EUR-Lex Access to European Union law

Back to EUR-Lex homepage

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 32017R0735

Regolament tal-Kummissjoni (UE) 2017/735 tal-14 ta' Frar 2017 li jemenda, għall-finijiet tal-adattament tiegħu għall-progress tekniku, l-Anness tar-Regolament (KE) Nru 440/2008 li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skont ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH) (Test b'rilevanza għaż-ŻEE. )

C/2017/0773

OJ L 112, 28.4.2017, p. 1–402 (BG, ES, CS, DA, DE, ET, EL, EN, FR, HR, IT, LV, LT, HU, MT, NL, PL, PT, RO, SK, SL, FI, SV)

In force

ELI: http://data.europa.eu/eli/reg/2017/735/oj

28.4.2017   

MT

Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea

L 112/1


REGOLAMENT TAL-KUMMISSJONI (UE) 2017/735

tal-14 ta' Frar 2017

li jemenda, għall-finijiet tal-adattament tiegħu għall-progress tekniku, l-Anness tar-Regolament (KE) Nru 440/2008 li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skont ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH)

(Test b'rilevanza għaż-ŻEE)

IL-KUMMISSJONI EWROPEA,

Wara li kkunsidrat it-Trattat dwar il-Funzjonament tal-Unjoni Ewropea,

Wara li kkunsidrat ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-18 ta' Diċembru 2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH), li jistabbilixxi Aġenzija Ewropea għas-Sustanzi Kimiċi, li jemenda d-Direttiva 1999/45/KE u li jħassar ir-Regolament (KEE) Nru 793/93 tal-Kunsill u r-Regolament (KE) Nru 1488/94 tal-Kummissjoni kif ukoll id-Direttiva 76/769/KEE tal-Kunsill u d-Direttivi tal-Kummissjoni 91/155/KEE, 93/67/KEE, 93/105/KE u 2000/21/KE (1), u b'mod partikolari l-Artikolu 13(2) tiegħu,

Billi:

(1)

Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 440/2008 (2) isemmi l-metodi ta' ttestjar li jintużaw biex jiġu ddeterminati l-proprjetajiet fiżikokimiċi, it-tossiċità u l-ekotossiċità ta' sustanzi kimiċi li għandhom jiġu applikati għall-finijiet tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006.

(2)

Huwa neċessarju li r-Regolament (KE) Nru 440/2008 jiġi aġġornat biex jinkludi metodi ta' ttestjar ġodda u aġġornati li ġew adottati reċentement mill-Organizzazzjoni għall-Kooperazzjoni u l-Iżvilupp Ekonomiċi (OECD) sabiex jitqies il-progress tekniku, u biex jiġi żgurat li jitnaqqas l-għadd ta' annimali li jintużaw għal skopijiet sperimentali, f'konformità mad-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill (3). Il-partijiet interessati ġew ikkonsultati dwar dan l-abbozz.

(3)

L-adattament għall-progress tekniku fih għoxrin metodi ta' ttestjar: metodu ġdid għad-determinazzjoni ta' proprjetà fiżikokimika, ħames metodi ta' ttestjar ġodda u wieħed aġġornat għall-valutazzjoni tal-ekotossiċità, żewġ metodi ta' ttestjar aġġornati sabiex jivvalutaw id-destin u l-imġiba ambjentali, u erba' metodi ta' ttestjar ġodda u seba' metodi ta' ttestjar aġġornati għad-determinazzjoni tal-effetti fuq is-saħħa tal-bniedem.

(4)

L-OECD regolarment tirrevedi l-linji gwida għall-ittestjar tagħha, sabiex tidentifika dawk li jkunu xjentifikament skaduti. Dan l-adattament għall-progress tekniku jħassar sitt metodi ta' ttestjar li l-linji gwida għall-ittestjar tal-OECD korrispondenti għalihom ġew ikkanċellati.

(5)

Ir-Regolament (KE) Nru 440/2008 għandu għalhekk jiġi emendat skont dan.

(6)

Il-miżuri previsti f'dan ir-Regolament huma skont l-opinjoni tal-Kumitat stabbilit bl-Artikolu 133 tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006,

ADOTTAT DAN IR-REGOLAMENT:

Artikolu 1

L-Anness tar-Regolament (KE) Nru 440/2008 huwa emendat skont l-Anness ta' dan ir-Regolament.

Artikolu 2

Dan ir-Regolament għandu jidħol fis-seħħ fl-għoxrin jum wara l-pubblikazzjoni tiegħu f' Il-Ġurnal Uffiċjali tal-Unjoni Ewropea.

Dan ir-Regolament għandu jorbot fl-intier tiegħu u japplika direttament fl-Istati Membri kollha.

Magħmul fi Brussell, l-14 ta' Frar 2017.

Għall-Kummissjoni

Il-President

Jean-Claude JUNCKER


(1)  ĠU L 396, 30.12.2006, p. 1.

(2)  Ir-Regolament tal-Kummissjoni (KE) Nru 440/2008 tat-30 ta' Mejju 2008 li jistabbilixxi metodi ta' ttestjar skont ir-Regolament (KE) Nru 1907/2006 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH) (ĠU L 142, 31.5.2008, p. 1).

(3)  Id-Direttiva 2010/63/UE tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tat-22 ta' Settembru 2010 dwar il-protezzjoni tal-annimali li jintużaw għal skopijiet xjentifiċi (ĠU L 276, 20.10.2010, p. 33).


ANNESS

L-Anness għar-Regolament (KE) Nru 440/2008 huwa emendat kif ġej:

(1)

Fil-Parti A, jiżdied il-Kapitolu li ġej:

“A.25   KOSTANTI TA' DISSOĊJAZZJONI FL-ILMA (METODU TA' WINKLER — METODU SPETTROFOTOMETRIKU — METODU KONDUTTOMETRIKU)

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 112 (1981) tal-OECD

Prerekwiżiti

Metodu analitiku xieraq

Is-solubilità fl-ilma

Informazzjoni ta' gwida

Formula strutturali

Il-konduttività elettrika għall-metodu konduttometriku

Dikjarazzjonijiet kwalifikati

Il-metodi ta' ttestjar jistgħu jsiru fuq sustanzi puri jew ta' grad kummerċjali. Għandhom jiġu kkunsidrati l-effetti possibbli tal-impuritajiet fuq ir-riżultati.

Il-metodu ta' Winkler mhuwiex adattat għal sustanzi b'solubilità baxxa (ara Soluzzjonijiet tat-test, iktar 'il quddiem).

Il-metodu spettrofotometriku huwa applikabbli biss għal sustanzi li għandhom spettri tal-assorbiment tal-UV/VIS effettivament differenti għall-forom dissoċjati u mhux dissoċjati. Dan il-metodu jista' jkun adattat ukoll għal sustanzi b'solubilità baxxa u għal dissoċjazzjonijiet mhux aċidi/bażi, eż. formazzjoni kumplessa.

Fil-każijiet li fihom tapplika l-ekwazzjoni ta' Onsager, jista' jintuża l-metodu konduttometriku, anki f'konċentrazzjonijiet moderatament baxxi u anki f'każijiet għal ekwilibriji mhux aċidi/bażi.

Dokumenti standard

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq metodi mogħtijin fir-referenzi elenkati fit-taqsima “Tagħrif” u fil-Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA tat-18 ta' Awwissu, 1978.

METODU — INTRODUZZJONI, SKOP, KAMP TA' APPLIKAZZJONI, RILEVANZA, APPLIKAZZJONI U LIMITI TAT-TEST

Id-dissoċjazzjoni ta' sustanza fl-ilma hija ta' importanza fil-valutazzjoni tal-impatt tagħha fuq l-ambjent. Tirregola l-forma tas-sustanza li min-naħa tagħha tistabbilixxi l-imġiba u t-trasport tagħha. Tista' taffettwa l-adsorbiment tas-sustanza kimika fuq il-ħamriji u s-sedimenti u l-assorbiment fiċ-ċelloli bijoloġiċi.

Definizzjonijiet u unitajiet

Id-dissoċjazzjoni hija l-qsim irriversibbli f'żewġ speċijiet kimiċi jew iktar li jistgħu jkunu joniċi. Ġeneralment il-proċess ikun indikat bi

RXR ++ X

u l-kostant ta' ekwilibriju tal-konċentrazzjoni li jirregola r-reazzjoni huwa

Formula

Pereżempju, fil-każ partikolari li fih R huwa idroġenu (is-sustanza hija aċidu), il-kostant huwa

Formula

jew

Formula

Sustanzi ta' referenza

Is-sustanzi ta' referenza li ġejjin mhux bilfors jintużaw fil-każijiet kollha meta tiġi investigata sustanza ġdida. Primarjament jiġu pprovduti sabiex kultant ikun jista' jiġi kkalibrat il-metodu u sabiex tingħata l-possibbiltà li jitqabblu r-riżultati meta jiġi applikat metodu ieħor.

 

pKa  (1)

Temp. f'°C

p-Nitrofenol

7.15

25 (1)

Aċidu benżojku

4.12

20

p-Kloroanilina

3.93

20

Tajjeb li wieħed ikollu sustanza b'bosta pKs kif indikat fil-Prinċipju tal-metodu, hawn taħt. Sustana bħal din tista' tkun:

Aċidu ċitriku

pKa (8)

Temp. f'°C

 

1) 3,14

20

 

2) 4,77

20

 

3) 6,39

20

Il-prinċipju tal-metodu ta' ttestjar

Il-proċess kimiku deskritt ġeneralment ftit ikun dipendenti mit-temperatura fil-medda ta' temperaturi rilevanti għall-ambjent. Id-determinazzjoni tal-kostant ta' dissoċjazzjoni teħtieġ kejl tal-konċentrazzjonijiet tal-forom dissoċjati u mhux dissoċjati tas-sustanza kimika. Bl-għarfien tal-istekjometrija tar-reazzjoni ta' dissoċjazzjoni indikata fid-Definizzjonijiet u unitajiet, iktar 'il fuq, jista' jiġi stabbilit il-kostant it-tajjeb. Fil-każ partikolari deskritt f'dan il-metodu ta' ttestjar, is-sustanza qiegħda ġġib ruħha bħala aċidu jew bażi, u d-determinazzjoni tista' ssir l-aħjar billi jiġu stabbiliti l-konċentrazzjonijiet rilevanti tal-forom jonizzati u mhux jonizzati tas-sustanza u l-pH tas-soluzzjoni. Ir-relazzjoni bejn dawn it-termini tingħata fl-ekwazzjoni għall-pKa f'Definizzjonijiet u unitajiet, iktar 'il fuq. Ċerti sustanzi jesibixxu iktar minn kostant ta' dissoċjazzjoni wieħed u jistgħu jiġu żviluppati ekwazzjonijiet simili. Uħud mill-metodi deskritti hawnhekk huma adattati wkoll għal dissoċjazzjoni mhux aċida/bażi.

Kriterji tal-kwalità

Ripetibbiltà

Il-kostant ta' dissoċjazzjoni għandu jiġi rreplikat (tal-inqas tliet determinazzjonijiet) għal unità fi ħdan ± 0.1 unità log.

DESKRIZZJONI TAL-PROĊEDURI TA' TEST

Hemm żewġ approċċi bażiċi għad-determinazzjoni tal-pKa. Wieħed jinvolvi titrazzjoni ta' ammont magħruf ta' sustanza b'aċidu jew bażi standard, kif xieraq; l-ieħor jinvolvi l-istabbiliment tal-konċentrazzjoni relattiva tal-forom jonizzati u mhux jonizzati u d-dipendenza tagħha mill-pH.

Preparamenti

Il-metodi bbażati fuq dawk il-prinċipji jistgħu jiġu kklassifikati bħala proċeduri ta' titrazzjoni, ta' spettrofotometrija u ta' konduttometrija.

Soluzzjonijiet tat-test

Għall-metodu ta' Winkler u l-metodu konduttometriku, is-sustanza kimika għandha tiġi dissolta f'ilma distillat. Għal metodi spettrofotometriċi u oħrajn, jintużaw soluzzjonijiet mewwieta. Il-konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test ma għandhiex taqbeż l-inqas wieħed bejn 0.01 M jew nofs il-konċentrazzjoni tas-saturazzjoni, u l-iktar forma pura disponibbli tas-sustanza għandha tintuża fit-tiswir tas-soluzzjonijiet. Jekk is-sustanza jkollha solubilità medja, tista' tiġi dissolta f'ammont żgħir ta' solvent li jitħallat mal-ilma qabel ma jiżdiedu l-konċentrazzjonijiet indikati hawn fuq.

Is-soluzzjonijiet għandhom jiġu vverifikati għall-preżenza ta' emulsjonijiet bl-użu ta' raġġ ta' Tyndall, speċjalment jekk jintuża kosolvent sabiex tissaħħaħ is-solubilità. Meta jintużaw soluzzjonijiet mewwieta, il-konċentrazzjoni tal-bafer ma għandhiex taqbeż iż-0.05 M.

Kundizzjonijiet tat-test

Temperatura

It-temperatura għandha tiġi kkontrollata sa tal-inqas ± 1 °C. Id-determinazzjoni idealment għandha ssir f'20 °C.

Jekk ikun hemm suspett ta' dipendenza sinifikanti fuq it-temperatura, id-determinazzjoni għandha ssir f'tal-inqas żewġ temperaturi oħrajn. L-intervalli tat-temperatura għandhom ikunu ta' 10 °C f'dan il-każ u l-kontroll tat-temperatura ± 0.1 °C.

Analiżijiet

Il-metodu sejjer jiġi stabbilit mill-għamla tas-sustanza li tkun qiegħda tiġi ttestjata. Irid ikun sensittiv biżżejjed sabiex ikunu jistgħu jiġu stabbiliti l-ispeċijiet differenti f'kull konċentrazzjoni tas-soluzzjoni tat-test.

It-twettiq tat-test

Il-metodu ta' Winkler

Is-soluzzjoni tat-test tiġi stabbilita b'titrazzjoni bis-soluzzjoni bażi jew aċida standard kif xieraq, billi titkejjel il-pH wara kull żieda ta' soluzzjoni titrata. Għandhom isiru minimu ta' 10 żidiet addizzjonali qabel il-punt ta' ekwivalenza. Jekk l-ekwilibriju jintlaħaq malajr biżżejjed, jista' jintuża potentjometru tar-reġistrazzjoni. Għal dan il-metodu, kemm il-kwantità totali tas-sustanza kif ukoll il-konċentrazzjoni tagħha jridu jkunu magħrufin bl-eżatt. Iridu jittieħdu prekawzjonijiet sabiex jiġi eskluż id-diossidu tal-karbonju. Dettalji dwar il-proċedura, il-prekawzjonijiet, u l-kalkolu jingħataw f'testijiet standard, eż. referenzi (1), (2), (3), (4).

Il-metodu spettrofotometriku

Tul tal-mewġa jinstab meta l-forom jonizzati u mhux jonizzati tas-sustanzi jkollhom koeffiċjenti ta' estinzjoni konsiderevolment differenti. L-ispettru ta' assorbiment tal-UV/VIS jinkiseb minn soluzzjonijiet ta' konċentrazzjoni kostanti taħt kundizzjoni tal-pH li fiha s-sustanza essenzjalment ma tkunx jonizzata u kompletament jonizzata u f'bosta pHs intermedji. Dan jista' jsir, jew billi jiżdiedu inkrementi ta' aċidu kkonċentrat (bażi) ma' volum relattivament kbir ta' soluzzjoni tas-sustanza f'bafer b'bosta komponenti, inizjalment f'pH għolja (baxxa) (ref. 5), jew billi jiżdiedu volumi ndaqs ta' soluzzjoni ewlenija tas-sustanza, pereżempju fl-ilma, il-metanol, ma' volumi kostanti ta' bosta soluzzjonijiet mewwieta li jkopru l-medda ta' pH mixtieqa. Mill-valuri tal-pH u l-assorbiment fit-tul tal-mewġa magħżula, jiġi kkalkolat numru suffiċjenti ta' valuri għall-pKa billi tintuża dejta minn tal-inqas 5 pHs meta s-sustanza tkun tal-inqas 10 fil-mija u inqas minn 90 fil-mija jonizzata. Id-dettalji sperimentali ulterjuri u l-metodu ta' kalkolu jintgħataw fir-referenza (1).

Il-metodu konduttometriku

Bl-użu ta' ċellola ta' kostant żgħir u magħruf taċ-ċellola, titkejjel il-konduttività ta' soluzzjoni ta' madwar 0.1 M tas-sustanza f'ilma tal-konduttività. Jitkejlu wkoll il-konduttivitajiet ta' numru ta' dilwizzjonijiet li jsiru bi preċiżjoni ta' din is-soluzzjoni. Il-konċentrazzjoni titnaqqas bin-nofs kull darba, u s-serje għandha tkopri tal-inqas ordni ta' kobor fil-konċentrazzjoni. Il-konduttività ta' limitazzjoni f'dilwizzjoni infinita tinstab billi jsir esperiment simili b'melħ NA u bl-estrapolazzjoni. Imbagħad il-grad ta' dissoċjazzjoni jkun jista' jiġi kkalkolat mill-konduttività ta' kull soluzzjoni bl-użu tal-ekwazzjoni Onsager, u b'hekk bl-użu tal-Liġi ta' Dilwizzjoni Ostwald jista' jiġi kkalkolat il-kostant ta' dissoċjazzjoni bħala K = α2C/(1 – α) fejn C hija l-konċentrazzjoni f'moli kull litru u α hija l-frazzjoni dissoċjata. Iridu jittieħdu prekawzjonijiet sabiex jiġi eskluż is-CO2. Id-dettalji sperimentali ulterjuri u l-metodu ta' kalkolu jintgħataw fit-testi standard u fir-referenzi (1), (6) u (7).

DEJTA U RAPPORTAR

Trattament tar-riżultati

Il-metodu ta' Winkler

Il-pKa hija kkalkolata għal 10 punti mkejlin fuq il-kurva ta' titrazzjoni. Jiġu kkalkolati d-devjazzjoni medja u d-devjazzjoni standard tat-tali valuri pKa. Plott tal-pH kontra l-volum tal-bażi jew l-aċidu standard għandha tkun inkluża flimkien ma' preżentazzjoni f'tabelli.

Il-metodu spettrofotometriku

L-assorbiment u l-pH huma mqegħdin f'tabella minn kull spettru. Tal-inqas ħames valuri għall-pKa huma kkalkolati mill-punti ta' data tal-ispettri intermedji, u jiġu kkalkolati d-devjazzjoni medja u dik standard ta' dawn ir-riżultati wkoll.

Il-metodu konduttometriku

Il-konduttività ekwivalenti Λ hija kkalkolata għal kull konċentrazzjoni tal-aċidu u għal kull konċentrazzjoni ta' taħlita ta' ekwivalenti ta' aċidu, flimkien ma' 0.98 ekwivalenti ta' idrossidu tas-sodju mingħajr karbonat. L-aċidu huwa eċċessiv sabiex jiġi evitat OH eċċessiv minħabba l-idroliżi. 1/Λ tiġi pplottjata kontra Λ _ tal-melħ tista' tinstab bl-estrapolazzjoni għal konċentrazzjoni żero.

Λo tal-aċidu tista' tiġi kkalkolata billi jintużaw il-valuri tat-tagħrif għal H+ u Na+. Il-pKa tista' tiġi kkalkolata minn α = Λio u Ka = α2C/(1 – α) għal kull konċentrazzjoni. Valuri aħjar għall-Ka jistgħu jinkisbu billi jsiru korrezzjonijiet għall-mobilità u l-attività. Għandhom jiġu kkalkolati d-devjazzjoni medja u d-devjazzjoni standard tal-valuri pKa.

Rapport tat-test

Id-dejta mhux ipproċessata u l-valuri pKa kkalkolati kollha għandhom jiġu sottomessi flimkien mal-metodu ta' kalkolu (idealment f'forma ta' tabelli, kif issuġġerit fir-ref. 1) u hekk ukoll il-parametri statistiċi deskritti iktar 'il fuq. Għall-metodi ta' Winkler, għandhom jingħataw id-dettalji tal-istandardizzazzjoni tas-soluzzjonijiet titrati.

Għall-metodu spettrofotometriku, għandhom jiġu sottomessi l-ispettri kollha. Għall-metodu konduttometriku, għandhom jiġu rrapportati d-dettalji tad-determinazzjoni tal-kostant taċ-ċelloli. Għandha tingħata informazzjoni dwar it-teknika użata, il-metodi analitiċi u l-għamla ta' kwalunkwe bafer użat.

Għandha tiġi rrapportata t-temperatura (jew temperaturi) tat-test.

TAGĦRIF

(1)

Albert, A. & Sergeant, E.P.: Ionization Constants of Acids and Bases, Wiley, Inc., New York, 1962.

(2)

Nelson, N.H. & Faust, S.D.: Acidic dissociation constants of selected aquatic herbicides, Env. Sci. Tech. 3, II, pp. 1186-1188 (1969).

(3)

ASTM D 1293 — Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(4)

Standard Method 242. APHA/AWWA/WPCF, Standard Methods for the Examination of Water and Waste Water, 14th Edition, American Public Health Association, Washington, D.C., 1976.

(5)

Clark, J. & Cunliffe, A.E.: Rapid spectrophotometric measurement of ionisation constants in aqueous solution. Chem. Ind. (London) 281, (March 1973).

(6)

ASTM D 1125 — Annual ASTM Standards, Philadelphia, 1974.

(7)

Standard Method 205 — APHA/AWWA/NPCF (see above (4)).

(8)

Handbook of Chemistry and Physics, 60th ed. CRC-Press, Boca Raton, Florida, 33431 (1980).”

(2)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.5 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.5   IRRITAZZJONI AKUTA TAL-GĦAJNEJN/KORRUŻJONI

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 405 tal-OECD (2012). Il-linji gwida tat-test tal-OECD għall-Ittestjar tas-Sustanzi Kimiċi jiġu riveduti kull ċertu żmien sabiex jiġi żgurat li dawn jirriflettu l-aħjar xjenza disponibbli. Fir-reviżjonijiet preċedenti ta' din il-linja gwida tat-test, inxteħtet attenzjoni speċjali fuq it-titjib permezz tal-evalwazzjoni tal-informazzjoni eżistenti kollha dwar is-sustanza kimika tat-test sabiex ikunu evitati testijiet żejda fuq l-annimali tal-laboratorju u b'hekk jiġi indirizzat it-tħassib dwar it-trattament xieraq tal-annimali. TG 405 (adottata fl-1981 u aġġornata fl-1987, l-2002, u l-2012) tinkludi r-rakkomandazzjoni li qabel ma jitwettaq it-test in vivo deskritt għal irritazzjoni akuta tal-għajnejn/korrużjoni, għandha ssir analiżi tal-piż tal-evidenza (1) fuq id-dejta rilevanti eżistenti. Meta ma jkunx hemm biżżejjed dejta disponibbli, huwa rakkomandat li dawn jiġu żviluppati bl-applikazzjoni ta' testijiet sekwenzali (2) (3). L-istrateġija tat-testijiet tinkludi t-twettieq ta' testijiet in vitro vvalidati u aċċettabbli u hija pprovduta bħala suppliment għal dan il-metodu ta' ttestjar. Għall-fini tar-Regolament (KE) Nru 1907/2006 dwar ir-reġistrazzjoni, il-valutazzjoni, l-awtorizzazzjoni u r-restrizzjoni ta' sustanzi kimiċi (REACH) (2), strateġija ta' ttestjar integrata hija inkluża fil-Gwida tal-ECHA rilevanti wkoll (21). L-ittestjar fl-annimali għandu jsir biss jekk jiġi stabbilit li dan huwa neċessarju wara li jiġu kkunsidrati l-metodi alternattivi disponibbli, u l-użu ta' dan jitqies xieraq. F'dan iż-żmien li fih qiegħed jiġi abbozzat dan il-metodu ta' ttestjar aġġornat, hemm każijiet li fihom l-użu ta' dan il-metodu ta' ttestjar għadu neċessarju jew meħtieġ minn ċerti oqfsa regolatorji.

L-aħħar aġġornament iffoka l-iktar fuq l-użu ta' analġeżiċi u anestetiċi mingħajr ma jitħalla impatt fuq il-kunċett u l-istruttura bażiċi tal-linja gwida tat-test. ICCVAM (3) u bord xjentifiku internazzjonali indipendenti ta' evalwazzjoni bejn il-pari rrevedew l-utilità u l-limitazzjonijiet tal-użu spiss ta' anestetiċi topiċi, analġeżiċi sistemiċi u punti ta' tmiem umanitarji matul l-ittestjar in vivo tas-sikurezza tal-irritazzjoni okulari (12). Ir-reviżjoni kkonkludiet li l-użu ta' anestetiċi topiċi u analġeżiċi sistemiċi jista' jevita ħafna mill-uġigħ u t-tbatija jew kull uġigħ u tbatija bla ma jaffettwa l-eżitu tat-test, u rrakkomandat li dawn is-sustanzi jintużaw dejjem. Dan il-metodu ta' ttestjar jieħu f'kunsiderazzjoni din ir-reviżjoni. Anestetiċi topiċi, analġeżiċi sistemiċi, u punti ta' tmiem umanitarji għandhom jintużaw ta' spiss matul l-ittestjar in vivo tal-korrużjoni u l-irritazzjoni akuta tal-għajnejn. L-eċċezzjonijiet għall-użu tagħhom għandhom ikunu ġġustifikati. L-irfinamenti deskritti f'dan il-metodu sejrin inaqqsu b'mod sostanzjali jew jevitaw l-uġigħ u t-tbatija tal-annimali f'ħafna mis-sitwazzjonijiet ta' ttestjar fejn ikun għad hemm bżonn li jsir ittestjar in vivo tas-sikurezza okulari.

L-immaniġġjar preventiv ibbilanċjat tal-uġigħ għandu jinkludi (i) pretrattament ta' rutina b'anestetiku topiku (eż. proparacaine jew tetracaine) u analġeżiku sistemiku (eż. buprenorphine), (ii) skeda ta' rutina ta' wara t-trattament tal-analġeżija sistemika (eż. buprenorphine u meloxicam), (iii) osservazzjoni, monitoraġġ u reġistrazzjoni skedati tal-annimali għal sinjali kliniċi ta' uġigħ u/jew tbatija, u (iv) osservazzjoni, monitoraġġ u reġistrazzjoni skedati tal-għamla, is-severità u l-progressjoni ta' kull korriment marbut mal-għajnejn. Huma pprovduti iktar dettalji fil-proċeduri aġġornati deskritti iktar 'il quddiem. Wara l-għoti tas-sustanza kimika tat-test, ma għandu jiġi applikat l-ebda anestetiku jew analġeżiku topiku addizzjonali sabiex tiġi evitata interferenza mal-istudju. L-analġeżiċi b'attività antiinfjammatorja (eż. meloxicam) ma għandhomx jiġu applikati b'mod topiku, u d-dożi użati b'mod sistemiku ma għandhomx jinterferixxu ma' effetti okulari.

Id-definizzjonijiet huma stabbiliti fl-Appendiċi għall-metodu ta' ttestjar.

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

Fl-interess kemm ta' xjenza għaqlija kif ukoll tat-trattament xieraq tal-annimali, testijiet in vivo ma għandhomx jiġu kkunsidrati qabel ma tkun ġiet evalwata d-dejta disponibbli kollha rilevanti għall-potenzjal ta' korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn mis-sustanza f'analiżi tal-piż tal-evidenza. Tali dejta għandha tinkludi evidenza minn studji eżistenti kemm fuq il-bnedmin u/jew l-annimali tal-laboratorju, l-evidenza ta' korrużjoni/irritazzjoni ta' sustanza jew taħlita waħda jew iktar strutturalment relatata, id-dejta li turi aċidità jew alkalinità qawwija tas-sustanza kimika (4) (5), u r-riżultati minn testijiet in vitro jew ex vivo vvalidati u aċċettati għall-korrużjoni tal-ġilda u l-korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn (6) (13) (14) (15) (16) (17). L-istudji setgħu ġew konklużi qabel l-analiżi tal-piż tal-evidenza, jew bħala riżultat tagħha.

Għal ċerti sustanzi kimiċi, tali analiżi tista' tindika l-ħtieġa għal studji in vivo dwar il-potenzjal tas-sustanza kimika għal korrużjoni/irritazzjoni okulari. F'dawn il-każijiet kollha, qabel ma jiġi kkunsidrat l-użu tat-test in vivo tal-għajnejn, idealment l-ewwel għandu jsir u jiġi evalwat studju tal-effetti in vitro u/jew in vivo ta' korrużjoni tal-ġilda tas-sustanza kimika skont l-istrateġija ta' ttestjar sekwenzjali fil-metodu ta' ttestjar B.4 (7) jew l-istrateġija ta' ttestjar integrat deskritta fil-Gwida tal-ECHA (21).

Strateġija ta' ttestjar sekwenzjali, li tinkludi t-twettiq ta' testijiet validati in vitro jew ex vivo tal-korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn, hija inkluża bħala Suppliment għal dan il-metodu ta' ttestjar u, għall-fini tar-REACH, fil-Gwida tal-ECHA (21). Huwa rakkomandat li din l-istrateġija ta' ttestjar tkun segwita qabel ma jinbdew it-testijiet in vivo. Għal sustanzi kimiċi ġodda, huwa rakkomandat approċċ gradwali ta' ttestjar għall-iżvilupp ta' dejta xjentifikament solida fuq il-korrużjoni/irritazzjoni tas-sustanza kimika. Għal sustanzi kimiċi eżistenti b'dejta mhux suffiċjenti dwar il-korrużjoni/irritazzjoni tal-ġilda u l-għajnejn, l-istrateġija tista' tintuża sabiex timla l-vojt fin-nuqqas ta' dejta. L-użu ta' strateġija jew proċedura ta' ttestjar differenti, jew id-deċiżjoni li ma jintużax approċċ gradwali ta' ttestjar, għandhom ikunu ġustifikati.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST IN VIVO

Wara pretrattament b'analġeżiku sistemiku u l-induzzjoni ta' anesteżija topika xierqa, is-sustanza kimika li trid tiġi ttestjata hija applikata f'doża waħda għal waħda mill-għajnejn tal-annimal tal-esperiment; l-għajn mhux trattata isservi bħala l-kontroll. Il-grad tal-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajn huwa evalwat billi jiġu kklassifikati l-leżjonijiet tal-konġuntiva, tal-kornea u tal-iris, f'intervalli speċifiċi. Effetti oħrajn fl-għajn u l-effetti sistemiċi avversi huma deskritti wkoll sabiex jipprovdu evalwazzjoni sħiħa tal-effetti. It-tul ta' żmien tal-istudju għandu jkun biżżejjed sabiex tkun evalwata r-reversibilità jew l-irreversibilità tal-effetti.

Annimali li juru sinjali ta' tbatija u/jew uġigħ severi fi kwalunkwe stadju tat-test jew leżjonijiet konsistenti mal-punti ta' tmiem umanitarji deskritti f'dan il-metodu ta' ttestjar (ara l-Paragrafu 26) għandhom jinqatlu b'mod umanitarju, u s-sustanza kimika għandha tiġi vvalutata kif xieraq. Il-kriterji għat-teħid tad-deċiżjoni sabiex jinqatlu b'mod umanitarju annimali fi stat ta' agunija jew tbatija severa huma spjegati f'dokument ta' Gwida tal-OECD (8).

IL-PREPARAMENTI GĦAT-TEST IN VIVO

L-għażla tal-ispeċijiet

Il-fenek albino huwa l-annimal tal-laboratorju preferut, u jintużaw annimali adulti żgħażagħ b'saħħithom. Għandha tingħata raġuni għall-użu ta' razez jew speċijiet oħrajn.

Preparazzjoni tal-annimali

Iż-żewġ għajnejn ta' kull annimal sperimentali magħżul b'mod provviżorju għat-testijiet għandhom ikunu eżaminati fi żmien 24 siegħa qabel ma jibda t-test. Ma għandhomx jintużaw annimali li juru irritazzjoni fl-għajnejn, difetti okulari, jew li korriment korneali preeżistenti.

Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf

L-annimali għandhom jinżammu f'gaġeġ individwali. It-temperatura tal-kamra tal-annimali sperimentali għandha tkun ta' 20 °C (± 3 °C) għall-fniek. Filwaqt li l-umdità relattiva għandha tkun tal-inqas ta' 30 % u idealment ma taqbiżx is-70 %, minbarra matul it-tindif tal-kamra, il-mira għandha tkun ta' 50-60 %. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Għandha tiġi evitata intensità eċċessiva tad-dawl. Għall-għalf, jistgħu jintużaw id-dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista mingħajr limitu ta' ilma tax-xorb.

PROĊEDURA TAT-TEST

L-użu ta' anestetiċi topiċi u analġeżiċi sistemiċi

Huma rakkomandati l-proċeduri li ġejjin sabiex jiġu evitati jew minimizzati l-uġigħ u t-tbatija fil-proċeduri ta' ttestjar tas-sikurezza okulari. Minflok, jistgħu jintużaw proċeduri alternattivi li ġew stabbiliti li jipprovdu evitar jew tnaqqis ekwivalenti jew aħjar tal-uġigħ u t-tbatija.

Sittin minuta qabel l-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (TCA), tingħata buprenorfina 0.01 mg/kg permezz ta' injezzjoni taħt il-ġilda (SC) sabiex tipprovdi livell terapewtiku ta' analġeżija sistemika. Mhuwiex magħruf jew mistenni li buprenorfina u analġeżiċi opojdi simili oħrajn mogħtijin sistemikament jibdlu r-risponsi okulari (12).

Ħames minuti qabel it-TCA, tiġi applikata taqtira waħda jew tnejn ta' anestetiku okulari topiku (eż. 0.5 % kloridrat tal-proparacaine jew 0.5 % kloridrat tat-tetracaine) fuq kull għajn. Sabiex tiġi evitata l-interferenza possibbli mal-istudju, huwa rakkomandat anestetiku topiku li ma fihx preservattivi. L-għajn ta' kull annimal li mhijiex ittrattata b'sustanza kimika tat-test, iżda li hija ttrattata b'anestetiċi topiċi, isservi ta' kontroll. Jekk jiġi antiċipat li s-sustanza kimika tat-test tikkawża uġigħ u tbatija sinifikanti, normalment mhux suppost tiġi ttestjata in vivo. Madankollu, f'każ ta' dubju jew meta jkun hemm bżonn li jsir hekk, għandhom jiġu kkunsidrati l-applikazzjonijiet addizzjonali tal-anestetiku topiku f'intervalli ta' 5 minuti qabel it-TCA. L-utenti għandhom ikunu jafu li bosta applikazzjonijiet ta' anestetiċi topiċi jistgħu potenzjalment jikkaġunaw żieda ħafifa fis-severità u/jew iż-żmien meħtieġ sabiex jgħibu leżjonijiet indotti kimikament.

sigħat wara t-TCA, jingħataw buprenorfina 0.01 mg/kg SC u meloxicam 0.5 mg/kg SC sabiex jipprovdu livell terapewtiku kontinwu ta' analġeżija sistemika. Filwaqt li ma hemm l-ebda dejta li tissuġġerixxi li meloxican għandu effetti antiinfjammatorji fuq l-għajn meta jingħata SC darba kuljum, meloxicam ma għandux jingħata sa tal-inqas 8 sigħat wara t-TCA sabiex tiġi evitata kwalunkwe interferenza possibbli mal-istudju (12).

Wara t-trattament inizjali ta' 8 sigħat wara t-TCA, buprenorfina 0.01 mg/kg SC għandha tingħata kull 12-il siegħa, flimkien ma' meloxicam 0.5 mg/kg SC kull 24 siegħa, sakemm jitilqu l-leżjonijiet okulari u ma jifdal ebda sinjal kliniku ta' uġigħ jew tbatija. Hemm disponibbli preparamenti għar-rilaxx sostnut ta' analġeżiċi li jistgħu jiġu kkunsidrati sabiex inaqqsu l-frekwenza tad-dożaġġ tal-analġeżiku.

Analġeżija “ta' salvataġġ” għandha tingħata minnufih wara t-TCA jekk l-analġeżija preventiva u l-anesteżija topika ma jkunux adegwati. Jekk annimal juri sinjali ta' uġigħ u tbatija matul l-istudju, tingħata minnufih doża “ta' salvataġġ” ta' buprenorfina 0.03 mg/kg SC u din tiġi ripetuta bi frekwenza massima ta' kull 8 sigħat, jekk ikun hemm bżonn, minflok iż-0.01 mg/kg SC kull 12-il siegħa. Imbagħad meloxicam 0.5 mg/kg SC jingħata kull 24 siegħa flimkien mad-doża “ta' salvataġġ” ta' buprenorfina, iżda mhux sa tal-inqas 8 sigħat wara t-TCA.

Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test

Is-sustanza kimika tat-test għandha titqiegħed fil-ħofra konġuntivali ta' waħda mill-għajnejn ta' kull annimal wara li l-kappell t'isfel tal-għajn jinġibed bil-galbu lil hinn mill-boċċa tal-għajn. Imbagħad il-kpiepel jinżammu bil-galbu magħluqin għal madwar sekonda sabiex jiġi evitat it-telf tal-materjal. L-għajn l-oħra, li tibqa' mingħajr trattament, isservi ta' kontroll.

Irrigazzjoni

L-għajnejn tal-annimali tat-test ma għandhomx jinħaslu għal tal-inqas 24 siegħa wara l-instillazzjoni tas-sustanza kimika tat-test, ħlief għas-solidi (ara l-paragrafu 18), u fil-każ ta' effetti korrużivi jew irritanti immedjati. Wara 24 siegħa, tista' ssir tlaħliħa sewwa jekk jitqies li din hija xierqa.

L-użu ta' grupp satellita ta' annimali għall-investigazzjoni tal-infuwenza tal-ħasil mhuwiex rakkommandat, sakemm ma jkunx xjetifikament ġustifikat. Jekk ikun meħtieġ grupp satellita, għandhom jintużaw żewġt ifniek. Il-kundizzjonijiet tal-ħasil għandhom ikunu dokumentati bir-reqqa, eż. il-ħin tal-ħasil; il-kompożizzjoni u t-temperatura tas-soluzzjoni tal-ħasil; id-durata, il-volum u l-veloċità tal-applikazzjoni.

Livell tad-doża

(1)   L-ittestjar tal-likwidi

Għat-testijiet tal-likwidi, tintuża doża ta' 0.1 ml. Ma għandhomx jintużaw sprejs bil-pompa għall-instillazzjoni diretta tas-sustanza kimika fl-għajn. L-isprej tal-likwidu għandu jitneħħa u jinġabar f'kontenitur qabel l-instillazzjoni ta' 0,1 ml fl-għajn.

(2)   L-ittestjar tas-solidi

Meta jsiru t-testijiet ta' solidi, pejsts, u sustanzi partikolati, l-ammont użat għandu jkollu volum ta' 0.1 ml jew piż ta' mhux aktar minn 100 mg. Is-sustanza kimika tat-test għandha tkun mitħuna fi trab fin. Il-volum tal-materjal solidu għandu jitkejjel wara li jkun kumpattat b'ġentilezza, eż. b'taptip fuq il-kontenitur tal-kejl. Jekk is-sustanza kimika solida tat-test ma tkunx tneħħiet mill-għajn tal-annimal tat-test b'mekkaniżmi fiżjoloġiċi fl-ewwel punt tal-ħin tal-osserazzjoni ta' siegħa wara t-trattament, l-għajn tista' titlaħlaħ b'ilma salin jew distillat.

(3)   L-ittestjar ta' aerosoli

Huwa rakkommandat li l-isprejs bil-pompa u l-aerosoli kollha jinġabru qabel l-instillazzjoni fl-għajn. L-unika eċċezzjoni hija għas-sustanzi kimiċi f'kontenituri tal-aerosoli b'pressjoni għolja, li ma jistgħux jinġabru minħabba l-vaporizzazzjoni. F'dawn il-każijiet, l-għajn għandha tinżamm miftuħa, u s-sustanza kimika tat-test tingħata fl-għajn f'tagħfisa sempliċi ta' madwar sekonda, minn distanza ta' 10 cm direttament quddiem l-għajn. Din id-distanza tista' tvarja jiddependi mill-pressjoni tal-isprej u l-kontenuti tiegħu. Għandha tingħata attenzjoni sabiex ma ssirx ħsara lill-għajn mill-pressjoni tal-isprej. F'każijiet xierqa, jista' jkun hemm il-ħtieġa li jkun evalutat il-potenzjal ta' ħsara “mekkanika” tal-għajn mill-qawwa tal-isprej.

Tista' tinħareġ stima tad-doża minn aerosol billi t-test jiġi ssimulat kif ġej: is-sustanza kimika tiġi sprejjata fuq karta tal-użin minn fetħa d-daqs ta' għajn ta' fenek imqiegħda direttament quddiem il-karta. Iż-żieda fil-piż tal-karta tintuża sabiex jiġi kkalkolat l-ammont sprejjat fl-għajn. Għal sustanzi kimiċi volatili, id-doża tista' tkun ikkalkolata bl-użin ta' kontenitur riċevitur qabel u wara t-tneħħija tas-sustanza kimika tat-test.

It-test inizjali (test in vivo tal-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajn bl-użu ta' annimal wieħed)

Huwa ferm rakkomandat li t-test in vivo jsir inizjalment bl-użu ta' annimal wieħed (ara s-Suppliment għal dan il-metodu ta' ttestjar: Strateġija ta' Ttestjar Sekwenzali għall-Irritazzjoni u l-Korrużjoni tal-Għajnejn). L-osservazzjonijiet għandhom jippermettu li jiġu stabbiliti s-severità u r-reversibilità qabel ma jsir it-test konfermatorju f'annimal ieħor.

Jekk ir-riżultati ta' dan it-test jindikaw li s-sustanza kimika tkun korrużiva jew severament irritanti għall-għajn bl-użu tal-proċedura deskritta, ma għandhomx isiru aktar testiet dwar l-irritazzjoni okulari.

Test konfermatorju (test in vivo tal-irritazzjoni tal-għajn b'annimali addizzjonali)

Jekk ma jkunx osservat effett korrużiv jew irritanti severament fit-test inizjali, ir-rispons irritanti jew negattiv għandu jiġi kkonfermat bl-użu ta' massimu ta' żewġ annimali addizzjonali. Jekk jiġi osservat effett irritanti fit-test inizjali, huwa rakkomandat li t-test konfermatorju jsir b'mod sekwenzjali f'annimal wieħed wara l-ieħor, minflok ma jiġu esposti żewġ annimali addizzjonali fl-istess ħin. Jekk it-tieni annimal juri effetti korrużivi jew irritanti severi, it-test m'għandux jitkompla. Jekk ir-riżultati mit-tieni annimal ikunu biżżejjed sabiex jippermettu li tiġi stabbilita klassifikazzjoni tal-periklu, ma għandu jsir ebda test ieħor.

Perjodu ta' osservazzjoni

Id-durata tal-perjodu ta' osservazzjoni għandha tkun biżżejjed sabiex ikunu evalwati l-kobor u r-reversibilità tal-effetti osservati. Madankollu, l-esperiment għandu jkun terminat fi kwalunkwe ħin jekk l-annimal juri sinjali kontinwi ta' uġigħ jew tbatija severi (8). Sabiex tkun stabbilita r-reversibilità tal-effetti, l-annimali għandhom ikunu osservati normalment għal 21 jum wara l-amministrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test. Jekk ir-reversibilità tidher qabel 21 jum, l-esperiment għandu jkun terminat f'dak il-waqt.

Osservazzjonijiet kliniċi u l-iggradar tar-reazzjonijiet tal-għajn

L-għajnejn għandhom jiġu evalwati b'mod komprensiv għall-preżenza jew l-assenza ta' leżjonijiet okulari siegħa wara t-TCA, segwita minn evalwazzjonijiet li tal-inqas isiru ta' kuljum. L-annimali għandhom jiġu evalwati bosta drabi kuljum għall-ewwel 3 ijiem sabiex jiġi żgurat li d-deċiżjonijiet dwar it-terminazzjoni jittieħdu fil-ħin. L-annimali tat-test għandhom jiġu evalwati b'rutina għad-durata sħiħa tal-istudju għal sinjali kliniċi ta' uġigħ u/jew tbatija (eż. mess jew ħakk ripetut tal-għajn, teptip eċċessiv tal-għajnejn, dmugħ eċċessiv) (9) (10) (11) tal-inqas darbtejn kuljum, b'tal-inqas 6 sigħat bejn l-osservazzjonijiet, jew iktar spiss jekk ikun hemm bżonn. Dan huwa neċessarju sabiex (i) l-annimali jiġu vvalutati b'mod adegwat għal evidenza ta' uġigħ u tbatija sabiex jittieħdu deċiżjonijiet informati fuq il-ħtieġa li jiżdied id-dożaġġ tal-analġeżiċi u (ii) l-annimali jiġu vvalutati għal evidenza ta' punti ta' tmiem umanitarji stabbiliti sabiex jittieħdu deċiżjonijiet informati dwar jekk huwiex xieraq li l-annimali jingħataw ewtanażija umanitarja, u sabiex jiġi żgurat li t-tali deċiżjonijiet jittieħdu fil-ħin. It-tilwin bil-fluworexxeina għandu jintuża ta' spiss u għandu jintuża bijomikroskopju korneali meta jitqies li dan huwa xiearq (eż. għall-valutazzjoni tal-fond tal-korriment meta jkun hemm ulċerazzjoni korneali) bħala għajnuna fid-detezzjoni u l-kejl tal-ħsara okulari, u sabiex jiġi evalwat jekk intlaħqux il-kriterji tal-punt ta' tmiem stabbiliti għall-ewtanażja umanitarja. Jistgħu jinġabru ritratti diġitali tal-leżjonijiet osservati għal referenza u sabiex jiġi pprovdut rekord permanenti tal-firxa ta' ħsara okulari. L-annimali għandhom jinżammu fit-test mhux aktar milli meħtieġ ladarba tinkiseb l-informazzjoni definita. L-annimali li juru uġigħ jew tbatija severi għandhom jinqatlu b'mod umanitarju mingħajr dewmien, u s-sustanza kimika għandha tiġi vvalutata kif xieraq.

