---

LIITE

ANALYYTTISET VERTAILUMENETELMÄT SEURAAVILLE PARAMETREILLE:
	I
	II
	III
	III.1
	III.2
	III.3
	IV
	V
	VI
	VII
	VIII
	IX
▼M2
	X
▼M3
	XI
▼B

I   TISLATTUJEN ALKOHOLIJUOMIEN ALKOHOLIPITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN TILAVUUSPROSENTTINA

Johdanto

Vertailumenetelmäohje käsittää kaksi lisäystä:

Lisäys I : Tisleen valmistaminen

Lisäys II : Määritys tisleestä

1   Soveltamisala

Menetelmä soveltuu tislattujen alkoholijuomien todellisen alkoholipitoisuuden määrittämiseen tilavuusprosenttina.

2   Viittaukset säännöksiin ja määräyksiin

ISO 3696:1987: Analyyttiseen käyttöön tarkoitettu vesi — Laatuvaatimukset ja testausmenetelmät.

3   Termit ja määritelmät

3.1

Vertailulämpötila: Tislattujen alkoholijuomien alkoholipitoisuus tilavuusprosenttina sekä niiden tiheys ja ominaispaino määritetään 20 °C:n lämpötilassa. Huomautus 1: Termi ”t °C:n lämpötilassa” on varattu kaikille (tiheyden tai tilavuusprosenttina ilmaistun alkoholipitoisuuden) määrityksille, jotka ilmoitetaan muussa kuin vertailulämpötilassa 20 °C.

3.2	Tiheys: Tiheys tarkoittaa tislattujen alkoholijuomien massaa tilavuusyksikköä kohti tyhjiössä 20 °C:n lämpötilassa. Se ilmoitetaan kilogrammoina kuutiometriä kohti, ja sen symboli on ρ20 °C tai ρ20.

3.3

Ominaispaino: Ominaispaino on 20 °C:n lämpötilassa määritetyn tislatun alkoholijuoman tiheyden ja samassa lämpötilassa määritetyn veden tiheyden välinen suhde ilmaistuna desimaalilukuna. Siitä käytetään symbolia d20 °C/20 °C tai d20/20 tai yksinkertaisesti d-kirjainta, ellei väärinkäsityksen mahdollisuutta ilmene. Määritetty ominaisuus on mainittava määritystodistuksessa käyttäen ainoastaan edellä määriteltyjä symboleja. Huomautus 2: Ominaispaino voidaan saada 20 °C:n lämpötilassa määritetystä tiheydestä ρ20 seuraavasti: tai jolloin 998,203 on veden tiheys 20 °C:n lämpötilassa.

3.4

Todellinen alkoholipitoisuus tilavuusprosenttina: Tislattujen alkoholijuomien todellinen alkoholipitoisuus tilavuusprosenttina on yhtä kuin etanolin määrä litroina 100 litrassa sellaista vesi-alkoholiseosta, jolla on sama tiheys kuin alkoholilla tai alkoholijuomalla tislauksen jälkeen. Vertailuarvot, joita on käytettävä 20 °C:n lämpötilassa tilavuusprosenttina määritetyn alkoholipitoisuuden ja 20 °C:n lämpötilassa mitatun tiheyden suhteelle erilaisille vesi-alkoholiseoksille, annetaan kansainvälisessä taulukossa, jonka OIML (Organisation internationale de métrologie légale) on vahvistanut suosituksessaan nro 22. Yleinen yhtälö, jolla esitetään suhde tilavuusprosenttina ilmaistun alkoholipitoisuuden ja tiheyden välillä tietyssä lämpötilassa olevalle vesi-alkoholiseokselle, annetaan komission asetuksen (ETY) N:o 2676/90 liitteen sivulla 40 luvussa 3 ”Alkoholipitoisuus tilavuusprosenttina” (EYVL L 272, 3.10.1990, s. 1) tai kansainvälisen viinijärjestön (OIV) analyysimenetelmiä koskevassa käsikirjassa (1994) sivulla 17. Huomautus 3: Koska liköörien ja kermaliköörien tilavuutta on vaikea määrittää tarkasti, niiden osalta näyte on punnittava ja alkoholipitoisuus on laskettava ensin massaprosenttina. Muuntokaava: jossa ASM = alkoholipitoisuus massaprosenttina, ρ20 (alkoholi) = 789,24 kg/m3.

