32000L0045

Directive 2000/45/CE de la Commission

du 6 juillet 2000

établissant des méthodes communautaires d'analyse pour la détermination de la vitamine A, de la vitamine E et du tryptophane dans les aliments pour animaux

(Texte présentant de l'intérêt pour l'EEE)

LA COMMISSION DES COMMUNAUTÉS EUROPÉENNES,

vu le traité instituant la Communauté européenne,

vu la directive 70/373/CEE du Conseil du 20 juillet 1970 concernant l'introduction de modes de prélèvement d'échantillons et de méthodes d'analyse communautaires pour le contrôle officiel des aliments des animaux(1), modifiée en dernier lieu par l'acte d'adhésion de l'Autriche, de la Finlande et de la Suède(2), et notamment son article 2,

considérant ce qui suit:

(1) La directive 70/373/CEE stipule que les contrôles officiels des aliments pour animaux qui visent à constater le respect des conditions prescrites en vertu des dispositions législatives, réglementaires et administratives concernant la qualité et la composition des aliments pour animaux doivent être effectués selon des modes de prélèvement d'échantillons et des méthodes d'analyse communautaires.

(2) La directive 70/524/CEE du Conseil du 23 novembre 1970 concernant les additifs dans l'alimentation des animaux(3), modifiée en dernier lieu par le règlement (CE) n° 2439/1999 de la Commission(4), stipule que la teneur en vitamine A et en vitamine E doit être indiquée sur l'étiquetage lorsque ces substances sont ajoutées à des prémélanges et à des aliments pour animaux.

(3) La directive 79/373/CEE du Conseil du 2 avril 1979 concernant la commercialisation des aliments composés pour animaux(5), modifiée en dernier lieu par la directive 2000/16/CE(6), et la directive 93/74/CEE du Conseil du 13 septembre 1993 concernant les aliments pour animaux visant des objectifs nutritionnels particuliers(7), modifiée en dernier lieu par la directive 96/25/CE(8), stipulent que les amino-acides doivent être indiqués dans l'étiquetage des aliments pour animaux.

(4) Des méthodes d'analyse communautaires doivent être mises au point pour vérifier ces substances.

(5) Les mesures prévues par la présente directive sont conformes à l'avis du comité permanent des aliments des animaux,

A ARRÊTÉ LA PRÉSENTE DIRECTIVE:

Article premier

Les États membres garantissent que les analyses réalisées en vue des contrôles officiels de la teneur des aliments pour animaux et des prémélanges en vitamine A, vitamine E et tryptophane suivent la méthode décrite en annexe.

Article 2

Les États membres mettent en vigueur, avant le 31 août 2000, les dispositions législatives, réglementaires et administratives nécessaires pour se conformer à la présente directive. Ils en informent immédiatement la Commission.

Ils appliquent ces dispositions à compter du 1er septembre 2000.

Lorsque les États membres aodptent ces dispositions, celles-ci contiennent une référence à la présente directive ou sont accompagnées d'une telle référence lors de leur publication officielle. Les modalités de cette référence sont arrêtées par les États membres.

Article 3

La présente directive entre en vigueur le vingtième jour suivant celui de sa publication au Journal officiel des Communautés européennes.

Article 4

Les États membres sont destinataires de la présente directive.

Fait à Bruxelles, le 6 juillet 2000.

Par la Commission

David Byrne

Membre de la Commission

(1) JO L 170 du 3.8.1970, p. 2.

(2) JO C 241 du 29.8.1994, p. 1.

(3) JO L 270 du 14.12.1970, p. 1.

(4) JO L 297 du 18.11.1999, p. 8.

(5) JO L 86 du 6.4.1979, p. 30.

(6) JO L 105 du 3.5.2000, p. 36.

(7) JO L 237 du 22.9.1993, p. 23.

(8) JO L 125 du 23.5.1996, p. 35.

ANNEXE

PARTIE A

DOSAGE DE LA VITAMINE A

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de déterminer la vitamine A (rétinol) dans les aliments pour animaux et les prémélanges. La vitamine A comprend le rétinol-all-trans et ses isomères-cis, qui sont déterminés par cette méthode. La teneur en vitamine A est exprimée en unités internationales (UI) par kg. Une UI correspond à l'activité de 0,300 μg de vitamine A alcool-all-trans ou à 0,344 μg de vitamine A acétate all-trans ou de 0,550 μg de vitamine A palmitate all-trans.

La limite de détermination est de 2000 UI de vitamine A/kg.

2. Principe

L'échantillon est hydrolysé avec une solution d'hydroxyde de potassium éthanolique et la vitamine A est extraite dans de l'éther de pétrole. Le solvant est enlevé par évaporation; le résidu est dissous dans du méthanol et, si nécessaire, dilué à la concentration requise. La teneur en vitamine A est déterminée par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (CLHP-PI) à l'aide d'un détecteur UV ou fluorimétrique. Les paramètres de la chromatographie sont choisis de telle sorte qu'il n'y ait pas de séparation entre la vitamine A alcool-all-trans et ses isomères-cis.

3. Réactifs

3.1. Éthanol, σ = 96 %

3.2. Éther de pétrole, intervalle d'ébullition 40 °C-60 °C

3.3. Méthanol

3.4. Solution d'hydroxyde de potassium, β = 50 g/100 ml

3.5. Solution d'ascorbate de sodium, β = 10 g/100 ml (voir l'observation figurant au point 7.7)

3.6. Sulfure de sodium, Na2S · x H2O (x = 7-9)

3.6.1. Solution de sulfure de sodium, c = 0,5 mol/l dans du glycérol, β = 120 g/l (pour x = 9) (voir l'observation figurant au point 7.8)

3.7. Solution de phénolphtaléine, β = 2 g/100 ml dans de l'éthanol (3.1)

3.8. Propanol-2

3.9. Phase mobile pour CLHP: mélange de méthanol (3.3) et d'eau, par exemple: 980 + 20 (v + v). Les proportions exactes sont déterminées par les caractéristiques de la colonne employée.

3.10. Azote, libre d'oxygène

3.11. Vitamine A acétate all-trans, extra-pure, d'activité garantie, par exemple: 2,80 x 106 UI/g

3.11.1. Solution mère de vitamine A acétate all-trans: peser à 0,1 mg près 50 mg de vitamine A acétate (3.11) dans un ballon jaugé de 100 ml. Dissoudre dans du propanol-2 (3.8) et porter au trait avec le même solvant. La concentration nominale de cette solution est de 1400 UI de vitamine A par ml. La teneur exacte doit être déterminée selon le point 5.6.3.1.

