“I PIELIKUMS

OLĪVEĻĻAS ĪPAŠĪBAS

Piezīmes:

a)	Analīžu rezultāti jāuzrāda ar tādu pašu decimālciparu skaitu aiz komata kā attiecīgajai raksturlieluma skaitliskajai vērtībai. Pēdējais cipars jānoapaļo uz augšu, ja aiz tā nākamais cipars, kas jāatmet, ir lielāks par 4.

b)	Ja kaut viens raksturlielums neatbilst tam norādītajai vērtībai, šīs regulas vajadzībām var mainīt eļļas veidu vai to deklarēt par neattīrītu.

c)

Ja raksturlielums ir atzīmēts ar zvaigznīti (*), attiecībā uz eļļas kvalitāti tas nozīmē, ka: — spīdīgajai olīveļļai ir iespējams, ka abas attiecīgās robežvērtības vienlaicīgi atšķiras no noteiktajām; — neapstrādātajām olīveļļām ja vismaz viena no šim robežvērtībām atšķiras no noteiktajām vērtībām, oils, jāmaina eļļas veids, lai gan tā jorojām jāklasificē kā viens no neapstrādātas olīveļļas veidiem.

d)	Ja raksturlielums atzīmēts ar divām zvaigznītēm (**), attiecībā uz eļļas kvalitāti tas nozīmē, ka visu veidu olīvu izspaidu eļļām ir iespējams, ka vienlaikus abas robežvērtības var atšķirties no noteiktajām.”

Veids	Skābums (%) (*)	Peroksīda skaitlis mEq O2/kg (*)	Vaski mg/kg (**)	2 glicerilmonopalmitāts (%)	Stigmastadiēns mg/kg (1)	Starpība ECN42 HPLC – un ECN42 teorētiski aprēķinātā	K232 (*)	K270 (*)	Delta-K (*)	Organoleptiskais novērtējums Defekta mediāna (Md) (*)	Organoleptiskais novērtējums Augļu piegaršas mediāna (Mf) (*)
1. Neapstrādāta augstākā labuma olīveļļa	≤ 0,8	≤ 20	≤ 250	≤ 0,9 ja kop. palmitīnskābe % ≤ 14 % ≤ 1,0 ja kop. palmitīnskābe % > 14 %	≤ 0,10	≤ 0,2	≤ 2,50	≤ 0,22	≤ 0,01	Md = 0	Mf > 0
2. Neapstrādāta olīveļļa	≤ 2,0	≤ 20	≤ 250	≤ 0,9 ja kop. palmitīnskābe % ≤ 14 % ≤ 1,0 ja kop. palmitīnskābe % > 14 %	≤ 0,10	≤ 0,2	≤ 2,60	≤ 0,25	≤ 0,01	Md ≤ 2,5	Mf > 0
3. Spīdīgā olīveļļa	> 2,0	—	≤ 300 (3)	≤ 0,9 ja kop. palmitīnskābe % ≤ 14 % ≤ 1,1 ja kop. palmitīnskābe % > 14 %	≤ 0,50	≤ 0,3	—	—	—	Md > 2,5 (2)	—
4. Rafinēta olīveļļa	≤ 0,3	≤ 5	≤ 350	≤ 0,9 ja kop. palmitīnskābe % ≤ 14 % ≤ 1,1 ja kop. palmitīnskābe % > 14 %	—	≤ 0,3	—	≤ 1,10	≤ 0,16	—	—
5. Olīeļļas maisījums, kas sastāv norafinētas un neaptrādātas olīveļļas	≤ 1,0	≤ 15	≤ 350	≤ 0,9 ja kop. palmitīnskābe % ≤ 14 % ≤ 1,0 ja kop. palmitīnskābe % > 14 %	—	≤ 0,3	—	≤ 0,90	≤ 0,15	—	—
6. Neattīrīta olīvu izspaidu eļļa	—	—	> 350 (4)	≤ 1,4	—	≤ 0,6	—	—	—	—	—
7. Rafinēta olīvu izspaidu eļļa	≤ 0,3	≤ 5	> 350	≤ 1,4	—	≤ 0,5	—	≤ 2,00	≤ 0,20	—	—
8. Olīvu izspaidu eļļa	≤ 1,0	≤ 15	> 350	≤ 1,2	—	≤ 0,5	—	≤ 1,70	≤ 0,18	—	—

Veids

Skābju saturs (5)

Kopā transoleīnskābes izomēri (%)

Kopā translinolskābes + translinolēnskābes izomēri (%)

Sterīna sastāvs

Kopā sterīni (mg/kg)

Eritrodiols un uvaols (%) (**)

Miristīnskābe (%)

