32000L0045

Kommissionens direktiv 2000/45/EF

af 6. juli 2000

om fællesskabsmetoder til bestemmelse af vitamin A, vitamin E og tryptophan i foderstoffer

(EØS-relevant tekst)

KOMMISSIONEN FOR DE EUROPÆISKE FÆLLESSKABER HAR -

under henvisning til traktaten om oprettelse af Det Europæiske Fællesskab,

under henvisning til Rådets direktiv 70/373/EØF af 20. juli 1970 om indførelse af fællesskabsprøveudtagningsmåder og analysemetoder for så vidt angår den officielle kontrol med foderstoffer(1), som ændret ved akten vedrørende Østrigs, Finlands og Sveriges tiltrædelse(2), særlig artikel 2, og

ud fra følgende betragtninger:

(1) Ifølge direktiv 70/373/EØF skal den officielle kontrol med foderstoffer til konstatering af, om de betingelser, der er fastsat på grundlag af administrativt eller ved lov fastsatte bestemmelser om foderstoffernes beskaffenhed og sammensætning, er opfyldt, foretages ved hjælp af fællesskabsprøveudtagningsmåder og -analysemetoder.

(2) Rådets direktiv 70/524/EØF af 23. november 1970 om tilsætningsstoffer til foderstoffer(3), senest ændret ved Kommissionens forordning (EF) nr. 2439/1999(4), kræver at indholdet af vitamin A og vitamin E skal anføres på etiketten, hvis der til forblandinger og foderstoffer er tilsat sådanne stoffer.

(3) Rådets direktiv 79/373/EØF af 2. april 1979 om handel med foderblandinger(5), senest ændret ved direktiv 2000/16/EF(6), og Rådets direktiv 93/74/EØF af 13. september 1993 om foder med særlige ernæringsformål(7), senest ændret ved direktiv 96/25/EF(8), kræver, at aminosyrer anføres på etiketten.

(4) Der må fastsættes fællesskabsmetoder til kontrol af disse stoffer.

(5) Direktivets foranstaltninger er i overensstemmelse med udtalelse fra Den Stående Komité for Foderstoffer -

UDSTEDT FØLGENDE DIREKTIV:

Artikel 1

Medlemsstaterne sørger for, at analyser til officiel kontrol af indholdet af vitamin A, vitamin E og tryptophan i foderstoffer og forblandinger udføres efter metoderne i bilaget.

Artikel 2

Medlemsstaterne sætter de nødvendige love og administrative bestemmelser i kraft for at efterkomme dette direktiv inden den 31. august 2000. De underretter straks Kommissionen herom.

Bestemmelserne anvendes fra den 1. september 2000.

Disse love og bestemmelser skal ved vedtagelsen indeholde en henvisning til dette direktiv eller skal ved offentliggørelsen ledsages af en sådan henvisning. De nærmere regler for henvisningen fastsættes af medlemsstaterne.

Artikel 3

Dette direktiv træder i kraft på tyvendedagen efter offentliggørelsen i De Europæiske Fællesskabers Tidende.

Artikel 4

Dette direktiv er rettet til medlemsstaterne.

Udfærdiget i Bruxelles, den 6. juli 2000.

På Kommissionens vegne

David Byrne

Medlem af Kommissionen

(1) EFT L 170 af 3.8.1970, s. 2.

(2) EFT C 241 af 29.8.1994, s. 1.

(3) EFT L 270 af 14.12.1970, s. 1.

(4) EFT L 297 af 18.11.1999, s. 8.

(5) EFT L 86 af 6.4.1979, s. 30.

(6) EFT L 105 af 3.5.2000, s. 36.

(7) EFT L 237 af 22.9.1993, s. 23.

(8) EFT L 125 af 23.5.1996, s. 35.

BILAG

DEL A

BESTEMMELSE AF VITAMIN A

1. Formål og anvendelsesområde

Denne metode benyttes til bestemmelse af vitamin A (retinol) i foderstoffer og forblandinger. Ved vitamin A forstås all-trans-retinylalkohol og dens cis-isomerer, som bestemmes ved denne metode. Indholdet af vitamin A udtrykkes i internationale enheder (IU) pr. kg. En IU svarer til aktiviteten af 0,300 μg all-trans-vitamin A-alkohol eller 0,344 μg all-trans-vitamin A-acetat eller 0,550 μg all-trans-vitamin A-palmitat.

Bestemmelsesgrænsen er 2000 IU vitamin A pr. kg.

2. Princip

Prøven hydrolyseres med kaliumhydroxid opløst i ethanol, og vitamin A ekstraheres med petroleumsether. Opløsningsmidlet fjernes ved inddampning, og remanensen opløses i methanol og fortyndes om nødvendigt til den ønskede koncentration. Vitamin A-indholdet bestemmes ved omvendt fase-HPLC med UV- eller fluorescensdetektor. Kromatograferingsparametrene vælges således, at all-trans-vitamin A-alkohol og dens cis-isomere ikke adskilles.

3. Reagenser

3.1. Ethanol, σ = 96 %

3.2. Petroleumsether, kogepunktsinterval 40 °C-60 °C

3.3. Methanol

3.4. Kaliumhydroxidopløsning, β = 50 g/100 ml

3.5. Natriumascorbatopløsning, β = 10 g/100 ml (se punkt 7.7)

3.6. Natriumsulfid, Na2S · x H2O (x = 7 - 9)

3.6.1. Natriumsulfidopløsning, c = 0,5 mol/l i glycerol, β = 120 g/l (for x = 9) (se punkt 7.8)

3.7. Phenolphthaleinopløsning, β = 2 g/100 ml i ethanol (3.1)

3.8. 2-propanol

3.9. Mobil fase til HPLC: blanding af methanol (3.3) og vand, f.eks. 980 + 20 (v + v). Det nøjagtige forhold bestemmes af den anvendte kolonnes egenskaber.

3.10. Nitrogen, oxygenfri

3.11. All-trans-vitamin A-acetat, ekstra ren, med certificeret aktivitet, f.eks. 2,80 x 106 IU/g

3.11.1. Stamopløsning af all-trans-vitamin A-acetat: Der afvejes med 0,1 mg nøjagtighed 50 mg vitamin A-acetat (3.11) i en 100-ml-målekolbe. Efter opløsning i 2-propanol (3.8) fyldes der op til mærket med samme opløsningsmiddel. Denne opløsning har en nominel koncentration på 1400 IU vitamin A pr. ml. Det nøjagtige indhold bestemmes efter punkt 5.6.3.1.

