”LIITE I

OLIIVIÖLJYJEN OMINAISUUDET

Huom.

(a)	Määritystulokset on ilmaistava yhtä monen desimaalin tarkkuudella kuin kunkin ominaisuuden osalta esitetään. Viimeinen luku on pyöristettävä yhdellä yksiköllä ylöspäin, jos sitä seuraava luku on suurempi kuin 4.

(b)	Jos öljyn yksikin ominaisuus poikkeaa annetuista arvoista, sen luokka muutetaan tai todetaan, ettei se täytä vaatimuksia puhtauden osalta.

(c)

Öljyyn laatuun viittaavat tähdellä (*) merkityt ominaisuudet tarkoittavat, että: — lamppuoliiviöljyn ei tarvitse täyttää kaikkia raja-arvoja koskevia vaatimuksia samanaikaisesti, — jos neitsytoliiviöljy ei täytä jotain raja-arvoa koskevaa vaatimusta, öljyn luokka muutetaan, mutta se säilyy edelleen luokiteltuna johonkin neitsytoliiviöljyluokista.

(d)	Kaksi tähteä (**) ominaisuuden kohdalla tarkoittaa, että oliivin puristemassaöljyjen ei tarvitse täyttää kaikkia raja-arvoja koskevia vaatimuksia samanaikaisesti.”

Luokka	Happo-pitoisuus (%) (*)	Peroksidiluku mEq O2/kg (*)	Vahat mg/kg (**)	2-glyseryylimonopalmitaatti (%)	Stigma-stadieeni mg/kg (1)	HPLC:llä määritetyn ja teoreettisesti lasketun ECN42:n välinen ero	K232 (*)	K270 (*)	Delta-K (*)	Aistinvarainen arvio Virheen mediaani (Md) (*)	Aistinvarainen arvio hedelmäisyyden mediaani (Mf) (*)
1. Ekstra-neitsytoliiviöljy	≤ 0,8	≤ 20	≤ 250	≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 ≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14	≤ 0,10	≤ 0,2	≤ 2,50	≤ 0,22	≤ 0,01	Md = 0	Mf > 0
2. Neitsytoliiviöljy	≤ 2,0	≤ 20	≤ 250	≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 ≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14	≤ 0,10	≤ 0,2	≤ 2,60	≤ 0,25	≤ 0,01	Md ≤ 2,5	Mf > 0
3. Lamppuoliiviöljy	> 2,0	—	≤ 300 (3)	≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 ≤ 1,1 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14	≤ 0,50	≤ 0,3	—	—	—	Md > 2,5 (2)	—
4. Jalostettu oliiviöljy	≤ 0,3	≤ 5	≤ 350	≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 ≤ 1,1 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14	—	≤ 0,3	—	≤ 1,10	≤ 0,16	—	—
5. Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettu oliiviöljy	≤ 1,0	≤ 15	≤ 350	≤ 0,9 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % ≤ 14 ≤ 1,0 jos palmitiinihapon kokonaisprosenttiosuus % > 14	—	≤ 0,3	—	≤ 0,90	≤ 0,15	—	—
6. Raaka oliivin puristemassaöljy	—	—	> 350 (4)	≤ 1,4	—	≤ 0,6	—	—	—	—	—
7. Jalostettu oliivin puristemassaöljy	≤ 0,3	≤ 5	> 350	≤ 1,4	—	≤ 0,5	—	≤ 2,00	≤ 0,20	—	—
8. Oliivin puristemassaöljy	≤ 1,0	≤ 15	> 350	≤ 1,2	—	≤ 0,5	—	≤ 1,70	≤ 0,18	—	—

Luokka

Rasvahappojen pitoisuus (5)

Transoleeni-isomeerien (%)

Transoleeni-isomeerien ja translinoleeni-isomeerien summa (%)

Kolesteroli

Kokonais-sterolit (mg/kg)

Erytrodioli ja uvaoli (%) (**)

Myristiini-happo (%)

Linoleeni-happo (%)

Arakidoni-happo (%)

Eikosaeeni-happo (%)

Beheeni-happo (%)

Lignoseriini-happo (%)

Kolesteroli (%)

Brassika-steroli (%)

Kampe-steroli (%)

Stigma-steroli (%)

Beeta-steroli (%) (6)

Delta-7-stigma-steroli (%)

1. Ekstra-neitsytoliiviöljy

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

2. Neitsytoliiviöljy

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

3. Lamppuoliiviöljy

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,10

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5 (7)