Linolēnskābe (%)

Arahīnskābe (%)

Eikozānskābe (%)

Behenskābe (%)

Lignocerīnskābe (%)

Holesterīns (%)

Brasikasterīns (%)

Kampesterīns (%)

Stigmapesterīns (%)

Betasitosterīns (%) (6)

Delta-7-stigmastenols (%)

1. Neapstrādāta augstākā labuma olīveļļa

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

2. Neapstrādāta olīveļļa

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

3. Spīdīgā olīveļļa

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,10

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5 (7)

4. Rafinēta olīveļļa

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

5. Olīeļļas maisījums

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

6. Neattīrīta olīvu izspaidu eļļa

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 2 500

> 4,5 (8)

7. Rafinēta olīvu izspaidu eļļa

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 800

> 4,5

8. Olīvu izspaidu eļļa

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 600

> 4,5

IV PIELIKUMS

VASKU SATURA NOTEIKŠANA AR KAPILĀRĀS KOLONNAS GĀZU HROMATOGRĀFIJU

1.   IZMANTOŠANAS JOMA

Šajā metodē aprakstīta vasku satura noteikšana olīveļļās. Vaskus sadala pēc oglekļa atomu skaita molekulā. Šo metodi var jo īpaši izmantot, lai atšķirtu ar spiešanas paņēmienu iegūtu olīveļļu no olīvu izspaidu eļļas, ko iegūst pēc ekstrakcijas paņēmiena.

2.   PRINCIPS

Taukiem vai eļļai pievieno piemērotu iekšējo standartu, pēc tam hromatogrāfiski sadala hidrēta silikagela kolonnā. Testēšanas apstākļos iegūst frakciju, kas eluējas vispirms (kas satur savienojumus, kuru polaritāte ir mazāka nekā triglicerīdiem), un to tieši analizē ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3.   APARATŪRA

3.1.   25 ml tilpuma Erlenmeijera kolba

3.2.   Stikla kolonna gāzes hromatogrāfijai, iekšējais diametrs 15,0 mm, augstums 30 līdz 40 cm, ar krānu

3.3.   Piemērots gāzes hromatogrāfs ar kapilāro kolonnu, kas aprīkots ar tiešās ievadīšanas sistēmu kolonnā, kas sastāv no šādiem mezgliem:

3.3.1.   Termostata kamera kolonnām (kolonnu krāsns) ar programmējamu temperatūru

3.3.2.   Aukstās inžekcijas iekārta tiešai ievadīšanai kolonnā

3.3.3.   Liesmas jonizācijas detektors un pārveidotājs/pastiprinātājs

3.3.4.   Reģistrējošā iekārta/integrators ar maināmu papīra ātrumu darbam ar pārveidotāju/pastiprinātāju (3.3.3.), kuras atbildes reakcijas laiks ir ne lielāks par 1 s. (Var izmantot arī datorizētas sistēmas, kas nodrošina gāzes hromatogrāfijas datu iegūšanu, izmantojot personālo datoru.)

3.3.5.   Stikla vai kvarca stikla kapilārā kolonna ar iekšējo diametru 0,25 līdz 0,32 mm, kas ir 8 līdz 12 m gara, ar vienādu no 0,10 līdz 0,30 μm šķidrās fāzes slāni. (Šim nolūkam piemērotas gatavas nopērkamās SE-52 un SE-54 tipa šķidrās fāzes.)

3.4.   10 μl tilpuma mikrošļirce ar rūdītu adatu inžekcijai uz kolonnas

3.5.   Elektrovibrators

3.6.   Rotācijas ietvaicētājs

3.7.   Mufeļkrāsns

3.8.   Analītiskie svari ar svēršanas precizitāti + 0,1 mg

3.9.   Laboratorijas trauki

4.   REAKTĪVI

4.1.   Silikagels ar daļiņu izmēru no 60 līdz 200 μm

Silikagelu uz vismaz 4 h ievieto mufeļkrāsnī 500 °C temperatūrā. Atdzesē un pievieno 2 % ūdens no ņemtā silikagela daudzuma. Lai maisījumu homogenizētu, to rūpīgi sakrata. Pirms lietošanas vismaz 12 h glabā tumšā vietā

4.2.   n-heksāns, hromatogrāfijai

4.3.   Etilēteris, hromatogrāfijai

4.4.   n-heptāns, hromatogrāfijai

4.5.   Laurilarahidāta standarta 0,1 % (m/v) šķīdums heksānā (iekšējais standarts). (Var izmantot arī palmitilpalmitātu vai miristilstearātu.)

