Document 32017R0735

1.

Do časti A sa dopĺňa táto kapitola:

„A.25   DISOCIAČNÉ KONŠTANTY VO VODE (TITRAČNÁ METÓDA – SPEKTROFOTOMETRICKÁ METÓDA – KONDUKTOMETRICKÁ METÓDA)

ÚVOD

Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 112 (1981).

Základné požiadavky

Usmerňujúce informácie

Všeobecné informácie o metóde

Štandardné dokumenty

Táto testovacia metóda je založená na metódach uvedených v odkazoch v oddiele „Literatúra“ a v publikácii Preliminary Draft Guidance for Premanufacture Notification EPA, August 18, 1978.

METÓDA – ÚVOD, ÚČEL, ROZSAH, RELEVANTNOSŤ, POUŽITIE A OBMEDZENIA TESTU

Disociácia látky vo vode je dôležitá pri posudzovaní jej vplyvu na životné prostredie. Riadi formu látky, ktorá zas určuje jej správanie a prenos. Môže ovplyvniť adsorpciu chemikálií na pôdach a sedimentoch a absorpciu do biologických buniek.

Definície a jednotky

Disociácia je reverzibilné štiepenie na dve alebo viaceré chemické podoby, ktoré môžu byť iónmi. Tento proces sa vo všeobecnosti vyjadruje ako

RX ⇌ R ++ X –

a konštanta definovaná rovnovážnymi koncentráciami (rovnovážna konštanta), ktorou sa reakcia riadi je

Napríklad v konkrétnom prípade, kde R je vodík (látka je kyselina), konštanta je

alebo

Referenčné látky

Tieto referenčné látky sa nemusia použiť vo všetkých prípadoch, keď sa skúma nová látka. Uvádzajú sa predovšetkým preto, aby sa z času na čas mohla vykonať kalibrácia metódy a aby sa umožnilo porovnanie výsledkov, ak sa použije iná metóda.

Bolo by užitočné mať látku s niekoľkými pK, ako sa uvádza v princípe metódy uvedenom ďalej. Takýmito látkami by mohli byť:

Princíp testovacej metódy

Chemický proces opísaný vo všeobecnosti len mierne závisí od teploty v teplotnom rozsahu relevantnom pre dané prostredie. Určenie disociačnej konštanty si vyžaduje meranie koncentrácií disociovaných a nedisociovaných foriem chemickej látky. So znalosťou stechiometrie disociačnej reakcie uvedenej v časti Definície a jednotky možno určiť príslušnú konštantu. V tomto konkrétnom prípade opísanom v tejto testovacej metóde sa látky správajú ako kyseliny alebo zásady a ich stanovenie možno najľahšie uskutočniť stanovením relatívnej koncentrácie ionizovanej a neionizovanej formy látky a pH roztoku. Vzťah medzi uvedenými pojmami je daný rovnicou pre pKa v časti Definície a jednotky. Niektoré látky vykazujú viac ako jednu disociačnú konštantu. V takom prípade možno rozvinúť podobné rovnice. Niektoré z metód uvedených v tomto dokumente sú vhodné aj pri iných ako acidobázických disociáciách.

Kritériá kvality

Opakovateľnosť

Disociačná konštanta by sa mala dať zopakovať (pri minimálne troch stanoveniach) s presnosťou na ± 0,1 log jednotiek.

OPIS TESTOVACEJ METÓDY

K stanoveniu pKa existujú dva základné prístupy. V rámci jedného sa známe množstvo látky titruje podľa potreby kyselinou alebo zásadou, druhý zahŕňa určenie relatívnej koncentrácie ionizovanej a neionizovanej formy látky a jej závislosti od pH.

Príprava

Metódy založené na uvedených zásadách možno rozdeliť na titráciu, spektrofotometriu a konduktometriu.

Testovacie roztoky

Pri titračnej a konduktometrickej metóde by sa chemická látka mala rozpustiť v destilovanej vode. Pri spektrofotometrickej alebo inej metóde sa použijú tlmivé roztoky. Koncentrácia testovanej látky by nemala presiahnuť 0,01 M alebo polovicu koncentrácie látky v nasýtenom roztoku, podľa toho, ktorá z uvedených koncentrácií je nižšia, pričom by sa na prípravu roztokov mala použiť najčistejšia dostupná forma látky. Ak je látka len čiastočne rozpustná, možno ju pred prípravou roztokov s uvedenými koncentráciami rozpustiť v malom množstve vodou miešateľného rozpúšťadla.

Roztoky by sa mali skontrolovať na prítomnosť emulzií s využitím Tyndallovho javu, najmä ak bol na zvýšenie rozpustnosti použitý kosolvent. Ak sa použijú tlmivé roztoky, ich koncentrácia by nemala presiahnuť 0,05 M.

Podmienky testu

Teplota

Teplota by sa mala udržiavať s presnosťou najmenej ± 1 °C. Stanovenie by sa podľa možnosti malo uskutočniť pri 20 °C.

Ak existuje podozrenie, že látka je významne závislá od teploty, stanovenie by sa malo vykonať aspoň pri dvoch ďalších teplotách. V takom prípade by intervaly medzi teplotami mali byť 10 °C a teplota by sa mala udržiavať v rozmedzí ± 0,1 °C.

Analýzy

Konkrétna analytická metóda sa určí na základe charakteristických vlastností testovanej látky. Musí byť dostatočne citlivá, aby ňou bolo možné stanoviť rôzne druhy chemikálií pri každej koncentrácii testovaného roztoku.

Vykonanie testu

Titračná metóda

Testovaný roztok sa stanovuje titráciou štandardným roztokom kyseliny alebo zásady (podľa vhodnosti), pričom po každom pridaní titračného činidla sa odmeria pH. Pred dosiahnutím bodu ekvivalencie by sa malo pridať aspoň 10 čiastkových množstiev. Ak sa rovnováha dosiahne dostatočne rýchlo, možno použiť potenciometer so zapisovaním. Pri tejto metóde musí byť presne známe celkové množstvo látky a jej koncentrácia. Musia sa prijať preventívne opatrenia na vylúčenie oxidu uhličitého. Podrobnosti postupu, preventívnych opatrení a výpočtu sú uvedené v štandardných testoch, napr. odkazy (1), (2), (3), (4).

Spektrofotometrická metóda

Zistí sa vlnová dĺžka, pri ktorej má ionizovaná a neionizovaná forma látky výrazne odlišné mólové absorpčné (extinkčné) koeficienty. Absorpčné spektrum UV/VIS sa získa z roztokov konštantnej koncentrácie pri pH, pri ktorom je príslušná látka v podstate neionizovaná, pri ktorom je plne ionizovaná a pri niekoľkých pH nachádzajúcich sa medzi nimi. Dosiahnuť to možno buď pridaním koncentrovanej kyseliny (zásady) k pomerne veľkému objemu roztoku látky vo viaczložkovom tlmivom roztoku, a to spočiatku pri vysokom (nízkom) pH (odkaz 5), alebo pridaním rovnakých objemov zásobného roztoku látky, napr. vo vode, v metanole, do konštantných objemov rôznych tlmivých roztokov pokrývajúcich požadovaný rozsah pH. Z hodnôt pH a absorbancie pri zvolenej vlnovej dĺžke sa vypočíta dostatočný počet hodnôt pKa, pričom sa použije aspoň 5 hodnôt pH, pri ktorých je látka ionizovaná najmenej na 10 percent a zároveň menej ako na 90 percent. Ďalšie podrobnosti experimentu a metóda výpočtu sú uvedené v odkaze (1).

Konduktometrická metóda

Odmeria sa vodivosť približne 0,1 M elektricky vodivého vodného roztoku látky, pričom sa použije vodivostný článok so známou malou konštantou vodivostného článku. Odmeria sa aj vodivosť niekoľkých presných zriedení daného roztoku. Koncentrácia sa pri každom riedení zníži na polovicu, pričom celá séria by mala pokrývať aspoň koncentrácie v rozmedzí jedného rádu. Medzná (limitná) vodivosť pri nekonečnom riedení sa zistí vykonaním podobného experimentu so sodíkovou soľou a následnou extrapoláciou. Stupeň disociácie možno potom vypočítať z vodivosti každého roztoku pomocou Onsagerovej rovnice, a teda pomocou Ostwaldovho zrieďovacieho zákona možno disociačnú konštantu vypočítať ako K = α2C/(1 – α), kde C je koncentrácia v mol/l a α je (disociačný stupeň) disociovaná frakcia. Musia sa prijať preventívne opatrenia na vylúčenie CO2. Ďalšie podrobnosti experimentu a metóda výpočtu sú uvedené v štandardných textoch a v odkazoch (1), (6) a (7).

ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV

Spracovanie výsledkov

Titračná metóda

Hodnota pKa sa vypočíta z 10 nameraných bodov na titračnej krivke. Vypočíta sa priemer a štandardná odchýlka týchto hodnôt pKa. Spolu s tabuľkou výsledkov by sa mal predložiť aj graf závislosti pH od objemu štandardnej zásady alebo kyseliny.

Spektrofotometrické metódy

Z hodnôt absorbancie a pH z každého spektra sa zostaví tabuľka. Z medziľahlých údajov spektier sa vypočíta aspoň päť hodnôt pKa a takisto priemer a štandardná odchýlka týchto výsledkov.

Konduktometrická metóda

Pre každú koncentráciu kyseliny a pre každú koncentráciu zmesi jedného ekvivalentu kyseliny a 0,98 ekvivalentu bezuhličitanového hydroxidu sodného sa vypočíta ekvivalent vodivosti Λ. Kyselina má byť v prebytku, aby sa predišlo prebytku OH– iónov v dôsledku hydrolýzy. Hodnoty 1/Λ sa zobrazia v grafe v závislosti od √C a Λo soli možno zistiť extrapoláciou pri nulovej koncentrácii.

Hodnotu Λo kyseliny možno vypočítať z hodnôt pre H+ a Na+ uvádzaných v literatúre. Hodnotu pKa možno vypočítať zo vzorca α = Λi/Λo a Ka = α2C/(1 – α) pre každú koncentráciu. Presnejšie hodnoty Ka možno získať vykonaním korekcií na mobilitu a aktivitu. Mal by sa vypočítať priemer a štandardná odchýlka hodnôt pKa.

Skúšobný protokol

Predložiť by sa mali všetky nespracované údaje a vypočítané hodnoty pKa spolu s metódou výpočtu (najlepšie v tabuľkovej forme, napr. podľa návrhu v odkaze 1), ako aj štatistické parametre opísané v predchádzajúcej časti. V prípade titračných metód by sa mali uviesť podrobnosti o štandardizácii štandardných roztokov.

V prípade spektrofotometrickej metódy by sa mali uviesť všetky spektrá. V prípade konduktometrickej metódy by sa mali uviesť podrobnosti o stanovení konštanty vodivostného článku. Mali by sa uviesť informácie o použitej technike, analytických metódach a povahe všetkých použitých tlmivých roztokov.

Mala by sa uviesť skúšobná teplota(-y).

LITERATÚRA

2.

V časti B sa kapitola B.5 nahrádza takto:

„B.5   AKÚTNE PODRÁŽDENIE/POLEPTANIE OKA

ÚVOD

Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 405 (2012). Usmernenia OECD na testovanie chemikálií sa pravidelne preskúmavajú, aby sa zabezpečilo, že odzrkadľujú najaktuálnejšie vedecké poznatky. Pri predchádzajúcich preskúmaniach tohto usmernenia na vykonávanie testov sa osobitná pozornosť venovala možným zlepšeniam na základe vyhodnotenia všetkých existujúcich informácií o testovanej chemikálii, aby sa zabránilo zbytočnému testovaniu na pokusných zvieratách a aby sa tým zohľadnili dobré životné podmienky zvierat. Metóda TG 405 (prijatá v roku 1981 a aktualizovaná v rokoch 1987, 2002 a 2012) zahŕňa odporúčanie, podľa ktorého by sa pred uskutočnením opísaného testu akútneho podráždenia/poleptani oka in vivo mala uskutočniť analýza váhy dôkazov (1) na základe existujúcich relevantných údajov. Ak nie sú k dispozícii dostačujúce údaje, podľa odporúčania by sa mali získať na základe postupného testovania (2) (3). Stratégia testovania zahŕňa vykonanie validovaných a uznaných testov in vitro a je uvedená ako doplnok k tejto testovacej metóde. Na účely nariadenia (ES) č. 1907/2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) (2) je do príslušných usmernení ECHA takisto zahrnutá integrovaná stratégia testovania (21). Testovanie na zvieratách by sa malo vykonať len vtedy, ak sa po zvážení dostupných alternatívnych metód stanoví, že je to nevyhnutné a že jeho použitie je v týchto stanovených prípadoch vhodné. V čase prípravy tejto aktualizovanej testovacej metódy existujú prípady, keď je použitie tejto testovacej metódy stále potrebné alebo vyžadované podľa niektorých regulačných rámcov.

Najnovšia aktualizácia sa zameriava najmä na použitie analgetík a anestetík bez toho, aby bola ovplyvnená základná koncepcia a štruktúra usmernenia na vykonávanie testov. ICCVAM (3) a nezávislý medzinárodný vedecký panel pre partnerské preskúmanie preskúmali užitočnosť a obmedzenia bežného používania lokálnych anestetík, systémových analgetík a parametrov pre humánne ukončenie postupu v priebehu bezpečnostnej štúdie očnej dráždivosti in vivo (12). V rámci preskúmania sa dospelo k záveru, že využívaním lokálnych anestetík a systémových analgetík by sa dalo zabrániť väčšine bolesti a ťažkostí alebo ich úplne odstrániť bez toho, aby to malo vplyv na výsledky testu, a vyslovilo sa odporúčanie, že takéto látky by sa mali vždy používať. V tejto testovacej metóde sa prihliada na uvedené preskúmanie. V priebehu in vivo testovania akútneho podráždenia a poleptania oka by sa mali bežne používať lokálne anestetiká, systémové analgetiká a parametre pre humánne ukončenie postupu. Výnimky z ich použitia by sa mali odôvodniť. Jemnejšie prístupy uvedené v tejto metóde výrazne zmiernia bolesť a ťažkosti zvierat alebo im zabránia vo väčšine situácií, keď je štúdia bezpečnosti prostredníctvom očného testovania in vivo stále potrebná.

Súčasťou vyváženého preventívneho tíšenia bolesti by malo byť i) bežné predbežné ošetrenie lokálnym anestetikom (napr. proparakaínom alebo tetrakaínom) a systémovým analgetikom (napr. buprenorfínom), ii) bežné pravidelné dávkovanie systémových analgetík (napr. buprenorfínu a meloxikamu) po ošetrení, iii) naplánované pozorovanie, monitorovanie a zaznamenávanie klinických príznakov bolesti a/alebo ťažkostí u zvierat a iv) naplánované pozorovanie, monitorovanie a zaznamenávanie charakteru, závažnosti a priebehu všetkých poranení oka. Ďalšie podrobnosti sú uvedené v aktualizovaných postupoch opísaných ďalej. Po podaní testovanej chemikálie by sa nemali podávať žiadne ďalšie lokálne anestetiká ani analgetiká, aby sa zabránilo interferencii so štúdiou. Analgetiká s protizápalovým účinkom (napr. meloxikam) by sa nemali aplikovať lokálne a dávky používané systémovo by nemali interferovať s účinkami na oko.

Definície sú uvedené v dodatku k testovacej metóde.

ÚVODNÉ ÚVAHY

V záujme vedeckej spoľahlivosti, ako aj dobrých životných podmienok zvierat by sa o testovaní in vivo nemalo uvažovať, pokiaľ analýzou váhy dôkazov neboli vyhodnotené všetky dostupné údaje súvisiace s potenciálom chemikálie vyvolať poleptanie/podráždenie oka. Medzi takéto údaje patria dôkazy z existujúcich štúdií na ľuďoch a/alebo laboratórnych zvieratách, dôkazy o schopnosti jednej alebo viacerých štrukturálne príbuzných látok alebo zmesí takýchto látok vyvolať poleptanie/podráždenie oka, informácie svedčiace o silnej kyslosti alebo zásaditosti chemikálie (4) (5) a výsledky z validovaných a uznaných testov na poleptanie kože a poleptanie/podráždenie oka in vitro alebo ex vivo (6) (13) (14) (15) (16) (17). Štúdie sa mohli uskutočniť pred analýzou váhy dôkazov alebo ako jej dôsledok.

V prípade určitých chemikálií môže takáto analýza poukazovať na potrebu in vivo štúdií potenciálu chemikálie vyvolať poleptanie/podráždenie oka. Vo všetkých takýchto prípadoch by sa pred uvažovaním o použití očného testu in vivo mala pokiaľ možno najskôr uskutočniť štúdia žieravých účinkov chemikálie na kožu in vitro a/alebo in vivo, a potom vyhodnotiť v súlade so stratégiou postupného testovania testovacou metódou B.4 (7) alebo s integrovanou stratégiou testovania uvedenou v usmernení ECHA (21).

Stratégia postupného testovania, ktorej súčasťou je vykonanie validovaných testov poleptania/podráždenia oka in vitro alebo ex vivo, je zahrnutá ako doplnok k tejto testovacej metóde, a na účely nariadenia REACH v usmernení ECHA (21). Odporúča sa, aby sa pred vykonaním testovania in vivo uplatnila takáto stratégia testovania. V prípade nových chemikálií sa na získanie vedecky spoľahlivých údajov o schopnosti chemikálie vyvolať poleptanie/podráždenie odporúča stratégia postupného testovania. V prípade existujúcich chemikálií s nedostatkom údajov o schopnosti chemikálie vyvolať poleptanie/podráždenie kože a oka možno uvedenú stratégiu použiť na získanie chýbajúcich údajov. Použitie odlišnej stratégie testovania alebo testovacej metódy alebo rozhodnutie nepoužiť stratégiu postupného testovania treba zdôvodniť.

PRINCÍP TESTU IN VIVO

Po predbežnom ošetrení systémovým analgetikom a indukcii vhodnej lokálnej anestézie sa chemikália, ktorá sa má testovať, aplikuje v jednorazovej dávke do jedného oka pokusného zvieraťa; chemikáliou neovplyvňované oko slúži ako kontrola. Stupeň podráždenia/poleptania oka sa vyhodnotí na základe hodnotenia lézií spojovky, rohovky a dúhovky, a to v špecifických intervaloch. V záujme úplného vyhodnotenia účinkov sa opíšu aj iné účinky na oko a nepriaznivé systémové účinky. Trvanie štúdie by malo byť dostatočné na posúdenie vratnosti alebo nevratnosti účinkov.

Zvieratá vykazujúce príznaky závažných ťažkostí a/alebo bolesti v ktoromkoľvek štádiu testu alebo lézie, ktoré sú zhodné s parametrami pre humánne ukončenie postupu opísanými v tejto testovacej metóde (pozri bod 26), by sa mali humánnym spôsobom usmrtiť a daná chemikália by sa mala príslušným spôsobom vyhodnotiť. Kritéria pre rozhodnutie o humánnom usmrtení moribundných a silne trpiacich zvierat sú predmetom usmerňovacieho dokumentu OECD (8).

PRÍPRAVA NA TEST IN VIVO

Výber druhov

Podľa možnosti sa ako laboratórne zviera použije králik – albín a použijú sa zdravé mladé dospelé zvieratá. Použitie iných kmeňov alebo druhov by sa malo zdôvodniť.

Príprava zvierat

Obe oči každého pokusného zvieraťa predbežne vybratého na testovanie by sa mali vyšetriť počas 24 hodín pred začatím testovania. Zvieratá vykazujúce podráždenie oka, očné poruchy alebo predchádzajúce poranenie rohovky by sa nemali použiť.

Podmienky umiestnenia a kŕmenia

Zvieratá by sa mali umiestniť jednotlivo. V prípade králikov by teplota experimentálnej miestnosti mala byť 20 °C (± 3 °C). Aj keď relatívna vlhkosť by mala byť aspoň 30 % a pokiaľ možno, okrem obdobia počas čistenia miestnosti, by nemala prevyšovať 70 %, cieľová relatívna vlhkosť by mala byť 50 – 60 %. Osvetlenie by malo byť umelé so striedaním 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Malo by sa zabrániť nadmernej intenzite svetla. Na kŕmenie možno používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzenou dodávkou pitnej vody.

POSTUP TESTOVANIA

Použitie lokálnych anestetík a systémových analgetík

Uvádzané postupy sa odporúčajú, aby sa pri štúdii bezpečnosti prostredníctvom očného testovania zabránilo bolesti a ťažkostiam alebo aby sa bolesť a utrpenie minimalizovali. Tieto postupy možno nahradiť alternatívnymi postupmi, o ktorých sa preukázalo, že aspoň tak alebo ešte lepšie bránia bolesti a ťažkostiam alebo poskytujú aspoň takú alebo ešte lepšiu úľavu od bolesti a utrpenia ako tieto postupy.

Aplikácia testovanej chemikálie

Testovaná chemikália by sa mala umiestniť do spojovkového vaku jedného oka každého zvieraťa po jemnom odtiahnutí spodného viečka od očnej gule. Viečka sa potom jemne pritlačia k sebe asi na jednu sekundu, aby sa zabránilo strate materiálu. Druhé oko, ktoré nebolo ovplyvňované chemikáliou, slúži ako kontrola.

Vymývanie

Oči testovaných zvierat by sa nemali vymývať aspoň 24 hodín po instilácii testovanej chemikálie, okrem tuhých látok (pozri bod 18) a v prípade okamžitých žieravých alebo dráždivých účinkov. Po 24 hodinách možno oči vypláchnuť, ak sa to považuje za potrebné.

Použitie náhradnej skupiny zvierat na vyšetrenie vplyvu vyplachovania sa neodporúča, pokiaľ to nie je vedecky odôvodnené. Ak je náhradná skupina potrebná, mali by sa použiť dva králiky. Podmienky vyplachovania by sa mali starostlivo zdokumentovať, napr. čas vyplachovania, zloženie a teplota vyplachovacieho roztoku, trvanie, objem a rýchlosť aplikácie.

Veľkosť dávky

1.   Testovanie kvapalín

Na testovanie kvapalín sa používa dávka 0,1 ml. Na instiláciu chemikálie priamo do oka by sa nemali použiť tlakové dávkovače aerosólu. Tekutina zo spreja by sa mala nastriekať do nádobky pred instiláciou 0,1 ml do oka.

2.   Testovanie tuhých látok

Pri testovaní tuhých látok, pást a chemikálií, ktoré sú tvorené z častíc, by použité množstvo malo mať objem 0,1 ml alebo hmotnosť najviac 100 mg. Testovaná chemikália by sa mala pomlieť na jemný prášok. Objem tuhého materiálu by sa mal odmerať po jemnom zhutnení, napr. poklepaním nádobky na meranie. Ak testovaná tuhá chemikália nebola fyziologicky odstránená z oka pokusného zvieraťa pri prvom pozorovaní v časovom bode 1 hodina po ovplyvňovaní, oko možno vypláchnuť fyziologickým roztokom alebo destilovanou vodou.