4   Periaate

Tislauksen jälkeen tisleen alkoholipitoisuus määritetään tilavuusprosenttina pyknometrillä, elektronisella tiheysmittarilla tai hydrostaattiseen vaakaan perustuvalla tiheysmittarilla.

LISÄYS I: TISLEEN VALMISTUS

1   Soveltamisala

Menetelmä soveltuu tisleiden valmistamiseksi tislattujen alkoholijuomien todellisen alkoholipitoisuuden määrittämiseksi tilavuusprosenttina.

2   Periaate

Alkoholijuomat tislataan etanolin ja muiden haihtuvien yhdisteiden erottamiseksi uutoksesta (aineista, jotka eivät tislaudu).

3   Reagenssit ja materiaalit

4   Laitteet ja välineet

Tavanomaiset laboratoriolaitteet ja erityisesti seuraavat:

Huomautus:

Edellä kuvatun laitteen on oltava tarkoitettu vähintään 200 ml:n näytteelle. Laitetta voidaan kuitenkin mukauttaa siten, että se soveltuu pienemmälle näyteannokselle, käyttämällä pienempää tislauskolvia edellyttäen, että käytetään roiskeenestokupua tai jotakin muuta laitetta estämään nesteen kulkeutuminen höyryn mukana.

5   Tutkittavan näytteen säilytys

Näytteet varastoidaan huoneenlämpötilassa ennen analyysiä.

6   Suoritus

Alkuhuomautus:

6.1	Tislauslaitteen testaaminen Käytettävän laitteen on läpäistävä seuraava koe: Kun laitteella tislataan 200 ml vesi-alkoholiliuosta, jonka konsentraatio on noin 50 tilavuusprosenttia alkoholia, alkoholihäviö saa olla enintään 0,1 tilavuusprosenttia.

6.2

Alle 50 tilavuusprosenttia alkoholia sisältävät tislatut alkoholijuomat Mittapulloon annostellaan 200 ml alkoholijuomaa. Tämän nesteen lämpötila kirjataan tai nestettä säilytetään vakiolämpötilassa (20 °C). Näyte kaadetaan tislauslaitteen pyörökolviin ja mittapullo huuhdellaan kolme kertaa käyttäen kullakin huuhtelukerralla noin 20 ml tislattua vettä. Kaikki huuhtelunesteet lisätään tislauskolviin. Huomautus: Tämä 60 ml:n laimennus on riittävä alkoholijuomille, jotka sisältävät vähemmän kuin 250 g kuiva-ainetta litraa kohti. Muutoin pyrolyysin estämiseksi huuhteluveden tilavuuden on oltava vähintään 70 ml, jos kuiva-aineen konsentraatio on 300 g/l, 85 ml, jos kuiva-aineen konsentraatio on 400 g/l, ja 100 ml, jos kuiva-aineen konsentraatio on 500 g/l (jotkut hedelmä- tai kermaliköörit). Nämä tilavuudet suhteutetaan näytetilavuuden mukaan. Lisätään joitakin keitinkiviä (3.1) (ja vaahdonestoainetta, jos kyseessä ovat kermaliköörit). Kaadetaan 20 ml tislattua vettä alkuperäiseen 200 ml:n mittapulloon, jota käytetään tisleen talteen ottamiseksi. Tämä pullo on sitten asetettava kylmään vesihauteeseen (4.1) (10—15 °C:n lämpötilaan, jos kyseessä on aniksella maustettu alkoholijuoma). Pullon sisältöä tislataan välttäen nesteen kulkeutumista höyryn mukana ja pohjaan palamista sekä sekoittaen pullon sisältöä säännöllisesti, kunnes tisleen pinta on muutamia millimetrejä mittapullon kalibrointimerkin alapuolella. Kun tämä tisle on jäähdytetty ± 0,5 °C:n päähän nesteen alkuperäisestä lämpötilasta, pullo täytetään merkkiin saakka tislatulla vedellä ja sen sisältöä sekoitetaan perusteellisesti. Tätä tislettä käytetään alkoholipitoisuuden määrittämiseksi tilavuusprosenttina (Lisäys II).

