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Sublote: parte designada de um grande lote para aplicação do método de amostragem a essa parte designada. Cada sublote deve ser fisicamente separado e identificável.

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Amostra elementar: quantidade de material colhido num só ponto do lote ou do sublote.

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Amostra global: a totalidade das amostras elementares colhidas no lote ou do sublote.

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Amostra de laboratório: uma parte/quantidade representativa da amostra global destinada ao laboratório.

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Caso o lote a amostrar contenha peixes pequenos (cada um com peso inferior a cerca de 1 kg), o peixe inteiro é colhido como amostra elementar para efeitos de constituição da amostra global. Se a amostra global daí resultante pesar mais de 3 kg, as amostras elementares podem consistir da parte do meio dos peixes que formam a amostra global, pesando cada parte pelo menos 100 gramas. A parte inteira à qual o teor máximo é aplicável é usada para a homogeneização da amostra.

A parte do meio do peixe é aquela em que se situe o centro de gravidade, que está localizado, na maioria dos casos, na barbatana dorsal (se o peixe tiver uma barbatana dorsal) ou a meio entre a abertura branquial e o ânus.

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Caso o lote a amostrar contenha peixes maiores (cada um com peso superior a cerca de 1 kg), a amostra elementar consistirá na parte do meio do peixe. Cada amostra elementar deve pesar, no mínimo, 100 gramas.

Para peixes de tamanho intermédio (com cerca de 1-6 kg), a amostra elementar é colhida como uma porção da parte do meio do peixe, entre a espinha dorsal e a barriga.

Para peixes muito grandes (por exemplo, com peso superior a cerca de 6 kg), a amostra elementar é colhida do lado direito (perspectiva frontal) da parte do meio comestível lateral-dorsal do peixe. Caso a extracção de uma porção da parte do meio do peixe possa resultar num prejuízo económico significativo, pode considerar-se suficiente a extracção de três amostras elementares de, pelo menos, 350 gramas cada, independentemente da dimensão do lote, ou, em alternativa, podem ser colhidas porções iguais da parte comestível perto da cauda e da parte comestível perto da cabeça de um único peixe para formar a amostra elementar representativa do teor de dioxinas no peixe inteiro.

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São aplicáveis as disposições do ponto 4.3. no que respeita à constituição da amostra.

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No caso de uma classe/categoria de tamanho ou peso serem predominantes (cerca de 80 % ou mais do lote), a amostra é colhida dos peixes com o tamanho ou peso predominantes. Esta amostra deve ser considerada representativa do lote inteiro.

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Se não predominar nenhuma classe/categoria específica de tamanho ou peso, então é necessário garantir que os peixes seleccionados para a amostra são representativos da remessa. No documento relativo a orientações para a amostragem de lotes de peixes contendo peixes inteiros de tamanho e/ou peso diferentes (2) («Guidance document for the sampling of lots of fish containing whole fishes of different size and/or weight») são apresentadas directrizes específicas para estes casos.

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calculando a incerteza expandida, utilizando um factor de expansão de 2, que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %. Um lote ou sublote não é conforme se o valor medido menos U for superior ao teor permitido definido. No caso de uma determinação separada das dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina, a soma da incerteza expandida estimada dos resultados analíticos separados das dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina tem de ser utilizada para a soma de dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina,

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estabelecendo o limite de decisão (CCα), em conformidade com o disposto na Decisão 2002/657/CE da Comissão, de 12 de Agosto de 2002, que dá execução ao disposto na Directiva 96/23/CE do Conselho relativamente ao desempenho dos métodos analíticos e à interpretação dos resultados (5) (ponto 3.1.2.5 do anexo — em caso de substâncias com um limite permitido definido). Um lote ou sublote não é conforme se o valor medido for igual ou superior ao CCα.

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Devem ser tomadas medidas para evitar a contaminação cruzada em cada etapa do procedimento de amostragem e de análise.

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As amostras devem ser conservadas e transportadas em contentores de vidro, alumínio, polipropileno ou polietileno. Devem ser removidos do recipiente da amostra os vestígios de poeiras de papel. O material de vidro deve ser enxaguado com solventes certificados como isentos de dioxinas ou previamente submetidos a um controlo destinado a detectar a presença de dioxinas.

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O armazenamento e o transporte das amostras têm de ser realizados de modo a manter a integridade da amostra de alimentos.