4.5.1.   Sudāns 1 (1-fenil-azo-2-naftols)

4.6.   Nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, gāzes hromatogrāfijai

4.7.   Palīggāzes:

—	tīrs ūdeņradis gāzes hromatogrāfijai,

—	tīrs gaiss gāzes hromatogrāfijai.

5.   PROCEDŪRA

5.1.   Hromatogrāfijas kolonnas sagatavošana

Suspendē 15 g silikagela (4.1.) n-heksānā (4.2.) un pārnes kolonnā (3.2.). Nostādina. Sablīvē, izmantojot elektrovibratoru (3.5.), lai hromatogrāfijas slānis būtu homogenāks. Perkolē 30 ml n-heksāna attīrīšanai no piemaisījumiem. Ar svariem (3.8.) iesver precīzi 500 mg parauga 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.), un atbilstoši sagaidāmajam vasku saturam pievieno vajadzīgo daudzumu iekšējā standarta (4.5.). Piemēram, pievieno 0,1 mg laurilarahidāta, analizējot olīveļļu, vai 0,25 līdz 0,5 mg, analizējot olīvu izspaidu eļļu. Sagatavoto paraugu pārnes hromatogrāfijas kolonnā, izmantojot divas 2 ml porcijas n-heksāna (4.2.).

Šķīdinātājam ļauj izplūst no kolonnas, līdz tā līmenis pazeminās līdz apmēram 1 mm virs absorbenta, un tad, lai attīrītu no dabīgi saturošajiem n-alkāniem, perkolē vēl 70 ml n-heksāna. Tad sāk eluēšanu hromatogrāfijai, savācot 180 ml n-heksāna/etilētera maisījuma (attiecībā 99:1) ar ātrumu apmēram 15 pilieni desmit sekunžu laikā. Parauga eluēšana jāveic istabas temperatūrā 22 ± 4 °C temperatūrā.

NB!

—	n-heksāna/etilētera maisījums (99:1) jāsagatavo tajā pašā dienā.

—

Vasku pareizas eluēšanas vizuālai kontrolei maisījumam var pievienot 100 μl Sudānas 1 krāsvielas 1 % šķīdumu tajā. Tā kā krāsvielas aiztures laiks ir lielāks nekā vaskiem un mazāks nekā triglicerīdiem, eluēšana jāpārtrauc tūlīt pēc tam, kad krāsojums sasniedzis kolonnas apakšējo daļu, jo tas liecina, ka visi vaski jau ir eluēti no kolonnas.

Šādi iegūto parauga frakciju ietvaicē rotācijas ietvaicētājā (3.6.) gandrīz sausu. Pēdējos apmēram 2 ml šķīdinātāja iztvaicē ar vāju slāpekļa plūsmu; pievieno 2–4 ml n-heptāna.

5.2.   Gāzes hromatogrāfijas analīze

5.2.1.   Sagatavošana

Kolonnu uzstāda gāzes hromatogrāfam (3.3.), pievienojot ieeju kolonnā virskolonnas sistēmai, bet kolonnas izeju detektoram. Veic gāzes hromatogrāfijas aparatūras vispārēju pārbaudi (gāzes kontūru, detektora un reģistrācijas ierīces darbību, u. c.).

Ja kolonnu izmanto pirmo reizi, tā vispirms jākondicionē. Nedaudz nesējgāzes izlaiž caur kolonnu, un tad ieslēdz gāzes hromatogrāfu. Pakāpeniski iesilda tā, lai apmēram četru stundu laikā sasniegtu 350 °C temperatūru. Šādu temperatūru uztur vismaz divas stundas, un pēc tam iekārtai noregulē vajadzīgos darba apstākļus (iestata gāzes plūsmu, aizdedz liesmu, pievieno elektroniskajai reģistrācijas iekārtai (3.3.4.), iestata kolonnas krāsns temperatūru, detektoru, u. c.), reģistrē signālu ar jutību, kas ir vismaz divas reizes augstāka par analīzei nepieciešamo jutību. Nulles līnijai jābūt taisnai, bez jebkādiem izsitieniem, un tā nedrīkst novirzīties.

Negatīvas taisnvirziena novirzes liecina par neblīvumiem kolonnas savienojumu vietās; savukārt pozitīvas novirzes liecina, ka kolonna ir nepietiekami kondicionēta.

5.2.2.   Darba apstākļu izvēle

Parasti izmanto šādus apstākļus:

—	kolonnas temperatūra –   20 °C/min   5 °C/min   20 °C/min   sākumā 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

—	detektora temperatūra – 350 °C;

—	ievadītās vielas daudzums: 1 μl no n-heptāna šķīduma (2–4 ml);

—	nesējgāze: hēlijs vai ūdeņradis ar attiecīgajai gāzei pareizu lineāro ātrumu (sk. papildinājumā);

—	instrumenta jutība: atbilst turpmāk aprakstītajiem nosacījumiem.