4. Jalostettu oliiviöljy

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

5. Jalostetusta oliiviöljystä ja neitsytoliiviöljystä valmistettu oliiviöljy

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

6. Raaka oliivin puristemassaöljy

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 2 500

> 4,5 (8)

7. Jalostettu oliivin puristemassaöljy

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 800

> 4,5

8. Oliivin puristemassaöljy

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 600

> 4,5

LIITE IV

VAHAPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN KAPILLAARIKAASUKROMATOGRAFISELLA MENETELMÄLLÄ

1.   TARKOITUS

Tällä menetelmällä määritetään oliiviöljyjen vahapitoisuus. Vahat eroavat toisistaan hiiliatomien lukumäärän suhteen. Tätä menetelmää voidaan käyttää erityisesti tekemään ero puristamalla saadun oliiviöljyn ja puristemassasta saadun öljyn välillä.

2.   PERIAATE

Rasva, johon on lisätty soveltuva sisäinen standardi, fraktioidaan kromatografisesti hydratoitua silikageeliä sisältävässä kolonnissa; koeolosuhteissa ensimmäisenä eluoitunut jae (jonka polaarisuus on triglyseridien polaarisuutta heikompi) otetaan talteen ja määritetään suoraan kapillaarikaasukromatografian avulla.

3.   VÄLINEISTÖ

3.1   Erlenmeyer-pullo, 25 ml.

3.2   Lasikolonni kaasukromatografiaa varten, sisähalkaisija 15,0 mm ja pituus 30–40 cm, varustettu hanalla.

3.3   Soveltuva kaasukromatografialaitteisto, joka toimii kapillaarikolonnin kanssa ja jossa on suoraan kolonniin johtava näytteensyöttöjärjestelmä. Laitteiston osat ovat:

3.3.1   termostaattisäätöinen lämpötilaohjelmoitu uuni kolonnille,

3.3.2   kylmäinjektori, näytteen syöttämiseksi suoraan kolonniin,

3.3.3   liekki-ionisaatiodetektori ja muuntajavahvistin,

3.3.4   integroiva piirturi, joka toimii muuntajavahvistimen (3.3.3) kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan säätää. (On myös mahdollista käyttää tietokonepohjaisia järjestelmiä, joissa kaasukromatografin tiedot saadaan tietokoneen avulla.)

3.3.5   lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty stationäärifaasilla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10–0,30 μm. (Käyttövalmiina ostettavat stationäärifaasit ovat tyyppiä SE 52 tai SE 54.)

3.4   Mikroruisku, kolonniin suoraan syöttämiseksi, 10 μl, jossa on kiinteä neula.

3.5   Sähkökäyttöinen sekoittaja.

3.6   Pyöröhaihduttaja.

3.7   Muhveliuuni.

3.8   Analyysivaaka, jonka tarkkuus ± 0,1 mg.

3.9   Laboratorion tavanomaiset lasivälineet.

4.   REAGENSSIT

4.1   Silikageeliä, jonka hiukkaskoko 60–200 μm.

Silikageeli laitetaan uuniin 500 °C:n lämpötilaan vähintään 4 tunniksi. Jäähdytetään ja lisätään vettä 2 % silikageelin määrästä. Sekoitetaan massan homogenoimiseksi. Säilytetään pimeässä vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.

4.2   N-heksaani, kromatografialaatua.

4.3   Etyylieetteriä, kromatografialaatua.

4.4   N-heptaani, kromatografialaatua.

4.5   Lauryyliarakidaatin standardiliuos, 0,1 % (m/V) liuos heksaanissa (sisäinen standardi). (On myös mahdollista käyttää palmityylipalmitaattia tai myristyylistearaattia.)

4.5.1   Sudan 1 (1-fenyyliatso)-2-naftoli).

4.6   Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.

4.7   Apukaasut:

—	puhdas vety, kaasukromatografialaatua,

—	puhdas ilma, kaasukromatografialaatua.

5.   SUORITUS

5.1   Kromatografiakolonnin esikäsittely

Suspendoidaan 15 g silikageeliä (4.1) n-heksaaniin (4.2) ja laitetaan kolonniin (3.2). Annetaan laskeutua itsestään ja autetaan laskeutumista sähkökäyttöisellä sekoittajalla (3.5), jotta saadaan homogeenisempi kromatografiakerros. Suodatetaan läpi 30 ml n-heksaania mahdollisten epäpuhtauksien poistamiseksi. Punnitaan vaa’alla (3.8) tarkasti 500 mg näytettä 25 ml:n erlenmeyerpulloon (3.1), lisätään sopiva määrä sisäistä standardia (4.5) oletetun vahapitoisuuden mukaan. Esimerkiksi: lauryyliarakidaattia lisätään 0,1 mg, jos on kyse oliiviöljystä, ja 0,25–0,5 mg, jos kyse on puristemassaöljystä. Siirretään näin valmistettu näyte kahden 2 ml:n n-heksaaniannoksen avulla kromatografiakolonniin (4.2).