3.12. All-trans-vitamin A-palmitat, ekstra ren, med certificeret aktivitet, f.eks. 1,80 x 106 IU/g

3.12.1. Stamopløsning af all-trans-vitamin A-palmitat: Der afvejes med 0,1 mg nøjagtighed 80 mg vitamin A-palmitat (3.12) i en 100-ml-målekolbe. Efter opløsning i 2-propanol (3.8) fyldes der op til mærket med samme opløsningsmiddel. Denne opløsning har en nominel koncentration på 1400 IU vitamin A pr. ml. Det nøjagtige indhold bestemmes efter punkt 5.6.3.2.

3.13. 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (se punkt 7.5)

4. Apparatur

4.1. Vakuumrotationsfordamper

4.2. Udstyr af brunt glas

4.2.1. Fladbundede eller koniske kolber, 500 ml, med slib

4.2.2. Målekolber med slibprop og tynd hals, 10, 25, 100 og 500 ml

4.2.3. Skilletragte, koniske, 1000 ml, med slibprop

4.2.4. Pærekolber, 250 ml, med slib

4.3. Allihn-svaler, kappelængde 300 mm, med slib, med adapter til gastilførsel

4.4. Foldefilterpapir til faseseparation, diameter 185 mm (f.eks. Schleicher & Schüll 597 HY 1/2)

4.5. HPLC-udstyr med injektionssystem

4.5.1. HPLC-kolonne, 250 mm x 4 mm, C18, 5 eller 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende (præstationskriterium: kun én top for alle retinolisomerer under HPLC-betingelserne)

4.5.2. UV- eller fluorescensdetektor, med variabel bølgelængde

4.6. Spektrofotometer med 10-mm-kvartskuvetter

4.7. Vandbad med magnetomrører

4.8. Ekstraktionsapparat (se figur 1) bestående af følgende:

4.8.1. Cylinderglas på 1 l med slibhals og -prop

4.8.2. Slibindsats med sidearm og justerbart rør, der er ført igennem midten. Det justerbare rør skal være U-formet i den nedre ende og være tilspidset i den anden ende, således at det øverste væskelag i glasset kan overføres til en skilletragt.

5. Fremgangsmåde

Anmærkning:

Vitamin A er følsomt over for lys (UV) og oxidation. Alt arbejde skal udføres afskærmet mod lys (glasudstyr af brunt glas eller omviklet med aluminiumfolie) og oxygen (skylning med nitrogen). Under ekstraktionen udskiftes luften over væsken med nitrogen (overtryk udlignes ved jævnligt at lette på proppen).

5.1. Prøveforberedelse

Prøven formales så fint, at den kan passere gennem en sigte med 1 mm maskevidde, men varmeudvikling skal undgås. Formalingen foretages umiddelbart før afvejning og forsæbning, ellers kan der gå vitamin A tabt.

5.2. Forsæbning

Afhængigt af vitamin A-indholdet afvejes der med en nøjagtighed på 0,01 g 2-25 g af prøven i en 500-ml-fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1). Der tilsættes under forsigtig blanding i rækkefølge 130 ml ethanol (3.1), ca. 100 mg BHT (3.13), 2 ml natriumascorbatopløsning (3.5) og 2 ml natriumsulfidopløsning (3.6). Der sættes en svaler på kolben, som anbringes på vandbad med magnetomrører (4.7). Der opvarmes til kogning og koges med tilbagesvaling i 5 minutter. Dernæst tilsættes der 25 ml kaliumhydroxidopløsning (3.4) gennem svaleren (4.3), og der koges med tilbagesvaling i endnu 25 minutter under omrøring og under langsom nitrogengennemstrømning. Svaleren skylles med ca. 20 ml vand, og kolbens indhold afkøles til stuetemperatur.

5.3. Ekstraktion

Forsæbningsopløsningen overføres kvantitativt til en 1000-ml-skilletragt (4.2.3) eller ekstraktionsapparatet (4.8) ved skylning med i alt 250 ml vand. Derefter skylles forsæbningskolben først med 25 ml ethanol (3.1) og dernæst med 100 ml petroleumsether (3.2), idet skyllevæskerne overføres til skilletragten eller ekstraktionsapparatet. Forholdet mellem vand og ethanol i den samlede væskemængde skal være ca. 2:1. Der rystes kraftigt i 2 minutter, og blandingen henstår til adskillelse i 2 minutter.

5.3.1. Ekstraktion med skilletragt (4.2.3)

Når væsken er skilt i to lag (se punkt 7.3), overføres petroleumsetherlaget til en anden skilletragt (4.2.3). Ekstraktionen gentages 2 gange med 100 ml petroleumsether (3.2) og derefter 2 gange med 50 ml petroleumsether (3.2).

De samlede ekstrakter i skilletragten vaskes forsigtigt med 2 gange 100 ml vand (uden omrystning, så der ikke dannes emulsion) og derefter flere gange ved rystning med 100 ml vand, indtil vandet ikke farves ved tilsætning af phenolphthalein (3.7) (4 gange er normalt tilstrækkeligt). Det vaskede ekstrakt filtreres over i en 500-ml-målekolbe (4.2.2) gennem et tørt foldefilter til faseseparation (4.4), således at eventuelt opslæmmet vand fjernes. Skilletragten og filteret skylles med 50 ml petroleumsether (3.2), og der fyldes op til mærket med petroleumsether (3.2) og blandes omhyggeligt.

5.3.2. Ekstraktion med ekstraktionsapparat (4.8)

Når væsken er skilt i to lag (se punkt 7.3), udskiftes cylinderglassets (4.8.1) prop med slibindsatsen (4.8.2), og den nederste U-formede del af det justerbare rør anbringes, så dets munding er lige over skillefladen. Ved at sætte svagt nitrogentryk på sidearmen overføres det lette lag af petroleumsether til en 1000-ml-skilletragt (4.2.3). Der tilsættes 100 ml petroleumsether (3.2) til cylinderglasset, og det tilproppes og rystes omhyggeligt. Når væsken er skilt i to lag, overføres det lette lag til skilletragten som før. Ekstraktionen gentages med endnu 100 ml petroleumsether (3.2) og dernæst med 2 portioner 50 ml petroleumsether (3.2), som alle overføres til skilletragten.

