---

ANEXĂ

DESCRIEREA METODELOR DE REFERINȚĂ ANALITICE
I.	Determinarea tăriei alcoolice în volume Apendicele I : Pregătirea distilatului Apendicele II : Măsurarea densității distilatului — Metoda A = picnometrie — Metoda B = densimetrie electronică — Metoda C = densimetrie utilizând balanța hidrostatică
II.	Determinarea extractului sec total prin gravimetrie
III.	Determinarea substanțelor volatile și a metanolului
III.1.	Observații generale
III.2.	Congeneri volatili: aldehide, alcooluri superioare, acetat de etil și metanol (cromatografie gazoasă)
III.3.	Aciditate volatilă ►M2  ————— ◄
IV.	Acid hidrocianic (p.m.)
V.	Anetol ►M1  ————— ◄
VI.	Acid glicirizic ►M1  ————— ◄
VII.	Calcone ►M1  ————— ◄
VIII.	Glucide totale ►M2  ————— ◄
IX.	Gălbenuș de ou ►M1  ————— ◄
▼M2
X.	Determinarea compușilor din lemn: furfural, 5-hidroximetilfurfural, 5-metilfurfural, vanilină, aldehidă siringică, aldehidă coniferilică, sinapaldehidă, acid galic, acid elagic, acid vanilic, acid siringic și scopoletină
▼M3
XI.	Determinarea conținutului de radiocarbon în etanol
▼B

I.   DETERMINAREA TĂRIEI ALCOOLICE ÎN VOLUME LA BĂUTURILE SPIRTOASE

Introducere

Metoda de referință include două apendice:

Apendicele I : Pregătirea distilatului

Apendicele II : Măsurarea densității distilatului

1.   Domeniu

Metoda este adecvată pentru determinarea tăriei alcoolice reale în volume la băuturile spirtoase.

2.   Referințe normative

ISO 3696:1987:Apă pentru uzul laboratoarelor de analiză – specificații și metode de testare

3.   Termeni și definiții

3.1.

Temperatura de referință: Temperatura de referință pentru determinarea tăriei alcoolice în volume, a densității și a densității specifice la băuturile spirtoase este de 20 °C. Nota 1: termenul „la t °C” este rezervat pentru toate determinările (a densității sau tăriei alcoolice în volume) exprimate la o temperatură diferită de temperatura de referință de 20 °C.

3.2.	Densitate: Densitatea reprezintă masa per unitate de volum in vacuo la băuturile spirtoase la 20 °C. Se exprimă în kg per metri cubi, iar simbolul său este ρ20 °C sau ρ20.

3.3.

Densitatea specifică: Densitatea specifică reprezintă raportul, exprimat ca număr zecimal, dintre densitatea unei băuturi spirtoase la 20 °C și densitatea apei la aceeași temperatură. Are simbolul d20 °C/20 °C sau d20/20, sau numai d, atunci când nu există posibilitatea de a se crea confuzie. Caracteristica măsurată trebuie specificată pe certificatul de testare, fiind utilizate numai simbolurile definite mai sus. Nota 2: Densitatea specifică poate fi obținută pe baza densității ρ20 la 20 °C. sau unde 998,203 reprezintă densitatea apei la 20 °C.

3.4.

Tăria alcoolică reală în volume: Tăria alcoolică reală în volume la băuturile spirtoase este egală cu numărul de litri de alcool etilic conținuți în 100 litri de amestec apă-alcool cu aceeași densitate ca și alcoolul sau băutura spirtoasă după distilare. Valorile de referință pentru tăria alcoolică în volume (% vol) la 20 °C în raport cu densitatea la 20 °C pentru diferite amestecuri apă-alcool care sunt utilizare sunt cele din tabelul internațional adoptat de Organizația Internațională de Metrologie Legală în Recomandarea nr. 22. Ecuația generală care stabilește legătura între tăria alcoolică în volume și densitatea unui amestec apă-alcool la o anumită temperatură este dată la pagina 40 din capitolul 3 „Tăria alcoolică în volume” din anexa la Regulamentul (CEE) nr. 2676/90 al Comisiei (JO L 272, 3.10.1990, p. 1) sau în manualul metodelor de analiză al OIV (1994) (p. 17). Nota 3: pentru lichioruri și „lichioruri-cremă” al Comisiei căror volum exact este foarte greu de măsurat, trebuie cântărită proba iar tăria alcoolică se calculează întâi pe baza masei. Formula de conversie: unde TAM = tărie alcoolică în masă, ρ20 (alcool) = 789,24 kg/m3

4.   Principiu

În urma distilării, tăria alcoolică în volume a distilatului se determină prin picnometrie, densimetrie electronică sau densimetrie, cu utilizarea unei balanțe hidrostatice.

APENDICELE I: PREGĂTIREA DISTILATULUI

1.   Domeniu

Metoda este adecvată pentru pregătirea distilatelor utilizate la determinarea tăriei alcoolice în volume la băuturile spirtoase.

2.   Principiu

Băuturile spirtoase sunt distilate pentru a separa alcoolul etilic de alte componente volatile de materia extractivă (substanțe care nu se distilează).

3.   Reactivi și materiale

4.   Aparatură și echipamente

Aparatura de laborator obișnuită și, în special, următoarele:

Notă: aparatul descris mai sus este adecvat în cazul unei probe de minim 200 ml. Cu toate acestea, se poate distila o probă mai mică (100 ml) cu ajutorul unui balon de distilare mai mic, cu condiția să fie dotat cu un cap barbotor sau un alt instrument pentru a preveni antrenarea.

5.   Depozitarea probelor de testare

Înainte de analiză, probele sunt depozitate la temperatura camerei.

6.   Mod de lucru

Observații preliminare:

6.1.	Verificarea aparatului de distilare. Aparatura utilizată trebui să poată permite următoarele: Distilarea a 200 ml soluție apă-alcool cu o concentrație cunoscută aproape de 50 % vol nu trebuie să cauzeze o pierdere de alcool mai mare de 0,1 % vol.

6.2.

Băuturile spirtoase cu o tărie alcoolică sub 50 % vol. Se măsoară 200 ml băutură spirtoasă într-un balon volumetric. Se notează temperatura acestui lichid sau se menține o temperatură standard (20 °C). Se toarnă proba în balonul cu fund rotund din aparatura de distilare și se limpezește balonul volumetric cu trei porțiuni, fiecare de aproximativ 20 ml apă distilată. Se adaugă fiecare porțiune de apă de limpezire la conținutul balonului de distilare. Notă: Această diluție de 60 ml este suficientă pentru băuturile spirtoase care conțin mai puțin de 250 g extract sec la litru. În rest, pentru a preveni piroliza, volumul de apă de limpezire trebuie să fie de cel puțin 70 ml când concentrație extrasului sec este de 300 g/l, 85 ml pentru 400 g/l extract sec și 100 ml pentru 500 g/l extract sec (anumite lichioruri sau creme de fructe). Se ajustează aceste volume proporțional cu diferitele volume ale probelor. Se adaugă câteva granule antiîmproșcare (3.1) (și emulsie antispumantă în cazul lichiorurilor -cremă). Se toarnă 20 ml apă distilată în balonul volumetric original de 200 ml care va fi utilizat pentru a păstra distilatul. Acest balon trebuie apoi plasat într-o baie de apă rece (4.1) (între 10 și 15 °C pentru băuturile spirtoase cu aromă de anason). Se distilează, evitându-se antrenarea și carbonizarea, agitând uneori conținutul balonului, până când nivelul distilatului este cu câțiva milimetri sub marcajul de calibrare a balonului volumetric. Atunci când temperatura distilatului a fost coborâtă la ± 0,5 °C față de temperatura inițială a lichidului, se completează cu apă distilată până la marcaj și se amestecă bine. Distilatul este folosit pentru a determina tăria alcoolică în volume (apendicele II).

6.3.

Băuturi spirtoase cu tărie alcoolică peste 50 % vol. Se măsoară 100 ml băutură spirtoasă într-un balon volumetric de 100 ml și se toarnă în balonul cu fund rotund din aparatura de distilare. Se limpezește balonul volumetric de câteva ori cu apă distilată și se adaugă apa respectivă la conținutul balonului de distilare cu fund rotund. Se utilizează suficientă apă pentru a aduce conținutul balonului până la aproximativ 230 ml. Se toarnă 20 ml apă distilată într-un balon volumetric de 200 ml care va fi utilizat pentru a păstra distilatul. Acest balon trebuie plasat într-o baie de apă rece (4.1) (între 10 și 15 °C pentru băuturile spirtoase cu aromă de anason). Se distilează, agitându-se uneori conținutul balonului, până când nivelul distilatului este cu câțiva milimetri sub marcajul de calibrare a balonului volumetric de 200 ml. Atunci când temperatura distilatului a fost coborâtă la ± 0,5 °C față de temperatura inițială a lichidului, se completează cu apă distilată până la marcaj și se amestecă bine. Distilatul este folosit pentru a determina tăria alcoolică în volume (apendicele II). Notă: tăria alcoolică în volume a băuturii spirtoase este dublul tăriei alcoolice a distilatului.

APENDICELE II: MĂSURAREA DENSITĂȚII DISTILATULUI

METODA A:   DETERMINAREA TĂRIEI ALCOOLICE REALE ÎN VOLUME LA BĂUTURILOR SPIRTOASE – MĂSURAREA PRIN PICNOMETRIE

A.1.   Principiu

Tăria alcoolică în volume este obținută din densitatea distilatului măsurată prin picnometrie.

A.2.   Reactivi și materiale

Pe durata analizei, dacă nu se specifică altfel, se utilizează numai reactivi cu grad analitic recunoscut și apă de cel puțin gradul 3 conform definiției ISO 3696:1987.

A.2.1.

Soluție de clorură de sodiu (2 % m/v) Pentru a pregăti 1 litru, se cântăresc 20 g clorură de sodiu și se dizolvă până la un litru folosind apă.