L-annimali bil-leżjonijiet tal-għajnejn li ġejjin wara l-instillazzjoni għandhom jinqatlu b'mod umanitarju (irreferi għat-Tabella 1 għal deskrizzjoni tal-gradi tal-leżjonijiet): perforazzjoni korneali jew ulċerazzjoni korneali sinifikanti inkluża stafiloma; demm fil-kompartiment anterjuri tal-għajn; opaċità korneali tal-grad 4; assenza ta' rifless tad-dawl (grad 2 tar-rispons iridjali) li tippersisti għal 72 siegħa; ulċerazzjoni tal-membrana konġuntivali; nekrożi tal-membrana konġuntivali jew nittitanti; jew tqaxxir. Dan għaliex, ġeneralment, tali leżjonijiet ma jkunux reversibbli. Barra minn hekk, huwa rakkomandat li l-leżjonijiet okulari li ġejjin jistgħu jintużaw bħala punti ta' tmiem umanitarji sabiex jiġu terminati l-istudji qabel tmiem il-perjodu ta' osservazzjoni skedat ta' 21 jum. Dawn il-leżjonijiet jitqiesu bħala prekursuri ta' korrimenti irritanti jew korrużivi u korrimenti li mhumiex mistennijin li jitilqu sa tmiem il-perjodu ta' osservazzjoni ta' 21 jum: fond sever tal-korriment (eż. ulċerazzjoni korneali li testendi lil hinn mis-saffi superfiċjali tal-istroma), qerda tal-limbus > 50 % (kif evidenzjata minn tibjid tat-tessut konġuntivali), u infezzjoni severa tal-għajn (nixxija purulenti). Taħlita ta': vaskularizzazzjoni tal-wiċċ tal-kornea (jiġifieri pannu korneali); żona ta' tilwin bil-fluworexxeina li ma tonqosx maż-żmien skont valutazzjoni li ssir kuljum; u/jew nuqqas ta' riefiteljalizzazzjoni 5 ijiem wara l-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test jistgħu jitqiesu wkoll bħala kriterji potenzjalment siewja li jinfluwenzaw id-deċiżjoni klinika dwar it-terminazzjoni bikrija tal-istudju. Madankollu, dawn is-sejbiet waħedhom mhumiex biżżejjed sabiex jiġġustifikaw terminazzjoni bikrija tal-istudju. Ladarba jkunu ġew identifikati effetti okulari severi, għandu jiġi kkonsultat veterinarju tal-annimali tal-laboratorju inkarigat jew ikkwalifikat jew persunal imħarreġ sabiex jidentifika l-leżjonijiet kliniċi għal eżami kliniku sabiex jistabbilixxi jekk it-taħlita ta' dawn l-effetti jiġġustifikax terminazzjoni bikrija tal-istudju. Il-gradi ta' reazzjoni okulari (konġuntivi, kornea u iris) għandhom jinkisbu u jiġu rreġistrati wara siegħa, 24, 48 u 72 siegħa wara l-applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test (Tabella 1). L-annimali li ma jiżviluppawx leżjonijiet okulari jistgħu jiġu terminati mhux aktar qabel 3 ijiem wara l-instillazzjoni. L-annimali b'leżjonijiet okulari li mhumiex severi għandhom ikunu osservati sakemm ifiqu l-leżjonijiet, jew għal 21 jum, f'liema waqt l-istudju jkun terminat. L-osservazzjonijiet għandhom isiru u jiġu rreġistrati f'tal-inqas siegħa, 24 siegħa, 48 siegħa, 72 siegħa, 7 ijiem, 14-il jum, u 21 jum sabiex jiġi stabbilit l-istatus tal-leżjonijiet, u r-reversibilità jew l-irreversibilità tagħhom. Għandhom isiru osservazzjonijiet iktar frekwenti jekk ikun hemm bżonn sabiex jiġi stabbilit jekk l-annimal tat-test għandux jiġi ewtanizzat minħabba kunsiderazzjonijiet umanitarji jew jitneħħiex mill-istudju minħabba riżultati negattivi

Il-gradi tal-leżjonijiet okulari (Tabella 1) għandhom jiġu rreġistrati f'kull eżami. Kwalunkwe leżjoni oħra fl-għajn (eż. pannu korneali, tilwin, bidliet fil-kompatiment anterjuri) jew effett sistemiku avvers għandhom jiġu rrapportati wkoll.

L-eżami tar-reazzjonijiet jista' jkun iffaċilitat bl-użu tal-loupe binokulari, lampa tal-ferq tal-id, bijomikroskopju, jew xi apparat xieraq ieħor. Wara r-reġistrazzjoni tal-osservazzjonijiet wara 24 siegħa, l-għajnejn jistgħu jerġgħu jiġu eżaminati bl-għajnuna tal-fluworexxeina.

L-iggradar tar-risponsi okulari huwa neċċessarjament suġġettiv. Sabiex tkun imħeġġa l-armonizzazzjoni fl-iggradar tar-rispons okulari u sabiex ikunu megħjuna l-laboratorji tat-testijiet u dawk involuti fit-twettiq tall-osservazzjonijiet u tal-interpretazzjoni tagħhom, il-persunal li jwettaq l-osservazzjonijiet irid ikun imħarreġ b'mod adegwat fis-sistema tal-punteġġ użata.

DEJTA U RAPPORTAR

Evalwazzjoni tar-riżultati

Il-klassifikazzjonijiet tal-irritazzjoni okulari għandhom jiġu evalwati b'konnessjoni man-natura u s-severità tal-leżjonijiet, u r-reversibilità jew in-nuqqas ta' reversibilità tagħhom. Il-klassifikazzjonijiet individwali ma jirrapreżentawx standard assolut għall-proprjetajiet irritanti ta' sustanza kimika, minħabba li jiġu evalwati effetti oħrajn tas-sustanza kimika tat-test ukoll. Minflok, il-klassifikazzjonijiet individwali għandhom jitqiesu bħala valuri ta' referenza u jagħmlu sens biss meta jkunu sostnuti b'deskrizzjoni sħiħa u evalwazzjoni tal-osservazzjonijiet kollha.

Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

 

Il-ħsieb wara l-ittestjar in vivo: il-piż tal-evidenza ta' dejta preeżistenti tat-testijiet, inklużi r-riżultati minn strateġija ta' ttestjar sekwenzali:

deskrizzjoni tad-dejta rilevanti disponibbli minn testijiet preċedenti;

dejta miksuba f'kull stadju tal-istrateġija ta' ttestjar;

deskrizzjoni tat-testijiet in vitro mwettqin, inklużi d-dettalji tal-proċeduri, ir-riżultati miksubin bis-sustanzi kimiċi ta' referenza/tat-test;

deskrizzjoni tal-istudju in vivo dwar l-irritazzjoni/korrużjoni dermali li jkun sar, inklużi r-riżultati miksubin;

analiżi tal-piż tal-evidenza għat-twettieq tal-istudju in vivo.

 

Sustanza kimika tat-test:

dejta ta' identifikazzjoni (eż. isem is-sustanza u, jekk disponibbli, in-numru CAS, il-purità, l-impuritajiet magħrufin, is-sors, in-numru tal-lott);

in-natura fiżika u l-propjetajiet fiżikokimiċi (eż. il-pH, il-volatilità, is-solubilità, l-istabilità, ir-reattività mal-ilma);

fil-każ ta' taħlita, il-komponenti għandhom jiġu identifikati inkluża d-dejta ta' identifikazzjoni tas-sustanzi kostitwenti (eż. l-ismijiet tas-sustanzi kimiċi u, jekk disponibbli, in-numri tas-CAS) u l-konċentrazzjonijiet tagħhom;

id-doża applikata.

 

Il-veikolu:

l-identifikazzjoni, il-konċentrazzjoni (meta xieraq), il-volum użat;

il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu.

 

L-annimali tat-test:

l-ispeċijiet/ir-razza użati, ir-raġuni wara l-użu ta' annimali oħrajn u mhux fniek albino;

l-età ta' kull annimal fil-bidu tal-istudju;

in-numru ta' annimali ta' kull sess użati fit-test u fil-gruppi ta' kontroll (jekk meħtieġ);

il-piżijiet tal-annimali individwali, kemm fil-bidu kif ukoll fil-konklużjoni tat-test;

is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.

 

L-anestetiċi u l-analġeżiċi

id-dożi u l-ħinijiet ta' meta ngħataw l-anestetiċi topiċi u l-analġeżiċi sistemiċi;

jekk jintuża anestetiku lokali, l-identifikazzjoni, il-purità, it-tip, id-doża, u l-interazzjoni potenzjali mas-sustanza kimika tat-test.

 

Ir-riżultati:

id-deskrizzjoni tal-metodu użat sabiex jingħata punteġġ lill-irritazzjoni f'kull ħin tal-osservazzjoni (eż. lampa tal-ferq tal-id, bijomikroskopju, fluworexxeina);

it-tqegħid f'tabella tad-dejta dwar ir-rispons irritanti/korrużiv għal kull annimali f'kull ħin ta' osservazzjoni jew sat-tneħħija ta' kull animal mit-test;

id-deskrizzjoni narrattiva tal-grad u n-natura tal-irritazzjoni jew tal-korrożjoni osservata;

id-deskrizzjoni ta' kwalunkwe leżjoni oħra osservata fl-għajn (eż. vaskularizzazzjoni, formazzjoni tal-pannu korneali, aderenzi, tilwin);

id-deskrizzjoni tal-effetti avversi sistemiċi u lokali mhux okulari, reġistrazzjoni tas-sinjali kliniċi tal-uġigħ u t-tbatija, ritratti diġitali, u sejbiet istopatoloġiċi, jekk ikun hemm.

 

Diskussjoni dwar ir-riżultati

Interpretazzjoni tar-riżultati

L-estrapolazzjoni tar-riżultati tal-istudji dwar l-irritazzjoni tal-għajn fl-annimali tal-laboratorju għall-bnedmin hija valida biss sa ċertu punt limitat. F'ħafna każijiet, il-fenek albino huwa iktar sensittiv mill-bnedmin għal irritanti jew korrużivi okulari.

Għandha tingħata attenzjoni għall-interpretazzjoni tad-dejta sabiex tkun eskluża irritazzjoni li tirriżulta minn infezzjoni sekondarja.

TAGĦRIF

(1)

Barratt, M.D., et al. (1995), The Integrated Use of Alternative Approaches for Predicting Toxic Hazard, ECVAM Workshop Report 8, ATLA 23, 410 — 429.

(2)

de Silva, O., et al. (1997), Evaluation of Eye Irritation Potential: Statistical Analysis and Tier Testing Strategies, Food Chem. Toxicol 35, 159 — 164.

(3)

Worth A.P. and Fentem J.H. (1999), A general approach for evaluating stepwise testing strategies ATLA 27, 161-177.

(4)

Young, J.R., et al. (1988), Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals, Toxicol. In Vitro, 2, 19 — 26.

(5)

Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 — 231.

(6)

Fentem, J.H., et al. (1998), The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team, Toxicology in vitro 12, pp.483 — 524.

(7)

Kapitolu B.4 ta' dan l-Anness, Kapitolu B.4 ta' dan l-Anness.

(8)

OECD (2000), Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation. OECD Environmental Health and Safety Publications, Series on Testing and Assessment No. 19. (http://www.oecd.org/ehs/test/monos.htm).

(9)

Wright EM, Marcella KL, Woodson JF. (1985), Animal pain: evaluation and control, Lab Animal, May/June, 20-36.

(10)

National Research Council (NRC) (2008), Recognition and Alleviation of Distress in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.

(11)

National Research Council (NRC) (2009), Recognition and Alleviation of Pain in Laboratory Animals, Washington, DC: The National Academies Press.

(12)

ICCVAM (2010), ICCVAM Test Method Evaluation Report: Recommendations for Routine Use of Topical Anesthetics, Systemic Analgesics, and Humane Endpoints to Avoid or Minimize Pain and Distress in Ocular Safety Testing, NIH Publication No. 10-7514, Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences.

http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/OcuAnest- TMER.htm

(13)

Il-Kapitolu B.40 ta' dan l-Anness, Korrużjoni tal-Ġilda In Vitro: Test tar-Reżistenza Elettrika Transkutanja (TER).

(14)

Il-Kapitolu B.40bis ta' dan l-Anness, Korrużjoni tal-Ġilda In Vitro: Test Mudell tal-Ġilda tal-Bniedem.

(15)

OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.

(16)

Il-Kapitolu B.47 ta' dan l-Anness, Metodu ta' Ttestjar tal-Opaċità u l-Permeabilità tal-Kornea fil-Bovini għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn..

(17)

B.48 Metodu ta' Ttestjar tal-Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn.

(18)

U.S. EPA (2003), Label Review Manual: 3rd Edition, EPA737-B-96-001, Washington, DC: U.S., Environmental Protection Agency.

(19)

UN (2011), Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Fourth revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications.

(20)

KE (2008), ir-Regolament (KE) Nru Ir-Regolament (KE) Nru 1272/2008 tal-Parlament Ewropew u tal-Kunsill tas-16 ta' Diċembru 2008 dwar il-klassifikazzjoni, l-ittikkettar u l-imballaġġ tas-sustanzi u t-taħlitiet, li jemenda u jħassar id-Direttivi 67/548/KEE u 1999/45/KE, u li jemenda r-Regolament (KE) Nru 1907/2006. Il-ĠU L 353, 31.12.2008, p. 1.

(21)

ECHA Guidance on information requirements and chemical safety assessment, Chapter R.7a: Endpoint specific guidance.

http://echa.europa.eu/documents/10162/13632/information_requirements_r7a_en.pdf

Tabella 1

L-iggradar tal-leżjonijiet okulari

Il-kornea

Grad

Opaċità: il-grad ta' densità (il-qari għandu jittieħed mill-iktar żona densa) (*1)

 

Ebda ulċerazzjoni jew opaċità

0

Partijiet mifruxin jew imxerrdin tal-opaċità (għajr skurar ħafif ta' tleqqija normali); dettalji tal-iris viżibbli biċ-ċar

1

Parti trasluċida li tintlemaħ faċilment; dettalji tal-iris ftit oskurata

2

Parti nakruża; ebda dettalji tal-iris viżibbli; daqs tal-ħabba ftit li xejn jingħaraf

3

Kornea opaka; iris ma tistax tingħaraf mill-opaċità

4

Il-massimu possibbli: 4

 

L-iris

 

Normali

0

Tikmix fond ħafna, konġestjoni, nefħiet, iperemija ċirkumkorneali moderata; jew injezzjoni; iris reattiva għad-dawl (reazzjoni batuta titqies li hija effett

1

Emorraġija, qerda sinifikanti, jew ebda reazzjoni għad-dawl

2

Il-massimu possibbli: 2

 

Il-konġuntivi

 

Ħmura (tirreferi għal konġuntivi palpebrali u bulbari; esklużi l-kornea u l-iris)

 

Normali

0

Xi vini iperemiċi (injettati)

1

Kulur diffuż, krimżi; vini individwali ma jingħarfux faċilment

2

Aħmar mitfi diffuż

3

Il-massimu possibbli: 3

 

Il-kemożi

 

Nefħiet (tirreferi għall-kpiepel u/jew il-membrani nittitanti)

 

Normali

0

Xi nefħiet iktar min-normal

1

Nefħiet evidenti, b'everżjoni palpebrali parzjali

2

Nefħiet, bil-kpiepel kważi nofshom magħluqin

3

Nefħiet, bil-kpiepel iktar minn nofshom magħluqin

4

Il-massimu possibbli: 4

 

Appendiċi

DEFINIZZJONIJIET

Riserva tal-aċidi/alkali : Għal preparati aċidiċi, dan huwa l-ammont (g) ta' idrossidu tas-sodju/100 g tal-preparat meħtieġ għall-produzzjoni ta' pH speċifika. Għal preparati alkalini, dan huwa l-ammont (g) ta' idrossidu tas-sodju ekwivalenti għall-aċidu sulfuriku g/100 g tal-preparat meħtieġ għall-produzzjoni ta' pH speċifika (Young et al. 1988).

Sustanza Kimika : Sustanza jew taħlita.

Mhux irritanti : Is-sustanzi li mhumiex ikklassifikati bħala irritanti okulari tal-Kategorija I, II jew III tal-EPA; jew irritanti tal-għajnejn tal-GHS tal-Kategorija 1, 2, 2A, jew 2B; jew il-Kategorija 1 jew 2 tal-UE (17) (18) (19).

Korrużiva okulari : (a) Sustanza kimika li tikkawża ħsara irreversibbli fit-tessut għall-għajn; (b) Sustanzi kimiċi li huma klassifikati bħala irritanti tal-għajnejn tal-GHS tal-Kategorija 1, jew irritanti okulari tal-Kategorija I tal-EPA, jew il-Kategorija 1 tal-UE (17) (18) (19).

Irritanti okulari : (a) Sustanza kimika li tipproduċi bidla reversibbli fl-għajn; (b) Sustanzi kimiċi li huma kklassifikati bħala irritanti okulari tal-Kategorija II jew III tal-EPA; jew irritanti tal-għajnejn tal-GHS tal-Kategorija 2, 2A jew 2B; jew il-Kategorija 2 tal-UE (17) (18) (19).

Irranti okulari severa : (a) Sustanza kimika li tikkawża ħsara fit-tessut fl-għajn li ma tfiqx fi żmien 21 mill-applikazzjoni jew tikkaġuna tnaqqis fiżiku sever tal-vista; (b) Sustanzi kimiċi li huma klassifikati bħala irritanti tal-għajnejn tal-GHS tal-Kategorija 1, jew irritanti okulari tal-Kategorija I tal-EPA, jew il-Kategorija 1 tal-UE (17) (18)

Sustanza kimika tat-test : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.

Approċċ sekwenzjali : Strateġija ta' ttestjar gradwali li biha l-informazzjoni eżistenti kollha dwar sustanza kimika tat-test tiġi riveduta, f'ordni speċifiku, permezz ta' proċess tal-piż tal-evidenza f'kull livell sabiex jiġi ddeterminat jekk hemmx biżżejjed informazzjoni disponibbli għal deċiżjoni dwar il-klassifikazzjoni tal-periklu, qabel ma wieħed jgħaddi għal-livell li jmiss. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, ma jkun meħtieġ l-ebda ttestjar ieħor. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test ma jkunx jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, għandha ssir proċedura ta' ttestjar sekwenzjali fuq l-annimali sakemm tkun tista' ssir klassifikazzjoni mhux ekwivoka.

Piż tal-evidenza (proċess) : Il-vantaġġi u l-iżvantaġġi ta' ġabra ta' informazzjoni jintużaw bħala l-bażi għal konklużjoni li jaf ma tkunx evidenti mid-dejta individwali.

SUPPLIMENT GĦALL-METODU TA' TTESTJAR B.5  (4)

STRATEĠIJA TA' TTESTJAR SEKWENZALI GĦALL-IRRITAZZJONI U L-KORRUŻJONI TAL-GĦAJNEJN).

Kunsiderazzjonijiet ġenerali

Fl-interessi ta' xjenza valida u t-trattament xieraq tal-annimali, huwa importanti li jkun evitat l-użu bla bżonn tal-annimali, u li jitnaqqas l-ittestjar li aktarx li jipproduċi risponsi severi fl-annimali. L-informazzjoni kollha dwar sustanza kimika relatata mal-potenzal tagħha ta' irritazzjoni/korrużjoni okulari għandha tkun evalwata qabel ma jiġi kkunsidrat l-ittestjar in vivo. Jaf diġà jkun hemm biżżejjed evidenza sabiex sustanza kimika tat-test tkun tista' tiġi kklassifikata fir-rigward tal-potenzjal tagħha ta' irritazzjoni jew korrużjoni tal-għajnejn mingħajr il-ħtieġa li jsiru testijiet fuq annimali tal-laboratorju. Għalhekk, l-użu ta' analiżi tal-piż tal-evidenza u strateġija ta' ttestjar sekwenzjali sejjer inaqqas il-ħtieġa ta' testijiet in vivo, speċjalment jekk is-sustanza kimika aktarx li tipproduċi risponsi severi.

Huwa rakkommandat li tintuża analiżi tal-piż tal-evidenza għall-evalwazzjoni tal-informazzjoni eżistenti li tappartjeni għas-sustanzi ta' irritazzjoni u korrużjoni tal-għajnejn u sabiex jiġi stabbilit jekk għandhomx isiru studji addizzjonali, apparti minn studji in vivo fuq l-għajnejn, sabiex jgħinu fil-karatterizzazzjoni tat-tali potenzjal. Meta jkunu meħtieġa aktar studji, huwa rakkommandat li tintuża l-istrateġija ta' ttestjar sekwenzali sabiex tiġi żviluppata d-dejta sperimentali rilevanti. Għal sustanzi li ma jkollhom l-ebda storja ta' ttestjar, għandha tintuża l-istrateġija ta' ttestjar sekwenzali sabiex tiġi żviluppata d-dejta meħtieġa għall-evalwazzjoni tal-korrużjoni/irritazzjoni tagħhom għall-għajnejn. L-istrateġija ta' ttestjar inizjali deskritta f'dan is-Suppliment ġiet żviluppata f'sessjoni ta' ħidma tal-OECD (1). Imbagħad kompliet tiġi kkonfermata u elaborata fis-Sistema ta' Klassifikazzjoni Integrata Armonizzata għall-Effetti fuq is-Saħħa tal-Bniedem u l-Ambjent tas-Sustanzi Kimiċi, kif approvata mit-28 Laqgħa Konġunta tal-Kumitat dwar is-Sustanzi Kimiċi u l-Grupp ta' Ħidma dwar is-Sustanzi Kimiċi, f'Novembru 1998 (2), u aġġornata minn grupp ta' esperti tal-OECD fl-2011.

Għad li din l-istrateġija ta' ttestjar mhijiex parti integrata mill-metodu ta' ttestjar B.5, tesprimi l-approċċ rakkomandat għad-determinazzjoni tal-proprjetajiet ta' irritazzjoni/korrużjoni tal-għajnejn. Dan l-approċċ jirrappreżenta kemm l-aħjar prattika kif ukoll il-parametru referenzjarju etiku għall-ittestjar in vivo għall-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajn. Il-metodu ta' ttestjar jipprovdi gwida għat-twettieq tat-test in vivo u jiġbor fih il-fatturi li għandhom ikunu indirizzati qabel ma jkun ikkunsidrat tali test. L-istrateġija ta' ttestjar sekwenzali tipprovdi approċċ tal-piż tal-evidenza għall-evalwazzjoni ta' dejta eżistenti dwar il-proprjetajiet ta' irritazzjoni/korrużjoni tal-għajnejn tas-sustanzi kimiċi u approċċ sekwenzjali għall-ġenerazzjoni tad-dejta rilevanti dwar sustanzi li dwarhom hemm bżonn li jsiru studji addizzjonali jew li dwarhom ma sar l-ebda studju. L-istrateġija l-ewwel tinkludi t-twettiq ta' testijiet in vitro jew ex vivo vvalidati u aċċettati u mbagħad ta' studji TM B.4 f'ċirkustanzi speċifiċi (3) (4).

Deskrizzjoni tal-istrateġija ta' ttestjar gradwali

Qabel ma jitwettqu t-testijiet bħala parti mill-istrateġija ta' ttestjar sekwenżjali (Figura), l-informazzjoni kollha disponibbli għandha tkun evalwata sabiex jiġi stabbilit hemmx bżonn li jsir ittestjar in vivo fuq l-għajnejn. Għalkemm tista' tinkiseb informazzjoni sinifikanti mill-evalwazzjoni ta' parametri singoli (eż. pH estrema), għandha tiġi vvalutata l-informazzjoni kollha eżistenti. Id-dejta rilevanti kollha dwar l-effetti tas-sustanza kimika inkwistjoni, u tal-analogi strutturali tagħha, għandha tiġi evalutata fit-teħid tad-deċiżjoni tal-piż tal-evidenza, u għandu jiġi ppreżentat ir-raġunar wara d-deċiżjoni. L-enfasi ewlenija għandha tinxteħet fuq dejta eżistenti dwar il-bniedem u l-annimali rigward is-sustanza kimika, segwita mill-eżitu tal-ittestjar in vitro jew ex vivo. Studji in vivo ta' sustanzi kimiċi korrużivi għandhom ikunu evitati, kull meta dan ikun possibbli. Il-fatturi meqjusa għall-istrateġija tat-testijiet jinkludu:

 

Evalwazzjoni tad-dejta eżistenti dwar il-bniedem u/jew l-annimali u/jew dejta in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati (Stadju 1).

L-ewwel għandha tiġi kkunsidrata dejta eżistenti dwar il-biedem, eż. studji kliniċi u okkupazzjonali, u rapporti ta' każijiet, u/jew dejta dwar testijiet fuq l-animali minn studji okulari u/jew dejta in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati għall-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajnejn, għaliex din tipprovdi informazzjoni marbuta b'mod dirett mal-effetti fuq l-għajnejn. Wara, għandha tiġi evalwata d-dejta disponibbli minn studji fuq il-bniedem u/jew l-annimali li fihom tiġi investigata l-korrużjoni/irritazzjoni dermali, u/jew studji in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati għall-korrużjoni tal-ġilda. Sustanzi kimiċi b'korrużjoni jew irritazzjoni severa magħrufa, fuq l-għajnejn, m'għandhomx ikunu instillati fuq l-għajnejn tal-annimali, u l-anqas sustanzi kimiċi li juru effetti irritanti korrużivi jew severi fuq il-ġilda; dawn is-sustanzi kimiċi għandhom jitqiesu li huma korrużivi u/jew irritanti għall-għajnejn ukoll. Sustanzi kimiċi b'biżżejjed evidenza ta' nuqqas ta' korrużjoni u irritazzjoni minn studji okulari mwettqin fl-imgħoddi ma għandhomx jiġu ttestjati fi studji in vivo fuq l-għajnejn ukoll.

 

Analiżi tar-relazzjonijiet struttura-attività (SAR) (Stadju 2).

Ir-riżultati tat-testijiet fuq sustanzi kimiċi strutturalment relatati għandhom ikunu ikkunsidrati, jekk disponibbli. Meta jkun hemm biżżejjed dejta dwar il-bniedem u/jew l-annimali fuq sustanzi relatati strutturalment jew taħlitiet tat-tali sustanzi li tindika l-potenzjal ta' korrużjoni/irritazzjoni tagħhom għall-għajnejn, jista' jiġi supponut li s-sustanza kimika tat-test sejra tipproduċi l-istess risponsi. F'dawk il-każijiet, is-sustanza kimika jaf ma jkollhiex bżonn tiġi ttestjata. Dejta negattiva mill-istudji fuq sustanzi strutturalment relatati jew taħlitiet ta' tali sustanzi ma tkunx tikkostitwixxi evidenża suffiċjenti ta' nuqqas ta' korrużjoni/irritazzjoni ta' sustanza kimika permezz tal-istrateġija ta' ttestjar sekwenzjali. Għandhom jintużaw approċċi SAR vvalidati u aċċettati sabiex jiġi identifikat il-potenzjal ta' korrużjoni u irritazzjoni għal effetti dermali u dawk okulari.

 

Propjetajiet fiżikokimiċi u r-reattività kimika (Stadju 3).

Sustanzi kimiċi li jesibixxu pH estremi bħal ≤ 2.0 jew ≥ 11.5 jista' jkollhom effetti lokali qawwija. Jekk il-pH estrema hija l-bażi għall-identifikazzjoni ta' sustanza kimika bħala korrużiva jew irritanti għall-għajnejn, allura r-riserva aċida/alkalina tagħha (il-kapaċità mewwieta) tista' tkun ikkunsidrata wkoll (5)(6)(7). Jekk il-kapaċità mewwieta tissuġġerixxi li sustanza kimika jaf ma tkunx korrużiva għall-għajnejn (jiġifieri sustanzi kimiċi b'pH estrema u riserva aċida/alkalina baxxa), għandhom isiru iktar testijiet sabiex dan jiġi kkonfermat, idealment billi jintuża test in vitro jew ex vivo vvalidat u aċċettat (ara l-paragrafu 10).

 

Kunsiderazzjoni ta' informazzjoni eżistenti oħra (Stadju 4).

L-informazzjoni disponibbli kollha dwar it-tossiċità sistemika permezz tar-rotta dermali għandha tkun evalutata f'dan l-istadju. It-tossiċità dermali akuta tas-sustanza kimika tat-test għandha tkun ikkunsidrata wkoll. Jekk ikun intwera li s-sustanza kimika tat-test hija ferm tossika bir-rotta dermali, jaf ma jkunx hemm bżonn li tkun ittestjata fl-għajnejn. Għalkemm mhux bilfors li jkun hemm relazzjoni bejn it-tossiċità akuta dermali u l-irritazzjoni/korrużjoni tal-għajnejn, jista' jkun supponut li jekk aġent ikun ferm tossiku permezz tar-rotta dermali, dan ikun jesibixxi wkoll tossiċità għolja meta jkun instillat fl-għajnejn. Tali dejta tista' tkun ikkunsidrata wkoll bejn l-Istadji 2 u 3.

 

Valutazzjoni tal-korrużjoni dermali tas-sustanza kimika jekk tkun meħtieġa għal finijiet regolatorji wkoll (Stadju 5).

Il-potenzjal ta' korrużjoni u irritazzjoni severa tal-ġilda għandu jiġi evalwat l-ewwel skont il-metodu ta' ttestjar B.4 (4) u s-Suppliment li jakkumpanjah (8), inkluż l-użu ta' metodi ta' ttestjar dwar il-korrużjoni tal-ġilda in vitro aċċettati internazzjonalment u vvalidati (9) (10) (11). Jekk jintwera li s-sustanza kimika tipproduċi korrużjoni jew irritazzjoni serja tal-ġilda, tista' tiġi kkunsidrata wkoll li hija korrużiva jew irritanti b'mod sever għall-għajnejn. B'hekk, ma jkun meħtieġ li jsir ebda test ulterjuri. Jekk is-sustanza kimika ma tkunx korrużiva jew severament irritanti għall-ġilda, għandu jsir test in vitro jew ex vivo fuq l-għajnejn.

 

Ir-riżultati mit-testijiet in vitro jew ex vivo (Stadju 6).

Is-sustanzi kimiċi li jkunu wrew proprjetajiet korrużivi jew irritanti severi f'test in vitro jew ex vivo (12) (13) li jkun ġie vvalidat u aċċettat internazzjonalment għall-valutazzjoni speċifika tal-korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn, ma għandhomx bżonn jiġu ttestjati fl-annimali. Jista' jkun supponut li tali sustanzi kimiċi jipproduċu l-istess effetti severi in vivo. Jekk ma jkunx hemm testijiet in vitro/ex vivo vvalidati u aċċettati disponibbli, wieħed għandu jaqbeż l-Istadju 6 u jmur direttament għall-Istadju 7.

 

Test in vivo fuq il-fniek (Stadji 7 u 8):

L-ittestjar okulari in vivo għandu jibda b'test inizjali li juża annimal wieħed. Jekk ir-riżultati ta' dan it-test jindikaw li s-sustanza kimika tkun severament irritanti jew korrużiva għall-għajnejn, ma għandux isir iktar ittestjar. Jekk dak it-test ma jiżvelax effetti korrużivi jew irritanti severi, isir test konfermatorju b'żewġ annimali oħrajn. Skont ir-riżultati tat-test konfermatorju, jaf ikun hemm bżonn ta' iktar testijiet. [ara l-metodu ta' ttestjar B.5]

STRATEĠIJA GĦALL-ITTESTJAR U L-EVELWAZZJONI TA' IRRITAZZJONI/KORRUŻJONI TAL-GĦAJNEJN

 

Attività

Sejba

Konklużjoni

1

Dejta eżistenti dwar il-bniedem u/jew l-annimali, u/jew dejta in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati li juru l-effetti fuq l-għajnejn

Ħsara severa għall-għajnejn

Punt finali apikali; ikkunsidra korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.

Irritazzjoni għall-għajnejn

Punt finali apikali; ikkunsidra irritazzjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.

Ma hemmx korrużjoni/ma hemmx irritazzjoni għall-għajnejn

Punt finali apikali; ikkunsidra li ma hemmx korrużjoni u ma hemmx irritazzjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.

Dejta eżistenti dwar il-bniedem u/jew l-annimali, u/jew dejta in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati li juru l-effetti korrużivi fuq il-ġilda

Korrużjoni għall-ġilda

Assumi korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.

Dejta eżistenti dwar il-bniedem u/jew l-annimali, u/jew dejta in vitro minn metodi aċċettati internazzjonalment u vvalidati li juru l-effetti irritanti severi fuq il-ġilda

Irritazzjoni severa għall-ġilda

Assumi irritazzjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test

 

 

ebda informazzjoni disponibbli, jew l-informazzjoni disponibbli mhijiex konklużiva

 

 

 

 

2

Agħmel SAR għall-korrużjoni/irritazzjoni tal-għajnejn

Hija mbassra ħsara severa għall-għajnejn

Assumi korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.

Hija mbassra irritazzjoni għall-għajnejn

Assumi irritazzjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.

Ikkunsidra SAR għall-korrużjoni tal-ġilda

Hija mbassra korrużjoni għall-ġilda

Assumi korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.

 

 

Ma tista' ssir ebda previżjoni, jew il-previżjonijlet mhumiex konklużivi jew huma negattivi

 

 

 

 

3

Kejjel il-pH (kapaċità mewwieta, jekk rilevanti)

pH ≤ jew ≥ 11,5 (b'kapaċità mewwieta għolja, jekk rilevanti)

Assumi korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn tal-ebda test.

 

 

2 < H < 11,5, jew pH ≤ 2,0 jew ≥11,5 b'kapaċità mewwieta baxxa/b'ebda kapaċità mewwieta, jekk rilevanti

 

 

 

 

4

Ikkunsidra d-dejta eżistenti dwar it-tossiċità sistemika permezz tar-rotta dermali

Tossiċità għolja f'konċentrazzjonijiet li jkunu ttestjati fuq l-għajn.

Is-sustanza kimika tkun tossika wisq sabiex tiġi ttestjata. Ma hemm bżonn tal-ebda test.

 

 

Tali informazzjoni mhijiex disponibbli, jew is-sustanza kimika mhijiex tossika ħafna

 

 

 

 

5

Ivvaluta l-potenzjal ta' korrużjoni tal-ġilda b'esperimenti skont l-istrateġija ta' ttestjar fil-kapitolu B.4 ta' dan l-Anness jekk ikun hemm bżonn li jsir hekk għal finijiet regolatorji wkoll

Rispons korrużiv jew irritanti severament

Assumi korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.

 

 

Is-sustanza kimika mhijiex korrużiva jew severament irritanti għall-ġilda

 

 

 

 

6

Agħmel test(ijiet) okulari in vitro jew ex vivo vvalidat(i) u aċċettat(i)

Rispons korrużiv jew irritanti severament

Assumi korrużjoni jew irritazzjoni severa għall-għajnejn, diment li t-test imwettaq jista' jintuża sabiex jidentifika korrużivi/irritanti severi u s-sustanza kimika tkun fi ħdan id-dominju tal-applikabilità tat-test. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.

Rispons irritanti

Assumi irritazzjoni għall-għajnejn, diment li t-test(ijiet) imwettaq jista' jintuża sabiex jidentifika kif suppost korrużivi/irritanti severi u irritanti, u s-sustanza kimika hija fi ħdan id-dominju tal-applikabilità tat-test(ijiet). Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.

Rispons mhux irritanti

Assumi li ma hemmx irritazzjoni għall-għajnejn, diment li t-test(ijiet) imwettaq jista' jintuża sabiex jidentifika kif suppost mhux irritanti, jagħmel distinzjoni kif suppost ta' dawn minn sustanzi kimiċi li huma irritanti, irritanti severi, jew korrużivi okulari, u s-sustanza kimika hija fi ħdan id-dominju tal-applikabilità tat-test. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.

 

 

Test(ijiet) in vitro jew ex vivo vvalidat(i) u aċċettat(i) ma jistgħux jintużaw sabiex tintlaħaq konklużjoni

 

 

 

 

7

Agħmel test inizjali tal-għajnejn in vivo fuq il-fniek billi tuża annimal wieħed

Ħsara severa għall-għajnejn

Ikkunsidra korrużjoni lill-għajnejn. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.

 

 

L-ebda ħsara severa, jew l-ebda rispons

 

 

 

 

8

Agħmel test konfermatorju billi tuża annimal addizzjonali wieħed jew tnejn

Korrużjoni jew irritazzjoni

Ikkunsidra korrużjoni jew irritazzjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.

Ma hemmx korrużjoni jew irritazzjoni

Ikkunsidra li ma hemmx irritazzjoni u ma hemmx korrużjoni għall-għajnejn. Ma hemm bżonn li jsir ebda test ieħor.

TAGĦRIF

(1)

OECD (1996) OECD Test Guidelines Programme: Final Report of the OECD Workshop on Harmonization of Validation and Acceptance Criteria for Alternative Toxicological Test Methods. Li sar f'Solna, l-Iżvezja, 22 — 24 ta' Jannar 1996 (http://www.oecd.org/ehs/test/background.htm).

(2)

OECD (1998) Harmonized Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances, as endorsed by the 28th Joint Meeting of the Chemicals Committee and the Working Party on Chemicals, November 1998 (http://www.oecd.org/ehs/Class/HCL6.htm).

(3)

Worth, A.P. and Fentem J.H. (1999). A General Approach for Evaluating Stepwise Testing Strategies. ATLA 27, 161-177.

(4)

Kapitolu B.4 ta' dan l-Anness, Irritazzjoni/Korrużjoni Dermali Akuta.

(5)

Young, J.R., How, M.J., Walker, A.P., Worth W.M.H. (1988) Classification as Corrosive or Irritant to Skin of Preparations Containing Acidic or Alkaline Substance Without Testing on Animals. Toxicol. In Vitro, 2, 19 — 26.

(6)

Fentem, J.H., Archer, G.E.B., Balls, M., Botham, P.A., Curren, R.D., Earl, L.K., Edsail, D.J., Holzhutter, H.G. and Liebsch, M. (1998) The ECVAM international validation study on in vitro tests for skin corrosivity. 2. Results and evaluation by the Management Team. Toxicology in vitro 12, pp.483 — 524.

(7)

Neun, D.J. (1993), Effects of Alkalinity on the Eye Irritation Potential of Solutions Prepared at a Single pH, J. Toxicol. Toxicol. Cut. Ocular Toxicol. 12, 227 — 231.

(8)

Suppliment għall-Kapitolu B.4 ta' dan l-Anness, Strateġija ta' Ttestjar Sekwenzjali għall-Irritazzjoni u l-Korrużjoni tal-Ġilda.

(9)

Il-Kapitolu B.40 ta' dan l-Anness, Korrużjoni tal-Ġilda In Vitro: Test tar-Reżistenza Elettrika Transkutanja (TER).

(10)

Kapitolu B.40bis of this Annex, Korrużjoni tal-Ġilda In Vitro: Test Mudell tal-Ġilda tal-Bniedem.

(11)

OECD (2006), Test No. 435: In vitro Membrane Barrier Test Method for Skin corrosion, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Paris.

(12)

Il-Kapitolu B.47 ta' dan l-Anness, Metodu ta' Ttestjar tal-Opaċità u l-Permeabilità tal-Kornea fil-Bovini għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn.

(13)

Kapitolu B.48 ta' dan l-Anness, Metodu ta' Ttestjar tal-Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn.”

(3)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.10 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.10   Test In Vitro Ta' Aberrazzjoni Kromożomika Fil-Mammiferi

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 473 (2016) tal-OECD Huwa parti minn sensiela ta' metodi ta' ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. Ġie żviluppat dokument tal-OECD li jipprovdi informazzjoni sintetika dwar l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali dwar it-tibdil reċenti la sar f'dawk il-Linji Gwida tat-Test (1).

L-iskop tat-test in vitro ta' aberrazzjoni kromożomika huwa li jidentifika s-sustanzi kimiċi li jikkawżaw aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali f'kulturi ta' ċelloli tal-mammiferi (2) (3) (4). L-aberrazzjonijiet strutturali jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomiċi jew kromatidi. Tista' sseħħ piloplojdija (inkluża endoreduplikazzjoni) f'assaġġi tal-aberrazzjoni kromożomika in vitro. Filwaqt li l-anewġeni jistgħu jinduċu l-poliplojdija, il-poliplojdija waħedha ma tindikax potenzjal anewġeniku u tista' tindika sempliċi perturbazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli jew ċitotossiċità (5). It-test mhuwiex imfassal sabiex ikejjel l-anewplojdija. Sabiex jiġi verifikat hemmx anewplojdija, ikun rakkomandat test in vitro tal-mikronukleu (6).

It-test in vitro ta' aberrazzjoni kromożomika jista' juża kulturi ta' linji ta' ċelloli stabbiliti jew kulturi ta' ċelloli primarji ta' oriġini mill-bniedem jew minn rodituri. Iċ-ċelloli użati għandhom jintgħażlu fuq il-bażi tal-abilità ta' tkabbir fil-kultura, l-istabilità tal-karjotip (inkluż in-numru ta' kromożomi) u l-frekwenza spontanja tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi (7). Bħalissa, id-dejta disponibbli ma tippermettix li jinħarġu rakkomandazzjonijiet assoluti iżda tissuġġerixxi li, meta jiġu evalwati l-perikli kimiċi, huwa importanti li jiġu kkunsidrati l-istatus p53, l-istabilità ġenetika (karjotip), il-kapaċità ta' tiswija tad-DNA u l-oriġini (minn rodituri jew mill-bniedem) taċ-ċelloli magħżulin għall-ittestjar. Għalhekk, dawk li jużaw dan il-metodu ta' ttestjar huma mħeġġin jikkunsidraw l-influwenza ta' dawn il-karatteristiċi u karatteristiċi oħrajn taċ-ċelloli fuq il-prestazzjoni ta' linja ta' ċelloli fis-sejbien tal-induzzjoni ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi, peress li l-għarfien dejjem qiegħed jiżdied f'dan il-qasam.

Id-definizzjonijiet użati huma pprovduti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI

It-testijiet li jsiru in vitro ġeneralment jirrekjedu l-użu ta' sors eżoġeniku ta' attivazzjoni metabolika sakemm iċ-ċelloli ma jkunux metabolikament kompetenti fir-rigward tas-sustanzi kimiċi tat-test. Is-sistema eżoġena ta' attivazzjoni metabolika ma timitax għalkollox il-kundizzjonijiet in vivo. Wieħed għandu joqgħod attent li jevita kundizzjonijiet li jistgħu jwasslu għal riżultati pożittivi artifiċjali, jiġifieri ħsara fil-kromożomi mhux ikkaġunata minn interazzjoni diretta bejn is-sustanzi kimiċi tat-test u l-kromożomi; tali kundizzjonijiet jinkludu bidliet fil-pH jew l-ożmolalità (8) (9) (10), interazzjoni ma' komponenti medji (11) (12) jew livelli eċċessivi ta' ċitotossiċità (13) (14) (15) (16).

Dan it-test jintuża sabiex jaqbad aberrazzjonijiet kromożomiċi li jistgħu jirriżultaw minn avvenimenti klastoġeniċi. L-analiżi ta' induzzjoni ta' aberrazzjoni kromożomika għandha ssir bl-użu ta' ċelloli fil-metafażi. Għalhekk, huwa essenzjali li ċ-ċelloli għandhom jiksbu l-mitożi kemm f'kulturi ttrattati kif ukoll f'dawk mhux ittrattati. Għal nanomaterjali manifatturati, jaf ikun hemm bżonn li jsiru adattamenti speċifiċi ta' dan il-metodu ta' ttestjar li ma jkunux deskritti fih.

Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

Il-kulturi ta' ċelloli ta' oriġini umana jew minn mammiferi oħrajn huma esposti għas-sustanza kimika tat-test kemm b'sors eżoġenu ta' attivazzjoni metabolika kif ukoll mingħajr dan is-sors sakemm ma jintużawx ċelloli b'kapaċità metabolizzanti adegwata (ara l-paragrafu 13). F'intervalli prestabbiliti kif xieraq wara li l-kulturi ta' ċelloli jibdew jiġu esposti għas-sustanza kimika tat-test, dawn jiġu ttrattati b'inibitur tal-metafażi (eż. kolċemid jew kolċisina), miġbur u mlewwen, u ċ-ċelloli tal-metafażi jiġu analizzati bil-mikroskopju għall-preżenza ta' aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u tat-tip kromożomiku

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Preparamenti

Ċelloli

Tista' tintuża firxa ta' linji ta' ċelloli (eż. Ovarji tal-Hamster Ċiniż (CHO), pulmun tal-Hamster Ċiniż V79, Pulmun tal-Hamster Ċiniż (CHL)/IU, TK6) jew kulturi ta' ċelloli primarji, inklużi linfoċiti periferiċi tad-demm tal-bniedem jew ta' mammiferi oħrajn (7). L-għażla tal-linji ta' ċelloli għandha tkun iġġustifikata xjentifikament. Meta jintużaw ċelloli prmiarji, għal raġunijiet ta' trattament xieraq tal-annimali, għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' ċelloli primarji ta' oriġini umana meta dan ikun fattibbli u dawn għandhom jiġu kampjunati skont il-prinċipji u r-regolamenti etiċi umani. Il-linfoċiti periferiċi tad-demm tal-bniedem għandhom jinkisbu mingħand individwi żgħażagħ (madwar 18-35 sena) li ma jpejpux u li ma għandhom ebda marda magħrufa jew li ma kinux esposti riċentement għal aġenti ġenotossiċi (eż. sustanzi kimiċi, radjazzjonijiet jonizzanti) f'livelli li jżidu l-inċidenza ta' sfond ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi. Dan jiżgura li l-inċidenza ta' sfond ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi tibqa' baxxa u konsistenti. L-inċidenza bażi tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi tiżdied mal-età, u din it-tendenza hija iktar evidenti fin-nisa milli fl-irġiel (17) (18). Jekk jinġabru flimkien ċelloli mingħand iktar minn donatur wieħed, għandu jiġi speċifikat l-għadd ta' donaturi. Hemm bżonn li jintwera li ċ-ċelloli nqasmu sa mill-bidu nett tat-trattament bis-sustanza kimika tat-test sal-kampjunar taċ-ċelloli. Il-kulturi taċ-ċelloli jinżammu f'fażi ta' tkabbir taċ-ċelloli esponenzjali (linji ta' ċelloli) jew jiġu stimolati sabiex jinqasmu (kulturi primarji ta' linfoċiti), sabiex jesponu ċ-ċelloli fi stadji differenti taċ-ċiklu taċ-ċelloli, peress li jaf ma tkunx magħrufa s-sensittività tal-istadji taċ-ċelloli għas-sustanzi kimiċi. Iċ-ċelloli primarji li jeħtieġu stimolazzjoni b'aġenti mitoġeniċi sabiex jinqasmu ġeneralment ma jibqgħux sinkronizzati matul l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test (eż. linfoċiti umani wara stimolazzjoni mitoġenika ta' 48 siegħa). L-użu ta' ċelloli sinkronizzati matul it-trattament mhuwiex rakkomandat, iżda jista' jkun aċċettabbli jekk ikun iġġustifikat.

Il-kundizzjonijiet tal-media tal-kultura

Għandhom jintużaw kundizzjonijiet xierqa tal-media tal-kultura u tal-inkubazzjoni (reċipjenti tal-kultura, atmosfera umidifikata ta' 5 % CO2 jekk xieraq, temperatura ta' inkubazzjoni ta' 37 °C) għaż-żamma tal-kulturi. Il-linji ta' ċelloli għandhom jiġu verifikati b'mod regolari għall-istabilità tal-għadd ta' kromożomi modali u l-assenza ta' kontaminazzjoni tal-Mikoplażma (7) (19), u ċ-ċelloli ma għandhomx jintużaw jekk ikunu kontaminati jew jekk jinbidel l-għadd ta' kromożomi modali. It-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli tal-linji ta' ċelloli jew il-kulturi prmiarji użati fil-laboratorju tat-testijiet għandu jkun stabbilit u konsistenti mal-karatteristiċi taċ-ċelloli ppubblikati (20).

