórki pierwotne, które wymagają stymulacji mitogenami, aby się podzielić, zasadniczo nie podlegają synchronizacji podczas narażenia na działanie badanej substancji chemicznej (np. limfocyty ludzkie po 48-godzinnej stymulacji mitogenami). Wykorzystywanie zsynchronizowanych komórek podczas podawania badanej substancji chemicznej nie jest zalecane, ale może zostać zaakceptowane w uzasadnionych przypadkach.

Podłoża i warunki hodowli

W celu utrzymania kultur należy zastosować odpowiednie podłoże oraz warunki inkubacji (naczynia do hodowli komórkowych, wilgotne środowisko o zawartości CO2 5 %, w stosownych przypadkach, oraz temperatura w wysokości 37 °C). Linie komórkowe powinny być rutynowo sprawdzane pod kątem stabilności zmiennej liczby chromosomów oraz nieobecności zanieczyszczenia mykoplazmą, a komórki nie powinny być wykorzystywane, jeżeli są zanieczyszczone lub w przypadku, gdy zmienna liczba chromosomów uległa zmianie. Należy ustalić normalny czas trwania cyklu komórkowego linii komórkowych lub pierwotnych kultur wykorzystywanych w laboratorium badawczym, który powinien być zgodny z opublikowanymi właściwościami komórek (20).

Przygotowanie kultur

Linie komórkowe: komórki są rozmnażane z kultur wyjściowych i wysiewane na podłoże w takiej gęstości, by komórki w zawiesinie lub w jednowarstwowej hodowli komórek mogły nadal rosnąć wykładniczo aż do czasu pobrania (np. należy unikać konfluencji w przypadku komórek rosnących w jednowarstwowej hodowli komórek).

Limfocyty: krew pełną z antykoagulantem (np. heparyną) lub oddzielone limfocyty hoduje się (np. przez 48 godzin dla limfocytów ludzkich) w obecności mitogenu (np. fitohemaglutyniny (PHA) dla limfocytów ludzkich) w celu indukcji podziału komórek przed ich narażeniem na działanie badanej substancji chemicznej oraz cytochalazyny B.

Aktywacja metaboliczna

Egzogenne układy metabolizujące należy stosować w przypadku, gdy stosuje się komórki o nieodpowiedniej endogennej wydolności metabolicznej. Najpowszechniej stosowanym układem, który jest domyślnie zalecany, jeżeli nie jest uzasadnione zastosowanie innego systemu, jest frakcja postmitochondrialna suplementowanego kofaktora (S9) przygotowywana z wątroby gryzoni (najczęściej szczurów) otrzymujących czynniki pobudzające enzymy takie jak Aroclor 1254 (56) (57) lub kombinację fenobarbitalu i b-naftoflawonu (58) (59) (60). Ta ostatnia kombinacja nie pozostaje w sprzeczności z Konwencją sztokholmską w sprawie trwałych zanieczyszczeń organicznych (61) i okazała się równie skuteczna jak Aroclor 1254 w wywoływaniu oksydaz wieloczynnościowych (58) (59) (60). Frakcja S9 jest zazwyczaj wykorzystywana w stężeniach w zakresie 1–2 % (objętościowo), ale stężenie to może być zwiększone do 10 % (obj.) w końcowym podłożu użytym do badania. Podczas poddawania zwierzęcia czynnikom należy unikać stosowania produktów, które zmniejszają indeks mitotyczny, a zwłaszcza czynników wiążących wapń (62). Klasa badanych substancji chemicznej może mieć wpływ na wybór rodzaju i stężenia egzogennego układu metabolizującego lub czynnika pobudzającego metabolizm.

Przygotowanie badanej substancji chemicznej

Badane substancje chemiczne w stanie stałym należy rozpuścić w odpowiednich rozpuszczalnikach oraz rozcieńczyć, w stosownych przypadkach, przed poddaniem komórek ich działaniu. Ciekłe substancje chemiczne można dodać do układu badawczego bezpośrednio lub rozcieńczyć przed podaniem do układu badawczego. Gazowe lub lotne substancje chemiczne należy badać za pomocą odpowiednich modyfikacji standardowych protokołów, takich jak poddawanie komórek działaniu substancji badanej w szczelnie zamkniętych naczyniach (63) (64) (65). Preparaty badanej substancji chemicznej należy przygotowywać tuż przed poddaniem komórek jej działaniu, chyba że dane dotyczące stabilności wskazują, iż dopuszczalne jest składowanie substancji.