De samlede ekstrakter i skilletragten vaskes som beskrevet i punkt 5.3.1, og der fortsættes som beskrevet der.

5.4. Fremstilling af prøveopløsning til HPLC-analyse

Der afpipetteres en portion af petroleumsetherekstraktet (fra 5.3.1 eller 5.3.2) i en 250-ml-pærekolbe (4.2.4). Der inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (4.1) under vakuum med en vandbadstemperatur på højst 40 °C. Trykket udlignes til atmosfæretryk ved, at der ledes nitrogen (3.10) ind i kolben, og kolben fjernes fra inddampningsapparatet. Resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.10), og remanensen opløses straks i en kendt mængde (10-100 ml) methanol (3.3) (vitamin A-koncentrationen skal ligge i intervallet 5-30 IU/ml).

5.5. Bestemmelse ved HPLC

Separationen af vitamin A finder sted på en C18-kolonne med omvendt fase (4.5.1), og koncentrationen måles med en UV-detektor (325 nm) eller en fluorescensdetektor (excitation: 325 nm, emission: 475 nm) (4.5.2).

Der indsprøjtes en prøveportion (f.eks. 20 μl) af methanolopløsningen fra punkt 5.4, og der elueres med den mobile fase (3.9). Gennemsnittet af tophøjden (toparealet) for flere indsprøjtninger af samme prøveopløsning og gennemsnittet af tophøjden (toparealet) for flere indsprøjtninger af kalibreringsopløsningerne (5.6.2) beregnes.

HPLC-betingelser

Nedenstående betingelser er vejledende; der kan benyttes andre betingelser, forudsat at de fører til tilsvarende resultater.

>TABELPOSITION>

5.6. Kalibrering

5.6.1. Fremstilling af arbejdsstandardopløsninger

Der afpipetteres 20 ml stamopløsning af vitamin A-acetat (3.11.1) eller vitamin A-palmitat (3.12.1) i en 500-ml-fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1), og der hydrolyseres som beskrevet i punkt 5.2, dog uden tilsætning af BHT. Derefter ekstraheres der med petroleumsether (3.2) som beskrevet i 5.3 og fortyndes til 500 ml med petroleumsether (3.2). 100 ml af denne opløsning inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (se punkt 5.4), resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.10), og remanensen opløses i 10 ml methanol (3.3). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 560 IU pr. ml. Det nøjagtige indhold bestemmes efter punkt 5.6.3.3. Arbejdsstandardopløsningen fremstilles frisk før brugen.

Der afpipetteres 2,0 ml af denne arbejdsstandardopløsning i en 20-ml-målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Denne fortyndede arbejdsstandardopløsning har en nominel vitamin A-koncentration på 56 IU pr. ml.

5.6.2. Fremstilling af kalibreringsopløsninger og kalibreringskurve

Der overføres henholdsvis 1,0, 2,0, 5,0 og 10,0 ml af den fortyndede arbejdsstandardopløsning til 4 målekolber på hver 20 ml, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Opløsningernes nominelle vitamin A-koncentration er 2,8, 5,6, 14,0 og 28,0 IU pr. ml.

Der indsprøjtes 20 μl af hver kalibreringsopløsning flere gange, og gennemsnittet af tophøjden (toparealet) bestemmes. Kalibreringskurven optegnes ved hjælp af de gennemsnitlige tophøjder (arealer) under hensyntagen til resultaterne af UV-kontrollen (5.6.3.3).

5.6.3. UV-indstilling af standardopløsningerne

5.6.3.1. Stamopløsning af vitamin A-acetat

Der afpipetteres 2,0 ml stamopløsning af vitamin A-acetat (3.11.1) i en 50-ml-målekolbe (4.2.2), hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 56 IU pr. ml. Der afpipetteres 3,0 ml af denne fortyndede opløsning af vitamin A-acetat i en 25-ml-målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 6,72 IU pr. ml. Opløsningens UV-spektrum i området 300-400 nm måles mod 2-propanol (3.8) i spektrofotometeret (4.6). Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm.

Indholdet af vitamin A beregnes efter formlen:

>PIC FILE= "L_2000174DA.003601.EPS">

5.6.3.2. Stamopløsning af vitamin A-palmitat

Der afpipetteres 2,0 ml stamopløsning af vitamin A-palmitat (3.12.1) i en 50-ml-målekolbe (4.2.2), hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 56 IU pr. ml. Der afpipetteres 3,0 ml af denne fortyndede opløsning af vitamin A-palmitat i en 25-ml-målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 6,72 IU pr. ml. Opløsningens UV-spektrum i området 300-400 nm måles mod 2-propanol (3.8) i spektrofotometeret (4.6). Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm.

Indholdet af vitamin A beregnes efter formlen:

>PIC FILE= "L_2000174DA.003602.EPS">

5.6.3.3. Arbejdsstandardopløsning af vitamin A

Der afpipetteres 3,0 ml af den ufortyndede arbejdsstandardopløsning af vitamin A som fremstillet under punkt 5.6.1 i en 50-ml-målekolbe (4.2.2), hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Der afpipetteres 5,0 ml af denne opløsning i en 25-ml-målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med 2-propanol (3.8). Opløsningens nominelle vitamin A-koncentration er 6,72 IU pr. ml. Opløsningens UV-spektrum i området 300-400 nm måles mod 2-propanol (3.8) i spektrofotometeret (4.6). Ekstinktionsmaksimum skal ligge mellem 325 nm og 327 nm.

Indholdet af vitamin A beregnes efter formlen:

>PIC FILE= "L_2000174DA.003603.EPS">

6. Beregning af resultater

Ud fra gennemsnittet af højden (arealet) af vitamin A-toppene fra prøveopløsningen bestemmes prøveopløsningens koncentration i IU/ml på kalibreringskurven (5.6.2).