Apstākļus var izmainīt atbilstoši kolonnas un hromatogrāfa raksturlielumiem tā, lai tiktu izdalīti visi vaski un panākta pietiekama signālu izšķirtspēja (sk. attēlu); C32 iekšējā standarta aiztures laikam ir jābūt 18 ± 3 min. Visvairāk reprezentatīvā vaska signālam jābūt vismaz 60 % no pilnas skalas.

Signālu integrēšanas parametri jānosaka tā, lai tiktu iegūts attiecīgo signālu laukumu pareizs novērtējums.

NB! Ņemot vērā, ka beigu temperatūra ir augsta, pieļaujama līdz 10 % novirze no pilnas skalas vērtības.

5.3.   Analīzes veikšana

Ar 10 μl tilpuma mikrošļirci ņem 1 μl šķīduma paraugu; atvelk šļirces virzuli tā, lai iztukšotu adatu. Adatu ievieto inžektorā un pēc 1–2 sekundēm ātri ievada; pēc apmēram piecām sekundēm adatu lēnām izvelk.

Veic reģistrāciju, līdz visi vaski ir pilnībā eluēti.

Nulles līnijai noteikti jāatbilst nepieciešamajiem nosacījumiem.

5.4.   Signālu identifikācija

Signālus identificē pēc aiztures laikiem, tos salīdzinot ar tādos pašos apstākļos analizētiem tādu vasku maisījumiem, kuru aiztures laiki ir zināmi.

Attēlā redzama neapstrādātas augstākā labuma olīveļļas vasku hromatogramma.

5.5.   Daudzuma noteikšana

Izmantojot integratoru, nosaka iekšējā standarta un alifātisko esteru C40 līdz C46 signālu laukumu.

Aprēķina katra vaska estera saturu mg/kg eļļas pēc šādas formulas:

kur

Ax	=	katra estera signāla laukums, kvadrātmilimetros;
As	=	iekšējā standarta signāla laukums, kvadrātmilimetros;
ms	=	pievienotā iekšējā standarta masa, miligramos;
m	=	analīzei ņemtā parauga masa, gramos.

6.   REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Norāda dažādu C40 līdz C46 vasku kopīgo saturu mg/kg eļļas (ppm).

NB! Kvantitatīvi nosakāmie komponenti saistāmi ar C40 līdz un C46 esteru signāliem, izmantojot par paraugu olīveļļas vasku hromatogrammu turpmāk redzamajā attēlā. Ja esteris C46 parādās divas reizes, tad, lai to identificētu, ieteicams analizēt olīvu izspaidu eļļas vasku frakciju, kur C46 signāls ir viegli identificējams tāpēc, ka tas ir izteiktā pārākumā.

Rezultātus uzdod ar precizitāti līdz vienam ciparam aiz komata.

Attēls.

Olīveļļas vasku hromatogramma (9)

Papildinājums

Gāzes lineārā ātruma noteikšana

Pēc noregulēšanas darba normāliem darba apstākļiem gāzes hromatogrāfā ievada 1–3 μl metāna (vai propāna). Uzņem laiku, kādā gāze iziet cauri kolonnai no ievadīšanas mirkļa līdz tā signāla parādīšanās brīdim (tM).

Gāzes lineāro ātrumu aprēķina pēc formulas L/tM, kur L ir kolonnas garums centimetros un tM ir laiks sekundēs.

“VII PIELIKUMS

2-GLICERILMONOPALMITĀTA SATURA NOTEIKŠANA

1.   IZMANTOŠANAS JOMA

Šajā metodē aprakstīta triglicerīdu molekulā 2. pozīcijā saistītās palmitīnskābes noteikšana pēc 2-glicerilmonopalmitāta.

Šo metodi var izmantot istabas temperatūrā (20 °C) šķidrām augu eļļām.

2.   PRINCIPS

Pēc sagatavošanas eļļas paraugu šķeļ ar aizkuņģa dziedzera lipāzi: triglicerīdu daļējā selektīvā hidrolīzē 1. un 3. pozīcijā rodas 2-monoglicerīdi. 2-glicerilmonopalmitāta saturu monoglicerīdu frakcijā pēc sililēšanas nosaka ar kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfiju.