3.   Testovanie aerosólov

Odporúča sa, aby sa pred instiláciou do oka všetky chemikálie z tlakových dávkovačov a aerosóly vyprázdnil do nádobky. Jedinou výnimkou sú chemikálie v tlakových aerosólových nádobách, ktoré sa nedajú vystriekať a zozbierať kvôli vyparovaniu. V takýchto prípadoch by sa oko malo držať otvorené a testovaná chemikália by sa mala aplikovať do oka jednorazovým striekaním trvajúcim približne jednu sekundu zo vzdialenosti 10 cm priamo pred okom. Túto vzdialenosť možno meniť v závislosti od tlaku spreja a jeho obsahu. Pozornosť je potrebné venovať tomu, aby sa tlakom zo spreja nepoškodilo oko. Vo vhodných prípadoch môže byť potrebné posúdiť potenciál „mechanického” poškodenia oka tlakom kvapaliny zo spreja.

Odhad dávky z aerosólu možno urobiť simulovaním testu takto: Chemikália sa nasprejuje na navažovací papier cez otvor veľkosti oka králika nachádzajúci sa priamo pred papierom. Na základe zvýšenia hmotnosti papiera sa odhadne množstvo nasprejované do oka. V prípade prchavých chemikálií možno dávku odhadnúť tak, že sa nádobka odváži pred odstránením testovanej chemikálie a po ňom.

Počiatočný test (test podráždenia/poleptania oka in vivo s použitím jedného zvieraťa)

Dôrazne sa odporúča, aby sa test in vivo najprv uskutočnil s použitím jedného zvieraťa (pozri doplnok k tejto testovacej metóde: Stratégia postupného testovania podráždenia a poleptania oka). Pozorovania by mali umožniť stanovenie závažnosti a vratnosti pred tým, ako sa pristúpi k potvrdzujúcemu testu na druhom zvierati.

Ak z výsledkov tohto testu vyplynie, že chemikália je po použití uvedeného postupu žieravá alebo silne dráždivá pre oko, ďalšie testovanie očnej dráždivosti by sa nemalo vykonať.

Potvrdzujúci test (test podráždenia oka in vivo na ďalších zvieratách)

Ak sa v počiatočnom teste nezistí žieravý alebo silne dráždivý účinok, dráždivá alebo negatívna reakcia by sa mala potvrdiť na maximálne dvoch ďalších zvieratách. Ak sa dráždivý účinok zistí v počiatočnom teste, odporúča sa, aby sa potvrdzujúci test uskutočnil postupným spôsobom, naraz len na jednom zvierati, a nie súčasnou expozíciou dvoch ďalších zvierat. Ak sa na druhom zvierati prejavia žieravé alebo silne dráždivé účinky, test sa preruší. Ak sú výsledky z druhého zvieraťa dostatočné na to, aby umožnili stanovenie klasifikácie nebezpečnosti, potom nie je potrebné uskutočniť ďalšie testovanie.

Dĺžka pozorovania/Doba pozorovania/Sledované obdobie/Pozorovacie obdobie

Dĺžka pozorovania by mala byť dostatočná na úplné vyhodnotenie veľkosti/závažnosti a vratnosti/reverzibility zistených účinkov. Pokus by sa však mal ukončiť vždy, keď zviera vykazuje známky silnej bolesti alebo ťažkostí (8). Na stanovenie vratnosti účinkov by sa zvieratá za normálnych okolností mali pozorovať 21 dní po podaní testovanej chemikálie. Ak sa vratnosť pozoruje pred uplynutím 21 dní, pokus by sa mal v tej chvíli ukončiť.

Klinické pozorovania a klasifikácia reakcií oka

Oči by sa mali hodnotiť komplexne na prítomnosť alebo neprítomnosť očných lézií jednu hodinu po ATC, po ktorom nasledujú hodnotenia aspoň raz denne. Počas prvých 3 dní by sa zvieratá mali hodnotiť niekoľkokrát denne, aby sa zabezpečilo, že rozhodnutia o ukončení testu sa prijmú včas. Pokusné zvieratá by sa mali počas celého trvania štúdie pravidelne hodnotiť na prítomnosť klinických príznakov bolesti a/alebo ťažkostí (napr. opakované dotýkanie sa oka labkou alebo trenie oka, nadmerné žmurkanie, nadmerné slzenie) (9) (10) (11), a to najmenej dvakrát denne s rozostupom najmenej 6 hodín alebo v prípade potreby aj častejšie. Toto hodnotenie je potrebné, aby i) sa zvieratá náležite posúdili v záujme získania dôkazov o bolesti a ťažkostiach s cieľom prijať kvalifikované rozhodnutia o potrebe zvýšiť dávkovanie analgetík a aby ii) sa zvieratá posúdili v záujme získania dôkazov o stanovených parametroch pre humánne ukončenie postupu s cieľom prijať kvalifikované rozhodnutia o tom, či je vhodné, aby sa zvieratá humánne usmrtili, a zabezpečiť, aby sa takéto rozhodnutia prijímali včas. Farbenie fluoresceínom by sa malo používať pravidelne a v náležitých prípadoch by sa mala použiť biomikroskopia oka (štrbinová lampa a binokulárny stereomikroskop) (napr. pri posudzovaní hĺbky poranenia, ak je prítomná ulcerácia rohovky) ako pomôcky na detekciu a meranie poškodenia oka a s cieľom vyhodnotiť, či sú splnené stanovené kritériá týkajúce sa sledovaných parametrov v súvislosti s humánnym usmrtením. Na referenčné účely a na účely poskytnutia trvalého záznamu rozsahu poškodenia oka možno vyhotoviť digitálne fotografie pozorovaných lézií. Zvieratá by nemali byť podrobené testovaniu dlhšie, ako je potrebné, a mali by sa z neho vyradiť ihneď po získaní definitívnej informácie. Zvieratá vykazujúce silnú bolesť alebo ťažkosti by sa mali bezodkladne humánne usmrtiť a daná chemikália by sa mala príslušným spôsobom vyhodnotiť.

Humánne usmrtiť by sa mali zvieratá, ktoré po instilácii vykazujú tieto očné lézie (pozri tabuľku 1 s opisom tried lézií): perforácia rohovky alebo významná ulcerácia rohovky vrátane stafylómu; krv v prednej komore oka; zákal rohovky 4. triedy; neprítomnosť reflexu zreničky na osvit (reakcia zrenice 2. triedy), ktorá pretrváva 72 hodín; ulcerácia spojovky; nekróza spojovky alebo žmurky; alebo odlupovanie. Je to kvôli tomu, že takéto lézie sú zvyčajne nevratné. Okrem toho sa odporúča, aby sa očné lézie uvedené ďalej v texte použili ako parametre pre humánne ukončenie postupu s cieľom ukončiť štúdie pred koncom plánovaného 21-dňového pozorovania. Tieto lézie sa považujú za predpoveď silne dráždivých alebo žieravých poranení a poranení, v prípade ktorých sa do konca 21-dňového pozorovania nepredpokladá úplné zvrátenie poškodenia (úplné zotavenie): veľká hĺbka poranenia (napr. ulcerácia rohovky presahujúca povrchové vrstvy strómy), viac ako 50 % poškodenie limbusu (čo sa prejaví vyblednutím spojovkového tkaniva) a silná infekcia oka (hnisavý výtok). Za potenciálne užitočné kritérium, ktoré môže ovplyvniť klinické rozhodnutie o predčasnom ukončení štúdie, by sa mohla považovať aj kombinácia vaskularizácie povrchu rohovky (t. j. panus), oblasti sfarbenej fluoresceínom, ktorá sa podľa každodenného posudzovania časom nezmenšuje, a/alebo nedostatočnej/neexistujúcej reepitelizácie 5 dní po aplikovaní testovanej chemikálie. Uvedené nálezy však jednotlivo nepostačujú na zdôvodnenie predčasného ukončenia štúdie. Po zistení závažných účinkov na oko by sa klinické vyšetrenie malo konzultovať s ošetrujúcim veterinárnym lekárom, veterinárnym lekárom laboratórnych zvierat alebo kvalifikovaným personálom vyškoleným na identifikáciu klinických lézií s cieľom stanoviť, či si kombinácia uvedených účinkov vyžaduje predčasné ukončenie štúdie. Triedy reakcie oka (spojovky, rohovky a dúhovky) by sa mali zisťovať a zaznamenávať po 1 hodine po aplikácii testovanej chemikálie a následne po 24, 48 a 72 hodinách (tabuľka 1). Zvieratá, u ktorých sa nevytvoria žiadne lézie oka, možno usmrtiť najskôr 3 dni po instilácii. Zvieratá s léziami oka, ktoré nemajú závažný charakter, by sa mali pozorovať do ich vymiznutia alebo 21 dní, kedy štúdia ukončí. S cieľom stanoviť stav lézií a ich vratnosť alebo nevratnosť by sa mali uskutočniť a zaznamenať pozorovania aspoň v týchto časových intervaloch: po 1 hodine, 24 hodinách, 48 hodinách, 72 hodinách, 7 dňoch, 14 dňoch a 21 dňoch. Pozorovanie by sa malo vykonávať častejšie, ak je to potrebné na zistenie toho, či by sa testované zviera malo z humánnych dôvodov usmrtiť alebo by sa malo z dôvodu negatívnych výsledkov zo štúdie vylúčiť.

Pri každom vyšetrení by sa mali zaznamenať triedy lézií oka (tabuľka 1). Zaznamenať by sa mali aj všetky ďalšie lézie oka (napr. panus, sfarbenie, zmeny prednej komory oka) alebo nepriaznivé systémové účinky.

Vyšetrenie reakcií možno uľahčiť použitím binokulárnej lupy, ručnej štrbinovej lampy, biomikroskopu alebo iného vhodného prístroja. Po zaznamenaní pozorovaní po 24 hodinách možno oči ďalej vyšetriť fluoresceínom.

Klasifikácia reakcií oka je nevyhnutne subjektívna. Na podporu harmonizácie pri klasifikácii reakcií oka a na pomoc testovacím laboratóriám a tým, ktorí sú zainteresovaní na uskutočňovaní a interpretovaní pozorovaní, musí byť personál, ktorý pozorovania uskutočňuje, adekvátne vyškolený na používanie zavedeného systému hodnotenia.

ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV

Vyhodnotenie výsledkov

Triedy očnej dráždivosti by sa mali vyhodnocovať v súvislosti s charakterom a závažnosťou lézií a ich vratnosťou alebo nevratnosťou. Jednotlivé stupne nepredstavujú absolútne meradlo dráždivých vlastností chemikálie, keďže sa hodnotia aj iné účinky testovanej chemikálie. Skôr by sa na jednotlivé stupne malo nazerať ako na referenčné hodnoty, ktoré majú zmysel iba vtedy, ak sú doložené úplným opisom a vyhodnotením všetkých pozorovaní.

Skúšobný protokol

Skúšobný protokol by mal zahŕňať tieto informácie:

Interpretácia výsledkov

Extrapolácia výsledkov štúdií očnej dráždivosti u laboratórnych zvierat na ľudí platí len v obmedzenej miere. V mnohých prípadoch je králik – albín citlivejší na látky, ktoré spôsobujú podráždenie alebo poleptanie oka, ako ľudia.

Malo by sa dbať na to, aby sa pri interpretácii údajov vylúčilo podráždenie spôsobené sekundárnou infekciou.

LITERATÚRA

Tabuľka 1

Klasifikácia očných lézií

DOPLNOK K TESTOVACEJ METÓDE B.5  (4)

STRATÉGIA POSTUPNÉHO TESTOVANIA PODRÁŽDENIA A POLEPTANIA OKA

Všeobecné úvahy

Je dôležité, aby sa v záujme vedeckej spoľahlivosti a dobrých životných podmienok zvierat zabránilo používaniu zvierat v prípade, že to nie je nevyhnutné, a aby sa minimalizovalo testovanie, ktoré u zvierat potenciálne spôsobuje závažné reakcie. Pred zvažovaním použitia testovania in vivo by sa mali posúdiť všetky informácie o chemikálii, ktoré sú relevantné z hľadiska jej potenciálu spôsobiť podráždenie/poleptanie oka. Na účely klasifikácie testovanej látky v súvislosti s jej potenciálom spôsobiť podráždenie alebo poleptanie oka už môžu existovať dostatočné dôkazy, a teda testovanie na laboratórnych zvieratách nemusí byť potrebné. Použitie analýzy váhy dôkazov a stratégie postupného testovania preto minimalizuje potrebu testovania in vivo, najmä ak by chemikália pravdepodobne spôsobila silné reakcie.

Odporúča sa, aby sa na posúdenie existujúcich informácií o chemikáliách, ktoré sa týkajú podráždenia a poleptania oka, a na stanovenie potreby vykonať okrem štúdie oka in vivo aj ďalšie štúdie, použila analýza váhy dôkazov, ktorá by pomohla charakterizovať tento potenciál. Ak sú potrebné ďalšie štúdie, odporúča sa, aby sa na získanie príslušných experimentálnych údajov použila stratégia postupného testovania. V prípade látok, ktoré sa ešte netestovali, by sa na získanie údajov potrebných na vyhodnotenie ich potenciálu spôsobiť poleptanie/podráždenie oka, mala použiť stratégia postupného testovania. Stratégia prvotného testovania opísaná v tomto doplnku bola vypracovaná na seminári OECD (1). Následne bola potvrdená a rozšírená v publikácii Harmonised Integrated Hazard Classification System for Human Health and Environmental Effects of Chemical Substances (Harmonizovaný integrovaný systém klasifikácie nebezpečnosti chemických látok pre ľudské zdravie a ich účinku na životné prostredie), podporená na 28. spoločnom zasadnutí Výboru pre chemikálie a Pracovnej skupiny pre chemikálie v novembri 1998 (2) a aktualizovaná skupinou expertov OECD v roku 2011.

Hoci táto stratégia testovania nie je integrálnou súčasťou testovacej metódy B.5, vyjadruje odporúčaný prístup pre určovanie vlastností spočívajúcich v podráždení/poleptaní oka. Tento prístup predstavuje osvedčený postup, ako aj etické kritérium pre testovanie očnej dráždivosti/žieravosti in vivo. Táto testovacia metóda poskytuje usmernenie na vykonanie testu in vivo a sumarizuje faktory, ktoré treba preskúmať pred zvažovaním takéhoto testu. Súčasťou stratégie postupného testovania je prístup založený na analýze váhy dôkazov slúžiaci na vyhodnocovanie existujúcich údajov o schopnosti chemikálií podráždiť/poleptať oko a viacstupňový prístup na účely vytvorenia relevantných údajov o chemikáliách, v prípade ktorých sú potrebné ďalšie štúdie, alebo sa ešte žiadne neuskutočnili. Stratégia zahŕňa najprv vykonanie validovaných a uznaných testov in vitro alebo ex vivo a potom štúdií s testovacou metódou B.4 za špecifických okolností (3)(4).

Opis stratégie postupného testovania

Pred vykonaním testov ako súčasti stratégie postupného testovania (obrázok) by sa mali vyhodnotiť všetky dostupné informácie na určenie potreby očného testovania in vivo. Hoci by z hodnotenia jednotlivých parametrov (napr. extrémna hodnota pH) bolo možné získať významné informácie, mal by sa posúdiť súhrn existujúcich informácií. Pri rozhodovaní na základe analýzy váhy dôkazov by sa mali vyhodnocovať všetky relevantné údaje o účinkoch príslušnej chemikálie a jej štruktúrnych analógov a toto rozhodnutie by sa malo odôvodniť. Prednostne by sa bolo treba zamerať na existujúce údaje o účinkoch chemikálie na ľudí a zvieratá, za ktorými by mali nasledovať výsledky z testovania in vitro alebo ex vivo. Štúdie žieravých chemikálií by sa podľa možnosti nemali uskutočňovať in vivo. Faktory zvažované v stratégii testovania zahŕňajú:

STRATÉGIA TESTOVANIA A HODNOTENIA OČNEJ DRÁŽDIVOSTI/ŽIERAVOSTI

LITERATÚRA

3.

V časti B sa kapitola B.10 nahrádza takto:

„B.10   Test in vitro na chromozómové aberácie u cicavcov

ÚVOD

Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 473 (2016). Je súčasťou série testovacích metód v oblasti genetickej toxikológie. V tejto súvislosti bol vypracovaný aj dokument OECD, ktorý poskytuje stručné informácie o vykonávaní testov v oblasti genetickej toxikológie a prehľad o súčasných zmenách, ktorými tieto usmernenia na vykonávanie testov prešli (1).

Účelom testu na chromozómové aberácie in vitro je identifikovať chemikálie, ktoré spôsobujú štruktúrne chromozómové aberácie v bunkových kultúrach cicavcov (2) (3) (4). Štruktúrne chromozómové aberácie sa vyskytujú v dvoch typoch, chromozómové alebo chromatidové. V in vitro testoch na chromozómové aberácie môže vzniknúť polyploidia (vrátane endoreduplikácie). Zatiaľ čo aneugény môžu vyvolať vznik polyploidie, samotná polyploidia nenaznačuje aneugénny potenciál a môže jednoducho znamenať narušenie bunkového cyklu alebo cytotoxicitu (5). Tento test nie je určený na meranie aneuploidie. Na zistenie aneuploidie by sa mohol doporučiť in vitro mikronukleový test (6).

V in vitro teste na chromozómové aberácie možno používať kultúry zavedených (permanentných) bunkových línií alebo primárne bunkové kultúry ľudského alebo hlodavčieho pôvodu. Použité bunky by sa mali vyberať na základe schopnosti rastu v kultúre, stability karyotypu (vrátane počtu chromozómov), ako aj frekvencie spontánnych chromozómových aberácií (7). Na základe v súčasnosti dostupných údajov nemožno vysloviť jednoznačné odporúčania, vyplýva z nich však to, že pri hodnotení nebezpečnosti chemikálií je dôležité zvážiť stav p53, genetickú stabilitu (stabilitu karyotypu), kapacitu na opravu DNA a pôvod (hlodavčí alebo ľudský) buniek vybratých pre testovanie. Keďže poznatky v tejto oblasti sa vyvíjajú, používateľom tejto testovacej metódy sa odporúča, aby zvážili vplyv týchto a iných charakteristík buniek na výkonnosť bunkovej línie pri detekcii indukcie chromozómových aberácií.

Použité definície sú uvedené v dodatku 1.

POČIATOČNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA

Testy, ktoré sa vykonávajú in vitro, si zvyčajne vyžadujú použitie exogénneho zdroja metabolickej aktivácie okrem prípadov, keď majú bunky metabolickú kapacitu s ohľadom na testované chemikálie. Exogénny systém metabolickej aktivácie nenapodobňuje v plnej miere podmienky in vivo. Bolo by sa treba vyhnúť podmienkam, ktoré by mohli viesť k falošne pozitívnym výsledkom, t. j. poškodeniam chromozómov nespôsobeným priamou interakciou medzi testovanými chemikáliami a chromozómami. Takéto podmienky zahŕňajú zmeny pH alebo osmolality (8) (9) (10), interakciu so zložkami média (11) (12) alebo nadmerné úrovne cytotoxicity (13) (14) (15) (16).

Tento test sa používa na detekciu chromozómových aberácií, ktoré môžu byť výsledkom klastogénnych udalostí. Analýza indukcie chromozómových aberácií by sa mala vykonať na bunkách v metafáze. Je preto nevyhnutné, aby bunky dosiahli mitózu v ovplyvňovaných aj v neovplyvňovaných kultúrach. V prípade vyrobených nanomateriálov môže byť potrebné túto testovaciu metódu osobitne upraviť, tieto úpravy však nie sú opísané v tejto testovacej metóde.

Pred použitím testovacej metódy v prípade zmesi s cieľom generovať údaje pre stanovený regulačný účel by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť primerané výsledky na tento účel, a ak áno, malo by sa to zdôvodniť. Takéto úvahy nie sú potrebné, ak existuje regulačná požiadavka na testovanie zmesi.

PRINCÍP TESTU

Bunkové kultúry ľudského pôvodu alebo pochádzajúce z iných cicavcov sú vystavené testovanej chemikálii spolu s exogénnym zdrojom metabolickej aktivácie aj bez neho, pokiaľ nie sú použité bunky so zodpovedajúcou schopnosťou metabolizácie (pozri bod 13). Vo vhodných vopred určených intervaloch po začatí expozície bunkových kultúr testovanej chemikálii sa tieto bunkové kultúry ošetria chemikáliou zastavujúcou bunkové delenie v metafáze (napr kolcemidom alebo kolchicínom), odoberú sa, zafarbia sa a bunky v metafáze sa mikroskopicky analyzujú na prítomnosť aberácií chromatidového a chromozómového typu.

OPIS METÓDY

Príprava

Bunky

Použiť možno rôzne bunkové línie [napr. bunky vaječníkov škrečka čínskeho (CHO), pľúcne bunky škrečka čínskeho V79, pľúcne bunky škrečka čínskeho (CHL)/IU, TK6] alebo primárne bunkové kultúry vrátane periférnych lymfocytov ľudí alebo iných cicavcov (7). Výber použitých bunkových línií by sa mal vedecky odôvodniť. Ak sa použijú primárne bunky, z dôvodu dobrých životných podmienok zvierat by sa malo podľa možnosti zvážiť použitie primárnych buniek ľudského pôvodu, pričom by sa mal odber vzoriek uskutočniť v súlade s etickými zásadami a právnymi predpismi. Ľudské periférne lymfocyty by sa mali získať od mladých (približne 18 až 35 ročných) nefajčiarov, ktorí podľa známych informácií netrpia nejakou chorobou, a ktorí v poslednom čase neboli vystavení genotoxickým činiteľom (napr. chemikáliám, ionizujúcemu žiareniu) na úrovniach, ktoré by zvýšili výskyt chromozómových aberácií v pozadí. Tým by sa zabezpečil nízky a ustálený výskyt chromozómových aberácií v pozadí. Základný výskyt chromozómových aberácií sa vekom zvyšuje, pričom je tento trend výraznejší u žien než u mužov (17) (18). Ak sa spoločne použijú bunky od viacerých darcov, mal by sa uviesť počet darcov. Je potrebné preukázať, že bunky sa v čase od začiatku aplikácie testovanej chemikálie do odberu vzoriek delili. Bunkové kultúry sú udržiavané v exponenciálnej fáze rastu buniek (bunkové línie) alebo sa ich delenie stimuluje (primárne kultúry lymfocytov), aby boli testovanej chemikálii vystavené bunky v rôznych fázach bunkového cyklu, pretože citlivosť jednotlivých fáz bunkového cyklu na testovanú chemikáliu nemusí byť známa. Primárne bunky, ktoré sa musia stimulovať mitogénnymi aktivátormi, aby sa delili, sa už vo všeobecnosti počas vystavenia testovanej chemikálii nesynchronizujú (napr. ľudské lymfocyty po 48 hodinách mitogénnej stimulácie). Používanie synchronizovaných buniek sa počas ovplyvňovania neodporúča, ale môže byť prijateľné, ak je to odôvodnené.

Médiá a kultivačné podmienky

Na udržiavanie kultúr by sa malo použiť vhodné kultivačné médium a inkubačné podmienky (kultivačné nádoby, podľa potreby atmosféra s vyššou relatívnou vlhkosťou a 5 % CO2, inkubačná teplota 37 °C). Bunkové línie by sa mali pravidelne kontrolovať, pokiaľ ide o stabilitu modálneho počtu chromozómov a o vylúčenie kontaminácie mykoplazmou (7) (19), a v prípade kontaminácie alebo zmeny modálneho počtu chromozómov by sa nemali použiť. Mal by sa stanoviť čas bežného bunkového cyklu použitej bunkovej línie alebo primárnych kultúr v testovacom laboratóriu a mal by byť zhodný s publikovanými charakteristikami buniek (20).