Indholdet w af vitamin A i IU pr. kg prøve er givet ved følgende formel:

>PIC FILE= "L_2000174DA.003701.EPS">

hvor:

β= vitamin A-koncentration i prøveopløsningen (5.4) i IU/ml

V1= volumen af prøveopløsning (5.4) i ml

V2= volumen af den i 5.4 udtagne prøve i ml

m= massen af prøveportionen i g

7. Bemærkninger

7.1. For prøver med lavt indhold af vitamin A kan man med fordel samle petroleumsetherekstrakterne fra to forsæbningsportioner (afvejet mængde: 25 g) i én prøve til HPLC-analyse.

7.2. Den prøve, der tages ud til analyse, bør ikke indeholde mere end 2 g fedtstof.

7.3. Hvis faserne ikke skiller, kan der tilsættes ca. 10 ml ethanol (3.1) til at bryde emulsionen.

7.4. Med torskeleverolie og andre rene fedtstoffer øges forsæbningstiden til 45-60 minutter.

7.5. Der kan anvendes hydroquinon i stedet for BHT.

7.6. Ved brug af en normal-fase kolonne er det muligt at adskille retinolisomererne.

7.7. Der kan anvendes ca. 150 mg ascorbinsyre i stedet for natriumascorbatopløsning.

7.8. Der kan anvendes ca. 50 mg EDTA i stedet for natriumsulfidopløsning.

8. Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser, udført på den samme prøve, må højst være 15 % af det største resultat.

9. Resultater af en ringanalyser(1)

>TABELPOSITION>

Figur 1: Ekstraktionsapparat (4.8)

>PIC FILE= "L_2000174DA.003801.EPS">

DEL B

BESTEMMELSE AF VITAMIN E

1. Formål og anvendelsesområde

Denne metode benyttes til bestemmelse af vitamin E i foderstoffer og forblandinger. Indholdet af vitamin E udtrykkes i mg DL-α-tocopherolacetat pr. kg. 1 mg DL-α-tocopherolacetat svarer til 0,91 mg DL-α-tocopherol (vitamin E).

Bestemmelsesgrænsen er 2 mg vitamin E pr. kg.

2. Princip

Prøven hydrolyseres med kaliumhydroxid opløst i ethanol, og vitamin E ekstraheres med petroleumsether. Opløsningsmidlet fjernes ved inddampning, og remanensen opløses i methanol og fortyndes om nødvendigt til den ønskede koncentration. Vitamin E-indholdet bestemmes ved omvendt fase-HPLC med UV- eller fluorescensdetektor.

3. Reagenser

3.1. Ethanol, σ = 96 %

3.2. Petroleumsether, kogepunktsinterval 40 °C-60 °C

3.3. Methanol

3.4. Kaliumhydroxidopløsning, β = 50 g/100 ml

3.5. Natriumascorbatopløsning, β = 10 g/100 ml (se punkt 7.7)

3.6. Natriumsulfid, Na2S · x H2O (x = 7 - 9)

3.6.1. Natriumsulfidopløsning, c = 0,5 mol/l i glycerol, β = 120 g/l (for x = 9) (se punkt 7.8)

3.7. Phenolphthaleinopløsning, β = 2 g/100 ml i ethanol (3.1)

3.8. Mobil fase til HPLC: blanding af methanol (3.3) og vand, f.eks. 980 + 20 (v + v). Det nøjagtige forhold bestemmes af den anvendte kolonnes egenskaber.

3.9. Nitrogen, oxygenfri

3.10. DL-α-tocopherolacetat, ekstra ren, med certificeret aktivitet

3.10.1. Stamopløsning af DL-α-tocopherolacetat: Der afvejes med 0,1 mg nøjagtighed 100 mg DL-α-tocopherolacetat (3.10) i en 100-ml-målekolbe. Efter opløsning i ethanol (3.1) fyldes der op til mærket med samme opløsningsmiddel. 1 ml af denne opløsning indeholder 1 mg DL-α-tocopherolacetat. (UV-kontrol, se punkt 5.6.1.3; stabilisering, se punkt 7.4)

3.11. DL-α-tocopherol, ekstra ren, med certificeret aktivitet

3.11.1. Stamopløsning af DL-α-tocopherol: Der afvejes med 0,1 mg nøjagtighed 100 mg DL-α-tocopherol (3.11) i en 100-ml-målekolbe. Efter opløsning i ethanol (3.1) fyldes der op til mærket med samme opløsningsmiddel. 1 ml af denne opløsning indeholder 1 mg DL-α-tocopherol. (UV-kontrol, se punkt 5.6.2.3; stabilisering, se punkt 7.4)

3.12. 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (BHT) (set punkt 7.5)

4. Apparatur

4.1. Vakuumrotationsfordamper

4.2. Udstyr af brunt glas

4.2.1. Fladbundede eller koniske kolber, 500 ml, med slib

4.2.2. Målekolber med slibprop og tynd hals, 10, 25, 100 og 500 ml

4.2.3. Skilletragte, koniske, 1000 ml, med slibprop

4.2.4. Pærekolber, 250 ml, med slib

4.3. Allihn-svaler, kappelængde 300 mm, med slib, med adapter til gastilførsel

4.4. Foldefilterpapir til faseseparation, diameter 185 mm (f.eks. Schleicher & Schüll 597 HY 1/2)

4.5. HPLC-udstyr med injektionssystem

4.5.1. HPLC-kolonne, 250 mm x 4 mm, C18, 5 eller 10 μm pakkemateriale, eller tilsvarende

4.5.2. UV- eller fluorescensdetektor, med variabel bølgelængde

4.6. Spektrofotometer med 10 mm kvartskuvetter

4.7. Vandbad med magnetomrører

4.8. Ekstraktionsapparat (se figur 1) bestående af følgende:

4.8.1. Cylinderglas på 1 l med slibhals og -prop

4.8.2. Slibindsats med sidearm og justerbart rør, der er ført igennem midten. Det justerbare rør skal være U-formet i den nedre ende og være tilspidset i den anden ende, således at det øverste væskelag i glasset kan overføres til en skilletragt.