3.   APARATŪRA UN MATERIĀLI

3.1.   25 ml tilpuma Erlenmeijera kolba

3.2.   100, 250 un 300 ml tilpuma vārglāzes

3.3.   Hromatogrāfijas kolonna no stikla, iekšējais diametrs 21–23 mm, garums 400 mm, ar poraina stikla disku un krānu

3.4.   10, 50, 100 un 200 ml tilpuma mērcilindri

3.5.   100 un 250 ml tilpuma kolbas

3.6.   Rotācijas ietvaicētājs

3.7.   10 ml tilpuma centrifūgas mēģenes ar konisku apakšdaļu un slīpēta stikla aizbāzni

3.8.   Centrifūga 10 un 100 ml tilpuma mēģenēm

3.9.   Termostats, kurā var uzturēt 40 ± 0,5 °C temperatūru

3.10.   1 un 2 ml tilpuma graduētas pipetes

3.11.   1 ml tilpuma šļirce zemādas injekcijām

3.12.   100 μl tilpuma mikrošļirce

3.13.   1 000 ml tilpuma šķirpiltuve

3.14.   Kapilārās kolonnas gāzu hromatogrāfs ar virskolonnas auksto inžekciju parauga tiešai ievadīšanai kolonnā un krāsni, kurā var uzturēt vajadzīgo temperatūru ar precizitāti apm. 1 °C

3.15.   Virskolonnas aukstais inžektors parauga tiešai ievadīšanai kolonnā

3.16.   Liesmas jonizācijas detektors un elektrometrs

3.17.   Elektrometram piemērota reģistrējošā iekārta/integrators ar maināmu papīra ātrumu, kuras atbildes reakcijas laiks ir ne lielāks par 1 s

3.18.   Stikla vai kvarca stikla kapilārā kolonna, garums 8–12 metri, iekšējais diametrs 0,25–0,32 mm, kas pārklāta ar metilpolisiloksānu vai fenilmetilpolisiloksānu 5 %, 0,10–0,30 μm slānis, izmantojama 370 °C temperatūrā

3.19.   10 μl tilpuma mikrošļirce ar vismaz 7,5 cm garu rūdītu adatu tiešai virskolonnas ievadīšanai

4.   REAKTĪVI

4.1.   Silikagels ar daļiņu izmēru no 0,063 līdz 0,200 mm (70/280 mesh), kas sagatavots šādi: Silikagelu porcelāna tīģelī žāvskapī 4 stundas žāvē 160 °C temperatūrā, atdzesē eksikatorā istabas temperatūrā. Pievieno ūdeni 5 % no silikagela masas turpmāk aprakstītajā veidā. Erlenmeijera kolbā iesver 152 g silikagela, pievieno 8 g destilēta ūdens, noslēdz ar aizbāzni un uzmanīgi krata, lai ūdens sadalītos masā vienmērīgi. Pirms lietošanas jāiztur vismaz 12 stundas

4.2.   n-heksāns (hromatogrāfijai)

4.3.   Izopropanols

4.4.   Izopropanols, 1/1 (v/v) ūdens šķīdums

4.5.   Aizkuņģa dziedzera lipāze. Tās aktivitātei jābūt no 2,0 līdz 10 lipāzes vienībām uz miligramu. (Aizkuņģa dziedzera lipāzes ar aktivitāti no 2 līdz 10 vienībām uz miligramu fermenta ir nopērkamas.)

4.6.   Tris-hidroksimetilaminometāna buferšķīdums: 1 M ūdens reakciju ar konc. HCl (1/1 v/v) noregulē līdz pH 8 (nosaka potenciometriski)

4.7.   Enzīma kvalitātes nātrija holāts, 0,1 % ūdens šķīdums (šis šķīdums pēc pagatavošanas ir derīgs divas nedēļas)

4.8.   Kalcija hlorīds, 22 % ūdens šķīdums

4.9.   Dietilēteris, hromatogrāfijai

4.10.   Šķīdinātājs attīstīšanai: n-heksāna/dietilētera (87:13 v:v) maisījums

4.11.   Nātrija hidroksīds, 12 % šķīdums

4.12.   Fenolftaleīns, 1 % šķīdums etanolā

4.13.   Nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, gāzes hromatogrāfijai

4.14.   Palīggāzes: ūdeņradis, tīrība vismaz 99 %, sauss un attīrīts no organiskajām vielām; un gaiss, gāzes hromatogrāfijai, ar tādu pašu tīrības pakāpi

4.15.   Silanizācijas reaģents: piridīna/heksametildisilazāna, trimetilhlorsilāna 9/3/1 (v/v/v) maisījums. (Nopērkami arī lietošanai sagatavoti šķīdumi. Var izmantot citus sililēšanas reaģentus, konkrēti bis-trimetilsililtrifluoracetamīds + 1 % trimetilhlorsilāns, kas atšķaidīts ar tādu pašu tilpumu bezūdens piridīna.)