6.3

Yli 50 tilavuusprosenttia alkoholia sisältävät tislatut alkoholijuomat Annostellaan 100 ml:n mittapulloon 100 ml alkoholijuomaa ja kaadetaan se tislauslaitteen pyörökolviin. Mittapullo huuhdellaan useita kertoja tislatulla vedellä ja huuhtelunesteet lisätään pyörökolviin. Käytetään riittävä määrä vettä siten että kolvin sisällön tilavuudeksi saadaan noin 230 ml. 200 ml:n mittapulloon lisätään 20 ml tislattua vettä, johon tisle otetaan talteen. Mittapullo asetetaan sitten kylmään vesihauteeseen (4.1) (10—15 °C aniksella maustetuille alkoholijuomille). Kolvin sisältöä tislataan sekoittaen silloin tällöin, kunnes tisleen pinta on muutamia millimetrejä 200 ml:n mittapullon kalibrointimerkin alapuolella. Kun tämä tisle on jäähdytetty ± 0,5 °C:n päähän nesteen alkuperäisestä lämpötilasta, pullo täytetään merkkiin saakka tislatulla vedellä ja sen sisältöä sekoitetaan perusteellisesti. Tätä tislettä käytetään alkoholipitoisuuden määrittämiseksi tilavuudesta. (Lisäys II). Huomautus: Alkoholijuoman alkoholipitoisuus tilavuusprosenttina on kaksi kertaa tisleen alkoholipitoisuus.

LISÄYS II: TISLEEN TIHEYDEN MÄÄRITYS

MENETELMÄ A:   TISLATTUJEN ALKOHOLIJUOMIEN TODELLISEN ALKOHOLIPITOISUUDEN MÄÄRITYS TILAVUUSPROSENTTINA — MÄÄRITYS PYKNOMETRILLÄ

A.1   Periaate

Alkoholipitoisuus tilavuusprosenttina saadaan pyknometrillä määritetystä tisleen tiheydestä.

A.2   Reagenssit ja materiaalit

Ellei toisin mainita, analyysissä käytetään vain hyväksyttyä analyysilaatua olevia reagensseja ja vähintään kolmannen laatuluokan vettä standardin ISO 3696:1987 määritelmän mukaisesti.

A.2.1

Natriumkloridiliuos (2-prosenttinen, paino/tilavuus) Yksi litra natriumkloridiliuosta valmistetaan punnitsemalla 20 g natriumkloridia, joka liuotetaan yhteen litraan vettä.

A.3   Laitteet ja välineet

Tavanomaiset laboratoriolaitteet ja erityisesti seuraavat:

Huomautus 1:

Menetelmä tislattujen alkoholijuomien tiheyden määrittämiseksi tyhjiössä edellyttää kaksikuppivaa'an, pyknometrin ja ulkoiselta tilavuudeltaan pyknometrin kanssa samansuuruisen taarapullon käyttöä ilman nosteen korjaamiseksi. Tätä yksinkertaista tekniikkaa voidaan soveltaa käyttäen yksikuppivaakaa edellyttäen, että taarapullo punnitaan uudelleen ilman nosteessa tapahtuvien muutosten seuraamiseksi ajan kuluessa.

A.4   Suoritus

Alkuhuomautus:

A.4.1   Pyknometrin kalibrointi

Pyknometri kalibroidaan määrittämällä seuraavat parametrit:

A.4.1.1

Kalibrointi käyttäen yksikuppivaakaa: Määritetään seuraavat parametrit: —  puhtaan ja kuivan pyknometrin massa (P), —  vedellä täytetyn pyknometrin massa t °C:n lämpötilassa (P1), —  taarapullon massa (T0). A.4.1.1.1 Punnitaan puhdas ja kuiva pyknometri (P). A.4.1.1.2 Pyknometri täytetään huolellisesti huoneenlämpöisellä tislatulla vedellä ja lämpömittari asetetaan paikalleen. Pyknometri pyyhitään huolellisesti kuivaksi ja asetetaan lämpöeristetyn suojuksen sisälle. Säiliötä sekoitetaan kääntelemällä, kunnes lämpömittarin osoittama lämpötila pysyy muuttumattomana. Pyknometrin nestepinta säädetään samaan tasoon sivuputken yläreunan kanssa. Luetaan lämpötila t °C huolellisesti ja lukema korjataan tarvittaessa lämpöasteikon mahdollisen epätarkkuuden suhteen. Punnitaan vedellä täytetty pyknometri (P1). A.4.1.1.3 Punnitaan taarapullo (T0). A.4.1.1.4 Laskutoimitukset: —  Tyhjän pyknometrin taara = P – m jossa m on ilman massa pyknometrissä m = 0,0012 × (P1 – P) Huomautus 2: 0,0012 on kuivan ilman tiheys 20 °C:n lämpötilassa 760 mmHg:n paineessa. —  Pyknometrin tilavuus 20 °C:n lämpötilassa: jossa Ft on lämpötilan t °C kerroin, joka on saatu asetuksen (ETY) N:o 2676/90 liitteen luvun 1 ”Tiheys ja ominaispaino” taulukosta I (sivu 10). V20 °C on tunnettava 0,001 ml:n tarkkuudella. —  Veden massa pyknometrissä 20 °C:n lämpötilassa: jossa 0,998203 on veden tiheys 20 °C:n lämpötilassa. Huomautus 3: Tarvittaessa voidaan käyttää tiheyden arvoa ilmassa 0,99715 ja alkoholipitoisuus voidaan laskea Yhdistyneen kuningaskunnan tulliviranomaisten käyttämässä ilman tiheyttä koskevassa taulukossa ilmoitetun tiheyden mukaisesti. Tässä tapauksessa pyknometrin syrjäyttämän ilman massan korjausta ei tehdä.

A.4.1.2

Kalibrointimenetelmä käyttäen kaksikuppivaakaa: A.4.1.2.1  Taarapullo asetetaan vasemmanpuoleiseen vaakakuppiin ja puhdas, kuiva pyknometri paisuntasäiliöineen oikeanpuoleiseen vaakakuppiin. Lisätään punnuksia siihen vaakakuppiin, jossa pyknometri on, kunnes tasapaino on saavutettu: p grammaa. A.4.1.2.2  Pyknometri täytetään huolellisesti huoneenlämpöisellä tislatulla vedellä ja lämpömittari asetetaan paikalleen; pyknometri pyyhitään huolellisesti kuivaksi ja asetetaan lämpöeristetyn suojuksen sisälle; sekoitetaan säiliötä kääntelemällä, kunnes lämpömittarin osoittama lämpötila pysyy muuttumattomana. Pyknometrin nestepinta säädetään samaan tasoon sivuputken yläreunan kanssa. Sivuputki puhdistetaan ja paisuntasäiliö asetetaan paikalleen. Luetaan lämpötila t °C huolellisesti ja lukema korjataan tarvittaessa lämpöasteikon mahdollisen epätarkkuuden suhteen. Punnitaan vedellä täytetty pyknometri; p' on paino grammoina, kun tasapaino saavutetaan. A.4.1.2.3  Laskutoimitukset: —  Tyhjän pyknometrin taara = p + m jossa m on ilman massa pyknometrissä. m = 0,0012 × (p – p') —  Pyknometrin tilavuus 20 °C:n lämpötilassa: jossa Ft on lämpötilan t °C kerroin, joka on saatu asetuksen (ETY) N:o 2676/90 liitteen luvun 1 ”Tiheys ja ominaispaino” taulukosta I (sivu 10). V20 °C on tunnettava 0,001 ml:n tarkkuudella. —  Veden massa pyknometrissä 20 °C:n lämpötilassa: jossa 0,998203 on veden tiheys 20 °C:n lämpötilassa.

A.4.2   Tutkittavan näytteen alkoholipitoisuuden määrittäminen

A.5   Menetelmän suoritusarvot (mittaustarkkuus)

A.5.1   Laboratorioiden välisen testauksen tilastolliset tulokset

Seuraavat tulokset saatiin kansainvälisestä menetelmän suorituskykyä arvioivasta tutkimuksesta, joka toteutettiin kansainvälisesti hyväksyttyjen menetelmien [1] [2] mukaisesti.

MENETELMÄ B:   TISLATTUJEN ALKOHOLIJUOMIEN TODELLISEN ALKOHOLIPITOISUUDEN MÄÄRITYS TILAVUUSPROSENTTINA — MÄÄRITYS ELEKTRONISELLA TIHEYSMITTARILLA (NÄYTTEEN RESONANSSIVÄRÄHTELYTAAJUUDEN PERUSTEELLA VÄRÄHTELYKENNOSSA)

B.1   Periaate

Nesteen tiheys määritetään mittaamalla värähtelevän U-putken oskillointi elektronisesti. Tämän määrityksen suorittamiseksi näyte lisätään värähtelyjärjestelmään, jonka ominaisvärähtelytaajuutta lisätty massa tällöin muuttaa.