5. Fremgangsmåde

Anmærkning:

Vitamin E er følsomt over for lys (UV) og oxidation. Alt arbejde skal udføres afskærmet mod lys (glasudstyr af brunt glas eller omviklet med aluminiumfolie) og oxygen (skylning med nitrogen). Under ekstraktionen udskiftes luften over væsken med nitrogen (overtryk udlignes ved jævnligt at lette på proppen).

5.1. Prøveforberedelse

Prøven formales så fint, at den kan passere gennem en sigte med 1 mm maskevidde, men varmeudvikling skal undgås. Formalingen foretages umiddelbart før afvejning og forsæbning, ellers kan der gå vitamin A tabt.

5.2. Forsæbning

Afhængigt af vitamin E-indholdet afvejes der med en nøjagtighed på 0,01 g 2-25 g af prøven i en 500-ml-fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1). Der tilsættes under forsigtig blanding i rækkefølge 130 ml ethanol (3.1), ca. 100 mg BHT (3.12), 2 ml natriumascorbatopløsning (3.5) og 2 ml natriumsulfidopløsning (3.6). Der sættes en svaler på kolben, som anbringes på vandbad med magnetomrører (4.7). Der opvarmes til kogning og koges med tilbagesvaling i 5 minutter. Dernæst tilsættes der 25 ml kaliumhydroxidopløsning (3.4) gennem svaleren (4.3), og der koges med tilbagesvaling i endnu 25 minutter under omrøring og under langsom nitrogengennemstrømning. Svaleren skylles med ca. 20 ml vand, og kolbens indhold afkøles til stuetemperatur.

5.3. Ekstraktion

Forsæbningsopløsningen overføres kvantitativt til en 1000 ml skilletragt (4.2.3) eller ekstraktionsapparatet (4.8) ved skylning med i alt 250 ml vand. Derefter skylles forsæbningskolben først med 25 ml ethanol (3.1) og dernæst med 100 ml petroleumsether (3.2), idet skyllevæskerne overføres til skilletragten eller ekstraktionsapparatet. Forholdet mellem vand og ethanol i den samlede væskemængde skal være ca. 2:1. Der rystes kraftigt i 2 minutter, og blandingen henstår til adskillelse i 2 minutter.

5.3.1. Ekstraktion med skilletragt (4.2.3)

Når væsken er skilt i to lag (se punkt 7.3), overføres petroleumsetherlaget til en anden skilletragt (4.2.3). Ekstraktionen gentages 2 gange med 100 ml petroleumsether (3.2) og derefter 2 gange med 50 ml petroleumsether (3.2).

De samlede ekstrakter i skilletragten vaskes forsigtigt med 2 gange 100 ml vand (uden omrystning, så der ikke dannes emulsion) og derefter flere gange ved rystning med 100 ml vand, indtil vandet ikke farves ved tilsætning af phenolphthalein (3.7) (4 gange er normalt tilstrækkeligt). Det vaskede ekstrakt filtreres over i en 500-ml-målekolbe (4.2.2) gennem et tørt foldefilter til faseseparation (4.4), således at eventuelt opslæmmet vand fjernes. Skilletragten og filteret skylles med 50 ml petroleumsether (3.2), og der fyldes op til mærket med petroleumsether (3.2) og blandes omhyggeligt.

5.3.2. Ekstraktion med ekstraktionsapparat (4.8)

Når væsken er skilt i to lag (se punkt 7.3), udskiftes cylinderglassets (4.8.1) prop med slibindsatsen (4.8.2), og den nederste U-formede del af det justerbare rør anbringes, så dets munding er lige over skillefladen. Ved at sætte svagt nitrogentryk på sidearmen overføres det lette lag af petroleumsether til en 1000-ml-skilletragt (4.2.3). Der tilsættes 100 ml petroleumsether (3.2) til cylinderglasset, og det tilproppes og rystes omhyggeligt. Når væsken er skilt i to lag, overføres det lette lag til skilletragten som før. Ekstraktionen gentages med endnu 100 ml petroleumsether (3.2) og dernæst med 2 portioner 50 ml petroleumsether (3.2), som alle overføres til skilletragten.

De samlede ekstrakter i skilletragten vaskes som beskrevet i punkt 5.3.1, og der fortsættes som beskrevet der.

5.4. Fremstilling af prøveopløsning til HPLC-analyse

Der afpipetteres en portion af petroleumsetherekstraktet (fra 5.3.1 eller 5.3.2) i en 250-ml-pærekolbe (4.2.4). Der inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (4.1) under vakuum med en vandbadstemperatur på højst 40 °C. Trykket udlignes til atmosfæretryk ved, at der ledes nitrogen (3.9) ind i kolben, og kolben fjernes fra inddampningsapparatet. Resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.9), og remanensen opløses straks i en kendt mængde (10-100 ml) methanol (3.3) (koncentrationen af DL-α-tocopherol skal ligge i intervallet 5-30 μg/ml).

5.5. Bestemmelse ved HPLC

Separationen af vitamin E finder sted på en C18-kolonne med omvendt fase (4.5.1), og koncentrationen måles med en UV-detektor (292 nm) eller en fluorescensdetektor (excitation: 295 nm, emission: 330 nm) (4.5.2).

Der indsprøjtes en prøveportion (f.eks. 20 μl) af methanolopløsningen fra punkt 5.4, og der elueres med den mobile fase (3.8). Gennemsnittet af tophøjden (toparealet) for flere indsprøjtninger af samme prøveopløsning og gennemsnittet af tophøjden (toparealet) for flere indsprøjtninger af kalibreringsopløsningerne (5.6.2) beregnes.

HPLC-betingelser

Nedenstående betingelser er vejledende; der kan benyttes andre betingelser, forudsat at de fører til tilsvarende resultater.

>TABELPOSITION>

5.6. Kalibrering (DL-α-tocopherolacetat eller DL-α-tocopherol)

5.6.1. DL-α-tocopherolacetatstandard

5.6.1.1. Fremstilling af arbejdsstandardopløsning

Der afpipetteres 25 ml stamopløsning af DL-α-tocopherolacetat (3.10.1) i en 500-ml-fladbundet eller konisk kolbe (4.2.1), og der hydrolyseres som beskrevet i punkt 5.2. Derefter ekstraheres der med petroleumsether (3.2) som beskrevet i punkt 5.3, og fortyndes til 500 ml med petroleumsether. 25 ml af denne opløsning inddampes til næsten tørhed på rotationsfordamper (se punkt 5.4), resterende opløsningsmiddel fjernes under en nitrogenstrøm (3.9), og remanensen opløses i 25,0 ml methanol (3.3). Opløsningens nominelle koncentration er 45,5 DL-α-tocopherol pr. ml svarende til 50 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml. Arbejdsstandardopløsningen fremstilles frisk før brugen.