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Desde que relevante, triturar finamente e misturar completamente cada amostra de laboratório, mediante um processo relativamente ao qual se tenha demonstrado que possibilita uma homogeneização completa (por exemplo, trituração que permita passar por um crivo de 1 mm); as amostras devem ser exsicadas antes da trituração, caso o teor em humidade seja demasiado elevado.

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Efectuar uma análise em branco através da realização de todo o procedimento analítico, omitindo apenas a amostra.

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O peso da amostra utilizado para extracção deve ser suficiente para respeitar os requisitos no tocante à sensibilidade.

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Os procedimentos de preparação de amostras específicos utilizados para os produtos em causa são validados de acordo com orientações aceites internacionalmente.

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No caso de peixes, a pele tem de ser removida, dado que o teor máximo é aplicável à parte comestível sem pele. Contudo, é necessário que todos os restos da parte comestível e do tecido adiposo do lado interno da pele sejam cuidadosamente raspados e completamente separados da pele e que estes restos da parte comestível e do tecido adiposo sejam adicionados à amostra a analisar.

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Os laboratórios devem demonstrar o desempenho de um método na gama do teor requerido (por exemplo, 0,5 vezes, 1 vez e 2 vezes o teor requerido), com um coeficiente de variação aceitável para análises repetidas. No que se refere aos critérios de aceitação, ver o ponto 5.

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O limite de quantificação de um método de confirmação deve situar-se na gama de cerca de um quinto do teor requerido.

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Os controlos regulares com ensaios em branco, com amostras enriquecidas ou análises de amostras de controlo (de preferência, se disponível, material de referência certificado) devem ser realizados como medidas internas de controlo da qualidade.

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A competência de um laboratório é comprovada pelo êxito da sua participação contínua em estudos interlaboratoriais para a determinação de dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina nas matrizes relevantes de alimentos para animais/alimentos para o ser humano.

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Em conformidade com o disposto no Regulamento (CE) n.o 882/2004, os laboratórios devem ser acreditados por um organismo reconhecido que opere em conformidade com o Guia ISO 58, a fim de assegurar que aplicam a garantia de qualidade analítica. Os laboratórios devem ser acreditados através da norma EN ISO/IEC/17025.

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Sensibilidade elevada e limites de detecção baixos. Para os PCDD e PCDF, as quantidades detectáveis devem situar-se na gama dos picogramas TEQ (10-12 g) devido à extrema toxicidade de alguns destes compostos. Sabe-se que os PCB ocorrem a níveis mais elevados do que os PCDD e PCDF. Para bastantes congéneres de PCB, a sensibilidade na gama dos nanogramas (10-9 g) já é suficiente. No entanto, para a medição dos congéneres de PCB sob a forma de dioxina mais tóxicos (designadamente, congéneres não-orto substituídos), deve ser conseguida a mesma sensibilidade que para os PCDD e PCDF.

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Selectividade elevada (especificidade). É necessário estabelecer uma distinção entre PCDD, PCDF e PCB sob a forma de dioxina e inúmeros compostos co-extraídos e eventualmente interferentes, que estão presentes em concentrações que podem atingir várias ordens de grandeza superiores às dos analitos em causa. Relativamente aos métodos de cromatografia gasosa/espectrometria de massa (CG-EM), é necessária uma diferenciação entre vários congéneres, tal como entre congéneres tóxicos (por exemplo os 17 PCDD e PCDF substituídos nas posições 2,3,7 e 8 e os PCB sob a forma de dioxina) e outros congéneres. Os bioensaios devem ser capazes de determinar valores TEQ de forma selectiva, como a soma de PCDD, PCDF e PCB sob a forma de dioxina.

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Exactidão elevada (rigor e precisão). A determinação deve fornecer uma estimativa válida da verdadeira concentração numa amostra. É necessária uma exactidão elevada (exactidão da medição: a proximidade de concordância entre o resultado de uma medição e o valor verídico da grandeza medida) por forma a evitar a rejeição do resultado da análise de uma amostra com base na reduzida fiabilidade da estimativa de TEQ. A exactidão é expressa como rigor (diferença entre o valor médio medido para um analito num material certificado e o respectivo valor certificado, expresso em percentagem deste valor) e precisão (RSDR é o desvio-padrão relativo, calculado a partir dos resultados obtidos em condições de reprodutibilidade).