Warunki badania

Rozpuszczalniki

Rozpuszczalnik należy wybrać tak, aby zoptymalizować rozpuszczalność badanych substancji chemicznych, unikając niepożądanego wpływu na przeprowadzenie badania, tj. zmiany wzrostu komórek, wpływu na spójność badanej substancji chemicznej, reakcji z naczyniami do hodowli komórkowych czy zakłócenia układu metabolizującego. Zaleca się, aby w miarę możliwości w pierwszej kolejności rozważyć zastosowanie wodnego rozpuszczalnika (lub podłoża). Sprawdzonymi rozpuszczalnikami są woda lub sulfotlenek dimetylu (DMSO). Zasadniczo zawartość rozpuszczalników organicznych nie powinna przekraczać 1 % (obj.). Jeżeli cytochalazyna B jest rozpuszczona w sulfotlenku dimetylu, całkowita ilość rozpuszczalnika organicznego używanego zarówno dla badanej substancji chemicznej, jak i cytochalazyny B nie powinna przekraczać 1 % (obj.); w przeciwnym razie należy zastosować próby kontrolne niepoddane działaniu substancji, aby upewnić się, że zawartość procentowa rozpuszczalnika organicznego nie wykazuje szkodliwego działania. Zawartość rozpuszczalników wodnych (soli fizjologicznej lub wody) w końcowym podłożu użytym do badania nie powinna przekroczyć 10 % (obj.). Jeżeli używane są inne rozpuszczalniki niż sprawdzone rozpuszczalniki (np. etanol czy aceton), ich użycie powinno być uzasadnione danymi, które potwierdzają ich zgodność z badaną substancją chemiczną, układem badawczym oraz brak toksyczności genetycznej w zastosowanym stężeniu. W razie braku takich danych potwierdzających należy uwzględnić próby kontrolne niepoddawane działaniu substancji (zob. dodatek 1) oraz próby kontrolne z rozpuszczalnikiem w celu wykazania, że wybrany rozpuszczalnik nie wywołuje skutków szkodliwych lub wpływających na chromosomy (np. aneuploidia lub klastogenność).

Wykorzystanie cytochalazyny B jako inhibitora cytokinezy

Jedną z najistotniejszych kwestii przy przeprowadzaniu testu MNvit jest zapewnienie, aby zliczane komórki przeszły mitozę podczas poddawania działaniu badanej substancji chemicznej lub w okresie po poddaniu, jeżeli jest stosowany. Z tego względu liczenie mikrojąder należy ograniczyć do komórek, które przeszły mitozę w trakcie ich poddawania działaniu badanej substancji chemicznej lub po nim. Cytochalazyna B to czynnik, który jest najpowszechniej stosowany do celów inhibicji cytokinezy, ponieważ hamuje on polimeryzację aktyny, a tym samym zapobiega oddzielaniu komórek potomnych po mitozie, doprowadzając do powstawania komórek dwujądrowych (6) (66) (67). W przypadku stosowania cytochalazyny B wpływ badanej substancji chemicznej na kinetykę proliferacji komórek można mierzyć jednocześnie. Cytochalazyna B powinna być wykorzystywana jako inhibitor cytokinezy w przypadku stosowania ludzkich limfocytów, ponieważ czas trwania cyklu komórkowego będzie różny dla różnych dawców oraz ze względu na to, że nie wszystkie limfocyty będą reagować na stymulację PHA. Wykorzystanie cytochalazyny B nie jest obowiązkowe dla innych rodzajów komórek, jeżeli można stwierdzić, że przeszły one podział, jak opisano w pkt 27. Ponadto cytochalazyna B nie jest zasadniczo stosowana, jeżeli próbki są oceniane pod względem mikrojąder z wykorzystaniem metody cytometrii przepływowej.

Laboratorium powinno ustalić odpowiednie stężenie cytochalazyny B dla każdego rodzaju komórek w celu uzyskania optymalnej częstości występowania komórek dwujądrowych w kulturach kontrolnych z rozpuszczalnikiem oraz wykazać, że to stężenie doprowadzi do produkcji wystarczającej liczby komórek dwujądrowych dla celów oceny. Odpowiednie stężenie cytochalazyny B zwykle wynosi 3–6 μg/ml (19).