5.6.1.2. Fremstilling af kalibreringsopløsninger og kalibreringskurve

Der overføres henholdsvis 1,0, 2,0, 4,0 og 10,0 ml af arbejdsstandardopløsningen til 4 målekolber på hver 20 ml, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Opløsningernes nominelle koncentration er 2,5, 5,0, 10,0 og 25,0 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml, dvs. 2,28, 4,55, 9,10 og 22,8 μg DL-α-tocopherol pr. ml.

Der indsprøjtes 20 μl af hver kalibreringsopløsning flere gange, og gennemsnittet af tophøjden (toparealet) bestemmes. Kalibreringskurven optegnes ved hjælp af de gennemsnitlige tophøjder (arealer).

5.6.1.3. UV-indstilling af stamopløsningen af DL-α-tocopherolacetat (3.10.1)

5,0 ml af stamopløsningen af DL-α-tocopherolacetat (3.10.1) fortyndes til 25,0 ml med ethanol, og opløsningens UV-spektrum i området 250-320 nm måles mod ethanol (3.1) i spektrofotometeret (4.6).

Absorptionsmaksimum skal ligge ved 284 nm.

>PIC FILE= "L_2000174DA.004201.EPS">

Ved denne fortynding skal der opnås en ekstinktionsværdi på 0,84-0,88.

5.6.2. DL-α-tocopherolstandard

5.6.2.1. Fremstilling af arbejdsstandardopløsning

Der afpipetteres 2 ml stamopløsning af DL-α-tocopherol (3.11.1) i en 50-ml-målekolbe, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3). Opløsningens nominelle koncentration er 40 μg DL-α-tocopherol pr. ml svarende til 44,0 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml. Arbejdsstandardopløsningen fremstilles frisk før brugen.

5.6.2.2. Fremstilling af kalibreringsopløsninger og kalibreringskurve

Der overføres henholdsvis 1,0, 2,0, 4,0 og 10,0 ml af arbejdsstandardopløsningen til 4 målekolber på hver 20 ml, hvorefter der fyldes op til mærket med methanol (3.3) og blandes. Opløsningernes nominelle koncentration er 2,0, 4,0, 8,0 og 20,0 μg DL-α-tocopherolacetat pr. ml, dvs. 2,20, 4,40, 8,79 og 22,0 μg DL-α-tocopherol pr. ml.

Der indsprøjtes 20 μl af hver kalibreringsopløsning flere gange, og gennemsnittet af tophøjden (toparealet) bestemmes. Kalibreringskurven optegnes ved hjælp af de gennemsnitlige tophøjder (arealer).

5.6.2.3. UV-indstilling af stamopløsningen af DL-α-tocopherol (3.11.1)

2,0 ml af stamopløsningen af DL-α-tocopherol (3.11.1) fortyndes til 25,0 ml med ethanol, og opløsningens UV-spektrum i området 250-320 nm måles mod ethanol (3.1) i spektrofotometeret (4.6). Absorptionsmaksimum skal ligge ved 292 nm.

>PIC FILE= "L_2000174DA.004202.EPS">

Ved denne fortynding skal der opnås en ekstinktionsværdi på 0,6.

6. Beregning af resultater

Ud fra gennemsnittet af højden (arealet) af vitamin E-toppene fra prøveopløsningen bestemmes prøveopløsningens koncentration i μg/ml på kalibreringskurven (5.6.1.2 eller 5.6.2.2).

Indholdet w af vitamin E i mg pr. kg prøve er givet ved følgende formel:

>PIC FILE= "L_2000174DA.004203.EPS">

hvor:

β= vitamin E-koncentrationen i prøveopløsningen (5.4) i μg/ml

V1= volumen af prøveopløsning (5.4) i ml

V2= volumen af den i 5.4 udtagne prøve i ml

m= massen af prøveportionen i g

7. Bemærkninger

7.1. For prøver med lavt indhold af vitamin E kan man med fordel samle petroleumsetherekstrakterne fra to forsæbningsportioner (afvejet mængde: 25 g) i én prøve til HPLC-analyse.

7.2. Den prøve, der tages ud til analyse, bør ikke indeholde mere end 2 g fedtstof.

7.3. Hvis faserne ikke skiller, kan der tilsættes ca. 10 ml ethanol (3.1) til at bryde emulsionen.

7.4. Efter spektrofotometrisk måling af opløsningen af DL-α-tocopherolacetat eller DL-α-tocopherol ifølge henholdsvis 5.6.1.3 og 5.6.2.3, tilsættes der ca. 10 mg BHT (3.12) til opløsningen (3.10.1 eller 3.10.2), hvorefter den opbevares i køleskab (højst 4 uger).

7.5. Der kan anvendes hydroquinon i stedet for BHT.

7.6. Ved brug af en normal-fase kolonne er det muligt at adskille α-, β-, γ- og β-tocopherol.

7.7. Der kan anvendes ca. 150 mg ascorbinsyre i stedet for natriumascorbatopløsning.

7.8. Der kan anvendes ca. 50 mg EDTA i stedet for natriumsulfidopløsning.

8. Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser, udført på den samme prøve, må højst være 15 % af det største resultat.

9. Resultater af en ringanalyser(2)

>TABELPOSITION>

Figur 1: Ekstraktionsapparat (4.8)

>PIC FILE= "L_2000174DA.004401.EPS">

DEL C

BESTEMMELSE AF TRYPTOPHAN

1. Formål og anvendelsesområde

Denne metode benyttes til bestemmelse af samlet indhold af tryptophan (total tryptophan) og indholdet af fri tryptophan i foderstoffer. Der skelnes ikke mellem D- og L-formen.

2. Princip

Til bestemmelse af total tryptophan hydrolyseres prøven i basisk miljø i en mættet bariumhydroxidopløsning og holdes opvarmet til 110 °C i 20 timer. Efter hydrolysen tilsættes der intern standard.