Preparazzjoni tal-kulturi

Linji ta' ċelloli: iċ-ċelloli huma propagati minn kulturi omm, imqegħdin fil-medium tal-kultura f'densità b'tali mod li ċ-ċelloli f'sospensjonijiet jew f'monosaffi jibqgħu jikbru b'mod esponenzjali sal-ħin tal-ġbir (eż. għandha tiġi evitata konfluwenza għal ċelloli li jikbru f'monosaffi).

Linfoċiti: demm sħiħ ittrattat b'antikoagulant (eż. eparina) jew linfoċiti separati jiġu kulturati (eż. għal 48 siegħa għal linfoċiti umani) fil-preżenza ta' mitoġenu [eż. fitoemagglutinina (PHA) għal linfoċiti umani] sabiex tiġi indotta diviżjoni taċ-ċelloli qabel l-esponiment għas-sustanza kimika tat-test.

Attivazzjoni metabolika

Għandhom jintużaw sistemi metabolizzanti eżoġeni meta jintużaw ċelloli b'kapaċità metabolika endoġena inadegwata. L-iktar sistema użata spiss li hija l-ewwel rakkomandata, sakemm ma jkunx stipulat b'mod ieħor, hija frazzjoni postmitokondrijali ssupplimentata minn kofatturi (S9) imħejjija mill-fwied ta' rodituri (ġeneralment firien) ittrattati b'indutturi enzimatiċi bħal Aroclor 1254 (21) (22) (23) jew taħlita ta' fenobarbital u β-naftoflavon (24) (25) (26) (27) (28) (29). Din it-taħlita msemmija l-aħħar ma tmurx kontra l-Konvenzjoni ta' Stokkolma dwar Materjal Organiku Persistenti li Jniġġes (30) u ntwera li hija effettiva daqs Aroclor 1254 għall-induzzjoni ta' ossidażijiet b'funzjoni mħallta (24) (25) (26) (28). Il-frazzjoni S9 normalment tintuża f'konċentrazzjonijiet li jvarjaw minn 1 sa 2 % (v/v) iżda tista' tiżdied sa 10 % (v/v) fil-medium tat-test finali. L-użu ta' prodotti li jnaqqsu l-indiċi mitotiku, speċjalment prodotti ta' kumplessazzjoni tal-kalċju (31) għandu jiġi evitat matul it-trattament. L-għażla tat-tip u l-konċentrazzjoni ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika eżoġena jew induttur metaboliku użati tista' tkun influwenzata mill-klassi tas-sustanzi kimiċi li jiġu ttestjati.

Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test

Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jiġu ppreparati f'solventi xierqa u jiġu dilwiti, jekk dan ikun xieraq, qabel it-trattament taċ-ċelloli (ara l-paragrafu 23). Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiżdiedu direttament mas-sistema tat-test u/jew jiġu dilwiti qabel it-trattament tas-sistema tat-test. Is-sustanzi kimiċi gassużi jew volatili tat-test għandhom jiġu ttestjati b'modifiki xierqa fil-protokolli standard, bħat-trattament f'reċipjenti tal-kultura ssiġillati (32) (33) (34). Il-preparamenti tas-sustanza kimika tat-test għandhom isiru eżatt qabel it-trattament, sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix l-aċċettabilità tal-ħżin.

Kundizzjonijiet tat-test

Solventi

Is-solvent għandu jingħażel sabiex tiġi ottimizzata s-solubilità tas-sustanza kimika tat-test mingħajr ma jitħalla impatt avvers fuq it-twettiq tal-assaġġ, eż. bidla fit-tkabbir taċ-ċelloli, effett fuq l-integrità tas-sustanza kimika tat-test, reazzjoni ma' reċipjenti tal-kultura, indeboliment tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika. Huwa rakkomandat li, kull meta dan ikun possibbli, l-ewwel għandu jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent milwiem (jew medium tal-kultura). Pereżempju, fost is-solventi ferm stabbiliti hemm l-ilma jew is-sulfossidu tad-dimetil. Ġeneralment, is-solventi organiċi ma għandhomx jaqbżu l-1 % (v/v) u s-solventi milwiema (salina jew ilma) ma għandhomx jaqbżu l-10 % (v/v) fil-medium tat-trattament finali. Jekk jintużaw solventi mhux ferm stabbiliti (eż. etanol jew aċeton), l-użu tagħhom għandu jkun sostnut minn dejta li tindika l-kompatibilità tagħhom mas-sustanzi kimiċi tat-test, is-sistema tat-test u n-nuqqas tagħhom ta' tossiċità ġenetika fil-konċentrazzjoni użata. Fin-nuqqas ta' dik id-dejta ta' sostenn, importanti li jiġu inklużi kontrolli mhux ittrattati (ara l-Appendiċi 1) sabiex jintwera li s-solvent magħżul ma jinduċi ebda effett dannuż jew klastoġeniku.

Il-kejl tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli u ċ-ċitotossiċità u l-għażla tal-konċentrazzjonijiet tat-trattament

Meta wieħed jistabbilixxi l-ogħla konċentrazzjoni tas-sustanza tat-test, għandhom jiġu evitati konċentrazzjonijiet li għandhom il-kapaċità li jipproduċu rispons pożittiv artefattwali, bħal dawk li jipproduċu ċitotossiċità eċċessiva (ara l-paragrafu 22), il-preċipitazzjoni fil-medium tal-kultura (ara l-paragrafu 23), jew bidliet ċari fil-pH jew ożmolalità (ara l-paragrafu 5). Jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna bidla ċara fil-pH tal-medium fi żmien iż-żieda, il-pH tista' tiġi aġġustata bl-ibbaferjar tal-medium tat-trattament finali sabiex jiġu evitati riżultati pożittivi artifattwali u sabiex jinżammu l-kundizzjonijiet xierqa tal-kultura.

Il-kejliet tal-proliferazzjoni taċ-ċelloli jsiru sabiex ikun żgurat li biżżejjed ċelloli ttrattati jkunu jilħqu l-fażi tal-mitożi waqt it-test u li t-trattamenti jsiru fil-livelli xierqa ta' ċitotossiċità (ara l-paragrafi 18 u 22). Iċ-ċitotossiċità għandha tiġi stabbilita b'attivazzjoni metabolika u mingħajr fl-esperiment ewlieni bl-użu ta' indikazzjoni xierqa ta' mewt u tkabbir taċ-ċelloli. Filwaqt li l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità f'test inizjali tista' tkun siewja sabiex jiġu definiti aħjar il-konċentrazzjonijiet li sejrin jintużaw fl-esperiment ewlieni, test inizjali mhuwiex obbligatorju. Jekk isir, ma għandux isir minflok il-kejl taċ-ċitotossiċità fl-esperiment ewlieni.

L-Irduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (RPD) jew iż-Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (RICC) huma metodi xierqa għall-valutazzjoni taċ-ċitotossiċità f'testijiet ċitoġenetiċi (13) (15) (35) (36) (55) (ara l-Appendiċi 2 għall-formuli). Fil-każ ta' trattament fit-tul u ħinijiet tal-kampjunar wara l-bidu tat-trattament li jkunu itwal minn darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali (jiġifieri itwal minn 3 darbiet it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli b'kollox), l-RPD jista' jissottovaluta ċ-ċitotossiċità (37). F'dawn iċ-ċirkustanzi, l-RICC tista' tipprovdi kejl aħjar jew inkella l-evalwazzjoni taċ-ċitotossiċità wara darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali tkun stima siewja bl-użu tal-RPD.

Għal linfoċiti f'kulturi primarji, filwaqt li l-indiċi mitotiku (MI) huwa kejl tal-effetti ċitotossiċi/ċitostatiċi, huwa influwenzat mill-ħin li jitkejjel fih wara t-trattament, il-mitoġenu użat u t-tkissir taċ-ċiklu ċellulari possibbli. Madankollu, l-MI huwa aċċettabbli għaliex kejliet oħrajn taċ-ċitotossiċità jistgħu jkunu diffiċli u imprattiċi u jaf ma jkunux japplikaw għall-popolazzjoni fil-mira ta' linfoċiti li jikbru bħala tweġiba għall-istimolazzjoni tal-PHA.

Filwaqt li l-RICC u l-RPD għal-linji ta' ċelloli u l-MI għall-kultura primarja ta' linfoċiti huma l-parametri rakkomandati taċ-ċitotossiċità, indikaturi oħrajn (eż. l-integrità taċ-ċelloli, l-apoptożi, in-nekrożi, iċ-ċiklu taċ-ċelloli) jistgħu jipprovdu informazzjoni addizzjonali siewja.

Għandhom jiġu evalwati tal-inqas tliet konċentrazzjonijiet tat-test (mhux inklużi l-kontroll tas-solvent u pożittivi) li jissodisfaw il-kriterji ta' aċċettabilità (iċ-ċitotossiċità xierqa, in-numru ta' ċelloli, eċċ.). Ikun xi jkun it-tip taċ-ċelloli (linji ta' ċelloli jew kulturi primarji ta' linfoċiti), jistgħu jintużaw kulturi rreplikati jew kulturi uniċi ttrattati f'kull konċentrazzjoni ttestjata. Filwaqt li l-użu ta' kulturi duplikati huwa rakkomandat, kulturi uniċi huma aċċettabbli wkoll diment li jingħata punteġġ lill-istess numru totali ta' ċelloli għal kulturi uniċi jew kulturi duplikati. L-użu ta' kulturi waħedhom huwa ta' rilevanza partikolari meta jiġu vvalutati iktar minn 3 konċentrazzjonijiet (ara l-paragrafu 31). Ir-riżultati miksubin fil-kulturi rreplikati indipendenti f'konċentrazzjoni partikolari jistgħu jinġabru flimkien għall-analiżi tad-dejta (38). Għal sustanzi kimiċi tat-test li juru tossiċità baxxa jew ebda tossiċità, intervalli tal-konċentrazzjoni ta' madwar id-doppju jew it-tripplu normalment ikunu xierqa. Meta sseħħ ċitotossiċità, il-konċentrazzjonijiet tat-test magħżulin għandhom ikopru firxa minn dik iċ-ċitotossiċità produttiva kif spjegat fil-paragrafu 22 u jinkludu konċentrazzjonijiet li fihom ikun hemm ċitotossiċità moderata u baxxa jew ebda ċitotossiċità. Ħafna sustanzi kimiċi tat-test juru kurvi konċentrazzjoni rispons wiqfin u, sabiex tinkiseb dejta f'ċitotossiċità baxxa u moderata jew sabiex tiġi studjata r-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons f'dettall, sejjer ikun hemm bżonn li jintużaw konċentrazzjoni spazjati iktar qrib xulxin u/jew iktar minn tliet konċentrazzjonijiet (kulturi waħedhom jew repliki), speċjalment f'sitwazzjonijiet li fihom ikun hemm bżonn li jsir esperiment ripetut (ara l-paragrafu 47).

Jekk il-konċentrazzjoni massima tkun ibbażata fuq iċ-ċitotossiċità, l-ogħla konċentrazzjoni għandu jkollha l-għan li tikseb ċitotossiċità ta' 55 ± 5 % bl-użu tal-parametri rakkomandati dwar iċ-ċitotossiċità (jiġifieri tnaqqis fl-RICC u l-RPD għal linji ta' ċelloli u tnaqqis fl-MI għal kulturi primarji ta' linfoċiti għal 45± 5 % tal-kontroll negattiv parallel). Wieħed għandu joqgħod attent meta jinterpreta riżultati pożittivi li mbagħad jistgħu jinstabu li huma fil-parti superjuri ta' din il-firxa ta' ċitotossiċità ta' 55 ± 5 % (13).

Għal sustanzi kimiċi tat-test ftit li xejn solubbli li mhumiex ċitotossiċi f'konċentrazzjonijiet inqas mill-inqas konċentrazzjoni insolubbli, l-ogħla konċentrazzjoni analizzata għandha tipproduċi turbidità jew preċipitat viżibbli bl-għajnejn jew bl-għajnuna ta' mikroskopju invertit fi tmiem it-test bis-sustanza kimika tat-test. Anki jekk iċ-ċitotossiċità sseħħ f'livelli inqas mill-inqas konċentrazzjoni insolubbli, huwa rakkomandat li l-ittestjar isir f'konċentrazzjoni waħda biss li tipproduċi turbidità jew bi preċipitat viżibbli għaliex jistgħu jirriżultaw effetti artifattwali mill-preċipitat. Fil-konċentrazzjoni li tipproduċi preċipitat, għandha tingħata attenzjoni sabiex jiġi żgurat li l-preċipitat ma jxekkilx it-twettiq tat-test (eż. tilwin jew punteġġar). Id-determinazzjoni tas-solubilità fil-medium tal-kultura qabel l-esperiment tista' tkun utli.

Jekk ma jiġu osservati ebda preċipitat jew ċitotossiċità li tillimita, l-ogħla konċentrazzjoni tat-test għandha tkun tikkorrispondi għal 10 mM, 2 mg/ml jew 2 μl/ml, liema minnhom tkun l-inqas (39) (40) (41). Meta s-sustanza kimika tat-test ma jkollhiex kompożizzjoni definita, eż. sustanza b'kompożizzjoni mhux magħrufa jew varjabbli, il-prodotti ta' reazzjoni kumplessa jew il-materjal bijoloġiku (UVCB) (42), estratt ambjentali eċċ, il-konċentrazzjoni massima jaf trid tkun ogħla (eż. 5 mg/ml), fin-nuqqas ta' ċitotossiċità suffiċjenti, sabiex tiżdied il-konċentrazzjoni ta' kull wieħed mill-komponenti. Madankollu, ta' min jinnota li dawn ir-rekwiżiti jistgħu jvarjaw għall-prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem (43).

Kontrolli

Għal kull ħin tal-ġbir għandhom ikunu inklużi kontrolli negattivi paralleli (ara l-paragrafu 15), li jikkonsistu f'solvent waħdu fil-medium tat-trattament u ttrattat bl-istess mod bħall-kulturi tat-trattament.

Kontrolli pożittivi paralleli huma meħtieġa sabiex juru l-ħila tal-laboratorju fl-identifikazzjoni ta' klastoġeni fil-kundizzjonijiet tal-protokoll tat-test użat u l-effikaċja tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika eżoġena, meta applikabbli. Fit-Tabella 1 ta' hawn taħt jingħataw xi eżempji ta' kontrolli pożittivi. Jistgħu jintużaw sustanzi kimiċi ta' kontroll pożittiv oħrajn, jekk ikunu ġġustifikati. Peress li t-testijiet in vitro taċ-ċelloli tal-mammiferi huma standardizzati biżżejjed, l-użu tal-kontrolli pożittivi jista' jkun limitat għal klastoġenu li jeħtieġ attivazzjoni metabolika. Diment li dan isir fl-istess ħin mat-test mhux attivat bl-użu tal-istess durata tat-trattament, ir-rispons tal-kontroll pożittiv uniku sejjer juri kemm l-attività tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika u kemm hija risponsiva s-sistema tat-test. Madankollu, trattament fit-tul (mingħajr S9) għandu jkollu l-kontroll pożittiv tiegħu stess peress li d-durata tat-trattament sejra tvarja mit-test bl-użu tal-attivazzjoni metabolika. Kull kontroll pożittiv għandu jintuża f'konċentrazzjoni waħda jew iktar mistennija li toffri żidiet riproduċibbli u identifikabbli fuq l-isfond sabiex tintwera s-sensittività tas-sistema tat-test (jiġifieri l-effetti huma ċari iżda ma jikxfux minnufih l-identità tal-lametti kodifikati lill-qarrej), u r-rispons ma għandux ikun f'riskju minħabba ċitotossiċità li taqbeż il-limiti speċifikati fil-metodu ta' ttestjar.

Tabella 1.

Sustanzi kimiċi ta' referenza rakkomandati għall-valutazzjoni tal-għarfien tal-laboratorju u għall-għażla tal-kontrolli pożittivi.

Kategorija

Sustanza Kimika

CASRN

1.   

Klastoġeni attivi mingħajr attivazzjoni metabolika

 

Metansulfonat tal-metil

66-27-3

 

Mitomiċina C

50-07-7

 

4-Nitrokinolina-N-Ossida

56-57-5

 

Ċitożina arabinosida

147-94-4

2.   

Klastoġeni li jeħtieġu attivazzjoni metabolika

 

Benżo(a)piren

50-32-8

 

Ċiklofosfammid

50-18-0

PROĊEDURA

Trattament bis-sustanza kimika tat-test

Ċelloli li jipproliferaw huma ttrattati bis-sustanza tat-test fil-preżenza u fin-nuqqas ta' sistema ta' attivazzjoni metabolika.

Żmien il-ġbir tal-kulturi

Għal evalwazzjoni dettaljata, li tkun meħtieġa sabiex jiġi konkluż eżitu negattiv, għandhom isiru t-tliet kundizzjonijiet sperimentali kollha kemm huma li ġejjin bl-użu ta' trattament fuq terminu qasir b'attivazzjoni metabolika u mingħajrha u trattament fit-tul mingħajr attivazzjoni metabolika (ara l-paragrafi 43, 44 u 45):

Iċ-ċelloli għandhom ikunu esposti għas-sustanza kimika tat-test mingħajr attivazzjoni metabolika għal 3-6 sigħat, u jiġu kampjunati f'ħin ekwivalenti għal madwar kull darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali mindu jinbeda t-trattament (18),

Iċ-ċelloli għandhom ikunu esposti għas-sustanza kimika tat-test mingħajr attivazzjoni metabolika għal 3-6 sigħat, u jiġu kampjunati f'ħin ekwivalenti għal madwar kull darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali mindu jinbeda t-trattament (18),

Iċ-ċelloli għandhom ikunu esposti bla heda għas-sustanza kimika tat-test mingħajr attivazzjoni metabolika sal-kampjunar f'ħin għal madwar kull darba u nofs iċ-ċiklu taċ-ċelloli normali. Ċerti sustanzi kimiċi (eż. analogi nukleosidiċi) jistgħu jinqabdu iktar malajr minn ħinijiet ta' trattament/kampjunar ta' itwal minn darba u nofs it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli normali (24).

F'każ li xi waħda mill-kundizzjonijiet sperimentali ta' hawn fuq twassa għal rispons pożittiv, jaf ma jkunx hemm bżonn li jiġi investigat xi wieħed mir-reġimi tat-trattament l-oħrajn.

Preparazzjoni tal-kromożomi

Il-kulturi taċ-ċelloli jiġu ttrattati b'kolċemid jew kolċisina normalment għal siegħa sa tliet sigħat qabel il-ġbir. Kull kultura ta' ċelloli tinġabar u tiġi proċessata separatament għall-preparazzjoni tal-kromożomi. Il-preparazzjoni tal-kromożomi tinvolvi t-trattament ipotoniku taċ-ċelloli, il-fissazzjoni u t-tilwin. Fil-monosaffi, iċ-ċelloli mitotiċi (identifikabbli għaliex huma tondi u maqlugħin mill-wiċċ) jistgħu jkunu preżenti fl-aħħar tat-trattament ta' bejn 3 u 6 sigħat. Minħabba li dawn iċ-ċelloli mitotiċi jistgħu jinqalgħu faċilment, jistgħu jintilfu meta jitneħħa l-medium li jkun fih is-sustanza kimika tat-test. Jekk hemm evidenza ta' żieda sostanzjali fin-numru ta' ċelloli mitotiċi meta mqabbla mal-kontrolli, xi ħaġa li tindika inibizzjoni mitotika, iċ-ċelloli għandhom jinġabru b'ċentrifugazzjoni u jiżdiedu lura mal-kulturi, sabiex jiġi evitat milli jintilfu ċelloli li huma f'mitożi, u f'riskju ta' aberrazzjoni kromożomika, f'ħin il-ġbir.

Analiżi

Il-lametti kollha, inklużi dawk tal-kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati b'mod indipendenti qabel ma ssir analiżi mikroskopika għal aberrazzjonijiet kromożomiċi. Billi l-proċeduri ta' fissazzjoni spiss jirriżultaw fi proporzjon ta' ċelloli fil-metafażi li tilfu kromożomi, iċ-ċelloli li jingħaddu għandu għalhekk ikun fihom numru ta' ċentromeri ugwali għan-numru modali +/– 2.

Tal-inqas 300 metafażi mifruxin sew għandhom jingħaddu għal kull konċentrazzjoni u kontroll sabiex jiġi konkluż li sustanza kimika tat-test hija negattiva biċ-ċar (ara l-paragrafu 45). It-300 ċellola għandhom ikunu maqsumin indaqs bejn ir-repliki, meta jintużaw kulturi rreplikati. Meta jintużaw kulturi waħedhom għal kull konċentrazzjoni (ara l-paragafu 21), għandhom jingħaddu tal-inqas 300 metafażi mifruxin sew f'din il-kultura waħedha. L-għadd ta' 300 ċellola għandu l-vantaġġ li jżid is-saħħa statistika tat-test u, barra minn hekk, rari jiġu osservati valuri żero (mistennijin li jkunu 5 % biss) (44). In-numru ta' metafażijiet magħdudin jista' jitnaqqas meta jiġu osservati numri kbar ta' ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi u s-sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva b'mod ċar.

Għandhom jingħaddu ċelloli b'aberrazzjoni(jiet) kromożomiċi strutturali, li jinkludu u jeskludu distakki. Il-ksur u d-distakki huma definiti fl-Appendiċi 1 skont (45) (46). Aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u kromożomiku għandhom jiġu rreġistrati għalihom u jiġu kklassifikati skont is-sottotipi (ksur, skambji). Il-proċeduri li jintużaw fil-laboratorju għandhom jiżguraw li l-analiżi tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi ssir minn persuni mħarrġin sew fl-għoti ta' punteġġi u huma evalwati bejn il-pari, jekk xieraq.

Għalkemm l-għan tat-test huwa li jinkixfu aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali, huwa importanti li wieħed jirreġistra l-frekwenzi tal-poliplojdija u l-endoreduplikazzjoni meta jseħħu dawn l-avvenimenti. (Ara l-paragrafu 2).

Il-profiċjenza tal-laboratorju

Sabiex tiġi stabbilita biżżejjed esperjenza bit-test qabel ma jintuża għall-ittestjar ta' rutina, il-laboratorju għandu jkun għamel sensiela ta' esperimenti b'sustanzi kimiċi pożittivi ta' referenza li jaġixxu permezz ta' mekkaniżmi differenti u bosta kontrolli negattivi (bl-użu ta' bosta solventi/veikoli). Dawn ir-risponsi tal-kontroll pożittiv u negattiv reazzjonijiet għandhom ikunu konsistenti mat-tagħrif. Dan mhuwiex applikabbli għal laboratorju li għandhom esperjernza, jiġifieri li għandhom database storika disponibbli kif definita fil-paragrafu 37.

Għandha tiġi investigata firxa ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv (ara t-Tabella 1 fil-paragrafu 26) bi trattamenti qosra u twal fin-nuqqas ta' attivazzjoni metabolika, u anki bi trattament qasir fil-preżenza ta' attivazzjoni metabolika, sabiex tintwera l-ħila li jinqabdu sustanzi kimiċi klastoġeniċi u tiġi stabbilita l-effikaċja tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika. Għandha tingħażel medda ta' konċentrazzjonijiet tas-sustanzi kimiċi magħżulin sabiex jingħataw żidiet riproduċibbli u marbutin mal-konċentrazzjoni fuq l-isfond sabiex jintwerew is-sensittività u l-firxa dinamika tas-sistema tat-test.

Dejta storika tal-kontroll

Il-laboratorju għandu jistabbilixxi:

Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll pożittiv,

Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll negattiv (mhux ittrattat, solvent).

Meta għall-ewwel tinkiseb id-dejta għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu konsistenti mad-dejta tal-kontroll ippubblikata, meta tkun teżisti. Peress li tiżdied iktar dejta sperimentali mad-distribuzzjoni tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % ta' dik id-distribuzzjoni (44) (47). Id-database storika tal-kontrolli negattivi tal-laboratorju għall-ewwel għandha tinbena b'minimu ta' 10 esperimenti iżda idealment tkun tikkonsisti f'tal-inqas 20 esperiment imwettqin f'kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta' kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (48)), sabiex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-dejta tal-kontroll pożittiv u negattiv tagħhom, u sabiex juru li l-metodoloġija hija “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom (44). Rakkomandazzjonijiet ulterjuri dwar kif jibnu u jużaw id-dejta storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta' dejta fid-dejta storika u l-kriterji ta' aċċettabilità għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (47).

Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-konsistenza tagħha mad-databases tal-kontroll storiċi eżistenti tal-laboratorju. Kwalunkwe inkonsistenza kbira għandha tirriżulta fl-istabbiliment ta' database storika ġdida tal-kontroll.

Id-dejta tal-kontroll negattiv għandha tikkonsisti fl-inċidenza taċ-ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi minn kultura waħedha jew is-somma tal-kulturi rreplikati kif deskritti fil-paragrafu 21. Idealment, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % tad-distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju (44) (47). Meta d-dejta tal-kontroll negattiv parallel toħroġ mil-limiti ta' kontroll ta' 95 %, din tista' titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll diment li din id-dejta ma tkunx eċċezzjoni estrema u jkun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara l-paragrafu 37) u evidenza ta' nuqqas ta' żball tekniku jew uman.

DEJTA U RAPPORTAR

Preżentazzjoni tar-riżultati

Il-perċentwal ta' ċelloli b'aberrazzjoni(jiet) kromożomika strutturali għandu jiġi evalwat. L-aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u kromożomiku kklassifikat skont is-sottotipi (ksur, skambji) għandhom jiġu elenkati b'mod separat bin-numri u l-frekwenzi tagħhom għall-kulturi ta' esperimenti u ta' kontroll. Id-distakki jiġu rreġistrati u rrapportati separatament u ma jiddaħħlux fil-frekwenza ta' aberrazzjonijiet totali. Il-perċentwal ta' poliplojdija u/jew ċelloli endoreduplikati jiġi rrapportat meta jiġi osservat.

Għandhom jiġu rreġistrati l-miżuri paralleli ta' ċitotossiċità għall-kulturi tal-kontroll ittrattat, negattiv u pożittiv kollha fl-esperiment(i) tal-aberrazzjonijiet ewlenin.

Għandha tiġi pprovduta dejta dwar il-kultura individwali. Barra minn hekk, id-dejta kollha għandha tinġabar taħt forma ta' tabella.

Kriterji ta' Aċċettabilità

L-aċċettazzjoni ta' test hija bbażata fuq il-kriterji li ġejjin:

Il-kontroll negattiv parallel jitqies aċċettabbli għaż-żieda fid-database storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju kif deskritt fil-paragrafu 39.

Il-kontrolli negattivi paralleli (ara l-paragrafu 26) għandhom jinduċu risponsi li huma kompatibbli ma' dawk iġġenerati fid-database storika tal-kontroll pożittiv u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabblin mal-kontroll negattiv parallel.

Il-kriterji ta' proliferazzjoni taċ-ċelloli fil-kontroll tas-solventi għandhom ikunu ssodisfati (paragrafi 17 u 18).

It-tliet kundizzjonijiet sperimentali kollha kemm huma ġew ittestjati sakemm wieħed ma rriżultax f'riżultati pożittivi (ara l-paragrafu 28).

Hemm numru adegwat ta' ċelloli u konċentrazzjonijiet li huma analizzabbli (paragrafi 31 u 21).

Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla konċentrazzjoni huma konsistenti ma' dawk deskritti fil-paragrafi 22, 23 u

Evalwazzjoni u interpretazzjoni tar-riżultati

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk, fi kwalunkwe waħda mill-kundizzjonijiet sperimentali analizzati (ara l-paragrafu 28):

a)

tal-inqas waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel,

b)

iż-żieda hija marbuta mad-doża meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi,

c)

kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa' barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson; ara l-paragrafu 39).

Meta jiġu ssodisfati dawn il-kriterji kollha, is-sustanza kimika tat-test imbagħad tiġi kkunsidrata kapaċi tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi f'ċelloli kulturati tal-mammiferi f'din is-sistema tat-test. Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (49) (50) (51).

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali analizzati kollha (ara l-paragrafu 28):

a)

l-ebda waħda mill-konċentrazzjonijiet tat-test ma turi żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel,

b)

ma hemm l-ebda żieda marbuta mal-konċentrazzjoni meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi,

c)

ir-riżultati kollha jaqgħu fid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson; ara l-paragrafu 39).

Imbagħad, is-sustanza kimika tat-test tiġi kkunsidrata li mhijiex kapaċi tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi f'ċelloli kulturati tal-mammiferi f'din is-sistema tat-test.

Ma hemm l-ebda ħtieġa għall-verifika ta' rispons posittiv jew negattiv ċar.

F'każ li r-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar kif spjegat hawn fuq jew sabiex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta' riżultat, id-dejta għandha tiġi evalwata b'ġudizzju espert u/jew b'investigazzjonijiet ulterjuri. L-ikklassifikar ta' ċelloli addizzjonali (fejn xieraq) jew it-twettiq ta' esperiment ripetut possibilment bl-użu ta' kundizzjonijiet modifikati tal-esperiment (eż. spazjar tal-konċentrazzjonijiet, kundizzjonijiet ta' attivazzjoni metabolika oħrajn (jiġifieri konċentrazzjoni S9 jew oriġini S9)) jista' jkun siewi.

F'każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, is-sett ta' dejta sejjer jipprekludi l-ħruġ ta' konklużjoni ta' riżultati pożittivi jew negattivi u, għalhekk, ir-rispons tas-sustanza kimika tat-test sejjer jiġi konkluż bħala ekwivoku.

Żieda fin-numru ta' ċelloli poliplojdi tista' tindika li s-sustanzi kimiċi tat-test għandhom il-potenzjal li jinibixxu l-proċessi mitotiċi u jwasslu aberrazzjonijiet kromożomiċi numeriċi (52). Żieda fin-numru ta' ċelloli bi kromożżomi endoreduplikati tista' tindika li s-sustanzi kimiċi tat-test għandhom il-potenzjal li jinibixxu l-progress taċ-ċiklu taċ-ċelloli (53) (54) (ara l-paragrafu 2). Għaldaqstant, l-inċidenza ta' ċelloli poliplojdi u ċelloli bi kromożomi endoreduplikati għandha tiġi rreġistrata b'mod separat.

Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

 

Sustanza kimika tat-test:

is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta' limitu għall-użu, jekk disponibbli

l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test stess, jekk magħrufa;

is-solubilità u l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent, jekk magħrufin;

il-kejl tal-pH, l-ożmolalità u l-preċipitat fil-medium tal-kultura li miegħu żdiedet is-sustanza kimika tat-test, kif xieraq.

 

Sustanza monokostitwenti:

id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;

identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.

 

Sustanzi multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:

ikkaratterizzati safejn possibbli mill-identità kimika (ara iktar 'il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.

 

Solventi:

ġustifikazzjoni għall-għażla tas-solvent.

il-perċentwal ta' solvent fil-medium tal-kultura finali għandu jiġi indikat ukoll.

 

Ċelloli:

tip u sors taċ-ċelloli

karatteristiċi karjotipiċi u l-adegwatezza tat-tip ta' ċellola użat;

in-nuqqas ta' mikoplażma, għal-linji ta' ċelloli;

għal-linji ta' ċelloli, informazzjoni dwar it-tul taċ-ċiklu taċ-ċellola, il-ħin għall-irduppjar jew l-indiċi tal-proliferazzjoni;

is-sess tad-donaturi tad-demm, l-età u kwalunkwe informazzjoni rilevanti dwar id-donatur, id-demm sħiħ jew il-linfoċiti separati, il-mitoġenu użat;

in-numru ta' passaġġi, jekk disponibbli, għal-linji ta' ċelloli;

il-metodi għall-manutenzjoni tal-kulturi taċ-ċelloli, għal-linji ta' ċelloli;

in-numru modali ta' kromożomi, għal-linji ta' ċelloli.

 

Kundizzjonijiet tat-test:

l-identità tal-inibitur tal-metafażi, il-konċentrazzjoni tiegħu u d-durata tal-esponiment taċ-ċelloli;

il-konċentrazzjoni tas-sustanza kimika tat-test espressa bħala konċentrazzjoni finali fil-medium tal-kultura (eż. μg jew mg/mL jew mM tal-medium tal-kultura).

ir-raġuni prinċipali għall-għażla tal-konċentrazzjonijiet u l-għadd ta' kulturi inklużi, eż. dejta dwar iċ-ċitotossiċità u limitazzjonijiet tas-solubilità;

il-kompożizzjoni tal-media, il-konċentrazzjoni tas-CO2 jekk applikabbli, il-livell ta' umdità;

il-konċentrazzjoni (u/jew il-volum) ta' solvent u s-sustanza kimika tat-test miżjuda fil-medium tal-kultura;

it-temperatura ta' inkubazzjoni;

il-ħin ta' inkubazzjoni;

id-durata tat-trattament;

il-ħin tal-ġbir wara t-trattament;

id-densità taċ-ċelloli fiż-żriegħ, jekk xieraq;

it-tip u l-kompożizzjoni tas-sistema ta' attivazzjoni metabolika (is-sors ta' S9, il-metodu ta' preparazzjoni tat-taħlita ta' S9, il-konċentrazzjoni jew il-volum ta' taħlita ta' S9 u l-S9 fil-medium tal-kultura finali, il-kontrolli tal-kwalità tal-S9);

is-sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv u negattiv, il-konċentrazzjonijiet finali għal kull kundizzjoni tat-trattament;

il-metodi tal-preparazzjoni tal-lametti u t-teknika użata għat-tilwin;

il-kriterji għall-aċċettabilità tal-assaġġi;

il-kriterji għall-ikklassifikar tal-aberrazzjonijiet;

in-numru ta' metafażijiet analizzati;

il-metodi għall-kejl taċ-ċitotossiċità;

kwalunkwe informazzjoni supplimentari rilevanti għaċ-ċitotossiċità u l-metodu użat;

il-kriterji biex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew ekwivoċi;

il-metodi użati sabiex jiġu stabbiliti l-pH, l-ożmolalità u l-preċipitazzjoni.

 

Ir-riżultati:

l-għadd ta' ċelloli ttrattati u l-għadd ta' ċelloli miġburin għal kull kultura meta jintużaw il-linji ta' ċelloli

il-kejliet taċ-ċitotossiċità, eż. RPD, RICC, MI, osservazzjonijiet oħrajn, jekk ikun hemm;

informazzjoni dwar it-tul taċ-ċiklu taċ-ċelloli, il-ħin għall-irduppjar jew l-indiċi tal-proliferazzjoni fil-każ tal-linji ta' ċelloli;

is-sinjali ta' preċipitazzjoni u l-ħin tad-determinazzjoni;

id-definizzjoni għall-aberrazzjonijiet, inklużi d-distakki;

In-numru ta' ċelloli kklassifikati, in-numru ta' ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi u t-tip ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi mogħtijin b'mod separat għal kull kultura ttrattata u tal-kontroll, inklużi u esklużi d-distakki;

bidliet fil-plojdija (ċelloli poliplojdi u ċelloli bi kromożomi endoreduplikati, mogħtijin b'mod separat), jekk jiġu osservati;

ir-relazzjoni konċentrazzjoni rispons, fejn possibbli,

id-dejta tal-kontroll negattiv (solvent) u pożittiv (konċentrazzjonijiet u solventI) parallel;

id-dejta tal-kontroll negattiv (solvent) u pożittiv, b'meded, medji u devjazzjonijiet standard u limiti ta' kontroll ta' 95 % għad-distribuzzjoni, kif ukoll in-numru ta' dejta;

analiżijiet statistiċi, il-valuri p, jekk ikun hemm.

 

Diskussjoni tar-riżultati.

 

Konklużjonijiet.

TAGĦRIF

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

(1976), “Cytological Methods for Detecting Chemical Mutagens”, in Chemical Mutagens, Principles and Methods for their Detection, Vol. 4, Hollaender, A. (ed.), Plenum Press, New York and London, pp. 1-29

(3)

Ishidate, M. Jr., T. Sofuni (1985), “The in vitro Chromosomal Aberration Test Using Chinese Hamster Lung (CHL) Fibroblast Cells in Culture” fi Progress in Mutation Research, Vol. 5, Ashby, J. et al. (eds.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam-New York- Oxford, pp. 427-432.

(4)

Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosomal aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.

(5)

Muehlbauer, P.A. et al. (2008), “Improving dose selection and identification of aneugens in the in vitro chromosome aberration test by integration of flow cytometry-based methods”, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/4, pp. 318-327.

(6)

Il-Kapitolu B.49 ta' dan l-Anness: Test In Vitro tal-Mikronukleu taċ-Ċelloli tal-Mammiferi.

(7)

ILSI paper (draft), Lorge, E., M. Moore, J. Clements, M. O Donovan, F. Darroudi, M. Honma, A. Czich, J van Benthem, S. Galloway, V. Thybaud, B. Gollapudi, M. Aardema, J. Kim, D.J. Kirkland, Recommendations for good cell culture practices in genotoxicity testing.

(8)

Scott, D. et al. (1991), Genotoxicity under Extreme Culture Conditions. A report from ICPEMC Task Group 9, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol.257/2, pp. 147-204.

(9)

Morita, T. et al. (1992), Clastogenicity of Low pH to Various Cultured Mammalian Cells, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 268/2, pp. 297-305.

(10)

Brusick, D. (1986), Genotoxic effects in cultured mammalian cells produced by low pH treatment conditions and increased ion concentrations, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 8/6, pp. 789-886.

(11)

Long, L.H. et al. (2007), Different cytotoxic and clastogenic effects of epigallocatechin gallate in various cell-culture media due to variable rates of its oxidation in the culture medium, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 634/1-2, pp. 177-183.

(12)

Nesslany, F. et al. (2008), Characterization of the Genotoxicity of Nitrilotriacetic Acid, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 49/6, pp. 439-452.

(13)

Galloway, S. (2000), Cytotoxicity and chromosome aberrations in vitro: Experience in industry and the case for an upper limit on toxicity in the aberration assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 191-201.

(14)

Kirkland, D. et al. (2005), Evaluation of the ability of a battery of three in vitro genotoxicity tests to discriminate rodent carcinogens and non-carcinogens. I: Sensitivity, specificity and relative predictivity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 584/1-2, pp. 1–256.

(15)

Greenwood, S. et al. (2004), Population doubling: a simple and more accurate estimation of cell growth suppression in the in vitro assay for chromosomal aberrations that reduces irrelevant positive results, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 43/1, pp. 36–44.

(16)

Hilliard, C.A. et al. (1998), Chromosome aberrations in vitro related to cytotoxicity of nonmutagenic chemicals and metabolic poisons, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 31/4, pp. 316–326.

(17)

Hedner K. et al. (1982), Sister chromatid exchanges and structural chromosomal aberrations in relation to age and sex, Human Genetics, Vol. 62, pp. 305-309.

(18)

Ramsey M.J. et al. (1995), The effects of age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting, Mutation Research, Vol. 338, pp. 95-106.

(19)

Coecke S. et al. (2005), Guidance on Good Cell Culture Practice. A Report of the Second ECVAM Task Force on Good Cell Culture Practice, ATLA, Vol. 33/3, pp. 261-287.

(20)

Henderson, L. et al. (1997), Industrial Genotoxicology Group collaborative trial to investigate cell cycle parameters in human lymphocyte cytogenetics studies, Mutagenesis, Vol.12/3, pp.163-167.

(21)

Ames, B.N., J. McCann, E. Yamasaki (1975), Methods for Detecting Carcinogens and Mutagens with the Salmonella/Mammalian Microsome Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 31/6, pp. 347-363.

(22)

Maron, D.M., B.N. Ames (1983), Revised Methods for the Salmonella Mutagenicity Test, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 113/3-4, pp. 173-215.

(23)

Natarajan, A.T. et al. (1976), Cytogenetic Effects of Mutagens/Carcinogens after Activation in a Microsomal System In Vitro, I. Induction of Chromosomal Aberrations and Sister Chromatid Exchanges by Diethylnitrosamine (DEN) and Dimethylnitrosamine (DMN) in CHO Cells in the Presence of Rat-Liver Microsomes, Mutation Research, Vol. 37/1, pp. 83-90.

(24)

Matsuoka, A., M. Hayashi, M. Jr. Ishidate (1979), Chromosomal Aberration Tests on 29 Chemicals Combined with S9 Mix in vitro, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 66/3, pp. 277-290.

(25)

Ong, T.-m. et al. (1980), Differential effects of cytochrome P450-inducers on promutagen activation capabilities and enzymatic activities of S-9 from rat liver, Journal of Environmental Pathology and Toxicology, Vol. 4/1, pp. 55-65.

(26)

Elliot, B.M. et al. (1992), Report of UK Environmental Mutagen Society Working Party. Alternatives to Aroclor 1254-induced S9 in in vitro Genotoxicity Assays, Mutagenesis, Vol. 7/3, pp. 175-177.

(27)

Matsushima, T. et al. (1976), “A Safe Substitute for Polychlorinated Biphenyls as an Inducer of Metabolic Activation Systems” in In Vitro Metabolic Activation in Mutagenesis Testing, de Serres, F.J. et al. (eds.), Elsevier, North-Holland, pp. 85-88.

(28)

Galloway, S.M. et al. (1994). Report from Working Group on in vitro Tests for Chromosomal Aberrations, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 241-261.

(29)

Johnson, T.E., D.R. Umbenhauer, S.M. Galloway (1996), Human liver S-9 metabolic activation: proficiency in cytogenetic assays and comparison with phenobarbital/beta-naphthoflavone or Aroclor 1254 induced rat S-9, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 28/1, pp. 51-59.

(30)

UNEP (2001), Stockholm Convention on Persistent Organic Pollutants, United Nations Environment Programme (UNEP). Disponibbli fuq: http://www.pops.int/.

(31)

Tucker, J.D., M.L. Christensen (1987), Effects of anticoagulants upon sister-chromatid exchanges, cell-cycle kinetics, and mitotic index in human peripheral lymphocytes, Mutation Research, Vol. 190/3, pp. 225-8.

(32)

Krahn, D.F., F.C. Barsky, K.T. McCooey (1982), “CHO/HGPRT Mutation Assay: Evaluation of Gases and Volatile Liquids” in Genotoxic Effects of Airborne Agents, Tice, R.R., D.L. Costa, K.M. Schaich (eds.), Plenum, New York, pp. 91-103.

(33)

Zamora, P.O. et al. (1983), Evaluation of an Exposure System Using Cells Grown on Collagen Gels for Detecting Highly Volatile Mutagens in the CHO/HGPRT Mutation Assay, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 5/6, pp. 795-801.

(34)

Asakura, M. et al. (2008), An improved system for exposure of cultured mammalian cells to gaseous compounds in the chromosomal aberration assay, Mutation Research, Vol. 652/2, pp. 122-130.

(35)

Lorge, E. et al. (2008), Comparison of different methods for an accurate assessment of cytotoxicity in the in vitro micronucleus test. I. Theoretical aspects, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 655/1-2, pp. 1-3.

(36)

Galloway, S. et al. (2011), Workshop summary: Top concentration for in vitro mammalian cell genotoxicity assays; and Report from working group on toxicity measures and top concentration for in vitro cytogenetics assays (chromosome aberrations and micronucleus), Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 77-83.

(37)

Honma, M. (2011), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 724/1-2, pp. 86-87.

(38)

Richardson, C. et al. (1989), Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays. Fi: Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.) Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(39)

OECD (2014), Document supporting the WNT decision to implement revised criteria for the selection of the top concentration in the in vitro mammalian cell assays on genotoxicity (Test Guidelines 473, 476 and 487) ENV/JM/TG(2014)17. Disponibbli fuq talba.

(40)

Morita, T., M. Honma, K. Morikawa (2012), Effect of reducing the top concentration used in the in vitro chromosomal aberration test in CHL cells on the evaluation of industrial chemical genotoxicity, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 741/1-2, pp. 32-56.

(41)

Brookmire, L., J.J. Chen, D.D. Levy (2013), Evaluation of the Highest Concentrations Used in the In Vitro Chromosome Aberrations Assay, Environmental and Molecular Muagenesis, Vol. 54/1, pp. 36-43.

(42)

EPA, Office of Chemical Safety and Pollution Prevention (2011), Chemical Substances of Unknown or Variable Composition, Complex Reaction Products and Biological Materials: UVCB Substances, http://www.epa.gov/opptintr/newchems/pubs/uvcb.txt.

(43)

USFDA (2012), International Conference on Harmonisation (ICH) Guidance S2 (R1) on Genotoxicity Testing and Data Interpretation for Pharmaceuticals Intended For Human Use. Disponibbli fuq: https://federalregister.gov/a/2012-13774.

(44)

OECD (2014), Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.

(45)

ISCN (2013), An International System for Human Cytogenetic Nomenclature, Schaffer, L.G., J. MacGowan-Gordon, M. Schmid (eds.), Karger Publishers Inc., Connecticut.

(46)

Scott, D. et al. (1990), “Metaphase chromosome aberration assays in vitro”, in Basic Mutagenicity Tests: UKEMS Recommended Procedures, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 62-86.

(47)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control Data, Mutation Research, Vol. 723/2, pp. 87-90.

(48)

Ryan, T. P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd Edition, John Wiley and Sons, New York.

(49)

Fleiss, J. L., B. Levin, M.C. Paik (2003), Statistical Methods for Rates and Proportions, 3rd ed., John Wiley & Sons, New York.

(50)

Galloway, S.M. et al. (1987), Chromosome aberration and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: Evaluation of 108 chemicals, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 10/suppl. 10, pp. 1-175.

(51)

Richardson, C. et al. (1989), “Analysis of Data from In Vitro Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 141-154.

(52)

Warr, T.J., E.M. Parry, J.M. Parry (1993), A comparison of two in vitro mammalian cell cytogenetic assays for the detection of mitotic aneuploidy using 10 known or suspected aneugens, Mutation Research, Vol. 287/1, pp. 29-46.

(53)

Locke-Huhle, C. (1983), Endoreduplication in Chinese hamster cells during alpha-radiation induced G2 arrest, Mutation Research, Vol. 119/3, pp. 403-413.

(54)

Huang, Y., C. Change, J.E. Trosko (1983), Aphidicolin — induced endoreduplication in Chinese hamster cells, Cancer Research, Vol. 43/3, pp. 1362-1364.

(55)

Soper, K.A., S.M. Galloway (1994), Cytotoxicity measurement in in vitro chromosome aberration test and micronucleus test, Mutation Research, Vol. 312, pp. 139-149.