Pomiar proliferacji komórek i cytotoksyczności oraz wybór badanych stężeń

Przy ustalaniu najwyższego stężenia badanej substancji chemicznej należy unikać stężeń, które mogą dawać zniekształcone wyniki dodatnie, np. stężeń powodujących nadmierną cytotoksyczność (zob. pkt 29), strącanie substancji w podłożu (zob. pkt 30) i znaczne zmiany pH lub osmolalności (zob. pkt 9). Jeżeli badana substancja chemiczna powoduje znaczną zmianę pH podłoża w momencie dodania, pH może zostać dopasowane poprzez buforowanie końcowego podłoża użytego do badania, aby uniknąć zniekształconych wyników dodatnich i utrzymać odpowiednie warunki hodowli.

Dokonuje się pomiaru proliferacji komórek, aby upewnić się, że odpowiednia liczba komórek poddanych działaniu substancji przeszła mitozę podczas testu oraz że substancja chemiczna jest podawana przy odpowiednim poziomie cytotoksyczności (zob. pkt 29). Cytotoksyczność powinna zostać określona w ramach głównego doświadczenia z użyciem aktywacji metabolicznej lub bez niej, przy wykorzystaniu odpowiedniego wskazania dotyczącego śmierci i wzrostu komórek (zob. pkt 26 i 27). Chociaż ocena cytotoksyczności w badaniu wstępnym może być przydatna w lepszym określeniu stężeń, które mają zostać użyte w głównym doświadczeniu, badanie wstępne nie jest obowiązkowe. Jeżeli taka ocena zostanie przeprowadzona, nie może ona zastąpić pomiaru cytotoksyczności w głównym doświadczeniu.

Podawanie hodowlom cytochalazyny B i pomiar względnych częstości występowania komórek jednojądrowych, dwujądrowych i wielojądrowych w hodowli stanowi precyzyjną metodę ilościowego określania wpływu na proliferację komórek oraz działania cytotoksycznego lub cytostatycznego badanej substancji (6) oraz zapewnia mikroskopowe liczenie jedynie tych komórek, które podzieliły się podczas podawania substancji lub po jej podaniu. W celu oszacowania działania cytotoksycznego lub cytostatycznego badanej substancji przez porównanie wartości w kulturach poddanych działaniu substancji oraz w kulturach kontrolnych należy zastosować wskaźnik proliferacji blokera cytokinezy (CBPI) (6) (27) (68) lub wskaźnik replikacji (RI) oparte na co najmniej 500 komórkach na kulturę (zob. wzory w dodatku 2). Ocena innych wskaźników cytotoksyczności (np. integralność komórki, apoptoza, martwica, liczenie w stadium metafazy, cykl komórkowy) może dostarczyć użytecznych informacji, ale nie powinna być stosowana zamiast CBPI czy RI.

W badaniach przeprowadzonych bez udziału cytochalazyny B należy wykazać, że komórki w kulturze uległy podziałowi, tak aby znaczny odsetek zliczanych komórek uległ podziałowi w trakcie poddania działaniu badanej substancji chemicznej lub po nim; w przeciwnym razie można uzyskać wyniki fałszywie ujemne. Zaleca się pomiar względnego podwojenia populacji (RPD) oraz względnego wzrostu liczby komórek (RICC) celem oszacowania cytotoksycznego lub cytostatycznego działania badanej substancji (17) (68) (69) (70) (71) (zob. wzory w dodatku 2). W przypadku rozszerzonych okresów pobierania próbek (tj. poddawanie komórek działaniu substancji chemicznej przez 1,5–2-krotność normalnego czasu trwania cyklu komórkowego, przez co okresy pobierania próbek trwają ogółem dłużej niż 3–4-krotność normalnego czasu trwania cyklu komórkowego, jak opisano w pkt 38 i 39) RPD może spowodować niedoszacowanie cytotoksyczności (71). W takich warunkach RICC może być lepszą miarą; pomocne oszacowanie może również zapewnić ocena cytotoksyczności po upływie 1,5–2-krotności czasu trwania cyklu komórkowego. Ocena innych wskaźników cytotoksyczności lub cytostazy (np. integralności komórki, apoptozy, martwicy, liczenia w stadium metafazy, wskaźnika proliferacji (PI), cyklu komórkowego, mostków nukleoplazmatycznych lub „pączków” jądrowych) może dostarczyć użytecznych dodatkowych informacji, ale nie powinna być stosowana zamiast RPD czy RICC.