Til bestemmelse af fri tryptophan ekstraheres prøven i svagt sur væske, som indeholder intern standard.

Tryptophanet og den interne standard i hydrolysatet eller ekstraktet bestemmes ved HPLC med fluorescensdetektor.

3. Reagenser

3.1. Der benyttes dobbeltdestilleret vand eller vand af tilsvarende kvalitet (ledningsevne mindre end 10 μS)

3.2. Standardstof: tryptophan (renhedsgrad/indhold >= 99 %), tørret i vakuum over phosphorpentaoxid

3.3. Intern standard: α-methyltryptophan (renhedsgrad/indhold >= 99 %), tørret i vakuum over phosphorpentaoxid

3.4. Bariumhydroxidoctahydrat (man skal passe på ikke at udsætte Ba(OH)2 · 8 H2O for for meget luft, da der ellers dannes BaCO3, som kan interferere med bestemmelsen)

3.5. Natriumhydroxid

3.6. Orthophosphorsyre, w = 85 %

3.7. Saltsyre, ρ20 = 1,19 g/ml

3.8. Methanol, HPLC-kvalitet

3.9. Petroleumsether, kogepunktsinterval 40 °C-60 °C

3.10. Natriumhydroxidopløsning, c = 1 mol/l

40,0 g NaOH (3.5) opløses i vand og fortyndes til 1 liter med vand (3.1)

3.11. Saltsyre, c = 6 mol/l

492 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 l med vand

3.12. Saltsyre, c = 1 mol/l

82 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 l med vand

3.13. Saltsyre, c = 0,1 mol/l

8,2 ml saltsyre (3.7) fortyndes til 1 l med vand

3.14. Orthophosphorsyre, c = 0,5 mol/l

34 ml orthophosphorsyre (3.6) fortyndes til 1 l med vand (3.1)

3.15. Koncentreret opløsning af tryptophan (3.2), c = 2,5 μmol/l

I en 500-ml-målekolbe opløses 0,2553 g tryptophan (3.2) i saltsyre (3.13), og der fyldes op til mærket med saltsyre (3.13). Opløsningen kan opbevares ved - 18 °C i op til 4 uger.

3.16. Koncentreret opløsning af intern standard, c = 2,5 μmol/l

I en 500-ml-målekolbe opløses 0,2728 g α-methyl-tryptophan (3.3) i saltsyre (3.13), og der fyldes op til mærket med saltsyre (3.13). Opløsningen kan opbevares ved - 18 °C i op til 4 uger.

3.17. Kalibreringsopløsning af tryptophan og intern standard

2,00 ml koncentreret opløsning af tryptophan (3.15) og 2,00 ml koncentreret opløsning af intern standard (α-methyl-tryptophan) (3.16) fortyndes med vand (3.1) og methanol (3.8) til omtrent samme volumen og omtrent samme methanolkoncentration (10-30 %) som det færdige hydrolysat.

Opløsningen fremstilles frisk før brugen.

Der sørges for beskyttelse mod direkte sollys under fremstillingen.

3.18. Eddikesyre

3.19. 1,1,1-trichlor-2-methyl-2-propanol

3.20. Ethanolamin > 98 %

3.21. Opløsning af 1 g 1,1,1-trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) i 100 ml methanol (3.8)

3.22. Mobil fase til HPLC: 3,00 g eddikesyre (3.18), 900 ml vand (3.1) og 50,0 ml af opløsningen (3.21) af 1,1,1-trichlor-2-methyl-2-propanol (3.19) i methanol (3.8) (1 g pr. 100 ml) blandes, og blandingens pH indstilles til 5,00 med ethanolamin (3.20). Der fortyndes til 1000 ml med vand (3.1).

4. Apparatur

4.1. HPLC-udstyr med spektrofluorimetridetektor

4.2. HPLC-kolonne, 125 mm x 4 mm, C18, 3 μm pakkemateriale, eller tilsvarende

4.3. pH-meter

4.4. Polypropylenflaske, 125 ml, med vid hals og skrueprop

4.5. Membranfilter, 0,45 μm

4.6. Autoklav, 110 (+- 2) °C, 1,4 (+- 0,1) bar

4.7. Mekanisk rysteapparat eller magnetomrører

4.8. Vortex-blander

5. Fremgangsmåde

5.1. Prøveforberedelse

Prøven formales så fint, at den kan passere gennem en sigte med 0,5 mm maskevidde. Prøver med højt vandindhold lufttørres ved højst 50 °C eller frysetørres inden formaling. Prøver med højst fedtindhold ekstraheres med petroleumsether (3.9) inden formaling.

5.2. Bestemmelse af fri tryptophan (ekstrakt)

Der afvejes med en nøjagtighed på 1 mg en passende mængde (1-5 g) af den forberedte prøve (5.1) i en konisk kolbe. Der tilsættes 100,0 ml saltsyre, c = 0,1 mol/l, (3.13) og 5,00 ml koncentreret opløsning af intern standard (3.16). Der omrystes eller omrøres i 60 minutter på enten mekanisk rysteapparat eller magnetomrører (4.7). Efter at bundfaldet har sat sig, afpipetteres der 10,0 ml af væsken i et bægerglas. Der tilsættes 5 ml orthophosphorsyre, c = 0,5 mol/l (3.14), og pH indstilles til 3 med natriumhydroxid c = 1,0 mol/l (3.10). Der tilsættes så meget methanol (3.8), at slutkoncentrationen af methanol bliver 10-30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatograferingen (ca. samme volumen som kalibreringsopløsningen, 3.17).

Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45-μm-membranfilter (4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Kromatograferingen fortsættes som i punkt 5.4.

Standardopløsninger og ekstrakter beskyttes mod direkte sollys. Hvis ekstrakterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 °C i højst 3 døgn.