Appendiċi 1

DEFINIZZJONIJIET

Anewplojdija : kwalunkwe devjazzjoni mill-għadd ta' diplojdi (jew aplojdi) normali ta' kromożomi minn kromożomu wieħed jew aktar, iżda mhux mis-sett(ijiet) kollu/kollha ta' kromożomi (poliplojdija).

Apoptożi : mewta programmata taċ-ċelloli kkaratterizzata minn sensiela ta' passi li jwasslu għal diżintegrazzjoni taċ-ċelloli fil-partikoli mwaħħlin mal-membrana li mbagħad jiġu eliminati permezz ta' fagoċitożi jew permezz ta' tixrid.

Proliferazzjoni taċ-ċelloli : żieda fl-għadd ta' ċelloli bħala riżultat ta' diviżjoni mitotika taċ-ċelloli.

Sustanza kimika : sustanza jew taħlita.

Ksur tal-kromatid : diskontinwità ta' kromatid wieħed fejn ikun hemm nuqqas ta' allinjament ċar ta' wieħed mill-kromatidi.

Distakk kromatidu : reġjun mingħajr tilwin (leżjoni akromatika) ta' kromatid wieħed fejn ikun hemm nuqqas minimu ta' allinjament tal-kromatid.

Aberrazzjoni tat-tip tal-kromatidi : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi.

Aberrazzjoni tat-tip tal-kromożomi : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku.

Klastoġenu : kwalunkwe sustanza kimika li tikkawża aberrazzjonijiet kromożomiċi f'popolazzjonijiet ta' ċelloli jew organiżmi ewkarjotiċi.

Konċentrazzjonijiet : irreferi għal konċentrazzjonijiet finali tas-sustanza kimika tat-test fil-medium tal-kultura.

Ċitotossiċità : Għall-assaġġi koperti f'dan il-metodu ta' ttestjar li jużaw linji ta' ċelloli, iċ-ċitotossiċità hija identifikata bħala tnaqqis fl-irduppjar relattiv tal-popolazzjoni (RPD) jew iż-żieda relattiva fl-għadd taċ-ċelloli (RICC) taċ-ċelloli ttrattati meta mqabblin mal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 17 u l-Appendiċi 2). Għall-assaġġi koperti f'dan il-metodu ta' ttestjar li jużaw kulturi primarji ta' linfoċiti, iċ-ċitotossiċità hija identifikata bħala tnaqqis fl-indiċi mitotiku (MI) taċ-ċelloli ttrattati meta mqabblin mal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 18 u l-Appendiċi 2).

Endoreduplikazzjoni : proċess li bih wara perjodu S tar-replikazzjoni tad-DNA, in-nukleu ma jidħolx f'mitożi iżda jibda perjodu S ieħor. Ir-riżultat huwa kromożomi b'4, 8, 16,… il-kromatid.

Ġenotossiċi : terminu ġenerali li jkopri t-tipi kollha ħsara lid-DNA jew lill-kromożomi, inklużi ksur, tħassiriet, addotti, modifiki u konnessjonijiet tan-nukleotidi, riarranġamenti, mutazzjonijiet tal-ġeni, aberrazzjonijiet kromożomiċi, u anewplojdija. Mhux it-tipi kollha ta' effetti ġenotossiċi jirriżultaw f'mutazzjonijiet jew ħsara fil-kromożomi stabbli.

Indiċi mitotiku (MI) : il-proporzjon ta' ċelloli fil-metafażi diviż bin-numru totali ta' ċelloli osservati f'popolazzjoni ta' ċelloli; indikazzjoni tal-livell ta' profilerazzjoni ta' dik il-popolazzjoni.

Mitożi : diviżjoni tan-nukleu taċ-ċelloli li normalment jinqasam fi profażi, prometafażi, metafażi, anafażi u telofażi.

Mutaġeniku : jipproduċi bidla ereditarja ta' sekwenza(i) tal-koppja ta' bażijiet tad-DNA f'ġeni jew tal-istruttura tal-kromożomi (aberrazzjonijiet kromożomiċi).

Aberrazzjoni numerika : bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' ċelloli użati.

Poliplojdija : aberrazzjonijiet kromożomiċi numeriċi f'ċelloli jew organiżmi li jinvolvu sett(ijiet) sħiħ(sħaħ) ta' kromożomi, għall-kuntrarju ta' kromożomu jew kromożomi individwali (anewplojdija).

Status p53 : il-proteina p53 hija involuta fir-regolamentazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli, l-apoptożi u t-tiswija tad-DNA. Ċelloli b'defiċjenza fil-proteina p53 funzjonali, li mhux kapaċi jinibixxu ċ-ċiklu taċ-ċelloli jew jelimintaw iċ-ċelloli bil-ħsara b'apoptożi jew mekkaniżmi oħrajn (eż. induzzjoni tat-tiswija tad-DNA) marbutin mal-funzjonijiet p53 f'rispons għall-ħsara fid-DNA, teoretikament għandhom ikunu iktar suxxettibbli għal mutazzjonijiet tal-ġeni jew aberrazzjonijiet kromożomiċi.

Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (RICC) : iż-żieda fin-numru ta' ċelloli f'kulturi esposti għas-sustanza kimika kontra żieda f'kulturi mhux ittrattati, proporzjon espress bħala perċentwal.

Irduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (RPD) : iż-żieda fin-numru ta' raddoppji tal-popolazzjoni f'kulturi esposti għas-sustanza kimika kontra żieda f'kulturi mhux ittrattati, proporzjon espress bħala perċentwal.

Frazzjoni tal-fwied S9 : supernatant ta' omoġenat tal-fwied wara ċentrifugazzjoni ta' 9 000 g, jiġifieri estratt minn fwied mhux ipproċessat.

Taħlita ta' F9 : taħlita tal-frazzjoni tal-fwied S9 u l-kofatturi neċessarji għall-attività tal-enzimi metaboliċi.

Kontrolli tas-solvent : Terminu ġenerali li jiddefinixxi l-kulturi tal-kontroll li jirċievu s-solvent waħdu użat sabiex jiddisolvi s-sustanza kimika tat-test.

Aberrazzjoni strutturali : bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku tal-istadju metafażiku tad-diviżjoni taċ-ċelluoli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.

Sustanza kimika tat-test : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.

Kontrolli mhux ittrattati : kulturi li ma jirċievu ebda trattament (jiġifieri ebda sustanza kimika tat-test u lanqas solvent) iżda jiġu pproċessati fl-istess ħin bl-istess mod bħall-kulturi li jirċievu s-sustanza kimika tat-test.

Appendiċi 2

FORMOLI GĦALL-VALUTAZZJONI TAĊ-ĊITOTOSSIĊITÀ

Indiċi mitotiku (MI):

Formula

Iż-Żieda Relattiva fl-Għadd taċ-Ċelloli (RICC) jew l-Irduppjar Relattiv tal-Popolazzjoni (RPD), minħabba li t-tnejn iqisu l-proporzjon tal-popolazzjoni taċ-ċelloli li tkun iddividiet ruħha.

Formula

Formula

fejn:

Irduppjar tal-Popolazzjoni = [log (Numru ta' ċelloli wara t-trattament ÷ Numru ta' ċelloli inizjali)] ÷ log 2

Pereżempju, RICC, jew RPD ta' 53 % jindikaw ċitotossiċità/ċitostażi ta' 47 % u ċitotossiċità/ċitostażi ta' 55 % imkejla bl-MI tfisser li l-MI attwali huwa 45 % tal-kontroll.

Fi kwalunkwe każ, l-għadd ta' ċelloli qabel it-trattament għandu jitkejjel u l-istess għal kulturi ttrattati u tal-kontroll negattiv.

Filwaqt li l-RCC (jiġifieri n-Numru ta' ċelloli f'kulturi tat-trattament/ Numru ta' ċelloli f'kulturi tal-kontroll) intuża bħala parametru taċ-ċitotossiċità fl-imgħoddi, illum ma għadux rakkomandat għaliex jista' jissottovaluta ċ-ċitotossiċità

Fil-kulturi tal-kontroll negattiv, l-irduppjar tal-popolazzjoni għandu jkun kompatibbli mar-rekwiżit li jittieħed kampjun taċ-ċelloli wara t-trattament fi żmien ekwivalenti għal madwar darba u nofs it-tul normali taċ-ċiklu taċ-ċelloli u l-indiċi mitotiku għandu jkun għoli biżżejjed sabiex jinkiseb numru suffiċjenti ta' ċelloli fil-mitożi u sabiex jiġi kkalkolat b'mod affidabbli tnaqqis ta' 50 %.

(4)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.11 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.11   Test Tal-Aberrazzjoni Fil-Kromożomi Tal-Mudullun Tal-Mammiferi

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 475 (2016) tal-OECD Huwa parti minn sensiela ta' metodi ta' ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. Ġie żviluppat dokument tal-OECD li jipprovdi informazzjoni sintetika dwar l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali dwar it-tibdil reċenti la sar f'dawk il-Linji Gwida tat-Test (1).

It-test in vivo tal-aberrazzjoni fil-kromożomi tal-mudullun tal-mammiferi huwa ta' rilevanza partikolari għall-valutazzjoni tal-ġenotossiċità għaliex, għad li jvarja bejn l-ispeċijiet, il-fatturi tal-metaboliżmu in vivo, il-farmakokinetiċi u l-proċessi ta' tiswija tad-DNA huma attivi u jikkontribwixxu għar-risponsi. Assaġġ in vivo huwa siewi wkoll sabiex tkun tista' ssir investigazzjoni ulterjuri tal-ġenotossiċità żvelata minn sistema in vitro.

It-test in vivo ta' aberrazzjoni kromożomika fil-mammiferi jintuża sabiex jinstabu aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali indotti mis-sustanzi kimiċi tat-test fiċ-ċelloli tal-mudullun tal-annimali, normalment rodituri (2) (3) (4) (5). L-aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali jistgħu jkunu ta' żewġ tipi, kromożomiċi jew kromatidi. Filwaqt li l-maġġoranza ta' aberrazzjonijiet ġenotossiċi indotti bis-sustanzi kimiċi huma tat-tip kromatid, jistgħu jseħħu aberrazzjonijiet tat-tip kromożomiku wkoll. Il-ħsara kromożomika u l-avvenimenti relatati huma l-kawża ta' ħafna mard ġenetiku fil-bniedem u hemm evidenza sostanzjali li, meta dawn il-leżjonijiet u l-avvenimenti relatati jikkaġunaw alterazzjonijiet f'onkoġeni u f'ġeni li jrażżnu t-tumuri, dawn ikunu involuti fil-ħolqien tal-kanċer fil-bniedem u sistemi sperimentali. Tista' sseħħ piloplojdija (inkluża endoreduplikazzjoni) f'assaġġi tal-aberrazzjoni kromożomika in vivo. Madankollu, żieda fil-poliplojdija waħedha ma tindikax potenzjal anewġeniku u tista' tindika sempliċi perturbazzjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli jew ċitotossiċità. It-test mhuwiex imfassal sabiex ikejjel l-anewplojdija. Test in vivo tal-mikronukleu fl-eritroċiti mammiferi (Kapitolu B.12 ta' dan l-Anness) jew it-test in vitro tal-mikronukleu taċ-ċelloli tal-mammiferi (Kapitolu B.49 ta' dan l-Anness) ikunu t-testijiet in vivo u in vitro, rispettivament, rakkomandati għas-sejbien ta' anewplojdija.

Id-definizzjonijiet tat-terminoloġija użata huma stabbiliti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

F'dan it-test spiss jintużaw rodituri, iżda f'ċerti każijiet jista' jkun hemm speċijiet oħrajn li jkunu xierqa, jekk ikunu ġġustifikati xjentifikament. Il-mudullun huwa t-tessut fil-mira ta' dan it-test, peress li huwa tessut ferm vaskularizzat u fih popolazzjoni ta' ċelluli b'ċiklu rapidu li jistgħu jkunu faċilment iżolati u pproċessati. Fir-rapport għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika meta jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex firien u ġrieden. Jekk jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex rodituri, huwa rakkomandat li l-kejl tal-aberrazzjoni kromożomika tal-mudullun jiġi integrat f'test xieraq ieħor tat-tossiċità.

Jekk ikun hemm evidenza li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test, jew il-metabolit(i) tagħha, mhumiex sejrin jilħqu t-tessut fil-mira, jaf ma jkunx xieraq li jintuża dan it-test.

Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.

IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR

L-annimali huma esposti għas-sustanza kimika tat-test permezz ta' rotta xierqa ta' esponiment u jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju fi żmien xieraq wara t-trattament. Qabel l-ewtanażija, l-annimali jiġu ttrattati b'inibitur tal-metafażi (eż. kolċisina jew kolċemid). Imbagħad isiru preparazzjonijiet tal-kromożomi miċ-ċelloli tal-mudullun u dawn jitlewnu, u ċ-ċelluli fil-metafażi jiġu analizzati għal aberrazzjonijiet kromożomiċi.

VERIFIKA TAL-PROFIĊJENZA TAL-LABORATORJU

Investigazzjonijiet tal-Profiċjenza

Sabiex tiġi stabbilita biżżejjed esperjenza fit-twettiq tal-assaġġ qabel ma jintuża għal testijiet ta' rutina, il-laboratorju għandu jkun wera li għandu l-ħila li jirriproduċi r-riżultati mistennijin mid-dejta ppubblikata (eż. (6)) għal frekwenzi ta' aberrazzjonijiet kromożomatiċi b'tal-inqas żewġ sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv (inklużi risponsi dgħajfin indotti minn dożi baxxi ta' kontrolli pożittivi), bħal dawk elenkati fit-Tabella 1 u b'kontrolli tal-veikolu/solvent kompatibbli (ara l-paragrafu 22). Dawn l-esperimenti għandhom jużaw dożi li jagħtu żidiet riproduċibbli u relatati mad-dożi u juru s-sensittività u l-medda dinamika tas-sistema tat-test fit-tessut ta' interess (il-mudullun) u jużaw il-metodu tal-punteġġ li sejjer jitħaddem fil-laboratorju. Dan ir-rekwiżit mhuwiex applikabbli għal laboratorji li għandhom esperjenza, jiġifieri li għandhom database storika disponibbli kif definita fil-paragrafi 10-14.

Dejta Storika tal-Kontroll

Matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza, il-laboratorju għandu jistabbilixxi:

Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll pożittiv, u

Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll negattiv.

Meta għall-ewwel tinkiseb id-dejta għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu konsistenti mad-dejta tal-kontroll ippubblikata, meta tkun teżisti. Peress li tiżdied iktar dejta sperimentali mad-distribuzzjoni storika tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % ta' dik id-distribuzzjoni. Id-database storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju għandha tkun statistikament robusta sabiex tiġi żgurata l-ħila tal-laboratorju sabiex jivvaluta d-distribuzzjoni tad-dejta tal-kontroll negattiv tiegħu. It-tagħrif jissuġġerixxi li jista' jkun hemm bżonn ta' minimu ta' 10 esperimenti iżda idealment ikun hemm tal-inqas 20 esperiment imwettqin f'kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta' kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (7)), sabiex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-dejta tagħhom, u sabiex juru li l-metodoloġija hija “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom. Rakkomandazzjonijiet ulterjuri dwar kif jibnu u jużaw id-dejta storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta' dejta fid-dejta storika u l-kriterji ta' aċċettabilità għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (8).

Meta l-laboratorju ma jagħmilx numru kbir biżżejjed ta' esperimenti sabiex jistabbilixxi distribuzzjoni statistikament robusta tal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 11) matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza (deskritti fil-paragrafu 9), jista' jiġi aċċettat li d-distribuzzjoni tinbena matul l-ewwel testijiet ta' rutina. Dan l-approċċ għandu jsegwi r-rakkomandazzjonijiet stipulati fit-tagħrif (8) u r-riżultati tal-kontroll negattiv miksubin f'dawn l-esperimenti għandhom jibqgħu konsistenti mad-dejta ppubblikata tal-kontroll negattiv.

Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-impatt tagħha fuq kemm id-dejta li tirriżulta tibqa' konsistenti mad-database storika eżistenti tal-kontroll tal-laboratorju. Inkonsistenzi kbar biss għandhom jirriżultaw fl-istabbiliment ta' database storika ġdida tal-kontroll, fejn il-ġudizzju tal-esperti jistabbilixxi li tvarja mid-distribuzzjoni ta' qabel (ara l-paragrafu 11). Matul l-istabbiliment mill-ġdid, jaf ma jkunx hemm bżonn ta' database sħiħa tal-kontroll negattiv sabiex ikun jista' jsir test propju, diment li l-laboratorju jkun jista' juri li l-valuri tal-kontroll negattiv parallel tiegħu jibqgħu konsistenti mad-database ta' qabel jew mad-dejta ppubblikata korrispondenti.

Id-dejta tal-kontroll negattiv għandha tikkonsisti fl-inċidenza tal-aberrazzjoni kromożomika strutturali (esklużi d-distakki) f'kull annimal. Idealment, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % tad-distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju. Meta d-dejta tal-kontroll negattiv parallel toħroġ mil-limiti ta' kontroll ta' 95 %, din tista' titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll diment li din id-dejta ma tkunx eċċezzjoni estrema u jkun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara l-paragrafu 11) u ebda evidenza ta' żball tekniku jew uman.

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Preparamenti

Għażla ta' speċi tal-annimali

Għandhom jintużaw razez użati spiss fil-laboratorju ta' annimali żgħar b'saħħithom. Il-firien jintużaw l-iktar spiss, għad li l-ġrieden jistgħu jkunu adattati wkoll. Tista' tintuża kwalunkwe speċi ta' mammiferi xierqa oħra, jekk tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika fir-rapport.

Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf tal-annimali

Għar-rodituri, it-temperatura fil-kamra tal-annimali għandha tkun ta' 22 °C (± 3 °C). Għad li, idealment, l-umdità relattiva għandha tkun ta' 50-60 %, għandha tkun tal-inqas 40 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta' ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista' tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta' sustanza kimika tat-test meta tingħata minn din ir-rotta. Ir-rodituri għandhom jitrabbew fi gruppi żgħar (mhux iktar minn ħamsa f'gaġġa) tal-istess sess u grupp tat-trattament jekk ma tkun mistennija ebda mġiba aggressiva, idealment f'gaġeġ solidi mal-art bl-arrikkiment ambjentali xieraq. L-annimali jistgħu jitrabbew waħedhom biss jekk dan ikollu ġustifikazzjoni xjentifika.

Preparazzjoni tal-annimali

Normalment jintużaw annimali adulti żgħar b'saħħithom (għal rodituri, idealment 6-10 ġimgħat fil-bidu tat-trattament, għad li jistgħu jiġu aċċettati annimali ftit ixjaħ ukoll), u dawn jiġu assenjati b'mod aleatorju għall-gruppi tal-kontroll u tat-trattament. L-annimali individwali jiġu identifikati b'mod uniku bl-użu ta' metodu umanitarju u l-inqas invasiv possibbli (eż. b'ċirku madwarhom, tikketti, mikroċipep jew identifikazzjoni bijometrika, iżda mhux b'titqib fil-widnejn jew fis-swaba') u jitħallew iderru fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal tal-inqas ħamest ijiem. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b'mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. Għandha tiġi evitata kontaminazzjoni kroċjata mill-kontroll pożittiv u s-sustanza kimika tat-test. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali għandha tkun minima u ma taqbiżx ± 20 % tal-piż medju ta' kull sess.

Preparazzjoni tad-dożi

Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f'solventi jew veikoli xierqa jew jitħalltu f'dieta jew ilma tajjeb għax-xorb qabel id-dożaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiġu dożati direttament jew jiġu dilwiti qabel id-dożaġġ. Għal esponimenti bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw bħala gass, fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħhom. Għandhom jintużaw preparati ġodda tas-sustanza kimika tat-test sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix l-aċċettabilità tal-ħżin u tiddefinixxi l-kundizzjonijiet tal-ħżin xierqa.

Solvent/veikolu

Is-solvent/veikolu ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli ta' doża użati, u ma għandu jkun hemm l-ebda suspett ta' reazzjoni kimika mas-sustanzi kimiċi tat-test. Jekk jintużaw solventi/veikoli oħrajn li mhumiex magħrufin sew, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta permezz ta' dejta ta' referenza li tindika l-kompatibbiltà tagħhom. Huwa rakkomandat li, fejn jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/veikolu milwiem. Eżempji ta' solventi/veikoli kompatibbli użati spiss jinkludu ilma, salina fiżjoloġika, soluzzjoni tal-metilċelluloża, soluzzjoni tal-melħ tas-sodju taċ-ċelluloża tal-karbossimetilċelluloża, żejt taż-żebbuġa u żejt tal-qamħirrum. Fin-nuqqas ta' dejta storika jew ippubblikata tal-kontroll li turi li ma huma indotti ebda aberrazzjoni strutturali jew effett dannuż ieħor minn solvent/veikolu atipiku magħżul, għandu jsir studju inizjali sabiex tiġi stabbilita l-aċċettabbiltà tal-kontroll tas-solvent/veikolu.

Kontrolli

Kontrolli pożittivi

Normalment għandu jkun inkluż grupp ta' annimali ttrattati b'sustanza kimika tal-kontroll pożittiv ma' kull test. Dan jista' jiġi rrinunzjat meta l-laboratorju tal-ittestjar ikollu profiċjenza murija fit-twettiq tat-test u jkun stabbilixxa medda storika tal-kontroll pożittiv. Meta ma jkunx hemm grupp tal-kontroll pożittiv parallel inkluż, il-kontrolli tal-punteġġ (lametti fissi u mhux imlewnin) għandhom ikunu inklużi f'kull esperiment. Dawn jistgħu jinkisbu billi fl-ikklassifikar tal-istudju jiddaħħlu kampjuni ta' referenza xierqa li nkisbu u nħażnu minn esperiment tal-kontroll pożittiv separat imwettaq b'mod perjodiku (eż. kull 6-18-il xahar) fil-laboratorju fejn isir it-test; pereżempju, matul l-ittestjar tal-profiċjenza u fuq bażi regolari wara, fejn ikun hemm bżonn.

Is-sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv għandhom jipproduċu b'mod affidabbli żieda identifikabbli fil-frekwenza taċ-ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fuq il-livell spontanju. Id-dożi tal-kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tal-kampjuni kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettabbli li l-kontroll pożittiv jingħata b'rotta differenti mis-sustanza kimika tat-test, bl-użu ta' skeda tat-trattament differenti, u li l-kampjunar iseħħ biss f'waqt partikolari biss. Barra minn dan, jista' jiġi kkunsidrat l-użu ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv relatati mal-klassi tas-sustanzi kimiċi, meta xieraq. Fit-Tabella 1 hemm inklużi eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv.

Tabella 1

Eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv

Sustanza Kimika

CASRN

Metansulfonat tal-etil

62-50-0

Metansulfonat tal-metil

66-27-3

Nitrosurea tal-etil

759-73-9

Mitomiċina C

50-07-7

Ċiklofosfamida (monoidrat)

50-18-0 (6055-19-2)

Trietilenmelamina

51-18-3

Kontrolli negattivi

L-annimali tal-grupp tal-kontroll negattiv għandhom ikunu inklużi f'kull ħin tal-kampjunar u l-bqija jiġu mmaniġġjati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, ħlief li ma jirċivux trattament bis-sustanza kimika tat-test. Jekk jintuża solvent/veikolu fl-għoti tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi dan is-solvent/il-veikolu. Madankollu, jekk jintwera li hemm varjabbiltà konsistenti bejn l-annimali u frekwenzi ta' ċelloli b'aberrazzjonijiet strutturali permezz ta' dejta storika tal-kontroll negattiv f'kull waqt tal-kampjunar għal-laboratorju tal-ittestjar, jaf ikun hemm bżonn ta' kampjunar wieħed biss għall-kontroll negattiv. Meta jintuża kampjunar wieħed għall-kontrolli negattivi, għandu jkun l-ewwel waqt tal-kampjun użat fl-istudju.

PROĊEDURA

In-numru u s-sess tal-annimali

B'mod ġenerali, ir-rispons tal-mikronukleu huwa simili bejn l-annimali rġiel u nisa (9) u mhuwiex mistenni li dan sejjer iseħħ ukoll għal aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali; għalhekk, ħafna mill-istudji jistgħu jsiru f'kull sess. Dejta li turi d-differenzi rilevanti bejn l-irġiel u n-nisa (eż. differenzi fit-tossiċità sistemika, il-metaboliżmu, il-bijodisponibilità, it-tossiċità tal-mudullun, eċċ. inkluż, eż. studju għat-tiftix tal-medda) tħeġġeġ l-użu taż-żewġ sessi. F'dan il-każ, jaf ikun xieraq li jsir studju fiż-żewġ sessi, eż. bħala parti minn studju ripetut tat-tossiċità tad-doża. Jaf ikun xieraq li jintuża d-disinn fattorjali f'każ li jintużaw iż-żewġ sessi. Dettalji dwar kif tiġi analizzata d-dejta bl-użu ta' dan id-disinn huma mogħtijin fl-Appendiċi 2.

Id-daqsijiet tal-grupp fil-bidu tal-istudju għandhom jiġu stabbiliti bil-għan li jiġu pprovduti tal-inqas 5 annimali analizzabbli ta' sess wieħed, jew ta' kull sess jekk jintużaw it-tnejn, għal kull grupp. Fejn l-esponiment umana għas-sustanzi kimiċi tista' tkun speċifika għas-sess, bħal ma jseħħ pereżempju għal ċerti prodotti farmaċewtiċi, it-test għandu jsir b'annimali tas-sess xieraq. Bħala gwida għal rekwiżiti tipiċi massimi tal-annimali, studju fil-mudullun f'żewġ waqtiet tal-kampjunar bi tliet gruppi tad-doża u grupp tal-kontroll negattiv parallel, flimkien ma' grupp tal-kontroll pożittiv (kull grupp imsawwar minn ħames annimali ta' sess uniku), ikun jeħtieġ 45 annimal.

Livelli tad-doża

Jekk isir studju preliminari għat-tiftix tal-medda għaliex ma jkun hemm ebda dejta xierqa diġà disponibbli sabiex tgħin fl-għażla tad-doża, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, bl-użu tal-istess speċijiet, razza, sess u reġim tat-trattament li jrid jintuża fl-istudju ewlieni (10). L-istudju għandu jkollu l-għan li jidentifika d-doża massima tollerata (MTD), definita bħala l-ogħla doża li sejra tiġi tollerata mingħajr evidenza ta' tossiċità li tillimita l-istudju, b'rabta mad-durata tal-perjodu tal-istudju (pereżempju, billi tiġi indotta dipressjoni tal-piż tal-ġisem jew ċitotossiċità tas-sistema ematopoetika), iżda mhux mewt jew evidenza ta' uġigħ, tbatija jew diffikultà li jeħtieġu ewtanażja umanitarja (11).

L-ogħla doża tista' tiġi definita wkoll bħala doża li tipproduċi xi indikazzjoni ta' tossiċità għall-mudullun.

Sustanzi kimiċi li jesibixxu saturazzjoni tal-proprjetajiet tossikokinetiċi, jew jinduċu proċessi ta' ditossifikazzjoni li jistgħu jwasslu għal tnaqqis fl-esponiment wara trattament fit-tul jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' ssettar tad-dożi u għandhom jiġu evalwati fuq bażi ta' każ b'każ.

Sabiex tinkiseb informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, studju sħiħ għandu jinkludi grupp tal-kontroll negattiv u tal-inqas tliet livelli ta' dożi ġeneralment separati b'fattur ta' 2, iżda mhux ikbar minn 4. Jekk is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix tossiċità fi studju għat-tiftix tal-medda jew fuq il-bażi tad-dejta eżistenti, l-ogħla doża għal amministrazzjoni waħda għandha tkun ta' 2 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem. Madankollu, jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna tossiċità, l-MTD għandha tkun l-ogħla doża mogħtija u l-livelli tad-doża użati idealment għandhom ikopru medda mill-massimu sa doża li tipproduċi ftit tossiċità jew ebda tossiċità. Meta tiġi osservata tossiċità tat-tessut fil-mira (il-mudullun) fil-livelli tad-doża kollha ttestjati, huwa rakkomandat li jsir studju ulterjuri f'dożi mhux tossiċi. Studji li jkollhom l-għan li jikkaratterizzaw iktar bis-sħiħ l-informazzjoni kwantitattiva dwar ir-rispons għad-doża jistgħu jeħtieġu gruppi tad-doża addizzjonali. Għal ċerti tipi ta' sustanzi kimiċi tat-test (eż. prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem) koperti minn rekwiżiti speċifiċi, dawn il-limiti jistgħu jvarjaw.

Test tal-limitu

Jekk l-esperimenti għat-tiftix tal-medda, jew dejta eżistenti minn razez ta' annimali relatati, jindikaw li reġim tat-trattament ta' tal-inqas id-doża limitu (deskritta hawn taħt) ma jipproduċi ebda effett tossiku osservabbli (inkluż ebda dipressjoni tal-proliferazzjoni tal-mudullun jew evidenza oħra ta' ċitotossiċità tat-tessut fil-mira), u jekk ma tkunx mistennija ġenotossiċità fuq il-bażi ta' studji in vitro tal-ġenotossiċità jew dejta minn sustanzi kimiċi relatati strutturalment, f'dak il-każ jaf ma jitqiesx neċessarju li jsir studju sħiħ li juża tliet livelli tad-doża, diment li jkun intwera li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tilħaq it-tessut fil-mira (il-mudullun). F'dawn il-każijiet, livell tad-doża wieħed, fid-doża limitu, jista' jkun biżżejjed. Għal perjodu ta' amministrazzjoni ta' > 14-il jum, id-doża limitu hija ta' 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum. Għal perjodi ta' amministrazzjoni ta' 14-il jum jew inqas, id-doża limitu hija 2 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum.

Amministrazzjoni tad-dożi

Ir-rotta antiċipata tal-esponiment tal-bniedem għandha tiġi kkunsidrata meta jitfassal assaġġ. Għaldaqstant, jistgħu jingħażlu rotot tal-esponiment bħal rotta djetetika, mal-ilma tax-xorb, subkuntanja topika, fil-vini, orali (gavage), mat-teħid man-nifs, intratrakeali, jew b'impjant, kif iġġustifikati. Fi kwalunke każ, ir-rotta għandha tingħażel sabiex jiġi żgurat esponiment adegwat tat-tessut(i) fil-mira. Ġeneralment ma tkunx rakkomandata injezzjoni intraperitoneali peress li mhijiex rotta intiża ta' esponiment tal-bniedem, u għandha tintuża biss b'ġustifikazzjoni xjentifika speċifika. Jekk is-sustanza kimika tat-test tiġi mħallta fid-dieta jew l-ilma tax-xorb, speċjalment fil-każ ta' dożaġġ wieħed, wieħed għandu joqgħod attent li l-ħin bejn il-konsum tal-ikel u l-ilma u l-kampjunar ikun biżżejjed sabiex ikunu jistgħu jiġu identifikati l-effetti (ara l-paragrafi 33-34). Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jingħata b'gavage jew injezzjoni f'darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Normalment il-volum ma għandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta' soluzzjonijiet milwiema fejn jistgħu jintużaw massimu ta' 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ikbar minn dan għandu jkun iġġustifikat. Ħlief għal sustanzi kimiċi tat-test irritanti jew korrużivi, li normalment jipproduċu effetti aggravati f'konċentrazzjonijiet ikbar, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandu jitnaqqas kemm jista' jkun billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni sabiex tiġi żgurata amministrazzjoni ta' volum kostanti b'rabta mal-piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-doża.

Skeda tat-trattament

Normalment is-sustanzi kimiċi tat-test jingħataw bħala trattament wieħed, iżda jistgħu jingħataw bħala doża maqsuma (jiġifieri żewġ trattamenti jew iktar fl-istess ġurnata separati b'mhux iktar minn sagħtejn jew tlieta) sabiex jiġi ffaċilitat l-għoti ta' volum kbir. F'dawn iċ-ċirkustanzi, jew meta s-sustanza kimika tat-test tingħata bit-teħid man-nifs, il-ħin tal-kampjunar għandu jiġi skedat fuq il-bażi tal-ħin tal-aħħar dożaġġ jew tmiem l-esponiment.

Ftit li xejn hemm dejta disponibbli dwar l-adegwatezza ta' protokoll ta' doża ripetuta għal dan it-test. Madankollu, fiċ-ċirkustanzi li fihom ikun xieraq li jiġi integrat dan it-test b'test dwar it-tossiċità b'doża ripetuta, wieħed għandu joqgħod attent li jevita milli jintilfu ċelloli mitotiċi bi ħsara fil-kromożomi, xi ħaġa li tista' sseħħ b'dożi tossiċi. Integrazzjoni bħal din tkun aċċettabbli meta l-ogħla doża tkun ikbar jew daqs id-doża limitu (ara l-paragrafu 29) u grupp tad-doża jingħata d-doża limitu għad-durata tal-perjodu tat-trattament. It-test tal-mikronukleu (il-metodu ta' ttestjar B.12) għandu jitqies bħala t-test in vivo tal-għażla għal aberrazzjonijiet kromożomiċi meta tkun mixtieqa integrazzjoni ma' studji oħrajn.

Għandhom jittieħdu kampjuni tal-mudullun f'żewġ ħinijiet separati wara trattamenti uniċi. Għal rodituri, l-ewwel intervall ta' kampjunar għandu jkun il-ħin neċessarju sabiex jgħaddu darba u nofs it-tul taċ-ċiklu normali taċ-ċelloli (b'dan tal-aħħar li normalment ikun 12-18-il siegħa wara l-perjodu tat-trattament). Ladarba l-ħin meħtieġ għall-bidu u l-metaboliżmu tas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test kif ukoll l-effetti tagħha fuq il-kinetika taċ-ċikli taċ-ċelloli jistgħu jaffettwaw il-ħin ottimali sabiex wieħed jintebaħ bl-aberrazzjoni kromożomika, huwa rakkomandat li jittieħed kampjun ieħor 24 siegħa wara li jkun ittieħed l-ewwel kampjun. Fl-ewwel ħin tal-kampjunar, il-gruppi kollha tad-doża għandhom jiġu ttrattati u jinġabru kampjuni għall-analiżi; madankollu, fil-ħin(ijiet) tal-kampjunar iktar tard, l-ogħla doża biss trid tingħata. Jekk jintużaw reġimi tad-dożi ta' iktar minn ġurnata fuq il-bażi ta' ġustifikazzjoni xjentifika, ġeneralment għandu jintuża ħin tal-kampjunar wieħed sa madwar darba u nofs it-tul taċ-ċiklu normali taċ-ċelloli wara t-trattament finali.

Wara t-trattament u qabel il-ġbir tal-kampjun, l-annimali jingħataw injezzjoni intraperitoneali b'doża xierqa ta' inibitur tal-metafażi (eż. kolċemid jew kolċisina), u l-kampjuni jinġabru f'intervall xieraq wara. Għall-ġrieden, dan l-intervall huwa ta' madwar 3-5 qabel il-ġbir u, għall-firien, huwa sagħtejn sa 5 sigħat. Iċ-ċelloli jinġabru mill-mudullun u jitkabbru, jiġu ffissati u mlewna, u analizzati għal aberrazzjonijiet kromożomiċi (12).

Osservazzjonijiet

Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali fuq l-annimali tat-test u s-sinjali kliniċi għandhom jiġu rreġistrati tal-inqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li jiġi kkunsidrat il-perjodu ta' wara d-dożaġġ li fih sejrin jidhru l-iktar l-effetti antiċipati. Tal-inqas darbtejn kuljum matul il-perjodu ta' dożaġġ, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal morbidità u mortalità. L-annimali kollha għandhom jintiżnu fil-bidu tal-istudju, tal-inqas darba fil-ġimgħa matul l-istudji b'doża ripetuta, u fil-fażi tal-ewtanażja. Fi studji twal tal-inqas ġimgħa, il-kejliet tal-konsum tal-ikel għandhom isiru tal-inqas kull ġimgħa. Jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb, il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel f'kull bidla tal-ilma u tal-inqas darba fil-ġimgħa. L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta' tossiċità eċċessiva għandhom jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju qabel jintemm il-perjodu ta' ttestjar (11).

Esponiment tat-tessut fil-mira

Għandu jittieħed kampjun tad-demm f'ħin(ijiet) xieraq sabiex ikunu jistgħu jiġu mixtarra l-livelli ta' plażma tas-sustanzi kimiċi tat-test bil-għan li jintwera li seħħet l-esponiment tal-mudullun, meta dan ikun iġġustifikat u meta ma jkunx hemm dejta oħra dwar l-esponiment (ara l-paragrafu 44).

Preparazzjoni tal-mudullun u tal-kromożomi

Eżatt wara l-ewtanażja umanitarja, jittieħdu ċelloli tal-mudullun mill-femori jew mit-tibji tal-annimali, imbagħad dawn jiġu esposti għal soluzzjoni ipotonika u jiġu ffissati. Imbagħad iċ-ċelloli fil-metafażi jitferrxu fuq lametti u jiġu mlewnin billi jintużaw metodi stabbiliti (ara (3) (12)).

Analiżi

Il-lametti kollha, inklużi dawk tal-kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati b'mod indipendenti qabel l-analiżi u għandhom jitqassmu b'mod aleatorju sabiex min jaqrahom ma jkunx jaf x'inhi l-kundizzjoni tat-trattament.

L-indiċi mitotiku għandu jiġi stabbilit bħala miżura ta' ċitotossiċita f'għall-inqas 1 000 ċellula għal kull annimal għal kull annimal trattat għall-annimali ttrattati (inklużi kontrolli pożittivi), mhux ittrattati jew l-annimali tal-kontroll negattiv tal-veikolu/solvent kollha.

Għandhom jiġu analizzati tal-inqas 200 metafażi għal kull annimal għal aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali, inklużi u esklużi distakki (6). Madankollu, jekk id-database storika tal-kontroll negattiv tindika li l-frekwenza medja ta' sfond ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali hija <1 % fil-laboratorju tal-ittestjar, għandu jiġi kkunsidrat l-ikklassifiar ta' ċelloli addizzjonali. Aberrazzjonijiet tat-tip kromatid u kromożomiku għandhom jiġu rreġistrati għalihom u jiġu kklassifikati skont is-sottotipi (ksur, skambji). Il-proċeduri li jintużaw fil-laboratorju għandhom jiżguraw li l-analiżi tal-aberrazzjonijiet kromożomiċi ssir minn persuni mħarrġin sew fl-għoti ta' punteġġi u huma evalwati bejn il-pari, jekk xieraq. Fid-dawl tal-fatt li l-proċeduri ta' preparazzjoni tal-lametti spiss jirriżultaw fil-ksur ta' sehem mill-metafażijiet li jirriżulta fit-telf ta' kromożomi, iċ-ċelloli li jingħataw punteġġ għandu jkun fihom għadd ta' ċentromeri ta' mhux inqas minn 22, fejn n hija n-numru aplojdi ta' kromożomi għal dik l-ispeċi.

DEJTA U RAPPORTAR

Trattament tar-riżultati

Dejta dwar l-annimali individwali għandha tiġi ppreżentata f'forma ta' tabelli. L-indiċi mitotiku, l-għadd ta' ċelloli tal-metafażi li ngħataw punteġġ, in-numru ta' aberrazzjonijiet għal kull ċellola fil-metafażi u l-perċentwal ta' ċelloli b'aberrazzjoni(jiet) kromożomika strutturali għandhom jiġu evalwati għal kull annimal. Għandhom jiġu elenkati t-tipi differenti ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali bl-għadd u l-frekwenzi tagħhom għal gruppi tat-trattament u tal-kontroll. Id-distakki, kif ukoll iċ-ċelloli poliplojdi u ċ-ċelloli bi kromożomi endoreduplikati għandhom jiġu rreġistrati b'mod separat. Il-frekwenza tad-distakki tiġi rrapportata iżda, ġeneralment, ma tkunx inkluża fl-analiżi tal-frekwenza totali ta' aberrazzjonijiet strutturali. Jekk ma hemmx evidenza ta' differenza fir-rispons bejn is-sessi, id-dejta tista' tingħaqad f'daqqa għall-analiżi statistika. Għandha tiġi rrapportata dejta dwar it-tossiċità tal-annimali u s-sinjali kliniċi wkoll.

Kriterji ta' Aċċettabilità

Il-kriterji li ġejjin jistabbilixxu l-aċċettabilità tat-test:

a)

Huwa aċċettat li d-dejta tal-kontroll negattiv parallel tiżdied fid-database storika tal-kontroll tal-laboratorju (ara l-paragrafi 11-14);

b)

Il-kontrolli pożittivi paralleli jew il-kontrolli tal-punteġġ għandhom jinduċu risponsi li huma kompatibbli ma' dawk iġġenerati fid-database storika tal-kontroll pożittiv u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabblin mal-kontroll negattiv (ara l-paragrafi 20-21);

c)

Ġie analizzat in-numru xieraq ta' dożi u ċelloli;

d)

Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla doża huma konsistenti ma' dawk deskritti fil-paragrafi 25-28.

Evalwazzjoni u Interpretazzjoni tar-Riżultati

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk:

a)

Tal-inqas wieħed mill-gruppi tat-trattament jesibixxi żieda statistikament sinifikanti fil-frekwenza taċ-ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali (esklużi distakki) meta mqabbel mal-kontroll negattiv parallel,

b)

Din iż-żieda hija marbuta mad-doża tal-inqas f'mument tal-kampjunar wieħed meta tiġi evalwata b'test tat-tendenza xieraq, u

c)

Kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa' barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson).

Jekk l-ogħla doża biss tiġi eżaminata f'mument tal-kampjunar partikolari, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk ikun hemm żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel u r-riżultati jaqgħu barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson). Ir-rakkomandazzjonijiet għall-metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (13). Meta ssir analiżi tar-rispons għad-doża, għandhom jiġu analizzati tal-inqas tliet gruppi tad-doża. It-testijiet statistiċi għandhom jużaw l-annimal bħala l-unità sperimentali. Ir-riżultati pożittivi fit-test għall-aberrazzjonijiet kromożomiċi jindikaw li s-sustanza kimika tat-test tinduċi aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fil-mudullun tal-ispeċi ttestjata.

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali kollha eżaminati:

a)

L-ebda wieħed mill-gruppi tat-trattament ma jesibixxi żieda statistikament sinifikanti fil-frekwenza taċ-ċelloli b'aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali (esklużi distakki) meta mqabbel mal-kontroll negattiv parallel,

b)

Ma hemm l-ebda żieda marbuta mad-doża fi kwalunkwe ħin tal-kampjunar meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi,

c)

Ir-riżultati kollha jaqgħu fid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson), u

d)

Seħħ esponiment tal-mudullun għas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test.

Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (13). Evidenza ta' esponiment tal-mudullun għal sustanza kimika tat-test tista' tinkludi dipressjoni tal-indiċi mitotiku jew kejl tal-livelli ta' plażma jew tad-demm tas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test. Fil-każ ta' amministrazzjoni fil-vina, ma hemmx bżonn ta' evidenza ta' esponiment. Inkella, tista' tintuża dejta ADME, miksuba fi studju indipendenti bl-użu tal-istess rotta u l-istess speċi, sabiex jintwera li seħħ esponiment tal-mudullun. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, fil-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza kimika tat-test ma tinduċix aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali fil-mudullun tal-ispeċi ttestjata.

Ma hemm l-ebda ħtieġa għal verifika ta' rispons posittiv jew negattiv ċar.

F'każijiet li fihom ir-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar u sabiex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta' riżultat (eż. żieda batuta jew limitata), id-dejta għandha tiġi evalwata b'ġudizzju espert u/jew b'investigazzjonijiet ulterjuri tal-esperimenti eżistenti mwettqin. F'ċerti każijiet, l-analiżi ta' iktar ċelloli jew it-twettiq ta' esperiment ripetut bl-użu ta' kundizzjonijiet modifikati tal-esperiment jistgħu jkunu siewja.

F'każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, id-dejta sejra tipprekludi konklużjoni li s-sustanza kimika tat-test tipproduċi riżultati pożittivi jew negattivi u, għalhekk, l-istudju jiġi konkluż bħala ekwivoku.

Il-frekwenzi ta' metafażijiet endoreduplikati u poliplojdi fost il-metafażijiet totali għandhom jiġu rreġistrati b'mod separat. Żieda fin-numru ta' ċelloli poliplojdi/endoreduplikati tista' tindika li s-sustanza kimika tat-test għandha l-potenzjal li tinibixxi l-proċessi mitotiċi jew il-progressjoni taċ-ċiklu taċ-ċelloli (ara l-paragrafu 3).

Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

Sommarju

 

Sustanza kimika tat-test:

is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta' limitu għall-użu, jekk disponibbli

l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test, jekk magħrufa.

 

Sustanza monokostitwenti:

id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;

identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.

 

Sustanzi multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:

ikkaratterizzati safejn possibbli mill-identità kimika (ara iktar 'il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.

 

Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test:

il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu.

is-solubilità u l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/veikolu, jekk magħrufin;

il-preparazzjoni tal-formulazzjonijiet djetetiċi, tal-ilma tajjeb għax-xorb jew tat-teħid man-nifs;

id-determinazzjonijiet analitiċi dwar il-formulazzjonijiet (eż., l-istabilità, l-omoġenità, il-konċentrazzjonijiet nominali), meta jsiru.

 

L-annimali tat-test:

l-ispeċi/ir-razza użata u ġustifikazzjoni għall-għażla;

l-għadd, l-età u s-sess tal-annimali;

is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.;

il-metodu għall-identifikazzjoni unika tal-annimali;

għal studji fuq terminu qasir: il-piż individwali tal-annimali fil-bidu u fi tmiem it-test; għal studji itwal minn ġimgħa: il-piżijiet tal-ġisem individwali matul l-istudju u l-konsum ta' ikel. Il-medda tal-piż individwali, id-devjazzjoni medja u standard għal kull grupp għandhom ikunu inklużi.

 

Kundizzjonijiet tat-test:

il-kontroll pożittiv u dak negattiv (veikolu/solvent);

dejta minn studju għat-tiftix tal-medda, jekk ikun sar;

ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;

dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test;

dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test;

ir-raġuni għar-rotta u d-durata tal-għoti;

metodi għall-verifika li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test laħqet iċ-ċirkulazzjoni ġenerali jew il-mudullun;

id-doża propja (mg/kg piż tal-ġisem/jum) ikkalkolata mill-konċentrazzjoni (ppm) u l-konsum tas-sustanza kimika tat-test fid-dieta/ilma tax-xorb, jekk applikabbli;

dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma;

il-metodu tal-ewtanażja;

il-metodu tal-analġeżija (meta tintuża);

deskrizzjoni dettaljata tat-trattament u l-iskedi tal-kampjunar u ġustifikazzjonijiet għall-għażliet;

il-metodi tal-preparazzjoni tal-lametti;

il-metodi ta' kejl tat-tossiċità;

l-identità tal-inibitur tal-metafażi, il-konċentrazzjoni, id-doża u l-ħin tal-għoti tiegħu qabel il-kampjunar;

il-proċeduri għall-iżolament u l-preservazzjoni tat-tessuti;

il-kriterji għall-ikklassifikar tal-aberrazzjonijiet;

in-numru ta' ċelloli fil-metafażi analizzati għal kull annimal u n-numru ta' ċelloli analizzati għad-determinazzjoni tal-indiċi mitotiku;

il-kriterji għall-aċċettabilità tal-istudju;

il-kriterji sabiex l-istudji jitqiesu bħala pożittivi, negattivi jew inkonklużivi.