A.3.   Aparatură și echipamente

Aparatura de laborator obișnuită și, în special, următoarele:

Nota 1: metoda pentru determinarea densității băuturilor alcoolice in vacuo necesită utilizarea unei balanțe cu două platane, a unui picnometru și a unei sticle utilizate ca tară cu același volum exterior pentru a elimina efectul de flotabilitate al aerului în orice moment. Această tehnică simplă poate fi aplicată utilizând o balanță cu un singur platan, cu condiția ca sticla utilizată ca tară să fie cântărită din nou pentru a monitoriza modificările efectul de flotabilitate al aerului în timp.

A.4.   Mod de lucru

Observații preliminare:

A.4.1.   Calibrarea picnometrului

Picnometrul se calibrează prin determinarea următorilor parametri:

A.4.1.1.

Calibrarea cu ajutorul unei balanțe cu un singur platan: Se determină: —  masa picnometrului curat și uscat (P); —  masa picnometrului umplut cu apă la t °C (P1); —  masa sticlei utilizate ca tară (T0). A.4.1.1.1. Se cântărește picnometrul curat și uscat (P). A.4.1.1.2. Se umple picnometrul atent cu apă distilată la temperatura ambiantă și se atașează termometrul. Se șterge cu grijă picnometrul până este uscat și se instalează în mantaua izolată termic. Se agită răsturnând containerul până când termometrul indică o temperatură constantă. Se așează picnometrul astfel încât să se îmbine cu marginea superioară a tubului lateral. Se citește temperatura t °C și, dacă este necesar, se corectează posibilele inadvertențe ale gradației temperaturii. Se cântărește picnometrul umplut cu apă (P1). A.4.1.1.3. Se cântărește sticla utilizată ca tară (T0). A.4.1.1.4. Calcule —  tara picnometrului gol = P – m unde m reprezintă masa aerului din picnometru. m = 0,0012 × (P1 – P) Nota 2: 0,0012 reprezintă densitatea aerului uscat la 20 °C la o presiune de 760 mm Hg —  volumul picnometrului la 20 °C: unde Ft reprezintă factorul pentru temperatura la t °C din tabelul 1 capitolul 1 „Densitatea și densitatea specifică” din anexa la Regulamentul (CEE) nr. 2676/90 (p. 10). V20 °C trebuie să fie cât mai apropiat de 0,001 ml. —  Masa apei în picnometru la 20 °C: unde 0,998203 reprezintă densitatea apei la 20 °C. Nota 3: Dacă este necesar, poate fi utilizată valoarea 0,99715 a densității aerului iar tăria alcoolică se calculează pe baza densității echivalente din tabelele Accize și Vame HM pentru aer.

A.4.1.2.

Metodă de calibrare utilizând o balanță cu două platane: A.4.1.2.1.  Se plasează sticla utilizată ca tară pe platanul din stânga, iar picnometru curat și uscat cu opritorul colector pe platanul din dreapta. Se echilibrează cele două platane plasând greutăți pe cel care conține picnometrul: p grame. A.4.1.2.2.  Se umple picnometrul atent cu apă distilată la temperatura ambiantă și se atașează termometrul; se șterge cu grijă picnometrul până este uscat și se instalează în mantaua izolată termic; se agită răsturnând containerul până când termometrul indică o temperatură constantă. Se reglează nivelul cu exactitate până la marginea superioară a tubului lateral. Se curăță tubul lateral, se atașează opritorul colector; se citește temperatura t °C și, dacă este necesar, se corectează posibilele inadvertențe ale gradației temperaturii. Se cântărește picnometrul umplut cu apă, compensând pentru echilibrare cu p′ greutatea în grame. A.4.1.2.3.  Calcule —  tara picnometrului gol = p + m unde m reprezintă masa aerului din picnometru. m = 0,0012 × (p – p′) —  volumul picnometrului la 20 °C: unde Ft reprezintă factorul pentru temperatura la t °C din tabelul 1 capitolul 1 „Densitatea și densitatea specifică” din anexa la Regulamentul (CEE) nr. 2676/90 (p. 10). V20 °C trebuie să fie cât mai apropiat de 0,001 ml. —  Masa apei în picnometru la 20 °C: unde 0,998203 reprezintă densitatea apei la 20 °C.

A.4.2.   Determinarea tăriei alcoolice a probei de testare

A.5.   Caracteristici de performanță ale metodei (precizia)

A.5.1.   Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost obținute dintr-un studiu internațional de performanță a metodei efectuat cu proceduri acceptate la nivel internațional [1] [2].

METODA B:   DETERMINAREA TĂRIEI ALCOOLICE REALE ÎN VOLUME PENTRU BĂUTURILE SPIRTOASE – MĂSURARE PRIN DENSITOMETRIE ELECTRONICĂ (BAZATĂ PE OSCILAȚIA FRECVENȚEI REZONANTE A UNEI PROBE ÎNTR-O CELULĂ DE OSCILARE)

B.1.   Principiu

Densitatea lichidului este determinată prin măsurători electronice ale oscilațiilor unui tub vibrator sub formă de U. Pentru a efectua aceste măsurători, proba este adăugată unui sistem de oscilații a cărui frecvență de oscilare este astfel modificată de masa adăugată.

B.2.   Reactivi și materiale

Pe timpul analizei, dacă nu se specifică altfel, se utilizează numai reactivi cu grad analitic recunoscut și cu apă de cel puțin gradul 3, conform definiției din ISO 3696:1987.

B.3.   Aparatură și echipamente

Aparate de laborator obișnuite și, în special, următoarele aparate:

B.4.   Mod de lucru

B.5.   Caracteristici de performanță ale metodei (precizia)

B.5.1.   Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost obținute dintr-un studiu internațional de performanță a metodei efectuat cu proceduri acceptate la nivel internațional [1] [2].

METODA C:   DETERMINAREA TĂRIEI ALCOOLICE REALE ÎN VOLUME A BĂUTURILOR SPIRTOASE – MĂSURAREA PRIN DENSITOMETRIE CU AJUTORUL BALANȚEI HIDROSTATICE

C.1.   Principiu

Tăria alcoolică a băuturilor spirtoase poate fi măsurată prin densitometrie au ajutorul unei balanțe hidrostatice bazată pe principiul lui Arhimede conform căruia un corp scufundat într-un lichid este împins la suprafață de o cantitate de lichid egală cu greutatea lichidului dislocat.

C.2.   Reactivi și materiale

Pe timpul analizei, dacă nu se specifică altfel, se folosesc numai reactivi cu grad analitic recunoscut și cu apă de cel puțin gradul 3, conform definiției din ISO 3696:1987.

C.2.1.   Soluție de curățare a flotorului (hidroxid de sodiu, 30 % m/v)

Pentru a prepara 100 ml, se cântăresc 30 g de hidroxid de sodiu și se completează cu etanol 96 % vol.

C.3.   Aparatură și echipamente

Aparate de laborator obișnuite și, în special, următoarele:

Nota 1: Se poate folosi și o balanță cu un singur platan; principiul este descris în capitolul I „Densitatea și gravitatea specifică” din anexa la Regulamentul (CEE) nr. 2676/90 (p. 7).

C.4.   Mod de lucru

Flotorul și cilindrul gradat trebuie să se curețe, după fiecare măsurare, cu apă distilată, să se usuce cu hârtie moale de laborator care nu lasă fire și să se clătească cu soluție a cărei densitate urmează să fie determinată. Măsurările se efectuează în momentul în care aparatul este stabil pentru a limita pierderile de alcool cauzate de evaporare.

C.5.   Caracteristici de performanță ale metodei (precizia)

C.5.1.   Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost obținute dintr-un studiu internațional de performanță a metodei efectuat cu proceduri acceptate la nivel internațional [1] [2].

Figura 1. Aparat de distilare pentru măsurarea tăriei alcoolice reale în volume a băuturilor spirtoase

1.Balon de sticlă de 1 litru cu fundul rotund cu îmbinare sferică standardizată de sticlă rodată.

2.Coloană de rectificare tip „Vigreux” de 20 cm.

3.Condensator West cu margine dreaptă de 10 cm.

4.Spirală de răcire de 40 cm.

II.   DETERMINAREA EXTRACTULUI SEC TOTAL AL BĂUTURILOR SPIRTOASE PRIN GRAVIMETRIE

1.   Domeniu

Regulamentul (CEE) nr. 1576/89 prevede această metodă numai pentru aquavit pentru care extractul sec este limitat la 15 g/l.

2.   Referințe normative

ISO 3696:1987: Apă pentru uzul laboratorului – specificații și metode de testare.

3.   Definiție

Extractul sec total sau materia uscată totală include toată materia nevolatilă în condiții fizice specificate.

4.   Principiu

Cântărirea reziduului rămas după evaporarea alcoolului pe o baie de apă la fierbere și uscarea într-un cuptor de uscare.

5.   Aparatură și echipamente

6.   Prelevare și probe

Probele se păstrează la temperatura camerei înainte de analiză.

7.   Mod de lucru

8.   Calcule

Masa reziduului înmulțită cu 40 este egală cu conținutul uscat din alcool și trebuie să fie exprimată în g/l până la o zecimală.

9.   Caracteristici de performanță ale metodei (precizia)

9.1.   Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost obținute dintr-un studiu internațional de performanță a metodei efectuat cu proceduri acceptate la nivel internațional [1] [2].

III.   DETERMINAREA SUBSTANȚELOR VOLATILE ȘI A METANOLULUI DIN BĂUTURILE SPIRTOASE

III.1   OBSERVAȚII GENERALE

1.   Definiții

Regulamentul (CEE) nr. 1576/89 stabilește nivelurile minime de compuși volatili, alții decât etanolul și metanolul, pentru mai multe băuturi spirtoase (rom, alcooluri de origine viticolă, alcooluri din fructe etc.). Numai pentru aceste băuturi spirtoase, aceste niveluri sunt considerate, în mod convențional, echivalente cu suma concentrațiilor de:

Următoarele metode convenționale se folosesc pentru măsurarea compușilor volatili:

2.   Analiza prin cromatografia gazoasă a compușilor volatili

Evaluările prin cromatografia gazoasă a compușilor volatili, alții decât cei menționați anterior, se pot dovedi a fi extrem de interesante ca mijloace de determinare a originii materiei prime folosite în distilare și a condițiilor de distilare efective.