B.2   Reagenssit ja materiaalit

Ellei toisin mainita, analyysissä käytetään vain hyväksyttyä analyysilaatua olevia reagensseja ja vähintään kolmannen laatuluokan vettä standardin ISO 3696:1987 määritelmän mukaisesti.

B.3   Laitteet ja välineet

Tavanomaiset laboratoriolaitteet ja erityisesti seuraavat:

B.4   Suoritus

B.5   Menetelmän suoritusarvot (mittaustarkkuus)

B.5.1   Laboratorioiden välisen testauksen tilastolliset tulokset

Seuraavat tulokset saatiin kansainvälisestä menetelmän suorituskykyä arvioivasta tutkimuksesta, joka toteutettiin kansainvälisesti hyväksyttyjen menetelmien [1] [2] mukaisesti.

MENETELMÄ C:   TISLATTUJEN ALKOHOLIJUOMIEN TODELLISEN ALKOHOLIPITOISUUDEN MÄÄRITYS — MÄÄRITYS HYDROSTAATTISEEN VAAKAAN PERUSTUVALLA TIHEYSMITTARILLA

C.1   Periaate

Tislattujen alkoholijuomien alkoholipitoisuus voidaan määrittää hydrostaattiseen vaakaan perustuvalla tiheysmittarilla. Määritys perustuu Arkhimedeen lakiin, jonka mukaan nesteeseen upotettuun kappaleeseen kohdistuu nesteestä pystysuoraan ylöspäin vaikuttava noste, joka on kappaleen syrjäyttämän nestemäärän painon suuruinen.

C.2   Reagenssit ja materiaalit

Ellei toisin mainita, analyysissä käytetään vain hyväksyttyä analyysilaatua olevia reagensseja ja vähintään kolmannen laatuluokan vettä standardin ISO 3696:1987 määritelmän mukaisesti.

C.2.1   Uppokappaleen puhdistusliuos (natriumhydroksidi, 30-prosenttinen, paino/tilavuus)

Valmistettaessa 100 ml liuosta punnitaan 30 g natriumhydroksidia mittapulloon ja tilavuus täytetään 100 ml:ksi 96-prosenttisella etanolilla.

C.3   Laitteet ja välineet

Tavanomaiset laboratoriolaitteet ja erityisesti seuraavat:

Huomautus 1:

Kaksikuppivaa'an käyttö on myös mahdollista; periaate on kuvattu asetuksen (ETY) N:o 2676/90 liitteen luvussa 1 ”Tiheys ja ominaispaino” (sivu 7).

C.4   Suoritus

Uppokappale ja mittalasi on puhdistettava aina määritysten välillä tislatulla vedellä, kuivattava pehmeällä laboratoriopaperilla, josta ei irtoa kuituja, ja huuhdeltava liuoksella, jonka tiheys on tarkoitus määrittää. Haihtumalla tapahtuvan alkoholihäviön rajoittamiseksi määritykset on suoritettava heti kun laite on saavuttanut stabiilin tilan.

C.5   Menetelmän suoritusarvot (täsmällisyys)

C.5.1   Laboratorioiden välisen testauksen tilastolliset tulokset

Seuraavat tulokset saatiin kansainvälisestä menetelmän suorituskykyä arvioivasta tutkimuksesta, joka toteutettiin kansainvälisesti hyväksyttyjen menetelmien [1] [2] mukaisesti.

Kuva 1. Tislauslaite tislattujen alkoholijuomien todellisen alkoholipitoisuuden määrittämiseksi tilavuusprosenttina
1.Vakiopallohioksella varustettu pyörökolvi, jonka tilavuus on 1 litra.
2.20 cm:n Vigreux-väkevöimiskolonni.
3.10 cm:n pituinen suorareunainen West-jäähdytin.
4.40 cm:n jäähdytyskierukka.

II   KUIVA-AINEEN KOKONAISMÄÄRÄN GRAVIMETRINEN MÄÄRITYS

1   Soveltamisala

Asetuksessa (ETY) N:o 1576/89 säädetään tämän menetelmän käyttö vain akvaviitille, jonka kuiva-ainepitoisuus on rajoitettu 15 g:aan litraa kohti.