Liuottimen annetaan valua, kunnes se on 1 mm absorboimisaineen pinnan yläpuolella, minkä jälkeen suodatetaan läpi 70 ml n-heksaania luonnostaan esiintyvien n-alkaanien poistamiseksi. Aloitetaan kromatografinen eluointi keräämällä 180 ml n-heksaani/etyylieetteriseosta, suhde 99:1, valumisnopeuden ollessa noin 15 tippaa 10 sekunnissa. Näyte eluoidaan lämpötilassa 22 °C ± 4.

Huom.

—	N-heksaani/etyylieetteriseos, suhde 99:1, on valmistettava uudelleen joka päivä.

—

Vahojen eluoitumisen tarkkailemiseksi silmämääräisesti liuosnäytteeseen on mahdollista lisätä 100 μl 1-prosenttista sudania eluutioliuoksessa. Koska sudanin retentioaika sijoittuu vahojen ja triglyseridien välille, eluointi keskeytetään, kun väri saavuttaa kromatografiakolonnin pohjan, sillä tällöin kaikki vahat ovat eluoituneet.

Tällä tavoin saatu jae kuivataan pyöröhaihduttimessa (3.6), kunnes lähes kaikki liuotin on saatu poistettua. Viimeiset 2 ml liuotinta poistetaan heikon typpivirtauksen avulla, minkä jälkeen lisätään 2–4 ml n-heptaania.

5.2   Kaasukromatografinen määritys

5.2.1   Esivalmistelut

Kolonni asennetaan kaasukromatografiin (3.3) siten, että alkupää yhdistetään on-column -järjestelmään ja loppupää detektoriin. Tarkistetaan kaasukromatografialaitteiden toimivuus (kaasuliitäntöjen kunto, detektorin ja piirturijärjestelmän suoritusteho jne.).

Jos kolonnia ei ole aikaisemmin käytetty, se on ensin valmisteltava käyttöön. Kevyt kaasuvirtaus johdetaan kolonnin läpi ja kaasukromatografi käynnistetään. Lämmitetään asteittain siten, että lämpötila on noin neljän tunnin kuluttua kohonnut 350 °C:een. Tätä lämpötilaa pidetään yllä vähintään kaksi tuntia, jonka jälkeen laitteisto säädetään käyttöolosuhteisiin (kaasuvirtojen säätö, liekin sytytys, kytkeminen elektroniseen piirturiin (3.3.4), uunin lämpötilan säätö kolonnia varten, detektorin lämpötilasäätö jne.) ja signaali säädetään niin, että sen herkkyys on vähintään kaksi kertaa niin suuri kuin on arvioitu määrityksessä tarvittavan. Saadun pohjaviivan on oltava suora, siinä ei saa olla minkäänlaisia piikkejä eikä ryömintää mihinkään suuntaan.

Jos ilmenee negatiivista suoraviivaista ryömintää, se on merkki kolonnin liitäntöjen vuotamisesta; positiivinen ryömintä johtuu kolonnin riittämättömästä valmistelusta.

5.2.2   Toimintaolosuhteiden valinta

Yleisesti kromatografia tehdään seuraavissa käyttöolosuhteissa:

—	kolonnin lämpötila:   20 °C minuutissa   5 °C minuutissa   20 °C minuutissa   aluksi 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

—	detektorin lämpötila: 350 °C,

—	injektoidun aineen määrä: 1 μl n-heptaaniliuosta (2–4 ml),

—	kantajakaasut: helium tai vety valitun kaasun optimaalisella lineaarinopeudella (ks. lisäys),

—	laitteen herkkyys siten että seuraavat edellytykset täyttyvät:

Näitä olosuhteita voidaan muuttaa kolonnin ja kaasukromatografin ominaisuuksien perusteella, jotta kaikki vahat saadaan erotettua, jotta piikkien erotuskyky on riittävä (ks. kuva) ja jotta sisäisen standardin C32 retentioaika on 18 ± 3 minuuttia. Edustavimpien vahojen piikin on oltava vähintään 60 % asteikon pohjasta.

