„ANHANG I

MERKMALE VON OLIVENÖLEN

Anmerkungen:

a)	Die Analyseergebnisse müssen bis auf die gleiche Anzahl Dezimalstellen angegeben werden wie die für jedes Merkmal vorgesehenen Werte. Beträgt die nächstfolgende Dezimalstelle über 4, so ist die angegebene letzte Stelle hinter dem Komma aufzurunden.

b)	Auch wenn nur ein einziges Merkmal nicht mit dem vorgesehenen Grenzwert übereinstimmt, muss das Öl einer anderen Kategorie zugeordnet werden oder als nicht seinen Reinheitskriterien entsprechend erklärt werden.

c)

Die mit einem Sternchen (*) gekennzeichneten Ölqualitätsmerkmale bedeuten: — im Falle von Lampantöl, dass die betreffenden Grenzwerte nicht alle gleichzeitig erfüllt werden müssen; — im Falle nativer Olivenöle, dass die Nichterfüllung des Grenzwerts auch nur eines einzigen Merkmals eine Umstufung innerhalb der Kategorie der nativen Olivenöle zur Folge hat.

d)	Die mit zwei Sternchen (**) gekennzeichneten Ölqualitätsmerkmale bedeuten im Fall der betreffenden Oliventresteröle, dass die jeweiligen Grenzwerte nicht alle gleichzeitig erfüllt werden müssen.“

Kategorie	Säuregehalt (%) (*)	Peroxidzahl und meq O2/kg (*)	Wachse mg/kg (**)	2-Glycerinmonopalmitat (%)	Stigmastadien mg/kg (1)	ECN42-Differenz zwischen HPLC-Messwert und theoretischer Berechnung	K232 (*)	K270 (*)	Delta-K (*)	Sensorische Prüfung Fehlermedian (Md) (*)	Sensorische Prüfung Fruchtigkeitsmedian (Mf) (*)
1. Natives Olivenöl extra	≤ 0,8	≤ 20	≤ 250	≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure % ≤ 14 ≤ 1,0 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure % > 14	≤ 0,10	≤ 0,2	≤ 2,50	≤ 0,22	≤ 0,01	Md = 0	Mf > 0
2. Natives Olivenöl	≤ 2,0	≤ 20	≤ 250	≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure % ≤ 14 ≤ 1,0 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure % > 14	≤ 0,10	≤ 0,2	≤ 2,60	≤ 0,25	≤ 0,01	Md ≤ 2,5	Mf > 0
3. Lampantöl	> 2,0	—	≤ 300 (3)	≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure % ≤ 14 ≤ 1,1 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure % > 14	≤ 0,50	≤ 0,3	—	—	—	Md > 2,5 (2)	—
4. Raffiniertes Olivenöl	≤ 0,3	≤ 5	≤ 350	≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure % ≤ 14 ≤ 1,1 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure % > 14	—	≤ 0,3	—	≤ 1,10	≤ 0,16	—	—
5. Olivenöl — bestehend aus raffinierten und nativen Olivenölen	≤ 1,0	≤ 15	≤ 350	≤ 0,9 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure % ≤ 14 ≤ 1,0 wenn Gesamtgehalt an Palmitinsäure % > 14	—	≤ 0,3	—	≤ 0,90	≤ 0,15	—	—
6. Rohes Oliventresteröl	—	—	> 350 (4)	≤ 1,4	—	≤ 0,6	—	—	—	—	—
7. Raffiniertes Oliventresteröl	≤ 0,3	≤ 5	> 350	≤ 1,4	—	≤ 0,5	—	≤ 2,00	≤ 0,20	—	—
8. Oliventresteröl	≤ 1,0	≤ 15	> 350	≤ 1,2	—	≤ 0,5	—	≤ 1,70	≤ 0,18	—	—

Kategorie

Gehalt an Fettsäuren (5)

Summe trans-Isomere Ölsäure (%)

Summe trans- Isomere Linol und Linolensäure (%)

Zusammensetzung der Sterine

Sterine insgesamt (mg/kg)

Erythrodiol und Uvaol (%) (**)

Myristinsäure (%)

Linolensäure (%)

Arachninsäure (%)

Eicosensäure (%)

Behensäure (%)

Lignocerinsäure (%)

Cholesterin (%)

Brassicasterin (%)

Campesterin (%)

Stigmasterin (%)

Beta-Sitosterin (%) (6)

Delta-7-Stigmasterin (%)

1. Natives Olivenöl extra

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

2. Natives Olivenöl

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

3. Lampantöl

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,10

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5 (7)