2   Viittaukset säännöksiin ja määräyksiin

ISO 3696:1987: Analyyttiseen käyttöön tarkoitettu vesi — Laatuvaatimukset ja testimenetelmät

3   Määritelmä

Kuiva-aineen kokonaismäärään sisältyy kaikki sellainen aine, joka ei haihdu tietyissä fysikaalisissa olosuhteissa.

4   Periaate

Punnitaan jäännös, joka saadaan, kun tislattu alkoholijuoma on haihdutettu kuiviin kiehuvalla vesihauteella ja kuivattu kuivausuunissa.

5   Laitteet ja välineet

6   Näytteenotto ja näytteet

Näytteet varastoidaan huoneenlämpötilassa ennen analyysiä.

7   Suoritus

8   Laskutoimitus

Jäännöksen massa kerrottuna luvulla 40 vastaa tislatun alkoholijuoman sisältämää kuiva-aineen määrää. Tämä arvo on ilmoitettava grammoina litraa kohti (g/l) yhden desimaalin tarkkuudella.

9   Menetelmän suoritusarvot (mittaustarkkuus)

9.1   Laboratorioiden välisen testauksen tilastolliset tulokset

Seuraavat tulokset saatiin kansainvälisestä menetelmän suorituskykyä arvioivasta tutkimuksesta, joka toteutettiin kansainvälisesti hyväksyttyjen menetelmien [1] [2] mukaisesti.

III   HAIHTUVIEN AINEIDEN JA METANOLIN MÄÄRITYS

III.1   YLEISET HUOMAUTUKSET

1   Määritelmät

Direktiivissä (ETY) N:o 1576/89 asetetaan etanolia ja metanolia lukuun ottamatta haihtuvien yhdisteiden vähimmäispitoisuudet tietylle tislattujen alkoholijuomien ryhmälle (rommi, viinirypäleistä peräisin olevat tislatut alkoholijuomat, tislatut hedelmäalkoholit ja niin edelleen). Tässä juomaryhmässä näiden pitoisuuksien on katsottu olevan perinteisesti seuraavassa lueteltujen aineiden konsentraatioiden summa:

Seuraavat menetelmät ovat haihtuvien yhdisteiden määrittämiseen tarkoitettuja perinteisiä menetelmiä:

2   Haihtuvien yhdisteiden kaasukromatografinen analyysi

Muiden kuin edellä mainittujen haihtuvien yhdisteiden kaasukromatografiset analyysit saattavat osoittautua erityisen kiinnostaviksi sekä tislauksessa käytetyn raaka-aineen alkuperän että tislauksen todellisten olosuhteiden määrittämiseksi.

Jotkut tislatut alkoholijuomat sisältävät muita haihtuvia aineosia, kuten aromaattisia yhdisteitä, jotka ovat tunnusomaisia alkoholin valmistuksessa käytetyille raaka-aineille, tislatun alkoholijuoman aromiaineille ja tislatun alkoholijuoman valmistukseen liittyville erityispiirteille. Nämä yhdisteet ovat tärkeitä asetuksessa (ETY) N:o 1576/89 säädettyjen vaatimusten arvioimiseksi.

III.2   TISLATUISSA ALKOHOLIJUOMISSA ESIINTYVIEN HAIHTUVIEN AROMIYHDISTEIDEN KAASUKROMATOGRAFINEN MÄÄRITTÄMINEN

1   Soveltamisala

Tämä menetelmä soveltuu käytettäväksi tislatuissa alkoholijuomissa esiintyvien 1,1-dietoksietaanin (asetaalin), 2-metyyli-1-butanolin (amyylialkoholin), 3-metyyli-1-butanolin (isoamyylialkoholin), metanolin (metyylialkoholin), etyylietanoaatin (etyyliasetaatin), 1-butanolin (n-butanolin), 2-butanolin (sek-butanolin), 2-metyyli-1-propanolin (isobutyylialkoholin), 1-propanolin (n-propanolin) ja etanaalin (asetaldehydin) kaasukromatografiseen määrittämiseen. Menetelmässä käytetään sisäistä standardia, esimerkiksi 3-pentanolia. Analyyttien konsentraatiot ilmoitetaan grammoina 100 litraa kohti absoluuttista alkoholia; tuotteen alkoholipitoisuus on määritettävä ennen analyysiä. Tislattuja alkoholijuomia, jotka voidaan analysoida tällä menetelmällä, ovat viski, brandy, rommi, viinistä tislattu alkoholi, hedelmistä tislattu alkoholi ja rypäleiden puristusjätteestä tislattu alkoholi.