Piikkien integrointiparametrit asetetaan niin, että huomioon otettavien piikkien pinta-alat voidaan arvioida oikein.

Huom. Koska lopullinen lämpötila on korkea, sallitaan positiivinen siirtymä, joka saa kuitenkin olla enintään 10 % asteikon alarajasta.

5.3   Määritys

Imetään 10 μl:n mikroruiskuun 1 μl liuosta; vedetään männällä neula tyhjäksi. Työnnetään neula injektiolaitteeseen ja 1–2 sekunnin kuluttua injektoidaan nopeasti; noin 5 sekunnin kuluttua vedetään neula hitaasti pois.

Piirturi pidetään käynnissä, kunnes vahat ovat eluoituneet täydellisesti.

Pohjaviivan on koko ajan oltava vaatimusten mukainen.

5.4   Piikkien tunnistaminen

Eri piikkien tunnistaminen suoritetaan retentioaikojen perusteella ja vertaamalla samoissa olosuhteissa määritettyihin vahojen seoksiin, joiden retentioajat tunnetaan.

Kuva 1 esittää neitsytoliiviöljyn vahojen kromatogrammia.

5.5   Kvantitatiivinen arviointi

Sisäisen standardin ja C40–C46 -alifaattisten esterien piikkien pinta-alat lasketaan integraattorilla.

Lasketaan kunkin esterin vahapitoisuus, ilmoitettuna mg/kg rasvaa, seuraavasti:

jossa:

Ax	=	kunkin esterin piikin pinta-ala neliömillimetreinä
As	=	kunkin sisäisen standardin piikin pinta-ala neliömillimetreinä
ms	=	lisätyn sisäisen standardin massa milligrammoina
m	=	määritystä varten otetun näytteen massa grammoina.

6.   TULOSTEN ILMOITTAMINEN

C40–C46:n eri vahojen pitoisuuksien summa ilmoitetaan mg/kg rasvaa (ppm).

Huom. Määritetään piikkien pinta-aloista niiden komponenttien määrät, joissa on parillinen määrä C-atomeja välillä C40–C46, jäljempänä olevassa kuvassa esitetyn oliiviöljyn vahojen kromatogrammin mukaisesti. Jos C46-esteri esiintyy kahtena piikkinä, sen tunnistamiseksi on syytä analysoida oliivinpuristemassaöljyn vahojen jae, jossa C46:n piikki on helppo tunnistaa, koska se on selvästi hallitsevin.

Tulokset ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

KUVA

Oliiviöljyn vahojen kromatogrammi (9)

Lisäys

Kaasun lineaarinopeuden määrittäminen

Injektoidaan 1–3 μl metaania (tai propaania) tavanomaisiin käyttöolosuhteisiin säädettyyn kaasukromatografialaitteistoon. Mitataan aika, jonka kaasu kulkee kolonnin läpi, alkaen injektiohetkestä piikin muodostumiseen (tM).

Lineaarinopeus, cm/s, saadaan kaavasta L/tM, jossa L on kolonnin pituus senttimetreinä ja tM on aika sekunteina sekuntikellolla mitattuna.

”LIITE VII

2-GLYSERYYLIMONOPALMITAATIN PROSENTTIOSUUDEN MÄÄRITTÄMINEN

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tällä menetelmällä määritetään triglyseridin 2-asemassa olevan palmitiinihapon prosenttiosuus 2-glyseryylimonopalmitaatin määrityksen avulla.

Menetelmää sovelletaan kasviöljyihin, jotka ovat nestemäisiä huoneenlämmössä (20 °C).

2.   PERIAATE

Öljynäyte valmistellaan ja käsitellään haimalipaasin avulla: kun triglyseridimolekyyli hydrolysoidaan osittain ja spesifisesti 1- ja 3-asemassa, jäävät jäljelle 2-asemassa olevat monoglyseridit. 2-glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus monoglyseridijakeessa määritetään silyloinnin jälkeen käyttäen kapillaarikaasukromatografista määritystä.

3.   VÄLINEISTÖ

3.1   Erlenmeyer-pullo, 25 ml.

3.2   Dekantterilaseja, 100, 250 ja 300 ml.

3.3   Lasikolonni kromatografiaa varten (sisähalkaisija 21–23 mm, pituus 400 mm), varustettuna sintterilasilevyllä ja hanalla.