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Logo no início do método analítico, por exemplo antes da extracção, deve proceder-se à adição de padrões internos de PCDD/F marcados com 13C e substituídos com cloro nas posições 2,3,7 e 8 e de padrões internos de PCB sob a forma de dioxina marcados com 13C, por forma a validar o procedimento analítico. Deve ser adicionado, pelo menos, um congénere para cada grupo homólogo de PCDD/F tetra a octo-clorados e, pelo menos, um congénere para cada grupo homólogo de PCB sob a forma de dioxina (alternativamente, deve ser utilizado para o controlo de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina, pelo menos, um congénere para cada função de registo de iões seleccionados pela espectrometria de massa). Verifica-se uma nítida preferência, no caso dos métodos de confirmação, pela utilização dos padrões internos dos 17 PCDD/F substituídos nas posições 2,3,7 e 8 e marcados com 13C e dos padrões internos dos 12 PCB sob a forma de dioxina marcados com 13C.

Também devem ser determinados factores de resposta relativos para os congéneres aos quais não se adiciona um composto análogo marcado com 13C, através da utilização de soluções de calibração adequadas.

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Em relação aos géneros alimentícios de origem vegetal e aos géneros alimentícios de origem animal que contenham menos de 10 % de gorduras, a adição de padrões internos é obrigatória antes da extracção. Em relação aos géneros alimentícios de origem animal que contenham mais de 10 % de gorduras, os padrões internos podem ser adicionados antes ou após a extracção de gorduras. Deve ser efectuada uma validação adequada da eficácia da extracção, dependendo da fase em que são introduzidos os padrões internos e de os resultados serem notificados com base no produto ou na gordura.

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Antes da análise por CG/EM, devem ser adicionados 1 ou 2 padrões de recuperação (substituto).

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É necessário um controlo de recuperação. Para os métodos de confirmação, as recuperações de cada padrão interno devem situar-se na gama de 60 a 120 %. São aceitáveis recuperações inferiores ou superiores para congéneres individuais, nomeadamente para algumas dibenzodioxinas e dibenzofuranos hepta- e octo-clorados, desde que a sua contribuição para o valor TEQ não exceda 10 % do valor total de TEQ (com base na soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina). Para os métodos de pré-selecção, as recuperações devem situar-se na gama de 30 a 140 %.

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Deve proceder-se à separação entre dioxinas e compostos clorados interferentes, tais como PCB não sob a forma de dioxina e éteres difenílicos clorados através de técnicas de cromatografia adequadas (de preferência, com uma coluna de florisil, alumina e/ou carbono).

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Deve ser suficiente a separação de isómeros por cromatografia gasosa (< 25 % de pico a pico entre 1,2,3,4,7,8-HxCDF e 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

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A determinação deve ser realizada de acordo com o método EPA 1613 revisão B: Dioxinas e furanos tetra- a octo-clorados por diluição de isótopos com CGER/EMER ou outro método com critérios de desempenho equivalentes.

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A diferença entre o nível superior e o nível inferior não deve exceder 20 % no caso de géneros alimentícios com uma contaminação por dioxinas de cerca de 1 pg TEQ-OMS/g de gordura (com base na soma de PCDD/PCDF e PCB sob a forma de dioxina). No tocante a géneros alimentícios com baixo teor em gordura, têm de ser aplicados os mesmos requisitos respeitantes a níveis de contaminação de cerca de 1 pg TEQ-OMS/g de produto. Para níveis inferiores de contaminação, por exemplo, 0,50 pg TEQ-OMS/g de produto, a diferença entre o limite superior e o limite inferior pode situar-se na gama de 25-40 %.

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Em cada série de testes tem de se incluir uma amostra em branco e uma de referência, que são extraídas e testadas ao mesmo tempo e em condições idênticas. A amostra de referência deve apresentar uma resposta claramente elevada em comparação com a amostra em branco.

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Devem incluir-se outras amostras de referência com 0,5 vezes e 2 vezes o teor requerido, para demonstrar o desempenho correcto do teste na gama requerida para o controlo do teor requerido.

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Quando se testam outras matrizes, tem de se demonstrar a adequação das amostras de referência, preferencialmente incluindo amostras cuja CGER/EMER revelou conterem um teor TEQ próximo do da amostra de referência ou então uma amostra em branco enriquecida para este teor.