Unele alcooluri conțin alte componente volatile, cum ar fi compuși aromatici, care sunt caracteristici materiilor prime folosite la obținerea alcoolului, aromei băuturii spirtoase și caracteristicilor speciale ale preparării alcoolului. Acești compuși sunt importanți pentru evaluarea cerințelor stabilite în Regulamentul (CEE) nr. 1576/89.

III.2.   DETERMINAREA PRIN CROMATOGRAFIA GAZOASĂ A CONGENERILOR VOLATILI: ALDEHIDE, ALCOOLURI SUPERIOARE, ACETAT DE ETIL ȘI METANOL

1.   Domeniu

Această metodă este potrivită pentru a se determinarea 1,1 dietoxietan (acetal), 2-metilbutan-1-ol (alcool amil activ), 3-metilbutan-1-ol (alcool izoamil), metanolul (alcool metilic), etil etanoat (etil acetat), butan-1-ol (n-butanol), butan-2-ol (sec-butanol), 2-metilpropan-1-ol (alcool izobutil), propan-1-ol (n-propanol) și etanal (acetaldehidă) din băuturile spirtoase folosind cromatografia gazoasă. Metoda folosește un standard intern, de exemplu pentan-3-ol. Concentrațiile analiților sunt exprimate în grame pe 100 litri de alcool absolut; tăria alcoolică a produsului trebuie să se determine înainte de analiză. Băuturile spirtoase care pot fi analizate folosind această metodă includ whisky, brandy, rom, rachiu de vin, rachiu de fructe și rachiu de tescovină.

2.   Trimiteri normative

ISO 3696:1987: Apă pentru uzul laboratorului – specificații și metode de testare.

3.   Definiție

Congenerii sunt substanțe volatile formate în același timp cu etanolul pe parcursul fermentației, distilării și maturării băuturilor spirtoase.

4.   Principiu

Congenerii din băuturile spirtoase sunt determinați prin injectarea directă a băuturii spirtoase sau a băuturii spirtoase diluate corespunzător într-un sistem de cromatografie cu gaz (GC). Un standard intern corespunzător se adaugă băuturii spirtoase înainte de injectare. Congenerii sunt separați prin programarea temperaturii pe o coloană adecvată și sunt detectați folosind un detector de ionizare cu flacără (FID). Concentrația fiecărui congener este determinată luându-se în considerare standardul intern al factorilor de răspuns care sunt obținuți în timpul calibrării în același condiții cromatografice ca și cele pentru analiza băuturilor spirtoase.

5.   Reactivi și materiale

Dacă nu există alte specificații, folosiți numai reactivi cu o puritate de peste 97 %, achiziționați de la un furnizor acreditat ISO cu certificat de puritate, care nu prezintă congeneri la diluția test (acest lucru poate fi confirmat prin injectarea de standarde de congener individuale la diluția test folosind condițiile de GC de la punctul 6.4) și numai apă de cel puțin 3 grade conform definiției din ISO 3696. Acetalul și acetaldehida se păstrează la întuneric, la < 5 °C, toți ceilalți reactivi pot fi păstrați la temperatura camerei.

▼M3

▼B

6.   Aparatură și echipamente

7.   Prelevare și probe

8.   Mod de lucru (folosit pentru metoda validată)

9.   Calcule

Se poate folosi un sistem automat de tratare a datelor, cu condiția ca datele să poată fi verificate cu ajutorul principiilor descrise în metoda menționată în continuare.

Se măsoară fiecare platou sau vârf de maxim pentru congener și vârfurile standardului intern.

10.   Asigurarea calității și controlul calității (pentru metoda validată)

Cu ajutorul ecuației (2) menționate anterior se calculează concentrația fiecărui congener din soluțiile standard de control al calității preparate conform procedurii de la 8.1.1-8.1.4. Cu ajutorul ecuației (3) se calculează procentul de recuperare a valorii țintă. Dacă rezultatele analizate se încadrează în ± 10 % din valorile teoretice pentru fiecare congener, se poate începe analiza. În caz contrar, se recomandă o investigație pentru a găsi cauza inexactității și pentru a lua măsuri de remediere corespunzătoare.

11.   Caracteristici de performanță ale metodei (precizia)

Rezultatele statistice ale testului interlaboratoare: tabelele următoare prezintă valorile pentru următorii compuși: etanal, acetat de etil, acetal, etanal total, metanol, butan-2-ol, propan-1-ol, butan-1-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2 metil-butan-1-ol, 3 metil-butan-1-ol.

Următoarele date au fost obținute dintr-un studiu internațional de performanță a metodei efectuat cu proceduri acceptate la nivel internațional.

▼M2

III.3.   DETERMINAREA ACIDITĂȚII VOLATILE A BĂUTURILOR SPIRTOASE

1.    Domeniu de aplicare

Metoda a fost validată printr-un test interlaboratoare pe rom, brandy, rachiu de tescovină și rachiu de fructe, la niveluri variind între la 30 mg/l și 641 mg/l.

2.    Referințe normative

ISO 3696: 1987 Apă pentru uzul laboratoarelor de analiză – Specificații și metode de testare.

3.    Definiții

3.1.	Aciditatea volatilă se calculează prin scăderea acidității fixe din aciditatea totală.

3.2.	Aciditatea totală reprezintă suma acidităților titrabile.

3.3.	Aciditatea fixă reprezintă aciditatea reziduului rămas după evaporarea până la uscare a băuturii spirtoase.

4.    Principiu

Aciditatea totală și aciditatea fixă sunt determinate prin titrare sau prin potențiometrie.

5.    Reactivi și materiale

Pe durata analizei, dacă nu se specifică altfel, se utilizează doar reactivi cu grad analitic recunoscut și apă de cel puțin gradul 3, conform definiției din ISO 3696:1987.

5.1.	Soluție de hidroxid de sodiu (NaOH) 0,01 M

5.2.	Soluție indicator mixt: Se cântărește 0,1 g de carmin indigo și 0,1 g de roșu de fenol. Se dizolvă în 40 ml apă și se completează până la 100 ml cu etanol.

6.    Aparatură și echipamente

Aparatură indirectă de laborator, sticlărie gradată A și următoarele:

7.    Prelevare și probe

Probele se depozitează la temperatura camerei înainte de analiză.

8.    Mod de lucru

8.1.   Aciditate totală

8.1.1.   Pregătirea probei

Băutura spirtoasă se iradiază cu ultrasunete (ultrasonicare) sau se agită timp de două minute în vid pentru a se elimina dioxidul de carbon, dacă este necesar.

8.1.2.   Titrare

Se pipetează 25 ml din băutura spirtoasă într-un balon Erlenmeyer de 500 ml.

Se adaugă aproximativ 200 ml de apă distilată fiartă și răcită (proaspăt pregătită zilnic) și 2-6 picături de soluție indicator mixt (5.2).

Se titrează cu soluție de hidroxid de sodiu 0,01 M (5.1) până când culoarea galben-verzui devine violet în cazul băuturii spirtoase incolore și, respectiv, culoarea galben-maroniu devine roșu-maroniu în cazul băuturii spirtoase maronii.

Titrarea se poate realiza, de asemenea, prin potențiometrie, până la pH 7,5.

Se notează cu n1 ml volumul soluției de hidroxid de sodiu 0,01 M adăugate.

8.1.3.   Calculare

Aciditatea totală (AT), exprimată în miliechivalenți pe litru de băutură spirtoasă, este egală cu 0,4 × n1.

Aciditatea totală (AT′), exprimată în miligrame de acid acetic pe litru de băutură spirtoasă, este egală cu 24 × n1.

8.2.   Aciditate fixă

8.2.1.   Pregătirea probei

Se lasă să se evapore 25 ml din băutura spirtoasă până la uscare:

8.2.2.   Titrare

Se dizolvă reziduul rămas după evaporarea cu apă distilată fiartă și răcită (proaspăt pregătită zilnic), se completează până la un volum de circa 100 ml și se adaugă 2-6 picături de soluție indicator mixt (5.2).

Se titrează cu soluție de hidroxid de sodiu 0,01 M (5.1).

Titrarea se poate realiza, de asemenea, prin potențiometrie, până la pH 7,5.

Se notează cu n2 ml volumul soluției de hidroxid de sodiu 0,01 M adăugate.

8.2.3.   Calculare

Aciditatea fixă (AF), exprimată în miliechivalenți pe litru de băutură spirtoasă, este egală cu 0,4 × n2.

Aciditatea fixă (AF), exprimată în miligrame de acid acetic pe litru de băutură spirtoasă, este egală cu 24 × n2.

9.    Calcularea acidității volatile

9.1.	Se exprimă în miliechivalenți pe litru: Fie: AT = aciditatea totală în miliechivalenți pe litru AF = aciditatea fixă în miliechivalenți pe litru Aciditatea volatilă, AV, în miliechivalenți pe litru, este egală cu: AT – AF

9.2.	Se exprimă în miligrame de acid acetic pe litru: Fie: AT′ = aciditatea totală în miligrame de acid acetic pe litru AF′ = aciditatea fixă în miligrame de acid acetic pe litru Aciditatea volatilă, AV, în miligrame de acid acetic pe litru, este egală cu: AT′ – AF′

9.3.	Se exprimă în grame de acid acetic pe hl de alcool pur 100 % vol și este egală cu: unde A este tăria alcoolică în volume a băuturii spirtoase.

10.    Caracteristici de performanță ale metodei (precizia)

10.1.   Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost obținute dintr-un studiu internațional de performanță a metodei efectuat cu proceduri acceptate la nivel internațional [1] [2].

Tipuri de probe:

A	Rachiu de prune; nivel de ramificare *

B	Rom I; duplicate oarbe

C	Rom II; nivel de ramificare*

D	Șliboviță; duplicate oarbe

E	Brandy; duplicate oarbe

F	Rachiu de tescovină; duplicate oarbe

▼M1

V.   ANETOL. DETERMINAREA TRANS-ANETOLULUI ÎN BĂUTURILE SPIRTOASE PRIN CROMATOGRAFIE ÎN FAZĂ GAZOASĂ

1.   Domeniu de aplicare

Prezenta metodă este adecvată pentru determinarea trans-anetolului în băuturile spirtoase cu aromă de anason prin cromatografie capilară în fază gazoasă.