4. Raffiniertes Olivenöl

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

5. Olivenöl — bestehend aus raffinierten und nativen Olivenölen

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,2

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

6. Rohes Oliventresteröl

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 2 500

> 4,5 (8)

7. Raffiniertes Oliventresteröl

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 800

> 4,5

8. Oliventresteröl

≤ 0,05

≤ 1,0

≤ 0,6

≤ 0,4

≤ 0,3

≤ 0,2

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Camp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 600

> 4,5

ANHANG IV

KAPILLARGASCHROMATOGRAFISCHE BESTIMMUNG DES WACHSGEHALTS

1.   GEGENSTAND

Diese Arbeitsvorschrift beschreibt ein Verfahren zur Bestimmung des Wachsgehalts von Olivenölen. Die Wachse werden nach der Zahl der Kohlenstoffatome getrennt. Das Verfahren kann insbesondere zur Unterscheidung zwischen abgepresstem und extrahiertem Olivenöl (Oliventresteröl) verwendet werden.

2.   PRINZIP

Das Fett wird mit einem geeigneten internen Standard versetzt und chromatografisch über eine Kieselgelsäule fraktioniert; die unter Versuchsbedingungen zuerst eluierte Fraktion (schwächerer Polarität als Triglyceride) wird gesammelt und sofort kapillargaschromatografisch analysiert.

3.   GERÄTE

3.1.   Erlenmeyerkolben, 25 ml

3.2.   Glassäule für Gaschromatografie, Innendurchmesser 15,0 mm, Länge 30—40 cm, mit Hahn

3.3.   Gaschromatograf, geeignet für die Verwendung von Kapillarsäulen, mit Direkteinspritzung, bestehend aus:

3.3.1.   Säulenofen mit Temperaturprogrammierung

3.3.2.   Kalteinspritzsystem zur Direktaufgabe der Probe auf die Säule

3.3.3.   Flammenionisationsdetektor mit Verstärker

3.3.4.   Integrator mit Schreiber, mit Verstärker (3.3.3) zu koppeln, Ansprechzeit max. 1 Sekunde, variabler Papiervorschub. (Es können auch Informatiksysteme verwendet werden, bei denen die GC-Daten mittels PC erfasst werden.)

3.3.5.   Glaskapillarsäule oder Fused-silica-Säule, Länge 8—12 m, Innendurchmesser 0,25—0,32 mm, Innenwand belegt mit Trennflüssigkeit, gleichmäßige Schichtdicke zwischen 0,10 und 0,30 μm. (Geeignete Trennflüssigkeiten vom Typ SE 52 oder SE 54 sind im Handel erhältlich.)

3.4.   Mikroliterspritze, 10 μl, zur Direkteinspritzung in die Säule, mit gehärteter Nadel

3.5.   Elektrorührwerk

3.6.   Rotationsverdampfer

3.7.   Muffelofen

3.8.   Analysenwaage mit einer Messgenauigkeit von + 0,1 mg

3.9.   Übliche Laborgeräte.

4.   REAGENZIEN

4.1.   Kieselgel mit einer Korngröße zwischen 60 und 200 μm

Das Kieselgel wird im Muffelofen vier Stunden auf eine Temperatur von 500 °C erhitzt und nach dem Abkühlen mit 2 % Wasser, bezogen auf die betreffende Menge Kieselgel, versetzt. Durch gründliches Schütteln homogenisieren. Vor Gebrauch mindestens 12 Stunden im Dunkeln aufbewahren.

4.2.   n-Hexan, zur Chromatografie

4.3.   Ethylether, zur Chromatografie

4.4.   n-Heptan, zur Chromatografie

4.5.   Standardlösung aus Laurylarachidat 0,1 % (m/V) in Hexan (interner Standard) (Es kann auch Palmitylpalmitat oder Myristylstearat verwendet werden.)