 

Ir-riżultati:

il-kundizzjoni tal-annimali qabel u matul il-perjodu tat-test, inklużi sinjali tat-tossiċità;

l-indiċi mitotiku, mogħti b'mod separat għal kull annimal;

it-tip u n-numru ta' aberrazzjonijiet u ta' ċelloli aberranti, mogħti b'mod separat għal kull annimal;

in-numru totali ta' aberrazzjonijiet għal kull grupp bil-medji u d-devjazzjonijiet standard;

in-numru ta' ċelloli b'aberrazzjonijiet għal kull grupp bil-medji u d-devjazzjonijiet standard;

bidliet fil-plojdija, inklużi l-frekwenzi ta' ċelloli poliplojdi u/jew endoreduplikati;

ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn possibbli;

l-analiżijiet statistiċi u l-metodu applikat;

dejta li ssostni l-fatt li seħħ l-esponiment tal-mudullun;

dejta tal-kontroll negattiv parallel u tal-kontroll pożittiv bil-meded, il-medji u d-devjazzjonijiet standard;

id-dejta storika tal-kontroll negattiv u pożittiv b'meded, medji u devjazzjonijiet standard, u limiti ta' kontroll ta' 95 % għad-distribuzzjoni, kif ukoll il-perjodu ta' żmien u n-numru ta' osservazzjonijiet;

il-kriterji ssodisfati għal rispons pożittiv jew negattiv.

 

Diskussjoni tar-riżultati.

 

Konklużjoni.

 

Referenzi.

TAGĦRIF

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Adler, I.D. (1984), “Cytogenetic Tests in Mammals”, in Mutagenicity Testing: A Practical Approach, Venittand, S., J.M. Parry (eds.), IRL Press, Washington, DC, pp. 275-306.

(3)

Preston, R.J. et al. (1987), Mammalian in vivo cytogenetic assays. Analysis of chromosome aberrations in bone marrow cells, Mutation Research, Vol. 189/2, pp. 157-165.

(4)

Richold, M. et al. (1990), “In Vivo Cytogenetics Assays”, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.

(5)

Tice, R.R. et al. (1994), Report from the working group on the in vivo mammalian bone marrow chromosomal aberration test, Mutation Research, Vol. 312/3, pp. 305-312.

(6)

Adler, I.D. et al. (1998), Recommendations for statistical designs of in vivo mutagenicity tests with regard to subsequent statistical analysis, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 417/1, pp. 19-30.

(7)

Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.

(8)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.

(9)

Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.

(10)

Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.

(11)

OECD (2000), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No19, OECD Publishing, Paris.

(12)

Pacchierotti, F., V. Stocchi (2013), Analysis of chromosome aberrations in somatic and germ cells of the mouse, Methods in Molecular Biology, Vol. 1044, pp. 147-163.

(13)

Lovell, D.P. et al. (1989), “Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.

Appendiċi 1

DEFINIZZJONIJIET

Anewplojdija : Kwalunkwe devjazzjoni mill-għadd ta' diplojdi (jew aplojdi) normali ta' kromożomi minn kromożomu wieħed jew aktar, iżda mhux minn multipli tas-sett (jew settijiet) kollu ta' kromożomi (ara poliplojdija).

Ċentromeru : Reġjun(i) ta' kromożomu li miegħu huma assoċjati fibri rqaq waqt id-diviżjoni taċ-ċellola, li jippermettu l-moviment b'ċertu ordni ta' kromożomi sekondarji għall-poli ta' ċelloli sekondarji.

Sustanza kimika : sustanza jew taħlita.

Aberrazzjoni tat-tip tal-kromatidi : ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur ta' kromatidi singoli jew ksur u għaqda mill-ġdid bejn kromatidi.

Aberrazzjoni tat-tip tal-kromożomi : Ħsara strutturali fil-kromożomi espressa bħala ksur, jew ksur u għaqda mill-ġdid, taż-żewġ kromatidi f'sit identiku.

Endoreduplikazzjoni : Proċess li bih wara perjodu S tar-replikazzjoni tad-DNA, in-nukleu ma jidħolx f'mitożi iżda jibda perjodu S ieħor. Ir-riżultat huwa kromożomi b'4, 8, 16… il-kromatid.

Distakk : Leżjoni akromatika iżgħar mill-wisgħa ta' kromatid wieħed, u b'misallinjament minimu tal-kromatidi.

Indiċi mitotiku : Il-proporzjon bejn in-numru ta' ċelloli f'mitożi u n-numru totali ta' ċelloli f'popolazzjoni, li huwa kejl tal-istatus tal-proliferazzjoni ta' dik il-popolazzjoni taċ-ċelloli.

Aberrazzjoni numerika : Bidla fin-numru ta' kromożomi min-numru karatteristku normali ta' annimali użati (anewplojdija).

Poliplojdija : Aberrazzjoni kromożomika numerika li tinvolvi bidla fin-numru tas-sett sħiħ ta' kromożomi, għall-kuntrarju ta' bidla numerika fil-parti tas-sett ta' kromożomi (ara anewplojdija).

Aberrazzjoni kromożomika strutturali : Bidla fl-istruttura tal-kromożomi li wieħed jinduna biha bl-eżami mikroskopiku tal-istadju metafażiku tad-diviżjoni taċ-ċelluoli, osservati bħala tħassir u biċċiet, bidliet minn ġewwa u bidliet bejniethom.

Sustanza kimika tat-test : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.

Appendiċi 2

ID-DISINN FATTORJALI GĦALL-IDENTIFIKAZZJONI TAD-DIFFERENZI FIS-SESSI FL-ASSAĠĠ IN VIVO TAL-ABERRAZZJONI KROMOŻOMIKA

Id-disinn fattorjali u l-analiżi tiegħu

F'dan id-disinn, jiġu ttestjati tal-inqas 5 irġiel u 5 nisa f'kull livell tal-konċentrazzjoni li jirriżultaw f'disinn li juża tal-inqas 40 annimal (20 raġel u 20 mara, flimkien ma' kontrolli pożittivi rilevanti).

Id-disinn, li huwa wieħed mill-iktar disinni fattorjali sempliċi, huwa ekwivalenti għal analiżi bidirezzjonali tal-varjanza bis-sess u l-livell ta' konċentrazzjoni li huma l-effetti ewlenin. Id-dejta tista' tiġi analizzata billi jintużaw pakketti ta' softwer statistiku standard bħal SPSS, SAS, STATA, Genstat kif ukoll bl-użu ta' R.

L-analiżi tagħmel partizzjoni tal-varjabbiltà fis-sett ta' dejta bejn is-sessi, bejn il-konċentrazzjonijiet u b'rabta mal-interazzjoni bejn is-sessi u l-konċentrazzjonijiet. Kull wieħed mit-termini jiġi ttestjat kontra stima tal-varjabbiltà bejn l-annimali rreplikati fi ħdan il-gruppi ta' annimali tal-istess sess bl-istess konċentrazzjoni. Id-dettalji sħaħ dwar il-metodoloġija sottostanti huma disponibbli f'ħafna kotba standard dwar l-istatistika (ara r-referenzi) u fil-faċilitajiet tal-għajnuna pprovduti mal-pakketti statistiċi.

L-analiżi tkompli billi ssir spezzjoni tat-terminu ta' interazzjoni sess x konċentrazzjoni fit-tabella ANOVA (5). Fin-nuqqas ta' terminu ta' interazzjoni sinifikanti, il-valuri kombinati bejn is-sessi jew fost il-livelli ta' konċentrazzjoni jipprovdu testijiet statistiċi validi bejn il-livelli bbażati fuq it-terminu tal-varjabbiltà tar-raggruppati fi ħdan il-grupp tal-ANOVA.

L-analiżi tkompli billi tagħmel partizzjoni bejn l-istima tal-varjabbiltà bejn il-konċentrazzjonijiet f'kuntrasti li jipprovdu għal test għal kuntrasti lineari u kwadratiċi tar-risponsi bejn il-livelli tal-konċentrazzjonijiet. Meta jkun hemm interazzjoni sinifikanti sess x konċentrazzjoni, tista' ssir partizzjoni ta' dan it-terminu f'kuntrasti ta' interazzjoni lineari x sess u kwadradiku x sess ukoll. Dawn it-termini jipprovdu testijiet ta' jekk ir-risponsi għall-konċentrazzjoni humiex paralleli għaż-żewġ sessi jew jekk hemmx rispons differenzjali bejn iż-żewġ sessi.

L-istima tal-varjabbiltà tal-miġburin fi ħdan il-grupp tista' tintuża sabiex tipprovdi testijiet bejn il-pari tad-differenza bejn il-medji. Dawn il-paraguni jistgħu jsiru bejn il-medji għaż-żewġ sessi u bejn il-medji għal-livell ta' konċentrazzjoni differenti bħal fil-każ tal-paraguni mal-livelli tal-kontroll negattiv. F'dawk il-każijiet li fihom ikun hemm interazzjoni sinifikanti, jistgħu jsiru paraguni bejn il-medji ta' konċentrazzjonijiet differenti fi ħdan sess jew bejn il-medji tas-sessi fl-istess konċentrazzjoni.

Referenzi

Hemm ħafna kotba dwar l-istatistika li jiddiskutu t-teorija, id-disinn, il-metodoloġija, l-analiżi u l-interpretazzjoni tad-disinni fattorjali li jvarjaw mill-iktar analiżijiet b'żewġ fatturi sempliċi sal-iktar forom kumplessi użati fil-metodoloġija dwar id-Disinn tal-Esperiment. Din li ġejja mhijiex lista eżawrjenti. Uħud mill-kotba jipprovdu eżempji maħdumin ta' disinni komparabbli, f'ċerti każijiet b'kodiċi għat-twettiq tal-analiżijiet bl-użu ta' diversi pakketti ta' softwer.

 

Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

 

Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

 

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

 

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

 

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

 

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

 

Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

(5)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.12 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.12   Test Tal-Mikronukleu Fl-Eritroċiti Mammiferi

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test 474 (2016) tal-OECD Huwa parti minn sensiela ta' metodi ta' ttestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika. Ġie żviluppat dokument tal-OECD li jipprovdi informazzjoni sintetika dwar l-ittestjar dwar it-tossikoloġija ġenetika u ħarsa ġenerali dwar it-tibdil reċenti la sar f'dawk il-Linji Gwida tat-Test (1).

It-test in vivo tal-mikronukleu tal-mammiferi huwa ta' rilevanza partikolari għall-valutazzjoni tal-ġenotossiċità għaliex, għad li jvarja bejn l-ispeċijiet, il-fatturi tal-metaboliżmu in vivo, il-farmakokinetiċi u l-proċessi ta' tiswija tad-DNA huma attivi u jikkontribwixxu għar-risponsi. Assaġġ in vivo huwa siewi wkoll sabiex tkun tista' ssir investigazzjoni ulterjuri tal-ġenotossiċità żvelata minn sistema in vitro.

It-test in vivo tal-mikronukleu tal-mammiferi jintuża għall-qbid ta' ħsara indotta mis-sustanza kimika tat-test fil-kromożomi jew l-apparat mitotiku tal-eritroblasti. It-test jevalwa l-formulazzjoni tal-mikronukleu fl-eritroċiti tal-kampjun jew fil-mudullun jew fiċ-ċelloli tad-demm periferali tal-annimali, normalment rodituri.

L-għan tat-test tal-mikronukleu huwa li jidentifika sustanzi kimiċi li jikkawżaw ħsara ċitoġenetika li tirriżulta fil-formazzjoni ta' mikronukleji li jkun fihom biċċiet ta' residwi ta' kromożomi jew kromożomi sħaħ.

Meta eritroblast tal-mudullun jiżviluppa f'eritroċita immatura (kultant imsejħa wkoll retikuloċita jew eritroċita polikromatika), in-nukleu ewlieni jiġi estruż; kwalunkwe mikronukleu li ġie fformat jista' jitħalla fiċ-ċitoplażma. Il-viżwalizzazzjoni jew id-detezzjoni tal-mikronukleji hija ffaċilitata f'dawn iċ-ċelloli għax ma għandhomx nukleu ewlieni. Żieda fil-frekwenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati f'annimali ttrattati hija indikazzjoni ta' aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali jew numeriċi indotti.

Eritroċiti mikronukleati fformati ġodda jiġu identifikati u kkwantifikati bit-tilwin segwit minn punteġġar viżwali bl-użu ta' mikroskopju, jew b'analiżi awtomatizzata. L-għadd ta' biżżejjed eritroċiti immaturi fid-demm periferali jew fil-mudullun ta' annimali adulti huwa ffaċilitat ħafna bl-użu ta' pjattaforma tal-punteġġar awtomatizzata. Dawn il-pjattaformi huma alternattivi aċċettabbli għall-evalwazzjoni manwali (2). Studji komparattivi wrew li t-tali metodi, li jużaw standards tal-kalibraġġ xierqa, jistgħu jipprovdu riproduċibbilità u sensittività aħjar bejn il-laboratorji u fi ħdan il-laboratorji mill-ikklassifikar manwali bil-mikroskopju (3) (4). Sistemi awtomatizzati li jistgħu jkejlu l-frekwenzi tal-eritroċiti mikronukleati jinkludu, iżda mhumiex limitati għal, ċitometri tal-fluss (5), pjattaformi tal-analiżi tal-immaġnijiet (6) (7), u ċitometri ta' skennjar bil-laser (8).

Għad li dan normalment ma jsirx bħala parti mit-test, il-frammenti tal-kromożomi jistgħu jiġu distinti minn kromożomi sħaħ permezz ta' għadd ta' kriterji. Dawn jinkludu l-identifikazzjoni tal-preżenza jew l-assenza ta' kinetoċoru jew DNA ċentometriku, li t-tnejn li huma huma karatteristiċi ta' kromożomi intatti. L-assenza ta' kinetoċoru jew DNA ċentometriku tindika li l-mikronukleu fih biss frammenti ta' kromożomi, filwaqt li l-preżenza tindika telf ta' kromożomi.

Id-definizzjonijiet tat-terminoloġija użata huma stabbiliti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET TAL-BIDU

Il-mudullun ta' rodituri adulti żgħar huwa t-tessut fil-mira għal ħsara ġenetika fit-test peress li l-eritroċiti huma prodotti f'dan it-tessut. Il-kejl tal-mikronukleji f'eritroċiti immaturi fid-demm periferali huwa aċċettabbli fi speċijiet mammiferi oħrajn li għalihom intweriet sensittività adegwata għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi li jikkaġunaw aberrazzjonijiet kromożomiċi strutturali jew numeriċi f'dawn iċ-ċelloli (b'induzzjoni tal-mikronukleji f'eritroċiti immaturi) u ġiet ipprovduta ġustifikazzjoni xjentifika. Il-frekwenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati hija l-punt ta' tmiem ewlieni. Il-frekwenza tal-eritroċiti maturi li fihom mikronukleji fid-demm periferali tista' tintuża wkoll bħala punt ta' tmiem fi speċijiet mingħajr selezzjoni splenika b'saħħitha kontra ċelloli mikronukleati u meta l-annimali jiġu ttrattati kontinwament għal perjodu li jaqbeż it-tul tal-ħajja tal-eritroċita fl-ispeċijiet użati (eż. 4 ġimgħat jew iktar fil-ġurdien).

Jekk ikun hemm evidenza li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test, jew il-metabolit(i) tagħha, mhumiex sejrin jilħqu t-tessut fil-mira, jaf ma jkunx xieraq li jintuża dan it-test.

Qabel ma jintuża dan il-metodu ta' ttestjar fuq taħlita għall-ġenerazzjoni ta' dejta għal skop regolatorju intiż, għandu jiġi kkunsidrat jekk jistax jipprovdi riżultati adegwati għal dak l-għan u, jekk iva, għaliex. Dawn il-kunsiderazzjonijiet ma jkunux meħtieġa meta jkun hemm rekwiżit regolatorju għall-ittestjar tat-taħlita.

IL-PRINĊIPJU TAL-METODU TA' TTESTJAR

L-annimali huma esposti għas-sustanza kimika tat-test permezz ta' rotta xierqa. Jekk jintuża l-mudullun, l-annimali jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju f'ħin(ijiet) xieraq wara t-trattament, il-mudullun jiġi estratt, u jsiru l-preparazzjonijiet u t-tilwin (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15). Meta jintuża demm periferali, id-demm jinġabar f'ħinijiet xierqa wara t-trattament u jsiru l-preparazzjonijiet u t-tilwin (12) (16) (17) (18). Meta t-trattament jingħata b'mod akut, importanti li jingħażlu l-ħinijiet tal-ġbir tal-mudullun jew tad-demm li fihom tista' tiġi identifikata l-induzzjoni relatata mat-trattament ta' eritroċiti immaturi mikronukleati. Fil-każ ta' kampjunar tad-demm periferali, irid ikun għadda wkoll biżżejjed żmien sabiex dawn l-avvenimenti jidhru fid-demm li jiċċirkola. Il-preparati jiġu analizzati għall-preżenza ta' mikronukleji, jew b'viżwalizzazzjoni bl-użu ta' mikroskopju, analiżi tal-immaġnijiet, iċ-ċitometrija tal-fluss, jew b'ċitometrija ta' skennjar bil-laser.

VERIFIKA TAL-PROFIĊJENZA TAL-LABORATORJU

Investigazzjonijiet tal-Profiċjenza

Sabiex jiġi stabbilit li hemm biżżejjed esperjenza fit-twettiq tal-assaġġ qabel ma jintuża għall-ittestjar ta' rutina, il-laboratorju għandu jkun wera li għandu l-ħila li jirriproduċi r-riżultati mistennijin mid-dejta ppubblikata (17) (19) (20) (21) (22) għall-frekwenzi tal-mikronukleu b'tal-inqas żewġ sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv (inklużi risponsi dgħajfin indotti minn dożi baxxi ta' kontrolli pożittivi), bħal dawk elenkati fit-Tabella 1 u b'kontrolli tal-veikolu/solvent kompatibbli (ara l-paragrafu 26). Dawn l-esperimenti għandhom jużaw dożi li jagħtu żidiet riproduċibbli u relatati mad-dożi u juru s-sensittività u l-medda dinamika tas-sistema tat-test fit-tessut ta' interess (il-mudullun jew id-demm periferali) u jużaw il-metodu tal-punteġġ li sejjer jitħaddem fil-laboratorju. Dan ir-rekwiżit mhuwiex applikabbli għal laboratorji li għandhom esperjenza, jiġifieri li għandhom database storika disponibbli kif definita fil-paragrafi 14-18.

Dejta Storika tal-Kontroll

Matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza, il-laboratorju għandu jistabbilixxi:

Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll pożittiv, u

Medda u distribuzzjoni storiċi tal-kontroll negattiv.

Meta għall-ewwel tinkiseb id-dejta għal distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu konsistenti mad-dejta tal-kontroll ippubblikata, meta tkun teżisti. Peress li tiżdied iktar dejta sperimentali mad-distribuzzjoni storika tal-kontroll, idealment il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % ta' dik id-distribuzzjoni. Id-database storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju għandha tkun statistikament robusta sabiex tiġi żgurata l-ħila tal-laboratorju sabiex jivvaluta d-distribuzzjoni tad-dejta tal-kontroll negattiv tiegħu. It-tagħrif jissuġġerixxi li jista' jkun hemm bżonn ta' minimu ta' 10 esperimenti iżda idealment ikun hemm tal-inqas 20 esperiment imwettqin f'kundizzjonijiet sperimentali paragunabbli. Il-laboratorji għandhom jużaw metodi ta' kontroll tal-kwalità, bħal karti tal-kontroll (eż. C-charts jew X-bar charts (23)), sabiex jidentifikaw kemm hija varjabbli d-dejta tagħhom, u sabiex juru li l-metodoloġija hija “taħt kontroll” fil-laboratorju tagħhom. Rakkomandazzjonijiet ulterjuri dwar kif jibnu u jużaw id-dejta storika (jiġifieri kriterji għall-inklużjoni u l-esklużjoni ta' dejta fid-dejta storika u l-kriterji ta' aċċettabilità għal esperiment partikolari) jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (24).

Meta l-laboratorju ma jagħmilx numru kbir biżżejjed ta' esperimenti sabiex jistabbilixxi distribuzzjoni statistikament robusta tal-kontroll negattiv (ara l-paragrafu 15) matul l-investigazzjonijiet tal-profiċjenza (deskritti fil-paragrafu 13), jista' jiġi aċċettat li d-distribuzzjoni tinbena matul l-ewwel testijiet ta' rutina. Dan l-approċċ għandu jsegwi r-rakkomandazzjonijiet stipulati fit-tagħrif (24) u r-riżultati tal-kontroll negattiv miksubin f'dawn l-esperimenti għandhom jibqgħu konsistenti mad-dejta ppubblikata tal-kontroll negattiv.

Kwalunkwe bidla fil-protokoll tal-esperimenti għandha tiġi kkunsidrata fid-dawl tal-impatt tagħha fuq kemm id-dejta li tirriżulta tibqa' konsistenti mad-database storika eżistenti tal-kontroll tal-laboratorju. Inkonsistenzi kbar biss għandhom jirriżultaw fl-istabbiliment ta' database storika ġdida tal-kontroll, fejn il-ġudizzju tal-esperti jistabbilixxi li tvarja mid-distribuzzjoni ta' qabel (ara l-paragrafu 15). Matul l-istabbiliment mill-ġdid, jaf ma jkunx hemm bżonn ta' database sħiħa tal-kontroll negattiv sabiex ikun jista' jsir test propju, diment li l-laboratorju jkun jista' juri li l-valuri tal-kontroll negattiv parallel tiegħu jibqgħu konsistenti mad-database ta' qabel jew mad-dejta ppubblikata korrispondenti.

Id-dejta tal-kontroll negattiv għandha tikkonsisti fl-inċidenza eritroċiti immaturi mikronukleati f'kull annimal. Idealment, il-kontrolli negattivi paralleli għandhom ikunu fi ħdan il-limiti ta' kontroll ta' 95 % tad-distribuzzjoni storika tal-kontroll negattiv tal-laboratorju. Meta d-dejta tal-kontroll negattiv parallel toħroġ mil-limiti ta' kontroll ta' 95 %, din tista' titqies aċċettabbli li tiddaħħal fid-distribuzzjoni storika tal-kontroll diment li din id-dejta ma tkunx eċċezzjoni estrema u jkun hemm evidenza li s-sistema tat-test tkun “taħt kontroll” (ara l-paragrafu 15) u ebda evidenza ta' żball tekniku jew uman.

DESKRIZZJONI TAL-METODU

Preparamenti

Għażla ta' speċi tal-annimali

Għandhom jintużaw razez użati spiss fil-laboratorju ta' annimali żgħar b'saħħithom. Jistgħu jintużaw ġrieden, firien jew speċijiet mammiferi xierqa oħrajn. Meta jintuża demm periferali, irid jiġi stabbilit li t-tneħħija splenika ta' ċelloli mikronukleati miċ-ċirkulazzjoni ma tqegħidx f'riskju d-detezzjoni ta' mikronukleji indotti fl-ispeċi magħżula. Dan intwera biċ-ċar għad-demm periferali tal-ġrieden u l-firien (2). Fir-rapport għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xjentifika meta jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex firien u ġrieden. Jekk jintużaw speċijiet oħrajn li mhumiex rodituri, huwa rakkomandat li l-kejl tal-mikronukleji indotti jiġi integrat f'test xieraq ieħor tat-tossiċità.

Kundizzjonijiet tal-abitazzjoni u l-għalf tal-annimali

Għar-rodituri, it-temperatura fil-kamra tal-annimali għandha tkun ta' 22 °C (± 3 °C). Għad li, idealment, l-umdità relattiva għandha tkun ta' 50-60 %, għandha tkun tal-inqas 40 % u, idealment, ma taqbiżx is-70 % ħlief matul it-tindif tal-kamra. Id-dawl għandu jkun artifiċjali, b'sekwenza ta' 12-il siegħa dawl, 12-il siegħa dlam. Dwar l-għalf, jistgħu jintużaw dieti konvenzjonali tal-laboratorju bi provvista bla limitu ta' ilma tax-xorb. L-għażla tad-dieta tista' tkun influwenzata mill-bżonn li tiġi żgurata taħlita xierqa ta' sustanza kimika tat-test meta tingħata minn din ir-rotta. Ir-rodituri għandhom jitrabbew fi gruppi żgħar (mhux iktar minn ħamsa f'gaġġa) tal-istess sess u grupp tat-trattament jekk ma tkun mistennija ebda mġiba aggressiva, idealment f'gaġeġ solidi mal-art bl-arrikkiment ambjentali xieraq. L-annimali jistgħu jitrabbew waħedhom biss jekk dan ikollu ġustifikazzjoni xjentifika.

Preparazzjoni tal-annimali

Normalment jintużaw annimali adulti żgħar b'saħħithom (għal rodituri, idealment 6-10 ġimgħat fil-bidu tat-trattament, għad li jistgħu jiġu aċċettati annimali ftit ixjaħ ukoll), u dawn jiġu assenjati b'mod aleatorju għall-gruppi tal-kontroll u tat-trattament. L-annimali individwali jiġu identifikati b'mod uniku bl-użu ta' metodu umanitarju u l-inqas invasiv possibbli (eż. b'ċirku madwarhom, tikketti, mikroċipep jew identifikazzjoni bijometrika, iżda mhux b'titqib fil-widnejn jew fis-swaba') u jitħallew iderru fil-kundizzjonijiet tal-laboratorju għal tal-inqas ħamest ijiem. Il-gaġeġ għandhom ikunu rranġati b'mod li jkunu mminimizzati l-effetti possibbli minħabba t-tqegħid tal-gaġeġ. Għandha tiġi evitata kontaminazzjoni kroċjata mill-kontroll pożittiv u s-sustanza kimika tat-test. Fil-bidu tal-istudju, il-varjazzjoni fil-piż tal-annimali għandha tkun minima u ma taqbiżx ± 20 % tal-piż medju ta' kull sess.

Preparazzjoni tad-dożi

Is-sustanzi kimiċi solidi tat-test għandhom jinħallu jew jiġu sospiżi f'solventi jew veikoli xierqa jew jitħalltu f'dieta jew ilma tajjeb għax-xorb qabel id-dożaġġ tal-annimali. Is-sustanzi kimiċi likwidi tat-test jistgħu jiġu dożati direttament jew jiġu dilwiti qabel id-dożaġġ. Għal esponimenti bit-teħid man-nifs, is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw bħala gass, fwar jew aerosol solidu/likwidu, skont il-proprjetajiet fiżikokimiċi tagħhom. Għandhom jintużaw preparati ġodda tas-sustanza kimika tat-test sakemm id-dejta dwar l-istabilità ma turix l-aċċettabilità tal-ħżin u tiddefinixxi l-kundizzjonijiet tal-ħżin xierqa.

Kundizzjonijiet tat-test

Solvent/veikolu

Is-solvent/veikolu ma għandux jipproduċi effetti tossiċi fil-livelli tad-doża użati, u ma għandux ikun kapaċi li joħloq reazzjoni kimika mas-sustanzi kimiċi tat-test. Jekk jintużaw solventi/veikoli oħrajn li mhumiex magħrufin sew, l-inklużjoni tagħhom għandha tkun sostnuta permezz ta' dejta ta' referenza li tindika l-kompatibbiltà tagħhom. Huwa rakkomandat li, fejn jista' jkun, l-ewwel jiġi kkunsidrat l-użu ta' solvent/veikolu milwiem. Eżempji ta' solventi/veikoli kompatibbli użati spiss jinkludu ilma, salina fiżjoloġika, soluzzjoni tal-metilċelluloża, soluzzjoni tal-melħ tas-sodju taċ-ċelluloża tal-karbossimetilċelluloża, żejt taż-żebbuġa u żejt tal-qamħirrum. Fin-nuqqas ta' dejta storika jew ippubblikata tal-kontroll li turi li ma huma indotti ebda mikronukleu u effett dannuż ieħor minn solvent/veikolu atipiku magħżul, għandu jsir studju inizjali sabiex tiġi stabbilita l-aċċettabbiltà tal-kontroll tas-solvent/veikolu.

Kontrolli

Kontrolli pożittivi

Normalment għandu jkun inkluż grupp ta' annimali ttrattati b'sustanza kimika tal-kontroll pożittiv ma' kull test. Dan jista' jiġi rrinunzjat meta l-laboratorju tal-ittestjar ikollu profiċjenza murija fit-twettiq tat-test u jkun stabbilixxa medda storika tal-kontroll pożittiv. Meta ma jkunx hemm grupp tal-kontroll pożittiv parallel inkluż, il-kontrolli tal-punteġġ (lametti fissi u mhux imlewnin jew kampjuni ta' sospensjoni taċ-ċelloli, kif ikun xieraq għall-metodu tal-punteġġar) għandhom ikunu inklużi f'kull esperiment. Dawn jistgħu jinkisbu billi fil-punteġġar tal-istudju jiddaħħlu kampjuni ta' referenza xierqa li nkisbu u nħażnu minn esperiment tal-kontroll pożittiv separat imwettaq b'mod perjodiku (eż. kull 6-18-il xahar); pereżempju, matul l-ittestjar tal-profiċjenza u fuq bażi regolari wara, fejn ikun hemm bżonn.

Is-sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv għandhom jipproduċu b'mod affidabbli żieda identifikabbli fil-frekwenza tal-mikronukleji fuq il-livell spontanju. Meta ssir klassifikazzjoni manwali bil-mikroskopju, id-dożi tal-kontroll pożittiv għandhom jingħażlu sabiex l-effetti jkunu ċari iżda ma jiżvelawx immedjatament l-identità tal-kampjuni kodifikati lil min jaqrahom. Huwa aċċettabbli li l-kontroll pożittiv jingħata b'rotta differenti mis-sustanza kimika tat-test, bl-użu ta' skeda tat-trattament differenti, u li l-kampjunar iseħħ biss f'waqt partikolari biss. Barra minn dan, jista' jiġi kkunsidrat l-użu ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv relatati mal-klassi tas-sustanzi kimiċi, meta xieraq. Fit-Tabella 1 hemm inklużi eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv.

Tabella 1

Eżempji ta' sustanzi kimiċi tal-kontroll pożittiv.

Sustanzi Kimiċi u CASRN

Metansulfonat tal-etil [CASRN 62-50-0]

Metansulfonat tal-metil [CASRN 66-27-3]

Nitrosurea tal-etil [CASRN 759-73-9]

Mitomiċina C [CASRN 50-07-7]

Ċiklofosfamida (monoidrat) [CASRN 50-18-0 (CASRN 6055-19-2)]

Trietilenmelamina [CASRN 51-18-3]

Kolċisina [CASRN 64-86-8] jew Vinblastina [CASRN 865-21-4] — bħal anewġeni

Kontrolli negattivi

L-annimali tal-grupp tal-kontroll negattiv għandhom ikunu inklużi f'kull ħin tal-kampjunar u l-bqija jiġu mmaniġġjati bl-istess mod bħall-gruppi tat-trattament, ħlief li ma jirċivux trattament bis-sustanza kimika tat-test. Jekk jintuża solvent/veikolu fl-għoti tas-sustanza kimika tat-test, il-grupp tal-kontroll għandu jirċievi dan is-solvent/il-veikolu. Madankollu, jekk jintwera li hemm varjabbiltà konsistenti bejn l-annimali u frekwenzi ta' ċelloli b'mikronukleji permezz ta' dejta storika tal-kontroll negattiv f'kull waqt tal-kampjunar għal-laboratorju tal-ittestjar, jaf ikun hemm bżonn ta' kampjunar wieħed biss għall-kontroll negattiv. Meta jintuża kampjunar wieħed għall-kontrolli negattivi, għandu jkun l-ewwel waqt tal-kampjun użat fl-istudju.

Jekk jintuża demm periferali, kampjun ta' qabel it-trattament jista' jiġi aċċettat minflok kontroll negattiv parallel għal studji fuq terminu qasir meta d-dejta li tirriżulta tkun konsistenti mad-database storika tal-kontroll għal-laboratorju tal-ittestjar. Intwera li għall-firien, il-kampjunar ta' volumi żgħar (eż. taħt il-100 μl/jum) qabel it-trattament għandu impatt minimu fuq il-frekwenza tal-isfond tal-mikronukleji (25).

PROĊEDURA

In-numru u s-sess tal-annimali

B'mod ġenerali, ir-rispons tal-mikronukleu huwa simili bejn l-annimali rġiel u, għalhekk, ħafna mill-istudji jistgħu jsiru f'kull sess (26). Dejta li turi d-differenzi rilevanti bejn l-irġiel u n-nisa (eż. differenzi fit-tossiċità sistemika, il-metaboliżmu, il-bijodisponibilità, it-tossiċità tal-mudullun, eċċ. inkluż, eż. fi studju għat-tiftix tal-medda) tħeġġeġ l-użu taż-żewġ sessi. F'dan il-każ, jaf ikun xieraq li jsir studju fiż-żewġ sessi, eż. bħala parti minn studju ripetut tat-tossiċità tad-doża. Jaf ikun xieraq li jintuża d-disinn fattorjali f'każ li jintużaw iż-żewġ sessi. Dettalji dwar kif tiġi analizzata d-dejta bl-użu ta' dan id-disinn huma mogħtijin fl-Appendiċi 2.

Id-daqsijiet tal-grupp fil-bidu tal-istudju għandhom jiġu stabbiliti bil-għan li jiġu pprovduti tal-inqas 5 annimali analizzabbli ta' sess wieħed, jew ta' kull sess jekk jintużaw it-tnejn, għal kull grupp. Fejn l-esponiment uman għas-sustanzi kimiċi jista' jkun speċifiku għas-sess, bħal ma jseħħ pereżempju għal ċerti prodotti farmaċewtiċi, it-test għandu jsir b'annimali tas-sess xieraq. Bħala gwida għal rekwiżiti tipiċi massimi tal-annimali, studju fil-mudullun imwettaq skont il-parametri stabbiliti fil-paragrafu 37 bi tliet gruppi tad-doża u kontrolli negattivi u pożittivi paralleli (kull grupp imsawwar minn ħames annimali ta' sess uniku), ikun jeħtieġ bejn 25 u 35 annimal.

Livelli tad-doża

Jekk isir studju preliminari għat-tiftix tal-medda għaliex ma jkun hemm ebda dejta xierqa diġà disponibbli sabiex tgħin fl-għażla tad-doża, dan għandu jsir fl-istess laboratorju, bl-użu tal-istess speċijiet, razza, sess u reġim tat-trattament li jrid jintuża fl-istudju ewlieni (27). L-istudju għandu jkollu l-għan li jidentifika d-doża massima tollerata (MTD), definita bħala l-ogħla doża li sejra tiġi tollerata mingħajr evidenza ta' tossiċità li tillimita l-istudju, b'rabta mad-durata tal-perjodu tal-istudju (pereżempju, billi tiġi indotta dipressjoni tal-piż tal-ġisem jew ċitotossiċità tas-sistema ematopoetika, iżda mhux mewt jew evidenza ta' uġigħ, tbatija jew diffikultà li jeħtieġu ewtanażja umanitarja (28)).

L-ogħla doża tista' tiġi identifikata wkoll bħala doża li tipproduċi tossiċità fil-mudullun (eż. tnaqqis fil-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali fil-mudullun jew id-demm periferali ta' iktar minn 50 %, iżda mhux għal inqas minn 20 % tal-valur tal-kontroll). Madankollu, meta jiġu analizzati ċ-ċelloli pożittivi għas-CD71 fiċ-ċirkulazzjoni tad-demm periferali (jiġifieri biċ-ċitometrija tal-fluss), din il-frazzjoni bikrija ħafna ta' eritroċiti immaturi twieġeb għall-isfidi tossiċi iktar malajr mill-koorti ikbar pożittiva għall-RNA ta' eritroċiti immaturi. Għaldaqstant, it-tossiċità ikbar tista' ssir evidenti f'disinni tal-esponiment akut li jeżaminaw il-frazzjoni ta' eritroċiti immaturi pożittivi għas-CD71 meta mqabbla ma' dawk li jidentifikaw eritroċiti immaturi fuq il-bażi tal-kontenut tal-RNA. Għal din ir-raġuni, meta l-esperimenti jużaw ħamest ijiem tat-trattament jew inqas, l-ogħla livell tad-doża għas-sustanzi kimiċi tat-test li jikkaġunaw tossiċità jista' jiġi definit bħala d-doża li tikkaġuna tnaqqis statistikament sinifikanti fil-proporzjon ta' eritroċiti immaturi pożittivi għas-D71 fost l-eritroċiti totali iżda mhux inqas minn 5 % tal-valur tal-kontroll (29).

Sustanzi kimiċi li jesibixxu saturazzjoni tal-proprjetajiet tossikokinetiċi, jew jinduċu proċessi ta' ditossifikazzjoni li jistgħu jwasslu għal tnaqqis fl-esponiment wara għoti fit-tul jistgħu jkunu eċċezzjonijiet għall-kriterji ta' ssettar tad-dożi u għandhom jiġu evalwati fuq bażi ta' każ b'każ.

Sabiex tinkiseb informazzjoni dwar ir-rispons għad-doża, studju sħiħ għandu jinkludi grupp tal-kontroll negattiv u tal-inqas tliet livelli ta' dożi ġeneralment separati b'fattur ta' 2, iżda mhux ikbar minn 4. Jekk is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix tossiċità fi studju għat-tiftix tal-medda jew fuq il-bażi tad-dejta eżistenti, l-ogħla doża għal perjodu ta' amministrazzjoni ta' 14-il jum jew iktar għandha tkun ta' 1 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum, jew għal perjodi ta' amministrazzjoni ta' inqas minn 14-il jum, 2 000 mg/kg tal-piż tal-ġisem/jum. Madankollu, jekk is-sustanza kimika tat-test tikkaġuna tossiċità, l-MTD għandha tkun l-ogħla doża mogħtija u l-livelli tad-doża użati idealment għandhom ikopru medda mill-massimu sa doża li tipproduċi ftit tossiċità jew ebda tossiċità. Meta tiġi osservata tossiċità tat-tessut fil-mira (il-mudullun) fil-livelli tad-doża kollha ttestjati, huwa rakkomandat li jsir studju ulterjuri f'dożi mhux tossiċi. Studji li jkollhom l-għan li jikkaratterizzaw iktar bis-sħiħ l-informazzjoni kwantitattiva dwar ir-rispons għad-doża jistgħu jeħtieġu gruppi tad-doża addizzjonali. Għal ċerti tipi ta' sustanzi kimiċi tat-test (eż. prodotti farmaċewtiċi għall-bniedem) koperti minn rekwiżiti speċifiċi, dawn il-limiti jistgħu jvarjaw.

Test tal-limitu

Jekk l-esperimenti għat-tiftix tal-medda, jew dejta eżistenti minn razez ta' annimali relatati, jindikaw li reġim tat-trattament ta' tal-inqas id-doża limitu (deskritta hawn taħt) ma jipproduċi ebda effett tossiku osservabbli (inkluż ebda dipressjoni tal-proliferazzjoni tal-mudullun jew evidenza oħra ta' ċitotossiċità tat-tessut fil-mira), u jekk ma tkunx mistennija ġenotossiċità fuq il-bażi ta' studji in vitro tal-ġenotossiċità jew dejta minn sustanzi kimiċi relatati strutturalment, f'dak il-każ jaf ma jitqiesx neċessarju li jsir studju sħiħ li juża tliet livelli tad-doża, diment li jkun intwera li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tilħaq it-tessut fil-mira (il-mudullun). F'dawn il-każijiet, livell tad-doża wieħed, fid-doża limitu, jista' jkun biżżejjed. Meta l-għoti jsir għal 14-il jum jew iktar, id-doża limitu hija ta' 1 000 mg/kg piż tal-ġisem/jum. Għal perjodi ta' għoti ta' 14-il jum jew inqas, id-doża limitu hija ta' 2 000 mg/kg/piż tal-ġisem/jum.

Amministrazzjoni tad-dożi

Ir-rotta antiċipata tal-esponiment tal-bniedem għandha tiġi kkunsidrata meta jitfassal assaġġ. Għaldaqstant, jistgħu jingħażlu rotot tal-esponiment bħal rotta djetetika, mal-ilma tax-xorb, subkuntanja topika, fil-vini, orali (gavage), mat-teħid man-nifs, intratrakeali, jew b'impjant, kif iġġustifikati. Fi kwalunke każ, ir-rotta għandha tingħażel sabiex jiġi żgurat esponiment adegwat tat-tessut(i) fil-mira. Ġeneralment ma tkunx rakkomandata injezzjoni intraperitoneali peress li mhijiex rotta intiża ta' esponiment tal-bniedem, u għandha tintuża biss b'ġustifikazzjoni xjentifika speċifika. Jekk is-sustanza kimika tat-test tiġi mħallta fid-dieta jew l-ilma tax-xorb, speċjalment fil-każ ta' dożaġġ wieħed, wieħed għandu joqgħod attent li l-ħin bejn il-konsum tal-ikel u l-ilma u l-kampjunar ikun biżżejjed sabiex ikunu jistgħu jiġu identifikati l-effetti (ara l-paragrafi 37). Il-volum massimu ta' likwidu li jista' jingħata b'gavage jew injezzjoni f'darba jiddependi mid-daqs tal-annimal tat-test. Normalment il-volum ma għandux ikun aktar minn 1 ml/100 g tal-piż tal-ġisem ħlief fil-każ ta' soluzzjonijiet milwiema fejn jistgħu jintużaw massimu ta' 2 ml/100 g tal-piż tal-ġisem. L-użu ta' volumi ikbar minn dan għandu jkun iġġustifikat. Ħlief għal sustanzi kimiċi tat-test irritanti jew korrużivi, li normalment jipproduċu effetti aggravati f'konċentrazzjonijiet ikbar, il-varjabbiltà fil-volum tat-test għandu jitnaqqas kemm jista' jkun billi tiġi aġġustata l-konċentrazzjoni sabiex tiġi żgurata amministrazzjoni ta' volum kostanti b'rabta mal-piż tal-ġisem fil-livelli kollha tad-doża.

Skeda tat-trattament

Idealment, isiru 2 trattamenti jew iktar, mogħtijin f'intervalli ta' 24 siegħa, speċjalment meta dan it-test jiġi integrat fi studji oħrajn dwar it-tossiċità. Inkella, jistgħu jingħataw trattamenti waħedhom, jekk ikunu ġġustifikati xjentifikament (eż. sustanzi kimiċi tat-test li jkunu magħrufin li jimblokkaw iċ-ċiklu taċ-ċelloli). Is-sustanzi kimiċi tat-test jistgħu jingħataw ukoll bħala doża maqsuma, jiġifieri żewġ trattamenti jew iktar fl-istess ġurnata separati b'mhux iktar minn sagħtejn jew tlieta) sabiex jiġi ffaċilitat l-għoti ta' volum kbir. F'dawn iċ-ċirkustanzi, jew meta s-sustanza kimika tat-test tingħata bit-teħid man-nifs, il-ħin tal-kampjunar għandu jiġi skedat fuq il-bażi tal-ħin tal-aħħar dożaġġ jew tmiem l-esponiment.

It-test jista' jsir fi ġrieden jew firien b'wieħed minn dawn it-tliet modi:

a.

L-annimali jiġu ttrattati bis-sustanza kimika tat-test darba. Il-kampjuni tal-mudullun jittieħdu tal-inqas darbtejn (minn gruppi indipendenti ta' annimali), l-ewwel wieħed mhux qabel 24 siegħa wara t-trattament, iżda mhux wara 48 siegħa wara t-trattament b'intervall(i) xieraq bejn il-kampjuni, sakemm sustanza kimika tat-test ma tkunx magħrufa li għandha nofs ħajja partikolarment twila. L-użu ta' ħinijiet tat-teħid ta' kampjuni qabel 24 siegħa wara t-trattament għandu jkun iġġustifikat. Il-kampjuni ta' demm periferali jittieħdu għall-inqas darbtejn (mill-istess grupp ta' annimali), l-ewwel wieħed mhux qabel 36 siegħa wara t-trattament, b'intervall(i) xierqa wara t-teħid ta' l-ewwel kampjun, iżda mhux aktar minn 72 siegħa. Fl-ewwel ħin tal-kampjunar, il-gruppi kollha tad-doża għandhom jiġu ttrattati u jinġabru kampjuni għall-analiżi; madankollu, fil-ħin(ijiet) tal-kampjunar iktar tard, l-ogħla doża biss trid tingħata. Meta jiġi identifikat rispons pożittiv f'ħin tal-kampjun wieħed, ma jkunx hemm bżonn li jittieħdu iktar kampjuni sakemm ma jkunx hemm bżonn ta' informazzjoni kwantitattiva dwar ir-rispons għad-doża. Il-ħinijiet tal-ġbir deskritti huma konsegwenza tal-kinetika tal-feġġa u l-għibien tal-mikronukleji f'dawn iż-2 kompartimenti tat-tessut.

b.

Jekk jintużaw 2 trattament kuljum (eż. żewġ trattamenti f'intervalli ta' 24 siegħa), għandhom jinġabru kampjuni darba bejn 18 u 24 siegħa wara l-aħħar trattament riward il-mudullun jew darba bejn 36 u 48 siegħa wara l-aħħar trattament rigward demm periferali (30). Il-ħinijiet tal-ġbir deskritti huma konsegwenza tal-kinetika tal-feġġa u l-għibien tal-mikronukleji f'dawn iż-2 kompartimenti tat-tessut.

c.

Jekk jintużaw tliet trattamenti kuljum jew iktar (eż. tliet trattamenti jew iktar f'intervalli ta' madwar 24 siegħa), il-kampjuni tal-mudullun għandhom jinġabru mhux iktar minn 24 siegħa wara l-aħħar trattament u d-demm periferali għandu jinġabar mhux iktar tard minn 40 siegħa wara l-aħħar trattament (31). Din il-possibbiltà ta' trattament tħaddem taħlita tal-assaġġ kometa (eż. kampjunar 2-6 sigħat mill-aħħar trattament) mat-test tal-mikronukleji, u l-integrazzjoni tat-test tal-mikronukleji ma' studji tat-tossiċità b'doża ripetuta. Id-dejta akkumulata tissuġġerixxi li l-induzzjoni tal-mikronukleji tista' tiġi osservata matul dawn il-perjodi itwal ta' żmien meta jingħataw 3 dożi jew iktar (15).

Jistgħu jintużaw reġimi oħrajn tad-dożaġġ jew tal-kampjunar meta dawn ikunu rilevanti u xjentifikament iġġustifikati, u sabiex tiġi ffaċilitata l-integrazzjoni ma' testijiet oħrajn tat-tossiċità.