2.   Referințe normative

ISO 3696: 1987 Apă pentru utilizare analitică de laborator – Caracteristici și metode de testare.

3.   Principiu

Concentrația în trans-anetol a băuturii spirtoase se determină prin cromatografie în fază gazoasă (GC). După adăugarea aceleiași cantități de etalon intern, de exemplu 4-alilanisol (estragol), când estragolul nu este prezent în mod natural în eșantion, eșantionul de testare, pe de o parte, și soluția de referință conținând trans-anetol de concentrație cunoscută, pe de altă parte, ambele se diluează apoi cu ajutorul unei soluții de etanol de 45 % și se injectează direct în cromatograf. Este necesară o extracție înainte de prepararea și analiza eșantionului pentru băuturile spirtoase cu o concentrație mare în glucide.

4.   Reactivi și materiale

În cursul analizei, se utilizează exclusiv reactivi de o puritate de minimum 98 % și apă din minimum clasa 3, în conformitate cu definiția standardului ISO 3696.

Substanțele de referință trebuie păstrate la rece (aproximativ 4 °C), la adăpost de lumină, în recipiente de aluminiu sau flacoane speciale din sticlă colorată (brună) pentru reactivi. Dopurile trebuie prevăzute, de preferință, cu un dispozitiv de etanșare din aluminiu. Trans-anetolul trebuie „decongelat” din starea sa cristalină înainte de utilizare, dar în nici un caz temperatura sa nu trebuie să depășească 35 °C.

4.1.	Etanol de 96 % vol. (CAS 64-17-5)

4.2.	1-metoxi-4-(1-propenil) benzen; (trans-anetol) (CAS 4180-23-8)

4.3.	Etalon intern propus: 4-alilanisol, (estragol) (CAS 140-67-0)

4.4.	Etanol de 45 % vol. Se adaugă 560 g de apă distilată la 378 g de etanol de 96 % vol.

4.5.

Prepararea soluțiilor etalon Toate soluțiile etalon trebuie păstrate la temperatura camerei (15-35 °C), la adăpost de lumină, în recipiente de aluminiu sau flacoane din sticlă colorată (brună) pentru reactivi. Dopurile trebuie prevăzute, de preferință, cu un dispozitiv de etanșare din aluminiu. Trans-anetolul și 4-alilanisolul sunt practic insolubile în apă, de aceea este necesar să fie dizolvate în puțin etanol de 96 % (punctul 4.1) înainte de adăugarea etanolului de 45 % (punctul 4.4). Soluțiile-mamă trebuie reînnoite săptămânal. 4.5.1.   Soluția etalon A Soluție-mamă de trans-anetol (concentrație: 2 g/l) Se cântăresc 40 mg de trans-anetol (punctul 4.2) într-un balon gradat de 20 ml (sau 400 mg în 200 ml etc.). Se adaugă puțin etanol de 96 % (punctul 4.1) și se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (punctul 4.4). Se amestecă bine. 4.5.2.   Soluția etalon intern B Soluție-mamă de etalon intern, de exemplu de estragol (concentrație: 2 g/l) Se cântăresc 40 mg de estragol (vezi punctul 4.3) într-un balon gradat de 20 ml (sau 400 mg în 200 ml etc.). Se adaugă puțin etanol de 96 % (punctul 4.1) și se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (punctul 4.4). Se amestecă bine. 4.5.3.   Soluții utilizate pentru verificarea linearității răspunsului detectorului cu ionizare în flacără Răspunsul privind linearitatea la detectorul cu ionizare în flacără trebuie controlat în vederea analizei pentru o serie de concentrații a trans-anetolului din băuturile spirtoase de la 0 g/l până la 2,5 g/l. În timpul procedurii de analiză, eșantioanele necunoscute de băuturi spirtoase ce trebuie analizate se diluează de 10 ori (punctul 8.3). Pentru condițiile analizei descrise în prezenta metodă, soluțiile-mamă ce corespund unor concentrații de 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 și 0,25 g/l de trans-anetol în eșantionul de analizat se prepară după cum urmează: se prelevează cu ajutorul pipetelor 0,5, 1, 1,5, 2 și 2,5 ml de soluție-mamă A (punctul 4.5.1) și se introduc prelevările în baloane gradate separate de 20 ml. În fiecare balon, se introduc cu o pipetă 2 ml de soluție etalon intern B (punctul 4.5.2) și se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. Se amestecă bine. Se utilizează soluția martor (punctul 8.4) ca soluție de 0 g/l. 4.5.4.   Soluția etalon C Se introduc cu pipeta 2 ml de soluție etalon A (punctul 4.5.1) într-un balon gradat de 20 ml, se adaugă 2 ml de soluție etalon intern B (punctul 4.5.2) și se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (punctul 4.4). Se amestecă bine.

5.   Aparatură și echipamente

6.   Condiții de desfășurare a cromatografiei în fază gazoasă

Tipul și dimensiunile coloanei, precum și condițiile de operare ale cromatografiei în fază gazoasă trebuie să permită separarea anetolului de etalonul intern și de orice altă substanță ce ar putea interveni. Condițiile tipice de lucru pentru coloana prezentată ca exemplu la punctul 5.3 sunt următoarele:

7.   Eșantioane

Eșantioanele trebuie păstrate la temperatura camerei, ferite de lumină și de frig.

8.   Mod de lucru

8.1.   Căutarea prezenței eventuale a estragolului în eșantion

Pentru a se asigura că eșantionul nu conține în mod natural estragol, este necesar să se efectueze o analiză martor fără adăugarea vreunui etalon intern. Dacă eșantionul conține în mod natural estragol, atunci se alege alt etalon intern (de exemplu, mentolul).

Se introduc cu o pipetă 2 ml de eșantion într-un balon gradat de 20 ml și se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (punctul 4.4). Se amestecă bine.

8.2.   Prepararea eșantioanelor necunoscute

Se introduc cu o pipetă 2 ml de eșantion într-un balon gradat de 20 ml, apoi se adaugă 2 ml de soluție etalon intern B (punctul 4.5.2) și se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (punctul 4.4). Se amestecă bine.

8.3.   Analiză martor

Se introduc cu o pipetă 2 ml de soluție etalon intern B (punctul 4.5.2) într-un balon gradat de 20 ml și se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (punctul 4.4). Se amestecă bine.

8.4.   Test de linearitate

Înainte de începerea analizei, trebuie verificată linearitatea răspunsului detectorului cu ionizare în flacără, analizând de trei ori succesiv fiecare dintre soluțiile etalon pentru controlarea linearității (punctul 4.5.3).

De la ariile sau înălțimile vârfului integratorului, pentru fiecare injectare, se reprezintă grafic concentrația în g/l a soluției-mamă corespunzătoare în funcție de raportul R.

R = aria sau înălțimea vârfului trans-anetolului împărțită la înălțimea sau aria vârfului estragolului.

Se obține o reprezentare lineară.

8.5.   Determinare

Se injectează soluția martor (punctul 8.3), apoi soluția etalon C (punctul 4.5.4), urmată de unul dintre etaloanele de linearitate (punctul 4.5.3) care va servi drept eșantion de control al calității (acesta se poate alege cu referire la concentrația probabilă a trans-anetolului în eșantionul necunoscut), apoi cinci eșantioane necunoscute (punctul 8.2). Pentru a asigura stabilitatea analitică, se introduce un eșantion de control al linearității (de control al calității) după fiecare serie de cinci eșantioane necunoscute.

9.   Calcularea factorului de răspuns

Se măsoară ariile vârfului (utilizând un integrator sau alt sistem de colectare și de gestionare a datelor) sau înălțimile vârfului (integrare manuală) pentru trans-anetol și pentru etalonul intern.

9.1.   Calcularea factorului de răspuns (RFi)

Factorul de răspuns se calculează în următorul mod:

RFi = (Ci/aria sau înălțimeai) * (aria sau înălțimeais/Cis)

unde:

Ci	este concentrația trans-anetolului în soluția etalon A (punctul 4.5.1)

Cis	este concentrația etalonului intern în soluția etalon B (punctul 4.5.2)

ariai

este aria (sau înălțimea) vârfului trans-anetolului

ariais

este aria (sau înălțimea) vârfului etalonului intern

Factorul RFi se calculează din cele cinci eșantioane de soluție C (punctul 4.5.4).

9.2.   Analiza soluțiilor de testare a linearității răspunsului detectorului cu ionizare în flacără

Se injectează soluțiile de testare a linearității (punctul 4.5.3).

9.3.   Analiza eșantionului

Se injectează soluția de eșantion necunoscut (punctul 8.2).

10.   Calcularea rezultatelor

Formula pentru calcularea concentrației trans-anetolului este următoarea:

ci = Cis * (aria sau înălțimeai/aria sau înălțimeais)*RFi

unde

ci	este concentrația necunoscută a trans-anetolului

Cis	este concentrația etalonului intern în eșantionul necunoscut (punctul 4.5.2)

aria sau înălțimeai

este aria sau înălțimea vârfului trans-anetolului

aria sau înălțimeais

este aria sau înălțimea vârfului etalonului intern

RFi	este coeficientul răspunsului (calculat conform punctului 9.1)

Concentrația trans-anetolului se exprimă în grame pe litru, cu o zecimală.

11.   Asigurarea și controlul calității

Cromatogramele trebuie să prezinte o bună separare a anetolului de etalonul intern, precum și de orice alte substanțe ce ar putea interveni. Valoarea RFi se calculează din rezultatele celor cinci injecții de soluție C (punctul 4.5.4). În cazul în care coeficientul de variație [CV % = (decalaj standard/medie)*100] se încadrează în jurul valorii de 1 %, valoarea medie a factorului RFi este acceptabilă.

Calculul anterior trebuie utilizat pentru a se calcula concentrația trans-anetolului din eșantionul ales pentru controlul calității dintre soluțiile pentru controlarea linearității (punctul 4.5.3).