3.12. Vitamine A palmitate all-trans, extra-pure, d'activité garantie, par exemple: 1,80 x 106 UI/g

3.12.1. Solution mère de vitamine A palmitate all-trans: peser à 0,1 mg près 80 mg de vitamine A palmitate (3.12) dans un ballon jaugé de 100 ml. Dissoudre dans du propanol-2 (3.8) et porter au trait avec le même solvant. La concentration nominale de cette solution est de 1400 UI de vitamine A par ml. La teneur exacte doit être déterminée selon le point 5.6.3.2.

3.13. BHT (di-tert-butyl-2,6-méthyl-4-phénol) (voir l'observation figurant au point 7.5)

4. Appareillage

4.1. Évaporateur rotatif à vide

4.2. Verrerie opaque

4.2.1. Ballons sphériques ou coniques, 500 ml, avec col en verre rodé

4.2.2. Ballons jaugés à bouchon en verre rodé, col étroit, de 10, 25, 100 et 500 ml

4.2.3. Ampoules à décanter coniques, de 1000 ml, à bouchon en verre rodé

4.2.4. Ballons piriformes, de 250 ml, avec col en verre rodé

4.3. Réfrigérant d'Allihn, d'une longueur utile de 300 mm, avec joint en verre rodé et adaptateur pour tuyau d'alimentation en gaz

4.4. Papier filtre plissé pour la séparation des phases, d'un diamètre de 185 mm (par exemple: Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Équipement CLHP avec système à injection

4.5.1. Colonne pour chromatographie liquide de 250 mm x 4 mm, C18, particules de 5 ou 10 μm, ou équivalent (critère de performance: un seul pic pour tous les isomères de rétinol dans les conditions CLHP)

4.5.2. Détecteur UV ou fluorimétrique, de longueur d'onde variable

4.6. Spectrophotomètre avec cellules de quartz de 10 mm

4.7. Bain-marie avec agitateur magnétique

4.8. Appareil d'extraction (voir la figure 1) se composant de:

4.8.1. Éprouvette d'une capacité de 1 l, avec col et bouchon en verre rodé

4.8.2. Pièce à rodage mâle munie d'une tige latérale et d'un tube réglable passant en son centre. Ce tube doit avoir une partie inférieure en U et un bec gicleur à son extrémité opposée, de telle sorte que la couche liquide supérieure dans l'éprouvette puisse être transférée dans une ampoule à décanter.

5. Procédure

Note:

La vitamine A est sensible à la lumière (UV) et à l'oxydation. Toutes les opérations doivent être réalisées en l'absence de lumière (dans du verre opaque ou protégé d'une feuille d'aluminium) et en l'absence d'oxygène (éliminé avec de l'azote). Pendant l'extraction, l'air au-dessus du liquide doit être remplacé par de l'azote (éviter l'excès de pression en desserrant le bouchon de temps en temps).

5.1. Préparation de l'échantillon

Moudre l'échantillon pour qu'il passe par un tamis à mailles de 1 mm, en évitant la production de chaleur. Le broyage doit avoir lieu immédiatement avant la pesée et la saponification, sinon il peut y avoir des pertes en vitamine A.

5.2. Saponification

Selon la teneur en poids de la vitamine A, peser, avec une précision de 0,01 g, de 2 à 25 g de l'échantillon dans un ballon sphérique ou conique de 500 ml (4.2.1). Ajouter successivement, tout en remuant, 130 ml d'éthanol (3.1), environ 100 mg de BHT (3.13), 2 ml de solution d'ascorbate de sodium (3.5) et 2 ml de solution de sulfure de sodium (3.6). Adapter un réfrigérant (4.3) au ballon et immerger celui-ci dans un bain-marie avec agitateur magnétique (4.7). Chauffer jusqu'à ébullition et laisser refluer pendant 5 min. Ajouter alors 25 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.4) par le réfrigérant (4.3) et laisser refluer de nouveau pendant 25 min, tout en agitant sous un faible courant d'azote. Rincer alors le réfrigérant avec environ 20 ml d'eau et laisser refroidir le contenu du ballon à la température ambiante.

5.3. Extraction

Transférer quantitativement par décantation la solution de saponification en rinçant avec un volume total de 250 ml d'eau dans une ampoule à décanter de 1000 ml (4.2.3) ou dans l'appareil d'extraction (4.8). Rincer successivement le ballon de saponification avec 25 ml d'éthanol (3.1) et 100 ml d'éther de pétrole (3.2) et transférer le liquide de rinçage dans l'ampoule à décanter ou dans l'appareil d'extraction. La proportion d'eau et d'éthanol dans les solutions combinées doit être d'environ 2:1. Secouer énergiquement pendant 2 min et laisser reposer pendant 2 min.

5.3.1. Extraction à l'aide d'une ampoule à décanter (4.2.3)

Lorsque les couches sont séparées (voir l'observation du point 7.3), transférer la couche d'éther de pétrole dans une autre ampoule à décanter (4.2.3). Répéter deux fois l'opération avec 100 ml d'éther de pétrole (3.2), puis deux fois avec 50 ml d'éther de pétrole (3.2).

Laver deux fois les extraits combinés dans l'ampoule à décanter en remuant doucement (afin d'éviter la formation d'émulsions) avec des portions de 100 ml d'eau et de nouveau en secouant avec d'autres portions de 100 ml d'eau jusqu'à ce que l'eau demeure incolore après addition de solution de phénolphtaléine (3.7) (quatre lavages sont généralement suffisants). Filtrer l'extrait lavé sur un filtre plissé sec pour la séparation des phases (4.4) afin d'éliminer l'eau résiduelle et transférer dans un ballon jaugé de 500 ml (4.2.2). Rincer l'ampoule à décanter et le filtre avec 50 ml d'éther de pétrole (3.2), porter au trait avec de l'éther de pétrole (3.2) et bien mélanger.

5.3.2. Extraction à l'aide d'un appareil d'extraction (4.8)

Lorsque les couches sont séparées (voir l'observation du point 7.3), remettre le bouchon de l'éprouvette (4.8.1) sur la pièce à rodage mâle (4.8.2) et placer l'extrémité inférieure en forme de U du tube réglable de telle sorte qu'elle se trouve juste au-dessus du niveau de l'interface. En exerçant une pression d'azote par la tige latérale, transférer la couche supérieure d'éther de pétrole dans une ampoule à décanter de 1000 ml (4.2.3). Ajouter 100 ml d'éther de pétrole (3.2) dans le cylindre en verre, boucher et bien secouer. Laisser les couches se séparer et transférer la couche supérieure dans l'ampoule à décanter comme précédemment. Répéter la procédure d'extraction avec de nouveau 100 ml d'éther de pétrole (3.2), puis deux fois avec 50 ml d'éther de pétrole (3.2) et ajouter les couches d'éther de pétrole dans l'ampoule à décanter.