4.5.1.   Sudan 1 (1-Pheny-azo-2-naphthol)

4.6.   Trägergas: Wasserstoff oder Helium, rein, zur Gaschromatografie

4.7.   Hilfsgase

—	Wasserstoff, rein, zur Gaschromatografie

—	Luft, rein, zur Gaschromatografie

5.   VERFAHREN

5.1.   Vorbereiten der Chromatografiesäule

15 g Kieselgel (4.1) werden in n-Hexan (4.2) suspendiert und in die Säule (3.2) aufgegeben. Nach der Spontansedimentation wird die Phase mit einem Elektrorührwerk (3.5) nachbehandelt, um eine möglichst homogene Chromatografieschicht zu erzielen, und zur Entfernung etwa enthaltener Verunreinigungen wird mit 30 ml n-Hexan gespült. Genau 500 mg der Probe werden mithilfe der Waage (3.8) in den 25-ml-Erlenmeyerkolben (3.1) eingewogen und entsprechend dem vermuteten Wachsgehalt mit der geeigneten Menge interner Standardlösung (4.5) versetzt. So werden z. B. bei Olivenöl 0,1 mg Laurylarachidat und bei Oliventresteröl 0,25 bis 0,5 mg zugesetzt. Die derart gewonnene Probe wird unter Verwendung von je zwei Teilen 2 ml n-Hexan (4.2) in die Chromatografiesäule überführt.

Das Lösungsmittel bis zu einem Stand von 1 mm über der oberen Absorbensgrenzfläche ablaufen lassen und dann zur Entfernung der natürlich enthaltenen n-Alkane noch mit 70 ml n-Hexan spülen. Mit der chromatografischen Elution beginnen und 180 ml des n-Hexan/Ethylether-Gemischs, Verhältnis 99:1, bei einem Durchsatz von etwa 15 Tropfen/10 Sekunden auffangen. Die Elution der Probe ist bei einer Umgebungstemperatur von 22 ± 4 °C durchzuführen.

Anmerkungen:

—	Das n-Hexan/Ethylethergemisch (99:1) muss jeden Tag frisch zubereitet werden.

—

Für eine visuelle Kontrolle der Elution der Wachse können der gelösten Probe 100 μl Sudan (1 % im Elutionsmittel) zugesetzt werden. Die Retentionszeit des Farbstoffs liegt zwischen derjenigen der Wachse und derjenigen der Triglyceride. Wenn die Färbung das Ende der Säule erreicht, sind daher alle Wachse eluiert und die Elution kann beendet werden.

Die derart gewonnene Fraktion wird im Rotationsverdampfer (3.6) so lange getrocknet, bis das Lösungsmittel nahezu restlos verdampft ist, wobei die letzten 2 ml im schwachen Stickstoffstrom abgeblasen werden; der Trocknungsrückstand wird mit 2—4 ml n-Heptan versetzt.

5.2.   Gaschromatografische Analyse

5.2.1.   Vorarbeiten

Die Säule in den Gaschromatografen (3.3) einsetzen, wobei der Säulenanfang an das On-column-System und das Säulenende an den Detektor angeschlossen wird. Sodann ist der Gaschromatograf auf Dichtigkeit der Gasleitungen, Betriebsbereitschaft des Detektors und des Schreibers usw. zu überprüfen.

Wird die Säule zum ersten Mal verwendet, wird empfohlen, sie einzufahren. Einen schwachen Gasstrom durch die Säule geben, den Gaschromatografen einschalten und allmählich über einen Zeitraum von etwa 4 Stunden auf eine Temperatur von 350 °C aufheizen. Die Temperatur ist mindestens 2 Stunden konstant zu halten; sodann sind die Analysebedingungen einzustellen (Gasstrom, Zünden der Flamme, Anschluss an den elektronischen Schreiber (3.3.4), Temperatur des Säulenofens, des Detektors usw.). Anschließend das Signal mit einer Empfindlichkeit aufzeichnen, die mindestens doppelt so groß ist wie bei Durchführung der Analyse. Die Grundlinie muss linear verlaufen, ohne Peaks oder Drift.

Eine negative Drift ist ein Indiz für einen undichten Anschluss der Säule, eine positive deutet auf ein mangelhaftes Einfahren der Säule hin.

5.2.2.   Wahl der Arbeitsbedingungen

Anhaltspunkte für die Arbeitsbedingungen:

—	Säulentemperatur:   20 °C/Min.   5 °C/Min.   20 °C/Min.   Ausgangstemperatur 80 °C (1′) → 240 °C → 325 °C (6′) → 340 °C (10′)

—	Detektortemperatur: 350 °C

—	Einspritzvolumen: 1 μl der n-Heptanlösung (2—4 ml)

—	Trägergas: Helium oder Wasserstoff mit der für das gewählte Gas optimalen linearen Strömungsgeschwindigkeit (vgl. Anlage)

—	Geräteempfindlichkeit, die den nachstehenden Bedingungen genügt:

Diese Bedingungen können je nach Beschaffenheit der Säule und des Gaschromatografen abgewandelt werden, damit eine Trennung aller Wachse und eine ausreichende Auflösung der Peaks (siehe Abbildung) erzielt werden. Die Retentionszeit des internen Standards C32 muss 18 ± 3 Minuten betragen, und der größte Wachspeak muss mindestens 60 % des Vollausschlags erreichen.