Dacă rezultatele medii calculate pornind de la analiza soluției pentru controlarea linearității alese ca eșantion intern de control al calității (ICC) se încadrează în jurul valorii de 2,5 % din valoarea lor teoretică, atunci rezultatele obținute pentru eșantioanele necunoscute sunt considerate acceptabile.

12.   Tratarea eșantioanelor de băuturi spirtoase cu un conținut mare de zahăr și a eșantioanelor de lichior înainte de analiza prin cromatografie în fază gazoasă

Extragerea alcoolului din băuturile spirtoase cu un conținut mare de zahăr pentru a determina concentrația în trans-anetol prin cromatografia capilară în fază gazoasă.

12.1.   Principiu

Se prelevează o parte alicotă din eșantionul de lichior, la care se adaugă etalonul intern, la o concentrație similară celei a analitului (trans-anetolul) prezent în lichior. Se adaugă apoi fosfat de sodiu dodecahidrat și sulfat de amoniu anhidru. Amestecul se agită bine și se refrigerează. Se separă două faze, iar faza alcoolică superioară se recuperează. Se prelevează o parte alicotă din această fază alcoolică și se diluează cu o soluție de etanol de 45 % vol. (punctul 4.4). Trebuie menționat că în acest stadiu nu se adaugă nici un etalon intern, deoarece a fost deja adăugat. Soluția obținută se analizează prin cromatografie în fază gazoasă.

12.2.   Reactivi și materiale

În cursul extracției, se utilizează exclusiv reactivi de o puritate de minimum 99 %.

12.3.   Aparatură și echipamente

Baloane conice, baloane de separare, frigider.

12.4.   Mod de lucru

12.4.1.   Căutarea estragolului în eșantion

Pentru a se asigura că eșantionul nu conține în mod natural estragol, este necesar să se efectueze o prelevare martor (punctul 12.6.2) și să se realizeze analiza acesteia fără a se adăuga vreun etalon intern. Dacă se dovedește că eșantionul conține în mod natural estragol, este necesar să se aleagă alt etalon intern.

12.4.2.   Extragerea

Se introduc cu pipeta 5 ml de etanol de 96 % vol. (punctul 4.1) într-un balon conic, apoi se adaugă succesiv 50 mg de etalon intern (punctul 4.3) și 50 ml de eșantion. Se adaugă 12 g de sulfat de amoniu anhidru (punctul 12.2.1) și 8,6 g de fosfat de sodiu dibazic, dodecahidrat (punctul 12.2.2). Se închide balonul conic.

Se agită balonul timp de cel puțin treizeci de minute. Se poate utiliza un dispozitiv de agitare mecanică, dar nu o bară magnetică pentru agitare acoperită cu teflon, deoarece teflonul absoarbe o parte din analit. Trebuie reținut că sărurile adăugate nu se vor dizolva complet.

Balonul închis se pune într-un frigider (T < 5 °C), timp de cel puțin două ore.

După aceea, ar trebui să poată fi observate două straturi distincte în fază lichidă și un reziduu solid. Stratul de alcool trebuie să fie limpede; dacă nu este așa, se pune din nou balonul în frigider până se observă o separare netă.

Când stratul de alcool este limpede, se prelevează cu grijă o parte alicotă (10 ml, de exemplu), fără a tulbura stratul apos, apoi se pune într-un flacon de sticlă brună și se închide cu grijă.

12.4.3.   Prepararea extractului de eșantion ce trebuie analizat

Se așteaptă până când extractul (punctul 12.4.2) ajunge la temperatura camerei.

Se prelevează 2 ml din stratul de alcool al extractului de eșantion la temperatura camerei, se introduc cu pipeta într-un balon gradat de 20 ml, se completează la capacitate cu etanol de 45 % vol. (punctul 4.4) și se amestecă bine.

12.5.   Determinare

Se urmează modul de lucru prezentat la punctul 8.5.

12.6.   Calcularea rezultatelor

Pentru calcularea rezultatelor se utilizează următoarea formulă:

unde:

mis	este masa etalonului intern (punctul 4.3) prelevat (punctul 12.4.2) (în miligrame)

V	este volumul eșantionului necunoscut (50 ml)

RFi	este factorul de răspuns (punctul 9.1)

ariai

este aria vârfului trans-anetolului

ariais

este aria vârfului etalonului intern

Rezultatele se exprimă în grame pe litru, cu o zecimală.

12.7.   Controlul și asigurarea calității

Se urmează modul de lucru prezentat la punctul 11.

13.   Caracteristicile de performanță ale metodei (precizia)

Rezultate statistice ale testului interlaboratoare:

VI.   ACID GLICIRIZIC. DETERMINAREA ACIDULUI GLICIRIZIC PRIN CROMATOGRAFIE LICHIDĂ DE ÎNALTĂ PERFORMANȚĂ

1.   Domeniu de aplicare

Prezenta metodă este adecvată pentru determinarea acidului glicirizic în băuturile spirtoase cu aromă de anason prin cromatografie lichidă de înaltă performanță (HPLC). Regulamentul (CEE) nr. 1576/89 prevede că orice băutură spirtoasă cu aromă de anason numită „pastis” trebuie să prezinte un conținut în acid glicirizic cuprins între 0,05 g și 0,5 g per litru.

2.   Referințe normative

ISO 3696: 1987 Apă pentru utilizare analitică de laborator – Caracteristici și metode de testare.

3.   Principiu

Concentrația în acid glicirizic se determină utilizând cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC) cu detectare UV. Se filtrează o soluție etalon și eșantionul de testare și se injectează separat și direct în sistemul HPLC.

4.   Reactivi și materiale

În cursul analizei, se folosesc exclusiv reactivi adaptați la cromatografia lichidă, etanol absolut și apă de clasa 3, în conformitate cu definiția din standardul ISO 3696.

4.1.	Etanol de 96 % vol. (CAS 64-17-5)

4.2.	Glicirizinat de amoniu C42H62O16.NH3 (Sare de acid glicirizic monoamoniacal) (Masă molară: 839,98) (CAS 53956-04-0): puritate de minimum 90 % (Masă molară a acidului glicirizic: 822,94)

4.3.	Acid acetic cristalizabil, CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.4.	Metanol, CH3OH (CAS 67-56-1)

4.5.	Etanol de 50 % vol. Pentru 1 000  ml la 20 °C: —  etanol de 96 % vol. (punctul 4.1): 521 ml —  apă (punctul 2.0): 511 ml.

4.6.

Prepararea soluțiilor de eluare pentru cromatografie lichidă de înaltă performanță 4.6.1.   Solvent de eluare A (exemplu) 80 de părți (volume) de apă (punctul 2.0) 20 de părți (volume) de acid acetic (punctul 4.3). Se degazează solventul de eluare timp de cinci minute. Notă: dacă apa care se utilizează nu a fost microfiltrată, se recomandă filtrarea solventului de eluare preparat cu ajutorul unui filtru pentru solvenți organici cu un diametru al porilor mai mic sau egal cu 0,45 μm. 4.6.2.   Solvent de eluare B Metanol (punctul 4.4)

4.7.

Prepararea soluțiilor etalon Toate soluțiile etalon trebuie reînnoite la fiecare două luni. 4.7.1.   Soluția de referință C Se cântăresc, cu o eroare de maximum 0,1 mg, 25 mg de glicirizinat de amoniu (punctul 4.2) într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă etanol de 50 % vol. (punctul 4.5) și se dizolvă glicirizinatul de amoniu. După dizolvare, se completează până la semn cu o nouă cantitate de etanol de 50 % vol. (punctul 4.5). Se filtrează cu ajutorul unui filtru pentru solvenți organici. 4.7.2.   Soluții etalon (folosite pentru a controla linearitatea răspunsului instrumentelor) Se prepară o soluție-mamă de 1,0 g/l introducând, cu o eroare de maximum 0,1 mg, 100 mg de glicirizinat de amoniu într-un balon gradat de 100 ml. Se adaugă puțin etanol de 50 % vol. (punctul 4.5) și se dizolvă glicirizinatul de amoniu. După dizolvare, se completează până la semn cu o nouă cantitate de etanol de 50 % vol. (punctul 4.5). Se prepară cel puțin alte patru soluții ce corespund la 0,05, 0,1, 0,25 și 0,5 g/l de glicirizinat de amoniu, prelevând cu ajutorul unei pipete respectiv 5 ml, 10 ml, 25 ml și 50 ml din soluția-mamă de 1,0 g/l în baloane gradate separate de 100 ml. Se completează apoi până la semn cu o nouă cantitate de etanol de 50 % vol. (punctul 4.5) și se amestecă bine. Se filtrează toate soluțiile cu ajutorul unui filtru pentru solvenți organici.

5.   Aparatură și echipamente

5.1.   Sistem de separare

5.2.	Integrator computerizat sau înregistrator ce funcționează în deplină compatibilitate cu restul sistemului

5.3.	Coloană (exemplu): material: oțel inoxidabil sau sticlă diametru interior: 4-5 mm lungime: 100-250 mm fază staționară: silicagel reticulat cu grup funcțional octadecil (C18), de preferință sferic, cu o granulometrie maximă de 5 μm

5.4.	Echipament de laborator 5.4.1. Balanță de analiză (precizie: 0,1 mg) 5.4.2. Sticlărie gradată de precizie (clasa A) 5.4.3. Dispozitiv de filtrare pentru volume mici pe micromembrană

6.   Condiții ale cromatografiei

7.   Mod de lucru

7.1.   Prepararea eșantionului de băutură spirtoasă

Se filtrează, dacă este necesar, printr-un filtru pentru solvenți organici (diametrul porilor: 0,45 μm).

7.2.   Determinare

După stabilizarea condițiilor cromatografice:

8.   Caracteristicile de performanță ale metodei (precizia)

Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

VII.   CALCONE. METODĂ DE CROMATOGRAFIE LICHIDĂ DE ÎNALTĂ PERFORMANȚĂ PENTRU A VERIFICA PREZENȚA CALCONELOR ÎN PASTIS

1.   Domeniu de aplicare

Prezenta metodă este adecvată pentru determinarea prezenței calconelor în băuturile cu aromă de anason. Calconele sunt coloranți naturali din familia flavonoidelor, prezenți în lemnul dulce (Glycyrrhiza glabra).