Należy ocenić co najmniej trzy badane stężenia (poza kontrolami z rozpuszczalnikiem i kontrolami dodatnimi), które spełniają kryteria dopuszczalności (odpowiednia cytotoksyczność, liczba komórek itp.). Bez względu na rodzaj komórek (linie komórkowe bądź pierwotne kultury limfocytów) przy każdym badanym stężeniu można stosować zarówno zduplikowane, jak i pojedyncze kultury poddane działaniu substancji. Mimo że zalecane jest stosowanie zduplikowanych kultur, dopuszczalne jest również stosowane pojedynczych kultur, pod warunkiem że policzono taką samą całkowitą liczbę komórek w przypadków zarówno kultur pojedynczych, jak i zduplikowanych. Zastosowanie pojedynczych kultur jest szczególnie uzasadnione, jeżeli ocenie poddaje się więcej niż 3 stężenia (zob. pkt 44–45). Wyniki uzyskane na podstawie niezależnych zduplikowanych kultur przy danym stężeniu można łączyć na potrzeby analizy danych. W przypadku badanych substancji chemicznych wykazujących niewielką cytotoksyczność lub niewykazujących żadnej cytotoksyczności na ogół odpowiednie będzie zastosowanie 2–3-krotnych przedziałów stężenia. W przypadku wystąpienia cytotoksyczności wybrane badane stężenia powinny obejmować zakres rozpoczynający od stężenia, które wykazuje cytotoksyczność, jak opisano w pkt 29, oraz uwzględniający stężenia, w których wystąpiła umiarkowana i niewielka cytotoksyczność lub nie wystąpiła żadna cytotoksyczność. Wiele badanych substancji chemicznych wykazuje gwałtowny wzrost krzywych stężenie-odpowiedź, w związku z czym aby uzyskać dane przy niskiej i umiarkowanej cytotoksyczności lub aby szczegółowo zbadać zależność dawka-odpowiedź, konieczne będzie zastosowanie stężeń o bardziej zbliżonych wartościach lub więcej niż trzech stężeń (kultury pojedyncze lub zduplikowane), w szczególności w sytuacjach, w których wymagane jest powtórzenie doświadczenia (zob. pkt 60).

Jeżeli maksymalne stężenie opiera się na cytotoksyczności, najwyższe stężenie powinno dążyć do osiągnięcia cytotoksyczności na poziomie 55 ± 5 % przy wykorzystaniu zalecanych parametrów cytotoksyczności (tj. zmniejszenie RICC i RPD dla linii komórkowych, jeżeli nie jest stosowana cytochalazyna B, i zmniejszenie CBPI lub RI, jeżeli cytochalazyna B jest stosowana w przypadku 45 ± 5 % jednoczesnych kontroli ujemnych) (72). Należy zachować ostrożność w interpretowaniu wyników dodatnich, które wystąpiły wyłącznie w górnym przedziale tego zakresu cytotoksyczności 55 ± 5 % (71).

Dla słabo rozpuszczalnych badanych substancji chemicznych, które nie wykazują cytotoksyczności w stężeniach niższych od najniższego stężenia nierozpuszczalnego, najwyższe badane stężenie powinno spowodować mętność lub osad widoczny gołym okiem lub przez mikroskop odwrócony pod koniec podawania badanej substancji chemicznej. Nawet jeżeli cytotoksyczność wystąpi dla stężeń powyżej najniższego stężenia nierozpuszczalnego, zaleca się przeprowadzenie testu tylko dla jednego stężenia powodującego mętność bądź wytrącenie się widocznego osadu, ponieważ osad może spowodować pojawienie się wyników zniekształconych. W przypadku stężenia powodującego powstanie osadu należy zadbać o to, aby pojawienie się osadu nie zakłóciło przebiegu testu (np. barwienia lub oceny). Pomocne może się okazać określenie rozpuszczalności podłoża przed wykonaniem doświadczenia.

Jeżeli nie zaobserwowano żadnego osadu ani ograniczenia cytotoksyczności, najwyższe badane stężenie powinno odpowiadać 10 mM, 2 mg/ml lub 2 μl/ml w zależności od tego, która z tych wartości jest najniższa (73) (74) (75). Jeżeli badana substancja chemiczna nie ma określonego składu, np. substancje o nieznanym lub zmiennym składzie, złożone produkty reakcji lub materiały biologiczne (UVCB) (76), wyciągi pochodzące ze środowiska itp., może być konieczne podwyższenie (np. do 5 mg/ml) najwyższego stężenia w przypadku braku dostatecznej cytotoksyczności, tak aby zwiększyć stężenie każdego ze składników. Należy jednak zwrócić uwagę na fakt, że wymagania te mogą się różnić w przypadku produktów leczniczych przeznaczonych dla ludzi (93).