Príprava kultúr

Bunkové línie: bunky sa množia zo zásobných kultúr, zakladajú sa do rastového média, a to v takej hustote, pri ktorej sa počet buniek v suspenzii alebo v monovrstvách bude ďalej exponenciálne zvyšovať až do času odberu [napr. malo by sa zabrániť zhlukovaniu (konfluencii) buniek rastúcich v monovrstvách].

Lymfocyty: celá krv ošetrená antikoagulantom (napríklad: heparínom) alebo separované lymfocyty sa v prítomnosti mitogénu [napr. fytohemaglutinínu (PHA) v prípade ľudských lymfocytov] kultivujú (napr. počas 48 hodín v prípade ľudských lymfocytov), aby sa vyvolalo delenie buniek predtým, ako sa bunky vystavia testovanej chemikálii.

Metabolická aktivácia

Ak sa použijú bunky s nedostatočnou endogénnou metabolickou kapacitou, mali by sa použiť exogénne systémy metabolickej aktivácie. Najpoužívanejším systémom, ktorý sa štandardne odporúča, pokiaľ to nie je odôvodnené inak, je kofaktormi obohatená postmitochondriálna frakcia (S9) pripravená z pečene hlodavcov (väčšinou potkanov) ošetrená činidlami na indukciu enzýmov, ako napríklad Aroclorom 1254 (21) (22) (23) alebo kombináciou fenobarbitálu a beta-naftoflavónu (3-fenyl-1H-nafto[2,1-b]pyrán-1-ón) (27) (28) (29). Uvedená kombinácia nie je v rozpore so Štokholmským dohovorom o perzistentných organických látkach (30) a preukázateľne je pri indukovaní oxidáz so zmiešanými funkciami rovnako účinná ako Aroclor 1254 (24) (25) (26) (28). Frakcia S9 sa zvyčajne používa v koncentráciách v rozpätí od 1 do 2 obj. %, ale v konečnom testovacom médiu ju možno zvýšiť na 10 obj. %. Počas ovplyvňovania by sa malo zabrániť použitiu produktov, ktorými sa znižuje mitotický index, najmä produktov tvoriacich komplexy s vápnikom (31). Výber druhu a koncentrácie použitého exogénneho systému metabolickej aktivácie alebo metabolického induktora môže ovplyvniť trieda testovanej chemikálie.

Príprava testovanej chemikálie

Testované chemikálie v tuhom skupenstve by sa prípadne mali rozpustiť vo vhodnom rozpúšťadle pred ich aplikáciou na bunky (pozri bod 23). Testované chemikálie v kvapalnom skupenstve možno pridať priamo do testovacieho systému a/alebo ich rozriediť pred použitím na ovplyvňovanie testovacieho systému. Plynné alebo prchavé testované chemikálie by sa mali testovať tak, že sa štandardné protokoly vhodne upravia, napríklad sa v nich uskutoční ovplyvňovanie v uzavretých kultivačných nádobách (32) (33) (34). Príprava testovanej chemikálie by sa mala uskutočniť tesne pred ovplyvňovaním, pokiaľ z údajov o stabilite nevyplýva prípustnosť uskladnenia.

Podmienky testu

Rozpúšťadlá

Rozpúšťadlo by sa malo zvoliť tak, aby sa optimalizovala rozpustnosť testovaných chemikálií bez toho, aby to malo negatívny vplyv na vykonávanie skúšky (napr. zmenou rastu buniek), ovplyvňovalo integritu testovanej chemikálie, reagovalo s kultivačnými nádobami, narušovalo systém metabolickej aktivácie. Vždy, keď je to možné, odporúčame zvážiť, aby sa prednostne použilo vodné rozpúšťadlo (alebo rastové médium). Medzi overené rozpúšťadlá patrí napr. voda alebo dimetylsulfoxid. Organické rozpúšťadlá by vo všeobecnosti nemali presiahnuť 1 obj. % a vodné rozpúšťadlá (fyziologický roztok alebo voda) by nemali presiahnuť 10 obj. % v konečnom médiu s testovanou chemikáliou. Ak sa použijú iné ako overené rozpúšťadlá (napr. etanol alebo acetón), ich použitie by malo byť podložené údajmi potvrdzujúcimi ich kompatibilitu s testovanou chemikáliou, testovacím systémom a absenciu genetickej toxicity pri použitej koncentrácii. V prípade, že tieto podkladové údaje nie sú k dispozícii, je dôležité do testu zahrnúť neovplyvňované kontroly (pozri dodatok 1) s cieľom preukázať, že zvolené rozpúšťadlo nevyvoláva žiadne rušivé alebo klastogénne účinky.

Meranie proliferácie buniek a cytotoxicity a výber expozičných koncentrácií

Pri stanovovaní najvyššej koncentrácie testovanej chemikálie by sa malo zabrániť použitiu koncentrácií, ktoré majú schopnosť vyvolať falošné pozitívne reakcie, napr. koncentrácií vyvolávajúcich nadmernú cytotoxicitu (pozri bod 22), zrážanie rastového média (pozri bod 23) alebo výrazné zmeny pH alebo osmolality (pozri bod 5). Ak testovaná chemikália spôsobí výrazné zmeny pH média v čase jej pridania, pH možno upraviť tlmením finálneho média s testovanou chemikáliou tak, aby sa zabránilo falošným pozitívnym výsledkom a aby sa udržali vhodné kultivačné podmienky.

Aby sa zaistilo, že dostatočný počet ovplyvňovaných buniek dosiahol počas testu mitózu a že ošetrenia sa vykonávali na vhodných úrovniach cytotoxicity (pozri body 18 a 22), vykonávajú sa merania proliferácie buniek. V hlavnom experimente by sa mala stanoviť cytotoxicita s metabolickou aktiváciou a bez nej, a to použitím vhodného indikátora bunkovej smrti a rastu. Aj keď z hľadiska lepšieho definovania koncentrácií, ktoré sa majú použiť v hlavnom experimente, môže byť užitočné hodnotenie cytotoxicity v počiatočnom teste, počiatočný test nie je povinný. Ak sa vykonáva, nemal by nahradiť meranie cytotoxicity pri hlavnom experimente.

Relatívne zdvojenie populácie (RPD) alebo relatívne zvýšenie počtu buniek (RICC) sú vhodné metódy na posúdenie cytotoxicity cytogenetických testoch (13) (15) (35) (36) (55) (pozri vzorce v dodatku 2). V prípade dlhodobej aplikácie chemikálie a v prípade, že sa odbery vykonávajú neskôr, ako je 1,5-násobok trvania normálneho bunkového cyklu od začiatku aplikácie (t. j. neskôr, ako je dĺžka 3 bunkových cyklov spolu), môže RPD viesť k podhodnoteniu cytotoxicity. Za týchto okolností by lepšou alternatívou mohlo byť meranie RICC alebo by na vyhodnotenie cytotoxicity po 1,5-násobku trvania bunkového cyklu bolo užitočné použiť odhad pomocou RPD.

Pokiaľ ide o lymfocyty v primárnych kultúrach, meradlom cytotoxických/cytostatických účinkov je mitotický index (MI), ktorý je však ovplyvnený časom od aplikácie testovanej chemikálie do jeho merania použitým mitogénom a prípadným narušením bunkového cyklu. MI je však prijateľný, pretože iné merania cytotoxicity môžu byť náročné a nepraktické a nemusia sa vzťahovať na cieľovú populáciu lymfocytov rastúcich v dôsledku reakcie na stimuláciu pomocou PHA.

Zatiaľ čo v prípade bunkových línií sú odporúčanými parametrami cytotoxicity hodnoty RICC a RPD a v prípade primárnej kultúry lymfocytov sa na rovnaký účel odporúča hodnota MI, užitočné informácie by mohli vyplynúť aj z ďalších ukazovateľov (napr. z integrity buniek, apoptózy, nekrózy, bunkového cyklu).

Mali by sa vyhodnocovať aspoň tri testované koncentrácie (bez zahrnutia kontroly s rozpúšťadlom a pozitívnej kontroly), ktoré spĺňajú kritériá prípustnosti (vhodná cytotoxicita, počet buniek atď.). Pri každej testovanej koncentrácii možno použiť akýkoľvek typ buniek (bunkové línie alebo primárne kultúry lymfocytov), buď replikátne kultúry alebo jednu ovplyvňovanú kultúru. Zatiaľ čo sa odporúča používanie duplikátnych kultúr, jednotlivé kultúry sú rovnako prípustné za predpokladu, že sa hodnotí rovnaký celkový počet buniek v jednotlivých resp. duplikátnych kultúrach. Použitie jednotlivých kultúr je obzvlášť dôležité pri viac ako 3 posudzovaných koncentráciách (pozri bod 31). Výsledky získané v nezávislých replikátnych kultúrach pri danej koncentrácii možno združiť na účely analýzy údajov (38). V prípade testovaných chemikálií, ktoré preukazujú malú alebo žiadnu cytotoxicitu, sú zvyčajne vhodné približne 2 až 3-násobné intervaly testovaných koncentrácií. Pri výskyte cytotoxicity by vybrané testované koncentrácie mali pokrývať rozsah od koncentrácie, ktorá vyvoláva cytotoxicitu, ako sa opisuje v bode 22, vrátane koncentrácií, pri ktorých je cytotoxicita mierna a slabá alebo žiadna. Mnohé testované chemikálie vykazujú strmé krivky závislosti reakcie od koncentrácie a s cieľom získať údaje pri nízkej a miernej cytotoxicite alebo podrobne preskúmať vzťah medzi dávkou a reakciou bude nevyhnutné použiť viac koncentrácií s tesným odstupom a/alebo viac ako tri koncentrácie (pre jednotlivé kultúry alebo replikáty), najmä v situáciách, kde sa vyžaduje opakovať experiment (pozri bod 47).

Ak je maximálna koncentrácia založená na cytotoxicite, najvyššia koncentrácia by mala dosiahnuť 55 ± 5 % cytotoxicity pri použití odporúčaných parametrov cytotoxicity (t. j. v prípade bunkových línií zníženie hodnôt RICC a RPD a v prípade primárnych kultúr lymfocytov zníženie hodnoty MI na 45 ± 5 % hodnôt súbežnej negatívnej kontroly). Pozitívne výsledky, ktoré sa zistia len pri hornej hranici tohto 55 ± 5 % rozpätia cytotoxicity, by sa mali interpretovať s mimoriadnou opatrnosťou (13).

V prípade málorozpustných testovaných chemikálií, ktoré nie sú cytotoxické pri koncentráciách nižších, ako je ich rozpustnosť, by najvyššia analyzovaná koncentrácia mala na konci aplikovania testovanej chemikálie vyvolať zákal alebo zrazeninu viditeľnú voľným okom alebo pomocou inverzného mikroskopu. Aj keď sa cytotoxicita vyskytne pri koncentrácii vyššej, ako je najnižšia nerozpustná koncentrácia daných chemikálií, testovať sa odporúča len pri jednej koncentrácii vyvolávajúcej zákal alebo viditeľnú zrazeninu, pretože falošné účinky môžu byť spôsobené zrazeninou. Pri koncentráciách vyvolávajúcich zrazeninu treba dbať na to, aby nedochádzalo k interferencii zrazeniny s priebehom testu (napr. pri farbení alebo bodovom hodnotení). Mohlo by byť užitočné pred začatím experimentu stanoviť rozpustnosť v rastovom médiu.

Ak sa nezistí žiadna zrazenina alebo obmedzujúca cytotoxicita, najvyššia testovaná koncentrácia by mala zodpovedať 10 mM, 2 mg/ml alebo 2 μl/ml, podľa toho, ktorá je najnižšia (39) (40) (41). Ak testovaná chemikália nemá definované zloženie, napr. látka neznámeho alebo variabilného zloženia, produkt komplexných reakcií alebo biologický materiál (UVCB) (42), environmentálny extrakt atď., je možné, že v prípade nedostatočnej cytotoxicity sa na zvýšenie koncentrácie jednotlivých zložiek danej testovanej chemikálie bude musieť najvyššia koncentrácia zvýšiť (napr. na 5 mg/ml). Je však potrebné poznamenať, že tieto požiadavky sa môžu v prípade humánnych liekov líšiť (43).

Kontroly

Pri každom odbere by sa mali vykonať súbežné negatívne kontroly (pozri bod 15), ktoré pozostávajú iba zo samotného rozpúšťadla v médiu s testovanou chemikáliou a ktoré sú ovplyvňované rovnakým spôsobom ako ovplyvňované kultúry.

Súbežné pozitívne kontroly sú potrebné na preukázanie schopnosti laboratória identifikovať klastogény v podmienkach použitého skúšobného protokolu a v prípade potreby aj (na preukázanie) účinnosti exogénneho systému metabolickej aktivácie. Príklady pozitívnych kontrol sú uvedené v tabuľke 1. Ak je to odôvodnené, možno použiť alternatívne iné chemikálie na pozitívnu kontrolu. Pretože testy genetickej toxicity in vitro na bunkách cicavcov sú dostatočne normalizované, použitie pozitívnych kontrol možno obmedziť len na metabolickú aktiváciu, ktorá si vyžaduje klastogén. Za predpokladu, že sa takýto test vykonáva súbežne s neaktivovaným testom s použitím rovnakej dĺžky ovplyvňovania, táto jediná pozitívna reakcia kontroly bude preukazovať aktivitu systému metabolickej aktivácie, ako aj citlivosť testovacieho systému. Dlhodobé ovplyvňovanie (bez S9) by však malo mať svoju vlastnú pozitívnu kontrolu, keďže dĺžka ovplyvňovania sa bude líšiť od testu s metabolickou aktiváciou. Každá pozitívna kontrola by sa mala použiť pri jednej alebo viacerých koncentráciách, pri ktorých sa očakáva reprodukovateľný a zistiteľný nárast nad hodnoty v pozadí, aby sa preukázala citlivosť testovacieho systému (t. j. aby účinky boli jasné, ale aby sa pri odčítavaní priamo neodhaľovala identita kódovaných preparátov), pričom by reakcia nemala byť narušená cytotoxicitou prevyšujúcu limity stanovené v testovacej metóde.

Tabuľka 1

Referenčné chemikálie odporúčané na posúdenie spôsobilosti laboratória a na výber pozitívnych kontrol.

POSTUP

Aplikácia testovanej chemikálie

Proliferujúce bunky sa ovplyvnia testovanou chemikáliou za prítomnosti aj za neprítomnosti systému metabolickej aktivácie.

Čas odberu kultúry

Na účely dôkladného vyhodnotenia, ktoré by bolo potrebné na vyslovenie záveru, že ide o negatívny výsledok, by sa mali vykonať testy za všetkých troch ďalej uvedených experimentálnych podmienok, a to s použitím krátkodobého ovplyvňovania testovanou chemikáliou spolu s metabolickou aktiváciou alebo bez nej a s použitím dlhodobého ovplyvňovania testovanou chemikáliou bez metabolickej aktivácie (pozri body 43, 44 a 45):

V prípade, že ktorákoľvek z uvedených experimentálnych podmienok vedie k pozitívnej reakcii, nie je potrebné preskúmať ostatné dávkovacie schémy.

Chromozómové preparáty

Bunkové kultúry sa ošetrujú kolcemidom alebo kolchicínom zvyčajne 1 – 3 hodiny pred odberom. Každá bunková kultúra sa na prípravu chromozómových preparátov odoberá a spracúva oddelene. Príprava chromozómových preparátov zahŕňa hypotonické ošetrenie buniek, fixáciu a farbenie. V monovrstvových bunkových kultúrach sa mitotické bunky (možno ich identifikovať ako okrúhle a oddeľujúce sa od povrchu) môžu vyskytovať na konci 3 – 6 hodinového pôsobenia. Keďže sa tieto mitotické bunky dajú ľahko oddeliť, môžu sa stratiť pri odstraňovaní média obsahujúceho testovanú chemikáliu. Ak v čase odberu existuje dôkaz o výraznom zvýšení počtu mitotických buniek v porovnaní s kontrolami, čo by poukazovalo na možné zastavenie mitózy, potom by sa bunky mali zhromaždiť odstreďovaním a vrátiť späť ku kultúram, aby sa predišlo strate buniek v mitóze, ktorým hrozí vznik chromozómových aberácií.

Analýza

Všetky preparáty vrátane preparátov s negatívnymi a pozitívnymi kontrolami by sa pred mikroskopickou analýzou chromozómových aberácií mali nezávisle označiť kódmi. Keďže fixačné postupy často vedú k tomu, že časť metafázových buniek stratí chromozómy, vyhodnocované bunky by preto mali obsahovať centroméry, ktorých počet by sa mal rovnať modálnemu počtu chromozómov ± 2.

Hodnotiť by sa malo najmenej 300 dobre rozotretých buniek v metafáze na jednu koncentráciu a kontrolu, aby bolo možné dôjsť k záveru, že testovaná chemikália je jednoznačne negatívna (pozri bod 45). V prípade používania replikátnych kultúr by sa uvedených 300 buniek malo rovnomerne rozdeliť medzi replikáty. Ak sa pri každej koncentrácii použije len jedna kultúra (pozri bod 21), uvedených najmenej 300 dobre rozprestrených buniek v metafáze by sa malo hodnotiť z tejto jednej kultúry. Prednosťou hodnotenia 300 buniek je zvyšovanie štatistickej sily testu, pričom sa okrem toho zriedka vyskytnú nulové hodnoty (predpokladá sa len 5 %) (44). Počet hodnotených metafáz možno znížiť, ak sa zistí veľký počet buniek s chromozómovými aberáciami a testovaná chemikália sa považuje za jasne pozitívnu.

Mali by sa hodnotiť bunky so štruktúrnymi chromozómovými aberáciami, a to s gapmi a bez gapov. Definície zlomov a gapov sú uvedené v dodatku 1, podľa (45) (46). Aberácie chromatídového a chromozómového typu by sa mali zaznamenávať oddelene a klasifikovať podľa druhu (zlomy, výmeny). Postupy používané v laboratóriu by mali zabezpečiť, aby analýzy chromozómových aberácií vykonávali primerane vyškolení hodnotiaci pracovníci a aby sa podľa potreby partnersky preskúmali.

Hoci účelom tohto testu je zistiť štruktúrne chromozómové aberácie, v prípade polyploidie a endoreduplikácie je dôležité zaznamenať frekvenciu týchto javov. (pozri bod 2).

Spôsobilosť laboratória

V záujme nadobudnutia dostatočných skúseností s testom pred jeho použitím na rutinné testovanie by laboratórium malo mať uskutočnené série experimentov s referenčnými pozitívnymi chemikáliami pôsobiacimi rôznymi mechanizmami a s rôznymi negatívnymi kontrolami (s použitím rôznych rozpúšťadiel/nosičov). Tieto reakcie pozitívnych a negatívnych kontrol by mali byť konzistentné s literatúrou. Táto požiadavka sa nevzťahuje na laboratóriá, ktoré majú skúsenosti, t. j. majú dostupnú historickú databázu, ako sa vymedzuje v bode 37.

Na preukázanie spôsobilosti detegovať klastogénne chemikálie a určiť účinnosť systému metabolickej aktivácie by sa mal preskúmať výber chemikálií na pozitívnu kontrolu (pozri tabuľku 1 v bode 26), a to na základe krátkodobého a dlhodobého ovplyvňovania bez metabolickej aktivácie, ako aj na základe krátkodobého pôsobenia za prítomnosti metabolickej aktivácie. V záujme preukázania citlivosti a dynamického rozsahu testovacieho systému by sa rozsah koncentrácií vybraných chemikálií mal zvoliť tak, aby vznikali reprodukovateľné reakcie zvyšujúce sa v závislosti od koncentrácie nad úrovňou v pozadí.

Historické údaje o kontrolách

Laboratórium by malo vytvoriť:

Pri prvom získavaní údajov súvisiacich s rozdelením historických negatívnych kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v súlade s uverejnenými údajmi kontrol, ak takéto údaje existujú. S pridávaním ďalších experimentálnych údajov k rozdeleniu kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v ideálnom prípade v rámci 95 % regulačných medzí tohto rozdelenia (44) (47). Historickú databázu negatívnych kontrol laboratória by na začiatku malo tvoriť minimálne 10 experimentov, ale podľa možnosti by mala pozostávať aspoň z 20 experimentov vykonaných za porovnateľných experimentálnych podmienok. Laboratóriá by mali použiť metódy kontroly kvality, ako sú regulačné diagramy [napr. tzv. „C-charts“ alebo „X-bar charts“ (48)], s cieľom zistiť variabilitu svojich údajov týkajúcich sa pozitívnych a negatívnych kontrol a preukázať, že metodika v ich laboratóriu je „pod kontrolou“ (44). Ďalšie odporúčania k vytváraniu a využívaniu historických údajov (t. j. kritériá zaradenia údajov medzi historické údaje a ich vylúčenia z historických údajov a kritériá prijateľnosti v prípade daného experimentu) možno nájsť v literatúre (47).

Všetky zmeny v experimentálnom protokole by sa mali posúdiť z hľadiska ich súladu s existujúcou historickou databázou kontrol laboratória. Akékoľvek závažné nezrovnalosti by mali vyústiť do vytvorenia novej historickej databázy kontrol.

Údaje týkajúce sa negatívnych kontrol by mali zahŕňať výskyt buniek s chromozómovými aberáciami z jednej kultúry alebo súčet z replikátov kultúr, ako je opísané v bode 21. Súbežné negatívne kontroly by v ideálnom prípade mali byť v rámci 95 % regulačných medzí rozloženia historickej databázy negatívnych kontrol laboratória (44) (47). Ak údaje zo súbežných negatívnych kontrol nespadajú do 95 % regulačných medzí, môžu byť prijateľné na zaradenie do rozloženia historických kontrol, pokiaľ tieto údaje nie sú extrémne odľahlými hodnotami a pokiaľ existujú dôkazy, že testovací systém je „pod kontrolou“ (pozri bod 37) a neexistujú žiadne dôkazy o technickom alebo ľudskom zlyhaní.

ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV

Prezentovanie výsledkov

Vyhodnotiť by sa mal percentuálny podiel buniek so štruktúrnou chromozómovou aberáciou(-ami). Aberácie chromatídového a chromozómového typu klasifikované podľa druhu (zlomy, výmeny) by mali byť uvedené oddelene spolu s ich počtami a frekvenciami výskytu v prípade experimentálnych a kontrolných kultúr. Gapy sa zaznamenávajú a uvádzajú oddelene, ale neudávajú sa pri celkovej frekvencii aberácií. Uvádza sa percentuálny podiel polyploidie a/alebo endoreduplikovaných buniek, ak boli pozorované.

Mali by sa zaznamenať súbežné merania cytotoxicity pre všetky ovplyvňované, ako aj negatívne a pozitívne kontrolné kultúry v hlavnom experimente zameranom na aberácie.

Mali by sa uvádzať údaje o jednotlivých kultúrach. Okrem toho by sa všetky údaje mali uvádzať v tabuľkovej podobe.