5.3. Bestemmelse af total tryptophan (hydrolysat)

Med en nøjagtighed på 0,2 mg afvejes der 0,1-1 g af den forberedte prøve (5.1) i polypropylenflasken (4.4). Prøveportionen skal have et nitrogenindhold på ca. 10 mg. Der tilsættes 8,4 g bariumhydroxidoctahydrat (3.4) og 10 ml vand. Der blandes på Vortex-blander (4.8) eller magnetomrører (4.7). Den teflonbelagte magnetpind efterlades i blandingen. Flaskens vægge skylles med 4 ml vand. Skruelåget skrues løst på flasken, der sættes ind i autoklaven (4.6) med kogende vand i 30-60 minutter. Autoklaven lukkes, og der autoklaveres ved 110 (+- 2) °C i 20 timer.

Temperaturen i autoklaven sænkes til lige under 100 °C, inden den åbnes. For at undgå udkrystallisering af Ba(OH)2 · 8H2O tilsættes der til den varme blanding 30 ml stuevarmt vand. Der omrystes eller omrøres forsigtigt og tilsættes 2,00 ml koncentreret intern standardopløsning (α-methyltryptophan, 3.16). Flasken afkøles på vand/isbad i 15 minutter.

Der tilsættes derefter 5 ml orthophosphorsyre, c = 0,5 mol/l (3.14). Medens flasken stadig står i kølebadet, neutraliseres der med saltsyre, c = 6 mol/l (3.11) under omrøring, og pH indstilles til 3,0 med saltsyre, c = 1 mol/l (3.12). Der tilsættes så meget methanol, at slutkoncentrationen af methanol bliver 10-30 %. Opløsningen overføres til en målekolbe af passende størrelse og fortyndes med vand til et volumen, der passer til kromatograferingen (f.eks. 100 ml). Der må ikke ske udfældning under methanoltilsætningen.

Nogle få ml af opløsningen filtreres gennem et 0,45-μm-membranfilter (4.5), inden den indsprøjtes på HPLC-kolonnen. Kromatograferingen fortsættes som i punkt 5.4.

Standardopløsninger og hydrolysater beskyttes mod direkte sollys. Hvis hydrolysaterne ikke kan analyseres samme dag, kan de opbevares ved 5 °C i højst 3 døgn.

5.4. Bestemmelse ved HPLC

Nedenstående betingelser for isokratisk eluering er vejledende; der kan benyttes andre betingelser, forudsat at de fører til tilsvarende resultater (se også bemærkning 9.1 og 9.2).

>TABELPOSITION>

6. Beregning af resultater

>PIC FILE= "L_2000174DA.004701.EPS">

hvor:

A= topareal for intern standard, kalibreringsopløsning (3.17)

B= topareal for tryptophan, ekstrakt (5.2) eller hydrolysat (5.3)

C= volumen i ml (2 ml) af den mængde koncentreret tryptophanopløsning (3.15), der er tilsat til kalibreringsopløsningen (3.17)

D= koncentration i μmol/ml (= 2,50) af den koncentrerede tryptophanopløsning (3.15), der er tilsat til kalibreringsopløsningen (3.17)

E= volumen i ml af den mængde koncentreret opløsning af intern standard (3.16), der er tilsat til ekstraktet (5.2) (= 5,00 ml) eller til hydrolysatet (5.3) (= 2,00 ml)

F= topareal for intern standard, ekstrakt (5.2) eller hydrolyset (5.3)

G= topareal for tryptophan, kalibreringsopløsning (3.17)

H= volumen i ml (= 2,00 ml) af den mængde koncentreret opløsning af intern standard (3.16), der er tilsat til kalibreringsopløsningen (3.17)

W= prøvens vægt i g (korrigeret til oprindelig vægt, hvis den er toriet og/eller affedtel)

MW= tryptophans molekylvægt (= 204,23)

7. Repeterbarhed

Forskellen mellem resultaterne af to parallelle bestemmelser, udført på den samme prøve, må højst være 10 % af det største resultat.

8. Resultater af ringanalyse

Der er gennemført en EF-ringanalyse (4. ringanalyse), hvor 3 prøver er analyseret i op til 12 laboratorier med henblik på certificering af hydrolysemetoden. Der er foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:

>TABELPOSITION>

Der er også gennemført en EF-ringanalyse (3. ringanalyse), hvor 2 prøver er analyseret i op til 13 laboratorier med henblik på certificering af metoden til ekstraktion af frit tryptophan. Der er foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve. Resultaterne er vist i nedenstående tabel:

>TABELPOSITION>

Der er gennemført endnu en EF-ringanalyse, hvor 4 prøver er analyseret i op til 7 laboratorier med henblik på certificering af tryptophan med hensyn til hydrolyse. Der er foretaget 5-dobbelt bestemmelse på hver prøve.

>TABELPOSITION>

9. Bemærkninger

9.1. Nedenstående særlige kromatograferingsbetingelser kan give bedre adskillelse af tryptophan og α-methyltryptophan.

>TABELPOSITION>

9.2. Kromatograferingen varierer alt efter, hvilken type HPLC og kolonnemateriale der benyttes. Der skal vælges et system, der giver adskillelse til basislinjen mellem tryptophan og den interne standard. Det er desuden vigtigt, at nedbrydningsprodukter adskilles helt fra tryptophan og den interne standard. Der bør køres hydrolysater uden intern standard for at kontrollere, at der ikke ligger urenheder på basislinjen under den interne standard. Det er vigtigt at gennemløbstiden er lang nok til, at alle nedbrydningsprodukter elueres, ellers kan toppe med lang elueringstid interferere i efterfølgende kromatograferinger.

Kromatograferingssystemet skal i sit arbejdsområde give lineært respons. Det lineære respons kontrolleres med konstant (dvs. den normale) koncentration af intern standard og varierende koncentrationer af tryptophan. Det er vigtigt, at både toppen for tryptophan og toppen for intern standard ligger inden for HPLC/fluorescenssystemets lineære område. Hvis blot en af toppene er enten for lille eller for stor, gentages analysen med en anden prøvestørrelse og/eller et andet slutvolumen.

9.3. Bariumhydroxid

Bariumhydroxid bliver med tiden vanskeligere at opløse. Det medfører, at opløsningen til HPLC-bestemmelse bliver uklar, hvilket kan betyde, at resultaterne for tryptophan bliver for lave.

(1) Udført af arbejdsgruppen for foderstoffer under Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).

(2) Udført af arbejdsgruppen for foderstoffer under Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten (VDLUFA).