3.4   Koeputkia, 10, 50, 100 ja 200 ml.

3.5   Kolveja, 100 ja 250 ml.

3.6   Pyöröhaihduttaja.

3.7   Kartiopohjaisia sentrifugiputkia, 10 ml, hiottu tulppa.

3.8   Sentrifugi 10 ja 100 ml:n putkia varten.

3.9   Termostaatti, joka ylläpitää lämpötilaa 40 °C ± 0,5 °C.

3.10   Mittapipettejä, 1 ja 2 ml.

3.11   Injektioruisku, 1 ml.

3.12   Mikroruisku, 100 μl.

3.13   Suppilo, 1 000 ml

3.14   Kapillaarikolonnilla varustettu kaasukromatografi, jossa on kolonniin liitetty kylmäinjektori, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan koloniin, sekä uuni, joka pysyy valitussa lämpötilassa yhden celsiusasteen tarkkuudella.

3.15   Kolonniin liitetty kylmäinjektori, näytteen syöttämiseksi suoraan kolonniin.

3.16   Liekki-ionisaatiodetektori ja analysaattori.

3.17.   Integroiva piirturi, joka toimii analysaattorin kanssa ja jonka vastenopeus on enintään 1 sekunti ja jonka paperin nopeutta voidaan säätää.

3.18   Lasinen tai kvartsilasinen kapillaarikolonni, jonka pituus on 8–12 m ja sisähalkaisija 0,25–0,32 mm ja jonka sisäpinta on päällystetty 5-prosenttisella metyylipolysiloksaanilla tai fenyylimetyylipolysiloksaanilla siten, että nestekerroksen paksuus on 0,10–0,30 μm, ja jota voidaan käyttää 370 °C:n lämpötilassa.

3.19   Mikroruisku, 10 μl, jossa on vähintään 7,5 cm:n kiinteä neula, jonka avulla näyte voidaan syöttää suoraan kolonniin.

4.   REAGENSSIT

4.1   Silikageeli, jonka hiukkaskoko 0,063–0,200 mm (70/280 mesh) ja joka valmistetaan seuraavasti: Silikageeli pannaan posliiniastiaan, kuivataan lämpökaapissa 160 °C:n lämpötilassa neljän tunnin ajan, minkä jälkeen jäädytetään eksikkaattorissa huoneenlämmössä. Lisätään vettä 5 % silikageelin painosta seuraavasti: punnitaan 500 ml:n erlenmeyer-pulloon 152 g silikageeliä, lisätään 8 g tislattua vettä, suljetaan pullo ja ravistetaan varovasti siten, että vesi jakautuu tasaisesti. Säilytetään vähintään 12 tuntia ennen käyttöä.

4.2   N-heksaani, kromatografialaatua.

4.3   Isopropanoli

4.4   Isopropanoli, vesiliuos 1/1 (V/V)

4.5   Haimalipaasi. Käytettävän lipaasiaktiivisuuden on oltava 2,0–10 lipaasiyksikköä/mg. (Haimalipaasia, jonka aktiivisuus on 2–10 yksikköä/mg, on saatavilla valmiina.)

4.6   Tri-hydroksimetyyliaminometaani-puskuriliuos: lisätään vesiliuokseen suolahappoa 1 M, kunnes pH on 8 (tarkistetaan potentiometrillä) (1/1 V/V)

4.7   Natriumkolaatti (entsyymilaatua), 0,1 % vesiliuos (käytettävä 15 päivän kuluessa valmistamisesta).

4.8   Kalsiumkloridi, vesiliuos 22 %.

4.9   Dietyylieetteri, kromatografialaatua.

4.10   Kehitysliuos: n-heksaani/etyylieetteriseos (87/13) (V/V)

4.11   Natriumhydroksidi, 12-painoprosenttinen liuos.

4.12   1-prosenttinen fenoliftaleiiniliuos etanolissa.

4.13   Kantajakaasut: vety tai helium, kaasukromatografista laatua.

4.14   Apukaasut: vety, vähintään 99-prosenttinen, kuiva ja ilman orgaanisia aineita, ja vesi kaasukromatografista laatua, sama puhtausaste.

4.15   Silylointireagenssi: Pyridiinin, heksametyylidisilatsaanin ja trimetyylikloorisilaanin seos 9/3/1 (V/V/V). (Käyttövalmiita liuoksia on kaupallisesti saatavana. Voidaan käyttää myös muita silylointireagensseja, kuten esim. bis-trimetyylisilyylitrifluoriasetamidi + 1 % trimetyylikloorisilaania; reagenssi laimennetaan samalla määrällä vedetöntä pyridiiniä.)