Die Parameter für die Peakintegration sind so zu wählen, dass für die in Betracht kommenden Peaks korrekte Werte erzielt werden.

Anmerkung: In Anbetracht der hohen Endtemperatur ist eine positive Drift von höchstens 10 % der Skala zulässig.

5.3.   Durchführung der Analyse

Mit der 10-μl-Spritze 1 μl Probelösung aufziehen und dabei den Kolben der Spritze so weit einziehen, dass die Nadel leer ist. Die Nadel in das Einspritzsystem einführen, nach 1—2 Sekunden schnell einspritzen, dann nach etwa 5 Sekunden die Nadel langsam herausziehen.

Das Chromatogramm aufzeichnen, bis alle vorhandenen Wachse eluiert sind.

Die Grundlinie muss stets den vorgeschriebenen Anforderungen genügen.

5.4.   Identifizierung der Peaks

Die Peaks werden anhand der Retentionszeiten durch Vergleich mit Wachsgemischen identifiziert, deren Retentionszeiten bekannt sind und die unter denselben Bedingungen analysiert wurden.

Die Abbildung zeigt ein Chromatogramm der Wachsfraktion eines nativen Olivenöls.

5.5.   Quantitative Bestimmung

Die Peakflächen des internen Standards und der aliphatischen C40- bis C46-Ester werden mithilfe eines Integrators ermittelt.

Der Wachsgehalt jedes einzelnen Esters in mg/kg Fett wird nach folgender Formel berechnet:

Dabei ist:

Ax	=	jeweilige Ester-Peakfläche, in mm2
As	=	die Peakfläche des internen Standards, in mm2
ms	=	das Gewicht des zugegebenen internen Standards, in mg
m	=	Masse der zur Bestimmung entnommenen Probe in g.

6.   DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

Die Summe der Gehalte an den einzelnen Wachsen von C40 bis C46 wird in mg/kg Fett (ppm) angegeben.

Anmerkung Die mengenmäßig zu bestimmenden Bestandteile sind an den Peaks der Ester mit gerader Kohlenstoffzahl von C40 bis C46 abzulesen, wie als Beispiel im nachstehenden Chromatogramm der Wachse von Olivenöl dargestellt. Wenn der C46-Ester doppelt erscheint, ist zur Identifizierung die Wachsfraktion eines Oliventresteröls zu analysieren, bei dem der C46-Peak deutlich überwiegt und daher leicht zu erkennen ist.

Die Ergebnisse werden mit einer Dezimalstelle angegeben.

Abbildung

Chromatogramm der Wachsfraktion eines Olivenöls (9)

Anlage

Bestimmung der linearen Strömungsgeschwindigkeit

In den auf Normalbedingungen eingestellten Gaschromatografen werden 1—3 μl Methan (oder Propan) eingespritzt, und die Säulendurchlaufzeit des Gases wird vom Zeitpunkt des Einspritzens bis zum Peak-Austritt (tM) gemessen.

Die lineare Strömungsgeschwindigkeit in cm/s ist durch die Beziehung L/tM definiert; dabei ist L die Länge der Säule in cm und tM die gemessene Zeit in Sekunden.

„ANHANG VII

BESTIMMUNG DES PROZENTUALEN GEHALTS AN 2-GLYCERINMONOPALMITAT

1.   GEGENSTAND UND ANWENDUNGSBEREICH

Diese Arbeitsvorschrift beschreibt das Analyseverfahren für die Bestimmung des prozentualen Gehalts an Palmitinsäure in 2-Stellung der Triglyceride mittels Bestimmung von 2-Glycerinmonopalmitat.

Die Methode eignet sich für bei Raumtemperatur (20 °C) flüssige pflanzliche Öle.

2.   PRINZIP

Die vorbereitete Olivenölprobe wird der Wirkung der Pankreaslipase ausgesetzt. Die hierdurch bewirkte partielle und spezifische Hydrolyse an den Positionen 1 und 3 des Triglyceridmoleküls ergibt ein 2-Monoglycerid. Der prozentuale Gehalt an 2-Glycerinmonopalmitat in der Monoglyceridfraktion wird nach Silylierung durch Kapillargaschromatografie bestimmt.