Osservazzjonijiet

Għandhom isiru osservazzjonijiet kliniċi ġenerali fuq l-annimali tat-test u s-sinjali kliniċi għandhom jiġu rreġistrati tal-inqas darba kuljum, idealment fl-istess ħin(ijiet) kuljum u filwaqt li jiġi kkunsidrat il-perjodu ta' wara d-dożaġġ li fih sejrin jidhru l-iktar l-effetti antiċipati. Tal-inqas darbtejn kuljum matul il-perjodu ta' dożaġġ, l-annimali kollha għandhom ikunu osservati għal morbidità u mortalità. L-annimali kollha għandhom jintiżnu fil-bidu tal-istudju, tal-inqas darba fil-ġimgħa matul l-istudji b'doża ripetuta, u fil-fażi tal-ewtanażja. Fi studji twal tal-inqas ġimgħa, il-kejliet tal-konsum tal-ikel għandhom isiru tal-inqas kull ġimgħa. Jekk is-sustanza kimika tat-test tingħata mal-ilma tax-xorb, il-konsum tal-ilma għandu jitkejjel f'kull bidla tal-ilma u tal-inqas darba fil-ġimgħa. L-annimali li jesibixxu indikaturi mhux letali ta' tossiċità eċċessiva għandhom jiġu ewtanazzati b'mod umanitarju qabel jintemm il-perjodu ta' ttestjar (28). F'ċerti ċirkustanzi, it-temperatura tal-ġisem tal-annimali tista' tiġi ssorveljata, peress li ipertermja u ipotermja indotti mit-trattament ġew implikati fil-produzzjoni ta' riżultati spurji (32) (33) (34).

Esponiment tat-tessut fil-mira

Għandu jittieħed kampjun tad-demm f'ħin(ijiet) xieraq sabiex ikunu jistgħu jiġu mixtarra l-livelli ta' plażma tas-sustanzi kimiċi tat-test bil-għan li jintwera li seħħet l-esponiment tal-mudullun, meta dan ikun iġġustifikat u meta ma jkunx hemm dejta oħra dwar l-esponiment (ara l-paragrafu 48).

Preparazzjoni tal-mudullun / tad-demm

Normalment iċ-ċelloli tal-mudullun jinkisbu mill-femori jew mit-tibji tal-annimali, eżatt wara l-ewtanażja umanitarja. Spiss, iċ-ċelloli jitneħħew, jitħejjew u jitlewnu bl-użu tal-metodi stabbiliti. Jistgħu jinkisbu volumi żgħar ta' demm periferali, skont l-istandards adegwati dwar it-trattament xieraq tal-annimali, jew bl-użu ta' metodu li jippermetti li l-annimal tat-test jibqa' ħaj, bħall-fsad mill-vina tad-denb jew vina xierqa oħra, jew b'titqiba kardijaka jew kampjunar minn vina kbira fil-fażi tal-ewtanażja tal-annimal. Kemm għal eritroċiti miksubin mill-mudullun kif ukoll dawk mid-demm periferali, skont il-metodu ta' analiżi, iċ-ċelloli jista' jsirilhom tilwin sopravitali minnufih (16) (17) (18), isiru l-preparazzjonijiet tal-istrixxi li mbagħad jitlewnu għall-mikroskopju, jew inkella jiġu ffissati u jitlewnu kif xieraq għall-analiżi biċ-ċitometrija tal-fluss. L-użu ta' tilwin speċifiku tad-DNA [eż. oranġjo tal-akridina (35) jew Hoechst 33258 plus pyronin-Y (36)] jista' jelimina xi wħud mill-artifatti assoċjati mal-użu ta' tilwin mhux speċifiku għad-DNA. Dan il-vantaġġ ma jipprekludix l-użu ta' tilwin konvenzjonali (eż. Giemsa għall-analiżi bil-mikroskopju). Jistgħu jintużaw ukoll sistemi addizzjonali [eż. kolonni taċ-ċelluloża li jneħħu ċelloli nukleati (37) (38)] diment li jkun intwera li dawn is-sistemi huma kompatibbli mal-preparazzjoni tal-kampjun fil-laboratorju.

Meta dawn il-metodi jkunu applikabbli, jistgħu jintużaw antikorpi antikinetoċori (39), FISH b'sondi tad-DNA panċentromeriċi (40) jew tikkettar in situ mogħti primer bi primers speċifiċi għall-panċetromeri, flimkien mal-kontrotilwin xieraq tad-DNA (41), sabiex tiġi identifikata n-natura tal-mikronukleji (kromożoma/framment kromożomika) sabiex jiġi stabbilit jekk il-mekkaniżmu tal-induzzjoni tal-mikronukleu huwiex dovut għal attività klastoġenika u/jew anewġenika. Jistgħu jintużaw metodi oħrajn għal divrenzjar bejn il-klastoġeni u l-anewġeni jekk ikun intwera li dawn huma effettivi.

Analiżi (manwali u awtomatizzata)

Il-lametti jew il-kampjuni għall-analiżi kollha, inklużi dawk tal-kontrolli pożittivi u negattivi, għandhom jiġu kodifikati b'mod indipendenti qabel kull xorta ta' analiżi u għandhom jitqassmu b'mod aleatorju sabiex min jaqrahom manwalment ma jkunx jaf x'inhi l-kundizzjoni tat-trattament; it-tali kodifikazzjoni mhijiex neċessarja meta jintużaw sistemi ta' klassifikazzjoni awtomatizzati li ma jeħtiġux spezzjoni viżwali u li ma jistgħux jiġu affettwati minn preġudizzju tal-operatur. Il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali (immaturi + maturi) tiġi stabbilita għal kull annimal billi jingħaddu għall-inqas 500 eritroċiti għall-mudullun u 2 000 eritroċiti għad-demm periferali (42). Għandu jingħata punteġġ lil mill-inqas 4 000 eritroċiti immaturi għall-inċidenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati (43). Jekk id-database storika tal-kontroll negattiv tindika li l-frekwenza medja ta' sfond ta' eritroċiti immaturi mikronukleati hija ta' < 0.1 % fil-laboratorju tal-ittestjar, għandu jiġi kkunsidrat l-għoti ta' punteġġ lil ċelloli addizzjonali. Meta jiġu analizzati l-kampjuni, il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi għall-eritroċiti totali fl-annimali tat-trattament ma għandux ikun inqas minn 20 % tal-proporzjon tal-kontroll tal-veikolu/solvent meta l-punteġġar isir bil-mikroskopju u mhux inqas minn madwar 5 % tal-proporzjon tal-kontroll tal-veikolu/solvent meta l-punteġġar tal-eritroċiti immaturi tas-CD71+ isir b'metodi ċitometriċi (ara l-paragrafu 31) (29). Pereżempju, għal assaġġ tal-mudullun mogħti punteġġ bil-mikroskopju, jekk il-proporzjon tal-kontroll tal-eritroċiti immaturi fil-mudullun ikun ta' 50 %, il-limitu superjuri tat-tossiċità jkun 10 % eritroċiti immaturi.

Peress li l-milsa tal-firien taħtaf u teqred l-eritroċiti mikronukleati, sabiex tinżamm sensittività għolja tal-assaġġ meta jiġi analizzat id-demm periferali tal-firien, idealment l-analiżi tal-eritroċiti immaturi mikronukleati tiġi ristretta għall-iżgħar frazzjoni. Meta jintużaw metodi tal-analiżi awtomatizzati, dawn l-iktar eritroċiti immaturi jistgħu jiġu identifikati fuq il-bażi tal-kontenut għoli ta' RNA tagħhom, jew il-livell għoli ta' riċetturi tat-transferrina (CD71+) espress fuq il-wiċċ tagħhom (31). Madankollu, paragun dirett tal-metodi ta' tilwin differenti wera li jistgħu jinkisbu riżultati sodisfaċenti b'bosta metodi, inkluż it-tilwin konvenzjonali bl-oranġjo tal-akridina (3) (4).

DEJTA U RAPPORTAR

Trattament tar-riżultati

Dejta dwar l-annimali individwali għandha tiġi ppreżentata f'forma ta' tabelli. Għal kull annimal li jiġi analizzat għandhom jiġu elenkati separatament in-numru ta' eritroċiti immaturi li jingħaddu, il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi mikronukleati, u n-numru ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali. Meta l-ġrieden jiġu ttrattati kontinwament għal 4 ġimgħat jew iktar, id-dejta dwar in-numru u l-proporzjon ta' eritroċiti maturi mikronukleati għandha tingħata wkoll jekk tinġabar. Għandha tiġi rrapportata dejta dwar it-tossiċità tal-annimali u s-sinjali kliniċi wkoll.

Kriterji ta' Aċċettabilità

Il-kriterji li ġejjin jistabbilixxu l-aċċettabilità tat-test:

a.

Huwa aċċettat li d-dejta tal-kontroll negattiv parallel tiżdied fid-database storika tal-kontroll tal-laboratorju (ara l-paragrafi 15-18).

b.

Il-kontrolli pożittivi paralleli jew il-kontrolli tal-punteġġ għandhom jinduċu risponsi li huma kompatibbli ma' dawk iġġenerati fid-database storika tal-kontroll pożittiv u jipproduċu żieda statistikament sinifikanti meta mqabblin mal-kontroll negattiv parallel (ara l-paragrafi 24-25).

c.

Ġie analizzat in-numru xieraq ta' dożi u ċelloli;

d.

Il-kriterji għall-għażla tal-ogħla doża huma konsistenti ma' dawk deskritti fil-paragrafi 30-33.

Evalwazzjoni u Interpretazzjoni tar-Riżultati

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk:

a.

Tal-inqas wieħed mill-gruppi tat-trattament jesibixxi żieda statistikament sinifikanti fil-frekwenza eritroċiti immaturi mikronukleati meta mqabbel mal-kontroll negattiv parallel,

b.

Din iż-żieda hija marbuta mad-doża tal-inqas f'mument tal-kampjunar wieħed meta tiġi evalwata b'test tat-tendenza xieraq, u

c.

Kwalunkwe wieħed mir-riżultati jaqa' barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson).

Jekk l-ogħla doża biss tiġi eżaminata f'mument tal-kampjunar partikolari, sustanza kimika tat-test titqies li hija pożittiva biċ-ċar jekk ikun hemm żieda statistikament sinifikanti meta mqabbla mal-kontroll negattiv parallel u r-riżultati jaqgħu barra mid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson). Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (44) (45) (46) (47). Meta ssir analiżi tar-rispons għad-doża, għandhom jiġu analizzati tal-inqas tliet gruppi tad-doża. It-testijiet statistiċi għandhom jużaw l-annimal bħala l-unità sperimentali. Ir-riżultati pożittivi minn test mikronukleu jindikaw li sustanza kimika tat-test tinduċi mikronukleji li huma r-riżultat ta' ħsara fil-kromożomi jew ħsara fl-apparat mitotiku fl-eritroblasti tal-ispeċi tat-test. F'każ li fih ikun sar test sabiex jinqabdu ċentromeri fi ħdan mikronukleji, sustanza kimika tat-test li tipproduċi mikronukleji li fihom ċentromeri (DNA ċentromeriku jew kinetoċoru, li jindika telf ta' kromożoma sħiħa) hija evidenza li s-sustanza kimika tat-test hija anewġen.

Diment li jiġu ssodisfati l-kriterji ta' aċċettabilità kollha, sustanza kimika tat-test titqies li hija negattiva biċ-ċar jekk, fil-kundizzjonijiet sperimentali kollha eżaminati:

a.

L-ebda wieħed mill-gruppi tat-trattament ma jesibixxi żieda statistikament sinifikanti fil-frekwenza eritroċiti immaturi mikronukleati meta mqabbel mal-kontroll negattiv parallel,

b.

Ma hemm l-ebda żieda marbuta mad-doża fi kwalunkwe ħin tal-kampjunar meta tiġi evalwata b'test xieraq tat-tendenzi,

c.

Ir-riżultati kollha jaqgħu fid-distribuzzjoni tad-dejta storika tal-kontroll negattiv (eż. limiti tal-kontroll ta' 95 % ibbażati fuq Poisson), u

d.

Seħħ esponiment tal-mudullun għas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test.

Ir-rakkomandazzjonijiet għall-iktar metodi statistiċi xierqa jistgħu jinkisbu mit-tagħrif (44) (45) (46) (47). Evidenza ta' esponiment tal-mudullun għal sustanza kimika tat-test tista' tinkludi dipressjoni tal-proporzjon ta' eritroċiti immaturi għal maturi jew kejl tal-livelli ta' plażma jew tad-demm tas-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test. Fil-każ ta' għoti fil-vina, ma hemmx bżonn ta' evidenza tal-esponiment. Inkella, tista' tintuża dejta ADME, miksuba fi studju indipendenti bl-użu tal-istess rotta u l-istess speċi, sabiex jintwera li seħħ esponiment tal-mudullun. Ir-riżultati negattivi jindikaw li, fil-kundizzjonijiet tat-test, is-sustanza kimika tat-test ma tipproduċix mikronukleji fl-eritroċiti immaturi tal-ispeċi tat-test.

Ma hemm l-ebda ħtieġa għal verifika ta' rispons posittiv jew negattiv ċar.

F'każijiet li fihom ir-rispons la jkun negattiv ċar u lanqas pożittiv ċar u sabiex tgħin fl-istabbiliment tar-rilevanza bijoloġika ta' riżultat (eż. żieda batuta jew limitata), id-dejta għandha tiġi evalwata b'ġudizzju espert u/jew b'investigazzjonijiet ulterjuri tal-esperimenti eżistenti mwettqin. F'ċerti każijiet, l-analiżi ta' iktar ċelloli jew it-twettiq ta' esperiment ripetut bl-użu ta' kundizzjonijiet modifikati tal-esperiment jistgħu jkunu siewja.

F'każijiet rari, anki wara investigazzjonijiet ulterjuri, id-dejta sejra tipprekludi konklużjoni li s-sustanza kimika tat-test tipproduċi riżultati pożittivi jew negattivi u, għalhekk, l-istudju jiġi konkluż bħala ekwivoku.

Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja:

 

Sommarju

 

Sustanza kimika tat-test:

is-sors, in-numru tal-lott, id-data ta' limitu għall-użu, jekk disponibbli;

l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test, jekk magħrufa.

 

Sustanza monokostitwenti:

id-dehra fiżika, is-solubilità fl-ilma, u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti addizzjonali;

identifikazzjoni kimika, bħall-isem IUPAC jew CAS, in-numru CAS, il-kodiċi SMILES jew InChI, il-formula strutturali, il-purità, l-identità kimika tal-impuritajiet kif xieraq u fattibbli fil-prattika, eċċ.

 

Sustanzi multikostitwenti, UVCBs u taħlitiet:

ikkaratterizzati safejn possibbli mill-identità kimika (ara iktar 'il fuq), l-okkorrenza kwantitattiva u l-proprjetajiet fiżikokimiċi rilevanti tal-kostitwenti.

 

Preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test:

il-ġustifikazzjoni għall-għażla tal-veikolu.

is-solubilità u l-istabilità tas-sustanza kimika tat-test fis-solvent/veikolu, jekk magħrufin;

il-preparazzjoni tal-formulazzjonijiet djetetiċi, tal-ilma tajjeb għax-xorb jew tat-teħid man-nifs;

id-determinazzjonijiet analitiċi dwar il-formulazzjonijiet (eż. l-istabilità, l-omoġenità, il-konċentrazzjonijiet nominali), meta jsiru.

 

L-annimali tat-test:

l-ispeċi/ir-razza użata u ġustifikazzjoni għall-għażla;

l-għadd, l-età u s-sess tal-annimali;

is-sors, il-kundizzjonijiet tal-gaġeg, id-dieta, eċċ.;

il-metodu għall-identifikazzjoni unika tal-annimali;

studji fuq terminu qasir: il-piż individwali tal-annimali fil-bidu u fi tmiem it-test; għal studji itwal minn ġimgħa: il-piżijiet tal-ġisem individwali matul l-istudju u l-konsum ta' ikel. Il-medda tal-piż individwali, id-devjazzjoni medja u standard għal kull grupp għandhom ikunu inklużi.

 

Kundizzjonijiet tat-test:

dejta tal-kontroll pożittiv u negattiv (veikolu/solvent);

dejta minn studju għat-tiftix tal-medda, jekk ikun sar;

ir-raġuni għall-għażla tal-livell tad-doża;

dettalji dwar il-preparazzjoni tas-sustanza kimika tat-test;

dettalji dwar l-għoti tas-sustanza kimika tat-test;

ir-raġuni għar-rotta u d-durata tal-għoti;

metodi għall-verifika li s-sustanza (jew sustanzi) kimika tat-test laħqet iċ-ċirkulazzjoni ġenerali jew it-tessut fil-mira;

id-doża propja (mg/kg piż tal-ġisem/jum) ikkalkolata mill-konċentrazzjoni (ppm) u l-konsum tas-sustanza kimika tat-test fid-dieta/ilma tax-xorb, jekk applikabbli;

dettalji dwar il-kwalità tal-ikel u tal-ilma;

il-metodu tal-ewtanażja;

il-metodu tal-analġeżija (meta tintuża);

deskrizzjoni dettaljata tat-trattament u l-iskedi tal-kampjunar u ġustifikazzjonijiet għall- għażliet;

il-metodi tal-preparazzjoni tal-lametti;

il-proċeduri għall-iżolament u l-preservazzjoni tat-tessuti;

il-metodi ta' kejl tat-tossiċità;

kriterji għall-ikklassifikar tal-eritroċiti immaturi mikronukleati;

in-numru ta' ċelloli analizzati għal kull annimal fid-determinazzjoni tal-frekwenza ta' eritroċiti immaturi mikronukleati u għad-determinazzjoni tal-proporzjon ta' eritroċiti immaturi għal maturi;

il-kriterji għall-aċċettabilità tal-istudju;

il-metodi, bħall-użu ta' antikorpi antikinetoċori jew sondi tad-DNA speċifiċi għaċ-ċentromeri, sabiex jiġi kkaratterizat jekk mikronukleu fihx kromożomi sħaħ jew frammentati, jekk applikabbli.

 

Ir-riżultati:

il-kundizzjoni tal-annimali qabel u matul il-perjodu tat-test, inklużi sinjali tat-tossiċità;

il-proporzjon ta' eritroċiti immaturi fost l-eritroċiti totali;

in-numru ta' eritroċiti immaturi mikronukleati, mogħti separatament għal kull annimal;

id-devjazzjoni standard medja ± ta' eritroċiti immaturi mikronukleati għal kull grupp;

ir-relazzjoni bejn id-doża u r-rispons, fejn possibbli;

l-analiżijiet statistiċi u l-metodi applikati;

dejta tal-kontroll negattiv u tal-kontroll pożittiv paralleli bil-meded, il-medji u d-devjazzjonijiet standard;

id-dejta storika tal-kontroll negattiv u pożittiv b'meded, medji u devjazzjonijiet standard, u limiti ta' kontroll ta' 95 % għad-distribuzzjoni, kif ukoll il-perjodu ta' żmien u n-numru ta' punti ta' dejta;

dejta li ssostni l-fatt li seħħ l-esponiment tal-mudullun;

dejta ta' karatterizzazzjoni li tindika jekk mikronukleu fihx kromożomi sħaħ jew frammentati, jekk applikabbli;

il-kriterji ssodisfati għal rispons pożittiv jew negattiv.

 

Diskussjoni tar-riżultati.

 

Konklużjoni.

 

Referenzi.

TAGĦRIF

(1)

OECD (2016). Overview of the set of OECD Genetic Toxicology Test Guidelines and updates performed in 2014-2015. ENV Publications. Series on Testing and Assessment, No. 234, OECD, Paris.

(2)

Hayashi, M. et al. (2007), in vivo erythrocyte micronucleus assay III. Validation and regulatory acceptance of automated scoring and the use of rat peripheral blood reticulocytes, with discussion of non-hematopoietic target cells and a single dose-level limit test, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 627/1, pp. 10-30.

(3)

MacGregor, J.T. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: II. An efficient method of monitoring chromosomal damage in the rat, Toxicology Sciences, Vol. 94/1, pp. 92-107.

(4)

Dertinger, S.D. et al. (2006), Flow cytometric analysis of micronuclei in peripheral blood reticulocytes: I. Intra- and interlaboratory comparison with microscopic scoring, Toxicological Sciences, Vol. 94/1, pp. 83-91.

(5)

Dertinger, S.D. et al. (2011), Flow cytometric scoring of micronucleated erythrocytes: an efficient platform for assessing in vivo cytogenetic damage, Mutagenesis, Vol. 26/1, pp. 139-145.

(6)

Parton, J.W., W.P. Hoffman, M.L. Garriott (1996), Validation of an automated image analysis micronucleus scoring system, Mutation Research, Vol. 370/1, pp. 65-73.

(7)

Asano, N. et al. (1998), An automated new technique for scoring the rodent micronucleus assay: computerized image analysis of acridine orange supravitally stained peripheral blood cells, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 404/1-2, pp. 149-154.

(8)

Styles, J.A. et al. (2001), Automation of mouse micronucleus genotoxicity assay by laser scanning cytometry, Cytometry, Vol. 44/2, pp. 153-155.

(9)

Heddle, J.A. (1973), A rapid in vivo test for chromosomal damage, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 18/2, pp. 187-190.

(10)

Schmid, W. (1975), The micronucleus test, Mutation Research, Vol. 31/1, pp. 9-15.

(11)

Heddle, J.A. et al. (1983), The induction of micronuclei as a measure of genotoxicity. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 123/1, pp. 61-118.

(12)

Mavournin, K.H. et al. (1990), The in vivo micronucleus assay in mammalian bone marrow and peripheral blood. A report of the U.S. Environmental Protection Agency Gene-Tox Program, Mutation Research/Reviews in Genetic Toxicology, Vol. 239/1, pp. 29-80.

(13)

MacGregor, J.T. et al. (1983), Micronuclei in circulating erythrocytes: a rapid screen for chromosomal damage during routine toxicity testing in mice, Developments in Toxicology Environmental Science, Vol. 11, pp. 555-558.

(14)

MacGregor, J.T. et al. (1987), Guidelines for the conduct of micronucleus assays in mammalian bone marrow erythrocytes, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 189/2, pp. 103-112.

(15)

MacGregor, J.T. et al. (1990), The in vivo erythrocyte micronucleus test: measurement at steady state increases assay efficiency and permits integration with toxicity studies, Fundamental and Applied Toxicology, Vol. 14/3, pp. 513-522.

(16)

Hayashi, M. et al. (1990), The micronucleus assay with mouse peripheral blood reticulocytes using acridine orange-coated slides, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 245/4, pp. 245-249.

(17)

CSGMT/JEMS.MMS — The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (1992), Micronucleus test with mouse peripheral blood erythrocytes by acridine orange supravital staining: the summary report of the 5th collaborative study, Mutation Research/Genetic Toxicology, Vol. 278/2-3, pp. 83-98.

(18)

CSGMT/JEMS.MMS — The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan (1995), Protocol recommended by the CSGMT/JEMS.MMS for the short-term mouse peripheral blood micronucleus test. The Collaborative Study Group for the Micronucleus Test (CSGMT) (CSGMT/JEMS.MMS, The Mammalian Mutagenesis Study Group of the Environmental Mutagen Society of Japan), Mutagenesis, Vol. 10/3, pp. 153-159.

(19)

Salamone, M.F., K.H. Mavournin (1994), Bone marrow micronucleus assay: a review of the mouse stocks used and their published mean spontaneous micronucleus frequencies, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 23/4, pp. 239-273.

(20)

Krishna, G., G. Urda, J. Paulissen (2000), Historical vehicle and positive control micronucleus data in mice and rats, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 453/1, pp. 45-50.

(21)

Hayes, J. et al. (2009), The rat bone marrow micronucleus test--study design and statistical power, Mutagenesis, Vol. 24/5, pp. 419-424.

(22)

Wakata, A. et al. (1998), Evaluation of the rat micronucleus test with bone marrow and peripheral blood: summary of the 9th collaborative study by CSGMT/JEMS. MMS. Collaborative Study Group for the Micronucleus Test. Environmental Mutagen Society of Japan. Mammalian Mutagenicity Study Group, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 32/1, pp. 84-100.

(23)

Ryan, T.P. (2000), Statistical Methods for Quality Improvement, 2nd ed., John Wiley and Sons, New York.

(24)

Hayashi, M. et al. (2011), Compilation and use of genetic toxicity historical control data, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 87-90.

(25)

Rothfuss, A. et al. (2011), Improvement of in vivo genotoxicity assessment: combination of acute tests and integration into standard toxicity testing, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 723/2, pp. 108-120.

(26)

Hayashi, M. et al. (1994), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay, Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, Vol. 312/3, pp. 293-304.

(27)

Fielder, R.J. et al. (1992), Report of British Toxicology Society/UK Environmental Mutagen Society Working Group. Dose setting in in vivo mutagenicity assays, Mutagenesis, Vol. 7/5, pp. 313-319.

(28)

OECD (2000), “Guidance Document on the Recognition, Assessment and Use of Clinical Signs as Humane Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 19, OECD Publishing, Paris.

(29)

LeBaron, M.J. et al. (2013), Influence of counting methodology on erythrocyte ratios in the mouse micronucleus test, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 54/3, pp. 222-228.

(30)

Higashikuni, N., S. Sutou (1995), An optimal, generalized sampling time of 30 +/- 6 h after double dosing in the mouse peripheral blood micronucleus test, Mutagenesis, Vol. 10/4, pp. 313-319.

(31)

Hayashi, M. et al. (2000), in vivo rodent erythrocyte micronucleus assay. II. Some aspects of protocol design including repeated treatments, integration with toxicity testing, and automated scoring, Environmental and Molecular Mutagenesis, Vol. 35/3, pp. 234-252.

(32)

Asanami, S., K. Shimono (1997), High body temperature induces micronuclei in mouse bone marrow, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 390/1-2, pp. 79-83.

(33)

Asanami, S., K. Shimono, S. Kaneda (1998), Transient hypothermia induces micronuclei in mice, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 413/1, pp. 7-14.

(34)

Spencer, P.J. et al. (2007), Induction of micronuclei by phenol in the mouse bone marrow: I. Association with chemically induced hypothermia, Toxicological Sciences, Vol. 97/1, pp. 120-127.

(35)

Hayashi, M., T. Sofuni, M. Jr. Ishidate (1983), An application of Acridine Orange fluorescent staining to the micronucleus test, Mutation Research Letters, Vol. 120/4, pp. 241-247.

(36)

MacGregor, J.T., C.M. Wehr, R.G. Langlois (1983), A simple fluorescent staining procedure for micronuclei and RNA in erythrocytes using Hoechst 33258 and pyronin Y, Mutation Research, Vol. 120/4, pp. 269-275.

(37)

Romagna, F., C.D. Staniforth (1989), The automated bone marrow micronucleus test, Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, Vol. 213/1, pp. 91-104.

(38)

Sun, J.T., M.J. Armstrong, S.M. Galloway (1999), Rapid method for improving slide quality in the bone marrow micronucleus assay; an adapted cellulose column procedure, Mutation Research, Vol. 439/1, pp. 121-126.

(39)

Miller, B.M., I.D. Adler (1990), Application of antikinetochore antibody staining (CREST staining) to micronuclei in erythrocytes induced in vivo, Mutagenesis, Vol. 5/4, pp. 411-415.

(40)

Miller, B.M. et al. (1991), Classification of micronuclei in murine erythrocytes: immunofluorescent staining using CREST antibodies compared to in situ hybridization with biotinylated gamma satellite DNA, Mutagenesis, Vol. 6/4, pp. 297-302.

(41)

Russo, A. (2002), PRINS tandem labeling of satellite DNA in the study of chromosome damage, American Journal of Medical Genetics, Vol. 107/2, pp. 99-104.

(42)

Gollapudi, B.B., L.G. McFadden (1995), Sample size for the estimation of polychromatic to normochromatic erythrocyte ratio in the bone marrow micronucleus test, Mutation Research, Vol. 347/2, pp. 97-99.

(43)

OECD (2014), “Statistical analysis supporting the revision of the genotoxicity Test Guidelines”, OECD Environment, Health and Safety Publications (EHS), Series on Testing and Assessment, No. 198, OECD Publishing, Paris.

(44)

Richold, M. et al. (1990), “In Vivo Cytogenetics Assays”, in Basic Mutagenicity Tests, UKEMS Recommended Procedures. UKEMS Subcommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing. Report. Part I revised, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 115-141.

(45)

Lovell, D.P. et al. (1989), “Statistical Analysis of in vivo Cytogenetic Assays”, in Statistical Evaluation of Mutagenicity Test Data. UKEMS SubCommittee on Guidelines for Mutagenicity Testing, Report, Part III, Kirkland, D.J. (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, pp. 184-232.

(46)

Hayashi, M. et al. (1994), Statistical analysis of data in mutagenicity assays: rodent micronucleus assay, Environmental Health Perspectives, Vol. 102/Suppl 1, pp. 49-52.

(47)

Kim, B.S., M. Cho, H.J. Kim (2000), Statistical analysis of in vivo rodent micronucleus assay, Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, Vol. 469/2, pp. 233-241.

Appendiċi 1

DEFINIZZJONIJIET

Ċentromeru : Reġjun(i) ta' kromożomu li miegħu huma assoċjati fibri rqaq waqt id-diviżjoni taċ-ċellola, li jippermettu l-moviment b'ċertu ordni ta' kromożomi sekondarji għall-poli ta' ċelloli sekondarji.

Sustanza kimika : sustanza jew taħlita.

Eritroblast : Stadju bikri fl-iżvilupp tal-eritroċita, li jiġi eżatt qabel l-eritroċita immatura, fejn iċ-ċellola jkun għad fiha nukleu.

Kinetoċoru : L-istruttura tal-proteini li tifforma fiċ-ċentromeru taċ-ċelloli ewkarjotiċi, li torbot il-kromożoma mal-polimeri mikrotubuli mill-magħżel mitotiku matul il-mitożi u mejożi u l-funzjonijiet matul id-diviżjoni taċ-ċelloli sabiex tissepara l-kromatidi aħwa.

Mikronukleji : Nukleji żgħar, separati minn u addizzjonali għan-nukleji prinċipali taċ-ċelloli, prodotti waqt it-telofażi ta' mitożi (mejożi) permezz ta' biċċiet ta' residwi ta' kromożomi jew kromożomi sħaħ.

Eritroċita normokromatika jew matura : Eritroċita matura għalkollox li tilfet l-RNA residwu li jifdal wara l-enukleazzjoni u/jew li tilfet markaturi taċ-ċelloli oħrajn b'ħajja qasira li normalment jgħibu wara l-enukleazzjoni malli sseħħ id-diviżjoni tal-eritroblast finali.

Eritroċita polikromatika jew immatura : Eritroċita fformata ġdida fi stadju intermedju tal-iżvilupp, li tlewwen kemm bil-komponenti blu kif ukoll ħomor tat-tilwin klassiku tad-demm bħall-Giemsa ta' Wright minħabba l-preżenza ta' RNA residwu fiċ-ċellola fformata ġdida. Ċelloli fformati ġodda bħal dawn huma bejn wieħed u ieħor l-istess bħal retikuloċiti, li huma viżwalizzati bl-użu ta' kulurant vitali li jikkaġuna l-RNA residwu sabiex jagħqad f'retikulu. Metodi oħrajn, inkluż it-tilwin monokromatiku tal-RNA b'kuluranti fluworexxenti jew tikkettar ta' markaturi tal-wiċċ b'ħajja qasira bħas-CD71 b'antikorpi fluworexxenti, saru jintużaw ta' spiss sabiex tiġi identifikata ċ-ċellola ħamra tad-demm ifformata ġdida. Eritroċiti polikromatiċi, retikuloċiti, u eritroċiti pożittivi għas-CD71 ilkoll huma eritroċiti immaturi, għad li kull waħda minnhom għandha distribuzzjoni tal-età kemxejn differenti.

Retikuloċita : Eritroċita fformata ġdida mlewna b'kulurant vitali li twassal sabiex l-RNA ċellolari residu jagħqad f'retikulu karatteristiku. Ir-retikuloċiti u l-eritroċiti polikromatiċi għandhom distribuzzjoni tal-età ċellolari simili.

Sustanza kimika tat-test : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.

Appendiċi 2

ID-DISINN FATTORJALI GĦALL-IDENTIFIKAZZJONI TAD-DIFFERENZI FIS-SESSI FL-ASSAĠĠ IN VIVO TAL-MIKRONUKLEU

Id-disinn fattorjali u l-analiżi tiegħu

F'dan id-disinn, jiġu ttestjati tal-inqas 5 irġiel u 5 nisa f'kull livell tal-konċentrazzjoni li jirriżultaw f'disinn li juża tal-inqas 40 annimal (20 raġel u 20 mara, flimkien ma' kontrolli pożittivi rilevanti).

Id-disinn, li huwa wieħed mill-iktar disinni fattorjali sempliċi, huwa ekwivalenti għal analiżi bidirezzjonali tal-varjanza bis-sess u l-livell ta' konċentrazzjoni li huma l-effetti ewlenin. Id-dejta tista' tiġi analizzata billi jintużaw pakketti ta' softwer statistiku standard bħal SPSS, SAS, STATA, Genstat kif ukoll bl-użu ta' R.

L-analiżi tagħmel partizzjoni tal-varjabbiltà fis-sett ta' dejta bejn is-sessi, bejn il-konċentrazzjonijiet u b'rabta mal-interazzjoni bejn is-sessi u l-konċentrazzjonijiet. Kull wieħed mit-termini jiġi ttestjat kontra stima tal-varjabbiltà bejn l-annimali rreplikati fi ħdan il-gruppi ta' annimali tal-istess sess bl-istess konċentrazzjoni. Id-dettalji sħaħ dwar il-metodoloġija sottostanti huma disponibbli f'ħafna kotba standard dwar l-istatistika (ara r-referenzi) u fil-faċilitajiet tal-għajnuna pprovduti mal-pakketti statistiċi.

L-analiżi tkompli billi ssir spezzjoni tat-terminu ta' interazzjoni sess x konċentrazzjoni fit-tabella ANOVA (6). Fin-nuqqas ta' terminu ta' interazzjoni sinifikanti, il-valuri kombinati bejn is-sessi jew fost il-livelli ta' konċentrazzjoni jipprovdu testijiet statistiċi validi bejn il-livelli bbażati fuq it-terminu tal-varjabbiltà tar-raggruppati fi ħdan il-grupp tal-ANOVA.

L-analiżi tkompli billi tagħmel partizzjoni bejn l-istima tal-varjabbiltà bejn il-konċentrazzjonijiet f'kuntrasti li jipprovdu għal test għal kuntrasti lineari u kwadratiċi tar-risponsi bejn il-livelli tal-konċentrazzjonijiet. Meta jkun hemm interazzjoni sinifikanti sess x konċentrazzjoni, tista' ssir partizzjoni ta' dan it-terminu f'kuntrasti ta' interazzjoni lineari x sess u kwadradiku x sess ukoll. Dawn it-termini jipprovdu testijiet ta' jekk ir-risponsi għall-konċentrazzjoni humiex paralleli għaż-żewġ sessi jew jekk hemmx rispons differenzjali bejn iż-żewġ sessi.

L-istima tal-varjabbiltà tal-miġburin fi ħdan il-grupp tista' tintuża sabiex tipprovdi testijiet bejn il-pari tad-differenza bejn il-medji. Dawn il-paraguni jistgħu jsiru bejn il-medji għaż-żewġ sessi u bejn il-medji għal-livelli ta' konċentrazzjoni differenti bħal fil-każ tal-paraguni mal-livelli tal-kontroll negattiv. F'dawk il-każijiet li fihom ikun hemm interazzjoni sinifikanti, jistgħu jsiru paraguni bejn il-medji ta' konċentrazzjonijiet differenti fi ħdan sess jew bejn il-medji tas-sessi fl-istess konċentrazzjoni.

Referenzi

Hemm ħafna kotba dwar l-istatistika li jiddiskutu t-teorija, id-disinn, il-metodoloġija, l-analiżi u l-interpretazzjoni tad-disinni fattorjali li jvarjaw mill-iktar analiżijiet b'żewġ fatturi sempliċi sal-iktar forom kumplessi użati fil-metodoloġija dwar id-“Disinn tal-Esperiment”. Din li ġejja mhijiex lista eżawrjenti. Uħud mill-kotba jipprovdu eżempji maħdumin ta' disinni komparabbli, f'ċerti każijiet b'kodiċi għat-twettiq tal-analiżijiet bl-użu ta' diversi pakketti ta' softwer.

 

Box, G.E.P, Hunter, W.G. and Hunter, J.S. (1978). Statistics for Experimenters. An Introduction to Design, Data Analysis, and Model Building. New York: John Wiley & Sons.

 

Box G.E.P. & Draper, N.R. (1987). Empirical model-building and response surfaces. John Wiley & Sons Inc.

 

Doncaster, C.P. & Davey, A.J.H. (2007). Analysis of Variance and Covariance: How to Choose and Construct Models for the Life Sciences. Cambridge University Press.

 

Mead, R. (1990). The Design of Experiments. Statistical principles for practical application. Cambridge University Press.

 

Montgomery D.C. (1997). Design and Analysis of Experiments. John Wiley & Sons Inc.

 

Winer, B.J. (1971). Statistical Principles in Experimental Design. McGraw Hill.

 

Wu, C.F.J & Hamada, M.S. (2009). Experiments: Planning, Analysis and Optimization. John Wiley & Sons Inc.

(6)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.15.

(7)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.16.

(8)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.18.

(9)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.19.

(10)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.20.

(11)

Fil-Parti B, jitħassar il-Kapitolu B.24.

(12)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.47 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.47   Metodu tat-Test tal-Opaċità u l-Permeabilità tal-Kornea fil-Bovini għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 437 tal-OECD (2013). Il-metodu tat-test tal-Opaċità u l-Permeabilità tal-Kornea fil-Bovini ġie evalwat mill-Kumitat ta' Koordinazzjoni Interaġenzjali dwar il-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ICCVAM), flimkien maċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (JaCVAM), fl-2006 u l-2010 (1)(2). Fl-ewwel evalwazzjoni, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ġie evalwat għall-utilità tiegħu sabiex jidentifika sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (1). Fit-tieni evalwazzjoni, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ġie evalwat għall-utilità tiegħu sabiex jidentifika sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) mhux klassifikati għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (2). Id-database tal-validazzjoni tal-BCOP kien fiha 113-il sustanza u 100 taħlita b'kollox (2)(3). Minn dawn l-evalwazzjonijiet u r-reviżjoni bejn il-pari tagħhom, ġie konkluż li l-metodu ta' ttestjar jista' jidentifika kif suppost sustanzi kimiċi (kemm sustanzi kif ukoll taħlitiet) li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1) kif ukoll dawk li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, kif definiti mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) (4) u r-Regolament (KE) Nru 1272/2008 dwar il-Klassifikazzjoni, l-Ittikkettar u l-Imballaġġ tas-Sustanzi u t-Taħlitiet (CLP) (7) u, għaldaqstant, ġie approvat bħala xjentifikament validu għal dawn iż-żewġ skopijiet. Ħsara serja lill-għajnejn hija l-produzzjoni ta' tibdiliet fl-għajnejn, jew tnaqqis fiżiku serju tal-vista, wara li tiġi applikata sustanza kimika fuq il-wiċċ quddiemi tal-għajn, li ma jkunux riversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Is-sustanzi kimiċi tat-test li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn huma klassifikati fil-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU. Is-sustanzi kimiċi mhux ikklassifikati għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn huma definiti bħala dawk li ma jissodisfawx ir-rekwiżiti għall-klassifikazzjoni fil-Kategorija 1 jew 2 (2A jew 2B) tal-GHS tan-NU, jiġifieri huma msejħin bħala Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU. Dan il-metodu ta' ttestjar jinkludi l-użu rakkomandat u l-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP fuq il-bażi tal-evalwazzjonijiet tiegħu. Id-differenzi ewlenin bejn il-verżjoni oriġinali tal-2009 u l-verżjoni aġġornata tal-2013 tal-linja gwida tat-test tal-OECD jikkonċernaw, iżda mhumiex limitati għal: l-użu tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni skont il-GHS tan-NU (paragrafi 2 u 7); kjarifiki fuq l-applikabilità tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għall-ittestjar ta' alkoħols, ketoni u solidi (paragrafi 6 u 7) u ta' sustanzi u taħlitiet (paragrafu 8); kjarifiki fuq kif għandhom jiġu testjati sustanzi tensjoattivi u taħlitiet li fihom tensjoattivi (paragrafu 28); aġġornamenti u kjarifiki dwar il-kontrolli pożittivi (paragrafi 39 u 40); aġġornament tal-kriterji dwar id-deċiżjoni tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP (paragrafu 47); aġġornament tal-kriterji ta' aċċettazzjoni tal-istudju (paragrafu 48); aġġornament fl-elementi tar-rapport tat-test (paragrafu 49); aġġornament tal-Appendiċi 1 dwar id-definizzjonijiet; iż-żieda tal-Appendiċi 2 tal-kapaċità ta' previżjoni tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP skont id-diversi sistemi ta' klassifikazzjoni; aġġornament tal-Appendiċi 3 fuq il-lista ta' sustanzi kimiċi tal-profiċjenza; u aġġornament tal-Appendiċi 4 dwar l-apparat fejn titqiegħed il-kornea tal-BCOP (paragrafu 1) u dwar l-opaċitometru (paragrafi 2 u 3).

Ġeneralment huwa aċċettat li, fil-futur qarib, ebda test in vitro tal-irritazzjoni tal-għajnejn waħdu ma huwa sejjer ikun kapaċi jieħu post it-test Draize in vivo tal-għajnejn sabiex ibassar il-medda sħiħa ta' irritazzjonijiet għal klassijiet ta' sustanzi kimiċi differenti. Madankollu, taħlitiet strateġiċi ta' diversi metodi ta' ttestjar alternattivi fi ħdan strateġija ta' ttestjar (sekwenzjali) jaf ikunu kapaċi jieħdu post it-test Draize tal-għajnejn (5). L-approċċ minn Fuq għal Isfel (5) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika tkun mistennija li jkollha potenzjal għoli ta' irritazzjoni, filwaqt li l-approċċ minn Isfel għal Fuq (5) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika ma tkunx mistennija tikkaġuna biżżejjed irritazzjoni tal-għajnejn sabiex tkun teħtieġ li tiġi kklassifikata. Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa metodu ta' ttestjar in vitro li jista' jintuża f'ċerti ċirkustanzi u fi ħdan limitazzjonijiet speċifiċi għall-klassifikazzjoni tal-periklu għall-għajnejn u t-tikkettar ta' sustanzi kimiċi. Filwaqt li ma jitqiesx li huwa validu bħala sostitut awtonomu għat-test in vivo tal-għajnejn fuq il-fniek, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa rakkomandat bħala pass inizjali fi ħdan strateġija ta' ttestjar, bħall-approċċ minn Fuq għal Isfel issuġġerit minn Scott et al. (5) sabiex jiġu identifikati sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati fil-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, mingħajr ma jsiru iktar testijiet (4). Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa rakkomandat ukoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, kif definiti mill-GHS tan-NU (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU) (4) fi ħdan strateġija ta' ttestjar bħall-approċċ minn Isfel għal Fuq (5). Madankollu, sustanza kimika li mhijiex prevista li tikkaġuna ħsara serja lill-għajnejn jew bħala mhux klassifikata għal irritazzjoni tal-għajnejn/ħsara serja lill-għajnejn bil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP tkun teħtieġ iktar testijiet (in vitro u/jew in vivo) sabiex tistabbilixxi klassifikazzjoni definittiva.

L-għan ta' dan il-metodu ta' ttestjar huwa li jiddeskrivi l-proċeduri użati għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanza kimika tat-test tikkawża periklu għall-għajen kif imkejjel mill-ħila tagħha li tinduċi opaċità jew żieda fil-permeabilità f'kornea bovina iżolata. L-effetti tossiċi għall-kornea jitkejlu bi: (i) trażmissjoni mnaqqsa tad-dawl (opaċità), u (ii) żieda fil-passaġġ tal-kulurant fluworexxein tas-sodju (permeabilità). Il-valutazzjonijiet tal-opaċità u l-permeabilità tal-kornea wara esponiment għas-sustanza kimika tat-test jingħaqdu għall-kisba ta' Punteġġ tal-Irritazzjoni In Vitro (IVIS), li jintuża sabiex jiġi kklassifikat il-livell ta' irritazzjoni tas-sustanza kimika tat-test.

Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq il-protokoll tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP tal-ICCVAM (6)(7), li oriġinarjament kien żviluppat minn informazzjoni miksuba mill-Istitut għall-protokoll tax-Xjenzi in vitro (IIVS) u l-Protokoll 124 tal-INVITTOX (8). Dan tal-aħħar jirrappreżenta l-protokoll użat għall-istudju ta' prevalidazzjoni sponsorjat mill-Komunità Ewropea li sar fl-1997-1998. Dawn iż-żewġ protokolli kienu bbażati fuq il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP irrapportat għall-ewwel darba minn Gautheron et al. (9).

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn kif definiti mill-GHS tan-NU, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati taħt il-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU (4). Meta jintuża għal dan il-għan, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 79 % (150/191), rata ta' foloz pożittivi ta' 25 % (32/126), rata ta' foloz negattivi ta' 14 % (9/65), meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo tal-għajnejn tal-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (3) (ara l-Appendiċi 2, Tabella 1). Meta s-sustanzi kimiċi tat-test fi ħdan ċerti klassijiet ta' sustanzi kimiċi (jiġifieri alkoħols, ketoni) jew fiżiċi (jiġifieri solidi) jiġu esklużi mid-database, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 85 % (111/131), rata ta' foloz pożittivi ta' 20 % (16/81), rata ta' foloz negattivi ta' 8 % (4/50) għas-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (3). In-nuqqasijiet potenzjali tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP meta jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU) huma bbażati fuq ir-rati għoljin ta' foloz pożittivi għal alkoħols u ketoni u r-rata għolja ta' foloz negattivi għal solidi osservati fid-database dwar il-validazzjoni (1)(2)(3). Madankollu, peress li mhux l-alkoħols u l-ketoni kollha huma mbassra b'mod eċċessiv mill-metodu ta' ttestjar tal-BCOP u wħud huma mbassrin kif suppost bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, dawn iż-żewġ gruppi funzjonali organiċi ma jitqisux li jaqgħu barra mid-dominju ta' applikabilità tal-metodu ta' ttestjar. Huwa f'idejn l-utent ta' dan il-metodu ta' ttestjar li jiddeċiedi jekk previżjoni eċċessiva possibbli ta' alkoħol jew keton tistax tiġi aċċettat jew jekk għandhomx isiru iktar testijiet f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Rigward ir-rati ta' foloz negattivi għas-solidi, ta' min jinnota li s-solidi jistgħu jwasslu għal kundizzjonijiet varjabbli u ta' esponiment estrem fit-test Draize in vivo tal-irritazzjoni tal-għajnejn, li jitsgħu jirriżultaw fi previżjonijiet irrilevanti tal-potenzjal ta' irritazzjoni veru tagħhom (10). Ta' min jinnota wkoll li l-ebda wieħed mill-foloz negattivi identifikati fid-database tal-validazzjoni tal-ICCVAM (2)(3), fil-kuntest ta' identifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU), ma rriżulta f'IVIS ≤ 3, li huwa l-kriterju użat sabiex sustanza kimika tat-test tiġi identiifkata bħala Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU. Barra minn hekk, f'dan il-kuntest il-foloz negattivi tal-BCOP mhumiex kritiċi peress li s-sustanzi kimiċi kollha tat-test li jipproduċu 3 < IVIS ≤ 55 imbagħad jiġu ttestjati b'testijiet in vitro validati adegwatament oħrajn, jew bħala l-aħħar alternattiva fil-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Peress li ċerti sustanzi kimiċi solidi huma previsti kif suppost mill-metodu ta' ttestjar tal-BCOP bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, dan l-istat fiżiku lanqas ma jitqies li ma jaqax taħt id-dominju tal-applikabilità tal-metodu ta' ttestjar. L-investigaturi għandhom jikkunsidraw jużaw dan il-metodu ta' ttestjar għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, f'liema każ IVIS > 55 għandu jiġi aċċettat bħala indikatur ta' rispons inkluża ħsara serja lill-għajnejn li għandu jiġi klassifikat bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU mingħajr ma jsiru iktar testijiet. Madankollu, kif diġà ntqal, riżultati pożittivi miksuba bl-alkoħols jew il-ketoni għandhom jiġu interpretati b'ċerta kawtela minħabba potenzjal ta' tbassir żejjed.