Kontrole

Dla każdego czasu pobrania należy włączyć jednoczesną kontrolę ujemną (zob. pkt 21) obejmującą sam rozpuszczalnik w podłożu użytym do badania; w ramach tej kontroli test przeprowadza się w identyczny sposób jak w przypadku kultur poddanych działaniu substancji.

Jednoczesna kontrola dodatnia jest konieczna, aby wykazać zdolność laboratorium do zidentyfikowania klastogenów i aneugenów w warunkach określonych w stosowanym protokole badania oraz skuteczność egzogennego układu metabolizującego (w stosownych przypadkach). Przykładowe substancje służące do kontroli dodatniej są przedstawione poniżej w tabeli 1. W uzasadnionych przypadkach dopuszcza się zastosowanie alternatywnych substancji chemicznych służących do kontroli dodatniej.

W chwili obecnej nie są znane aneugeny wymagające aktywacji metabolicznej w celu wykazania działania genotoksycznego (17). Ponieważ testy na komórkach ssaków in vitro pod kątem toksyczności genetycznej są w dostatecznym stopniu ustandaryzowane, jeżeli chodzi o krótkoterminowe poddanie działaniu substancji chemicznej przeprowadzane jednocześnie z aktywacją metaboliczną i bez niej, zastosowanie kontroli dodatniej można ograniczyć do klastogenu wymagającego aktywacji metabolicznej. W tym przypadku pojedyncza reakcja klastogenna w ramach kontroli dodatniej wykaże zarówno aktywność układu metabolizującego, jak i reaktywność układu badawczego. W przypadku długoterminowego poddawania działaniu substancji chemicznej (bez S9) należy zastosować jednak oddzielną kontrolę dodatnią, ponieważ czas podawania badanej substancji chemicznej będzie się różnił od czasu w badaniu z wykorzystaniem aktywacji metabolicznej. Jeżeli klastogen został wybrany jako pojedyncza kontrola dodatnia dla krótkoterminowego poddawania działaniu badanej substancji chemicznej z aktywacją metaboliczną i bez niej, w przypadku poddawania długoterminowego bez aktywacji metabolicznej należy wybrać aneugen. W przypadku komórek wydolnych metabolicznie niewymagających użycia S9 należy zastosować kontrolę dodatnią zarówno pod kątem klastogenności, jak i aneugenności.

Każdą kontrolę dodatnią należy zastosować przy co najmniej jednym stężeniu, od którego oczekuje się wytworzenia odtwarzalnego oraz wykrywalnego wzrostu wykraczającego poza poziom wyjściowy, w celu wykazania czułości układu badawczego (tj. efekty są jasne, ale nie ujawniają badającemu bezpośrednio tożsamości zakodowanych szkiełek mikroskopowych), a reakcja nie powinna być zakłócona cytotoksycznością wykraczającą poza limity określone w niniejszej metodzie badawczej.

Tabela 1

Chemiczne substancje odniesienia zalecane do oceny biegłości laboratorium oraz do wyboru substancji do kontroli dodatniej

Kategoria

Substancja chemiczna

Numer CAS

1.   Klastogeny aktywne bez aktywacji metabolicznej

 

Metanosulfonian metylu

66-27-3

 

Mitomycyna C

50-07-7

 

N-tlenek 4-nitrochinoliny

56-57-5

 

Arabinozyd cytozyny

147-94-4

2.   Klastogeny wymagające aktywacji metabolicznej

 

Benzo[a]piren

50-32-8

 

Cyklofosfamid

50-18-0

3.   Aneugeny

 

Kolchicyna

64-86-8

 

Winblastyna

143-67-9

PROCEDURA

Harmonogram podawania substancji chemicznej

Aby zmaksymalizować prawdopodobieństwo wykrycia aneugenu lub klastogenu oddziałującego na określonych etapach cyklu komórkowego, konieczne jest poddanie wystarczającej liczby komórek działaniu badanej substancji chemicznej na wszystkich poszczególnych etapach ich cykli komórkowych. Każde poddanie działaniu substancji chemicznej powinno rozpocząć się i zakończyć w momencie, w którym komórki rosną wykładniczo; komórki powinny nadal rosnąć aż do czasu pobrania próbek. Harmonogram podawania substancji chemicznej dla linii komórkowych i pierwotnych hodowli komórek może zatem różnić się nieco od harmonogramu stosowanego w przypadku limfocytów, które wymagają stymulacji mitogenami, aby rozpocząć swój cykl komórkowy (17). W przypadku limfocytów najefektywniejszym podejściem jest rozpoczęcie poddawania działaniu badanej substancji chemicznej po upływie 44–48 godzin od stymulacji PHA, kiedy to komórki będą się dzielić asynchronicznie (6).