3.   GERÄTE UND LABORAUSSTATTUNG

3.1.   Erlenmeyerkolben, 25 ml

3.2.   Bechergläser, 100 ml, 250 ml und 300 ml

3.3.   Glassäule für Chromatografie, 21—23 mm Innendurchmesser, 400 mm Länge, mit gläsernem Frittenboden und Hahn

3.4.   Messkolben, 10, 50, 100 und 200 ml

3.5.   Rundkolben, 100 ml und 250 ml

3.6.   Rotationsverdampfer

3.7.   Zentrifugengläser mit konischem Boden, 10 ml, mit Schliffstopfen

3.8.   Zentrifuge für 10- und 100-ml-Gläser

3.9.   Thermostat, einstellbar auf 40 °C mit einer Genauigkeit von ± 0,5 °C

3.10.   Messpipetten, 1 ml und 2 ml

3.11.   Injektionsspritze, 1 ml

3.12.   Mikroliterspritze, 100 μl

3.13.   Trichter, 1 000 ml

3.14.   Kapillargaschromatograf mit ‚Cold-on-column‘-Injektor zur Direkteinspritzung der Probe in die Säule und mit auf 1 °C genau einstellbarem Ofen

3.15.   ‚Cold-on-column‘-Injektor zur Direkteinspritzung der Probe in die Säule

3.16.   Flammenionisationsdetektor und Elektrometer

3.17.   Für das Elektrometer geeigneter Integrator mit Schreiber, Ansprechzeit max. 1 Sekunde, variabler Papiervorschub

3.18.   Glaskapillarsäule oder Fused-silica-Säule, Länge 8—12 m, Innendurchmesser 0,25—0,32 mm, beschichtet mit Methylpolysiloxan oder Phenylmethylpolysiloxan 5 %, Schichtdicke 0,10—030 μm, verwendbar bis 370 °C

3.19.   Mikroliterspritze, 10 μl, mit gehärteter Nadel, Länge mindestens 7,5 cm, für Direkteinspritzung.

4.   REAGENZIEN

4.1.   Kieselgel mit einer Korngröße zwischen 0,063 und 0,200 mm (70/280 mesh), hergestellt wie folgt: Kieselgel in eine Porzellanschale geben, im Trockenschrank 4 Stunden bei 160 °C trocknen, anschließend im Exsikkator auf Raumtemperatur abkühlen lassen. Ein 5 % der Kieselgelmasse entsprechendes Volumen Wasser wie folgt zugeben: 152 g Kieselgel in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben einwiegen, 8 g destilliertes Wasser zugeben, den Kolben verschließen und leicht schütteln, bis eine gleichmäßige Verteilung des Wassers erreicht ist. Vor der Verwendung mindestens 12 Stunden ruhen lassen.

4.2.   n-Hexan, zur Chromatografie

4.3.   Isopropanol

4.4.   Isopropanol, wässrige Lösung 1/1 (V/V)

4.5.   Pankreaslipase: Die verwendete Lipase muss eine Aktivität zwischen 2,0 und 10 Lipaseeinheiten je mg haben (Pankreaslipasen mit einer Aktivität zwischen 2 und 10 Einheiten je mg Enzym sind im Handel erhältlich).

4.6.   tris-Hydroxymethylaminomethan-Pufferlösung: 1 M wässrige Lösung durch Zusatz von konzentrierter HCl (1/1 V/V) auf pH 8 gebracht (durch Potenziometer überprüfen)

4.7.   Natriumcholat, Enzymqualität, 0,1 %ige wässrige Lösung (diese Lösung ist innerhalb von 15 Tagen nach ihrer Herstellung zu verbrauchen)

4.8.   Calciumchlorid, 22 %ige wässrige Lösung

4.9.   Diethylether, zur Chromatografie

4.10.   Elutionsmittel: Gemisch von n-Hexan/Diethylether (87/13) (V/V)

4.11.   Natriumhydroxid, 12-Gew. %-Lösung

4.12.   Phenolphthalein, 1 %ige Lösung in Ethanol

4.13.   Trägergas: Wasserstoff oder Helium, zur Gaschromatografie

4.14.   Hilfsgase: Wasserstoff, Reinheit mindestens 99 %, frei von Feuchtigkeit und organischen Stoffen, und Luft, gleicher Reinheitsgrad, zur Gaschromatografie

4.15.   Silylierungsreagenz: Gemisch von Pyridin, Hexamethyldisilazan und Trimethylchlorsilan im Verhältnis 9/3/1 (V/V/V). (Gebrauchsfertige Lösungen sind im Handel erhältlich. Daneben gibt es auch andere Silylierungsreagenzien, z. B. bis-Trimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % Trimethylchlorsilan, das mit gleichen Teilen wasserfreiem Pyridin gemischt werden muss.)