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jintuża wkoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4). Meta jintuża għal dan il-għan, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 69 % (135/196), rata ta' foloz pożittivi ta' 69 % (61/89), rata ta' foloz negattivi ta' 0 % (0/107), meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo tal-għajnejn tal-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (3) (ara l-Appendiċi 2, Tabella 2). Ir-rata ta' foloz pożittivi miksuba (sustanzi kimiċi ta' Ebda Kategorija tal-GNS tan-NU li in vivo jipproduċi IVIS > 3, ara l-paragrafu 47) hija konsiderevolment għolja, iżda mhijiex kritika f'dan il-kuntest peress li s-sustanzi kimiċi kollha tat-test li jipproduċu 3 < IVIS ≤ 55 imbagħad jiġu ttestjati b'testijiet in vitro validati adegwatament oħrajn, jew bħala l-aħħar alternattiva fil-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma juri ebda nuqqas speċifiku għall-ittestjar ta' alkoħols, ketoni u solidi meta l-iskop ikun li jiġu identifikati sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU) (3). L-investigaturi għandhom jikkunsidraw jużaw dan il-metodu ta' ttestjar għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, f'liema każ riżultat negattiv (IVIS ≤ 3) għandu jiġi aċċettat bħala indikatur li ma hemm bżonn ta' ebda klassifikazzjoni (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU). Peress li l-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jidentifika korrettament 31 % biss mis-sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, dan il-metodu ta' ttestjar ma għandux ikun l-ewwel għażla sabiex jinbeda approċċ minn Isfel għal Fuq (5), jekk ikun hemm metodi in vitro validati u aċċettati oħrajn b'sensittività għolja simili iżda speċifiċità għolja għad-dispożizzjoni.

Id-database tal-validazzjoni tal-BCOP kien fiha 113-il sustanza u 100 taħlita b'kollox (2)(3). Għaldaqstant, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jitqies applikabbli għall-ittestjar taż-żewġ sustanzi u taħlitiet.

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP mhuwiex rakkomandat għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala irritanti għall-għajnejn (Kategorija 2 jew Kategorija 2A tal-GHS tan-NU) jew sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala ftit irritanti għall-għajnejn (Kategorija 2B tal-GHS tan-NU) minħabba n-numru konsiderevoli ta' sustanzi kimiċi tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU bħala sustanzi kimiċi tal-Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU u ta' Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU sovraklassifikati bħala Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU(2)(3). Għal dan il-għan, jista' jkun hemm bżonn li jsiru iktar testijiet b'metodu xieraq ieħor.

Il-proċeduri kollha li jinvolvu għajnejn bovini u korneji bovini għandhom isegwu r-regolamenti u l-proċeduri applikabbli tal-istallazzjoni tal-ittestjar f'dak li għandu x'jaqsam mal-manipulazzjoni ta' materjali dderivati mill-annimali, li jinkludu, iżda li mhumiex limitati għal, tessuti u fluwidi tat-tessuti. Huwa rakkomandat li jittieħdu l-prekawzjonijiet universali tal-laboratorju (11).

Filwaqt li l-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma jqisx feriti konġuntivali u iridali, jindirizza l-effetti korneali, li huma kawża primarja tal-klassifikazzjoni in vivo meta titqies il-klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU. Ir-reversibilità tal-feriti korneali ma tistax tiġi evalwata per se fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP. Ġie propost, abbażi ta' studji fuq għajnejn il-fniek, li valutazzjoni tal-fond inizjali tal-ferita fil-kornea tista' tintuża sabiex jiġu identifikati xi tipi ta' effetti riversibbli (12). Madankollu, hemm bżonn ta' iktar għarfien xjentifiku sabiex nifhmu kif iseħħu effetti irreversibbli mhux marbtin ma' ferita inizjali ta' livell għoli. Fl-aħħar nett, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma jippermettix li ssir valutazzjoni tal-potenzjal għal tossiċità sistemika assoċjata ma' esponiment okulari.

Dan il-metodu ta' ttestjar sejjer jiġi aġġornat kull ċertu żmien iktar ma jkun hemm informazzjoni u dejta ġodda kkunsidrati. Pereżempju, l-istopatoloġija tista' tkun potenzjalment siewja meta jkun hemm bżonn ta' karatterizzazzjoni iktar kompluta tal-ħsara fil-kornea. Ki spjegat fid-Dokument ta' Gwida tal-OECD Nru 160 (13), dawk li jużawh huma mħeġġin jippreservaw il-kornei u jħejju kampjuni għall-istopatoloġija li jistgħu jintużaw sabiex jiġu żviluppati database u kriterji dwar id-deċiżjonijiet li jistgħu jkomplu jtejbu l-preċiżjoni ta' dan il-metodu ta' ttestjar.

Għal kwalunkwe laboratorju li inizjalment jistabbilixxi dan il-metodu ta' ttestjar, għandhom jintużaw is-sustanzi kimiċi tal-profiċjenza pprovduti fl-Appendiċi 3. Laboratorju jista' juża dawn is-sustanzi kimiċi sabiex juri l-kompetenza teknika tiegħu fit-twettiq tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP qabel ma jissottometti dejta tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għall-finijiet tal-klassifikazzjoni regolatorja tal-perikli.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa mudell organotipiku li jipprovdi manutenzjoni fuq perjodu qasir tal-funzjoni fiżjoloġika u bijokimika normali tal-kornea tal-bovini in vitro. F'dan il-metodu ta' ttestjar, il-ħsara mis-sustanza kimika tat-test tiġi vvalutata minn kejl kwantitattiv ta' bidliet fl-opaċità u l-permeabilità tal-kornea permezz ta' opaċitometru u spettrofotometru ta' dawl viżibbli, rispettivament. Iż-żewġ tipi ta' kejl jintużaw sabiex jiġi kkalkolat IVIS, li jintuża sabiex tiġi assenjata kategorija ta' klassifikazzjoni tal-periklu ta' irritazzjoni in vitro għat-tbassir tal-potenzjal ta' irritazzjoni okulari tas-sustanza kimika tat-test in vivo (ara l-Kriterji tad-Deċiżjoni fil-paragrafu 48).

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP juża kornei iżolati mill-għajnejn ta' bhejjem li jkunu għadhom kemm inqatlu. L-opaċità tal-kornea titkejjel b'mod kwantitattiv bħala l-ammont ta' trażmissjoni ta' dawl minn ġol-kornea. Il-permeabilità titkejjel b'mod kwantitattiv bħala l-ammont ta' żebgħa fluworexxeina tas-sodju li jgħaddi min-naħa għall-oħra tal-ħxuna kollha tal-kornea, kif individwat fil-medium fil-kavità posterjuri. Is-sustanzi kimiċi tat-test, li jiġu introdotti fil-kavità anterjuri tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea, jiġu applikati fis-superfiċje tal-epitelju tal-kornea. L-Appendiċi 4 tipprovdi deskrizzjoni u dijagramma tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea użat fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP. L-apparat fejn titqiegħed il-kornea jista' jinxtara minn sorsi differenti jew jista' jinbena.

Is-Sors u l-Età tal-Għajnejn tal-Bovini u l-Għażla tal-Ispeċijiet tal-Annimali

Bhejjem mibgħuta l-biċċeriji tipikament jinqatlu jew għall-konsum mill-bniedem jew inkella għal użi kummerċjali oħrajn. Bħala sors ta' korneji għall-użu fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jintużaw biss l-annimali b'saħħithom li jitqiesu xierqa sabiex jidħlu fil-katina alimentari tal-bniedem. Minħabba li l-bhejjem għandhom skala wiesgħa ta' piżijiet, skont ir-razza, l-età u s-sess, mhemmx piż irrakkomandat għall-annimal meta jiġi biex jinqatel.

Meta jintużaw għajnejn minn annimali ta' età differenti jistgħu jirriżultaw varjazzjonijiet fid-dimensjonijiet tal-kornea. Korneji b'dijametru orizzontali > 30.5 mm u valuri tal-ħxuna ċentrali tal-kornea (CCT) ≥ 1 100 μm ġeneralment jinkisbu minn bhejjem li jkollhom aktar minn tmien snin, filwaqt li dawk b'dijametru orizzontali < 28.5 mm u CCT < 900 μm ġeneralment jinkisbu minn bhejjem li jkollhom anqas minn ħames snin (14). Minħabba f'hekk, tipikament ma jintużawx għajnejn minn bhejjem li jkollhom aktar minn 60 xahar. Għajnejn minn bhejjem li jkollhom anqas minn 12-il xahar tradizzjonalment ma ntużawx għaliex l-għajnejn ikunu għadhom qegħdin jiżviluppaw u l-ħxuna tal-kornea u d-dijametru tal-kornea jkunu iżgħar b'mod konsiderevoli minn dawk irrapportati għall-għajnejn mill-bhejjem adulti. Madankollu, l-użu ta' kornei minn annimali żgħar (jiġifieri ta' età minn 6 xhur sa 12-il xahar) huwa permess minħabba li hemm xi vantaġġi, bħal pereżempju disponibilità akbar, skala dejqa ta' etajiet, u inqas perikli marbuta ma' esponiment potenzjali tal-ħaddiema għall-Enċefalopatija Sponġiforma Bovina (15). Minħabba li aktar evalwazzjoni tal-effett tad-daqs jew il-ħxuna tal-kornea fuq is-sensibilità għal sustanzi kimiċi korrużivi u irritanti tkun utli, l-utenti huma mħeġġin jirrapportaw stima tal-età u/jew il-piż tal-annimali li jipprovdu l-korneji użati fi studju.

Ġbir u Trasport tal-Għajnejn lejn il-Laboratorju

L-għajnejn jinġabru mill-impjegati tal-biċċerija. Sabiex jiġu minimizzati l-ħsara mekkanika u tipi oħrajn ta' ħsara lill-għajnejn, l-għajnejn għandhom jiġu enukleati mill-iktar fis wara l-mewt u jitkessħu minnufih wara l-enukleazzjoni u matul it-trasport. Sabiex jiġi evitat l-esponiment tal-għajnejn għal sustanzi kimiċi potenzjalment irritanti, il-ħaddiema tal-biċċerija ma għandhomx jużaw deterġent meta jlaħalħu ras l-annimal.

L-għajnejn għandhom jingħaddsu kompletament f'Soluzzjoni tal-Melħ Ekwilibrata mkessħa ta' Hanks, (Hanks' Balanced Salt Solution, HBSS) f'reċipjent ta' daqs adattat, u ttrasportati lejn il-laboratorju b'mod li kemm jista' jkun inaqqas id-deterjorament u/jew il-kontaminazzjoni mill-batterji. Minħabba li l-għajnejn jinġabru waqt il-proċess tal-qatla, dawn jistgħu jiġu esposti għad-demm u għal materjali bijoloġiċi oħrajn, inklużi batterji u mikroorganiżmi oħrajn. Għalhekk huwa importanti li jiġi żgurat li r-riskju ta' kontaminazzjoni jitnaqqas kemm jista' jkun (eż. billi r-reċipjent li jkun fih l-għajnejn jinżamm fuq silġ imxarrab, billi jiżdiedu antibijotiċi fl-HBSS li tintuża għall-ħżin tal-għajnejn waqt it-trasport [eż. 100 IU/mL ta' peniċillina u 100 μg/ml ta' streptomiċina]).

L-intervall tal-ħin li jgħaddi minn meta jinġabru l-għajnejn u l-użu tal-kornei fil-BCOP għandu jitnaqqas kemm jista' jkun (tipikament għandhom jinġabru u jintużaw fl-istess ġurnata) u għandu jintwera li dan ma jikkompromettix ir-riżultati tal-assaġġ. Dawn ir-riżultati huma bbażati fuq il-kriterji tal-għażla għall-għajnejn, kif ukoll ir-risponsi tal-kontrolli pożittivi u negattivi. L-għajnejn kollha użati fl-assaġġ għandhom ikunu mill-istess grupp ta' għajnejn miġbura f'ġurnata speċifika.

Il-Kriterji tal-Għażla għall-Għajnejn Użati fil-Metodu ta' Ttestjar tal-BCOP

Malli jaslu fil-laboratorju, l-għajnejn jiġu eżaminati bir-reqqa għad-difetti inklużi żieda fl-opaċità, grif u neovaskularizzazzjoni. Għandhom jintużaw biss il-korneji minn għajnejn li ma jkollhom l-ebda difett ta' dan it-tip.

Il-kwalità ta' kull kornea tiġi evalwata wkoll fi stadji li jiġu aktar 'il quddiem fl-assaġġ. Korneji li għandhom opaċità ikbar minn seba' unitajiet tal-opaċità jew ekwivalenti għall-opaċitometru u apparati fejn titqiegħed il-kornea wara perjodu ta' ekwilibrazzjoni inizjali ta' siegħa għandhom jintremew (NOTA: l-opaċitometru għandu jiġi kkalibrat bi standards tal-opaċità li jintużaw sabiex jiġu stabbiliti l-unitajiet tal-opaċità, ara l-Appendiċi 4).

Kull grupp tat-trattament (sustanza kimika tat-test, kontrolli negattivi u pożittivi paralleli) jikkonsisti minn minimu ta' tliet għajnejn. Fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP għandhom jintużaw tliet korneji għall-kontroll negattiv. Minħabba li l-korneji kollha jinqatgħu barra mill-globu sħiħ, u jitqiegħdu fil-kavitajiet tal-korneji, il-manipulazzjoni tagħhom tista' tirriżulta f'artefatti fil-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-korneji individwali (inkluż il-kontroll negattiv). Barra minn hekk, il-valuri tal-opaċità u l-permeabilità mill-korneji tal-kontroll negattiv jintużaw biex jikkoreġu l-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-kornei ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u l-kornei ttrattati bil-kontroll pożittiv fil-kalkoli tal-IVIS.

PROĊEDURA

Preparazzjoni tal-Għajnejn

Korneji li ma jkollhom l-ebda difett jiġu dissezzjonati b'tali mod li jibqa' minn 2 sa 3 mm ta' xifer tal-isklerotika sabiex jgħin il-manipulazzjoni sussegwenti, u dan isir b'attenzjoni sabiex tiġi evitata kwalunkwe ħsara fl-epitelju u l-endotelju. Korneji iżolati jitqiegħdu f'apparat fejn titqiegħed il-kornea ddisinjat speċjalment għal dan il-għan li jikkonsisti f'kavitajiet anterjuri u posterjuri, li jkunu f'kuntatt mal-ġenb epiteljali u l-ġenb endoteljali tal-kornea, rispettivament. Iż-żewġ kavitajiet jimtlew sax-xifer bil-Medium Essenzjali Minimu ta' Eagle (Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM) mingħajr fenol aħmar (l-ewwel il-kavità posterjuri), filwaqt li jiġi żgurat li ma jifformawx bżieżaq. L-apparat imbagħad jiġi kkalibrat għal tal-anqas siegħa f'temperatura ta' 32 ± 1 °C sabiex il-korneji jekwilibraw mal-medium u jiksbu kemm jista' jkun possibbli attività metabolika normali (it-temperatura approssimattiva tas-superfiċje tal-kornea in vivo hija 32 °C).

Wara l-perjodu ta' ekwilibrazzjoni, EMEM frisk, mingħajr fenol aħmar u msaħħan minn qabel jiżdied fiż-żewġ kavitajiet u jittieħed l-ewwel qari tal-valuri tal-opaċità għal kull kornea. Kwalunkwe kornea li turi ħsara makroskopika fit-tessut (eż. grif, pigmentazzjoni, neovaskularizzazzjoni) jew opaċità ikbar minn seba' unitajiet tal-opaċità jew ekwivalenti għall-opaċitometru u l-apparati fejn titqiegħed il-kornea użati jintremew. Tal-inqas tliet korneji jintgħażlu bħala korneji tal-kontroll negattiv (jew solvent). Imbagħad, il-korneji li jifdal jiġu ddistribwiti fi grupp tat-trattament u tal-kontroll pożittiv.

Minħabba li l-kapaċità tas-sħana tal-ilma hija ogħla minn dik tal-arja, l-ilma jipprovdi kundizzjonijiet ta' temperatura aktar stabbli għall-inkubazzjoni. Għalhekk, huwa rrakkomandat l-użu ta' banju tal-ilma sabiex l-apparat fejn titqiegħed il-kornea u l-kontenut tiegħu jinżammu f'temperatura ta' 32 ± 1 °C. Madankollu, jistgħu jintużaw ukoll inkubaturi tal-arja, filwaqt li jittieħdu prekawzjonijiet sabiex tinżamm l-istabilità tat-temperatura (eż., billi l-apparat u l-media jissaħħnu minn qabel).

Applikazzjoni tas-sustanza kimika tat-test

Jintużaw żewġ protokolli ta' trattament, wieħed għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi (solidi jew likwidi), u ieħor għal solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi.

Il-likwidi jiġu ttestjati meta ma jkunux dilwiti. Semisolidi, kremi u x-xema' tipikament jiġu ttestjati bħala likwidi. Sustanzi tensjoattivi puri jiġu ttestjati f'konċentrazzjoni ta' 10 % w/v f'soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0.9 %, ilma distillat, jew solvent ieħor li jkun intwera li ma għandu l-ebda effetti avversi fuq is-sistema tat-test. Għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xierqa għal konċentrazzjonijiet ta' dilwizzjoni alternattivi. Taħlitiet li fihom aġenti tensjoattivi jistgħu jiġu ttestjati mhux dilwiti jew dilwiti f'konċentrazzjoni xierqa skont ix-xenarju tal-esponiment rilevanti in vivo. Għandha tiġi pprovduta ġustifikazzjoni xierqa għall-konċentrazzjoni ttestjata. Il-kornei jiġu esposti għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi għal 10 minuti. L-użu ta' ħinijiet oħrajn ta' esponiment għandu jkun ibbażat fuq raġuni xjentifika xierqa. Jekk jogħġbok ara l-Appendiċi 1 għal definizzjoni ta' taħlita tensjoattiva u taħlita li fiha aġent tensjoattiv.

Solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi tipikament jiġu ttestjati bħala soluzzjonijiet jew sospensjonijiet f'konċentrazzjoni ta' 20 % w/v f'soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0.9 %, ilma distillat, jew solvent ieħor li jkun intwera li ma għandu l-ebda effetti avversi fuq is-sistema tat-test. F'ċerti ċirkostanzi u b'ġustifikazzjoni xjentifika xierqa, is-solidi jistgħu jiġu ttestjati puri b'applikazzjoni diretta fuq is-superfiċje tal-kornea permezz tal-metodu tal-kavità miftuħa (ara l-paragrafu 32). Il-korneji jiġu esposti għas-solidi għal erba' sigħat, iżda bħalma jsir għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi, jistgħu jintużaw ħinijiet ta' esponiment alternattivi fuq il-bażi ta' raġuni xjentifika xierqa.

Jistgħu jintużaw metodi ta' trattament differenti, skont in-natura fiżika u l-karatteristiċi kimiċi (eż. solidi, likwidi, likwidi viskużi jew mhux viskużi) tas-sustanza kimika tat-test. Il-fattur kritiku huwa li jiġi żgurat li s-sustanza kimika tat-test tkopri b'mod xieraq is-superfiċje tal-epitelju u li titneħħa b'mod xieraq waqt l-istadji tat-tlaħliħ. Metodu tal-kavità magħluqa tipikament jintuża għal sustanz kimiċi tat-test li jvarjaw minn likwidi mhux viskużi għal likwidi viskużi ftit, filwaqt li metodu tal-kavità miftuħa tipikament jintuża għal sustanzi tat-test li jvarjaw minn likwidi semiviskużi għal likwidi viskużi u għal solidi puri.

Fil-metodu tal-kavità magħluqa, ammont tas-sustanza kimika tat-test (750 μl) li jkun biżżejjed biex ikopri l-kavità anterjuri jiġi introdott minn ġot-toqob tad-dożaġġ fuq is-superfiċje ta' fuq tal-kavità, u t-toqob sussegwentement jiġu ssiġillati bit-tappieri tal-kavità waqt l-esponiment. Huwa importanti li jiġi żgurat li kull kornea tiġi esposta għas-sustanza kimika tat-test għall-intervall tal-ħin xieraq.

Fil-metodu tal-kavità miftuħa, iċ-ċirku li jsakkar it-tieqa u t-tieqa tal-ħġieġ jitneħħew mill-kavità anterjuri qabel ma jibda t-trattament. Il-kontroll jew is-sustanza kimika tat-test (750 μl, jew biżżejjed sustanza kimika tat-test biex tiksi l-kornea għalkollox) jiġu applikati direttament fuq is-superfiċje tal-epitelju tal-kornea permezz ta' mikropipetta. Jekk ikun diffiċli li tuża l-pipetta għas-sustanza kimika tat-test, is-sustanza kimika tat-test tista' tiġi kkargata bil-pressa f'pipetta bi spostament pożittiv sabiex tgħin fid-dożaġġ. Il-ponta tal-pipetta bi spostament pożittiv, tiddaħħal fil-ponta tad-distribuzzjoni tas-siringa sabiex il-materjal ikun jista' jinġibed fil-ponta tal-pipetta taħt pressjoni. Imbagħad jeħtieġ li l-pistun tal-pipetta jinġibed 'il fuq fl-istess waqt li l-pistun tas-siringa jingħafas 'l isfel. Jekk fil-ponta tal-pipetta jiffurmaw xi bżieżaq tal-arja, is-sustanza kimika tat-test għandha titneħħa (tinħareġ 'il barra) u l-proċess jiġi ripetut sa mal-ponta timtela mingħajr ma jkun hemm bżieżaq tal-arja. Jekk ikun meħtieġ, tista' tintuża siringa normali (mingħajr labra) minħabba li din tippermetti l-kejl ta' volum akkurat tas-sustanza kimika tat-test u applikazzjoni eħfef fuq is-superfiċje tal-epitelju tal-kornea. Wara d-dożaġġ, it-tieqa tal-ħġieġ terġa' titqiegħed fuq il-kavità anterjuri biex terġa' tinħoloq sistema magħluqa.

Inkubazzjoni ta' Wara l-Esponiment

Wara l-perjodu ta' esponiment, is-sustanza kimika tat-test, is-sustanza kimika tal-kontroll negattiv, jew tal-kontroll pożittiv jitneħħew mill-kavità anterjuri u l-epitelju jinħaslu tal-inqas tliet darbiet (jew sakemm ma tkun tista' tiġi osservata l-ebda evidenza viżiva tas-sustanza kimika tat-test) bl-EMEM (li jkun fih il-fenol aħmar). Medium li jkun fih il-fenol aħmar jintuża għat-tlaħliħ minħabba li bidla fil-kulur tal-fenol aħmar tista' tiġi mmonitorjata sabiex tiġi ddeterminata l-effikaċja tat-tlaħliħ ta' sustanzi kimiċi tat-test aċidużi jew alkalini. Il-korneji jinħaslu aktar minn tliet darbiet jekk il-fenol aħmar jibqa' jibdel il-kulur (isfar jew vjola), jew is-sustanza kimika tat-test tkun għadha viżibbli. Ladarba l-medium ma jibqagħlux sustanza kimika tat-test, il-kornei jitlaħalħu għall-aħħar darba bl-EMEM (mingħar fenol aħmar). L-EMEM (mingħajr fenol aħmar) jintuża għall-aħħar tlaħliħa sabiex jiġi żgurat li l-fenol aħmar jitneħħa kompletament mill-kavità anterjuri qabel ma titkejjel l-opaċità. Imbagħad il-kavità anterjuri terġa' timtela b'EMEM frisk mingħajr fenol aħmar.

Għal-likwidi jew l-aġenti tensjoattivi, wara t-tlaħliħ, il-korneji jiġu inkubati għal sagħtejn oħra f'temperatura ta' 32 ± 1 °C. F'ċerti ċirkostanzi ħin itwal ta' inkubazzjoni wara l-esponiment jista' jkun utli u jista' jiġi kkunsidrati fuq bażi ta' każ b'każ. Korneji ttrattati b'solidi jitlaħalħu kompletament fi tmiem il-perjodu tal-esponiment li jdum erba' sigħat, iżda ma jeħtiġux aktar inkubazzjoni.

Fi tmiem il-perjodu ta' inkubazzjoni wara l-esponiment għal-likwidi u l-aġenti tensjoattivi u fi tmiem il-perjodu tal-esponiment ta' erba' sigħat għas-solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi, jiġu rreġistrati l-opaċità u l-permeabilità ta' kull kornea. Barra minn hekk, kull kornea tiġi osservata b'mod viżiv u l-osservazzjonijiet pertinenti jiġu rreġistrati (eż. tqaxxir tat-tessuti, sustanza kimika tat-test residwa, opaċità mhux uniformi). Dawn l-osservazzjonijiet jistgħu jkunu importanti għaliex jistgħu jiġu riflessi minn varjazzjonijiet fil-qari tal-valuri tal-opaċitometru.

Sustanzi Kimiċi tal-Kontroll

Kontrolli negattivi jew tas-solvent/tal-veikolu u kontrolli pożittivi paralleli jiġu inklużi f'kull esperiment.

Meta sustanza likwida tiġi ttestjata f'100 %, kontroll negattiv (eż., soluzzjoni tal-klorur tas-sodju ta' 0.9 % jew ilma distillat) jiġi inkluż fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP sabiex ikunu jistgħu jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test u sabiex tiġi pprovduta linja ta' bażi għall-punti ta' tmiem tal-assaġġ. Dan jiżgura wkoll li l-kundizzjonijiet tal-assaġġ ma jirriżultawx b'mod li mhux xieraq f'rispons irritanti.

Meta jiġi ttestjat likwidu dilwit, aġent tensjoattiv jew solidu fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP, jiġi inkluż grupp tal-kontroll tas-solvent/tal-veikolu parallel sabiex ikunu jistgħu jiġu individwati bidliet mhux speċifiċi fis-sistema tat-test u sabiex tiġi pprovduta linja ta' bażi għall-punti ta' tmiem tal-assaġġ. Jista' jintuża biss solvent/veikolu li jkun intwera li ma għandu l-ebda effett avvers fuq is-sistema tat-test.

Sustanza kimika magħrufa li tinduċi rispons pożittiv hija inkluża bħala kontroll pożittiv parallel f'kull esperiment sabiex tiġi verifikata l-integrità tas-sistema tat-test u t-twettiq korrett ta' dan. Madankollu, sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-reazzjoni tal-kontroll pożittiv tista' tiġi vvalutata, id-daqs tar-reazzjoni irritanti ma għandux ikun eċċessiv.

Eżempji ta' kontrolli pożittivi għal sustanzi kimiċi tat-test likwidi huma 100 % etanol jew 100 % dimetilformamid. Eżempju ta' kontroll pożittiv għal sustanzi kimiċi tat-test huwa 20 % w/v imidażol f'0.9 % soluzzjoni tal-klorur tas-sodju.

Is-sustanzi kimiċi ta' riferiment huma utli għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanzi kimiċi mhux magħrufa ta' klassi speċifika ta' kimiċi jew tal-prodotti jikkawżaw irritazzjoni okulari, jew għall-evalwazzjoni tal-potenzjal relattiv li sustanza irritanti għall-għajnejn tikkawża irritazzjoni okulari fi ħdan skala speċifika ta' risponsi ta' sustanzi irritanti.

Punti ta' Tmiem Imkejlin

L-opaċità tiġi stabbilita mill-ammont ta' trażmissjoni ta' dawl minn ġol-kornea. L-opaċità tal-kornea titkejjel b'mod kwantitattiv permezz ta' opaċitometru, li jagħti valuri ta' opaċità fuq skala kontinwa.

Il-permeabilità tiġi stabbilita mill-ammont taż-żebgħa fluworexxeina tas-sodju li tippenetra s-saffi kollha taċ-ċelloli tal-kornea (jiġifieri l-epitelju fuq is-superfiċje esterna tal-kornea għal ġol-endotelju fuq is-superfċije interna tal-kornea). Millilitru ta' soluzzjoni ta' fluworexxeina tas-sodju (4 jew 5 mg/ml meta jiġu ttestjati likwidi jew aġenti tensjoattivi jew solidi li mhumiex aġenti tensjoattivi, rispettivament) jiżdied fil-kavità anterjuri tal-apparat fejn titqiegħed il-kornea, li tkun f'kuntatt mal-ġenb epiteljali tal-kornea, filwaqt li l-kavità posterjuri, li tkun f'kuntatt mal-ġenb endoteljali tal-kornea, timtela b'EMEM frisk. Imbagħad l-apparat jiġi inkubat f'pożizzjoni orizzontali għal 90 ± 5 min fi 32 ± 1 °C. L-ammont ta' fluworexxeina tas-sodju li jgħaddi għal ġol-kavità posterjuri jitkejjel b'mod kwantitattiv permezz ta' spettrofotometru UV/VIS. Kejl spettrofotometriku evalwat f'490 nm jiġi rreġistrat bħala densità ottika (OD490) jew valuri ta' assorbità li jitkejlu fuq skala kontinwa. Il-valuri ta' permeabilità tal-fluworexxeina jiġu stabbiliti bl-użu ta' valuri ta' OD490 fuq il-bażi ta' spettrofotometru viżibbli li juża traġitt ottiku standard ta' 1 cm.

Inkella jista' jintuża qarrej tal-folja tal-mikrotitrazzjoni b'96 bwejra diment li; (i) tkun tista' tiġi stabbilita l-iskala ta' valuri lineari tal-qarrej tal-folja għad-determinazzjoni tal-valuri tal-fluworexxeina OD490; u (ii), jintuża l-volum it-tajjeb ta' kampjuni ta' fluworexxeina fil-folja b'96 bir sabiex jinkisbu valuri OD490 ekwivalenti għat-traġitt okulari standard ta' 1 cm (dan jista' jkun jeħtieġ bir sħiħ [normalment 360μl]).

DEJTA U RAPPORTAR

Evalwazzjoni tad-Dejta

Ladarba l-valuri (OD490) tal-opaċità u l-permeabilità medja jkunu ġew ikkoreġuti għall-opaċità tal-isfond u l-valuri OD490 tal-permeabilità tal-kontroll negattiv, il-valuri medji OD490 tal-opaċità u l-permeabilità għal kull grupp ta' trattament għandhom jiġu kkombinati f'formula dderivata empirikament sabiex jiġi kkalkulat punteġġ tal-irritanza in vitro (IVIS) għal kull grupp tat-trattament kif ġej:

IVIS = valur medju tal-opaċità + (15 × valur OD490 medju tal-permeabilità)

Sina et al. (16) irrapportaw li din il-formula ġiet idderivata matul studji interni u bejn laboratorji. Id-dejta ġġenerata għal sensiela ta' 36 kompost fi studju fost bosta laboratorji ġiet soġġetta għal analiżi b'varjabbli mutlipli sabiex tiġi ddeterminata l-ekwazzjoni tal-aqwa adattament bejn id-dejta in vivo u dik in vitro. Ix-xjentisti f'żewġ kumpaniji separati għamlu din l-analiżi u waslu għal ekwazzjonijiet kważi identiċi.

Il-valuri tal-opaċità u tal-permeabilità għandhom jiġu evalwati wkoll b'mod indipendenti sabiex jiġi ddeterminat jekk sustanza kimika tat-test tkunx ipprovokat korrużività jew irritazzjoni severa permezz ta' wieħed biss miż-żewġ punti ta' tmiem (ara l-Kriterji tad-Deċiżjoni).

Kriterji tad-Deċiżjoni

Il-valuri limitu tal-IVIS għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi tat-test li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU) u sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU) jingħataw hawnhekk:

IVIS

GHS tan-NU

≤ 3

Ebda Kategorija

> 3; ≤ 55

Ma tista' ssir ebda previżjoni

> 55

Kategorija 1

Kriterji ta' Aċċettazzjoni tal-Istudju

Test jitqies aċċettabbli jekk il-kontroll pożittiv jagħti IVIS li jkun fi ħdan żewġ devjazzjonijiet standard tal-medja storika attwali, li tiġi aġġornata tal-anqas kull tliet xhur, jew kull darba li jitwettaq test aċċettabbli f'laboratorji fejn it-testijiet ma jitwettqux b'mod frekwenti (jiġifieri anqas minn darba fix-xahar). Ir-reazzjonijiet mill-kontroll negattiv jew tas-solvent/tal-medium għandhom jirriżultaw f'valuri ta' opaċità u permeabilità li jkunu anqas mill-ogħla limiti stabbiliti għall-valuri tal-opaċità u l-permeabilità tal-isfond għall-korneji bovini ttrattati bil-kontroll negattiv jew tas-solvent/tal-veikolu rispettiv. Sessjoni waħda ta' ttestjar magħmula minn tal-inqas tliet korneji għandha tkun biżżejjed għal sustanza kimika tat-test meta l-klassifikazzjoni li tirriżulta tkun inekwivokabbli. Madankollu, f'każijiet ta' riżultati mhux ċari fl-ewwel sensiela ta' testijiet, għandha tiġi kkunsidrata t-tieni sensiela ta' testijiet (iżda mhux bilfors), kif ukoll it-tielet waħda fil-każ ta' riżultati tal-IVIS medju li ma jaqblux bejn l-ewwel żewġ sensiliet ta' testijiet. F'dan il-kuntest, riżultat fl-ewwel sensiela ta' testijet jitqies li mhuwiex ċar jekk il-previżjonijiet mit-3 korneji ma jkunux jaqblu, b'tali mod li:

2 mit-3 korneji taw previżjonijiet li ma jaqblux mill-medja tat-3 korneji kollha kemm huma, JEW,

1 mit-3 korneji tat previżjoni li ma taqbilx mill-medja tat-3 korneji kollha kemm huma, U r-riżultat li ma jaqbiżx kien > 10 unitajiet tal-IVIS mil-limitu ta' 55.

Jekk is-sensiela ripetuta ta' testijiet tikkonferma l-previżjoni tal-ewwel sensiela ta' testijiet (fuq il-bażi tal-valur medju tal-IVIS), tkun tista' tittieħed deċiżjoni finali mingħajr ma jsiru testijiet oħrajn. Jekk is-sensiela ripetuta ta' testijiet fi previżjoni mhux konkordanti mill-ewwel sensiela ta' testijiet (fuq il-bażi tal-valur medju tal-IVIS), issir it-tielet u l-aħħar sensiela ta' testijiet sabiex jiġu solvuti l-previżjonijiet li ma jaqblux, u sabiex tiġi kklassifikata s-sustanza kimika tat-test. Jista' jkun awtorizzat li jiġu rinunzjati iktar testijiet għall-klassifikazzjoni u t-tikkettar f'każ li xi sensiela ta' testijiet tirriżulta fi previżjoni tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU.

Rapport tat-test

Ir-rapport tat-test għandu jinkludi l-informazzjoni li ġejja, jekk tkun rilevanti għat-twettiq tal-istudju:

 

Sustanzi Kimiċi tat-Test u tal-Kontroll

Isem tas-sustanza kimika (jew sustanzi kimiċi) pereżempju l-isem strutturali użat mill-Chemical Abstracts Service (CAS), segwit minn ismijiet oħrajn, jekk ikunu magħrufin; in-Numru tar-Reġistru (RN) tas-CAS, jekk ikun magħruf;

Il-purità u l-kompożizzjoni tas-sustanza kimika tat-test/tal-kontroll (f'perċentwal(i) skont il-piż), sakemm din l-informazzjoni tkun disponibbli;

Proprjetajiet fiżikokimiċi bħall-istat fiżiku, il-volatilità, il-pH, l-istabilità, il-klassi kimika, is-solubilità fl-ilma rilevanti għat-twettiq tal-istudju;

Trattament tas-sustanzi kimiċi tat-test/ta' kontroll qabel l-ittestjar, jekk applikabbli (pereżempju tisħin, tħin);

L-istabilità, jekk tkun magħrufa.

 

Informazzjoni dwar l-Isponser u l-Faċilità tat-Test

L-isem u l-indirizz tal-isponser, tal-faċilità tat-test u tad-direttur tal-istudju.

 

Il-Kundizzjonijiet tal-Metodu ta' Ttestjar

L-opaċitometru użat (eż. mudell u speċifikazzjonijiet) u l-issettjar tal-istrumenti;

L-informazzjoni dwar il-kalibraġġ għal apparati użati għall-kejl tal-opaċità u l-permeabilità (eż. opaċitometru u spettrofotometru) sabiex tiġi żgurata linearità tal-kejliet;

It-tip ta' apparati fejn titqiegħed il-kornea użati (eż. mudell u speċifikazzjonijiet);

Deskrizzjoni ta' tagħmir ieħor użat;

Il-proċedura użata sabiex tiġi żgurata l-integrità (jiġifieri l-preċiżjoni u l-affidabilità) tal-metodu ta' ttestjar maż-żmien (eż. ittestjar perjodiku tas-sustanzi kimiċi tal-profiċjenza).

 

Kriterji għal Test Aċċettabbli

Il-meded aċċettabbli tal-kontrolli pożittivi u negattivi paralleli bbażati fuq dejta storika;

Jekk applikabbli, il-meded aċċettabbli tal-kontrolli paralleli ta' riferiment bbażati fuq dejta storika.

 

Il-Ġbir u l-Preparazzjoni tal-Għajnejn

Identifikazzjoni tas-sors tal-għajnejn (jiġifieri l-faċilità minn fejn inġabru);

Id-dijametru tal-kornea bħala kejl tal-età u l-annimal sors u l-idoneità għall-assaġġ;

Il-kundizzjonijiet tat-trasport u l-ħżin tal-għajnejn (eż., id-data u l-ħin meta nġabru l-għajnejn, l-intervall tal-ħin qabel ma nbeda t-test, il-media tat-trasport u l-kundizzjonijiet tat-temperatura, kwalunkwe antibijotiku li ntuża);

Il-preparazzjoni u l-immuntar tal-korneji tal-bovini, inklużi dikjarazzjonijiet fuq il-kwalità tagħhom, it-temperatura tal-apparati fejn titqiegħed il-kornea, u l-kriterji għall-għażla tal-korneji użati għall-ittestjar.

 

Proċedura tat-test

In-numru ta' repliki użati;

L-identità tal-kontrolli negattivi u pożittivi użati (jekk applikabbli, anki s-solvent u l-kontrolli ta' riferiment);

Il-konċentrazzjoni(jiet) tas-sustanza kimika, l-applikazzjoni, il-ħin tal-esponiment u l-ħin ta' inkubazzjoni wara l-esponiment użati;

Deskrizzjoni tal-kriterji ta' evalwazzjoni u deċiżjoni użati;

Deskrizzjoni tal-kriterji ta' aċċettazzjoni tal-istudju użati;

Deskrizzjoni ta' kwalunkwe modifika tal-proċedura tat-test;

Deskrizzjoni tal-kriterji ta' deċiżjoni użati.

 

Ir-riżultati

Tabulazzjoni ta' dejta minn kampjuni individwali tat-test (eż. valuri ta' opaċità u OD490 u IVIS ikkalkolat għas-sustanza lkimika tat-test u l-kontrolli pożittivi, negattivi u ta' riferiment [jekk inklużi], irrapportati f'forma ta' tabella, inkluża dejta minn esperimenti ripetuti ta' replika kif ikun xieraq, u l-medji ± tad-devjazzjoni standard għal kull esperiment);

Deskrizzjoni ta' effetti osservati oħrajn;

Il-klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU in vitro derivata, jekk applikabbli.

 

Diskussjoni tar-Riżultati

 

Konklużjoni

TAGĦRIF

(1)

ICCVAM (2006). Test Method Evaluation Report — In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponibbli fuq: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.

(2)

ICCVAM (2010). ICCVAM Test Method Evaluation Report: Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. NIH Publication No.10-7553. Research Triangle Park, NC:National Institute of Environmental Health Sciences. Disponibbli fuq: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(3)

OECD (2013). Streamlined Summary Document supporting the Test Guideline 437 for eye irritation/corrosion. Series on Testing and Assessment, No.189, OECD, Paris.

(4)

UN (2011). United Nations Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), ST/SG/AC.10/30 Rev 4, New York and Geneva: United Nations. Disponibbli fuq: http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev04/04files_e.html.

(5)

Scott, L., Eskes, C., Hoffmann, S., Adriaens, E., Alépée, N., Bufo, M., Clothier, R., Facchini, D., Faller, C., Guest, R., Harbell, J., Hartung, T., Kamp, H., Le Varlet, B., Meloni, M., McNamee, P., Osborne, R., Pape, W., Pfannenbecker, U., Prinsen, M., Seaman, C., Spielman, H., Stokes, W., Trouba, K., Van den Berghe, C., Van Goethem, F., Vassallo, M., Vinardell, P., and Zuang, V. (2010). A proposed eye irritation testing strategy to reduce and replace in vivo studies using Bottom-Up and Top-Down approaches. Toxicol. in Vitro 24:1-9.

(6)

ICCVAM (2006). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. Fi: ICCVAM Test Method Evaluation Report — in vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Disponibbli fuq: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm.

(7)

ICCVAM (2010). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. Fi: ICCVAM Test Method Evaluation Report — Current Validation Status of In Vitro Test Methods Proposed for Identifying Eye Injury Hazard Potential of Chemicals and Products. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 10-7553A. Disponibbli fuq: http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/MildMod-TMER.htm.

(8)

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay — SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

(9)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

(10)

Prinsen, M.K. (2006). The Draize Eye Test and in vitro alternatives; a left-handed marriage? Toxicol. in Vitro 20:78-81.

(11)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Disponibbli fuq: [http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(12)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(13)

OECD (2011). Guidance Document on The Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) and Isolated Chicken Eye (ICE) Test Methods: Collection of Tissues for Histological Evaluation and Collection of Data on Non-severe Irritants. Series on Testing and Assessment, No. 160. Adopted October 25, 2011. Paris: Organisation for Economic Co-operation and Development.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

(15)

Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on — Part I. The Lancet 349: 636-641.

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam. Appl. Toxicol. 26:20-31.

(17)

Il-Kapitolu B.5 ta' dan l-Anness, Irritazzjoni/korrużjoni akuta tal-għajnejn.

(18)

ICCVAM (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Disponibbli fuq: [http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].

(19)

OECD (1998). Series on Good Laboratory Practice and Compliance Monitoring. No. 1: OECD Principles on Good Laboratory Practice (revised in 1997).

Disponibbli fuq: http://www.oecd.org/document/63/0,3343,en_2649_34381_2346175_1_1_1_1,00.html

Appendiċi 1

DEFINIZZJONIJIET

Preċiżjoni : Il-qrubija fil-livell ta' qbil bejn ir-riżultati tal-metodu ta' ttestjar u l-valuri ta' referenza aċċettati. Hija kejl tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar u wieħed mill-aspetti ta'“rilevanza”. It-terminu jintuża spiss minflok “konkordanza” sabiex ifisser il-proporzjon ta' riżultati tajbin tal-metodu ta' ttestjar.

Sustanza kimika ta' riferiment : Sustanza kimika użata bħala standard għall-paragun ma' sustanza kimika tat-test. Sustanza kimika ta' riferiment għandu jkollha l-proprjetajiet li ġejjin; (i) sors(i) konsistenti u affidabbli; (ii) similarità strutturali u funzjonali mal-klassi ta' sustanzi kimiċi ttestjati; (iii) karatteristiċi fiżiċi/kimiċi magħrufin; (iv) dejta ta' appoġġ dwar effetti magħrufin, u (v) potenza magħrufa fl-iskala tar-rispons mixtieq.

Approċċ Minn Isfel Għal Fuq : approċċ sekwenzjali użat għal sustanza kimika ssuspettata li ma teħtieġx klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, li jibda bid-determinazzjoni ta' sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni (eżitu negattiv) minn sustanzi kimiċi oħrajn (eżitu pożittiv).

Sustanza kimika : Sustanza jew taħlita.

Kornea : Il-parti trasparenti tal-parti ta' quddiem tal-boċċa tal-għajn li tiksi l-iris u l-pupilla u tħalli d-dawl jgħaddi għal ġol-parti interna tal-għajn.

Opaċità tal-kornea : Kejl tal-estensjoni tal-opaċità tal-kornea wara esponiment għal sustanza kimika tat-test. Żieda fl-opaċità tal-kornea hija indikattiva ta' ħsara fil-kornea. L-opaċità tista' tiġi evalwata b'mod suġġettiv kif isir fit-test Draize li jsir fuq għajnejn il-fniek, jew b'mod oġġettiv bi strument bħal pereżempju “opaċitometru”.

Permeabilità tal-kornea : Kejl kwantitattiv tal-ħsara fl-epitelju tal-kornea billi jiġi ddeterminat l-ammont ta' żebgħa fluworexxeina tas-sodju li tgħaddi minn ġos-saffi kollha taċ-ċelluli tal-kornea.

Irritazzjoni għall-għajnejn : Il-produzzjoni ta' tibdiliet fl-għajnejn wara l-applikazzjoni ta' sustanza kimika tat-test fil-wiċċ ta' wara tal-għajn, li huma kompletament reversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Interkambjabbli ma' “Effetti reversibbli fuq l-għajnejn” u mal-“Kategorija 2 tal-GHS tan-NU” (4).

Rata ta' negattivi foloz : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi pożittivi kollha identifikati b'mod falz bħala negattivi permezz ta' metodu ta' ttestjar. Dan huwa wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar.