4.16.   Standartparaugi: tīri monoglicerīdi vai monoglicerīdu maisījumi ar zināmu sastāvu, kas ir līdzīgs analizējamo paraugu sastāvam

5.   METODE

5.1.   Paraugu sagatavošana

5.1.1.   Eļļas, kuru brīvais skābums ir mazāks par 3 %, pirms hromatografēšanas silikagela kolonnā nav obligāti jāneitralizē. Eļļas, kuru brīvais skābums ir lielāks par 3 %, jāneitralizē, kā aprakstīts 5.1.1.1. punktā.

5.1.1.1.   Pārnes 50 g eļļas un 200 ml n-heksāna 1 000 ml tilpuma šķirpiltuvē (3.13.). Pievieno 100 ml izopropanola un 12 % nātrija hidroksīda (4.11.) daudzumā, kas ir ekvivalents eļļas brīvajam skābumam plus 5 %. Vienu minūti enerģiski krata. Pievieno 100 ml destilēta ūdens, vēlreiz sakrata un nostādina.

Pēc dekantēšanas atdala apakšējo ziepes saturošo slāni. Atdala arī visus pārējos starpslāņus (duļķes un nešķīstošās vielas). Neitralizētā eļļas parauga šķīdumu heksānā vairākas reizes mazgā ar 50–60 ml izopropanola/ūdens 1/1 (v/v) šķīdumu (4.4.), līdz izzūd tā sārtais krāsojums ar fenolftaleīnu.

Lielāko daļu heksāna atdala ar vakuumdestilāciju (izmantojot, piemēram, rotācijas ietvaicētāju), un eļļu pārnes 100 ml tilpuma kolbā (3.5.). Eļļu vakuumā žāvē, līdz pilnībā atdalīts viss šķīdinātājs.

Šīs procedūras beigās eļļas skābumam jābūt mazākam par 0,5 %.

5.1.2.   Šādi sagatavotas eļļas 1,0 g lielu iesvaru pārnes 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.), un to izšķīdina 10 ml attīstīšanas maisījumā (4.10.). Pirms hromatogrāfijas silikagela kolonnā šķīdumu nostādina vismaz 15 minūtes.

Lai nodrošinātu hromatogrāfijai optimālus apstākļus, ja šķīdums nav dzidrs, to centrifugē (var izmantot lietošanai sagatavotus 500 mg SPE silikagela kartridžus).

5.1.3.   Hromatogrāfijas kolonnas sagatavošana

Apmēram 30 ml attīstītāja šķīdinātāja (4.10.) pārnes kolonnā (3.3.), izmantojot stikla spieķīti, kolonnas apakšā ievieto kokvilnas auduma gabaliņu; saspiež, lai aizvadītu gaisu.

Vārglāzē sagatavo 25 g silikagela (4.1.) suspensiju apmēram 80 ml attīstītāja šķīdinātāja, un pārnes kolonnā, izmantojot piltuvi.

Pārbauda, vai viss silikagels pārnests kolonnā; mazgā ar attīstītāja šķīdinātāju (4.10.), atver krānu un šķidruma līmeni pazemina tā, lai tas būtu apmēram 2 mm virs silikagela līmeņa.

5.1.4.   Kolonnas hromatogrāfija

No parauga, kas sagatavots, kā aprakstīts iepriekš 5.1. punktā, 25 ml tilpuma Erlenmeijera kolbā (3.1.) ņem precīzi 1,0 g lielu iesvaru.

Parauga iesvaru izšķīdina 10 ml attīstītāja šķīdinātāja (4.10.). Šķīdumu pārnes hromatogrāfijas kolonnā, kas sagatavota saskaņā ar 5.1.3. punktu. Jāraugās, lai netiktu aizskarta kolonnas virsma.

Atver krānu un parauga šķīdumu pārnes kolonnā, līdz tas sasniedz silikagela līmeni. Attīsta ar 150 ml attīstītāja šķīdinātāja. Noregulē plūsmas ātrumu 2 ml/min (tā, lai 150 ml šķīduma tiktu pārnesti kolonnā apmēram 60–70 min laikā).

Eluātu savāc iepriekš nosvērtā 250 ml tilpuma kolbā. Šķīdinātāju iztvaicē vakuumā gandrīz sausu, un šķīdinātāja atliekas atdala slāpekļa plūsmā.

Kolbu nosver un aprēķina iegūtā ekstrakta masu.

(Ja izmanto lietošanai sagatavotus SPE silikagela kartridžus, rīkojas, kā aprakstīts turpmāk. 1 ml šķīduma (5.1.2.) pārnes sagatavotos kartridžos ar 3 ml n-heksāna.