Laver les extraits combinés d'éther de pétrole selon la procédure décrite au point 5.3.1 et procéder selon ce point.

5.4. Préparation de la solution de l'échantillon pour CLHP

Pipeter une portion aliquote de la solution d'éther de pétrole (issue de 5.3.1 ou de 5.3.2) dans un ballon piriforme de 250 ml (4.2.4). Laisser évaporer le solvant presque entièrement dans l'évaporateur rotatif (4.1) sous une pression réduite, à une température de bain ne dépassant pas 40 °C. Restaurer la pression atmosphérique en laissant entrer l'azote (3.10) et enlever le ballon de l'évaporateur. Supprimer le reste du solvant dans un courant d'azote (3.10) et dissoudre immédiatement le résidu dans un volume connu (10-100 ml) de méthanol (3.3) (la concentration en vitamine A doit être de l'ordre de 5 UI/ml à 30 UI/ml).

5.5. Dosage par CLHP

La vitamine A est séparée sur une colonne C18 à phase inverse (4.5.1) et la concentration est mesurée à l'aide d'un détecteur UV (325 nm) ou d'un détecteur fluorimétrique (excitation: 325 nm; émission: 475 nm) (4.5.2).

Injecter une portion aliquote (par exemple 20 μl) de la solution méthanolique obtenue sous 5.4 et éluer avec la phase mobile (3.9). Calculer la hauteur moyenne du pic (surface) de plusieurs injections de la même solution de l'échantillon et les hauteurs moyennes des pics (surfaces) de plusieurs injections des solutions d'étalonnage (5.6.2).

Conditions CLHP

Les conditions suivantes sont proposées à titre d'orientation; d'autres conditions peuvent être appliquées pour autant qu'elles donnent des résultats équivalents:

>TABLE>

5.6. Étalonnage

5.6.1. Préparation des solutions-étalons de travail

Pipeter 20 ml de la solution mère de vitamine A acétate (3.11.1) ou 20 ml de la solution mère de vitamine A palmitate (3.12.1) dans un ballon à fond plat ou conique de 500 ml (4.2.1) et hydrolyser comme décrit sous 5.2, mais sans ajouter de BHT. Procéder ensuite à l'extraction avec de l'éther de pétrole (3.2) selon 5.3 et porter à 500 ml avec de l'éther de pétrole (3.2). Laisser évaporer 100 ml de cet extrait presque entièrement sur l'évaporateur rotatif (voir 5.4), enlever le solvant résiduel dans un courant d'azote (3.10) et redissoudre le résidu dans 10,0 ml de méthanol (3.3). La concentration nominale de cette solution est de 560 UI de vitamine A par ml. La teneur exacte doit être déterminée selon 5.6.3.3. La solution-étalon de travail doit être préparée pour chaque emploi.

Pipeter 2,0 ml de cette solution-étalon de travail dans un ballon jaugé de 20 ml, porter au trait avec du méthanol (3.3) et mélanger. La concentration nominale de cette solution étalon de travail diluée est de 56 UI de vitamine A par ml.

5.6.2. Préparation des solutions d'étalonnage et de la courbe d'étalonnage

Transférer 1,0, 2,0, 5,0 et 10,0 ml de la solution-étalon de travail diluée dans une série de ballons jaugés de 20 ml, porter au trait avec du méthanol (3.3) et mélanger. Les concentrations nominales de ces solutions sont de 2,8, 5,6, 14,0 et 28,0 UI de vitamine A par ml.

Injecter plusieurs fois 20 μl de chaque solution d'étalonnage et déterminer les hauteurs moyennes des pics (surfaces). D'après les hauteurs moyennes des pics (surfaces), tracer une courbe d'étalonnage tenant compte des résultats du contrôle UV (5.6.3.3).

5.6.3. Calibration par UV des solutions-étalons

5.6.3.1. Solution mère de vitamine A acétate

Pipeter 2,0 ml de la solution mère de vitamine A acétate (3.11.1) dans un ballon jaugé de 50 ml (4.2.2) et porter au trait avec du propanol-2 (3.8). La concentration nominale de cette solution est de 56 UI de vitamine A par ml. Pipeter 3,0 ml de cette solution de vitamine A acétate diluée dans un ballon jaugé de 25 ml et porter au trait avec du propanol-2 (3.8). La concentration nominale de cette solution est de 6,72 UI de vitamine A par ml. Mesurer le spectre UV de cette solution contre du propanol-2 (3.8) dans le spectrophotomètre (4.6) entre 300 nm et 400 nm. L'extinction maximale doit se situer entre 325 nm et 327 nm.

Calcul de la teneur en vitamine A:

>PIC FILE= "L_2000174FR.003601.EPS">

5.6.3.2. Solution mère de vitamine A palmitate

Pipeter 2,0 ml de la solution mère de vitamine A palmitate (3.12.1) dans un ballon jaugé de 50 ml (4.2.2) et porter au trait avec du propanol-2 (3.8). La concentration nominale de cette solution est de 56 UI de vitamine A par ml. Pipeter 3,0 ml de cette solution de vitamine A de palmitate diluée dans un ballon jaugé de 25 ml et porter au trait avec du propanol-2 (3.8). La concentration nominale de cette solution est de 6,72 UI de vitamine A par ml. Mesurer le spectre UV de cette solution contre du propanol-2 (3.8) dans le spectrophotomètre (4.6) entre 300 nm et 400 nm. L'extinction maximale doit se situer entre 325 nm et 327 nm.

Calcul de la teneur en vitamine A:

>PIC FILE= "L_2000174FR.003602.EPS">

5.6.3.3. Solution-étalon de travail de vitamine A

Pipeter 3,0 ml de la solution-étalon de travail de vitamine A non diluée, préparée selon 5.6.1, dans un ballon jaugé de 50 ml (4.2.2) et porter au trait avec du propanol-2 (3.8). Pipeter 5,0 ml de cette solution dans un ballon jaugé de 25 ml et porter au trait avec du propanol-2 (3.8). La concentration nominale de cette solution est de 6,72 UI de vitamine A par ml. Mesurer le spectre UV de cette solution contre du propanol-2 (3.8) dans le spectrophotomètre (4.6) entre 300 nm et 400 nm. L'extinction maximale doit se situer entre 325 nm et 327 nm.

Calcul de la teneur en vitamine A:

>PIC FILE= "L_2000174FR.003603.EPS">

6. Calcul des résultats

À partir de la hauteur moyenne (surface) des pics de vitamine A de la solution de l'échantillon, déterminer la concentration de cette solution en UI/ml par référence à la courbe d'étalonnage (5.6.2).