4.16   Standardit: puhtaat monoglyseridit tai monoglyseridien seokset, joiden prosenttiosuuksien mukainen tunnettu koostumus on samanlainen kuin näytteen.

5.   MENETTELY

5.1   Näytteen valmistelu

5.1.1   Öljyjä, joiden vapaiden happojen pitoisuus on alle 3 %, ei tarvitse neutraloida ennen silikageelikolonnikromatografiaa. Öljyt, joiden vapaiden happojen pitoisuus on yli 3 %, on neutraloitava 5.1.1.1 kohdan mukaisesti.

5.1.1.1   1 000 ml:n suppiloon (3.13) kaadetaan 50 g öljyä ja 200 ml n-heksaania. Lisätään 100 ml isopropanolia ja 12-prosenttista natriumhydroksidiliuosta (4.11) määrä, joka vastaa öljyn vapaiden rasvahappojen määrää lisättynä 5 prosentilla. Ravistetaan voimakkaasti yhden minuutin ajan. Lisätään 100 ml tislattua vettä, ravistetaan uudelleen ja annetaan seistä.

Kun erottuminen on tapahtunut, pohjalla oleva saippuoitunut kerros poistetaan. Myös mahdolliset välikerrokset (liimamaiset ja liukenemattomat aineet) poistetaan. Neutraalin öljyn heksaaniliuos pestään useita kertoja isopropanolin ja tislatun veden liuoksella, 50–60 ml, suhteessa 1:1 (V/V) (4.4), kunnes fenoliftaleiinin vaaleanpunainen väri on hävinnyt.

Poistetaan suurin osa heksaania höyrystämällä tyhjiössä (käyttäen esim. kiertohaihdutinta) ja siirretään öljy 100 ml:n kolviin (3.5). Kuivataan öljy tyhjiössä, kunnes liuotin on kokonaan haihtunut.

Tämän vaiheen jälkeen öljyn happopitoisuuden on oltava alle 0,5 %.

5.1.2   Kaadetaan 1,0 g edellä kuvatulla tavalla käsiteltyä öljyä 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) ja liuotetaan se 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Liuoksen annetaan seistä vähintään 15 minuuttia ennen silikageelikolonnikromatografiaa.

Jos liuos on sameaa, se sentrifugoidaan optimaalisten edellytysten varmistamiseksi kromatografiaa varten. (Voidaan käyttää käyttövalmiita 500 mg:n SPE-silikageelipatruunoita.)

5.1.3   Kromatografiakolonnin esikäsittely

Kolonniin (3.3) kaadetaan noin 30 ml kehitysliuosta (4.10) ja kolonnin alaosaan työnnetään lasisauvalla pumpulituppo; painetaan tuppoa ilman poistamiseksi.

Valmistetaan dekantterilasissa suspensio, jossa on 25 g silikageeliä (4.1) ja noin 80 ml kehitysliuosta, ja kaadetaan se suppilon avulla kolonniin.

Varmistetaan, että kaikki silikageeli on syötetty kolonniin; pestään kehitysliuoksella (4.10), avataan hana ja annetaan nesteen tulla pylväästä, kunnes sen pinta on noin 2 mm piihappogeelin yläpinnan yläpuolella.

5.1.4   Kolonnikromatografia

Punnitaan 25 ml:n erlenmeyer-pulloon (3.1) tarkasti 1,0 g 5.1 kohdan mukaisesti valmistettua näytettä.

Liuotetaan näyte 10 ml:aan kehitysliuosta (4.10). Kaadetaan liuos 5.1.3 kohdan mukaisesti valmisteltuun kromatografikolonniin. Vältetään koskemasta kolonnin pintaa.

Hana avataan ja liuottimen annetaan tulla pylväästä, kunnes sen pinta on silikageelin pinnan tasolla. Annetaan kehittyä 150 ml:ssa kehitysliuosta. Säädetään virtaukseksi 2 ml/minuutissa (siten että 150 ml valuu 60–70 minuutissa).

Eluaatti kerätään 250 ml:n taarattuun kolviin. Liuotin haihdutetaan tyhjiössä ja sen jäänteet poistetaan typpivirtauksen avulla.

Punnitaan pullo ja lasketaan kerätty uute.

(Jos käytetään käyttövalmiita SPE-silikageelipatruunoita, toimitaan seuraavasti: Lisätään 1 ml liuosta (5.1.2) patruunoihin, jotka on etukäteen käsitelty 3 ml:lla n-heksaania.