Pentru ca o băutură spirtoasă cu aromă de anason să se numească „pastis”, aceasta trebuie să conțină calcone [Regulamentul (CEE) nr. 1576/89].

2.   Referințe normative

ISO 3696: 1987 Apă pentru utilizare analitică de laborator – Caracteristici și metode de testare.

3.   Principiu

Se prepară o soluție de extract de lemn dulce de referință. Prezența sau absența calconelor se determină prin cromatografie lichidă de înaltă performanță cu detectare UV.

4.   Reactivi și materiale

În cursul analizei, se folosesc doar reactivi adaptați la cromatografia lichidă de înaltă performanță. Etanolul trebuie să fie de 96 % vol. Trebuie să se folosească doar apă de clasa 3 (în conformitate cu definiția din norma ISO 3696).

4.1.	Etanol de 96 % vol. (CAS 64-17-5)

4.2.	Acetonitril CH3CN, (CAS 75-05-8)

4.3.	Substanță de referință: Glycyrrhiza glabra (lemn dulce) Lemn dulce (Glycyrrhiza glabra) măcinat mare. Dimensiuni medii ale particulelor de tip „batonașe”: lungimea 10-15 mm, grosimea 1-3 mm.

4.4.	Acetat de sodiu CH3COONa, (CAS 127-09-3)

4.5.	Acid acetic cristalizabil CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.6.

Prepararea soluțiilor 4.6.1.   Etanol de 50 % vol. Pentru 1 000  ml la 20 °C: —  etanol de 96 % vol. (punctul 4.1): 521 ml —  apă (punctul 2.0): 511 ml. 4.6.2.   Solventul A: acetonitril Acetonitril (punctul 4.2) de puritate analitică pentru HPLC. Se degazează 4.6.3.   Solventul B: 0,1 M dintr-o soluție tampon de acetat de sodiu cu pH de 4,66 Se cântăresc 8,203 g de acetat de sodiu (punctul 4.4), se adaugă 6,005 g de acid acetic cristalizabil (punctul 4.5) și se completează până la 1 000  ml cu apă (punctul 2) într-un balon gradat.

5.   Prepararea extractului de referință din Glycyrrhiza glabra (punctul 4.3)

5.1.	Se cântăresc 10 g de lemn dulce măcinat (Glycyrrhiza glabra) (punctul 4.3) și se pun într-un balon de distilare cu fund rotund. —  Se adaugă 100 ml de etanol de 50 % vol. (punctul 4.6.1) —  Se distilează sub reflux timp de o oră —  Se filtrează —  Se rezervă filtratul pentru o utilizare ulterioară.

5.2.	Se recuperează extractul de lemn dulce prezent în filtru. —  Se pune într-un balon de distilare cu fund rotund —  Se adaugă 100 ml de etanol de 50 % vol. (punctul 4.6.1) —  Se fierbe sub reflux pentru o oră —  Se filtrează. Se păstrează filtratul pentru o utilizare ulterioară.

5.3.	Extragerea de lemn dulce trebuie să se efectueze de trei ori succesiv.

5.4.	Se combină cele trei filtrate.

5.5.	Se evaporă faza solvent (punctul 5.4) cu ajutorul unui evaporator de tip rotativ.

5.6.	Se recuperează extractul rezidual (punctul 5.5) cu 100 ml de etanol de 50 % vol. (punctul 4.6.1).

6.   Aparatură și echipamente

6.1.   Sistem de separare

6.2.	Integrator computerizat sau înregistrator ce funcționează în compatibilitate cu restul sistemului de separare

6.3.	Coloana: material: oțel inoxidabil sau sticlă diametru interior: 4-5 mm fază staționară: silicagel reticulat cu grupare funcțională de tip derivat octadecil (C18), cu o granulometrie maximă de 5 μm (faza reticulată).

6.4.

Echipament obișnuit de laborator, mai ales: 6.4.1.  balanță de analiză (precizie: ± 0,1 mg) 6.4.2.  aparat de distilare echipat cu un condensator cu reflux ce cuprinde, de exemplu: —  un balon de 250 ml cu fund rotund cu îmbinare șlefuită standardizată —  un condensator cu reflux de o lungime de 30 cm —  o sursă de căldură (orice pirogenare a materiilor extractive trebuie evitată cu ajutorul unui dispozitiv corespunzător) 6.4.3.  Aparat de evaporare de tip rotativ 6.4.4.  Dispozitiv de filtrare (pâlnie Buchner, de exemplu)

6.5.

Condiții ale cromatografiei (exemplu) 6.5.1. Caracteristici de eluare a solvenților A (punctul 4.6.2) și B (punctul 4.6.3): —  se trece de la gradientul 20/80 (v/v) la 50/50 (v/v) în 15 minute —  se trece de la gradientul 50/50 (v/v) la 75/25 (v/v) în 5 minute —  tărie egală la 75/25 (v/v) timp de 5 minute —  stabilizare a coloanei între două injectări —  tărie egală la 20/80 (v/v) timp de 5 minute. 6.5.2. Debit: 1 ml/minut 6.5.3. Reglări ale detectorului cu UV Detectorul trebuie reglat la 370 nm pentru a detecta prezența calconelor și apoi la 254 nm pentru a detecta acidul glicirizic. Notă: schimbarea lungimilor de undă (de la 370 nm la 254 nm) trebuie efectuată cu 30 de minute înainte de începerea vârfului de eluare a acidului glicirizic.

7.   Mod de lucru

7.1.   Prepararea eșantionului de băutură spirtoasă

Se filtrează printr-un filtru pentru solvenți organici (diametrul porilor: 0,45 μm).

7.2.   Prepararea extractului rezidual de lemn dulce (punctul 5.6)

Înaintea analizei, se procedează la o diluare de 1:10 în etanol de 50 % vol. (punctul 4.6.1).

7.3.   Determinare

8.   Cromatograma caracteristică pentru pastis

Figura 1

Cromatogramă obținută prin metoda descrisă anterior, indicând prezența calconelor într-un pastis. Vârfurile de la 1 la 8 corespund calconelor, iar vârful 9 acidului glicirizic.

9.   Caracteristicile de performanță ale metodei (precizia)

Rezultatele testului interlaboratoare

▼M2

VIII.   ZAHARURI TOTALE

1.    Domeniu de aplicare

Metoda HPLC-RI se aplică pentru a determina zaharurile totale (exprimate ca zahăr invertit) din băuturile spirtoase, cu excepția lichiorurilor care conțin ouă și produse lactate.

Metoda a fost validată printr-un test interlaboratoare pentru pastis, anason distilat, lichior de cireșe, „crème de” (urmată de numele fructului sau al materiei prime utilizate) și „crème de cassis”, la niveluri variind între 10,86g/l și 509,7 g/l. Cu toate acestea, linearitatea răspunsului instrumentului a fost dovedită pentru o concentrație variind între 2,5 g/l și 20,0 g/l.

Această metodă nu este destinată determinării conținuturilor scăzute de zaharuri.

2.    Referințe normative

ISO 3696:1987 Apă pentru uzul laboratoarelor de analiză – Specificații și metode de testare.

3.    Principiu

Cromatografia lichidă de înaltă performanță testează soluțiile de zahăr, pentru a le stabili concentrațiile de glucoză, fructoză, zaharoză, maltoză și lactoză.

Această metodă utilizează o fază staționară de alchilamină și detectarea refractometriei diferențiale și este prezentată ca exemplu. Este posibilă și utilizarea rășinilor schimbătoare de anioni ca fază staționară.

4.    Reactivi și materiale

4.1.	Glucoză (CAS 50-99-7), cu o puritate de minimum 99 %.

4.2.	Fructoză (CAS 57-48-7), cu o puritate de minimum 99 %.

4.3.	Zaharoză (CAS 57-50-1), cu o puritate de minimum 99 %.

4.4.	Lactoză (CAS 5965-66-2), cu o puritate de minimum 99 %.

4.5.	Maltoză monohidrată (CAS 6363-53-7), cu o puritate de minimum 99 %.

4.6.	Acetonitril pur (CAS 75-05-8) pentru analiza HPLC.

4.7.	Apă distilată sau demineralizată, de preferat microfiltrată.

4.8.

Solvenți (exemplu) Solventul de eluare este compus din: 75 de părți (volume) de acetonitril (4.6), 25 de părți (volume) de apă distilată (4.7). Se trece heliu prin solventul de eluare, într-un ritm lent, timp de 5-10 minute, înainte de a fi folosit pentru degazare. Dacă apa utilizată nu a fost microfiltrată, solventul ar trebui să fie filtrat cu ajutorul unui filtru pentru solvenți organici cu diametrul porilor mai mic decât sau egal cu 0,45 μm.

4.9.	Etanol absolut (CAS 64-17-5).

4.10.

Soluție de etanol (5 %, v/v).

4.11.

Pregătirea soluției-mamă standard (20g/l) Se cântăresc 2 g din fiecare dintre zaharurile care urmează să fie analizate (4.1.-4.5.), se transferă cantitativ într-un balon volumetric de 100 ml. (NB: 2,11 g de maltoză monohidrată echivalează cu 2 g de maltoză). Se ajustează la 100 ml cu o soluție de alcool de 5 % vol. (4.10), se agită și se păstrează la aproximativ + 4 °C. Se prepară o nouă soluție-mamă o dată pe săptămână.

4.12.

Pregătirea soluțiilor standard de lucru (2,5; 5,0; 7,5; 10,0 și 20,0 g/l) Se diluează soluția-mamă, 20 g/l, (4.11) corespunzător cu o soluție de alcool de 5 % vol. (4.10) pentru a obține cinci soluții standard de lucru de 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 și 20,0 g/l. Se filtrează cu un filtru având diametrul porilor mai mic decât sau egal cu 0,45 μm (5.3.).

5.    Aparatură și echipamente

5.1.   Sistem HPLC care poate asigura rezoluția liniei de bază pentru toate zaharurile.

5.1.1.

Cromatograf lichid de înaltă performanță prevăzut cu valvă de injecție cu șase orificii, prevăzut cu o buclă de 10 μL sau cu orice alt dispozitiv, automat sau manual, pentru injectarea fiabilă a microvolumelor.