Opublikowane dane (19) wskazują, że większość aneugenów i klastogenów jest wykrywana w okresie krótkoterminowego poddawania działaniu substancji chemicznej wynoszącym 3–6 godzin w obecności i w braku frakcji S9, po którym następuje usunięcie badanej substancji chemicznej i pobranie próbek w czasie równoważnym około 1,5–2-krotności normalnego czasu trwania cyklu komórkowego po rozpoczęciu poddawania działaniu substancji (7).

W celu gruntownej oceny, która jest niezbędna do potwierdzenia wyniku ujemnego, należy jednak przeprowadzić doświadczenie we wszystkich trzech następujących warunkach doświadczalnych z zastosowaniem krótkoterminowego poddawania działaniu substancji chemicznej z aktywacją metaboliczną i bez niej oraz długoterminowego poddawania działaniu substancji bez aktywacji metabolicznej (zob. pkt 56, 57 i 58):

komórki należy poddawać działaniu badanej substancji chemicznej bez aktywacji metabolicznej przez 3–6 godzin, a następnie należy pobrać próbki w czasie równoważnym około 1,5–2-krotności normalnego czasu trwania cyklu komórkowego po rozpoczęciu poddawania działaniu substancji (19);

komórki należy poddawać działaniu badanej substancji chemicznej z użyciem aktywacji metabolicznej przez 3–6 godzin, a następnie należy pobrać próbki w czasie równoważnym około 1,5–2-krotności normalnego czasu trwania cyklu komórkowego po rozpoczęciu poddawania działaniu substancji (19);

komórki powinny być nieprzerwanie poddawane działaniu badanej substancji chemicznej bez aktywacji metabolicznej aż do pobrania próbek w czasie równoważnym około 1,5–2-krotności normalnego czasu trwania cyklu komórkowego.

Jeżeli którekolwiek z powyższych warunków doświadczalnych wywołały reakcję dodatnią, badanie któregokolwiek z pozostałych schematów poddawania działaniu substancji chemicznej może okazać się zbędne.

Jeżeli wiadomo lub podejrzewa się, że badana substancja chemiczna wpływa na czas cyklu komórkowego (np. podczas badania analogów nukleozydowych), zwłaszcza w odniesieniu do komórek posiadających białko p53 (35) (36) (77), można wydłużyć czas pobierania próbek lub ustania działania substancji maksymalnie o kolejną 1,5–2-krotność normalnego czasu trwania cyklu komórkowego (tj. ogółem 3–4-krotność normalnego czasu trwania cyklu komórkowego od rozpoczęcia krótko- i długoterminowego poddawania działaniu substancji chemicznej). Z tych opcji można korzystać w sytuacjach, w których może istnieć obawa co do możliwych interakcji między badaną substancją chemiczną a cytochalazyną B. Podczas stosowania wydłużonych okresów pobierania próbek (tj. całkowity czas hodowli wynoszący 3–4-krotność czasu trwania cyklu komórkowego) należy zadbać, aby komórki wciąż aktywnie się dzieliły. Przykładowo wzrost wykładniczy limfocytów może spadać po 96 godzinach od stymulacji, a jednowarstwowe hodowle komórek mogą się zlać.

Zalecane harmonogramy podawania substancji chemicznej zestawiono w tabeli 2. Te ogólne harmonogramy podawania substancji chemicznej można modyfikować (i należy podać uzasadnienie) w zależności od stabilności lub reaktywności badanej substancji chemicznej lub określonych właściwości wzrostowych stosowanych komórek.