4.16.   Referenzproben: reine Monoglyceride oder Gemische von Monoglyceriden mit bekannter Zusammensetzung, die möglichst der Zusammensetzung der Probe ähnlich ist.

5.   VERFAHREN

5.1.   Vorbereiten der Probe

5.1.1.   Öle mit einem Gehalt an freien Säuren unter 3 % brauchen vor der Säulenchromatografie mit Kieselgel nicht neutralisiert zu werden. Öle mit einem Gehalt an freien Säuren über 3 % sind gemäß Ziffer 5.1.1.1 zu neutralisieren.

5.1.1.1.   50 g Öl und 200 ml n-Hexan in den 1 000-ml-Trichter (3.13) geben. 100 ml Isopropanol und so viel 12 %ige Natriumhydroxidlösung (4.11) hinzufügen, wie dem Gehalt des Öls an freien Fettsäuren, zuzüglich 5 %, entspricht. Eine Minute lang kräftig schütteln, 100 ml destilliertes Wasser zugeben, erneut schütteln und absetzen lassen.

Nach dem Dekantieren die untere, die Seifen enthaltende Schicht sowie etwaige Zwischenschichten (Schleim, unlösliche Stoffe) entfernen. Die Hexanlösung des neutralisierten Öls mehrmals mit je 50—60 ml der Isopropanol/Wasserlösung (1/1 V/V) (4.4) waschen, bis die Rosafärbung des Phenolphthaleins verschwindet.

Den größten Teil des Hexans unter Vakuum (z. B. im Rotationsverdampfer) abdestillieren. Das Öl in einen 100-ml-Rundkolben (3.5) überführen und bis zur vollständigen Entfernung des Lösungsmittels unter Vakuum trocknen.

Nach diesem Verfahren muss der Säuregehalt des Öls unter 0,5 % liegen.

5.1.2.   1,0 g des wie beschrieben vorbereiteten Öls in einen 25-ml-Erlenmeyerkolben (3.1) geben und in 10 ml Elutionsmittel (4.10) lösen. Die Lösung vor der Kieselgelsäulenchromatografie mindestens 15 Minuten ruhen lassen.

Wenn die Lösung trüb ist, sollte sie zentrifugiert werden, um optimale Chromatografiebedingungen zu schaffen. (Es können gebrauchsfertige SPE-Kartuschen (500 mg) verwendet werden).

5.1.3.   Vorbereiten der Chromatografiesäule

Etwa 30 ml Elutionsmittel (4.10) in die Säule (3.3) geben, einen Wattebausch mit Hilfe des Glasstabs bis auf den Grund der Säule schieben; dabei die Luft herausdrücken.

In einem 100-ml-Becherglas 25 g Kieselgel (4.1) in etwa 80 ml Elutionsmittel suspendieren, dann mithilfe eines Trichters in die Säule geben.

Zur restlosen Überführung des Kieselgels in die Säule ist das Becherglas mit dem Elutionsmittel (4.10) zu spülen. Hahn öffnen und soviel Elutionsmittel ablaufen lassen, bis der Elutionsmittelspiegel etwa 2 mm über dem Kieselgel liegt.

5.1.4.   Säulenchromatografie

In einen 25-ml-Erlenmeyerkolben (3.1) wird genau 1,0 g der gemäß Ziffer 5.1 vorbereiteten Probe eingewogen.

Die Probe in 10 ml Elutionsmittel (4.10) auflösen und die Lösung in die gemäß Ziffer 5.1.3 vorbereitete Chromatografiesäule geben. Nicht umrühren.

Hahn öffnen und die Probenlösung bis zur Kieselgelschicht ablaufen lassen. Mit 150 ml Elutionsmittel eluieren. Die Durchlaufgeschwindigkeit auf 2 ml/Min. einstellen (so dass 150 ml die Säule in 60 bis 70 Minuten durchströmen).

Eluat in einem zuvor austarierten 250-ml-Rundkolben auffangen. Das Lösungsmittel unter Vakuum eindampfen und letzte Lösungsmittelspuren im Stickstoffstrom entfernen.

Den Rundkolben wiegen und den Extrakt berechnen.

(Bei Verwendung von gebrauchsfertigen Kieselgel-SPE-Kartuschen ist wie folgt vorzugehen:

1 ml der Lösung (5.1.2) in die mit 3 ml n-Hexan vorbereiteten Kartuschen geben.

Nach der Perkolation der Lösung mit 4 ml h-Hexan/Diethylether 9:1 (V/V) eluieren.