La teneur w en vitamine A de l'échantillon, exprimée en UI/kg, est donnée par la formule suivante:

>PIC FILE= "L_2000174FR.003701.EPS">

dans laquelle:

β= teneur en vitamine A de la solution de l'échantillon (5.4) en UI/ml

V1= volume de la solution de l'échantillon (5.4) en ml

V2= volume de la portion aliquote prélevée sous 5.4 en ml

m= masse de la prise d'essai en g

7. Observations

7.1. Pour les échantillons ayant une faible teneur en vitamine A, il peut être utile de rassembler les extraits dans l'éther de pétrole issus de deux saponifications (quantité pesée: 25 g) à une solution de l'échantillon pour dosage par CLHP.

7.2. L'échantillon prélevé pour l'analyse ne doit pas contenir plus de 2 g de matières grasses.

7.3. S'il n'y a pas séparation des phases, ajouter environ 10 ml d'éthanol (3.1) pour briser l'émulsion.

7.4. Avec de l'huile de foie de morue et d'autres matières grasses pures, le temps de saponification doit être porté à 45-60 min.

7.5. Le BHT peut être remplacé par de l'hydroquinone.

7.6. En utilisant une colonne en phase directe, il est possible de séparer les isomères de rétinol.

7.7. La solution d'ascorbate de sodium peut être remplacée par environ 150 mg d'acide ascorbique.

7.8. La solution de sulfure de sodium peut être remplacée par environ 50 mg de EDTA.

8. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles réalisés sur le même échantillon ne doit pas dépasser 15 % par rapport au résultat supérieur.

9. Résultats d'une étude interlaboratoire(1)

>TABLE>

Figure 1: Appareil d'extraction (4.8)

>PIC FILE= "L_2000174FR.003801.EPS">

PARTIE B

DOSAGE DE LA VITAMINE E

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de déterminer la vitamine E dans les aliments pour animaux et les prémélanges. La teneur en vitamine E est exprimée en mg d'acétate de DL-α-tocophérol par kg. 1 mg d'acétate de DL-α-tocophérol correspond à 0,91 mg de DL-α-tocophérol (vitamine E).

La limite de détermination est de 2 mg de vitamine E/kg.

2. Principe

L'échantillon est hydrolysé avec une solution d'hydroxyde de potassium éthanolique et la vitamine E est extraite dans de l'éther de pétrole. Le solvant est enlevé par évaporation; le résidu est dissous dans du méthanol et, si nécessaire, dilué à la concentration requise. La teneur en vitamine E est déterminée par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (CLHP-PI) à l'aide d'un détecteur UV ou fluorimétrique.

3. Réactifs

3.1. Éthanol, σ = 96 %

3.2. Éther de pétrole, intervalle d'ébullition 40 °C-60 °C

3.3. Méthanol

3.4. Solution d'hydroxyde de potassium, β = 50 g/100 ml

3.5. Solution d'ascorbate de sodium, β = 10 g/100 ml (voir l'observation figurant au point 7.7)

3.6. Sulfure de sodium, Na2S · x H2O (x = 7-9)

3.6.1. Solution de sulfure de sodium, c = 0,5 mol/l dans du glycérol, β = 120 g/l (pour x = 9) (voir l'observation figurant au point 7.8)

3.7. Solution de phénolphtaléine, β = 2 g/100 ml dans de l'éthanol (3.1)

3.8. Phase mobile pour CLHP: mélange de méthanol (3.3) et d'eau, par exemple 980 + 20 (v + v). Les proportions exactes sont déterminées par les caractéristiques de la colonne employée.

3.9. Azote, libre d'oxygène

3.10. Acétate de DL-α-tocophérol, extra-pur, d'activité garantie

3.10.1. Solution mère d'acétate de DL-α-tocophérol: peser à 0,1 mg près 100 mg d'acétate de DL-α-tocophérol (3.10) dans un ballon jaugé de 100 ml. Dissoudre dans de l'éthanol (3.1) et porter au trait avec le même solvant. 1 ml de cette solution contient 1 mg d'acétate de DL-α-tocophérol (pour le contrôle UV: voir 5.6.1.3; pour la stabilisation: voir l'observation figurant au point 7.4).

3.11. DL-α-tocophérol, extra-pur, d'activité garantie

3.11.1. Peser à 0,1 mg près 100 mg de DL-α-tocophérol (3.10) dans un ballon jaugé de 100 ml. Dissoudre dans de l'éthanol (3.1) et porter au trait avec le même solvant. 1 ml de cette solution contient 1 mg de DL-α-tocophérol (pour le contrôle UV: voir 5.6.2.3; pour la stabilisation: voir l'observation figurant au point 7.4).

3.12. BHT (di-tert-butyl-2,6-méthyl-4-phénol) (voir l'observation figurant au point 7.5)

4. Appareillage

4.1. Évaporateur rotatif à vide

4.2. Verrerie opaque

4.2.1. Ballons sphériques ou coniques, 500 ml, avec col en verre rodé

4.2.2. Ballons jaugés à bouchon en verre rodé, col étroit, de 10, 25, 100 et 500 ml

4.2.3. Ampoules à décanter coniques, 1000 ml, à bouchon en verre rodé

4.2.4. Ballons piriformes, 250 ml, avec col en verre rodé

4.3. Réfrigérant d'Allihn, de longueur utile 300 mm, avec joint en verre rodé et adaptateur pour tuyau d'alimentation en gaz

4.4. Papier filtre plissé pour la séparation des phases, d'un diamètre de 185 mm (par exemple Schleicher & Schuell 597 HY 1/2)

4.5. Équipement CLHP avec système à injection

4.5.1. Colonne pour chromatographie liquide de 250 mm x 4 mm, C18, particules de 5 ou 10 μm, ou équivalent

4.5.2. Détecteur UV ou fluorimétrique, de longueur d'onde variable

4.6. Spectrophotomètre avec cellules de quartz de 10 mm

4.7. Bain-marie avec agitateur magnétique

4.8. Appareil d'extraction (voir la figure 1) se composant de:

4.8.1. Éprouvette d'une capacité de 1 l, avec col et bouchon en verre rodé

4.8.2. Pièce à rodage mâle munie d'une tige latérale et d'un tube réglable passant en son centre. Ce tube doit avoir une partie inférieure en U et un bec gicleur à son extrémité opposée, de telle sorte que la couche liquide supérieure dans l'éprouvette puisse être transférée dans une ampoule à décanter.