Tabela 2

Czas poddawania komórek działaniu substancji chemicznej i czas pobrania w przypadku testu MNvit

Limfocyty, komórki pierwotne i linie komórkowe poddawane działaniu substancji w obecności cytochalazyny B

+ S9

Krótkie poddawanie

Poddawać działaniu przez 3–6 godzin w obecności S9;

usunąć S9 oraz podłoże użyte do badania;

dodać świeże podłoże i cytochalazynę B;

pobierać przez 1,5–2-krotność normalnego czasu trwania cyklu komórkowego po rozpoczęciu poddawania działaniu substancji.

– S9

Krótkie poddawanie

Poddawać działaniu substancji przez 3–6 godzin;

usunąć podłoże użyte do badania;

dodać świeże podłoże i cytochalazynę B;

pobierać przez 1,5–2-krotność normalnego czasu trwania cyklu komórkowego po rozpoczęciu poddawania działaniu substancji.

– S9

Wydłużone poddawanie

Poddawać działaniu substancji przez 1,5–2-krotność normalnego czasu trwania cyklu komórkowego w obecności cytochalazyny B;

pobierać po zakończeniu okresu poddawania działaniu substancji.

Linie komórkowe poddawane działaniu substancji bez cytochalazyny B

(identyczne z przedstawionymi powyżej harmonogramami podawania substancji chemicznej, z tym że nie dodaje się cytochalazyny B)

W przypadku jednowarstwowych hodowli komórek po zakończeniu 3–6 godzin poddawania działaniu substancji mogą być obecne komórki mitotyczne (można je rozpoznać po okrągłym kształcie i fakcie, że oddzielają się od powierzchni). Z uwagi na łatwość oddzielania się komórek mitotycznych można je utracić w momencie usuwania podłoża zawierającego badaną substancję chemiczną. Jeżeli istnieją dowody na znaczny wzrost liczby komórek mitotycznych w porównaniu z próbami kontrolnymi, co wskazuje na prawdopodobieństwo zatrzymania mitozy, należy zebrać komórki poprzez odwirowanie i dodać je z powrotem do hodowli, aby uniknąć utraty w trakcie czasu poboru komórek w fazie mitozy zagrożonych aberracjami mikrojądrowymi i chromosomowymi.

Pobieranie komórek i przygotowywanie preparatów

Każdą kulturę należy pobrać oddzielnie i oddzielnie poddać działaniu substancji. Przygotowanie komórek może obejmować hipotoniczne przetwarzanie komórek, ale etap ten nie jest konieczny, jeżeli w inny sposób osiągnięto odpowiednie rozprowadzenie komórek. Można stosować różne techniki przygotowywania preparatów, pod warunkiem że uzyskuje się wysokiej jakości preparaty komórkowe do celów liczenia. Komórki z nienaruszoną błoną komórkową i nienaruszoną cytoplazmą należy zatrzymać, aby umożliwić wykrycie mikrojąder oraz (w metodzie z wykorzystaniem blokera cytokinezy) wiarygodne zidentyfikowanie komórek dwujądrowych.

Preparaty można barwić przy użyciu różnych metod, takich jak metoda Giemsy lub fluorescencyjne barwniki specyficzne dla DNA. Wykorzystanie odpowiednich barwników fluorescencyjnych (np. oranżu akrydyny (78) lub Hoechst 33258 oraz pyroniny-Y (79)) może wyeliminować niektóre spośród artefaktów związanych ze stosowaniem barwnika niebędącego barwnikiem specyficznym dla DNA. Jeżeli informacje mechanistyczne dotyczące powstawania mikrojąder są przedmiotem zainteresowania, w celu określenia zawartości mikrojądra (całe chromosomy zostaną wybarwione, natomiast acentryczne fragmenty chromosomów nie zostaną wybarwione) można zastosować przeciwciała antykinetochorowe, FISH z sondami molekularnymi specyficznymi dla pancentromerów lub syntezę in situ przy udziale startera ze starterami specyficznymi dla pancentromerów, wraz z odpowiednim barwieniem kontrastowym DNA (16) (17). Inne metody rozróżnienia klastogenów i aneugenów można stosować, o ile okazały się skuteczne i zostały zweryfikowane. Przykładowo w przypadku niektórych linii komórkowych pożytecznych informacji mogą dostarczyć również pomiary jąder o liczbie chromosomów < 2n jako zdarzeń hipodiploidalnych przy użyciu technik takich jak analiza obrazowa, laserowa cytometria skaningowa lub cytometria przepływowa (80) (81) (82). Obserwacje morfologii jąder również mogą uwidocznić oznaki możliwej aneuploidii. Ponadto badanie aberracji chromosomowych w stadium metafazy, najlepiej w odniesieniu do komórek tego samego rodzaju i protokołu o podobnej czułości, również może stanowić pomocne narzędzie do określenia, czy mikrojądra powstały w wyniku złamań chromosomów (przy czym należy pamiętać, że badanie aberracji chromosomowych nie wykryje utraty chromosomów).