Kritériá prijateľnosti

Prijateľnosť vychádza z týchto kritérií:

Vyhodnotenie a interpretácia výsledkov

Za predpokladu, že všetky kritériá prijateľnosti sú splnené, sa testovaná chemikália pokladá za jasne pozitívnu, ak pre ktorúkoľvek z preskúmaných experimentálnych podmienok platí, že (pozri bod 28):

Ak sú splnené všetky tieto kritériá, potom sa testovaná chemikália považuje za schopnú vyvolať chromozómové aberácie v kultivovaných bunkách cicavcov v tomto testovacom systéme. Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno nájsť v literatúre (49) (50) (51).

Za predpokladu, že všetky kritériá prijateľnosti sú splnené, sa testovaná chemikália pokladá za jasne negatívnu, ak pri všetkých preskúmaných experimentálnych podmienkach (pozri bod 28) platí, že:

Testovaná chemikália sa považuje za neschopnú vyvolať chromozómové aberácie v kultivovaných bunkách cicavcov v tomto testovacom systéme.

Overenie jasnej pozitívnej alebo negatívnej reakcie sa nevyžaduje.

V prípade, že reakcia nie je jednoznačne negatívna, ani jednoznačne pozitívna podľa uvedeného opisu, alebo v prípade, že ide o pomoc pri stanovovaní biologickej relevantnosti výsledku, by sa údaje mali odborne posúdiť a/alebo podrobiť ďalšiemu skúmaniu. Užitočné by mohlo byť hodnotenie ďalších buniek (ak je to vhodné) alebo opakovanie experimentu podľa možnosti za modifikovaných experimentálnych podmienok [napr. odstup koncentrácií, iné podmienky metabolickej aktivácie (t. j. koncentrácia S9 alebo pôvod S9)].

V zriedkavých prípadoch, dokonca aj po ďalších skúmaniach, z údajov nemožno vyvodiť záver o tom, či sú výsledky pozitívne alebo negatívne, a preto sa reakcia na testovanú chemikáliu uzavrie ako reakcia s nejasným výsledkom.

Nárast počtu polyploidných buniek môže naznačovať, že testované chemikálie majú potenciál brzdiť mitotické procesy a indukovať numerické chromozómové aberácie (52). Nárast počtu buniek s endoreduplikovanými chromozómami môže naznačovať, že testované chemikálie majú potenciál brzdiť priebeh bunkového cyklu (53) (54) (pozri bod 2). Preto by sa incidencia polyploidných buniek a buniek s endoreduplikovanými chromozómami mala zaznamenávať oddelene.

Skúšobný protokol

Skúšobný protokol by mal zahŕňať tieto informácie:

LITERATÚRA

4.

V časti B sa kapitola B.11 nahrádza takto:

„B.11   Test na chromozómové aberácie v cicavčích bunkách kostnej drene

ÚVOD

Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 475 (2016). Je súčasťou série testovacích metód v oblasti genetickej toxikológie. V tejto súvislosti bol vypracovaný aj dokument OECD, ktorý poskytuje stručné informácie o vykonávaní testov v oblasti genetickej toxikológie a prehľad o súčasných zmenách, ktorými tieto usmernenia na vykonávanie testov prešli (1).

Tento in vivo test na chromozómové aberácie v cicavčích bunkách kostnej drene je osobitne relevantný pre posúdenie genotoxicity, pretože faktory ako in vivo metabolizmus, farmakokinetika a oprava DNA sú aktívne a prispievajú k reakciám, hoci sa v prípade rôznych druhov môžu líšiť. Skúška in vivo je užitočná aj pre ďalšie skúmanie genotoxicity zistenej pomocou in vitro systému.

Test na chromozómové aberácie v cicavčích bunkách in vivo sa používa na zisťovanie štruktúrnych chromozómových aberácií indukovaných testovanou chemikáliou v bunkách kostnej drene zvierat, zvyčajne hlodavcov (2) (3) (4) (5). Štruktúrne chromozómové aberácie sa vyskytujú v dvoch typoch, chromozómové alebo chromatidové. Zatiaľ čo väčšina aberácií indukovaných genotoxickou chemikáliou je chromatidového typu, vyskytujú sa aj aberácie chromozómového typu. Chromozómové poškodenia a súvisiace javy sú príčinou mnohých ľudských genetických chorôb a existujú dostatočné dôkazy o tom, že pokiaľ tieto lézie a súvisiace javy spôsobujú zmeny onkogénov a tumor supresorových génov, sú zapojené do vzniku rakoviny u ľudí a v pokusných systémoch. V in vivo testoch na chromozómové aberácie by mohla vzniknúť polyploidia (vrátane endoreduplikácie). Samotné zvýšenie polyploidie však nenaznačuje aneugénny potenciál a môže jednoducho znamenať narušenie bunkového cyklu alebo cytotoxicitu. Tento test nie je určený na meranie aneuploidie. Na detekciu aneuploidie sa odporúčajú in vivo a in vitro testy ako in vivo mikrojadrový test na erytrocytoch cicavcov (kapitola B.12 tejto prílohy) alebo in vitro mikrojadrový test bunkách cicavcov (kapitola B.49 tejto prílohy).

Použité definície termínov sú uvedené v dodatku 1.

ÚVODNÉ ÚVAHY

V tomto teste sa zvyčajne používajú hlodavce, ale ak je to vedecky opodstatnené, v niektorých prípadoch môžu byť vhodné aj iné druhy. Cieľovým tkanivom v tomto teste je kostná dreň, pretože je to vysokovaskularizovaným tkanivom a obsahuje populáciu rýchlo sa deliacich buniek, ktoré sa dajú jednoducho izolovať a spracovať. V správe by sa malo uviesť vedecké odôvodnenie použitia iných druhov než potkanov a myší. Ak sa použijú iné druhy než hlodavce, odporúča sa, aby sa meranie chromozómových aberácií v bunkách kostnej drene začlenilo do iného vhodného testu toxicity.

Ak existujú dôkazy, že testovaná chemikália, resp. testované chemikálie alebo ich metabolity nedosiahnu cieľové tkanivo, použitie tohto testu nemusí byť vhodné.

Pred použitím testovacej metódy v prípade zmesi s cieľom generovať údaje pre zamýšľaný regulačný účel by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť primerané výsledky na tento účel, a ak môže, malo by sa to zdôvodniť. Takéto úvahy nie sú potrebné, ak existuje regulačná požiadavka na testovanie zmesi.

PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY

Zvieratá sa testovanej chemikálii vystavia vhodnou cestou a vo vhodnom čase po aplikácii testovanej chemikálie sa humánne usmrtia. Pred usmrtením sa zvieratám aplikuje prostriedok zastavujúci metafázu (napr kolchicín alebo kolcemid). Následne sa z kostnej drene urobia chromozómové preparáty, zafarbia sa a bunky v metafáze sa analyzujú na chromozómové aberácie.

OVEROVANIE SPÔSOBILOSTI LABORATÓRIA

Zisťovanie spôsobilosti

V záujme nadobudnutia dostatočných skúseností s vykonávaním skúšky pred jej použitím na rutinné testovanie by laboratórium malo preukázať schopnosť reprodukovať výsledky predpokladané na základe zverejnených údajov [napr. (6)], pokiaľ ide o frekvenciu výskytu chromozómových aberácií, s minimálne dvomi chemikáliami na pozitívnu kontrolu (vrátane slabých reakcií indukovaných nízkymi dávkami pozitívnych kontrol), ako sú chemikálie uvedené v tabuľke 1, a s kompatibilnými kontrolami s nosičom/rozpúšťadlom (pozri bod 22). Pri týchto experimentoch by sa mali používať dávky, ktoré vyvolajú reprodukovateľný a od dávky závislý nárast účinku a preukážu citlivosť a dynamický rozsah testovacieho systému v predmetnom tkanive (kostná dreň), pričom sa použije metóda hodnotenia, ktorá sa má uplatňovať v laboratóriu. Táto požiadavka sa nevzťahuje na laboratóriá, ktoré majú skúsenosti, t. j. majú dostupnú historickú databázu, ako sa vymedzuje v bodoch 10 – 14.

Historické údaje o kontrolách

V priebehu zisťovania spôsobilosti by malo laboratórium určiť:

Pri prvom získavaní údajov súvisiacich s rozdelením historických negatívnych kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v súlade s uverejnenými údajmi týkajúcimi sa kontrol, ak takéto údaje existujú. S pridávaním ďalších experimentálnych údajov k rozdeleniu historických kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v ideálnom prípade v rámci 95 % regulačných medzí tohto rozdelenia. Historická databáza negatívnych kontrol laboratória by mala byť štatisticky solídna, aby sa zaistila schopnosť laboratória posudzovať rozdelenie jeho údajov týkajúcich sa negatívnych kontrol. Na základe literatúry môže byť potrebných minimálne 10 experimentov, no bolo by vhodnejšie vykonať aspoň 20 experimentov za porovnateľných experimentálnych podmienok. Laboratóriá by mali používať metódy kontroly kvality, ako sú regulačné diagramy [napr. tzv. „C-charts“ alebo „X-bar charts“ (7)], s cieľom zistiť variabilitu svojich údajov a preukázať, že metodika v ich laboratóriu je „pod kontrolou“. Ďalšie odporúčania k vytváraniu a využívaniu historických údajov (t. j. kritériá zaradenia údajov medzi historické údaje a ich vylúčenia z historických údajov a kritériá prijateľnosti v prípade daného experimentu) možno nájsť v literatúre (8).

Ak laboratórium nevykoná dostatočný počet experimentov na vytvorenie štatisticky solídneho rozdelenia negatívnych kontrol (pozri bod 11) počas zisťovania spôsobilosti (ako sa opisuje v bode 9), je prijateľné, aby sa rozdelenie vytváralo počas prvých rutinných testov. Tento postup by mal vychádzať z odporúčaní uvedených v literatúre (8) a výsledky negatívnych kontrol získané na základe týchto experimentov by mali zostať v súlade s uverejnenými údajmi týkajúcimi sa negatívnych kontrol.

Všetky zmeny v experimentálnom protokole by sa mali posúdiť z hľadiska ich vplyvu na výsledné údaje, ktoré musia zostať v súlade s existujúcou historickou databázou kontrol laboratória. K vytvoreniu novej historickej databázy kontrol by mali viesť len veľké rozdiely, ak sa na základe odborného posúdenia stanoví, že sa líši od predchádzajúceho rozdelenia (pozri bod 11). Počas tejto obnovy nemusí byť na vykonanie príslušného testu potrebná úplná databáza negatívnych kontrol, ak laboratórium vie preukázať, že jeho hodnoty súbežných negatívnych kontrol sú naďalej v súlade s jeho predchádzajúcou databázou alebo s príslušnými uverejnenými údajmi.

Údaje týkajúce sa negatívnych kontrol by mali zahŕňať údaje o výskyte štruktúrnych chromozómových aberácií (s výnimkou gapov) u každého zvieraťa. Súbežné negatívne kontroly by v ideálnom prípade mali byť v rámci 95 % regulačných medzí rozdelenia historickej databázy negatívnych kontrol laboratória. Ak údaje zo súbežných negatívnych kontrol nespadajú do 95 % regulačných medzí, môžu byť prijateľné na zaradenie do rozdelenia historických kontrol, pokiaľ tieto údaje nie sú extrémne odľahlými hodnotami a pokiaľ existujú dôkazy, že testovací systém je „pod kontrolou“ (pozri bod 11) a neexistujú žiadne dôkazy o technickom alebo ľudskom zlyhaní.

OPIS METÓDY

Príprava

Výber živočíšnych druhov

Mali by sa vyberať bežne používané laboratórne kmene zdravých mladých dospelých zvierat. Bežne sa používajú potkany, hoci vhodné môžu byť aj myši. Použiť možno akékoľvek iné vhodné druhy cicavcov, ak je to vedecky zdôvodnené v správe.

Podmienky umiestnenia a kŕmenia zvierat

V prípade hlodavcov by mala byť teplota v miestnosti pre zvieratá 22 °C (± 3 °C). Hoci ideálna relatívna vlhkosť by mala byť 50 – 60 %, mala by dosahovať minimálne 40 % a podľa možnosti by nemala presiahnuť 70 % okrem času čistenia miestnosti. Osvetlenie by malo byť umelé so striedaním 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie možno používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzeným prísunom pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, keď sa podáva týmto spôsobom. Hlodavce by mali byť umiestnené do malých skupín (najviac päť zvierat na jednu klietku) rovnakého pohlavia a testovanej skupiny, pokiaľ sa nepredpokladá žiadne agresívne správanie, pričom sa uprednostňujú klietky s pevnou podlahou a vhodne obohateným prostredím. Zvieratá môžu byť umiestnené samostatne len vtedy, ak je to vedecky opodstatnené.

Príprava zvierat

Bežne sa používajú zdravé mladé dospelé zvieratá (pri hlodavcoch je ideálny vek 6 – 10 týždňov na začiatku testovania, hoci je prijateľný aj trochu vyšší vek), ktoré sa náhodne rozdelia do kontrolných a testovaných skupín. Každé zviera sa jedinečne označí humánnou, minimálne invazívnou metódou (napr. krúžkovanie, označenie štítkom, aplikácia mikročipu alebo biometrická identifikácia, nie však skracovanie uší ani prstov) a aklimatizuje sa na laboratórne podmienky v priebehu minimálne piatich dní. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy spôsobené ich umiestnením. Malo by sa zabrániť krížovej kontaminácii pozitívnou kontrolou a testovanou chemikáliou. Na začiatku štúdie by mala byť hmotnostná variácia zvierat minimálna a nemala by presiahnuť ± 20 % priemernej hmotnosti každého pohlavia.

Príprava dávok

Tuhé testované chemikálie by sa pred podávaním dávok zvieratám mali rozpustiť alebo rozptýliť vo vhodných rozpúšťadlách alebo nosičoch alebo primiešať do krmiva alebo pitnej vody. Kvapalné testované chemikálie sa môžu podávať priamo alebo ich pred podávaním možno rozriediť. V prípade inhalačných expozícií možno testované chemikálie v závislosti od ich fyzikálno-chemických vlastností podávať vo forme plynu, pary alebo aerosólu (tuhá látka/kvapalina). Pokiaľ sa v údajoch o stabilite neuvádza prijateľnosť skladovania a nevymedzujú sa jeho vhodné podmienky, testovaná chemikália by sa mala používať čerstvo pripravená.

Rozpúšťadlo/nosič

Rozpúšťadlo/nosič by nemali vyvolávať toxické účinky pri používaných dávkach a nemalo by sa o nich predpokladať, že budú chemicky reagovať s testovanými chemikáliami. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by mali podporiť referenčné údaje uvádzajúce ich kompatibilitu. Odporúča sa podľa možnosti najskôr zvážiť použitie vodného rozpúšťadla/nosiča. Príklady bežne používaných kompatibilných rozpúšťadiel/nosičov zahŕňajú vodu, fyziologický roztok, roztok metylcelulózy, roztok sodnej soli karboxymetylcelulózy, olivový olej a kukuričný olej. Ak neexistujú historické alebo zverejnené údaje o kontrolách, z ktorých vyplýva, že zvolené atypické rozpúšťadlo/nosič neindukuje tvorbu štruktúrnych chromozómových aberácií ani iné škodlivé účinky, mala by sa vykonať východisková štúdia s cieľom stanoviť prijateľnosť rozpúšťadla/nosiča ako kontroly.

Kontroly

Pozitívne kontroly

Do každého testu by sa za normálnych okolností mala zahrnúť skupina zvierat, ktorej bola podaná chemikália na pozitívnu kontrolu. Možno od toho upustiť v prípade, že testovacie laboratórium preukázalo spôsobilosť pri vykonávaní testu a stanovilo rozsah historických pozitívnych kontrol. Ak nie je zahrnutá súbežná pozitívna kontrolná skupina, do každého experimentu by sa mali zahrnúť kontroly hodnotenia (fixované a nezafarbené preparáty). Možno ich získať tak, že sa do hodnotenia štúdie zahrnú vhodné referenčné vzorky získané a uchované zo samostatného experimentu s pozitívnou kontrolou, ktorý sa vykonáva periodicky (napr. každých 6 až 18 mesiacov) v laboratóriu, kde sa test vykonáva; napríklad počas testovania spôsobilosti a potom pravidelne, podľa potreby.

Chemikálie na pozitívnu kontrolu by mali spoľahlivo vyvolať zistiteľný nárast frekvencie buniek so štruktúrnymi chromozómovými aberáciami nad spontánnu úroveň. Dávky pozitívnej kontroly by sa mali voliť tak, aby boli účinky zjavné, ale aby hodnotiteľovi priamo neodhaľovali identitu kódovaných vzoriek. Je prijateľné, aby sa pozitívne kontroly podávali inou cestou ako testovaná chemikália, na základe iného harmonogramu aplikácie, a aby sa vzorky odoberali len jeden raz. V náležitých prípadoch možno na pozitívnu kontrolu takisto zvážiť použitie chemikálií rovnakej chemickej triedy. Príklady chemikálií na pozitívnu kontrolu sú uvedené v tabuľke 1.

Tabuľka 1

Príklady chemikálií na pozitívnu kontrolu

Negatívne kontroly

Zvieratá v negatívnych kontrolných skupinách by mali byť zahrnuté do každého odberu a inak by sa s nimi malo zaobchádzať rovnako ako s testovanými skupinami, nebude im však podaná testovaná chemikália. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie použije rozpúšťadlo/nosič, kontrolná skupina by mala dostať toto rozpúšťadlo/nosič. Ak sa však na základe historických údajov o negatívnych kontrolách pri každom odbere vzoriek v danom testovacom laboratóriu preukážu konzistentné údaje o variabilite medzi zvieratami a o frekvenciách buniek so štruktúrnymi aberáciami, môže byť pre negatívnu kontrolu potrebný len jeden odber. Ak sa na negatívne kontroly použije len jeden odber, mal by to byť odber vykonaný prvý raz v štúdii.

POSTUP

Počet zvierat a ich pohlavie

Vo všeobecnosti je reakcia vo forme vzniku mikrojadier podobná u samcov a samíc (9) a očakáva sa, že to bude platiť aj v prípade štruktúrnych chromozómových aberácií, preto by sa väčšina štúdií mohla uskutočniť na oboch pohlaviach. Údaje, ktoré poukazujú na relevantné rozdiely medzi samcami a samicami (napr. rozdiely v systémovej toxicite, metabolizme, biodostupnosti, toxicite pre kostnú dreň atď. vrátane napr. štúdie na vyhľadávanie rozsahu), by boli v prospech používania oboch pohlaví. V takomto prípade môže byť vhodné vykonať štúdiu na oboch pohlaviach, a to napr. ako súčasť štúdie toxicity po opakovaných dávkach. Ak sa použijú obe pohlavia, mohlo by byť vhodné použiť faktoriálny návrh. Podrobnosti o analýze údajov s použitím tohto návrhu sú uvedené v dodatku 2.

Mala by sa stanoviť veľkosť skupín na začiatku štúdie s cieľom poskytnúť minimálne 5 analyzovateľných zvierat jedného pohlavia alebo, ak sa použijú zvieratá oboch pohlaví, 5 zvierat každého pohlavia za skupinu. V prípade, že expozícia ľudí chemikáliám potenciálne súvisí s pohlavím, ako napríklad v prípade niektorých liekov, daný test by sa mal vykonať na jedincoch príslušného pohlavia. Ako pomôcku pri bežných požiadavkách týkajúcich sa maximálneho počtu zvierat možno uviesť, že štúdia na kostnej dreni s dvomi odbermi vzoriek, tromi dávkovými skupinami a so súbežnými negatívnymi a pozitívnymi kontrolami (každá skupina zložená z piatich zvierat jedného pohlavia) by si vyžadovala 45 zvierat.

Úrovne dávok

Ak sa z dôvodu, že ešte nie sú dostupné vhodné údaje na pomoc pri výbere dávky, vykoná predbežná štúdia na vyhľadávanie rozsahu, mala by sa vykonať v tom istom laboratóriu s použitím toho istého druhu, kmeňa, pohlavia a dávkovacej schémy, aké majú byť použité v hlavnej štúdii (10). Štúdia by sa mala zamerať na zistenie maximálnej tolerovanej dávky (MTD) definovanej ako najvyššia dávka, ktorá sa bude tolerovať bez dôkazu toxicity obmedzujúcej štúdiu, a to vzhľadom na trvanie štúdie (napr. indukovaním zníženia telesnej hmotnosti alebo hematopoetickej systémovej cytotoxicity), ale nie smrti ani znakov bolesti, utrpenia či ťažkostí, ktoré si vyžadujú humánne usmrtenie (11).

Najvyššiu dávku možno takisto definovať ako dávku, ktorá spôsobuje určité známky toxicity v kostnej dreni.

Chemikálie, ktoré vykazujú saturáciu toxikokinetických vlastností alebo indukujú detoxikačné procesy, ktoré môžu viesť k zníženiu expozície po dlhodobom ovplyvňovaní, môžu byť vyňaté z kritérií na stanovenie dávok a mali by sa hodnotiť jednotlivo.

V záujme získania informácií o reakcii na dávku by kompletná štúdia mala zahŕňať negatívnu kontrolnú skupinu a minimálne tri úrovne dávok vo všeobecnosti oddelené faktorom 2, ale nie vyšším ako 4. Ak testovaná chemikália nevyvoláva toxicitu v štúdii na vyhľadávanie rozsahu alebo na základe existujúcich údajov, najvyššia dávka pri jednorazovom podaní by mala byť 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti. Ak však testovaná chemikália spôsobuje toxicitu, maximálna tolerovaná dávka by mala byť najvyššia podávaná dávka a použité úrovne dávky by mali podľa možnosti pokrývať rozsah od maximálnej dávky po dávku, ktorá spôsobuje slabú alebo nespôsobuje žiadnu toxicitu. Ak sa zistí toxicita v cieľovom tkanive (kostná dreň) pri všetkých testovaných úrovniach dávok, odporúča sa vykonať ďalšiu štúdiu s netoxickými dávkami. Štúdie, ktorých cieľom je podrobnejšie charakterizovať kvantitatívne informácie o reakcii na dávku, si môžu vyžadovať ďalšie dávkové skupiny. V prípade určitých druhov testovaných chemikálií (napr. humánne lieky), na ktoré sa vzťahujú osobitné požiadavky, sa tieto limity môžu líšiť.

Limitný test

Ak z pokusov na vyhľadávanie rozsahu dávok alebo existujúcich údajov týkajúcich sa príbuzných kmeňov zvierat vyplýva, že dávkovací režim, aspoň pokiaľ ide o limitujúcu dávku (opísanú ďalej v texte), nespôsobuje žiadne pozorovateľné toxické účinky (vrátane žiadneho poklesu proliferácie kostnej drene alebo iného dôkazu cytotoxicity v cieľovom tkanive), a ak by sa genotoxicita na základe in vitro štúdií genotoxicity alebo na základe údajov týkajúcich sa štrukturálne príbuzných chemikálií neočakávala, potom nemusí byť potrebná úplná štúdia s použitím troch úrovní dávok, ak sa preukázalo, že testovaná chemikália(-e) dosahuje cieľové tkanivo (kostná dreň). V takýchto prípadoch môže byť postačujúca jedna dávka na úrovni limitujúcej dávky. V prípade obdobia podávania chemikálie dlhšieho než 14 dní predstavuje limitujúca dávka 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň. V prípade období podávania chemikálie počas najviac 14 dní predstavuje limitujúca dávka 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň.