5. Procédure

Note:

La vitamine E est sensible à la lumière (UV) et à l'oxydation. Toutes les opérations doivent être réalisées en l'absence de lumière (dans du verre opaque ou protégé d'une feuille d'aluminium) et en l'absence d'oxygène (éliminé avec de l'azote). Pendant l'extraction, l'air au-dessus du liquide doit être remplacé par de l'azote (éviter l'excès de pression en desserrant le bouchon de temps en temps).

5.1. Préparation de l'échantillon

Moudre l'échantillon pour qu'il passe par un tamis à mailles de 1 mm, en évitant la production de chaleur. Le broyage doit avoir lieu immédiatement avant la pesée et la saponification, sinon il peut y avoir des pertes en vitamine E.

5.2. Saponification

Selon la teneur en poids de la vitamine E, peser, avec une précision de 0,01 g, de 2 à 25 g de l'échantillon dans un ballon sphérique ou conique de 500 ml (4.2.1). Ajouter successivement, tout en remuant, 130 ml d'éthanol (3.1), environ 100 mg de BHT (3.12), 2 ml de solution d'ascorbate de sodium (3.5) et 2 ml de solution de sulfure de sodium (3.6). Adapter un réfrigérant (4.3) au ballon et immerger celui-ci dans un bain-marie avec agitateur magnétique (4.7). Chauffer jusqu'à ébullition et laisser refluer pendant 5 min. Ajouter alors 25 ml de solution d'hydroxyde de potassium (3.4) par le réfrigérant (4.3) et laisser refluer de nouveau pendant 25 min, tout en agitant sous un faible courant d'azote. Rincer alors le réfrigérant avec environ 20 ml d'eau et laisser refroidir le contenu du ballon à la température ambiante.

5.3. Extraction

Transférer quantitativement par décantation la solution de saponification en rinçant avec un volume total de 250 ml d'eau dans une ampoule à décanter de 1000 ml (4.2.3) ou dans l'appareil d'extraction (4.8). Rincer successivement le ballon de saponification avec 25 ml d'éthanol (3.1) et 100 ml d'éther de pétrole (3.2) et transférer le liquide de rinçage dans l'ampoule à décanter ou dans l'appareil d'extraction. La proportion d'eau et d'éthanol dans les solutions combinées doit être d'environ 2:1. Secouer énergiquement pendant 2 min et laisser reposer pendant 2 min.

5.3.1. Extraction à l'aide d'une ampoule à décanter (4.2.3)

Lorsque les couches sont séparées (voir l'observation figurant au point 7.3), transférer la couche d'éther de pétrole dans une autre ampoule à décanter (4.2.3). Répéter deux fois l'opération avec 100 ml d'éther de pétrole (3.2), puis deux fois avec 50 ml d'éther de pétrole (3.2).

Laver deux fois les extraits combinés dans l'ampoule à décanter en remuant doucement (afin d'éviter la formation d'émulsions) avec des portions de 100 ml d'eau et de nouveau en secouant avec d'autres portions de 100 ml d'eau jusqu'à ce que l'eau demeure incolore après addition de solution de phénolphtaléine (3.7) (quatre lavages sont généralement suffisants). Filtrer l'extrait lavé sur un filtre plissé sec pour la séparation des phases (4.4) afin d'éliminer l'eau résiduelle et transférer dans un ballon jaugé de 500 ml (4.2.2). Rincer l'ampoule à décanter et le filtre avec 50 ml d'éther de pétrole (3.2), porter au trait avec de l'éther de pétrole (3.2) et bien mélanger.

5.3.2. Extraction à l'aide d'un appareil d'extraction (4.8)

Lorsque les couches sont séparées (voir l'observation figurant au point 7.3), remettre le bouchon de l'éprouvette (4.8.1) sur la pièce à rodage mâle (4.8.2) et placer l'extrémité inférieure en forme de U du tube réglable de telle sorte qu'elle se trouve juste au-dessus du niveau de l'interface. En exerçant une pression d'azote par la tige latérale, transférer la couche supérieure d'éther de pétrole dans une ampoule à décanter de 1000 ml (4.2.3). Ajouter 100 ml d'éther de pétrole (3.2) dans le cylindre en verre, boucher et bien secouer. Laisser les couches se séparer et transférer la couche supérieure dans l'ampoule à décanter comme précédemment. Répéter la procédure d'extraction avec de nouveau 100 ml d'éther de pétrole (3.2), puis deux fois avec 50 ml d'éther de pétrole (3.2) et ajouter les couches d'éther de pétrole dans l'ampoule à décanter.

Laver les extraits combinés d'éther de pétrole selon la procédure décrite au point 5.3.1 et procéder selon ce point.

5.4. Préparation de la solution de l'échantillon pour CLHP

Pipeter une portion aliquote de la solution d'éther de pétrole (issue de 5.3.1 ou de 5.3.2) dans un ballon piriforme de 250 ml (4.2.4). Laisser évaporer le solvant presque entièrement dans l'évaporateur rotatif (4.1) sous une pression réduite, à une température de bain ne dépassant pas 40 °C. Restaurer la pression atmosphérique en laissant entrer l'azote (3.9) et enlever le ballon de l'évaporateur. Supprimer le reste du solvant dans un courant d'azote (3.9) et dissoudre immédiatement le résidu dans un volume connu (10-100 ml) de méthanol (3.3) (la concentration en DL-α-tocophérol doit être de l'ordre de 5 μg/ml à 30 μg/ml).

5.5. Dosage par CLHP

La vitamine E est séparée sur une colonne C18 à phase inverse (4.5.1) et la concentration est mesurée à l'aide d'un détecteur fluorimétrique (excitation: 295 nm; émission: 330 nm) ou d'un détecteur UV (292 nm) (4.5.2).

Injecter une portion aliquote (par exemple 20 μl) de la solution méthanolique obtenue sous 5.4 et éluer avec la phase mobile (3.8). Calculer les hauteurs moyennes des pics (surfaces) de plusieurs injections de la même solution de l'échantillon et les hauteurs moyennes des pics (surfaces) de plusieurs injections des solutions d'étalonnage (5.6.2).

Conditions CLHP

Les conditions suivantes sont proposées à titre d'orientation; d'autres conditions peuvent être appliquées pour autant qu'elles donnent des résultats équivalents.