Kun liuos on suodattunut, annetaan kehittyä 4 ml:ssa n-heksaania/dietyylietteriä 9/1 (V/V).

Eluaatti kerätään 10 ml:n putkeen ja haihdutetaan kuiviin typpivirtauksen alla.

Kuiva jäännös käsitellään haimalipaasin (5.2) avulla. Rasvahappokoostumus on ehdottomasti tarkistettava sekä ennen SPE-patruunan käyttöä että sen jälkeen.

5.2   Hydrolyysi haimalipaasin avulla

5.2.1   Mitataan sentrifugin putkeen 0,1 g 5.1 kohdan mukaisesti valmisteltua öljyä. Lisätään 2 ml puskuriliuosta (4.6), 0,5 ml natriumkolaattiliuosta (4.7) ja 0,2 ml kalsiumkloridiliuosta sekoittaen hyvin jokaisen lisäyksen jälkeen. Putki suljetaan hiotulla tulpalla ja asetetaan heti termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 40 °C ± 0,5.

5.2.2   Putkeen lisätään 20 mg lipaasia, ravistetaan varovasti (niin että tulppa ei pääse kastumaan), asetetaan putki termostoituun hauteeseen tasan 2 minuutiksi ja poistetaan, minkä jälkeen ravistetaan voimakkaasti tasan 1 minuutti ja annetaan jäähtyä.

5.2.3   Lisätään 1 ml dietyylieetteriä, suljetaan pullo ja ravistetaan voimakkaasti, sentrifugoidaan ja siirretään eetteriliuos mikroruiskulla puhtaaseen ja kuivaan putkeen.

5.3   Silanoitujen johdannaisten ja kaasukromatografian valmistelu

5.3.1   Lisätään mikroruiskulla 10 ml:n kartiopohjaiseen putkeen 100 μl liuosta (5.2.3).

5.3.2   Liuotin haihdutetaan heikossa typpivirrassa, lisätään 20 μl silylointireagenssia (4.15), suljetaan putki tulpalla ja annetaan seistä 20 minuuttia.

5.3.3   Lisätään 1–5 ml n-heksaania (kromatografiaolosuhteiden mukaisesti). Tuloksena on liuos kaasukromatografiaa varten.

5.4   Kaasukromatografia

Käyttöolosuhteet ovat seuraavat:

—	Injektorin (kolonniin liitetty kylmäinjektori) lämpötila matalampi kuin liuoksen kiehumislämpötila (68 °C),

—	Detektorin lämpötila: 350 °C,

—	Kolonnin lämpötila: uunin lämpötila ohjelmoidaan seuraavasti: 60 °C yhden minuutin ajan, lisätään 15 °C minuutissa kunnes lämpötila on 180 °C, minkä jälkeen lisätään 5 °C minuutissa kunnes lämpötila on 340 °C, minkä jälkeen lämpötila pidetään 340 °C:ssa 13 minuutin ajan,

—

Kantajakaasut: vety tai helium sopivalla lineaarinopeudella kuvassa 1 esitetyn resoluution saavuttamiseksi. C54-triglyseridin retentioajan on oltava 40 ± 5 minuuttia (ks. kuva 2). (Jäljempänä esitetyt käyttöolosuhteet ovat ohjeellisia. Käyttäjän on optimoitava ne halutun resoluution saavuttamiseksi. 2-glyseryylimonopalmitaatin piikin korkeuden on oltava vähintään 10 % piirturin asteikosta.),

—	Injektoidun aineen määrä: 0,5–1 μl n-heksaaniliuosta (5 ml) (5.3.3.).

5.4.1   Piikkien tunnistaminen

Yksittäiset monoglyseridit tunnistetaan retentioaikojen perusteella ja suhteessa niihin, jotka on saatu samoissa olosuhteissa määritetyillä monoglyseridien standardiseoksilla.

5.4.2   Kvantitatiivinen arviointi

Jokaisen piikin pinta-ala lasketaan elektronisen integraattorin avulla.

6.   TULOSTEN ESITTÄMINEN

Glyseryylimonopalmitaatin prosenttiosuus lasketaan sitä vastaavan piikin suhteellisena osuutena kaikkien monoglyseridien piikkien yhteenlasketusta pinta-alasta (ks. kuva 2) seuraavan kaavan mukaisesti:

Glycéril monopalmitate (%):

NdT: Glycéril monopalmitate = glyseryylimonopalmitaatti jossa:

Ax	=	glyseryylimonopalmitaatin piikin pinta-ala
ΣA	=	kaikkien monoglyseridien piikkien pinta-alojen summa.