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Uma vez que não se pode utilizar padrões internos nos bioensaios, devem ser realizados os testes de repetibilidade para se obter informações sobre o desvio-padrão numa série de testes. O coeficiente de variação deve ser inferior a 30 %.

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Para os bioensaios, devem ser definidos os compostos-alvo, as possíveis interferências e os níveis em branco máximos toleráveis.

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Na pré-selecção, podem usar-se os métodos de análise e de bioensaio CG/EM. Para os métodos CG/EM, devem ser utilizados os requisitos descritos no ponto 6. Para os bioensaios com células, estão fixados os requisitos específicos no ponto 7.3 e, para os bioensaios com kits, no ponto 7.4 do presente anexo.

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É necessária informação sobre o número de falsos positivos e falsos negativos de um conjunto grande de amostras abaixo e acima do teor máximo ou do nível de acção, em comparação com o teor de TEQ conforme determinado por um método de análise de confirmação. As taxas efectivas de falsos negativos devem ser inferiores a 1 %. A taxa de amostras com falsos positivos deve ser suficientemente baixa para se poder recorrer vantajosamente ao instrumento de pré-selecção.

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Os resultados positivos têm sempre de ser confirmados por um método de análise de confirmação (CGER/EMER). Além disso, devem confirmar-se por CGER/EMER as amostras de uma ampla gama de TEQ (aproximadamente, 2-10 % das amostras negativas). Deve ser disponibilizada informação sobre a correspondência entre os resultados do bioensaio e os de CGER/EMER.

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Quando se procede a um bioensaio, cada teste exige uma série de concentrações de referência de TCDD ou uma mistura de dioxina/furano/PCB sob a forma de dioxina (curva de dose-resposta completa com um R2 > 0,95). No entanto, para efeitos de pré-selecção, pode usar-se uma curva expandida de baixo nível para analisar as amostras de baixo nível.

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Para o resultado do bioensaio durante um período de tempo constante, deve usar-se uma concentração de referência de TCDD (cerca de três vezes o limite de quantificação) numa ficha de controlo de qualidade. Em alternativa, pode utilizar-se a resposta relativa de uma amostra de referência por comparação com a recta de calibração de TCDD, uma vez que a resposta das células pode depender de muitos factores.

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Devem registar-se e verificar-se os gráficos de controlo de qualidade (CQ) para cada tipo de material de referência, a fim de garantir que o resultado está conforme com as directrizes definidas.

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Em especial para os cálculos quantitativos, a indução da diluição da amostra utilizada deve encontrar-se dentro da porção linear da curva de resposta. As amostras que se encontrem acima da porção linear da curva de resposta devem ser diluídas e testadas de novo. Assim, recomenda-se a realização simultânea de testes com, pelo menos, três ou mais diluições.

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O desvio-padrão percentual não deve ser superior a 15 % numa determinação em triplicado para cada diluição da amostra e não superior a 30 % entre três experiências independentes.

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O limite de detecção pode ser fixado multiplicando por três o desvio-padrão da solução em branco de solvente ou da resposta de base. Outra abordagem consiste em aplicar uma resposta que seja superior à base (factor de indução cinco vezes superior ao da solução em branco de solvente) calculada a partir da curva de calibração do dia. O limite de quantificação pode ser fixado multiplicando por cinco ou seis vezes o desvio-padrão da solução em branco de solvente ou da resposta de base ou aplicar uma resposta que seja superior à base (factor de indução 10 vezes superior ao da solução em branco de solvente) calculada a partir da curva de calibração do dia.

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Deve garantir-se que os bioensaios com kits são suficientemente sensíveis e fidedignos para serem aplicados aos alimentos.

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Devem ser respeitadas as instruções do fabricante no que se refere à preparação da amostra e às análises.

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Os kits de ensaio não devem ser utilizados depois do prazo de validade.

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Não devem ser utilizados materiais ou componentes concebidos para serem usados com outros kits.

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Os kits de ensaio devem ser mantidos a uma temperatura de armazenamento dentro dos limites especificados e utilizados à temperatura de funcionamento especificada.

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O limite de detecção para os imunoensaios é determinado multiplicando por três o desvio-padrão, calculado com base em 10 repetições da análise em branco, dividindo o resultado pelo valor do declive da equação de regressão linear.

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Devem ser utilizados padrões de referência para testes de laboratório a fim de se garantir que a capacidade de resposta ao padrão se encontra numa gama aceitável.