Rata ta' foloz pożittivi : Il-proporzjon tas-sustanzi kimiċi negattivi kollha identifikati b'mod falz bħala pożittivi permezz ta' metodu ta' ttestjar. Dan huwa wieħed mill-indikaturi tal-prestazzjoni tal-metodu ta' ttestjar.

Periklu : Proprjetà inerenti ta' aġent jew sitwazzjoni li għandhom il-potenzjal li jikkawżaw effetti avversi meta organiżmu, sistema jew (sub)popolazzjoni jiġu esposti għal dak l-aġent.

Punteġġ tal-Irritazzjoni In Vitro (IVIS) : Formula dderivata empirikament użata fil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP li biha l-valuri medji tal-opaċità u tal-permeabilità għal kull grupp tat-trattament jiġu kkombinati f'punteġġ in vitro wieħed għal kull grupp tat-trattament. L-IVIS = valur medju tal-opaċità + (15 x valur medju tal-permeabilità).

Effetti irreversibbli fuq l-għajnejn : Ara “Ħsara serja lill-għajnejn”.

Taħlita : Taħlita jew soluzzjoni msawra minn żewġ sustanzi jew iktar li fiha ma jirreaġixxux (4)

Kontroll negattiv : Replika mhux ittrattata li fiha l-komponenti kollha ta' sistema tat-test. Dan il-kampjun jiġi proċessat b'kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn sabiex jiġi ddeterminat jekk is-solvent ikollux interazzjoni mas-sistema tat-test.

Mhux ikklassifikati : Sustanzi kimiċi li mhumiex ikklassifikati għal Irritazzjoni tal-għajnejn (Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU) jew Ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU). Interkambjabbli ma' “Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU”.

Opaċitometru : Strument li jintuża sabiex ikejjel “l-opaċità tal-kornea” billi jevalwa b'mod kwantitattiv it-trażmissjoni tad-dawl minn ġol-kornea. L-istrument tipiku jkollu żewġ kompartimenti, kull wieħed minnhom b'sors ta' dawl u fotoċellola tiegħu stess. Kompartiment minnhom jintuża għall-kornea trattata, filwaqt li l-ieħor jintuża biex jikkalibra u jiżżera l-istrument. Dawl minn lampa aloġena jintbagħat minn ġo kompartiment ta' kontroll (kavità vojta mingħajr twieqi jew likwidu) għal ġo fotoċellola u jitqabbel mad-dawl mingħut minn ġol-kompartiment sperimentali, fejn tinsab il-kavità li fiha l-kornea, għal ġo fotoċellola. Id-differenza fit-trażmissjoni tad-dawl mill-fotoċelloli titqabbel u valur numeriku ta' opaċità jidher fuq displej diġitali.

Kontroll pożittiv : Replika li jkun fiha l-komponenti kollha ta' sistema tat-test u ttrattata b'sustanza li jkun magħruf li tikkawża rispons pożittiv. Sabiex jiġi żgurat li l-varjabilità fir-rispons tal-kontroll pożittiv tkun tista' tiġi vvalutata tul iż-żmien, id-daqs tar-rispons pożittiv ma għandux ikun eċċessiv.

Effetti irreversibbli fuq l-għajnejn : Ara “Irritazzjoni għall-għajnejn”.

Affidabilità : Kejliet ta' kemm metodu ta' ttestjar jista' jitwettaq b'mod riproduċibbli fil-laboratorji u bejn il-laboratorji tul iż-żmien, meta jitwettaq billi jintuża l-istess protokoll. Tiġi vvalutatata bil-kalkolu tar-riproduċibilità fil-laboratorju u bejn laboratorju u ieħor u r-ripetibilità fil-laboratorju.

Ħsara serja lill-għajnejn : Il-produzzjoni ta' ħsara fit-tessut fl-għajnejn, jew tnaqqis fiżiku serju tal-vista, wara li tiġi applikata sustanza kimika fuq il-wiċċ quddiemi tal-għajn, li ma jkunux riversibbli fi żmien 21 jum mill-applikazzjoni. Interkambjabbli ma' “Effetti irreversibbli fuq l-għajnejn” u mal-“Kategorija 1 tal-GHS tan-NU” (4).

Kontroll tas-solvent/veikolu : Kampjun mhux ittrattat li fih il-komponenti kollha ta' sistema tat-test, inkluż is-solvent jew il-veikolu li jiġi pproċessat mal-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test u kampjuni tal-kontroll oħrajn sabiex jiġi stabbilit ir-rispons bażi għall-kampjuni ttrattati bis-sustanza kimika tat-test dissolta fl-istess solvent jew veikolu. Meta jiġi ttestjat ma' kontroll negattiv parallel, dan il-kampjun juri wkoll jekk is-solvent jew il-veikolu jkollux interazzjoni mas-sistema tat-test.

Sustanza : Elementi kimiċi u l-komposti tagħhom fl-istat naturali jew miksubin bi kwalunkwe proċess ta' produzzjoni, inkluż kwalunkwe addittiv meħtieġ għall-preservazzjoni tal-istabilità tal-prodott u ta' kwalunkwe impurità li toriġina mill-proċess użat, imma eskluż kwalunkwe solvent li jista' jkun separat mingħajr ma jaffetwa l-istabilità tas-sustanza jew ibiddel il-kompożizzjoni tagħha (4).

Tensjoattiv : Imsejjaħ ukoll aġent tensjoattiv, dan huwa sustanza, bħal deterġent, li tista' tnaqqas it-tensjoni fil-wiċċ ta' likwidu u b'hekk tippermettilu jtella' r-ragħwa jew jippenetra solidi; huwa magħruf ukoll bħala aġent li jxarrab.

Taħlita li fiha aġent tensjoattiv : Fil-kuntest ta' dan il-metodu ta' ttestjar, din hija taħlita li fiha aġent tensjoattiv wieħed jew iktar f'konċentrazzjoni finali ta' > 5 %.

Approċċ Minn Fuq Għal Isfel : approċċ sekwenzjali użat għal sustanza kimika ssuspettata li tikkawża ħsara serja lill-għajnejn, li jibda bid-determinazzjoni ta' sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (eżitu pożittiv) minn sustanzi kimiċi oħrajn (eżitu negattiv).

Sustanza kimika tat-test : Kwalunkwe sustanza jew taħlita ttestjata permezz ta' dan il-metodu ta' ttestjar.

Strateġija ta' ttestjar sekwenzjali : Strateġija ta' ttestjar gradwali li biha l-informazzjoni eżistenti kollha dwar sustanza kimika tat-test tiġi riveduta, f'ordni speċifiku, permezz ta' proċess tal-piż tal-evidenza f'kull livell sabiex jiġi ddeterminat jekk hemmx biżżejjed informazzjoni disponibbli għal deċiżjoni dwar il-klassifikazzjoni tal-periklu, qabel ma wieħed jgħaddi għal-livell li jmiss. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, ma jkun meħtieġ l-ebda ttestjar ieħor. Jekk il-potenzjal ta' irritazzjoni ta' sustanza kimika tat-test ma jkunx jista' jiġi assenjat fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, għandha ssir proċedura ta' ttestjar sekwenzjali fuq l-annimali sakemm tkun tista' ssir klassifikazzjoni mhux ekwivoka.

Is-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi tan-Nazzjonijiet Uniti (GHS tan-NU) : Sistema li tipproponi l-klassifikazzjoni tas-sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) skont it-tipi u l-livelli standardizzati ta' perikli fiżiċi, sanitarji u ambjentali, u tindirizza l-elementi ta' komunikazzjoni korrispondenti, bħal pittogrammi, kliem ta' twissija, dikjarazzjonijiet ta' periklu, dikjarazzjonijiet ta' prekawzjoni u skedi ta' tagħrif dwar is-sikurezza, sabiex jitwassal tagħrif dwar l-effetti avversi bil-għan li n-nies ikunu protetti (inklużi min iħaddem, il-ħaddiema, it-trasportaturi, il-konsumaturi u l-ħaddiema tal-emerġenza) u l-ambjent (4).

Kategorija 1 tal-GHS tan-NU : Ara “Ħsara serja lill-għajnejn”.

Kategorija 2 tal-GHS tan-NU : Ara “Irritazzjoni għall-għajnejn”.

Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU : Sustanzi kimiċi li ma jissodisfawx ir-rekwiżiti għall-klassifikazzjoni fil-Kategorija 1 jew 2 (2A jew 2B) tal-GHS tan-NU. Interkambjabbli ma' “Mhux Ikklassifikati”.

Metodu ta' ttestjar ivvalidat : Metodu ta' ttestjar li għalih ikunu tlestew studji ta' validazzjoni sabiex tiġi ddeterminata r-rilevanza (inkluża l-preċiżjoni) u l-affidabilità għal għan speċifiku. Ta' min jinnota li jista' jkun li metodu ta' ttestjar ivvalidat ma jkollux prestazzjoni tajba biżżejjed f'termini ta' preċiżjoni u affidabilità sabiex jitqies aċċettabli għall-għan propost.

Piż tal-evidenza : Il-proċess li fih jitqiesu l-qawwiet u d-dgħufijiet ta' diversi biċċiet ta' informazzjoni sabiex tintlaħaq u tiġi appoġġata konklużjoni rigward il-potenzjal ta' sustanza kimika li tkun ta' periklu.

Appendiċi 2

IL-KAPAĊITÀ TA' PREVIŻJONI TAL-METODU TA' TTESTJAR TAL-BCOP

Tabella 1

Il-Kapaċità ta' Previżjoni tal-BCOP għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn [Kat 1 vs Mhux Kat 1 (Kat 2 + Ebda Kat) tas-CLP tal-UE/ tal-GHS tan-NU; Kat I vs Mhux Kat I (Kat II + KAT III + KAT IV) tal-EPA tal-Istati Uniti]

Klassifikazzjoni Sistema

Nru

Preċiżjoni

Sensittività

Foloz Negattivi

Speċifiċità

Foloz pożittivi

%

Nru

%

Nru

%

Nru

%

Nru

%

Nru

GHS tan-NU

CLP tal-UE

191

78,53

150/191

86,15

56/65

13,85

9/65

74,60

94/126

25,40

32/126

EPA tal-Istati Uniti

190

78,95

150/190

85,71

54/63

14,29

9/63

75,59

96/127

24,41

31/127


Tabella 2

Il-Kapaċità ta' Previżjoni tal-BCOP għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn [“mhux irritanti”) [Ebda Kat vs Mhux Ebda Kat (Kat 1 + Kat 2) tas-CLP tal-UE/ tal-GHS tan-NU; Kat IV vs Mhux Kat IV (Kat I + Kat II + Kat III) tal-EPA tal-Istati Uniti]

Klassifikazzjoni Sistema

Nru

Preċiżjoni

Sensittività

Foloz Negattivi

Speċifiċità

Foloz pożittivi

%

Nru

%

Nru

%

Nru

%

Nru

%

Nru

GHS tan-NU

CLP tal-UE

196

68,88

135/196

100

107/107

0

0/107

31,46

28/89

68,54

61/89

EPA tal-Istati Uniti

190

82,11

156/190

93,15

136/146

6,85

10/146

45,45

20/44

54,55

24/44

Appendiċi 3

SUSTANZI KIMIĊI TA' PROFIĊJENZA GĦALL-METODU TA' TTESTJAR TAL-BCOP

Qabel l-użu ta' rutina ta' dan il-metodu ta' ttestjar, il-laboratorji għandhom juru l-profiċjenza teknika billi jidentifikaw b'mod korrett il-klassifikazzjoni tal-ħsara lill-għajnejn ta' 13-il sustanza kimika rrakkomandati fit-Tabella 1. Dawn is-sustanzi kimiċi ntgħażlu sabiex jirrappreżentaw il-firxa ta' risponsi għal perikli tal-għajnejn fuq il-bażi tar-riżultati fit-test in vivo fuq l-għajnejn tal-fniek (TG 405) (17) u s-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (jiġifieri l-Kategoriji 1, 2A, 2B jew Mhux Ikklassifikati) (4). Kriterji tal-għażla oħrajn kienu li s-sustanzi kimiċi huma disponibbli fis-suq, li hemm dejta ta' referenza in vivo ta' kwalità għolja għad-dispożizzjoni, u li hemm dejta in vitro ta' kwalità għolja għad-dispożizzjoni mill-metodu ta' ttestjar tal-BCOP. Hemm dejta ta' referenza disponibbli fid-Dokument Sommarju Simplifikat (3) u fid-Dokument ta' Reviżjoni ta' Sfond tal-ICCVAM għall-metodu ta' ttestjar tal-BCOP (2)(18).

Tabella 1

Is-sustanzi kimiċi rakkomandati għall-wiri tal-profiċjenza teknika bil-metodu ta' ttestjar tal-BCOP

Sustanza Kimika

CASRN

Sustanza Kimika tal-Klassi (8)

Forma Fiżika

Klassifikazzjoni (9) In Vivo

Klassifikazzjoni tal-BCOP

Klorur tal-benżalkonju (5 %)

8001-54-5

Kompost tal-onju

Likwidu

Kategorija 1

Kategorija 1

Kloressidin

55-56-1

Ammin, Ammidin

Solidu

Kategorija 1

Kategorija 1

Dibenzojl-L- aċidu tartariku

2743-38-6

Aċidu karbossiliku, Ester

Solidu

Kategorija 1

Kategorija 1

Imidażol

288-32-4

Eteroċikliku

Solidu

Kategorija 1

Kategorija 1

Aċidu trikloroaċetiku (30 %)

76-03-9

Aċidu karbossiliku

Likwidu

Kategorija 1

Kategorija 1

Klorur ta' 2,6-diklorobenżojl

4659-45-4

Aloġenur tal-aċil

Likwidu

Kategorija 2A

Ma tista' ssir ebda previżjoni preċiża/affidabbli

Etil-2-metilaċetoaċetat

609-14-3

Keton, Ester

Likwidu

Kategorija 2 B

Ma tista' ssir ebda previżjoni preċiża/affidabbli

Nitrat tal-ammonju

6484-52-2

Melħ inorganiku

Solidu

Kategorija 2 (10)

Ma tista' ssir ebda previżjoni preċiża/affidabbli

EDTA, melħ di-potassju

25102-12-9

Ammin, Aċidu karbossiliku (melħ)

Solidu

Mhux ikklassifikat

Mhux ikklassifikat

Tween 20

9005-64-5

Ester, Polietere

Likwidu

Mhux ikklassifikat

Mhux ikklassifikat

2-Merkaptopirimidina

1450-85-7

Aloġenur tal-aċil

Solidu

Mhux ikklassifikat

Mhux ikklassifikat

Fenilbutażon

50-33-9

Eteroċikliku

Solidu

Mhux ikklassifikat

Mhux ikklassifikat

Poliossietilen 23 lauril eter (BRIJ-35) (10 %)

9002-92-0

Alkoħol

Likwidu

Mhux ikklassifikat

Mhux ikklassifikat

Taqsiriet: CASRN = Numru tar-Reġistru tal-Chemical Abstracts Service

Appendiċi 4

L-APPARAT TAL-BCOP FEJN TITQIEGĦED IL-KORNEA

L-apparat tal-BCOP fejn titqiegħed il-kornea huwa magħmul minn materjal inerti (eż. polipropilen). L-apparat huwa magħmul minn żewġ nofsijiet (kavità anterjuri u oħra posterjuri), u għandu żewġ kavitajiet interni ċilindriċi simili. Kull kavità hija mfassal sabiex tiflaħ volum ta' madwar 5 ml u tintemm f'tieqa tal-ħġieġ, li minnha jiġu rreġistrati l-kejliet tal-opaċità. Kull waħda mill-kavitajiet interni għandha dijametru ta' 1,7 cm u fond ta' 2,2 cm (11). Iċ-ċirku-o jitqiegħed fil-kavità posterjuri biex jipprevjeni kwalunkwe tnixxija. Il-korneji jitqiegħdu bil-parti tal-endotelju tħares 'l isfel fuq iċ-ċirku-o tal-kavitajiet posterjuri u l-kavitajiet anterjuri jitqiegħdu fuq il-parti tal-epitelju tal-korneji. Il-kavitajiet jinżammu f'posthom permezz ta' tliet viti tal-azzar inossidabbli li jinsabu fuq it-truf esterni tal-kavità. Fl-aħħar parti ta' kull kavità nsibu tieqa tal-ħġieġ li tista' titneħħa sabiex ikun hemm aċċess faċli għall-kornea. Ċirku-o jitqiegħed ukoll bejn it-tieqa tal-ħġieġ u l-kavità biex jipprevjeni kwalunkwe tnixxija. Żewġ toqbiet fil-parti ta' fuq ta' kull kavità jippermettu l-introduzzjoni u t-tneħħija tal-medium u s-sustanzi kimiċi tat-test. Dawn jingħalqu b'tappijiet tal-lastku waqt il-perjodi ta' trattament u ta' inkubazzjoni. It-trażmissjoni tad-dawl minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea għandha l-potenzjal li tinbidel peress li l-effetti ta' xedd u kedd jew il-ġmigħ ta' residwi kimiċi speċifiċi fit-toqob tal-kavità interna jew fuq it-twieqi tal-ħġieġ jistgħu jaffettwaw it-tifrix jew ir-riflettanza tad-dawl. Il-konsegwenza tista' tkun żidiet jew tnaqqisiet fit-trażmissjoni tad-dawl bażi (u, b'mod kuntrarju, il-valuri tal-opaċità bażi) minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea, u tista' tkun evidenti peress li bidliet sinifikanti fil-kejliet inizjali bażi mistennijin tal-opaċità tal-kornea fil-kavitajiet individwali (jiġifieri l-valuri tal-opaċità tal-kornea inizjali f'apparati speċifiċi individwali tal-kornea jistgħu jvarjaw spiss b'iktar minn 2 jew 3 unitajiet tal-opaċità mill-valuri bażi mistennijin). Kull laboratorju għandu jikkunsidra jistabbilixxix programm għall-evalwazzjoni ta' tibdiliet fit-trażmissjoni tad-dawl minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea, skont in-natura tal-kimiki ttestjati u l-frekwenza tal-użu tal-kavitajiet. Sabiex jiġu stabbiliti l-valuri bażi, l-apparati fejn titqiegħed il-kornea jistgħu jiġu vverifikati qabel ma jsir użu ta' rutina billi jitkejlu l-valuri tal-opaċità bażi (jew it-trażmissjoni tad-dawl) tal-kompartimenti b'medium komplut, mingħajr kornei. Imbagħad, l-apparati li jżommu l-korneji jiġu verifikati b'mod perjodiku għal tibdiliet fit-trażmissjoni tad-dawl matul il-perjodi tal-użu. Kull laboratorju jista' jistabbilixxi l-frekwenza għall-verifika tal-apparati fejn titqiegħed il-kornea, fuq il-bażi tas-sustanzi kimiċi ttestjati, il-frekwenza tal-użu, u l-osservazzjonijiet tat-tibdiliet fil-valuri bażi tal-opaċità tal-kornea. Jekk jiġu osservati tibdiliet notevoli fit-trażmissjoni tad-dawl minn ġol-apparati fejn titqiegħed il-kornea, iridu jiġu kkunsidrati proċeduri xierqa ta' tindif u/jew illostrar tal-wiċċ ta' ġewwa tal-apparati fejn titqiegħed il-kornea jew is-sostituzzjoni ta' dawn.

Apparat fejn titqiegħed il-kornea: dijagramma bi spjega tal-installazzjoni

Image

Appendiċi 5

L-OPAĊITOMETRU

L-opaċitometru huwa apparat li jkejjel it-trażmissjoni tad-dawl. Pereżempju, għal tagħmir OP-KIT minn Electro Design (Riom, Franza) użat fil-validazzjoni tal-metodu ta' ttestjar tal-BCOP, id-dawl minn lampa aloġena jintbagħat minn ġo kompartiment ta' kontroll (kavità vojta mingħajr twieqi jew likwidu) għal ġo fotoċellola u jitqabbel mad-dawl mingħut minn ġol-kompartiment sperimentali, fejn tinsab il-kavità li fiha l-kornea, għal ġo fotoċellola. Id-differenza fit-trażmissjoni tad-dawl mill-fotoċelloli titqabbel u valur numeriku ta' opaċità jidher fuq displej diġitali. L-unitajiet tal-opaċità huma stabbiliti. Jistgħu jintużaw tipi oħrajn ta' opaċitometri b'issettjar differenti (eż. li ma jeħtiġux il-kejliet paralleli tal-kompartimenti tal-kontroll u tal-esperiment) jekk jintwera bil-provi li dawn jagħtu riżultati simili għat-tagħmir ivvalidat.

L-opaċitometru għandu jipprovdi rispons lineari minn skala ta' qari ta' valuri ta' opaċità li jkopru l-valuri tal-limiti użati għal klassifiki differenti deskritti mill-Mudell ta' Tbassir (jiġifieri sal-valur tal-limitu li jindika korrużjoni/irritazzjoni severa). Sabiex jiġi żgurat qari ta' valuri lineari u akkurat sa 75-80 unità ta' opaċità, jeħtieġ li l-opaċitometru jiġi kkalibrat bl-użu ta' sensiela ta' kalibraturi. Il-kalibraturi jitqiegħdu fil-kavità tal-kalibraġġ (kavità tal-kornea mfassla sabiex iżżomm fiha l-kalibraturi) u jinqraw fuq l-opaċitometru. Il-kavità tal-kalibraġġ hija ddisinjata b'tali mod li l-kalibraturi jinżammu bejn wieħed u ieħor fl-istess distanza bejn id-dawl u l-fotoċellola fejn ikunu sejrin jitqiegħdu l-korneji waqt il-kejl tal-opaċità. Il-valuri ta' referenza u l-valur programmat inizjali skont it-tip ta' tagħmir użat. Il-linearità tal-kejliet tal-opaċità għandha tiġi żgurata permezz ta' proċeduri xierqa (speċifiċi għall-istrument). Pereżempju, għat-tagħmir OP-KIT minn Electro Design (Riom, Franza), l-opaċitometru l-ewwel jiġi kkalibrat għal 0 unitajiet tal-opaċità bl-użu tal-kavità tal-kalibraġġ mingħajr kalibratur. Imbagħad tliet kalibraturi differenti jitqiegħdu fil-kavità tal-kalibraġġ wieħed wieħed u jitkejlu l-opaċitajiet. Il-kalibraturi 1, 2 u 3 għandhom jirriżultaw f'qari ta' valuri tal-opaċità daqs il-valuri stabbiliti tagħhom ta' 75, 150, u 225 unità ta' opaċità, rispettivament, ±5 %.

(13)

Fil-Parti B, il-Kapitolu B.48 huwa sostitwit b'dan li ġej:

“B.48   Metodu ta' Ttestjar tal-Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati għall-Identifikazzjoni ta' i) Sustanzi Kimiċi li Jinduċu Ħsara Serja lill-Għajnejn u ii) Sustanzi Kimiċi li ma Jeħtiġux Klassifikazzjoni għal Irritazzjoni tal-Għajnejn jew Ħsara Serja lill-Għajnejn

INTRODUZZJONI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa ekwivalenti għal-linja gwida tat-test (TG) 438 tal-OECD (2013). Il-metodu ta' ttestjar tal-Għajnejn tat-Tiġieġ Iżolati (ICE) ġie evalwat mill-Kumitat ta' Koordinazzjoni Interaġenzjali dwar il-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ICCVAM), flimkien maċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (JaCVAM), fl-2006 u l-2010 (1) (2) (3). Fl-ewwel evalwazzjoni, l-ICE ġie approvat bħala metodu ta' ttestjar xjentifikament validu għall-użu bħala test ta' skrinjar sabiex jidentifika sustanzi kimiċi (sustanzi u taħlitiet) li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1), kif definiti mis-Sistema Globalment Armonizzata tal-Klassifikazzjoni u l-Ittikettar ta' Sustanzi Kimiċi (GHS) tan-Nazzjonijiet Uniti (NU) (1) (2) (4) u r-Regolament (KE) Nru 1272/2008 dwar il-Klassifikazzjoni, l-Ittikkettar u l-Imballaġġ tas-Sustanzi u t-Taħlitiet (CLP) (12). Fit-tieni evalwazzjoni, il-metodu ta' ttestjar tal-ICE ġie evalwat għall-utilità tiegħu sabiex jidentifika sustanzi kimiċi mhux ikklassifikati għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn kif definita mill-GHS tan-NU (3) (4). Ir-riżultati mill-istudju ta' validazzjoni u r-rakkomandazzjonijiet tal-bord ta' evalwazzjoni bejn il-pari żammew ir-rakkomandazzjoni oriġinali għall-użu tal-ICE għall-klassifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU), peress li d-database disponibbli baqgħet l-istess mill-validazzjoni tal-ICCVAM oriġinali. F'dak l-istadju, ma ġiet issuġġerita ebda rakkomandazzjoni ulterjuri għal espansjoni tad-dominju ta' applikabilità tal-ICE sabiex ikunu inklużi kategoriji oħrajn. Saret rievalwazzjoni tas-sett ta' dejta in vitro u in vivo użat fl-istudju ta' validazzjoni b'enfasi fuq l-evalwazzjoni tal-utilità tal-ICE sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn (5). Din ir-rievalwazzjoni kkonkludiet li l-metodu ta' ttestjar tal-ICE jista' jintuża wkoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn u ħsara serja lill-għajnejn kif definita mill-GHS tan-NU (4) (5). Dan il-metodu ta' ttestjar jinkludi l-użi rakkomandat u l-limitazzjonijiet tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE fuq il-bażi ta' dawn l-evalwazzjonijiet. Id-differenzi ewlenin bejn il-verżjoni oriġinali tal-2009 u l-verżjoni aġġornata tal-2013 tal-linja gwida tat-test tal-OECD jinkludu, iżda mhumiex limitati għal: l-użu tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni skont is-Sistema ta' Klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU, aġġornament fl-elementi tar-rapport tat-test, aġġornament tal-Appendiċi 1 dwar id-definizzjonijiet, u aġġornament tal-Appendiċi 2 dwar is-sustanzi kimiċi ta' profiċjenza.

Ġeneralment huwa aċċettat li, fil-futur qarib, ebda test in vitro tal-irritazzjoni tal-għajnejn waħdu ma huwa sejjer ikun kapaċi jieħu post it-test Draize in vivo tal-għajnejn sabiex ibassar il-medda sħiħa ta' irritazzjonijiet għal klassijiet ta' sustanzi kimiċi differenti. Madankollu, taħlitiet strateġiċi ta' diversi metodi ta' ttestjar alternattivi fi ħdan strateġija ta' ttestjar (sekwenzjali) jaf ikunu kapaċi jieħdu post it-test Draize tal-għajnejn (6). L-approċċ minn Fuq għal Isfel (7) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika tkun mistennija li jkollha potenzjal għoli ta' irritazzjoni, filwaqt li l-approċċ minn Isfel għal Fuq (7) huwa mfassal sabiex jintuża meta, fuq il-bażi tal-informazzjoni eżistenti, sustanza kimika ma tkunx mistennija tikkaġuna biżżejjed irritazzjoni tal-għajnejn sabiex tkun teħtieġ li tiġi kklassifikata. Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE huwa metodu ta' ttestjar in vitro li jista' jintuża f'ċerti ċirkustanzi u fi ħdan limitazzjonijiet speċifiċi kif deskritti fil-paragrafi 8 sa 10 għall-klassifikazzjoni tal-periklu għall-għajnejn u t-tikkettar ta' sustanzi kimiċi. Filwaqt li ma jitqiesx li huwa validu bħala sostitut awtonomu għat-test in vivo tal-għajnejn fuq il-fniek, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP huwa rakkomandat bħala pass inizjali fi ħdan strateġija ta' ttestjar, bħall-approċċ minn Fuq għal Isfel issuġġerit minn Scott et al. (7) sabiex jiġu identifikati sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati fil-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU, mingħajr ma jsiru iktar testijiet (4). Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE huwa rakkomandat ukoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, kif definiti mill-GHS tan-NU (Ebda Kategorija, NC) (4) u għalhekk jista' jintuża bħala l-ewwel pass fi ħdan approċċ ta' strateġija ta' ttestjar minn Isfel għal Fuq (7). Madankollu, sustanza kimika li mhijiex prevista li tikkaġuna ħsara serja lill-għajnejn jew bħala mhux klassifikata għal irritazzjoni tal-għajnejn/ħsara serja lill-għajnejn bil-metodu ta' ttestjar tal-ICE tkun teħtieġ iktar testijiet (in vitro u/jew in vivo) sabiex tistabbilixxi klassifikazzjoni definittiva. Barra minn hekk, għandhom jiġu kkonsultati l-awtoritajiet regolatorji xierqa qabel ma l-ICE jintuża f'approċċ minn isfel għal fuq skont skemi ta' klassifikazzjoni oħrajn li mhumiex il-GHS tan-NU.

L-għan ta' dan il-metodu ta' ttestjar huwa li jiddeskrivi l-proċeduri użati għall-evalwazzjoni tal-potenzjal li sustanza kimika tat-test tikkawża periklu għall-għajen kif imkejjel mill-ħila tagħha li tinduċi jew le tossiċità f'għajn enukleata ta' tiġieġa. Effetti tossiċi għall-kornea jitkejlu permezz ta' (i) valutazzjoni kwalitattiva tal-opaċità, (ii) valutazzjoni kwalitattiva tal-ħsara għall-epitelju fuq il-bażi tal-applikazzjoni tal-fluworexxeina fl-għajn (żamma tal-fluworexxeina), (iii) kejl kwantitattiv ta' żieda fil-ħxuna (nefħa), u (iv) evalwazzjoni kwalitattiva ta' ħsara morfoloġika makroskopika fis-superfiċje. Il-valutazzjonijiet tal-opaċità, tan-nefħa, u tal-ħsara fil-kornea wara l-esponiment għal sustanza kimika tat-test jiġu vvalutati b'mod individwali u jiġu kkombinati sabiex tiġi dderivata Klassifikazzjoni tal-Irritazzjoni tal-Għajnejn.

Id-definizzjonijiet huma pprovduti fl-Appendiċi 1.

KUNSIDERAZZJONIJIET U LIMITAZZJONIJIET INIZJALI

Dan il-metodu ta' ttestjar huwa bbażat fuq il-protokoll issuġġerit fid-Dokument ta' Gwida 160 tal-OECD (8), li ġie żviluppat b'segwitu għal studju ta' validazzjoni internazzjonali tal-ICCVAM (1) (3) (9), b'kontribuzzjonijiet mingħand iċ-Ċentru Ewropew għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi (ECVAM) u ċ-Ċentru Ġappuniż għall-Validazzjoni ta' Metodi Alternattivi, u d-Dipartiment tat-Tossikoloġija u l-Farmakoloġija Applikata tat-TNO Kwalità tal-Ħajja (in-Netherlands). Il-protokoll huwa bbażat fuq informazzjoni miksuba minn protokolli ppubblikati, kif ukoll il-protokoll attwali użat mit-TNO (10) (11) (12) (13) (14).

Saru testijiet fuq firxa wiesgħa ta' sustanzi kimiċi fil-validazzjoni li hija l-bażi ta' dan il-metodu ta' ttestjar u d-database empirika tal-istudju ta' validazzjoni rriżultaw f'152 sustanza kimika inklużi 72 sustanza u 80 taħlita (5). Il-metodu ta' ttestjar huwa applikabbli għal solidi, likwidi, emulsjonijiet u ġellijiet. Il-likwidi jistgħu jkunu jew ma jkunux milwiema; is-solidi jistgħu jkunu jew ma jkunux solubbli fl-ilma. Il-gassijiet u l-aerosols għadhom ma ġewx eżaminati fi studju ta' validazzjoni.

Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE jista' jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri sustanzi kimiċi li jiġu klassifikati taħt il-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU (4). Meta jintużaw għal dan il-għan, il-limitazzjonijiet identifikati għall-metodu ta' ttestjar tal-ICE huma bbażati fuq ir-rati għoljin ta' foloz pożittivi għal alkoħols u r-rati għoljin ta' foloz negattivi għal solidi u aġenti tensjoattivi (1) (3) (9). Barra minn hekk, f'dan il-kuntest ir-rati ta' foloz negattivi (tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU identifikati li mhumiex tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU) mhumiex kritiċi peress li s-sustanzi kimiċi kollha tat-test li jiġu negattivi mbagħad jiġu ttestjati b'test(ijiet) in vitro vvalidat b'mod adegwat ieħor, jew bħala l-aħħar alternattiva, fil-fniek, skont ir-rekwiżiti regolatorji, bl-użu ta' strateġija ta' ttestjar sekwenzjali f'approċċ tal-piż tal-evidenza. Ta' min jinnota li s-solidi jistgħu jwasslu għal kundizzjonijiet varjabbli u ta' esponiment estrem fit-test Draize in vivo tal-irritazzjoni tal-għajnejn, li jitsgħu jirriżultaw fi previżjonijiet irrilevanti tal-potenzjal ta' irritazzjoni veru tagħhom (15). L-investigaturi għandhom jikkunsidraw jużaw dan il-metodu ta' ttestjar għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, f'liema każ riżultat pożittiv għandu jiġi aċċettat bħala indikatur ta' ħsara serja lill-għajnejn, jiġifieri klassifikazzjoni bħala tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU mingħajr ma jsiru iktar testijiet. Madankollu, riżultati pożittivi miksuba bl-alkoħols għandhom jiġu interpretati b'ċerta kawtela minħabba r-riskju ta' tbassir eċċessiv.

Meta jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li jinduċu ħsara serja lill-għajnejn (Kategorija 1 tal-GHS tan-NU), il-metodu ta' ttestjar tal-ICE għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 86 % (120/140), rata ta' foloz pożittivi ta' 6 % (7/113) u rata ta' foloz negattivi ta' 48 % (13/27) meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo fuq għajnejn il-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4) (5).

Il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP jista' jintuża wkoll sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għall-irritazzjoni tal-għajnejn jew ħsara serja lill-għajnejn, skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4). Għandhom jiġu kkonsultati l-awtoritajiet regolatorji xierqa qabel ma l-ICE jintuża f'approċċ minn isfel għal fuq skont skemi ta' klassifikazzjoni oħrajn. Dan il-metodu ta' ttestjar jista' jintuża għat-tipi kollha ta' sustanzi kimiċi, fejn riżultat negattiv jista' jiġi aċċettat għan-nuqqas ta' klassifikazzjoni ta' sustanza kimika għal irritazzjoni tal-għajnejn u ħsara serja lill-għajnejn. Madankollu, fuq il-bażi ta' riżultat wieħed mid-database tal-validazzjoni, żebgħa antifouling li fiha solvent organiku tista' tkun sottovalutata fil-previżjonijiet (5).

Meta jintuża sabiex jidentifika sustanzi kimiċi li ma jeħtiġux klassifikazzjoni għal irritazzjoni tal-għajnejn u ħsara serja lill-għajnejn, il-metodu ta' ttestjar tal-ICE għandu preċiżjoni kumplessiva ta' 82 % (125/152), rata ta' foloz pożittivi ta' 33 % (26/79) u rata ta' foloz negattivi ta' 1 % (1/73) meta mqabbel mad-dejta tal-metodu ta' ttestjar in vivo fuq għajnejn il-fniek ikklassifikat skont is-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4) (5). Meta s-sustanzi kimiċi tat-test fi ħdan ċerti klassijiet (jiġifieri antifouling żebgħat li fiha solvent organiku) jiġu esklużi mid-database, il-preċiżjoni tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE hija ta' 83 % (123/149), ir-rata ta' foloz pożittivi 33 % (26/78), u r-rata ta' foloz negattivi ta' 0 % (0/71) għas-sistema ta' klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU (4) (5).

Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE mhuwiex rakkomandat għall-identifikazzjoni ta' sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala irritanti għall-għajnejn (jiġifieri Kategorija 2 jew Kategorija 2A tal-GHS tan-NU) jew sustanzi kimiċi tat-test li għandhom jiġu klassifikati bħala ftit irritanti għall-għajnejn (Kategorija 2B tal-GHS tan-NU) minħabba n-numru konsiderevoli ta' sustanzi kimiċi tal-Kategorija 1 tal-GHS tan-NU bħala sustanzi kimiċi tal-Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU u ta' Ebda Kategorija tal-GHS tan-NU sovraklassifikati bħala Kategorija 2, 2A jew 2B tal-GHS tan-NU. Għal dan il-għan, jista' jkun hemm bżonn li jsiru iktar testijiet b'metodu xieraq ieħor.

Il-proċeduri kollha li jinvolvu għajnejn tat-tiġieġ għandhom isegwu r-regolamenti u l-proċeduri applikabbli tal-istallazzjoni tal-ittestjar f'dak li għandu x'jaqsam mal-manipulazzjoni ta' materjali derivati mill-bnedmin jew l-annimali, li jinkludu, iżda li mhumiex limitati għal, tessuti u fluwidi tat-tessuti. Huwa rakkomandat li jittieħdu l-prekawzjonijiet universali tal-laboratorju (16).

Filwaqt li l-metodu ta' ttestjar tal-ICE ma jqisx feriti konġuntivali u iridali kif evalwati fil-metodu ta' ttestjar tal-irritazzjoni okulari fil-fniek, dan jindirizza l-effetti korneali, li huma kawża primarja tal-klassifikazzjoni in vivo meta titqies il-Klassifikazzjoni tal-GHS tan-NU. Barra dan, għalkemm ir-reversibilità tal-feriti fil-kornea ma tistax tiġi evalwata per se fil-metodu ta' ttestjar tal-ICE, ġie propost, fuq il-bażi ta' studji fuq għajnejn il-fniek, li valutazzjoni tal-fond inizjali tal-ferita fil-kornea tista' tintuża sabiex jiġu identifikati uħud mit-tipi ta' effetti irreversibbli (17). B'mod partikolari, hemm bżonn ta' iktar għarfien xjentifiku sabiex nifhmu kif iseħħu effetti irreversibbli mhux marbtin ma' ferita inizjali ta' livell għoli. Fl-aħħar nett, il-metodu ta' ttestjar tal-BCOP ma jippermettix li ssir valutazzjoni tal-potenzjal għal tossiċità sistemika assoċjata ma' esponiment okulari.

Dan il-metodu ta' ttestjar sejjer jiġi aġġornat kull ċertu żmien iktar ma jkun hemm informazzjoni u dejta ġodda kkunsidrati. Pereżempju, l-istopatoloġija tista' tkun potenzjalment siewja meta jkun hemm bżonn ta' karatterizzazzjoni iktar kompluta tal-ħsara fil-kornea. Sabiex jevalwaw din il-possibbiltà, dawk li jużawh huma mħeġġin jippreservaw l-għajnejn u jħejju kampjuni għall-istopatoloġija li jistgħu jintużaw sabiex jiġu żviluppati database u kriterji dwar id-deċiżjonijiet li jistgħu jkomplu jtejbu l-preċiżjoni ta' dan il-metodu ta' ttestjar. L-OECD żviluppat Dokument ta' Gwida dwar l-użu ta' metodi ta' ttestjar tat-tossiċità okulari in vitro, li jinkludi proċeduri dettaljati dwar il-ġbir ta' kampjuni tal-istopatoloġija u informazzjoni dwar fejn għandhom tiġi sottomessa dejta dwar il-kampjuni u/jew l-istopatoloġija (8).

Għal kwalunkwe laboratorju li inizjalment ikun qiegħed jistabbilixxi dan l-assaġġ, għandhom jintużaw is-sustanzi kimiċi ta' profiċjenza pprovduti fl-Appendiċi 2. Laboratorju jista' juża dawn is-sustanzi kimiċi sabiex juri l-kompetenza teknika tiegħu fit-twettiq tal-metodu ta' ttestjar tal-ICE qabel ma jissottometti dejta tal-ICE għall-finijiet tal-klassifikazzjoni regolatorja tal-perikli.

IL-PRINĊIPJU TAT-TEST

Il-metodu ta' ttestjar tal-ICE huwa mudell organotipiku li jipprovdi manutenzjoni fuq terminu ta' żmien qasir fuq għajnejn it-tiġieġ in vitro. F'dan il-metodu ta' ttestjar, il-ħsara mis-sustanza kimika tat-test tiġi vvalutata bid-determinazzjoni tan-nefħa, l-opaċità u ż-żamma tal-fluworexxeina fil-kornea. Filwaqt li l-aħħar żewġ parametri jinvolvu valutazzjoni kwalitattiva, analiżi tan-nefħa fil-kornea tipprovdi valutazzjoni kwantitattiva. Kull kejl jiġi kkonvertit f'punteġġ kwantitattiv użat għall-kalkolu ta' Indiċi tal-Irritazzjoni Kumplessiv, jew inkella jiġi assenjat kategorizzazzjoni kwalitattiva li tintuża sabiex tiġi assenjata klassifikazzjoni tal-periklu okulari in vitro, jew bħala Kategorija 1 tal-GHS tan-NU jew bħala mhux klassifikat fil-GHS tan-NU. Imbagħad jista' jintuża wieħed minn dawn l-eżiti sabiex jitbassar il-potenzjal ta' ħsara serja lill-għajnejn in vivo jew ebda rekwiżit għall-klassifikazzjoni ta' periklu għall-għajnejn ta' sustanza kimika tat-test (ara l-Kriterji tad-Deċiżjoni). Madankollu, ma tista' tingħata ebda klassifikazzjoni għal sustanzi kimiċi li mhumiex previsti li jikkaġunaw ħsara serja lill-għajnejn jew li mhumiex ikklassifikati bil-metodu ta' ttestjar tal-ICE (ara l-paragrafu 11).

Sors u Età ta' Għajnejn it-Tiġieġ

Storikament, għal dan l-assaġġ intużaw għajnejn li jkunu ttieħdu mit-tiġieġ minn biċċerija fejn jinqatlu għall-konsum mill-bniedem, u b'hekk ġiet eliminata l-ħtieġa ta' annimali tal-laboratorju. Jintużaw biss għajnejn ta' annimali b'saħħithom li huma xierqa sabiex jidħlu fil-katina alimentari tal-bniedem.

Għalkemm ma twettaq l-ebda studju kontrollat għall-valutazzjoni tal-età ideali tat-tiġieġ, l-età u l-piż tat-tiġieġ użati storikament f'dan il-metodu ta' ttestjar huma dawk ta' tiġieġ tar-rebbiegħa li tradizzjonalment jiġu pproċessati minn biċċerija tat-tjur (jiġifieri bejn wieħed u ieħor ta' età ta' 7 ġimgħat, u piż ta' 1.5 — 2.5 kg).

Ġbir u Trasport tal-Għajnejn lejn il-Laboratorju

L-irjus għandhom jitneħħew immedjatament wara s-sedazzjoni tat-tiġieġ, ġeneralment b'xokk elettriku u inċiżjoni tal-għonq għall-fsada. Għandu jiġi lokalizzat sors lokali ta' tiġieġ qrib il-laboratorju sabiex l-irjus tat-tiġieġ jiġu ttrasferiti mill-biċċerija sal-laboratorju malajr biżżejjed sabiex kemm jista' jkun jonqos/tonqos id-deterjorament u/jew il-kontaminazzjoni mill-batterji. L-intervall tal-ħin li jgħaddi minn meta jinġabru l-irjus tat-tiġieġ u t-tqegħid tal-għajnejn fil-kavità tas-superfużjoni wara l-enuklerazzjoni għandu jitnaqqas kemm jista' jkun (normalment fi żmien sagħtejn) sabiex jiġi żgurat li jintlaħqu l-kriterji ta' aċċettazzjoni tal-assaġġ. L-għajnejn kollha użati fl-assaġġ għandhom ikunu mill-istess grupp ta' għajnejn miġbura f'ġurnata speċifika.

Minħabba l-fatt li l-għajnejn jiġu ddissektjati fil-laboratorju, l-irjus intatti jiġu ttrasportati mill-biċċerija f'temperatura ambjentali (normalment bejn 18 °C u 25 °C) f'kaxex tal-plastik umdifikati b'karti mxarrba b'soluzzjoni iżotonika ta' ilma bil-melħ.

Il-Kriterji tal-Għażla u n-Numru ta' Għajnejn Użati fl-ICE

Għajnejn li jkollhom punteġġ għoli ta' tilwin bil-fluworexxeina (jiġifieri > 0.5) jew punteġġ għoli ta' opaċità fil-kornea (jiġifieri > 0.5) wara li jitneħħew mill-ħofra tal-għajn jitwarrbu.

Kull grupp tat-trattament u tal-kontroll pożittiv parallel jikkonsisti minn tal-anqas tliet għajnejn. Il-grupp tal-kontrolli negattivi jew il-kontroll tas-solvent (jekk jintuża solvent li ma jkunx salina) jikkonsisti minn tal-anqas għajn waħda.

Fil-każ ta' materjali solidi li jwasslu għal eżitu ta' NC tal-GHS, huwa rakkomandat li tintuża t-tieni sensiela ta' tliet għajnejn sabiex jiġi kkonfermat jew miċħud ir-riżultat negattiv.

PROĊEDURA

Preparazzjoni tal-Għajnejn

Il-kappell tal-għajn jinqata' barra b'ħafna attenzjoni sabiex ma ssir l-ebda ħsara fil-kornea. L-integrità tal-kornea tiġi vvalutata malajr b'qatra fluworexxeina tas-sodju 2 % (w/v) li tiġi applikata fuq is-superfiċje tal-kornea għal ftit sekondi, u mbagħad titlaħlaħ b'salina iżotonika. Imbagħad l-għajnejn ittrattati bil-fluworexxeina jiġu eżaminati b'mikroskopju korneali sabiex jiġi żgurat li l-kornea ma jkollha l-ebda ħsara (jiġifieri punteġġi taż-żamma tal-fluworexxeina u tal-opaċità tal-kornea ≤ 0.5).

Jekk l-għajn ma jkollha l-ebda ħsara, tinqata' mill-kranju b'attenzjoni kbira sabiex ma ssir l-ebda ħsara lill-kornea. Il-boċċa tal-għajn tinġibed mill-orbita billi wieħed iżomm sod il-membrana nittitanti b'forċipi kirurġiċi, u l-muskoli tal-għajn jinqatgħu b'imqass mgħawweġ u b'ponta spuntata. Huwa importanti li wieħed jevita li jikkawża ħsara fil-kornea minħabba pressjoni eċċessiva (jiġifieri artefatti ta' kompressjoni.)

Meta l-għajn titneħħa mill-orbita, porzjon viżibbli tan-nerv ottiku għandu jibqa' mwaħħal. Ladarba titneħħa mill-orbita, l-għajn titqiegħed fuq kuttunar assorbenti u l-membrana nittitanti u tessut konnettiv ieħor jinqatgħu.

L-għajn imneħħija mill-ħofra tagħha titqiegħed fuq klamp tal-azzar inossidabbli b'tali mod li l-kornea tkun f'pożizzjoni vertikali. Imbagħad il-klamp jiġi ttrasferit f'kavità fl-apparat tas-superfużjoni (18). Il-klampijiet għandhom jitqiegħdu fl-apparat tas-superfużjoni b'tali mod li l-kor