Das Eluat in einem 10-ml-Glas auffangen und im Stickstoffstrom bis zur Trockne eindampfen.

Die Pankreaslipase (5.2) auf den Rückstand einwirken lassen. Es ist wichtig, die Fettsäurezusammensetzung vor und nach dem Durchlaufen der SPE-Kartusche zu überprüfen).

5.2.   Hydrolyse durch Pankreaslipase

5.2.1.   0,1 g des gemäß Ziffer 5.1 zubereiteten Öls in ein Zentrifugenglas einwiegen. 2 ml Pufferlösung (4.6), 0,5 ml Natriumcholatlösung (4.7) und 0,2 ml Calciumchloridlösung zugeben und nach jeder Zugabe gut schütteln. Das Glas mit dem Schliffstopfen verschließen und bei 40 + 0,5 °C in den Thermostaten stellen.

5.2.2.   20 mg Lipase zugeben, vorsichtig schütteln (Befeuchten des Stopfens vermeiden) und das Glas genau 2 Minuten in den Thermostaten stellen. Herausnehmen, genau 1 Minute kräftig schütteln und abkühlen lassen.

5.2.3.   1 ml Diethylether zugeben, das Glas verschließen und kräftig schütteln, dann zentrifugieren und die Etherlösung mithilfe einer Mikroliterspritze in ein sauberes und trockenes Glas überführen.

5.3.   Zubereitung der silylierten Derivate und Vorbereitung der Gaschromatografie

5.3.1.   Mithilfe einer Mikroliterspritze 100 μl der Lösung (5.2.3.) in ein 10-ml-Zentrifugenglas mit konischem Boden geben.

5.3.2.   Das Lösungsmittel im schwachen Stickstoffstrom austreiben, 200 μl Silylierungsreagenz (4.15) zugeben, das Glas verschließen und 20 Minuten ruhen lassen.

5.3.3.   Nach 20 Minuten 1 bis 5 ml n-Hexan (je nach Chromatografiebedingungen) zugeben; die erhaltene Lösung ist bereit für die Gaschromatografie.

5.4.   Gaschromatografie

Betriebsbedingungen:

—	Injektortemperatur (‚On-column-Injektor‘) unter dem Siedepunkt des Lösungsmittels (68 °C),

—	Detektortemperatur: 350 °C,

—	Säulentemperatur: Temperaturprogramm des Ofens: 1 Minute 60 °C, dann Erhöhung um 15 °C pro Minute bis auf 180 °C, dann um 5 °C pro Minute bis auf 340 °C, dann 13 Minuten 340 °C,

—

Trägergas: Wasserstoff oder Helium, mit für die Auflösung gemäß Abbildung 1 geeigneter linearer Strömungsgeschwindigkeit. Die Retentionszeit des Triglycerids C54 muss 40 ± 5 Minuten betragen (siehe Abbildung 2). (Die hier vorgeschlagenen Arbeitsbedingungen sind Anhaltspunkte. Bei der Durchführung der Analyse sind sie so zu optimieren, dass die gewünschte Auflösung erzielt wird. Die Höhe des 2-Glycerinmonopalmitat-Peaks muss mindestens 10 % der Skala des Schreibers entsprechen.)

—	Einspritzmenge: 0,5—1 μl der (5 ml) n-Hexanlösung (5.3.3).

5.4.1.   Identifizierung der Peaks

Die einzelnen Monoglyceride werden auf der Grundlage der erhaltenen Retentionszeiten bestimmt, die mit den Retentionszeiten von unter den gleichen Bedingungen analysierten Standardmischungen von Monoglyceriden verglichen werden.

5.4.2.   Quantitative Bestimmung

Die einzelnen Peakflächen werden mithilfe eines elektronischen Integrators berechnet.

6.   DARSTELLUNG DER ERGEBNISSE

Der prozentuale Gehalt an Glycerinmonopalmitat errechnet sich aus dem Quotienten der Peakfläche des entsprechenden Peaks und der Summe der Peakflächen aller Monoglyceride (vgl. Abbildung 2) nach folgender Formel:

Glycéryl monopalmitate (%):

(Glycéril monopalmitate = Glycerinmonopalmitat)

Dabei ist:

Ax	=	Peakfläche von Glycerinmonopalmitat
ΣA	=	Summe der Peakflächen aller Monoglyceride

Das Ergebnis wird mit einer Dezimalstelle angegeben.