Podávanie dávok

Pri plánovaní skúšky by sa mal zvážiť predpokladaný spôsob expozície ľudí. Preto možno ako opodstatnené zvoliť spôsoby expozície prostredníctvom stravy, pitnej vody, topickou, subkutánnou cestou, intravenózne, perorálne (pomocou sondy), inhalačne, intratracheálne alebo implantačne. V každom prípade by sa mal zvoliť spôsob, ktorým sa zabezpečí primeraná expozícia cieľového tkaniva(-ív). Vo všeobecnosti sa neodporúča použitie intraperitoneálnej injekcie, keďže to nie je zamýšľaný spôsob expozície ľudí, a mal by sa použiť iba s osobitným vedeckým zdôvodnením. Ak je testovaná chemikália primiešaná do krmiva alebo pitnej vody, najmä v prípade jednej dávky, treba venovať pozornosť tomu, aby sa medzi spotrebou potravy a vody a odberom vzorky ponechal dostatočný čas na zistenie účinkov (pozri body 33 – 34). Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podávať sondou alebo injekciou, závisí od veľkosti testovaného zvieraťa. Objem by za bežných okolností nemal prekročiť 1 ml/100 g telesnej hmotnosti okrem vodných roztokov, pri ktorých možno použiť najviac 2 ml/100 g. Požitie väčších ako uvedených objemov by malo byť opodstatnené. S výnimkou dráždivých alebo žieravých testovaných chemikálií, ktoré pri vyšších koncentráciách zvyčajne vyvolajú zhoršenie účinkov, by sa variabilita v objeme testovanej chemikálie mala minimalizovať tým, že sa koncentrácia upraví tak, aby sa na všetkých úrovniach dávok zabezpečil stály objem vo vzťahu k telesnej hmotnosti.

Harmonogram aplikácie

Testované chemikálie sa bežne podávajú jednorazovou aplikáciou, ale možno ich podať v delenej dávke (t. j. dve alebo viaceré aplikácie v jeden deň s časovým odstupom najviac 2 – 3 hodiny), čím sa uľahčí podávanie veľkého objemu chemikálie. Za týchto okolností alebo pri podávaní testovanej chemikálie inhalačne by sa mal čas odberu vzoriek naplánovať na základe posledného podania dávky alebo skončenia vystavenia.

V prípade tohto testu existuje len málo dostupných údajov o vhodnosti protokolu opakovanej dávky. V prípadoch, kedy je žiaduce, aby tento test zahŕňal test toxicity po opakovaných dávkach, treba dbať na to, aby sa zabránilo strate mitotických buniek s poškodenými chromozómami, čo sa pri toxických dávkach môže stať. Táto integrácia je prijateľná, ak je najvyššia dávka väčšia alebo sa rovná limitujúcej dávke (pozri bod 29) a dávkovej skupine sa počas trvania testu podáva limitujúca dávka. Ak je žiaduca integrácia s inými štúdiami, v prípade chromozómových aberácií by sa ako preferovaný in vivo test mal posúdiť mikrojadrový test (testovacia metóda B.12).

Vzorky kostnej drene by sa mali odoberať v dvoch rôznych časoch po jednej aplikácii testovanej chemikálie. V prípade hlodavcov by prvým intervalom odberu vzorky mal byť čas potrebný na dokončenie 1,5-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu (zvyčajne 12 – 18 hodín) po období aplikácie chemikálie. Keďže čas potrebný na príjem a metabolizmus testovanej látky(-ok) a účinky testovanej látky na kinetiku bunkového cyklu môžu ovplyvniť optimálny čas na zistenie chromozómovej aberácie, odporúča sa neskoršie odobratie vzorky – 24 hodín po čase prvého odberu vzorky. V čase prvého odberu by sa mala všetkým dávkovým skupinám aplikovať chemikália a mali by sa odobrať vzorky na analýzu; pri neskoršom odbere(-och) je však potrebné podať len najvyššiu dávku. Ak sa na základe vedeckého zdôvodnenia používajú dávkovacie režimy dlhšie ako jeden deň, všeobecne by sa mal uskutočniť jeden odber vzorky pri približne 1,5-násobku dĺžky bežného bunkového cyklu po poslednej aplikácii chemikálie.

Po ošetrení a pred odberom vzoriek sa zvieratám intraperitoneálne vstrekne vhodná dávka prostriedku zastavujúceho metafázu (napr. kolcemid alebo kolchicín) a vzorky sa odoberú po uplynutí vhodného času. V prípade myší je tento interval približne 3 – 5 hodín pred odberom a v prípade potkanov 2 – 5 hodín. Bunky sa po odobratí z kostnej drene nechajú napučať, fixujú a farbia sa a analyzujú sa na chromozómové aberácie (12).

Pozorovania

Najmenej raz denne by sa mali vykonať všeobecné klinické pozorovania testovaných zvierat a zaznamenať klinické príznaky, najlepšie každý deň v rovnakom čase a s ohľadom na časový interval najintenzívnejších predpokladaných účinkov po podaní dávky. Počas obdobia podávania dávok by sa mala aspoň dvakrát denne sledovať chorobnosť a úmrtnosť zvierat. Všetky zvieratá by sa mali odvážiť na začiatku štúdie, a to aspoň raz za týždeň počas štúdií s opakovanou dávkou, a potom pri usmrtení. V prípade štúdií, ktoré trvajú aspoň jeden týždeň, by sa malo aspoň raz za týždeň vykonať meranie spotreby potravy. Ak sa testovaná chemikália podáva v pitnej vode, spotreba vody by sa mala merať pri každej výmene vody a aspoň raz za týždeň. Zvieratá, ktoré vykazujú neletálne ukazovatele nadmernej toxicity, by mali byť humánne usmrtené pred ukončením testovacieho obdobia (11).

Expozícia cieľového tkaniva

Vzorka krvi by sa mala odobrať vo vhodnom čase(-och), aby bolo možné preskúmať úrovne testovaných chemikálií v plazme na účely preukázania, že došlo k expozícii kostnej drene, ak je to opodstatnené a ak neexistujú iné údaje o expozícii (pozri bod 45).

Príprava kostnej drene a chromozómov

Ihneď po humánnom usmrtení sa zo stehenných alebo holenných kostí zvierat odoberú bunky kostnej drene, ktoré sa vystavia pôsobeniu hypotonického roztoku a následne sa fixujú. Bunky v metafáze sa potom rozotrú na sklíčka a zafarbia sa bežnými metódami pozri [(3) (12)].

Analýza

Všetky preparáty vrátane pozitívnych a negatívnych kontrol by sa mali pred analýzou nezávisle označiť kódmi a mali by sa náhodne usporiadať, aby hodnotiaci nebol oboznámený s podmienkami testovania.

Ako meradlo cytotoxicity by sa mal stanoviť mitotický index, a to aspoň na 1 000 bunkách na jedno zviera v prípade všetkých ovplyvňovaných zvierat (vrátane pozitívnych kontrol), neovplyvňovaných alebo negatívnych kontrolných zvierat s nosičom/rozpúšťadlom.

V prípade každého zvieraťa by sa malo analyzovať aspoň 200 metafáz na štruktúrne chromozómové aberácie vrátane gapov a bez gapov (6). Ak historická databáza negatívnych kontrol naznačuje, že v testovacom laboratóriu je priemerná hodnota frekvencie štruktúrnych chromozómových aberácií v pozadí < 1 %, malo by sa zvážiť hodnotenie ďalších buniek. Aberácie chromatidového a chromozómového typu by sa mali zaznamenávať oddelene a klasifikovať podľa podtypov (zlomy, výmeny). Postupy používané v laboratóriu by mali zabezpečiť, aby analýzy chromozómových aberácií vykonávali dobre vyškolení hodnotiaci pracovníci a aby sa podľa potreby partnersky preskúmali. Vzhľadom na to, že pri príprave preparátov často dochádza k zlomom časti buniek v metafáze s následnou stratou chromozómov, vyhodnocované bunky by preto mali obsahovať najmenej 2n ± 2 centromér, kde n je haploidný počet chromozómov pre daný druh.

ÚDAJE A PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV

Spracovanie výsledkov

Údaje o jednotlivých zvieratách by sa mali uvádzať v tabuľkovej forme. V prípade každého zvieraťa by sa mal vyhodnotiť mitotický index, počet hodnotených buniek v metafáze, počet aberácií na bunku v metafáze a percentuálny podiel buniek so štruktúrnou chromozómovou aberáciou, resp. aberáciami. V prípade ovplyvňovaných a kontrolných skupín by sa mali uvádzať rôzne typy štruktúrnych chromozómových aberácií s príslušnými počtami a frekvenciami. Gapy, polyploidné bunky a bunky s endoreduplikovanými chromozómami sa zaznamenávajú oddelene. Frekvencia gapov sa zaznamenáva, ale vo všeobecnosti sa nezahŕňa do analýzy celkovej frekvencie štruktúrnych aberácií. Ak neexistujú dôkazy o rozdieloch medzi reakciami rôznych pohlaví, údaje možno na účely štatistickej analýzy kombinovať. Mali by sa uvádzať aj údaje o toxicite a klinických príznakoch u zvierat.

Kritériá prijateľnosti

Prijateľnosť testu určujú tieto kritériá:

Vyhodnotenie a interpretácia výsledkov

Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jasne pozitívnu, ak:

Ak sa v konkrétnom čase odberu vzorky preskúma len najvyššia dávka, testovaná chemikália sa pokladá za jasne pozitívnu, ak dôjde k štatisticky významnému zvýšeniu v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou a výsledky sú mimo rozdelenia historických údajov týkajúcich sa negatívnych kontrol (napr. mimo 95 % regulačných medzí Poissonovho rozdelenia). Odporúčania týkajúce sa vhodných štatistických metód možno nájsť v literatúre (13). Pri vykonávaní analýzy vzťahu medzi dávkou a reakciou by sa mali analyzovať aspoň tri ovplyvňované dávkové skupiny. Pri štatistických testoch by sa malo použiť zviera ako experimentálna jednotka. Pozitívne výsledky testu na chromozómové aberácie naznačujú, že testovaná chemikália indukuje štruktúrne chromozómové aberácie v bunkách kostnej drene testovaného druhu.

Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, sa testovaná chemikália pokladá za jasne negatívnu, ak pri všetkých preskúmaných experimentálnych podmienkach platí, že:

Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno nájsť v literatúre (13). Ako dôkaz o expozícii kostnej drene testovanej chemikálii môže slúžiť zníženie mitotického indexu alebo meranie hladín testovanej chemikálie resp. chemikálií v plazme alebo krvi. V prípade intravenózneho podania nie je potrebný dôkaz o expozícii. Alternatívne možno na preukázanie expozície kostnej drene použiť údaje ADME získané v nezávislej štúdii s použitím toho istého spôsobu podania a toho istého druhu. Negatívne výsledky naznačujú, že za daných testovacích podmienok testovaná chemikália neindukuje štruktúrne chromozómové aberácie v bunkách kostnej drene testovaného druhu.

Overenie jasnej pozitívnej alebo negatívnej reakcie sa nevyžaduje.

V prípade, že reakcia nie je jednoznačne negatívna alebo pozitívna, a v prípade, že ide o pomoc pri stanovovaní biologickej relevantnosti výsledku (napr. slabé alebo hraničné zvýšenie), by sa údaje mali odborne posúdiť a/alebo by sa existujúce vykonané pokusy mali podrobiť ďalšiemu skúmaniu. V niektorých prípadoch by mohlo byť užitočné vykonať analýzu viacerých buniek alebo zopakovať experiment za upravených experimentálnych podmienok.

V zriedkavých prípadoch, dokonca ani po ďalších skúmaniach, z údajov nemožno vyvodiť záver, že testovaná chemikália vedie k negatívnym alebo pozitívnym výsledkom, a preto sa štúdia uzavrie ako štúdia s nejasným výsledkom.

Frekvencia výskytu polyploidných, ako aj endoreduplikovaných metafáz medzi všetkými metafázami by sa mala zaznamenávať oddelene. Nárast počtu polyploidných/endoreduplikovaných buniek môže naznačovať, že testovaná chemikália má potenciál brzdiť mitotické procesy alebo postup bunkového cyklu (pozri bod 3).

Skúšobný protokol

Skúšobný protokol by mal zahŕňať tieto informácie:

Zhrnutie

LITERATÚRA

5.

V časti B sa kapitola B.12 nahrádza takto:

„B.12.   Mikrojadrový (mikronukleový) test na erytrocytoch cicavcov

ÚVOD

Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov 474 (2016). Je súčasťou série testovacích metód v oblasti genetickej toxikológie. Bol vypracovaný dokument OECD, ktorý obsahuje stručné informácie o testovaní v oblasti genetickej toxikológie a prehľad posledných zmien, ktoré sa vykonali v týchto usmerneniach na vykonávanie testov (1).

Tento in vivo mikrojadrový test na cicavcoch je osobitne relevantný pre hodnotenie genotoxicity, pretože faktory in vivo metabolizmu, farmakokinetiky a opravných procesov DNA sú aktívne a prispievajú k reakciám, hoci sú v prípade rôznych druhov odlišné. In vivo skúška je takisto užitočná pre ďalšie skúmanie genotoxicity zistenej pomocou in vitro systému.

In vivo mikrojadrový test na cicavcoch sa používa na zisťovanie poškodenia vyvolaného testovanou chemikáliou na chromozómoch alebo mitotickom aparáte erytroblastov. Testom sa hodnotí tvorba mikrojadier v erytrocytoch odobratých buď z kostnej drene alebo z periférnych krvných buniek zvierat, zvyčajne hlodavcov.

Účelom mikrojadrového testu je identifikovať chemikálie spôsobujúce cytogenetické poškodenie, ktorého výsledkom je tvorba mikrojadier obsahujúcich buď oneskorené chromozómové fragmenty alebo celé chromozómy.

Keď sa erytroblast kostnej drene vyvinie na nezrelý erytrocyt (niekedy sa uvádza aj ako polychromatický erytrocyt alebo retikulocyt), hlavné jadro sa vypudzuje; akékoľvek mikrojadro, ktoré sa vytvorilo, môže zostať v cytoplazme. Vizualizácia alebo detekcia mikrojadier je v týchto bunkách jednoduchšia, pretože nemajú hlavné jadro. Zvýšenie frekvencie nezrelých erytrocytov s mikrojadrami u ovplyvnených zvierat je indikáciou vyvolaných štruktúrnych alebo numerických chromozómových aberácií.

Novovytvorené erytrocyty s mikrojadrami sa identifikujú a ich počty sa stanovujú farbením, po ktorom nasleduje buď vizuálne hodnotenie pomocou mikroskopu alebo automatická analýza. Použitie automatizovanej hodnotiacej platformy značne uľahčuje počítanie dostatočného množstva nezrelých erytrocytov v periférnej krvi alebo v kostnej dreni dospelých zvierat. Takéto platformy sú prijateľnými alternatívami manuálneho hodnotenia (2). Porovnávacie štúdie ukázali, že takéto metódy s použitím vhodných kalibračných štandardov môžu priniesť lepšiu vnútrolaboratórnu a medzilaboratórnu reprodukovateľnosť a citlivosť než manuálne mikroskopické hodnotenie (3) (4). Automatizované systémy, ktoré dokážu merať frekvencie erytrocytov s mikrojadrami, zahŕňajú, nie sú však obmedzené na prietokové cytometre (5), platformy obrazovej analýzy (6) (7) a laserové skenovacie cytometre (8).

Hoci to nie je bežnou súčasťou testu, chromozómové fragmenty možno odlíšiť od celých chromozómov na základe niekoľkých kritérií. Tieto kritériá zahŕňajú identifikáciu prítomnosti alebo neprítomnosti kinetochoru alebo centromerickej DNA, ktoré sú charakteristické pre neporušené chromozómy. Neprítomnosť kinetochoru alebo centromerickej DNA naznačuje, že mikrojadro obsahuje len fragmenty chromozómov, zatiaľ čo ich prítomnosť je príznačná pre stratu chromozómov.

Použité definície termínov sú uvedené v dodatku 1.

ÚVODNÉ ÚVAHY

Cieľovým tkanivom pre genetické poškodenie v tomto teste je kostná dreň mladých dospelých hlodavcov, keďže erytrocyty sa tvoria v tomto tkanive. Meranie mikrojadier v nezrelých erytrocytoch v periférnej krvi je prijateľné aj u iných druhov cicavcov, v prípade ktorých bola preukázaná primeraná citlivosť na detekciu chemikálií spôsobujúcich štruktúrne alebo numerické chromozómové aberácie v týchto bunkách (indukciou vzniku mikrojadier v nezrelých erytrocytoch) a v prípade ktorých je poskytnuté vedecké zdôvodnenie. Hlavným sledovaným parametrom je frekvencia nezrelých erytrocytov s mikrojadrami. Frekvenciu zrelých erytrocytov obsahujúcich mikrojadrá v periférnej krvi možno takisto použiť ako sledovaný parameter pri druhoch bez silného vychytávania buniek s mikrojadrami v slezine a v prípade, že sú zvieratá ovplyvňované nepretržite počas obdobia, ktoré presahuje životnosť erytrocytov u použitých druhov (napr. 4 alebo viac týždňov v prípade myší).

Ak existujú dôkazy, že testovaná(-é) chemikália(-e) alebo jej/ich metabolit(-y) nedosiahne(-u) cieľové tkanivo, nemusí byť vhodné použiť tento test.

Pred použitím testovacej metódy v prípade zmesi s cieľom generovať údaje pre stanovený regulačný účel by sa malo zvážiť, či môže poskytnúť primerané výsledky na tento účel, a ak môže, malo by sa to zdôvodniť. Takéto úvahy nie sú potrebné, ak existuje regulačná požiadavka na testovanie zmesi.

PRINCÍP TESTOVACEJ METÓDY

Zvieratá sú vystavené testovanej chemikálii vhodným spôsobom. Ak sa používa kostná dreň, zvieratá sa vo vhodnom(-ých) čase(-och) po ovplyvnení humánnym spôsobom utratia, odoberie sa kostná dreň a pripravia a zafarbia sa preparáty (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15)sa. Ak sa používa periférna krv, odoberá sa vo vhodnom(-ých) čase(-och) po ovplyvnení a pripravia a zafarbia sa preparáty (12) (16) (17) (18). Ak sa ovplyvnenie vykoná akútne, je dôležité zvoliť časy odberu kostnej drene alebo krvi, kedy možno zistiť indukciu nezrelých erytrocytov s mikrojadrami súvisiacu s ovplyvnením. V prípade odberu periférnej krvi musí takisto ubehnúť dostatočný čas na to, aby sa tieto javy objavili v krvnom obehu. Preparáty sa analyzujú na prítomnosť mikrojadier buď vizualizáciou pod mikroskopom, obrazovou analýzou, prietokovou cytometriou alebo laserovou skenovacou cytometriou.

OVEROVANIE SPÔSOBILOSTI LABORATÓRIA

Zisťovanie spôsobilosti

S cieľom potvrdiť dostatočné skúsenosti s vykonávaním skúšky pred jej použitím na rutinné testovanie by laboratórium malo preukázať schopnosť reprodukovať predpokladané výsledky zo zverejnených údajov (17) (19) (20) (21) (22), pokiaľ ide o frekvenciu výskytu mikrojadier, s minimálne dvoma chemikáliami na pozitívnu kontrolu (vrátane slabých reakcií vyvolaných nízkymi dávkami pozitívnych kontrol), ako sú chemikálie uvedené v tabuľke 1, a s kompatibilnými kontrolami nosiča/rozpúšťadla (pozri bod 26). Pri týchto pokusoch by sa mali používať dávky, ktoré vyvolajú reprodukovateľný a od dávky závislý nárast účinku a preukážu citlivosť a dynamický rozsah testovacieho systému v predmetnom tkanive (kostná dreň alebo periférna krv), pričom sa použije metóda hodnotenia, ktorá sa má uplatňovať v laboratóriu. Táto požiadavka sa nevzťahuje na laboratóriá, ktoré majú skúsenosti, t. j. majú dostupnú historickú databázu, ako sa vymedzuje v bodoch 14 – 18.

Údaje o historických kontrolách

V priebehu zisťovania spôsobilosti by malo laboratórium určiť:

Pri prvom získavaní údajov súvisiacich s rozdelením historických negatívnych kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v súlade s uverejnenými údajmi o kontrolách, ak takéto údaje existujú. S pridávaním ďalších údajov k rozdeleniu historických kontrol by súbežné negatívne kontroly mali byť v ideálnom prípade v rámci 95 % regulačných medzí tohto rozdelenia. Databáza historických negatívnych kontrol laboratória by mala byť štatisticky solídna, aby sa laboratóriu zabezpečila možnosť posudzovať rozdelenie svojich údajov o negatívnych kontrolách. Na základe literatúry môže byť potrebných minimálne 10 pokusov, no bolo by vhodnejšie vykonať aspoň 20 pokusov za porovnateľných podmienok. Laboratóriá by mali použiť metódy kontroly kvality, ako sú regulačné diagramy [napr. tzv. „C-charts“ alebo „X-bar charts“ (23)], s cieľom zistiť variabilitu svojich údajov a preukázať, že metodika je v laboratóriu „pod kontrolou“. Ďalšie odporúčania ako vytvárať a využívať historické údaje (t. j. kritériá zaradenia údajov medzi historické údaje a ich vylúčenia z historických údajov a kritériá prijateľnosti v prípade daného pokusu) možno nájsť v literatúre (24).

Ak laboratórium nevykoná dostatočný počet pokusov na vytvorenie štatisticky solídneho rozdelenia negatívnych kontrol (pozri bod 15) počas zisťovania spôsobilosti (ako sa opisuje v bode 13), je prijateľné, aby sa rozdelenie mohlo vytvárať počas prvých rutinných testov. Tento postup by mal vychádzať z odporúčaní uvedených v literatúre (24) a výsledky negatívnych kontrol získané na základe týchto pokusov by mali zostať v súlade s uverejnenými údajmi o negatívnych kontrolách.

Všetky zmeny v experimentálnom protokole by sa mali posúdiť z hľadiska ich vplyvu na výsledné údaje, ktoré musia zostať v súlade so súčasnou databázou historických kontrol v laboratóriu. K vytvoreniu novej databázy historických kontrol by mali viesť len veľké rozdiely, ak sa na základe odborného posúdenia zistí, že sa líši od predchádzajúceho rozdelenia (pozri bod 15). Počas tejto obnovy nemusí byť potrebná úplná databáza negatívnych kontrol na vykonanie príslušného testu, ak vie laboratórium preukázať, že jeho hodnoty súbežných negatívnych kontrol sú naďalej v súlade s jeho predchádzajúcou databázou alebo s príslušnými uverejnenými údajmi.

Údaje o negatívnych kontrolách by mali zahŕňať údaje o výskyte nezrelých erytrocytov s mikrojadrami v každom zvierati. Súbežné negatívne kontroly by v ideálnom prípade mali byť v rámci 95 % regulačných medzí rozdelenia databázy historických negatívnych kontrol laboratória. Ak údaje o súbežných negatívnych kontrolách nespadajú do 95 % regulačných medzí, môžu byť prijateľné na zaradenie do rozdelenia historických kontrol, pokiaľ tieto údaje nie sú extrémne mimo uvedených medzí a pokiaľ existujú dôkazy, že testovací systém je „pod kontrolou“ (pozri bod 15) a neexistujú žiadne dôkazy o technickom alebo ľudskom zlyhaní.