Pēc šķīduma perkolēšanas attīsta ar 4 ml n-heksāna/dietilētera 9/1 (v/v) maisījumu.

Eluātu savāc 10 ml tilpuma mēģenē un slāpekļa plūsmā ietvaicē sausu.

Uz sauso atlikumu iedarbojas ar aizkuņģa dziedzera lipāzi (5.2.). Jāpārbauda taukskābju sastāvs pirms SPE kartridža un pēc tā.)

5.2.   Hidrolīze ar aizkuņģa dziedzera lipāzi

5.2.1.   Centrifūgas mēģenē iesver 0,1 g eļļas, kas sagatavotas saskaņā ar 5.1. punktu. Pievieno 2 ml buferšķīduma (4.6.), 0,5 ml nātrija holāta šķīduma (4.7.) un 0,2 ml kalcija hlorīda šķīduma, katru reizi šķīdumu rūpīgi samaisot. Mēģeni noslēdz ar pieslīpēta stikla aizbāzni, un ievieto termostatā 40 ± 0,5 °C temperatūrā.

5.2.2.   Pievieno 20 mg lipāzes, uzmanīgi sakrata (nesaslapinot aizbāzni), un mēģeni ievieto termostatā precīzi uz 2 min. Pēc tam izņem, enerģiski krata precīzi 1 min un atdzesē.

5.2.3.   Pievieno 1 ml dietilētera, noslēdz ar aizbāzni un enerģiski krata, pēc tam centrifugē, un ar mikrošļirci ētera šķīdumu pārnes tīrā sausā mēģenē.

5.3.   Silanilatvasinājumu iegūšana un gāzes hromatogrāfija

5.3.1.   Ar mikrošļirci 100 μl šķīduma (5.2.3.) pārnes 10 ml tilpuma mēģenē ar konisku apakšdaļu.

5.3.2.   Vājā slāpekļa plūsmā atdala šķīdinātāju, pievieno 200 μl silanizācijas reaģenta (4.15.), mēģeni noslēdz ar aizbāzni un 20 min nostādina.

5.3.3.   Pēc 20 min pievieno 1 līdz 5 ml n-heksāna (atkarībā no hromatografēšanas apstākļiem): šādi iegūtais šķīdums ir sagatavots gāzes hromatogrāfijai.

5.4.   Gāzes hromatogrāfija

Darba apstākļi:

—	inžektora temperatūra (virskolonnas inžektors) zem šķīdinātāja viršanas punkta (68 °C);

—	detektora temperatūra: 350 °C;

—	kolonnas temperatūra: krāsns temperatūras programma: 1 minūti 60 °C, paaugstināšana par 15 °C minūtē līdz 180 °C, tad par 5 °C minūtē līdz 340 °C, tad 13 minūtes 340 °C;

—

nesējgāze: ūdeņradis vai hēlijs, ar lineāro ātrumu, kas ir pietiekams 1. att. parādītās izšķirtspējas panākšanai. Aiztures laikam C54 triglicerīdam jābūt 40 ± 5 min (sk. 2. att.). (Norādītie darba apstākļi ir orientējoši. Operatoriem tie jāoptimizē, lai panāktu vajadzīgo izšķirtspēju. Tā signāla augstumam, kas atbilst 2-glicerilmonopalmitātam, jābūt vismaz 10 % no reģistrācijas iekārtas skalas.)

—	ievadītās vielas daudzums: 0,5–1 μl n-heksāna šķīduma (5 ml) (5.3.3.).

5.4.1.   Signālu identifikācija

Atsevišķos monoglicerīdus identificē pēc aiztures laikiem, tos salīdzinot ar monoglicerīdu standartmaisījumiem tādos pašos apstākļos noteiktajiem aiztures laikiem.

5.4.2.   Kvantitatīva noteikšana

Katra signāla laukumu aprēķina, izmantojot elektronisko integratoru.

6.   REZULTĀTU IZTEIKŠANA

Glicerilmonopalmitāta saturu aprēķina pēc attiecīgā signāla laukuma attiecības pret visu monoglicerīdu signālu laukumu kopējo summu (sk. 2. att.), izmantojot šādu formulu:

glicerilmonopalmitāts (%)

kur:

Ax	=	glicerilmonopalmitāta signāla laukums;
ΣA	=	visu monoglicerīdu signālu laukumu summa.

Rezultātus uzdod ar precizitāti līdz vienam decimālciparam aiz komata.