Tulos ilmoitetaan yhden desimaalin tarkkuudella.

7.   MÄÄRITYSSELOSTE

Määritysselosteessa on oltava:

—	viittaus tähän menetelmään,

—	näytteen tunnistamiseksi tarvittavat tiedot,

—	määrityksen tulos,

—	poikkeamiset tästä menetelmästä riippumatta siitä, johtuvatko ne asianomaisten päätöksestä vai jostain muusta syystä,

—	laboratorion tunnistetiedot, määrityspäivä ja määrityksestä vastaavien allekirjoitukset.

Kuva 1

Kromatogrammi silylointireaktion tuotteista, saatu lipaasikäsittelyllä jalostetusta oliiviöljystä, johon lisätty 20 % esteröityä öljyä (100 %).

Kuva 2

Kromatogrammi:

(A)   esteröimätön oliiviöljy, lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen.

Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 %.

Kromatogrammi:

B)   esteröity öljy lipaasikäsittelyn jälkeen; silyloinnin jälkeen; näissä olosuhteissa (kapillaarikolonni 8–12 m) vahajae eluoituu samassa ajassa kuin diglyseridijae tai hieman sen jälkeen.

Triglyseridipitoisuus saa lipaasikäsittelyn jälkeen olla enintään 15 %

8.   SELITYKSIÄ

Huom. 1.   LIPAASIN VALMISTUS

Myynnissä on lipaaseja, joiden aktiivisuus on tyydyttävä. On myös mahdollista valmistaa niitä laboratoriossa seuraavasti:

Jäähdytetään 5 kg tuoretta sian haimaa 0 °C:seen. Poistetaan ympäröivä kiintorasva ja kalvot ja jauhetaan sekoittimessa niin, että syntyy tahnamainen neste. Tahnaan lisätään 2,5 l vedetöntä asetonia ja sekoitetaan 4–6 tuntia, minkä jälkeen liuos sentrifugoidaan. Jäännöstä uutetaan vielä kolme kertaa samalla tilavuusmäärällä vedetöntä asetonia, sitten kaksi kertaa asetonin ja dietyylieetterin seoksella 1:1 (V/V) ja kaksi kertaa dietyylieetterillä.

Jäännös kuivataan tyhjiössä 48 tuntia, jotta saadaan stabiili jauhe, joka säilyy kauan jääkaapissa ja kuivissa olosuhteissa.

Huomautus 2.   LIPAASIAKTIIVISUUDEN TARKISTAMINEN

Valmistetaan oliiviöljyemulsio seuraavasti:

Sekoitetaan 165 ml arabikumiliuosta (100 g/l), 15 g jäämurskaa ja 20 ml neutraloitua öljyä sekoittimella.

Lisätään 50 ml:n dekantterilasiin 10 ml tätä emulsiota, sitten 0,3 ml natriumkolaattiliuosta (0,2 g/ml) ja sitten 20 ml tislattua vettä.

Dekantterilasi asetetaan termostoituun hauteeseen, jonka lämpötila on 37 °C. Upotetaan pH-mittarin elektrodit nesteeseen ja asetetaan spiraalisekoitin paikoilleen.

Lisätään natriumhydroksidiliuosta (0,1 N) tipoittain byretin avulla, kunnes pH on 8,3.

Lisätään sama tilavuusmäärä lipaasijauheen vesisuspensiota (0,1 g/ml lipaasia). Heti kun pH on 8,3, käynnistetään sekuntikello ja aloitetaan natriumhydroksidiliuoksen tiputtaminen sellaisella nopeudella, että pH pysyy koko ajan 8,3:ssa. Liuoksen kulutus luetaan joka minuutti.

Tiedot kirjataan koordinaatistoon, jossa x-akselilla on aika ja y-akselilla on pH:n säilyttämiseen tarvittavan emäsliuoksen määrä millilitroina. Tuloksena on oltava lineaarinen kuvaaja.

Lipaasiaktiviteetti, joka mitataan lipaasiyksikköinä mg:aa kohden, saadaan seuraavasti:

jossa:

A	aktiviteetti lipaasiyksikköä/mg
V	natriumhydroksidiliuoksen (0,1 N) määrä millilitroina minuutissa (kuvaajasta laskettuna)
N	natriumhydroksidiliuoksen normaalisuus
m	lipaasinäytteen paino mg:oina.

Lipaasiyksikkö on se määrä entsyymiä, joka tarvitaan vapauttamaan 10 mikroekvivalenttia happoa minuutissa.”