5.1.2.

Sistem de pompare care permite obținerea și menținerea unui debit constant sau programat de înaltă precizie.

5.1.3.

Refractometru diferențial.

5.1.4.

Integrator computerizat sau înregistrator ce funcționează în compatibilitate cu restul sistemului.

5.1.5.

Precoloană: Se recomandă atașarea unei precoloane adecvate la coloana analitică.

5.1.6.

Coloană (exemplu): Material: oțel inoxidabil sau sticlă. Diametru interior: 2-5 mm. Lungime: 100-250 mm (în funcție de dimensiunea particulei încărcate), de exemplu 250 mm dacă particula are diametrul de 5 μm. Fază staționară: grupele funcționale ale alchilaminei legate de siliciu, dimensiunea maximă a particulei de 5 μm.

5.1.7.

Condiții pentru cromatografie (exemplu): Solvent de eluare (4.8.), debit: 1 ml/minut. Detectare: Refractometrie diferențială. Pentru a se asigura că detectorul este perfect stabil, acesta ar trebui să fie pornit cu câteva ore înainte de utilizare. Celula de referință trebuie să fie umplută cu solvent de eluare.

5.2.	Balanța analitică cu o precizie de 0,1 mg.

5.3.	Dispozitiv de filtrare pentru volume mici cu ajutorul unei micromembrane de 0,45 μm.

6.    Depozitarea probelor

La primire, probele trebuie depozitate la temperatura camerei înainte de analiză.

7.    Mod de lucru

7.1.   PARTEA A: Pregătirea probei

7.1.1.

Se agită proba.

7.1.2.

Se filtrează cu un filtru având diametrul porilor mai mic decât sau egal cu 0,45 μm (5.3.).

7.2.   PARTEA B: HPLC

7.2.1.   Determinare

Se injectează 10 μl din soluțiile standard (4.12.) și probe (7.1.2.). Se efectuează analiza în condiții cromatografice adecvate, cum ar fi cele descrise mai sus.

7.2.2.

În cazul în care oricare vârf al unei probe are suprafața (sau înălțimea) mai mare decât vârful corespunzător în soluția standard cea mai concentrată, proba trebuie diluată cu apă distilată și reanalizată.

8.    Calculare

Se compară cele două cromatograme obținute pentru soluția standard și pentru băutura spirtoasă. Se identifică vârfurile după timpul lor de retenție. Se măsoară suprafețele lor (sau înălțimile) pentru a se calcula concentrațiile prin metoda standard externă. Se iau în considerare toate diluțiile efectuate în timpul pregătirii probei.

Rezultatul final reprezintă suma zaharozei, maltozei, lactozei, glucozei și fructozei, exprimat ca zahăr invertit în g/l.

Zahărul invertit se calculează ca suma tuturor monozaharidelor și reducând dizaharidele prezente, plus cantitatea stoechiometrică de glucoză și fructoză calculată din zaharoza prezentă.

Zahăr invertit (g/l)

=

glucoză (g/l) + fructoză (g/l) + maltoză (g/l) + lactoză (g/l) + (zaharoză (g/l) × 1,05)

1,05

=

(masa moleculară a fructozei + masa moleculară a glucozei)/masa moleculară a zaharozei

9.    Caracteristici de performanță ale metodei (precizia)

9.1.   Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

Următoarele date au fost obținute dintr-un studiu internațional de performanță a metodei efectuat cu proceduri acceptate la nivel internațional [1] [2].

▼M1

IX.   GĂLBENUȘ DE OU. DETERMINAREA CONCENTRAȚIEI DE GĂLBENUȘ DE OU DIN BĂUTURILE SPIRTOASE – METODA FOTOMETRICĂ

1.   Domeniu de aplicare

Prezenta metodă este adecvată pentru determinarea concentrației de gălbenuș de ou de la 40 la 250 g/l în lichiorul de ou și lichiorul pe bază de ou.

2.   Referințe normative

ISO 3696: 1897 Apă pentru utilizare analitică de laborator – Caracteristici și metode de testare

3.   Principiu

Compușii fosforoși solubili în etanol prezenți în gălbenușul de ou se extrag și se determină prin fotometrie sub formă de complex fosfo-molibdenic.

4.   Reactivi

5.   Aparatură și echipamente

6.   Eșantioane

Eșantioanele se păstrează la temperatura camerei înainte de analiză.

7.   Mod de lucru

7.1.   Pregătirea eșantioanelor

7.2.   Testare fotometrică a fosfaților

7.2.1.   Soluție comparativă

7.2.2.   Soluție de eșantion

7.2.3.   Curba de etalonare

8.   Exprimarea rezultatelor

Conținutul în gălbenuș de ou, exprimat în g/l, se calculează după următoarea formulă:

unde:

110	este factorul de conversie pentru cantitatea totală de P2O5 în g din 100 g de gălbenuș de ou

mg P2O5

este valoare determinată de curba de etalonare

densitate

este masa per unitate de volum (g/ml) de lichior de ou la temperatura de 20 °C

E	este masa lichiorului de ou în g

40	este factorul de diluare pentru o porțiune de 5 ml de soluție de cenușă.

9.   Caracteristicile de performanță ale metodei (precizia)

Rezultate statistice ale testului interlaboratoare

▼M2

X.   DETERMINAREA URMĂTORILOR COMPUȘI DIN LEMN ÎN BĂUTURILE SPIRTOASE PRIN METODA CROMATOGRAFIEI LICHIDE DE ÎNALTĂ PERFORMANȚĂ (HPLC): FURFURAL, 5-HIDROXIMETILFURFURAL, 5-METILFURFURAL, VANILINĂ, ALDEHIDĂ SIRINGICĂ, ALDEHIDĂ CONIFERILICĂ, SINAPALDEHIDĂ, ACID GALIC, ACID ELAGIC, ACID VANILIC, ACID SIRINGIC ȘI SCOPOLETINĂ

1.    Domeniu de aplicare

Metoda se referă la determinarea compușilor: furfural, 5-hidroximetilfurfural, 5-metilfurfural, vanilină, aldehidă siringică, aldehidă coniferilică, sinapaldehidă, acid galic, acid elagic, acid vanilic, acid siringic și scopoletină prin cromatografia lichidă de înaltă performanță.

2.    Referință normativă

Metodă analitică recunoscută de Adunarea Generală a Organizației Internaționale a Viei și Vinului (OIV) și publicată de OIV cu numărul de referință OIV-MA-BS-16: R2009.

3.    Principiu

Determinarea prin cromatografia lichidă de înaltă performanță (HPLC), cu detectare prin spectofotometria în ultraviolet la mai multe lungimi de undă și prin spectrofluorimetrie.

4.    Reactivi

Reactivii trebuie să fie de calitate analitică. Apa utilizată trebuie să fie apă distilată sau apă de o puritate cel puțin echivalentă. Este de preferat să se utilizeze apă microfiltrată cu o rezistivitate de 18,2 M Ω.cm.

4.1.	Alcool de 96 % vol.

4.2.	Metanol de calitate HPLC (Solvent B).

4.3.	Acid acetic diluat la 0,5 % vol. (Solvent A).

4.4.	Faze mobile: (dat numai ca exemplu). Solvent A (0,5 % acid acetic) și solvent B (metanol pur). Se filtrează printr-o membrană (cu porozitate 0,45 μm). Dacă este necesar, se degazează într-o baie cu ultrasunete.

4.5.	Soluție standard de referință cu puritate minimă 99 %: furfural, 5-hidroximetilfurfural, 5-metilfurfural, vanilină, aldehidă siringică, aldehidă coniferilică, sinapaldehidă, acid galic, acid elagic, acid vanilic, acid siringic și scopoletină.

4.6.

Soluție de referință: substanțele standard se dizolvă într-o soluție apă-alcool de 50 % vol. Concentrațiile finale în soluția de referință trebuie să fie de ordinul a: furfural: 5 mg/l; 5-hidroximetilfurfural: 10 mg/l; 5-metilfurfural 2 mg/l; vanilină: 5 mg/l; aldehidă siringică: 10 mg/l; aldehidă coniferilică: 5 mg/l; sinapaldehidă: 5 mg/l; acid galic: 10 mg/l; acid elagic: 10 mg/l; acid vanilic: 5 mg/l; acid siringic: 5 mg/l; scopoletină: 0,5 mg/l.

5.    Aparatură

Aparatură standard de laborator

5.1.

Un cromatograf lichid de înaltă performanță capabil să funcționeze în mod gradient binar și echipat cu: 5.1.1.  Un detector spectrofotometric capabil să măsoare la lungimi de undă de la 260 până la 340 nm. Cu toate acestea, este de preferat să se lucreze cu un detector cu multiple lungimi de undă cu rețea de diode, pentru a confirma puritatea vârfurilor. 5.1.2.  Un detector spectrofluorimetric – lungime de undă de excitare: 354 nm, lungime de undă de emisie: 446 nm (pentru determinarea urmelor de scopoletină; care este detectabilă, de asemenea, la 313 nm cu ajutorul spectrofotometriei). 5.1.3.  Un dispozitiv de injectare care poate introduce 10 sau 20 μl (de exemplu) din proba de testare. 5.1.4.  O coloană pentru cromatografie lichidă de înaltă performanță, de tip RP C18, cu dimensiunea maximă a particulei de 5 μm.

5.2.	Seringi pentru HPLC.

5.3.	Dispozitiv pentru filtrare prin membrană a volumelor mici.

5.4.	Integrator computerizat sau înregistrator care funcționează în compatibilitate cu întreaga aparatură și, în special, care trebuie să aibă mai multe canale de achiziție.

6.    Mod de lucru

6.1.   Pregătirea soluției care urmează a fi injectată

Soluția de referință și băutura spirtoasă se filtrează, dacă este necesar, printr-o membrană cu diametrul maxim al porilor de 0,45 μm.

6.2.