7.   ANALĪZES REZULTĀTU PĀRSKATS

Pārskatā par analīzes rezultātiem jānorāda:

—	atsauce uz šo metodi,

—	visa informācija, kas vajadzīga parauga pilnīgai identifikācijai,

—	analīzes rezultāts,

—	ziņas par atkāpēm no šīs metodes, pamatojoties uz ieinteresēto pušu vienošanos, vai kāda cita iemesla dēļ,

—	laboratorijas identifikācijas dati, analīzes dienas datums un par analīzes veikšanu atbildīgo personu paraksti.

1.   attēls

To silanizēšanas reakcijas produktu hromatogramma, kas iegūti, ar lipāzi iedarbojoties uz rafinētu olīveļļu, kurai pievienoti 20 % esterificētas eļļas (100 %).

2.   attēls

Hromatogrammas:

A)   neesterificēta olīveļļa, pēc iedarbības ar lipāzi; pēc silanizēšanas; šādos apstākļos (8–12 m kapilārā kolonna) vasku frakcija eluējas vienlaicīgi ar digicerīdu frakciju vai pavisam nedaudz vēlāk.

Pēc iedarbības ar lipāzi triglicerīdu saturs nedrīkst būt augstāks par 15 %.

Hromatogrammas:

B)   esterificēta eļļa pēc iedarbības ar lipāzi; pēc silanizēšanas; šādos apstākļos (8–12 m kapilārā kolonna) vasku frakcija eluējas vienlaicīgi ar digicerīdu frakciju vai pavisam nedaudz vēlāk.

Pēc iedarbības ar lipāzi triglicerīdu saturs nedrīkst būt augstāks par 15 %.

8.   PIEZĪMES

1. piezīme.   LIPĀZES SAGATAVOŠANA

Ir nopērkamas lipāzes ar pietiekamu aktivitāti. Tās var sagatavot arī laboratorijā šādi.

Atdzesē līdz 0 °C temperatūrai 5 kg svaigu cūkas aizkuņģa dziedzeru. Atdala apkārtējos cietos taukus un saistaudus, un pēc tam blenderī sasmalcina šķidras pastas veidā. Pastai pievieno 2,5 l bezūdens acetona, 4–6 stundas maisa, pēc tam centrifugē. Atlikumu vēl trīs reizes ekstrahē ar tādu pašu daudzumu bezūdens acetona, pēc tam divas reizes ar acetona/dietilētera (1/1 v/v) maisījumu, un divas reizes ar dietilēteri.

Atlikumu 48 h žāvē vakuumā, lai iegūtu stabilu pulveri, ko var ilgstoši glabāt ledusskapī, sargājot no mitruma iedarbības.

2. piezīme.   LIPĀZES AKTIVITĀTES KONTROLE

Sagatavo olīveļļas emulsiju šādā veidā.

Mikserī 10 min maisa maisījumu, kas sastāv no 165 ml gumiarabika 100 g/l šķīduma, 15 g sasmalcināta ledus un 20 ml iepriekš neitralizētas olīveļļas.

Pārnes 10 ml šīs emulsijas 50 ml tilpuma vārlāzē, pievieno 0,3 ml nātrija holāta 0,2 g/ml šķīdumu, un pēc tam 20 ml destilēta ūdens.

Vārglāzi novieto termostatā 37 °C temperatūrā; ievieto pH-metra elektrodus un spirāles maisītāju.

Ar bireti pa pilienam pievieno 0,1 N nātrija hidroksīda šķīdumu līdz pH 8,3.

Pievieno alikvotu lipāzes pulvera suspensijas ūdenī (0,1 g/ml lipāzes). Tiklīdz pH-metrs rāda 8,3, palaiž hronometru un pa pilienam pievieno nātrija hidroksīdu ar tādu ātrumu, lai reakcija nemainītos, un visu laiku būtu pH 8,3. Ik pēc minūtes atzīmē patērētā sārma daudzumu.

Iegūtos datus attēlo x/y grafikā, kurā uz abscisu ass atliek laiku, bet uz ordinātu ass – 0,1 N sārma šķīduma tilpumu mililitros, kas patērēts nemainīga pH saglabāšanai. Iegūtajai sakarībai jābūt lineārai.

Lipāzes aktivitāti, kas izteikta lipāzes vienībās vienā miligramā, aprēķina pēc šādas formulas:

kur:

A	aktivitāte lipāzes vienības/mg;
V	mililitri 0,1 N nātrija hidroksīda šķīduma minūtē (aprēķina pēc grafika);
N	nātrija hidroksīda šķīduma titrs;
m	testējamās lipāzes parauga masa miligramos.

Lipāzes vienība ir fermenta daudzums, kāds fermentatīvās šķelšanas reakcijās vienā minūtē izdala 10 mikroekvivalentus skābes.”