OPIS METÓDY

Príprava

Výber živočíšnych druhov

Mali by sa vyberať bežne používané laboratórne kmene zdravých mladých dospelých zvierat. Použiť možno myši, potkany alebo iné vhodné druhy cicavcov. Ak sa používa periférna krv, musí byť preukázané, že odstránenie buniek s mikrojadrami z krvného obehu uskutočnené v slezine neovplyvní detekciu indukovaných mikrojadier vo vybraných druhoch. Toto bolo jasne preukázané v prípade periférnej krvi myší a potkanov (2). V správe by malo byť poskytnuté vedecké zdôvodnenie použitia iných druhov než potkanov a myší. Ak sa použijú iné druhy než hlodavce, odporúča sa, aby sa meranie indukovaných mikrojadier začlenilo do iného vhodného testu toxicity.

Podmienky umiestnenia a kŕmenia zvierat

V prípade hlodavcov by mala byť teplota v miestnosti pre zvieratá 22 °C (± 3 °C). Hoci ideálna relatívna vlhkosť by mala byť 50 – 60 %, mala by dosahovať minimálne 40 % a podľa možnosti by nemala presiahnuť 70 % inokedy než počas čistenia miestnosti. Osvetlenie by malo byť umelé so striedaním 12 hodín svetla a 12 hodín tmy. Na kŕmenie sa môže používať bežné laboratórne krmivo s neobmedzeným prísunom pitnej vody. Výber krmiva môže byť ovplyvnený potrebou zabezpečiť vhodnú prímes testovanej chemikálie, keď sa podáva týmto spôsobom. Hlodavce by mali byť umiestnené do malých skupín (najviac päť zvierat na jednu klietku) rovnakého pohlavia a ovplyvnenej skupiny, pokiaľ sa nepredpokladá žiadne agresívne správanie, pričom sa uprednostňujú klietky s pevnou podlahou a vhodne obohateným prostredím. Zvieratá môžu byť umiestnené samostatne len vtedy, ak je to vedecky opodstatnené.

Príprava zvierat

Bežne sa používajú zdravé mladé dospelé zvieratá (pri hlodavcoch je ideálny vek 6 – 10 týždňov na začiatku ovplyvňovania, hoci je prijateľný aj trochu vyšší vek), ktoré sa náhodne rozdelia do kontrolných a ovplyvnených skupín. Každé zviera sa jednotlivo označí humánnou, minimálne invazívnou metódou (napr. krúžkovanie, označenie štítkom, aplikácia mikročipu alebo biometrická identifikácia, nie však skracovanie uší ani prstov) a aklimatizuje sa na laboratórne podmienky v priebehu minimálne piatich dní. Klietky sa usporiadajú tak, aby sa minimalizovali prípadné vplyvy spôsobené ich umiestnením. Malo by sa zabrániť krížovej kontaminácii pozitívnou kontrolou a testovanou chemikáliou. Na začiatku štúdie by mala byť hmotnostná variabilita zvierat minimálna a nemala by presiahnuť ± 20 % priemernej hmotnosti každého pohlavia.

Príprava dávok

Tuhé testované chemikálie by sa pred podávaním dávok zvieratám mali rozpustiť alebo rozptýliť vo vhodných rozpúšťadlách alebo nosičoch alebo primiešať do krmiva alebo pitnej vody. Kvapalné testované chemikálie sa môžu podávať priamo alebo ich pred podávaním možno rozriediť. V prípade inhalačných expozícií možno testované chemikálie v závislosti od ich fyzikálno-chemických vlastností podávať vo forme plynu, pary alebo aerosólu (tuhá látka/kvapalina). Pokiaľ sa v údajoch o stabilite neuvádza prijateľnosť skladovania a nevymedzujú sa jeho vhodné podmienky, testovaná chemikália by sa mala používať čerstvo pripravená.

Podmienky testu

Rozpúšťadlo/nosič

Rozpúšťadlo/nosič by nemali vyvolávať toxické účinky pri používaných dávkach a nemali by mať schopnosť chemicky reagovať s testovanou chemikáliou. Ak sa používajú iné ako dobre známe rozpúšťadlá/nosiče, ich použitie by mali podporiť referenčné údaje uvádzajúce ich kompatibilitu. Odporúča sa podľa možnosti najskôr zvážiť použitie vodného rozpúšťadla/nosiča. Príklady bežne používaných kompatibilných rozpúšťadiel/nosičov zahŕňajú vodu, fyziologický roztok, roztok metylcelulózy, roztok sodnej soli karboxymetylcelulózy, olivový olej a kukuričný olej. Ak neexistujú historické alebo zverejnené údaje o kontrolách, z ktorých vyplýva, že zvolené atypické rozpúšťadlo/nosič neindukuje tvorbu mikrojadier ani iné škodlivé účinky, mala by sa vykonať východisková štúdia s cieľom stanoviť prijateľnosť kontroly rozpúšťadla/nosiča.

Kontroly

Pozitívne kontroly

Do každého testu by sa za normálnych okolností mala zahrnúť skupina zvierat ovplyvnená chemikáliou na pozitívnu kontrolu. Možno od toho upustiť v prípade, že skúšobné laboratórium preukázalo spôsobilosť pri vykonávaní testu a stanovilo rozsah historických pozitívnych kontrol. Ak nie je zahrnutá súbežná pozitívna kontrolná skupina, do každého pokusu by sa mali zahrnúť kontroly hodnotenia (fixované a nezafarbené podložné sklíčka alebo vzorky bunkovej suspenzie, podľa toho, čo je pre danú metódu hodnotenia vhodné). Možno ich získať tak, že sa do hodnotenia štúdie zahrnú vhodné referenčné vzorky získané a uchované zo samostatného pokusu s pozitívnou kontrolou, ktorý sa vykonáva periodicky (napr. každých 6 až 18 mesiacov); napríklad počas testovania spôsobilosti a potom pravidelne, podľa potreby.

Chemikálie na pozitívnu kontrolu by mali spoľahlivo vyvolať zistiteľný nárast frekvencie mikrojadier nad spontánnu úroveň. Pri manuálnom hodnotení pomocou mikroskopu by sa dávky pozitívnej kontroly mali zvoliť tak, aby boli účinky zjavné, ale aby hodnotiteľovi priamo neodhaľovali identitu kódovaných vzoriek. Je prijateľné, aby sa pozitívne kontroly podávali inou cestou ako testovaná chemikália, na základe iného harmonogramu ovplyvňovania a aby sa vzorky odoberali len jeden raz. V náležitých prípadoch možno na pozitívnu kontrolu takisto zvážiť použitie chemikálií rovnakej chemickej triedy. Príklady chemikálií na pozitívnu kontrolu sú uvedené v tabuľke 1

Tabuľka 1

Príklady chemikálií na pozitívnu kontrolu:

Chemikálie a CAS čísla

etyl-metánsulfonát [CAS číslo 62-50-0]

metyl-metánsulfonát [CAS číslo 66-27-3]

N-etyl-N-nitrózomočovina [CAS číslo 759-73-9]

mitomycín C [CAS číslo 50-07-7]

cyklofosfamid (monohydrát) [CAS číslo 50-18-0 (CAS číslo 6055-19-2)]

tretamín [CAS číslo 51-18-3]

kolchicín [CAS číslo 64-86-8] alebo vinblastín [CAS číslo 865-21-4] – ako aneugény

Negatívne kontroly

Zvieratá v negatívnych kontrolných skupinách by mali byť zahrnuté do každého odberu a inak by sa s nimi malo zaobchádzať rovnako ako s ovplyvnenými skupinami, nebudú však ovplyvnené testovanou chemikáliou. Ak sa pri podávaní testovanej chemikálie použije rozpúšťadlo/nosič, kontrolná skupina by mala dostať toto rozpúšťadlo/nosič. Ak sa však na základe historických údajov negatívnych kontrol pri každom odbere vzoriek v danom skúšobnom laboratóriu preukážu konzistentné údaje o variabilite medzi zvieratami a o frekvenciách buniek s mikrojadrami, môže byť pre negatívnu kontrolu potrebný len jeden odber. Ak sa na negatívne kontroly použije len jeden odber, mal by to byť odber vykonaný prvý raz v tejto štúdii.

Ak sa použije periférna krv, je namiesto súbežnej negatívnej kontroly prijateľná vzorka pred ovplyvnením, a to v prípade krátkych štúdií, keď sú výsledné údaje v súlade s databázou historických kontrol skúšobného laboratória. Preukázalo sa, že v prípade potkanov má odber vzoriek malých objemov (napr. menej ako 100 μl/deň) pred ovplyvnením minimálny vplyv na frekvenciu mikrojadier v pozadí (25).

POSTUP

Počet zvierat a ich pohlavie

Vo všeobecnosti je reakcia vo forme mikrojadier u samcom a samíc podobná, a preto by sa väčšina štúdií mohla vykonávať so zvieratami ktoréhokoľvek pohlavia (26). Údaje, ktoré preukazujú relevantné rozdiely medzi samcami a samicami (napr. rozdiely v systémovej toxicite, metabolizme, biodostupnosti, toxicite kostnej drene atď. vrátane napr. štúdie na zistenie rozsahu), by boli v prospech používania oboch pohlaví. V takomto prípade môže byť vhodné vykonať štúdiu na oboch pohlaviach, a to napr. ako súčasť štúdie toxicity pri opakovaných dávkach. Ak sa použijú obe pohlavia, mohlo by byť vhodné použiť faktoriálny návrh. Podrobnosti o analýze údajov s použitím tohto návrhu sú uvedené v dodatku 2.

Mala by sa stanoviť veľkosť skupín na začiatku štúdie s cieľom poskytnúť minimálne 5 analyzovateľných zvierat jedného pohlavia alebo, ak sa použijú zvieratá oboch pohlaví, 5 z každého pohlavia za skupinu. Ak je možné, že vystavenie ľudí účinkom chemikálií závisí od pohlavia, ako napríklad v prípade niektorých liekov, test by sa mal vykonať na jedincoch príslušného pohlavia. Ako smerná hodnota v prípade bežných požiadaviek na maximálny počet zvierat by štúdia kostnej drene vykonaná podľa parametrov stanovených v bode 37 s troma dávkovými skupinami a so súbežnými negatívnymi a pozitívnymi kontrolami (každá skupina zložená z piatich zvierat jedného pohlavia) vyžadovala 25 a 35 zvierat.

Úrovne dávok

Ak sa z dôvodu, že ešte nie sú dostupné vhodné údaje na pomoc pri výbere dávky, vykoná predbežná štúdia na zistenie rozsahu, mala by sa vykonať v tom istom laboratóriu s použitím toho istého druhu, kmeňa, pohlavia a dávkovacej schémy, aké majú byť použité v hlavnej štúdii (27). Štúdia by sa mala zamerať na zistenie maximálnej tolerovanej dávky (MTD) definovanej ako najvyššia dávka, ktorá sa bude tolerovať bez dôkazu toxicity obmedzujúcej štúdiu, a to vzhľadom na trvanie štúdie [napr. indukovaním zníženia telesnej hmotnosti alebo hematopoetickej systémovej cytotoxicity, ale nie smrti ani znakov bolesti, utrpenia či stavu, ktorý si vyžaduje humánnu eutanáziu (28)].

Najvyššiu dávku možno takisto definovať ako dávka, ktorá spôsobuje toxicitu v kostnej dreni (napr. zníženie podielu nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov v kostnej dreni alebo v periférnej krvi o viac než 50 %, no nie na menej než 20 % kontrolnej hodnoty). Pri analýze CD71 pozitívnych buniek v periférnom krvnom obehu (t. j. prietokovou cytometrickou analýzou) však táto veľmi mladá frakcia nezrelých erytrocytov reaguje na toxické výzvy rýchlejšie než väčší RNA pozitívny kohort nezrelých erytrocytov. Preto môže byť zjavná vyššia toxicita evidentná pri plánoch akútnej expozície na skúmanie frakcie CD71 pozitívnych nezrelých erytrocytov v porovnaní s tými, ktoré označujú nezrelé erytrocyty na základe obsahu RNA. Z tohto dôvodu, ak v rámci pokusov prebieha ovplyvnenie päť alebo menej dní, najvyššiu dávku testovaných chemikálií spôsobujúcich toxicitu možno definovať ako dávku, ktorá spôsobuje štatisticky významné zníženie podielu CD71 pozitívnych nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov, no nie na menej než 5 % kontrolnej hodnoty (29).

Chemikálie, ktoré vykazujú saturáciu toxikokinetických vlastností alebo indukujú detoxikačné procesy, ktoré môžu viesť k zníženiu expozície po dlhodobom podávaní, môžu byť vyňaté z kritérií na stanovenie dávok a mali by sa hodnotiť jednotlivo.

Na získanie informácií o reakcii na dávku by kompletná štúdia mala zahŕňať negatívnu kontrolnú skupinu a minimálne tri úrovne dávok vo všeobecnosti oddelené faktorom 2, ale nie vyšším ako 4. Ak testovaná chemikália nevyvoláva na základe štúdie na zistenie rozsahu alebo na základe existujúcich údajov toxicitu, najvyššia dávka pri 14-dňovom alebo dlhšom období podávania by mala byť 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň alebo 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň v prípade obdobia podávania kratšieho ako 14 dní. Ak však testovaná chemikália spôsobuje toxicitu, maximálna tolerovaná dávka by mala byť najvyššia podávaná dávka a použité úrovne dávky by mali podľa možnosti pokrývať rozsah od maximálnej dávky po dávku, ktorá spôsobuje slabú alebo nespôsobuje žiadnu toxicitu. Ak sa zistí toxicita v cieľovom tkanive (kostná dreň) pri všetkých testovaných úrovniach dávok, odporúča sa vykonanie ďalšej štúdie s netoxickými dávkami. Štúdie, ktorých cieľom je podrobnejšie charakterizovať kvantitatívne informácie o reakcii na dávku, môžu vyžadovať dodatočné dávkové skupiny. V prípade určitých druhov testovaných chemikálií (napr. humánne lieky), na ktoré sa vzťahujú osobitné požiadavky, sa tieto limity môžu líšiť.

Limitný test

Ak pokusy na stanovenie rozsahu dávok alebo existujúce údaje týkajúce sa súvisiacich kmeňov zvierat naznačujú, že dávkovacia schéma, aspoň pokiaľ ide o limitujúcu dávku (opísanú ďalej v texte), nespôsobuje žiadne pozorovateľné toxické účinky, (vrátane žiadneho poklesu proliferácie kostnej drene ani iný dôkaz cytotoxicity v cieľovom tkanive), a ak by sa genotoxicita na základe in vitro štúdií genotoxicity alebo na základe údajov týkajúcich sa štrukturálne príbuzných chemikálií neočakávala, potom nemusí byť potrebná úplná štúdia s použitím troch úrovní dávok, ak sa ukázalo, že testovaná(-é) chemikália(-e) dosahuje(-ú) cieľové tkanivo (kostná dreň). V takýchto prípadoch môže byť postačujúca jedna dávka na úrovni limitujúcej dávky. Ak sa chemikália podáva počas 14 dní alebo dlhšie, limitujúca dávka predstavuje 1 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň. V prípade období podávania chemikálie kratších než 14 dní predstavuje limitujúca dávka 2 000 mg/kg telesnej hmotnosti/deň.

Podávanie dávok

Pri plánovaní skúšky by sa mal zvážiť predpokladaný spôsob vystavenia ľudí. Preto možno zvoliť spôsoby vystavenia, ako napríklad prostredníctvom stravy, pitnej vody, topickou, subkutánnou cestou, intravenózne, perorálne (pomocou sondy), inhalačne, intratracheálne alebo implantačne, ako opodstatnené spôsoby. V každom prípade by sa mal zvoliť spôsob, ktorým sa zabezpečí primeraná vystavenie cieľového(-ých) tkaniva(-ív). Vo všeobecnosti sa neodporúča použitie intraperitoneálnej injekcie, keďže to nie je zamýšľaný spôsob vystavenia ľudí, a mal by sa použiť iba v prípade, že je k dispozícii osobitné vedecké zdôvodnenie. Ak je testovaná chemikália primiešaná do krmiva alebo pitnej vody, najmä v prípade jednej dávky, treba venovať pozornosť tomu, aby sa medzi spotrebou potravy a vody a odberom vzorky ponechal dostatočný čas, aby sa umožnilo zistenie účinkov (pozri bod 37). Maximálny objem kvapaliny, ktorá sa môže naraz podávať sondou alebo injekciou, závisí od veľkosti testovaného zvieraťa. Objem by za bežných okolností nemal prekročiť 1 ml/100 g telesnej hmotnosti okrem vodných roztokov, pri ktorých sa môže použiť najviac 2 ml/100 g. Požitie väčších ako uvedených objemov by malo byť opodstatnené. S výnimkou dráždivých alebo žieravých testovaných chemikálií, ktoré pri vyšších koncentráciách zvyčajne zhoršia účinky, by sa variabilita v testovanom objeme mala minimalizovať tým, že sa koncentrácia upraví tak, aby sa na všetkých úrovniach dávok zabezpečil stály objem vo vzťahu k telesnej hmotnosti.

Harmonogram ovplyvňovania

Uprednostňujú sa 2 alebo viaceré ovplyvnenia v 24-hodinových intervaloch, najmä v prípade začlenenia tohto testu do iných toxikologických štúdií toxicity. Alternatívou môže byť jednorazové ovplyvnenie, ak je vedecky opodstatnené (napr. testované chemikálie známe ako blokátory bunkového cyklu). Testované chemikálie môžu byť podávané v rozdelenej dávke, t. j. dve alebo viaceré ovplyvnenia v jeden deň s časovým odstupom najviac 2 – 3 hodiny, čím sa uľahčí podávanie veľkého objemu chemikálie. Za týchto okolností alebo pri podávaní testovanej chemikálie inhalačne by sa čas odberu vzoriek mal naplánovať na základe posledného podania dávky alebo skončenia vystavenia.

Test sa môže vykonať na myšiach alebo potkanoch jedným z týchto troch spôsobov:

Iné režimy podávania dávok alebo odberu vzoriek možno použiť vtedy, ak je to relevantné a vedecky opodstatnené, a s cieľom uľahčiť spojenie s inými testami toxicity.

Pozorovania

Najmenej raz denne by sa mali vykonať všeobecné klinické pozorovania testovaných zvierat a zaznamenať klinické príznaky, najlepšie každý deň v rovnakom čase a s ohľadom na časový interval najintenzívnejších predpokladaných účinkov po podaní dávky. Počas obdobia podávania dávok je potrebné aspoň dvakrát denne sledovať chorobnosť a úmrtnosť zvierat. Všetky zvieratá by sa mali odvážiť na začiatku štúdie, aspoň raz za týždeň počas štúdií s opakovanou dávkou a potom pri utratení. V prípade štúdií, ktoré trvajú aspoň jeden týždeň, by sa malo aspoň raz za týždeň vykonať meranie spotreby potravy. Ak sa testovaná chemikália podáva v pitnej vode, spotreba vody by sa mala merať pri každej výmene vody a aspoň raz za týždeň. Zvieratá, ktoré vykazujú neletálne ukazovatele nadmernej toxicity, by mali byť humánne utratené pred ukončením testovacieho obdobia (28). Za určitých okolností by sa mohla monitorovať telesná teplota zvierat, keďže hypertermia a hypotermia vyvolané ovplyvnením mohli prispieť k falošným výsledkom (32) (33) (34).

Vystavenie cieľového tkaniva

Vzorka krvi by sa mala odobrať vo vhodnom(-ých) čase(-och), aby bolo možné preskúmať úrovne testovaných chemikálií v plazme na účely preukázania, že došlo k vystaveniu kostnej drene, ak je to opodstatnené a ak neexistujú iné údaje o expozícii (pozri bod 48).

Preparát kostnej drene/krvi

Bunky kostnej drene sa zvyčajne získavajú zo stehnových kostí (femur) alebo píšťal (tibia) zvierat ihneď po humánnej eutanázii. Bunky sa zvyčajne odoberú, pripravia sa z nich preparáty a zafarbia sa použitím zavedených metód. Malé objemy periférnej krvi možno získať v súlade s primeranými normami týkajúcimi sa dobrých podmienok zvierat, a to buď pomocou metódy, ktorá umožňuje prežitie testovaného zvieraťa, ako je napríklad získanie krvi z chvostovej žily alebo inej vhodnej žily, alebo srdcovou punkciou alebo odberom vzoriek z veľkej cievy pri utratení zvierat. V prípade erytrocytov získaných z kostnej drene alebo periférnej krvi možno bunky v závislosti od metódy analýzy ihneď supravitálne zafarbiť (16) (17) (18), bunky sa rozotrú na podložnom sklíčku a vzniknuté preparáty sa zafarbia a mikroskopicky vyhodnotia, alebo sa fixujú a vhodne zafarbia na účely prietokovej cytometrickej analýzy. Použitie farbiva so špecifickou väzbou na DNA [napríklad akridínová oranžová (35) alebo Hoechst 33258 plus pyronín-Y (36)] môže eliminovať niektoré umelo vzniknuté štruktúry buniek spojené s používaním farbiva bez špecifickej väzby na DNA. Táto výhoda nebráni používaniu konvenčných farbív (napríklad Giemsa na účely mikroskopickej analýzy). Použiť možno takisto dodatočné systémy [napríklad celulózové kolóny na odstránenie buniek s jadrom (37) (38)], a to za predpokladu, že sa preukázala kompatibilita týchto systémov s prípravou vzoriek v laboratóriu.

Ak sú tieto metódy uplatniteľné, na identifikáciu povahy mikrojadier (chromozómy/fragmenty chromozómov) s cieľom zistiť, či je mechanizmus indukcie mikrojadier dôsledkom klastogénnych a/alebo aneugénnych procesov, možno použiť protilátky kinetochoru (39), FISH s pancentromérovými sondami DNA (40) alebo značenie in situ pomocou primerov špecifických pre pancentroméru spolu s vhodným odfarbovacím roztokom DNA (41). Na rozlišovanie medzi klastogénmi a aneugénmi možno použiť aj iné metódy, ak sa ukázalo, že sú účinné.