>TABLE>

5.6. Étalonnage (acétate de DL-α-tocophérol ou DL-α-tocophérol)

5.6.1. Solution-étalon d'acétate de DL-α-tocophérol

5.6.1.1. Préparation de la solution-étalon de travail

Pipeter 25 ml de la solution mère d'acétate de DL-α-tocophérol (3.10.1) dans un ballon à fond plat ou conique de 500 ml (4.2.1) et hydrolyser comme décrit au point 5.2. Procéder ensuite à l'extraction avec de l'éther de pétrole (3.2) selon le point 5.3 et porter à 500 ml avec de l'éther de pétrole. Laisser évaporer 25 ml de cet extrait presque entièrement sur l'évaporateur rotatif (voir le point 5.4), enlever le solvant résiduel dans un courant d'azote (3.9) et redissoudre le résidu dans 25,0 ml de méthanol (3.3). La concentration nominale de cette solution est de 45,5 μg de DL-α-tocophérol par ml, équivalent à 50 μg d'acétate de DL-α-tocophérol par ml. La solution-étalon de travail doit être préparée pour chaque emploi.

5.6.1.2. Préparation des solutions d'étalonnage et de la courbe d'étalonnage

Transférer 1,0, 2,0, 4,0 et 10,0 ml de la solution-étalon de travail dans une série de ballons jaugés de 20 ml, porter au trait avec du méthanol (3.3) et mélanger. Les concentrations nominales de ces solutions sont de 2,5, 5,0, 10,0 et 25,0 μg/ml d'acétate de DL-α-tocophérol, soit 2,28, 4,55, 9,10 μg/ml et 22,8 μg/ml de DL-α-tocophérol.

Injecter plusieurs fois 20 μl de chaque solution d'étalonnage et déterminer les hauteurs moyennes des pics (surfaces). D'après les hauteurs moyennes des pics (surfaces), tracer une courbe d'étalonnage.

5.6.1.3. Calibration par UV de la solution mère d'acétate de DL-α-tocophérol (3.10.1)

Diluer 5,0 ml de la solution mère d'acétate de DL-α-tocophérol (3.10.1), porter à 25,0 ml dans de l'éthanol et mesurer le spectre UV de cette solution contre de l'éthanol (3.1) dans le spectrophotomètre (4.6) entre 250 nm et 320 nm.

L'absorption maximale doit être de 284 nm:

>PIC FILE= "L_2000174FR.004201.EPS">

À cette dilution, une valeur d'extinction de 0,84 à 0,88 devrait être obtenue.

5.6.2. Solution-étalon de DL-α-tocophérol

5.6.2.1. Préparation de la solution-étalon de travail

Pipeter 2,0 ml de la solution-étalon de DL-α-tocophérol (3.11.1) dans un ballon jaugé de 50 ml, dissoudre dans du méthanol (3.3) et porter au trait avec du méthanol. La concentration nominale de cette solution est de 40 μg de DL-α-tocophérol par ml, équivalant à 44,0 μg d'acétate de DL-α-tocophérol par ml. La solution-étalon de travail doit être préparée pour chaque emploi.

5.6.2.2. Préparation des solutions d'étalonnage et de la courbe d'étalonnage

Transférer 1,0, 2,0, 4,0 et 10,0 ml de la solution-étalon de travail dans une série de ballons jaugés de 20 ml, porter au trait avec du méthanol (3.3) et mélanger. Les concentrations nominales de ces solutions sont de 2,0, 4,0, 8,0 et 20,0 μg/ml de DL-α-tocophérol, soit 2,20, 4,40, 8,79 μg/ml et 22,0 μg/ml d'acétate de DL-α-tocophérol.

Injecter plusieurs fois 20 μl de chaque solution d'étalonnage et déterminer les hauteurs moyennes des pics (surfaces). D'après les hauteurs moyennes des pics (surfaces), tracer une courbe d'étalonnage.

5.6.2.3. Calibration par UV de la solution mère de DL-α-tocophérol (3.11.1)

Diluer 2,0 ml de la solution mère de DL-α-tocophérol (3.11.1), porter à 25,0 ml dans de l'éthanol et mesurer le spectre UV de cette solution contre de l'éthanol (3.1) dans le spectrophotomètre (4.6) entre 250 nm et 320 nm. L'absorption maximale doit être de 292 nm:

>PIC FILE= "L_2000174FR.004202.EPS">

À cette dilution, une valeur d'extinction de 0,6 devrait être obtenue.

6. Calcul des résultats

À partir de la hauteur moyenne (surface) des pics de vitamine E de la solution de l'échantillon, déterminer la concentration de cette solution en μg/ml (exprimée en acétate de DL-α-tocophérol) par référence à la courbe d'étalonnage (5.6.1.2 ou 5.6.2.2).

La teneur w en vitamine E de l'échantillon, exprimée en mg/kg, est donnée par la formule suivante:

>PIC FILE= "L_2000174FR.004203.EPS">

dans laquelle

β= teneur en vitamine E de la solution de l'échantillon (5.4) en μg/ml

V1= volume de la solution de l'échantillon (5.4) en ml

V2= volume de la portion aliquote prélevée sous 5.4 en ml

m= masse de la prise d'essai en g

7. Observations

7.1. Pour les échantillons ayant une faible teneur en vitamine E, il peut être utile de rassembler les extraits dans l'éther de pétrole issus de deux saponifications (quantité pesée: 25 g) à une solution de l'échantillon pour dosage par CLHP.

7.2. L'échantillon prélevé pour l'analyse ne doit pas contenir plus de 2 g de matières grasses.

7.3. S'il n'y a pas séparation des phases, ajouter environ 10 ml d'éthanol (3.1) pour briser l'émulsion.

7.4. Une fois la mesure spectrophotométrique de la solution d'acétate de DL-α-tocophérol ou de DL- -tocophérol effectuée, respectivement selon 5.6.1.3 ou 5.6.2.3, ajouter environ 10 mg de BHT (3.12) à la solution (3.10.1 ou 3.10.2) et conserver cette solution au réfrigérateur (durée maximale de stockage: quatre semaines).

7.5. Le BHT peut être remplacé par de l'hydroquinone.

7.6. Il est possible d'utiliser une colonne en phase directe pour séparer les tocophérols α-, β-, χ- et δ.

7.7. La solution d'ascorbate de sodium peut être remplacée par environ 150 mg d'acide ascorbique.

7.8. La solution de sulfure de sodium peut être remplacée par environ 50 mg de EDTA.

8. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux dosages parallèles réalisés sur le même échantillon ne doit pas dépasser 15 % par rapport au résultat supérieur.

9. Résultats d'une étude interlaboratoire(2)

>TABLE>

Figure 1: Appareil d'extraction (4.8)

>PIC FILE= "L_2000174FR.004401.EPS">

PARTIE C

DOSAGE DU TRYPTOPHANE

1. Objet et domaine d'application

La méthode permet de déterminer le tryptophane total et libre dans les aliments pour animaux. Elle ne fait pas de distinction entre les formes D et L.

2. Principe

Pour la détermination du tryptophane total, l'échantillon est hydrolysé en milieu basique avec une solution d'hydroxyde de baryum saturée et il est chauffé à 110 °C pendant vingt heures. Après l'hydrolyse, l'étalon interne est ajouté.