Condiții de operare cromatografică: analiza se efectuează la temperatura ambiantă cu ajutorul echipamentului descris la punctul (5.1) și folosind fazele mobile (4.4), cu un debit de aproximativ 0,6 ml pe minut și urmărind gradientul de mai jos (dat numai ca exemplu) Timp: 0 min 50 min 70 min 90 min solvent A (apă-acid): 100 % 60 % 100 % 100 % solvent B (metanol): 0 % 40 % 0 % 0 % Trebuie remarcat că, în anumite cazuri, acest gradient ar trebui modificat pentru a se evita co-eluările.

6.3.

Determinare 6.3.1. Se injectează soluțiile standard de referință separat, apoi amestecate. Se adaptează condițiile de operare astfel încât factorii de rezoluție ai vârfurilor tuturor compușilor să fie egali cu cel puțin 1. 6.3.2. Se injectează proba preparată conform punctului 6.1. 6.3.3. Se măsoară suprafața vârfurilor în soluția de referință și băutura spirtoasă și se calculează concentrațiile.

7.    Exprimarea rezultatelor

Se exprimă concentrația fiecărui constituent în mg/l.

8.    Caracteristici de performanță ale metodei (precizia)

Următoarele date au fost obținute în 2009 dintr-un studiu internațional de performanță a metodei, efectuat cu proceduri acceptate la nivel internațional [1], [2].

8.1.   Furfural

8.2.   5-Hidroximetilfurfural

8.3.   5-Metilfurfural

8.4.   Vanilină

8.5.   Aldehidă siringică

8.6.   Aldehidă coniferilică

8.7.   Sinapaldehidă

8.8.   Acid galic

8.9.   Acid elagic

8.10.   Acid vanilic

8.11.   Acid siringic

8.12.   Scopoletină

▼M3

XI.    DETERMINAREA CONȚINUTULUI DE RADIOCARBON ÎN ETANOL

1.    Introducere

Determinarea conținutului de radiocarbon în etanol permite să se facă distincția între alcoolul pe bază de combustibili fosili (alcool de sinteză) și alcoolul pe bază de materii prime produse recent (alcool de fermentație).

2.    Definiție

Conținutul de radiocarbon al etanolului trebuie considerat ca fiind conținutul de radiocarbon determinat prin metoda descrisă aici sau prin metoda descrisă în standardul EN 16640 metoda C.

Conținutul natural de radiocarbon din atmosferă (valoarea de referință), care este absorbit de vegetația vie prin asimilare, nu este o valoare constantă. Valoarea de referință se determină, așadar, pe etanolul din materii prime provenite din cea mai recentă perioadă de vegetație. Această valoare de referință anuală este determinată în conformitate cu standardul EN 16640. Totuși, poate fi acceptată o altă valoare de referință dacă valoarea respectivă este certificată de un organism acreditat.

3.    Principiu

Conținutul de radiocarbon al probelor care conțin alcool cu cel puțin 85 % masă de etanol se determină direct prin numărare prin scintilație lichidă.

4.    Reactivi

4.1.   Scintilator cu toluen

5,0 g de 2,5-difeniloxazol (PPO)

0,5 g de p-bis-[4-metil-5-feniloxazol (2)]-benzen (dimetil-POPOP) într-un litru de toluen pur pentru analiză.

Se pot utiliza și scintilatoare cu toluen cu această compoziție disponibile în comerț, gata preparate.

4.2.   Standard radiocarbon

Radiocarbon n-hexadecan cu o activitate de aproximativ 1 × 106 dpm/g (circa 1,67 × 106 cBq/g) și cu o precizie garantată a activității determinate de ± 2 % rel.

4.3.   Etanol fără radiocarbon

Alcool de sinteză din materii prime de origine fosilă, cu cel puțin 85 % masă de etanol, pentru determinarea zgomotului de fond.

5.    Aparatură

6.    Procedură

6.1.   Reglarea echipamentelor

Echipamentele trebuie reglate în conformitate cu instrucțiunile producătorului. Condițiile de măsurare sunt optime atunci când valoarea E2/B, indicele de calitate, este la maximum.

E = efficiency (eficiență)

B = background (zgomot de fond)

Numai două canale de măsurat se optimizează. Cel de-al treilea se lasă complet deschis pentru a permite controlul.

6.2.   Selecția flacoanelor contor

Se umplu mai multe flacoane contor decât vor fi necesare ulterior cu câte 10 ml de etanol de sinteză fără conținut de radiocarbon și 10 ml de scintilator cu toluen. Se măsoară fiecare pe parcursul a cel puțin 4 cicluri × 100 de minute. Se elimină flacoanele al căror zgomot de fond se abate cu mai mult de ± 1 % rel. de la medie. Se utilizează numai flacoane noi, provenite din același lot de fabricație.

6.3.   Determinarea raportului canal/standard extern (RCSE).

În timpul procesului de reglare a canalelor (punctul 6.1), RCSE se determină cu ajutorul programului de calcul corespunzător, atunci când se determină coeficientul de eficiență. Standardul extern utilizat este cesiu 137, deja integrat din fabricație.

6.4.   Pregătirea probei

Se pot măsura probele cu un conținut de etanol de cel puțin 85 % masă, fără impurități, cu o absorbanță sub 450 nm. Un reziduu slab de esteri și aldehide nu are un efect perturbator. Conținutul de alcool al probei este determinat în prealabil cu o aproximare de 0,1 %.

7.    Măsurarea probelor prin utilizarea unui standard extern

7.2.   Măsurare

Se introduc cu pipeta câte 10 ml din fiecare probă preparată în conformitate cu punctul 6.4 într-un flacon contor controlat pentru zgomot de fond și se adaugă 10 ml de scintilator cu toluen, cu ajutorul unui dispozitiv de dozare automată. Probele din flacoane se omogenizează prin mișcări circulare corespunzătoare; lichidul nu trebuie să umezească protecția interioară din polietilenă din dopul filetat. Se prepară în același mod un flacon cu etanol fosil fără conținut de radiocarbon pentru a se determina zgomotul de fond. Pentru a se verifica valoarea anuală relevantă a radiocarbonului, se prepară o probă duplicat din etanol produs recent, provenit din ultima perioadă de vegetație, amestecându-se un flacon cu standardul intern, a se vedea punctul 8.

Proba martor și proba pentru zgomot de fond se așază la începutul seriei de măsurători, care trebuie să conțină cel mult 10 probe de analiză. Timpul total de măsurare per probă este de cel puțin 2 × 100 de minute, probele individuale fiind măsurate în etape parțiale de 100 de minute fiecare, pentru a se permite detectarea eventualelor derive sau defecțiuni ale echipamentelor. (Așadar, un ciclu corespunde unui interval de măsurare de 100 de minute per probă.).

Probele martor și probele pentru zgomot de fond trebuie preparate din nou din patru în patru săptămâni.

În cazul probelor cu absorbanță ușor redusă (cu RCSE de aproximativ 1,8), eficiența este afectată doar neglijabil de modificarea acestei valori. În cazul în care modificarea se încadrează în intervalul ± 5 % rel., este probabil să se obțină aceeași eficiență. În cazul probelor cu absorbanță mai ridicată, cum ar fi alcoolii denaturați, eficiența se poate determina cu ajutorul graficului de corecție a absorbanței. În cazul în care nu există un program de calcul disponibil, trebuie să se utilizeze standardul intern, ceea ce conduce la un rezultat fără echivoc.

8.    Măsurarea probelor prin utilizarea unui standard intern hexadecan14C

8.1.   Procedură

Probele martor și probele pentru zgomot de fond (etanol produs recent și etanol fosil), precum și materialul necunoscut se măsoară fiecare în duplicat. O probă duplicat se prepară într-un flacon neselecționat, adăugându-se o cantitate dozată cu precizie (30 μl) de hexadecan radiocarbon ca standard intern (activitate suplimentară de aproximativ 26 269  dpm/gC, circa 43 782  cBq/gC). Pentru prepararea celorlalte probe și timpii de măsurare, a se vedea punctul 7.2, însă timpul de măsurare pentru probele cu standard intern poate fi redus la aproximativ cinci minute printr-un prereglaj la 105 impulsuri. Pe o serie de măsurători, se utilizează câte un duplicat al probei martor și al probei pentru zgomot de fond; acestea se așază la începutul seriei de măsurători.

8.2.   Utilizarea standardului intern și a flacoanelor contor

Pentru a se preveni contaminarea în cazul măsurărilor cu un standard intern, standardul trebuie depozitat și manipulat departe de spațiul în care se prepară și se măsoară probele pentru analiză. După măsurare, flacoanele controlate pentru zgomot de fond pot fi reutilizate. Dopurile filetate și tuburile care conțin standardul intern se elimină.

9.    Exprimarea rezultatelor

9.1.   Unitatea activității unei substanțe radioactive este becquerelul; 1 Bq = 1 dezintegrare/sec.

Indicarea radioactivității specifice se exprimă în becquereli în raport cu un gram de carbon = Bq/gC.

Pentru a se obține mai multe rezultate practice, acestea trebuie să fie exprimate în centibecquereli = cBq/gC.

Pot fi utilizate și descrierile și formulele utilizate în literatura de specialitate, bazate pe dpm. Pentru a obține valorile corespunzătoare în cBq, valoarea dpm se înmulțește cu 100/60.

9.2.   Exprimarea rezultatelor cu un standard extern

9.3.   Exprimarea rezultatelor cu un standard intern

9.4.   Abrevieri

cpmpr

=

media ratei de numărare a probelor, calculată pentru toată durata măsurării.

cpmNE

=

media ratei impulsurilor pentru zgomot de fond, calculată în același mod.

cpmIS

=

rata de numărare a probelor, cu un standard intern.

dpmIS

=

cantitatea de standard intern adăugată (radioactivitate etalonată dpm).

V

=

volumul probelor utilizate, în ml.

F

=

conținutul în grame de alcool pur per ml, în funcție de concentrație.

Z

=

coeficientul de eficiență corespunzător valorii RCSE.

1,918

=

numărul de grame de alcool per gram de carbon.

10.    Fiabilitatea metodei

10.1.   Repetabilitate (r)

r = 0,632 cBq/g C; S(r) = ± 0,223 cBq/g C

10.2.   Reproductibilitate (R)

R = 0,821 cBq/g C; S(R) = ± 0,290 cBq/g C.