Analýza (ručná a automatizovaná)

Všetky sklíčka alebo vzorky na analýzu vrátane pozitívnych a negatívnych kontrol by sa mali pred každou analýzou nezávisle označiť kódmi a mali by byť náhodné, aby hodnotiaci používajúci manuálnu metódu nebol oboznámený s podmienkami ovplyvnenia; takéto kódovanie nie je potrebné pri automatizovaných systémoch hodnotenia, ktoré sa neopierajú o vizuálnu kontrolu a nemôžu byť ovplyvnené zaujatosťou prevádzkovateľa. Pri každom zvierati sa stanovuje podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov (zrelých plus nezrelých), pričom sa počíta celkovo najmenej 500 erytrocytov v prípade kostnej drene a 2 000 erytrocytov v prípade periférnej krvi (42). Pri výskyte nezrelých erytrocytov s mikrojadrami by sa malo hodnotiť aspoň 4 000 nezrelých erytrocytov na jedno zviera (43). Ak databáza historických negatívnych kontrol naznačuje, že priemerná hodnota pozaďovej frekvencie nezrelých erytrocytov s mikrojadrami je < 0,1 % v skúšobnom laboratóriu, malo by sa zvážiť hodnotenie dodatočných buniek. Pri analyzovaní vzoriek by podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov u ovplyvnených zvierat nemal byť nižší ako 20 % podielu kontroly nosiča/rozpúšťadla pri mikroskopickom hodnotení a zároveň by nemal byť nižší než približne 5 % podielu kontroly nosiča/rozpúšťadla pri hodnotení CD71+ nezrelých erytrocytov cytometrickými metódami (pozri bod 31) (29). Napríklad ak je v prípade skúšky kostnej drene hodnotenej mikroskopicky podiel nezrelých erytrocytov v kostnej dreni 50 %, horná hranica toxicity by bola 10 % nezrelých erytrocytov.

Pretože potkania slezina vychytáva a ničí erytrocyty s mikrojadrami, je na zachovanie vysokej citlivosti skúšky pri analýze periférnej krvi potkanov vhodnejšie obmedziť analýzu nezrelých erytrocytov s mikrojadrami na najmladšiu frakciu. Ak sa použijú automatizované metódy analýzy, možno tieto najmenej zrelé erytrocyty identifikovať na základe ich vysokého obsahu RNA alebo vysokej úrovne transferínových receptorov (CD71+) na ich povrchu (31). Z priameho porovnania rôznych metód farbenia však vyplýva, že uspokojivé výsledky možno dosiahnuť rôznymi spôsobmi vrátane konvenčného farbenia pomocou farbiva akridínová oranžová (3) (4).

PREZENTOVANIE VÝSLEDKOV

Spracovanie výsledkov

Údaje o jednotlivých zvieratách by sa mali uvádzať v tabuľkovej forme. Pri každom zvierati podrobenom analýze by sa mal samostatne uviesť počet hodnotených nezrelých erytrocytov, počet nezrelých erytrocytov s mikrojadrami a podiel nezrelých erytrocytov na celkovom počte erytrocytov. V prípade, že sa myši ovplyvňujú nepretržite počas 4 týždňov alebo dlhšie, mali by sa uvádzať aj údaje o počte a podiele zrelých erytrocytov s mikrojadrami, ak boli odobraté. Mali by sa uvádzať aj údaje o toxicite a klinických príznakoch u zvierat.

Kritériá prijateľnosti

Prijateľnosť testu určujú tieto kritériá:

Vyhodnotenie a výklad výsledkov

Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jasne pozitívnu, ak:

Ak sa preskúma len najvyššia dávka v konkrétnom čase odberu vzorky, testovaná chemikália sa pokladá za jasne pozitívnu, ak dôjde k štatisticky významnému zvýšeniu v porovnaní so súbežnou negatívnou kontrolou a výsledky sú mimo rozdelenia historických údajov negatívnych kontrol (napr. 95 % regulačné medze podľa Poissonovho rozdelenia). Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno nájsť v literatúre (44) (45) (46) (47). Pri vykonávaní analýzy vzťahu medzi dávkou a reakciou by sa mali analyzovať aspoň tri ovplyvnené dávkové skupiny, v rámci ktorých sa podáva určitá dávka. Pri štatistických testoch by sa malo zviera použiť ako experimentálna jednotka. Pozitívne výsledky mikrojadrového testu naznačujú, že testovaná chemikália indukuje mikrojadrá, ktoré sú výsledkom chromozómového poškodenia alebo poškodenia mitotického aparátu v erytroblastoch testovaného druhu. V prípade, že sa vykonal test na zistenie centromér v mikrojadrách, testovaná chemikália, ktorá produkuje mikrojadrá obsahujúce centroméry (centromérická DNA alebo kinetochor, ktoré sú príznačné pre stratu celých chromozómov), je dôkazom toho, že testovaná chemikália je aneugén.

Za predpokladu, že sú splnené všetky kritériá prijateľnosti, testovaná chemikália sa pokladá za jasne negatívnu, ak pri všetkých preskúmaných podmienkach pokusu platí, že:

Odporúčania týkajúce sa najvhodnejších štatistických metód možno nájsť v literatúre (44) (45) (46) (47). Ako dôkaz o vystavení kostnej drene účinkom testovanej chemikálie môže slúžiť zníženie pomeru medzi nezrelými a zrelými erytrocytmi alebo meranie hladín testovanej chemikálie v plazme alebo krvi. V prípade intravenózneho podania nie je potrebný dôkaz o vystavení. Alternatívne možno na preukázanie vystavenia kostnej drene použiť údaje ADME získané v nezávislej štúdii s použitím tej istej cesty podania a toho istého druhu. Negatívne výsledky naznačujú, že testovaná chemikália za daných testovacích podmienok nevytvára mikrojadrá v nezrelých erytrocytoch testovaného druhu.

Neexistuje požiadavka na overenie jasnej pozitívnej alebo negatívnej reakcie.

V prípadoch, keď reakcia nie je jasne negatívna ani pozitívna, a s cieľom pomôcť stanoviť biologickú relevantnosť výsledku (napr. slabé alebo hraničné zvýšenie), by na posúdenie údajov malo slúžiť odborné posúdenie a/alebo ďalšie skúmanie vykonaných pokusov. V niektorých prípadoch by mohlo byť užitočné vykonať analýzu viacerých buniek alebo zopakovať pokus s pozmenenými podmienkami.

V zriedkavých prípadoch, dokonca aj po ďalších skúmaniach, údaje neumožnia vyvodiť záver, že testované chemikálie vedú k negatívnym alebo pozitívnym výsledkom, a preto sa štúdia uzavrie ako štúdia „s nejasným výsledkom“.

Skúšobný protokol

Skúšobný protokol by mal zahŕňať tieto informácie:

LITERATÚRA

6.

V časti B sa vypúšťa kapitola B.15.

7.

V časti B sa vypúšťa kapitola B.16.

8.

V časti B sa vypúšťa kapitola B.18.

9.

V časti B sa vypúšťa kapitola B.19.

10.

V časti B sa vypúšťa kapitola B.20.

11.

V časti B sa vypúšťa kapitola B.24.

12.

V časti B sa kapitola B.47 nahrádza takto:

„B.47   Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na identifikáciu i) chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí a ii) chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí

ÚVOD

Táto testovacia metóda je rovnocenná s usmernením OECD na vykonávanie testov (TG) 437 (2013). Testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky ohodnotil Medziagentúrny koordinačný výbor pre validáciu alternatívnych metód (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ICCVAM) v spojení s Európskym centrom pre validáciu alternatívnych metód (European Centre for the Validation of Alternative Methods, ECVAM) a Japonským centrom pre validáciu alternatívnych metód (Japanese Center for the Validation of Alternative Methods, JaCVAM) v rokoch 2006 a 2010 (1)(2). V prvom hodnotení bola testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky hodnotená z hľadiska užitočnosti pri identifikácii chemikálií (látok a zmesí), ktoré vyvolávajú vážne poškodenie očí (1). V druhom hodnotení bola uvedená testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky hodnotená z hľadiska užitočnosti pri identifikácii chemikálií (látok a zmesí), ktoré nie sú klasifikované ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí (2). Validačná databáza testovacích metód zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky zahŕňala spolu 113 látok a 100 zmesí (2)(3). Z týchto hodnotení a ich partnerského preskúmania sa vyvodil záver, že testovacou metódou možno správne identifikovať chemikálie (látky aj zmesi), ktoré vyvolávajú vážne poškodenie očí (kategória 1), ako aj chemikálie, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí, ako sa definuje v Globálnom harmonizovanom systéme klasifikácie a označovania chemikálií (GHS) Organizácie spojených národov (OSN) (4) a v nariadení (ES) č. 1272/2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí (nariadenie CLP) (7), a preto bola schválená ako vedecky platná na oba účely. Vážne poškodenie očí je vyvolanie poškodenia tkaniva v oku alebo vážne fyzické zhoršenie zraku po aplikácii testovanej chemikálie na predný povrch oka, ktoré nie je úplne reverzibilné do 21 dní po aplikácii. Testované chemikálie vyvolávajúce vážne poškodenie očí sa podľa GHS OSN klasifikujú ako kategória 1. Chemikálie neklasifikované ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí sú definované ako chemikálie, ktoré nespĺňajú požiadavky na klasifikáciu v kategórii 1 alebo 2 GHS OSN (2A alebo 2B), t. j. uvádzajú sa ako chemikálie „bez kategórie“ v zmysle GHS OSN. Táto testovacia metóda zahŕňa odporúčané použitie a obmedzenia testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na základe jej hodnotení. Hlavné rozdiely medzi pôvodnou verziou usmernenia OECD na vykonávanie testov z roku 2009 a jeho aktualizovanou verziou z roku 2013 sa okrem iného vzťahujú na: použitie testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu podľa GHS OSN (body 2 a7); objasnenie uplatniteľnosti testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na testovanie alkoholov, ketónov a tuhých látok (body 6 a 7) a látok a zmesí (bod 8); objasnenie toho, ako by sa mali testovať povrchovo aktívne látky (surfaktanty) a zmesi, ktoré obsahujú povrchovo aktívne látky (bod 28); aktualizácie a objasnenia týkajúce sa pozitívnych kontrol (body 39 a 40); aktualizáciu rozhodovacích kritérií, pokiaľ ide o testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky (bod 47); aktualizáciu kritérií prijateľnosti štúdie (bod 48); aktualizáciu prvkov skúšobného protokolu (bod 49); aktualizáciu dodatku 1, pokiaľ ide o definície; doplnenie dodatku 2 o prediktívnej schopnosti testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky v rámci rôznych klasifikačných systémov; aktualizáciu dodatku 3, pokiaľ ide o zoznam chemikálií na preukázanie spôsobilosti a aktualizáciu dodatku 4, pokiaľ ide o držiak rohovky testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky (bod 1) a o opacitometer (body 2 a 3).

V súčasnosti sa všeobecne uznáva, že ani jediný in vitro test očnej dráždivosti nedokáže v blízkej budúcnosti nahradiť Draizov in vivo očný test slúžiaci na predpovedanie celého radu podráždení pri rôznych triedach chemikálií. Je však možné, že Draizov očný test dokážu nahradiť strategické kombinácie niekoľkých alternatívnych testovacích metód v rámci (viacstupňovej) testovacej stratégie (5). Prístup zhora nadol (5) je určený na použitie vtedy, keď sa na základe existujúcich informácií očakáva, že chemikália bude mať veľký potenciál spôsobiť podráždenie, zatiaľ čo prístup zdola nahor (5) sa má použiť vtedy, keď sa na základe existujúcich informácií očakáva, že chemikália spôsobí podráždenie očí v dostatočnej miere na to, aby si vyžadovala klasifikáciu. Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky je in vitro testovacia metóda, ktorú možno použiť za určitých okolností a so špecifickými obmedzeniami, pokiaľ ide o klasifikáciu chemikálií z hľadiska ich nebezpečnosti pre oči a ich označovanie. Hoci sa testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky nepokladá za platnú samostatnú náhradu za očný test in vivo na králikoch, odporúča sa ako úvodný krok v rámci testovacej stratégie, ako je prístup zhora nadol, ktorý odporúča Scott et al. (5) na identifikáciu chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí, t. j. chemikálií, ktoré sa majú klasifikovať ako kategória 1 GHS OSN bez ďalšieho testovania (4). Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa takisto odporúča na identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí podľa definície GHS OSN (bez kategórie v zmysle GHS OSN) (4) v rámci testovacej stratégie, ako je prístup zdola nahor (5). Chemikália, o ktorej sa na základe testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky nepredpokladá, že spôsobí vážne poškodenie očí alebo že nebude klasifikovaná ako chemikália spôsobujúca podráždenie/vážne poškodenie očí, by si však na stanovenie konečnej klasifikácie vyžadovala ďalšie testovanie (in vitro a/alebo in vivo).

Účelom tejto testovacej metódy je opísať postupy používané na hodnotenie potenciálu testovanej chemikálie predstavovať nebezpečnosť pre oči, a to na základe merania jej schopnosti vyvolať zákal a zvýšenú priepustnosť v izolovanej hovädzej rohovke. Toxické účinky na rohovku sa merajú: i) zníženou priepustnosťou svetla (zákalom) a ii) zvýšeným prepúšťaním farbiva fluoresceínu sodného (priepustnosťou). Výsledky posudzovania zákalu a priepustnosti rohovky po vystavení účinkom testovanej chemikálie sa skombinujú a odvodí sa z nich skóre in vitro dráždivosti (In Vitro Irritancy Score, IVIS), ktoré sa používa na klasifikáciu úrovne dráždivosti testovanej chemikálie.

Definície sa uvádzajú v dodatku 1.

ÚVODNÉ ÚVAHY A OBMEDZENIA

Táto testovacia metóda vychádza z protokolu testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky ICCVAM (6)(7), ktorý bol pôvodne vypracovaný na základe informácií z protokolu Inštitútu pre vedy in vitro a z protokolu INVITTOX 124 (8). Protokol INVITTOX 124 predstavuje protokol používaný pri predbežnej validačnej štúdii, ktorú financovalo Európske spoločenstvo a ktorá prebehla v rokoch 1997 – 1998. Obidva protokoly vychádzajú z testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky, ktorú prvýkrát zverejnil Gautheron et al. (9).

Testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky možno použiť na identifikáciu chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí v zmysle GHS OSN, t. j. chemikálií, ktoré sa majú klasifikovať ako chemikálie kategórie 1 GHS OSN (4). Keď sa testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky používa na tento účel, vykazuje celkovú presnosť 79 % (150/191), mieru falošnej pozitivity 25 % (32/126) a mieru falošnej negativity 14 % (9/65) v porovnaní s údajmi z metódy očného testu in vivo na králikoch s klasifikáciou podľa klasifikačného systému GHS OSN (3) (pozri dodatok 2 tabuľku 1). Keď sa testované chemikálie v rámci určitých chemických (t. j. alkoholy, ketóny) alebo fyzikálnych (t. j. tuhé látky) tried vylúčia z databázy, testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky vykazuje podľa klasifikačného systému GHS OSN celkovú presnosť 85 % (111/131), mieru falošnej pozitivity 20 % (16/81), a mieru falošnej negativity 8 % (4/50) (3). Potenciálne nedostatky testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky pri jej použití na identifikáciu chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí (kategória 1 GHS OSN) spočívajú vo vysokej miere falošnej pozitivity pri alkoholoch a ketónoch a vysokej miere falošnej negativity pri tuhých látkach, ktoré sa zistili vo validačnej databáze (1)(2)(3). Avšak vzhľadom na to, že nie všetky alkoholy a ketóny sú testovacou metódou zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky nadhodnotené a o niektorých sa správne predpokladalo zaradenie do kategórie 1 GHS OSN, nepokladajú sa tieto dve organické funkčné skupiny sa za skupiny mimo oblasti uplatniteľnosti tejto testovacej metódy. Používateľ tejto testovacej metódy sa bude musieť rozhodnúť, či v prípade alkoholov a ketónov možno prípadný nadhodnotený predpoklad akceptovať, alebo či by sa malo vykonať ďalšie testovanie formou analýzy váhy dôkazov. Pokiaľ ide o miery falošnej negativity v prípade tuhých látok, malo by sa poznamenať, že tuhé látky môžu pri Draizovom in vivo teste očnej dráždivosti viesť k premenlivým a extrémnym podmienkam expozície, dôsledkom čoho môžu byť predpoklady týkajúce sa ich skutočného potenciálu spôsobiť podráždenie irelevantné (10). Malo by sa takisto uviesť, že falošne negatívne výsledky identifikované vo validačnej databáze ICCVAM (2)(3) v súvislosti s identifikáciou chemikálií vyvolávajúcich vážne poškodenie očí (kategória 1 GHS OSN) v žiadnom prípade neviedli k hodnote IVIS ≤ 3, čo je kritérium používané na identifikáciu testovanej chemikálie ako chemikálie bez kategórie v zmysle GHS OSN. Okrem toho falošné negatívne výsledky testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky v tejto súvislosti nie sú rozhodujúce, keďže všetky testované chemikálie, ktoré vedú k hodnote 3 < IVIS ≤ 55, by sa následne testovali pomocou iných adekvátne validovaných in vitro testov, alebo – ako posledná možnosť na králikoch, v závislosti od regulačných požiadaviek pomocou stratégie postupného testovania v rámci analýzy váhy dôkazov. Vzhľadom na skutočnosť, že v prípade niektorých tuhých chemikálií sa na základe testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky správne predpokladá ich zaradenie do kategórie 1 GHS OSN, nepovažuje sa ani toto fyzikálne skupenstvo za nachádzajúce sa mimo oblasti uplatniteľnosti testovacej metódy. Výskumní pracovníci by mohli zvážiť použitie tejto testovacej metódy pri všetkých typoch chemikálií, pričom hodnota IVIS > 55 by sa mala prijať ako indikátor reakcie vyvolávajúcej vážne poškodenie očí, na základe čoho by sa mala uplatniť klasifikácia v kategórii 1 GHS OSN bez ďalšieho testovania. Ako už bolo uvedené, pozitívne výsledky získané v prípade alkoholov alebo ketónov by sa však mali interpretovať opatrne, v dôsledku prípadného nadhodnotenia.

Testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky možno takisto použiť na identifikáciu chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí podľa klasifikácie GHS OSN (4). Keď sa testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky používa na tento účel, vykazuje celkovú presnosť 69 % (135/196), mieru falošnej pozitivity 69 % (61/89), a mieru falošnej negativity 0 % (0/107) v porovnaní s údajmi o metóde očného testu in vivo na králikoch s klasifikáciou podľa klasifikačného systému GHS OSN (3) (pozri dodatok 2 tabuľku 2). Zistená miera falošnej pozitivity (chemikálie bez kategórie v zmysle GHS OSN na základe testov in vivo s hodnotou IVIS > 3, pozri bod 47) je značne vysoká, no v tejto súvislosti nie je rozhodujúca, keďže všetky testované chemikálie, ktoré vedú k hodnote 3 < IVIS ≤ 55, by sa následne testovali pomocou iných adekvátne validovaných in vitro testov, alebo – ako posledná možnosť na králikoch, v závislosti od regulačných požiadaviek pomocou stratégie postupného testovania v rámci analýzy váhy dôkazov. Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky nevykazuje žiadne osobitné nedostatky v súvislosti s testovaním alkoholov, ketónov a tuhých látok, keď je jej účelom identifikovať chemikálie, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí (bez kategórie v zmysle GHS OSN) (3). Výskumní pracovníci by mohli zvážiť použitie tejto testovacej metódy v prípade všetkých typov chemikálií, pričom negatívny výsledok (IVIS ≤ 3) by sa mal prijať ako indikátor toho, že nie je potrebná klasifikácia (bez kategórie v zmysle GHS OSN). Keďže testovacou metódou zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky možno správne identifikovať len 31 % chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí, nemala by byť táto testovacia metóda prvou voľbou na iniciovanie prístupu zdola nahor, ak sú dostupné iné validované a uznané in vitro metódy s podobným stupňom citlivosti, no vyššou špecifickosťou.

Validačná databáza testovacích metód zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky obsahovala spolu 113 látok a 100 zmesí (2)(3). Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa preto považuje za metódu uplatniteľnú na látky, ako aj zmesi.

Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa neodporúča na identifikáciu testovaných chemikálií, ktoré by sa mali klasifikovať ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí (kategória 2 alebo kategória 2A GHS OSN), alebo testovaných chemikálií, ktoré by sa mali klasifikovať ako chemikálie spôsobujúce mierne podráždenie očí (kategória 2B GHS OSN), vzhľadom na značné množstvo chemikálií kategórie 1 GHS OSN, ktoré sú zaradené do príliš nízkej kategórie, ako napr. kategória 2, 2A alebo 2B, a chemikálií bez kategórie v zmysle GHS OSN, ktoré sú zaradené do príliš vysokej kategórie, ako napr. kategória 2, 2A alebo 2B GHS OSN (2)(3). Na tento účel sa môže vyžadovať ďalšie testovanie pomocou inej vhodnej metódy.

Pri všetkých postupoch, pri ktorých sa používajú hovädzie oči a hovädzie rohovky, by sa mali dodržiavať platné nariadenia a postupy pre dané testovacie zariadenie v oblasti zaobchádzania s materiálom živočíšneho pôvodu, medzi ktoré okrem iného patria tkanivá a tkanivové tekutiny. Odporúčajú sa všeobecne platné laboratórne bezpečnostné opatrenia (11).

Zatiaľ čo pri testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa nezohľadňujú spojovkové a dúhovkové poškodenia, zohľadňujú sa v nej účinky na rohovku, ktoré sú hlavným faktorom klasifikácie in vivo pri klasifikácii v zmysle GHS OSN. Reverzibilitu lézií rohovky nemožno v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky posudzovať ako takú. Na základe štúdií na očiach králikov sa navrhlo, aby sa posúdenie počiatočnej hĺbky poškodenia rohovky mohlo používať na identifikáciu niektorých druhov ireverzibilných účinkov (12). Na porozumenie toho, ako dochádza k ireverzibilným účinkom, ktoré nesúvisia s počiatočným vysokým stupňom poškodenia, sú však potrebné ďalšie vedecké poznatky. Nakoniec treba poznamenať, že testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky neumožňuje posúdenie potenciálu systémovej toxicity súvisiacej s vystavením očí.

Táto testovacia metóda sa bude s prehodnocovaním nových informácií a údajov pravidelne aktualizovať. Napríklad v prípade potreby ucelenejšej charakteristiky poškodenia rohovky by prípadne mohla byť užitočná histopatológia. Podľa usmerňovacieho dokumentu OECD č. 160 (13) sa používateľom odporúča uchovať rohovky a pripraviť histopatologické vzorky, ktoré možno použiť na vytvorenie databázy a zavedenie rozhodovacích kritérií, ktoré by mohli ďalej zlepšiť presnosť tejto testovacej metódy

V každom laboratóriu, ktoré používa túto metódu prvý raz, by sa mali použiť chemikálie na preukázanie spôsobilosti uvedené v dodatku 3. Laboratórium môže použiť tieto chemikálie na účely preukázania svojej odbornej spôsobilosti na vykonávanie testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky pred predložením údajov z testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na účely regulačnej klasifikácie nebezpečnosti.

PRINCÍP TESTU

Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky predstavuje organotypický model, ktorý poskytuje krátkodobé udržanie normálnej fyziologickej a biochemickej funkcie hovädzej rohovky in vitro. V rámci tejto testovacej metódy sa poškodenie testovanou chemikáliou posudzuje kvantitatívnymi meraniami zmien zákalu rohovky pomocou opacitometra a priepustnosti rohovky pomocou spektrofotometra vo viditeľnej oblasti svetla. Obe merania sa používajú na výpočet hodnoty IVIS, ktorá sa používa na priradenie klasifikačnej kategórie nebezpečnosti podráždenia in vitro na účely predpokladu potenciálu testovanej chemikálie spôsobiť podráždenie očí in vivo (pozri rozhodovacie kritériá v bode 48).

V testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa používajú izolované rohovky z očí čerstvo zabitého dobytka. Zákal rohovky sa meria kvantitatívne ako množstvo rohovkou prepusteného svetla. Priepustnosť sa meria kvantitatívne ako množstvo farbiva fluoresceínu sodného, ktoré prejde celou hrúbkou rohovky, zistené v médiu v zadnej komore. Testované chemikálie sa nanášajú na epitelový povrch rohovky pridaním do prednej komory držiaka rohovky. V dodatku 4 je uvedený opis a schéma držiaka rohovky, ktorý sa používa v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky. Držiaky rohovky sa dajú zakúpiť z rôznych zdrojov, alebo sa dajú zhotoviť.

Zdroj a vek hovädzích očí a výber druhov zvierat

Dobytok posielaný na bitúnky sa zvyčajne usmrcuje na ľudskú spotrebu alebo na iné komerčné použitia. Ako zdroj rohoviek na použitie v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa používajú iba zdravé zvieratá, ktoré sa považujú za vhodné na vstup do ľudského potravinového reťazca. Keďže dobytok má široký rozsah hmotnosti a závisí od plemena, veku a pohlavia, neexistuje žiadne odporúčanie týkajúce sa hmotnosti zvierat v čase zabitia.

Odlišné rozmery rohoviek môžu byť výsledkom použitia očí zo zvierat v rôznom veku. Rohovky s horizontálnym priemerom > 30,5 mm a so stredovou hrúbkou rohovky ≥ 1 100 μm sa zvyčajne získavajú z dobytka staršieho ako osem rokov, zatiaľ čo rohovky s horizontálnym priemerom < 28,5 mm a so stredovou hrúbkou rohovky < 900 μm sa zvyčajne získavajú z dobytka mladšieho ako päť rokov (14). Z toho dôvodu sa oči dobytka staršieho ako 60 mesiacov väčšinou nepoužívajú. Oči dobytka mladšieho ako 12 mesiacov sa takisto bežne nepoužívajú, pretože tieto oči sa ešte vyvíjajú a hrúbka rohovky a jej priemer sú značne menšie než je hrúbka a priemer rohoviek, ktoré sa uvádzajú v prípade očí dospelého dobytka. Použitie rohoviek mladých zvierat (t. j. vo veku 6 až 12 mesiacov) je však prípustné, pretože má niekoľko výhod, ako je lepšia dostupnosť, užší vekový rozsah a nižšia miera nebezpečnosti, pokiaľ ide o potenciálne vystavenie pracovníkov bovinnej spongiformnej encefalopatii (15). Keďže by bolo prínosné vykonať ďalšie posúdenie vplyvu veľkosti alebo hrúbky rohovky na schopnosť reagovať na žieravé a dráždivé chemikálie, odporúča sa, aby používatelia uvádzali odhadovaný vek a/alebo hmotnosť zvierat, ktorých rohovky boli použité v štúdii.

Odber a doprava očí do laboratória

Odber očí vykonávajú zamestnanci bitúnkov. V snahe minimalizovať mechanické a iné druhy poškodenia očí by sa oči mali odobrať čo najskôr po usmrtení zvieraťa a hneď po odobratí a počas prepravy by sa mali chladiť. Zamestnanci bitúnkov by pri oplachovaní hlavy zvieraťa nemali použiť žiadny detergent, aby sa predišlo vystaveniu očí účinkom potenciálne dráždivých chemikálií.

Oči by sa mali úplne ponoriť do vychladnutého Hanksovho vyváženého soľného roztoku (ďalej len „HBSS“) v nádobe s vhodnou veľkosťou a dopraviť do laboratória takým spôsobom, aby sa minimalizovalo poškodenie a/alebo kontaminácia baktériami. Keďže oči sa odoberajú počas zabíjania, môžu byť vystavené krvi alebo iným biologickým materiálom vrátane baktérií a iných mikroorganizmov. Preto je dôležité zabezpečiť, aby bolo riziko kontaminácie minimálne [napr. tak, že sa nádoba, v ktorej sú oči uložené, bude počas odberu a prepravy udržiavať na mokrom ľade a že sa do HBSS, ktorý sa používa na skladovanie očí pri preprave, pridajú antibiotiká (napr. penicilín v dávke 100 IU/ml a streptomycín v dávke 100 μg/ml)].

Časový interval medzi odberom očí a použitím rohoviek v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky by sa mal minimalizovať (zvyčajne sa rohovky použijú v ten istý deň, ako sa vykoná odber) a dokázateľne by nemal spochybniť výsledky skúšky. Tieto výsledky sú založené na kritériách výberu očí, ako aj na reakciách pozitívnych a negatívnych kontrol. Všetky oči použité v skúške by mali byť z tej istej skupiny očí odobratých v určitý deň.

Kritériá výberu očí používaných v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky

Keď sa oči dopravia do laboratória, pozorne sa prekontrolujú s ohľadom na poškodenia vrátane zvýšeného zákalu, škrabnutí a neovaskularizácie. Použiť sa majú len rohovky z očí, ktoré nie sú takto poškodené.

V ďalších krokoch skúšky sa posudzuje aj kvalita každej rohovky. Rohovky, ktoré majú zákal silnejší ako sedem zákalových jednotiek alebo zákal ekvivalentnej hodnoty pre použitý opacitometer a príslušné držiaky rohovky po prvej hodine dosahovania rovnovážneho stavu, sa majú vyradiť (POZNÁMKA: opacitometer by sa mal kalibrovať zákalovými štandardmi, ktoré sa použijú na určenie zákalových jednotiek, pozri dodatok 4).

Každá ovplyvnená skupina (testovaná chemikália, súbežné negatívne a pozitívne kontroly) pozostáva minimálne z troch očí. V testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky by sa mali použiť tri rohovky na negatívnu kontrolu. Keďže všetky odobrané rohovky sú vyrezané z celej očnej gule a pripevnené do rohovkových komôr, existuje možnosť, že táto manipulácia bude mať vplyv na jednotlivé hodnoty zákalu a priepustnosti rohovky (vrátane negatívnej kontroly). Okrem toho hodnoty zákalu a priepustnosti rohoviek z kontrol na negatívnu kontrolu sa používajú na korigovanie hodnôt zákalu a priepustnosti rohovky po ovplyvnení testovanou chemikáliou a hodnôt z pozitívnej kontroly vo výpočtoch IVIS.

POSTUP

Príprava očí

Rohovky, ktoré nie sú poškodené, sa vyrežú s 2 až 3 mm okrajom očného bielka, ktorý pomáha pri následnej manipulácii, pričom sa dáva pozor na to, aby nedošlo k poškodeniu epitelu a endotelu rohovky. Izolované rohovky sa upevnia do špeciálne navrhnutých držiakov rohovky pozostávajúcich z prednej a zadnej komory, ktoré sú jednotlivo prepojené s epitelovou a s endotelovou stranou rohovky. Obidve komory sa naplnia až po okraj predhriatym minimálnym základným médiom podľa Eagla (Eagle's Minimum Essential Medium, EMEM) bez fenolovej červene (najskôr zadná komora), pričom sa zabezpečí, aby sa nevytvorili bubliny. Zariadenie sa potom nechá ustáliť na teplotu 32 ± 1 °C aspoň jednu hodinu, čím sa umožní, aby sa teplota rohoviek vyrovnala s teplotou média a aby rohovky dosiahli bežnú metabolickú aktivitu v najväčšej možnej miere (približná teplota povrchu rohovky in vivo je 32 °C).

Po dobe ustálovania sa do oboch komôr pridá čerstvé predhriate EMEM bez fenolovej červene a pri každej rohovke sa odčítajú základné údaje o zákale. Všetky rohovky, ktoré vykazujú makroskopické poškodenie tkaniva (napr. škrabnutia, pigmentáciu, neovaskularizáciu), alebo zákal silnejší ako sedem zákalových jednotiek, alebo ekvivalentnú hodnotu nameranú s použitím opacitometra a držiaka rohovky, sa vyradia. Minimálne tri rohovky sa vyberú ako rohovky na negatívnu kontrolu (alebo kontrolu rozpúšťadla). Zvyšné rohovky sa potom rozdelia do ovplyvnených skupín a pozitívnych kontrolných skupín.

Keďže tepelná kapacita vody je vyššia ako tepelná kapacita vzduchu, voda poskytuje stabilnejšie teplotné podmienky na inkubáciu. Preto sa odporúča použiť vodný kúpeľ na udržiavanie držiaka rohovky a jeho obsahu na teplote 32 ± 1 °C. Takisto však možno použiť vzdušné inkubátory za predpokladu, že sa zabezpečí udržiavanie stabilnej teploty (napr. predhriatím držiakov a médií).

Aplikácia testovanej chemikálie

Používajú sa dva rôzne protokoly o ovplyvnení, jeden na kvapaliny a povrchovo aktívne látky (tuhé látky alebo kvapaliny) a jeden na povrchovo neaktívne tuhé látky.

Kvapaliny sa testujú nezriedené. Polotuhé látky, krémy a vosky sa zvyčajne testujú ako kvapaliny. Čisté povrchovo aktívne látky sa testujú pri koncentrácii 10 % hmotnostnej koncentrácie v 0,9 % roztoku chloridu sodného, destilovanej vody alebo iného rozpúšťadla, v prípade ktorého sa preukázalo, že nemá nepriaznivé účinky na testovací systém. Pri alternatívnych koncentráciách zriedenia by sa mali uviesť príslušné dôvody. Zmesi s obsahom povrchovo aktívnych látok možno testovať nezriedené alebo zriedené na vhodnú koncentráciu v závislosti od príslušného expozičného scenára in vivo. Pri testovaných koncentráciách by sa mali uviesť príslušné dôvody. Rohovky sa vystavia kvapalinám a povrchovo aktívnym látkam na 10 minút. Pri použití inej doby expozície by sa malo uviesť primerané vedecké zdôvodnenie. Definíciu povrchovo aktívnej látky a zmesi, ktorá obsahuje povrchovo aktívne látky, možno nájsť v dodatku 1.

Povrchovo neaktívne tuhé látky sa zvyčajne testujú ako roztoky alebo suspenzie pri koncentrácii 20 % hmotnostnej koncentrácie v 0,9 % roztoku chloridu sodného, v destilovanej vode alebo v inom rozpúšťadle, o ktorom sa preukázalo, že nemá žiadne nepriaznivé účinky na testovací systém. Za určitých okolností a pri náležitom vedeckom zdôvodnení sa tuhé látky môžu testovať aj čisté priamym nanesením na povrch rohovky s použitím metódy otvorenej komory (pozri bod 32). Rohovky sa vystavia pôsobeniu tuhých látok na štyri hodiny, no rovnako ako v prípade kvapalín a povrchovo aktívnych látok, možno použiť aj inú dĺžku vystavenia, ak sa primeraným spôsobom vedecky zdôvodní.

Je možné používať rôzne metódy ovplyvnenia, ich použitie závisí od fyzikálnej povahy a chemických vlastností (napr. tuhé látky, kvapaliny, viskózne či neviskózne kvapaliny) testovanej chemikálie. Kritický faktor spočíva v zabezpečení, aby testovaná chemikália primerane pokrývala epitelový povrch a aby sa pri oplachovaní dostatočne odstránila. Metóda uzavretej komory sa zvyčajne používa pri neviskóznych až mierne viskóznych kvapalných testovaných chemikáliách, zatiaľ čo metóda otvorenej komory sa zvyčajne používa v prípade poloviskóznych a viskóznych kvapalných testovaných chemikáliách a čistých tuhých látok.

V prípade metódy uzavretej komory sa do prednej komory cez dávkovacie otvory na hornom povrchu komory zavedie dostatočné množstvo testovanej chemikálie (750 μl) tak, aby sa ňou pokryla epitelová strana rohovky, a otvory komory sa následne uzavrú komorovými zátkami na čas vystavenia. Je dôležité zabezpečiť, aby každá rohovka bola vystavená pôsobeniu testovanej chemikálie počas primeranej doby.

Pri metóde otvorenej komory sa pred ovplyvnením vyberie prstencový zámok okienkovej dosky a sklenená doska z prednej komory. Kontrolná alebo testovaná chemikália (750 μl alebo dostatočné množstvo testovanej chemikálie na úplné pokrytie rohovky) sa pomocou mikropipety nanesie priamo na epitelový povrch rohovky. Ak sa testovaná chemikália ťažko pipetuje, môže sa na uľahčenie dávkovania naplniť do výtlakovej piestovej pipety. Špička výtlakovej piestovej pipety sa vloží do dávkovacieho hrotu injekčnej striekačky tak, aby sa materiál mohol zaviesť do vytláčacieho hrotu pod tlakom. S posúvaním piestu pipety nahor sa súčasne tlačí na piest injekčnej striekačky. Ak sa v špičke pipety objavia vzduchové bubliny, testovaná chemikália sa odstráni (vytlačí) a postup sa opakuje, pokiaľ sa špička nenaplní bez vzduchových bublín. V prípade potreby možno použiť obyčajnú injekčnú striekačku (bez ihly), pretože umožňuje odmeranie presného objemu testovanej chemikálie a jej ľahšie nanesenie na epitelový povrch rohovky. Po dávkovaní sa sklenené okienko vráti na svoje miesto v prednej komore a tým sa obnoví uzavretý systém.

Postexpozičná inkubácia

Po uplynutí doby expozície sa testovaná chemikália, chemikália na negatívnu kontrolu alebo chemikália na pozitívnu kontrolu odstránia z prednej komory a epitel sa umyje aspoň trikrát (alebo pokiaľ sa nedosiahne stav, že nie sú viditeľné žiadne znaky prítomnosti testovanej chemikálie) s EMEM (obsahujúcim fenolovú červeň). Médium s obsahom fenolovej červene sa používa na oplachovanie, lebo zmena farby fenolovej červene sa môže monitorovať, čím sa zistí účinnosť oplachovania kyslých alebo zásaditých testovaných chemikálií. Rohovky sa umývajú viac ako trikrát, ak je farba fenolovej červene stále zmenená (na žltú alebo fialovú), alebo ak je testovaná chemikália stále viditeľná. Keď médium neobsahuje testovanú chemikáliu, rohovky sa opláchnu posledný raz pomocou EMEM (bez fenolovej červene). EMEM (bez fenolovej červene) sa používa na konečné opláchnutie, aby sa zabezpečilo odstránenie fenolovej červene z prednej komory pred meraním zákalu. Predná komora sa potom znova naplní čerstvým EMEM bez fenolovej červene.

V prípade kvapalín alebo povrchovo aktívnych látok sa rohovky po opláchnutí inkubujú ďalšie dve hodiny pri teplote 32 ± 1 °C. Dlhší postexpozičný čas môže byť za určitých okolností užitočný a mohlo by sa o ňom uvažovať v konkrétnych prípadoch. Rohovky ovplyvnené tuhými látkami sa na konci štvorhodinovej doby expozície dôkladne opláchnu, ale nevyžaduje sa ďalšia inkubácia.

Na konci postexpozičnej inkubačnej doby (v prípade kvapalín a povrchovo aktívnych látok) a na konci štvorhodinovej doby vystavenia (v prípade povrchovo neaktívnych tuhých látok) sa zaznamená zákal a priepustnosť každej rohovky. Každá rohovka sa takisto vizuálne prehliadne a zaznamenajú sa prípadné zistenia (napr. zlupovanie tkaniva, zvyšky testovanej chemikálie, vzorky s nerovnomerným zákalom). Tieto pozorovania by mohli byť dôležité, lebo sa môžu prejaviť v odchýlkach vo výsledkoch odčítavaných z opacitometra.

Kontrolné chemikálie

Do každého pokusu sa zaradia súbežné negatívne kontroly alebo kontroly rozpúšťadla/nosiča a pozitívne kontroly.

Keď sa testuje kvapalná látka s koncentráciou 100 %, zaradí sa súbežná negatívna kontrola (napr. 0,9 % roztok chloridu sodného alebo destilovaná voda) do testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky, aby sa dali zistiť nešpecifické zmeny v testovacom systéme a aby sa poskytol základ pre sledované parametre skúšky. Tým sa takisto zabezpečí, aby v dôsledku podmienok skúšky nedošlo k neprimeranej reakcii vo forme podráždenia.

Keď sa testuje zriedená kvapalina, povrchovo aktívna látka alebo tuhá látka, do testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa zaradí súbežná kontrolná skupina rozpúšťadla/nosiča, aby sa dali zistiť nešpecifické zmeny v testovacom systéme a aby sa poskytol základ pre sledované parametre skúšky. Môže sa použiť iba také rozpúšťadlo/nosič, u ktorého sa preukázalo, že nemá žiadne nepriaznivé účinky na testovací systém.

Do každého pokusu sa zaradí chemikália známa schopnosťou vyvolať podráždenie očí ako súbežná pozitívna kontrola, čím sa overí integrita testovacieho systému a jeho správne vykonávanie. V snahe zabezpečiť možnosť posúdiť variabilitu reakcie pri pozitívnej kontrole v čase by však rozsah dráždivej reakcie nemal byť nadmerný.

Príklady pozitívnych kontrol pri kvapalných testovaných chemikáliách sú 100 % etanol alebo 100 % dimetylformamid. Príkladom pozitívnej kontroly pri tuhých testovaných chemikáliách je 20 % hmotnostnej koncentrácie imidazolu v 0,9 % roztoku chloridu sodného.

Referenčné chemikálie sú užitočné na posudzovanie potenciálu neznámych chemikálií určitej chemickej triedy alebo triedy výrobkov vyvolať očnú dráždivosť, alebo na posudzovanie potenciálu pomernej dráždivosti chemikálie spôsobujúcej podráždenie očí v rámci osobitného rozsahu dráždivých reakcií.

Merané sledované parametre

Zákal sa určuje množstvom prepusteného svetla cez rohovku. Zákal rohovky sa kvantitatívne meria pomocou opacitometra a výsledkom sú hodnoty zákalu merané na spojitej stupnici.

Priepustnosť sa určuje množstvom farbiva fluoresceínu sodného, ktoré prenikne cez všetky bunkové vrstvy rohovky (t. j. od epitelu na vonkajšom povrchu rohovky cez endotel na vnútornom povrchu rohovky). Jeden ml roztoku fluoresceínu sodného (4 mg/ml pri testovaní kvapalín a povrchovo aktívnych látok alebo 5 mg/ml pri testovaní povrchovo neaktívnych tuhých látok) sa pridá do prednej komory držiaka rohovky, ktorá je spojená s epitelovou stranou rohovky, zatiaľ čo zadná komora, ktorá je spojená s endotelovou stranou rohovky, sa naplní čerstvým EMEM. Držiak sa potom inkubuje v horizontálnej polohe počas 90 ± 5 minút pri teplote 32 ± 1 °C. Množstvo fluoresceínu sodného, ktorý prejde do zadnej komory, sa kvantitatívne odmeria pomocou UV/VIS spektrofotometrie. Spektrofotometrické merania hodnotené pri 490 nm sa zaznamenajú ako hodnoty optickej hustoty (OD490) alebo absorbancie, ktoré sa merajú na spojitej stupnici. Hodnoty priepustnosti fluoresceínu sa stanovia použitím hodnôt OD490 nameraných spektrofotometrom pri viditeľnom svetle s použitím štandardnej dĺžky dráhy 1 cm.

Alternatívne sa môže použiť snímač 96-jamkovej mikrotitračnej platničky za predpokladu, že i) je možné vytvoriť lineárny rozsah snímača platničiek na stanovenie hodnôt OD490 pre fluoresceín a ii) použije sa správny objem vzoriek fluoresceínu na 96-jamkovej platničke, aby výsledkom boli hodnoty OD490, ktoré sa rovnajú štandardnej dĺžke dráhy 1 cm [to by mohlo vyžadovať kompletné naplnenie jamky (zvyčajne 360 μl)].

PREENTOVANIE VÝSLEDKOV

Vyhodnotenie údajov

Keď sa vykoná korekcia hodnôt zákalu a priemerných hodnôt priepustnosti (OD490) na zákal pozadia a hodnoty priepustnosti OD490 pre negatívnu kontrolu, priemerné hodnoty zákalu a priepustnosti OD490 pre každú ovplyvnenú skupinu by sa mali dosadiť do empiricky odvodeného vzorca na výpočet skóre in vitro dráždivosti (ďalej len „IVIS”) pre každú ovplyvnenú skupinu takto:

IVIS = priemerná hodnota zákalu + (15 × priemerná hodnota priepustnosti OD490)

Sina et al. (16) oznámili, že tento vzorec bol odvodený pri vnútrolaboratórnych a medzilaboratórnych štúdiách. Údaje vypočítané pre súbor 36 zlúčenín v rámci štúdie za účasti viacerých laboratórií boli podrobené analýze podľa viacerých náhodných premenných s cieľom určiť rovnicu, ktorá by najlepšie vyjadrovala vzťah medzi údajmi in vivo a in vitro. Túto analýzu vykonali vedci v dvoch nezávislých spoločnostiach a odvodili takmer totožné rovnice.

Hodnoty zákalu a priepustnosti by sa mali posudzovať aj samostatne, aby sa zistilo, či testovaná chemikália vyvolala žieravý účinok alebo silné podráždenie iba prostredníctvom jedného z dvoch sledovaných parametrov (pozri rozhodovacie kritériá).

Rozhodovacie kritériá

Ďalej sa uvádzajú hraničné hodnoty IVIS na identifikáciu testovaných chemikálií, ktoré vyvolávajú vážne poškodenie očí (kategória 1 GHS OSN), a testovaných chemikálií, ktoré si nevyžadujú klasifikáciu ako chemikálie spôsobujúce podráždenie očí alebo vážne poškodenie očí (bez kategórie v zmysle GHS OSN):

Kritériá prijateľnosti testu

Test sa považuje za prijateľný, ak výsledkom pozitívnej kontroly je IVIS, ktoré patrí do rozsahu dvoch štandardných odchýlok aktuálneho historického priemeru, ktorý sa má aktualizovať aspoň každé tri mesiace, alebo vždy, keď sa vykoná nejaký prijateľný test v laboratóriách, v ktorých sa testy vykonávajú zriedkavo (t. j. menej ako raz za mesiac). Výsledkom reakcií negatívnej kontroly alebo kontroly rozpúšťadla/nosiča by mali byť hodnoty zákalu a priepustnosti, ktoré sú menšie ako stanovené horné medze hodnôt zákalu pozadia a priepustnosti pre hovädzie rohovky ovplyvnené príslušnou negatívnou kontrolou alebo kontrolou rozpúšťadla/nosiča. V prípade testovanej chemikálie s jednoznačnou výslednou klasifikáciou by malo byť postačujúce jedno testovanie, ktoré zahŕňa použitie aspoň troch rohoviek. Ak sa však pri prvom testovaní dosiahnu hraničné výsledky, malo by sa zvážiť druhé testovanie (no nevyžaduje sa nevyhnutne), ako aj tretie v prípade, že sa výsledky priemerného IVIS z prvých dvoch testovaní odlišujú. V tejto súvislosti sa výsledok prvého testovania pokladá za hraničný, ak predpoklady týkajúce sa troch rohoviek boli nesúhlasné tak, že:

Skúšobný protokol

Skúšobný protokol by mal obsahovať tieto informácie, ak sú relevantné pre vykonanie štúdie:

LITERATÚRA