Pour la détermination du tryptophane libre, l'échantillon est extrait en milieu acide en présence de l'étalon interne.

Le tryptophane et l'étalon interne dans l'hydrolysat ou dans l'extrait sont déterminés par CLHP à l'aide d'un détecteur fluorimétrique.

3. Réactifs

3.1. Utiliser de l'eau bi-distillée ou de l'eau de qualité équivalente (conductivité < 10 ìS/cm)

3.2. Substance-étalon: tryptophane (pureté/teneur >= 99 %) séché sous vide sur diphosphore pentoxyde

3.3. Étalon interne proprement dit: α-méthyl-tryptophane (pureté/teneur >= 99 %), séché sous vide sur diphosphore pentoxyde

3.4. Hydroxyde de baryum octahydraté (veiller à ne pas exposer excessivement le Ba(OH)2 · 8H2O à l'air afin d'éviter la formation de BaCO3, qui pourrait perturber le dosage) (voir l'observation figurant au point 9.3).

3.5. Hydroxyde de sodium

3.6. Acide orthophosphorique, w = 85 %

3.7. Acide chlorhydrique, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8. Méthanol, de qualité CLHP

3.9. Éther de pétrole, intervalle d'ébullition: 40-60 °C

3.10. Solution d'hydroxyde de sodium, c = 1 mol/l:

dissoudre 40,0 g de NaOH (3.5) dans de l'eau et porter au litre avec de l'eau (3.1)

3.11. Acide chlorhydrique, c = 6 mol/l:

Prendre 492 ml HCl (3.7) et porter au litre avec de l'eau

3.12. Acide chlorhydrique, c = 1 mol/l:

prendre 82 ml HCl (3.7) et porter au litre avec de l'eau

3.13. Acide chlorhydrique, c = 0,1 mol/l:

prendre 8,2 ml HCl (3.7) et porter au litre avec de l'eau

3.14. Acide orthophosphorique, c = 0,5 mol/l:

prendre 34 ml d'acide orthophosphorique (3.6) et porter au litre avec de l'eau (3.1)

3.15. Solution mère de tryptophane (3.2), c = 2,50 μmol/ml

Dans un ballon jaugé de 500 ml, dissoudre 0,2553 g de tryptophane (3.2) dans de l'acide chlorhydrique (3.13) et porter au trait avec de l'acide chlorhydrique (3.13). Entreposer à - 18 °C pendant quatre semaines au maximum.

3.16. Solution-étalon interne concentrée, c = 2,50 μmol/ml

Dans un ballon jaugé de 500 ml, dissoudre 0,2728 g de α-méthyl-tryptophane (3.3) dans de l'acide chlorhydrique (3.13) et porter au trait avec de l'acide chlorhydrique (3.13). Entreposer à - 18 °C pendant quatre semaines au maximum.

3.17. Solution-étalon de calibration de tryptophane et étalon interne

Prendre 2,00 ml de solution mère de tryptophane (3.15) et 2,00 ml de solution mère-étalon interne (de α-méthyl-tryptophane) (3.16). Diluer avec de l'eau (3.1) et du méthanol (3.8) approximativement au même volume et approximativement à la même concentration de méthanol ( 10-30 %) que l'hydrolysat fini.

Cette solution doit être préparée pour chaque usage.

Se protéger de la lumière directe du soleil pendant la préparation.

3.18. Acide acétique

3.19. Trichloro-1,1,1-méthyl-2-propanol-2

3.20. Éthanolamine > 98 %

3.21. Solution de 1 g de trichloro-1,1,1-méthyl-2-propanol-2 (3.19) dans 100 ml de méthanol (3.8)

3.22. Phase mobile pour CLHP: 3,00 g d'acide acétique (3.18) + 900 ml d'eau (3.1) + 50,0 ml de solution (3.21) de trichloro-1,1,1-méthyl-2-propanol-2 (3.19) dans du méthanol (3.8) (1 g/100 ml). Ajuster le pH à 5,00 à l'aide d'éthanolamine (3.20). Porter à 1000 ml avec de l'eau (3.1).

4. Appareillage

4.1. Équipement pour CLHP avec détection spectrofluorimétrique

4.2. Colonne pour chromatographie liquide, 125 mm x 4 mm, C18, particules de 3 μm, ou équivalent

4.3. pH-mètre

4.4. Ballon en polypropylène, capacité 125 ml, à large col et bouchon à vis

4.5. Filtre membrane, 0,45 μm

4.6. Autoclave, 110 (+- 2) °C, 1,4 (+- 0,1) bar

4.7. Agitateur mécanique ou magnétique

4.8. Agitateur Vortex

5. Procédure

5.1. Préparation des échantillons

Broyer l'échantillon pour le faire passer dans un tamis de 0,5 mm. Les échantillons à forte teneur en humidité doivent être séchés à l'air à une température de 50 °C au maximum ou par lyophilisation avant broyage. Les échantillons à forte teneur en matières grasses doivent être extraits par éther de pétrole (3.9) avant broyage.

5.2. Détermination du tryptophane libre (extrait)

Peser à 1 mg près une quantité adéquate (1-5 g) de l'échantillon préparé (5.1) dans un ballon conique. Ajouter 100,0 ml d'acide chlorhydrique, c = 0,1 mol/l (3.13) et 5,00 ml de solution mère étalon interne (3.16). Agiter ou mélanger pendant 60 min à l'aide d'un agitateur mécanique ou magnétique (4.7). Laisser décanter le sédiment et pipeter 10,0 ml de la solution surnageante dans un bécher. Ajouter 5 ml d'acide orthophosphorique, c = 0,5 mol/l (3.14). Ajuster le pH à 3 avec de l'hydroxyde de sodium, c = 1,0 mol/l (3.10). Ajouter suffisamment de méthanol (3.8) pour obtenir une concentration comprise entre 10 et 30 % de méthanol dans le volume final. Transférer dans un ballon jaugé de volume approprié et diluer avec de l'eau au volume nécessaire pour la chromatographie [environ le même volume que la solution étalon de calibration (3.17)].

Filtrer quelques millilitres de la solution à travers un filtre membrane de 0,45 μm (4.5) avant d'injecter sur une colonne CLHP. Passer à l'étape de la chromatographie selon le point 5.4.

Protéger la solution-étalon et les extraits de la lumière directe du soleil. S'il n'est pas possible d'analyser les extraits le jour même, ils doivent être stockés à 5 °C pendant trois jours au maximum.