7.   ANALYSEBERICHT

Im Analysebericht ist Folgendes anzugeben:

—	Verweis auf diese Methode,

—	alle für die vollständige Identifizierung der Probe erforderlichen Angaben,

—	Analyseergebnis,

—	jede Abweichung von dieser Methode aufgrund einer Entscheidung der Beteiligten oder aus anderen Gründen,

—	Angaben zum Labor, Analysedatum und Unterschrift der für die Analyse verantwortlichen Personen.

Abbildung 1

Chromatogramm der Produkte der Silylierungsreaktion, die durch Einwirkung der Lipase auf ein raffiniertes Olivenöl mit 20 %igem Zusatz an verestertem Öl (100 %) gewonnen wurden

Abbildung 2

Chromatogramm von:

A)   Olivenöl, nicht verestert; nach Lipase; nach Silylierung; unter diesen Bedingungen (Kapillarsäule 8—12 m) wird die Wachsfraktion gleichzeitig mit der Diglyceridfraktion oder kurze Zeit später eluiert.

Nach der Lipase darf der Triglyceridgehalt 15 % nicht übersteigen.

Chromatogramm von:

B)   verestertem Öl nach Lipase; nach Silylierung; unter diesen Bedingungen (Kapillarsäule 8—12 m) wird die Wachsfraktion gleichzeitig mit der Diglyceridfraktion oder kurze Zeit später eluiert.

Nach der Lipase darf der Triglyceridgehalt 15 % nicht übersteigen.

8.   ANMERKUNGEN

Anmerkung 1:   HERSTELLUNG DER LIPASE

Lipasen mit ausreichender Aktivität sind im Handel erhältlich. Sie können aber auch im Labor wie folgt hergestellt werden:

5 kg frisches Schweinepankreas auf 0 °C abkühlen. Das umhüllende feste Fett und die anhängenden Gewebe entfernen und Pankreas im Mixer zu einem flüssigen Brei zerkleinern. Diesen Brei 4 bis 6 Stunden mit 2,5 l wasserfreiem Aceton rühren, anschließend zentrifugieren. Den Rückstand noch dreimal mit dem gleichen Volumen Aceton, dann zweimal mit einer Mischung von Aceton und Diethylether 1:1 (V/V) und zweimal mit Diethylether extrahieren.

Den Rückstand 48 Stunden im Vakuum trocknen, bis ein stabiles Pulver entsteht, das vor Feuchtigkeit geschützt im Kühlschrank aufbewahrt werden sollte.

Anmerkung 2:   PRÜFUNG DER LIPASEAKTIVITÄT

Durch Rühren (10 Min.) eines Gemischs von 165 ml Gummiarabikumlösung (100 g/l), 15 g gemahlenem Eis und 20 ml neutralisiertem Olivenöl mit einem geeigneten Rührgerät eine Ölemulsion herstellen.

10 ml dieser Emulsion in ein 50-ml-Becherglas geben, anschließend 0,3 ml Natriumcholatlösung (0,2 g/ml) und 20 ml destilliertes Wasser hinzufügen.

Das Becherglas bei 37 °C in einen Thermostaten stellen; die Elektroden des pH-Meters und den Spiralrührer einsetzen.

Mit Hilfe einer Bürette tropfenweise 0,1 N Natriumhydroxidlösung hinzufügen bis zu einem pH-Wert von 8,3.

Eine ausreichende Menge der wässrigen Lipasesuspension (0,1 g/ml Lipase) hinzufügen. Sobald das pH-Meter 8,3 anzeigt, die Stoppuhr anstellen und Natriumhydroxidlösung so zutropfen lassen, dass der pH-Wert bei 8,3 gehalten wird. Das Volumen der pro Minute verbrauchten Lösung notieren.

Die Werte in ein Koordinatensystem eintragen, und zwar die Zeitablesungen als Abszisse und die Anzahl ml 0,1 N Alkalilösung zur Aufrechterhaltung eines konstanten pH-Werts als Ordinate. Dabei muss sich eine Gerade ergeben.

Die Lipaseaktivität, ausgedrückt als Lipaseeinheiten je mg, wird mit folgender Formel angegeben:

Dabei ist:

A	die Aktivität in Lipaseeinheiten/mg
V	die Anzahl der pro Minute verbrauchten Milliliter 0,1 N Natriumhydroxidlösung (berechnet aus der grafischen Darstellung)
N	die Normalität der Natriumhydroxidlösung
m	das Gewicht der Lipaseprobe in mg.

Die Lipaseeinheit wird als die Menge Enzym definiert, die 10 Mikroäquivalente Säure pro Minute freisetzt.“