Analiza

Wszystkie preparaty, w tym te zawierające rozpuszczalnik oraz komórki niepoddane działaniu substancji (jeżeli zostały użyte) lub stanowiące kontrolę dodatnią, należy niezależnie zakodować przed przeprowadzeniem analizy mikroskopowej częstości występowania mikrojąder. Przy stosowaniu automatycznego systemu zliczania, na przykład cytometrii przepływowej, laserowej cytometrii skaningowej lub analizy obrazowej, należy zastosować odpowiednie techniki w celu kontrolowania wszystkich błędów systematycznych lub zniekształceń. Bez względu na to, czy do zliczania mikrojąder używa się platformy automatycznej, należy przeprowadzić jednoczesną ocenę CBPI, RI, RPD lub RICC.

W kulturach poddanych działaniu cytochalazyny B częstości występowania mikrojąder należy analizować w co najmniej 2 000 komórek dwujądrowych na stężenie i próbę kontrolną (83), których liczbę należy podzielić równo pomiędzy kontrpróby, jeżeli takowe są stosowane. W przypadku pojedynczych kultur na dawkę (zob. pkt 28) w takiej pojedynczej kulturze należy zliczyć co najmniej 2 000 komórek dwujądrowych (83) na kulturę. Jeżeli do celów liczenia jest dostępnych znacznie mniej niż 1 000 komórek dwujądrowych przypadających na kulturę (dla zduplikowanych kultur) lub 2 000 (dla pojedynczej kultury) na każde stężenie oraz jeżeli nie wykryto znacznego wzrostu liczby mikrojąder, należy powtórzyć test, stosując więcej komórek lub mniej cytotoksyczne stężenia, w zależności od tego, co jest bardziej właściwe. Należy zwrócić uwagę, by nie liczyć komórek dwujądrowych o nieregularnych kształtach lub gdy obydwa jądra różnią się znacznie pod względem wielkości. Ponadto nie należy mylić komórek dwujądrowych ze źle rozprowadzonymi komórkami wielojądrowymi. Komórki zawierające więcej niż dwa jądra nie powinny analizowane pod kątem mikrojąder, ponieważ podstawowa częstość występowania mikrojąder może być wyższa w przypadku tych komórek (84). Liczenie komórek jednojądrowych jest dopuszczalne, jeżeli wykazano, że badana substancja chemiczna zakłóca aktywność cytochalazyny B. W takich przypadkach pomocne może być powtórzenie testu bez udziału cytochalazyny B. Zliczenie nie tylko komórek dwujądrowych, lecz także jednojądrowych, może być źródłem pożytecznych informacji (85) (86), ale nie jest obowiązkowe.

W liniach komórkowych badanych bez poddania działaniu cytochalazyny B mikrojądra należy zliczyć w co najmniej 2 000 komórek dwujądrowych na stężenie testowe i próbę kontrolną (83), których liczbę należy podzielić równo pomiędzy kontrpróby, jeżeli takowe są stosowane. W przypadku stosowania pojedynczych kultur na stężenie (zob. pkt 28) w takiej pojedynczej kulturze należy zliczyć co najmniej 2 000 komórek na kulturę. Jeżeli do celów liczenia jest dostępnych znacznie mniej niż 1 000 komórek przypadających na kulturę (dla zduplikowanych kultur) lub 2 000 (dla pojedynczej kultury) na każde stężenie oraz jeżeli nie wykryto znacznego wzrostu liczby mikrojąder, należy powtórzyć test, stosując więcej komórek lub mniej cytotoksyczne stężenia, w zależności od tego, co jest bardziej właściwe.

W przypadku stosowania cytochalazyny B należy określić CBPI lub RI, aby ocenić proliferację komórek (zob. dodatek 2), używając co najmniej 500 komórek na kulturę. Jeżeli poddawanie działaniu substancji odbywa się w nieobecności cytochalazyny B, konieczne jest uzyskanie dowodów, że komórki w kulturze uległy podziałowi, jak omówiono w pkt 24–28.

Biegłość laboratorium

Aby ustalić wystarczające doświadczenie laboratorium w zakresie omawianego