5.3. Dosage du tryptophane total (hydrolysat)

Peser à 0,2 mg près entre 0,1 et 1 g de l'échantillon préparé (5.1) dans le ballon en polypropylène (4.4). La portion d'échantillon pesée doit avoir une teneur en azote d'environ 10 mg. Ajouter 8,4 g d'hydroxyde de baryum octahydraté (3.4) et 10 ml d'eau. Mélanger avec un agitateur Vortex (4.8) ou un agitateur magnétique (4.7). Laisser l'aimant enrobé de téflon dans le mélange. Laver les parois du récipient avec 4 ml d'eau. Poser le bouchon à vis et fermer le ballon sans serrer. Transférer dans un autoclave (4.6) avec eau bouillante et vapeur d'eau pendant 30 à 60 min. Fermer l'autoclave et le mettre en marche à 110 (+- 2) °C pendant vingt heures.

Avant d'ouvrir l'autoclave, réduire la température à un peu moins de 100 °C. Pour éviter la cristallisation de Ba(OH)2 · 8 H2O, ajouter au mélange chaud 30 ml d'eau à la température ambiante. Agiter ou remuer doucement. Ajouter 2,00 ml de la solution mère (de α-méthyl-tryptophane)-étalon interne (3.16). Refroidir les récipients dans un bain d'eau/de glace pendant 15 min.

Ajouter alors 5 ml d'acide orthophosphorique, c = 0,5 mol/l (3.14). Maintenir le récipient dans le bain réfrigérant et neutraliser à l'acide chlorhydrique, c = 6 mol/l (3.11) tout en remuant, puis ajuster le pH à 3,0 à l'aide de HCl, c = 1 mol/l (3.12). Ajouter suffisamment de méthanol pour obtenir une concentration comprise entre 10 et 30 % de méthanol dans le volume final. Transférer dans un ballon jaugé de volume approprié et diluer avec de l'eau au volume nécessaire pour la chromatographie (par exemple 100 ml). L'addition de méthanol ne doit pas provoquer de précipitation.

Filtrer quelques millilitres de la solution au travers d'un filtre membrane de 0,45 μm (4.5) avant d'injecter sur une colonne CLHP. Passer à l'étape de la chromatographie selon le point 5.4.

Protéger la solution-étalon et les hydrolysats de la lumière directe du soleil. Si les hydrolysats ne peuvent pas être analysés le jour même, ils doivent être stockés à 5 °C pendant trois jours au maximum.

5.4. Dosage par CLHP

Les conditions suivantes de l'élution isocratique sont proposées à titre d'orientation; d'autres conditions peuvent être appliquées à condition qu'elles donnent des résultats équivalents (voir également les observations figurant aux points 9.1 et 9.2):

>TABLE>

6. Calcul des résultats

>PIC FILE= "L_2000174FR.004701.EPS">

A= surface du pic de l'étalon interne, solution étalon de calibration (3.17)

B= surface du pic de tryptophane, extrait (5.2) ou hydrolysat (5.3)

C= volume en ml (2 ml) de solution mère de tryptophane (3.15) ajoutée à la solution de calibration (3.17)

D= concentration en μmol/ml (= 2,50) de solution mère de tryptophane (3.15) ajoutée à la solution de calibration (3.17)

E= volume en ml de la solution mère-étalon interne (3.16) ajoutée à l'extraction (5.2) (= 5,00 ml) ou à l'hydrolysat (5.3) (= 2,00 ml)

F= surface du pic de l'étalon interne, extrait (5.2) ou hydrolysat (5.3)

G= surface du pic de tryptophane, solution-étalon de calibration (3.17)

H= volume en ml (= 2,00 ml) de la solution mère-étalon interne (3.16) ajoutée à la solution-étalon de calibration (3.17)

W= poids de l'échantillon en g (corrigé pour obtenir le poids initial si le produit est séché et/ou dégraissé)

MW= poids moléculaire du tryptophane (= 204,23)

7. Répétabilité

La différence entre les résultats de deux déterminations parallèles réalisées sur le même échantillon ne peut dépasser 10 % par rapport au résultat le plus élevé.

8. Résultats d'un essai interlaboratoire

Un essai interlaboratoire communautaire (quatrième intercomparaison) a été réalisé; trois échantillons ont été analysés par 12 laboratoires pour certifier la méthode par hydrolyse. Chaque essai a été soumis à 5 analyses. Les résultats figurent dans le tableau suivant:

>TABLE>

Un autre essai interlaboratoire communautaire (troisième intercomparaison) a été réalisé; deux échantillons ont été analysés par treize laboratoires pour certifier la méthode par extraction du tryptophane libre. Chaque essai a été soumis à cinq analyses. Les résultats figurent dans le tableau suivant:

>TABLE>

Un autre essai interlaboratoire communautaire a été réalisé; quatre échantillons ont été analysés par sept laboratoires pour certifier la méthode par hydrolyse. Chaque essai a été soumis à cinq analyses. Les résultats figurent dans le tableau suivant:

>TABLE>

9. Observations

9.1. Les conditions spéciales de chromatographie suivantes peuvent donner une meilleure séparation entre le tryptophane et le α-méthyl-tryptophane.

>TABLE>

9.2. La chromatographie varie selon le type de CLHP et selon le remplissage de la colonne. Le système retenu doit donner un retour à la ligne de base entre les pics du tryptophane et de l'étalon interne. De plus, il est important que les produits de décomposition soient bien séparés du tryptophane et de l'étalon interne. Il faut réaliser un essai sans étalon interne de façon à vérifier l'absence d'impuretés sur la ligne de base au niveau de l'étalon interne. Il est important que le temps d'élution soit suffisamment long pour permettre l'élution de tous les produits de décomposition, faute de quoi des pics d'élution tardifs peuvent interférer avec les opérations de chromatographie ultérieures.

Dans la gamme des opérations, le système chromatographique doit donner une réponse linéaire. Cette réponse doit être mesurée à une concentration constante (la concentration normale) de l'étalon interne et à différentes concentrations en tryptophane. Il est important que la hauteur des pics du tryptophane et de l'étalon interne se situe dans la gamme linéaire du système CLHP/fluorescence. Si le ou les pics du tryptophane et/ou de l'étalon interne sont trop petits ou trop grands, l'analyse doit être reproduite avec un échantillon d'une autre dimension et/ou un volume final modifié.

9.3. Hydroxyde de baryum

Avec le temps, l'hydroxyde de baryum devient plus difficile à dissoudre. Cela donne une solution trouble pour la détermination par CLHP, ce qui peut entraîner de faibles résultats pour le tryptophane.

(1) Étude menée par le groupe de travail sur les aliments pour animaux de la Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(2) Étude menée par le groupe de travail sur les aliments pour animaux de la Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).