2   Viittaukset säännöksiin ja määräyksiin

ISO 3696:1987: Analyyttiseen käyttöön tarkoitettu vesi — Laatuvaatimukset ja testimenetelmät.

3   Määritelmä

Haihtuvat aromiyhdisteet ovat haihtuvia yhdisteitä, joita muodostuu etanolin ohella tislattujen alkoholijuomien käymisen, tislauksen ja kypsyttämisen aikana.

4   Periaate

Tislattujen alkoholijuomien haihtuvat aromiyhdisteet määritetään injektoimalla alkoholijuomaa tai sopivasti laimennettua alkoholijuomaa suoraan kaasukromatografiajärjestelmään. Alkoholijuomaan lisätään sopiva sisäinen standardi ennen ruiskuttamista. Yhdisteet erotetaan lämpötilaohjelmoinnin avulla sopivassa kolonnissa ja ne havaitaan liekki-ionisaatiodetektorilla (FID). Kunkin yhdisteen konsentraatio määritetään suhteessa sisäiseen standardiin niiden vastetekijöiden avulla, jotka on saatu kalibroinnissa ennalta määrätyissä kromatografisissa olosuhteissa, joiden on oltava samanlaiset kuin kyseisen alkoholijuoman kromatografiaolosuhteet.

5   Reagenssit ja materiaalit

Ellei toisin mainita, käytetään vain ISO-akkreditoidulta tavarantoimittajalta hankittuja reagensseja, joilla on puhtaustodistus, joiden puhtaus on yli 97 prosenttia ja jotka eivät sisällä muita haihtuvia aromiyhdisteitä, kun niitä käytetään kokeen vaatimassa laimennuksessa (tämä voidaan varmistaa injisoimalla yksittäiset aromiyhdisteiden standardit kokeessa käytettävinä laimennuksina kohdassa 6.4 esitetyissä kaasukromatografiaolosuhteissa), ja vain vähintään kolmannen laatuluokan vettä standardin ISO 3696 määritelmän mukaisesti. Asetaali ja asetaldehydi on säilytettävä pimeässä < 5 °C:n lämpötilassa. Kaikkia muita reagensseja voidaan säilyttää huoneenlämpötilassa.

▼M3

▼B

6   Laitteet ja välineet

7   Näytteenotto ja näytteet

8   Suoritus (validoidussa menetelmässä käytetty menettely)

9   Laskutoimitus

Automaattista tietojenkäsittelyjärjestelmää voidaan käyttää edellyttäen, että tiedot voidaan tarkistaa seuraavassa menetelmässä kuvattujen periaatteiden mukaisesti.

Mitataan yhdisteen ja sisäisen standardin piikin ala tai korkeus

10   Laadunvarmistus ja valvonta (käytetty validoidussa menetelmässä)

Lasketaan edellä esitetyn yhtälön (2) mukaisesti yhdisteiden konsentraatio laadunvalvontastandardeissa, jotka on valmistettu noudattaen kohdissa 8.1.1—8.1.4 esitettyä menettelyä. Lasketaan yhtälön (3) mukaisesti saanto prosentteina. Jos yhdisteiden analyysitulokset poikkeavat enintään ± 10 prosenttia teoreettisista arvoista, määrityksiä voidaan jatkaa. Ellei näin ole, epätarkkuuteen johtaneet syyt tulee selvittää ja asiaankuuluvat parannukset tulee tehdä.

11   Menetelmän suoritusarvot (mittaustarkkuus)

Laboratorioiden välisen testauksen tilastolliset tulokset: Seuraavissa taulukoissa esitetään seuraavia yhdisteitä koskevat tulokset: etanoli, etyyliasetaatti, asetaali, etanolin kokonaismäärä, metanoli, 2-butanoli, 1-propanoli, 1-butanoli, 2-metyyli-1-propanoli, 2-metyyli-1-butanoli, 3-metyyli-1-butanoli.

Seuraavat tulokset saatiin kansainvälisestä menetelmän suorituskykyä arvioivasta tutkimuksesta, joka toteutettiin kansainvälisesti hyväksyttyjen menetelmien mukaisesti.

▼M2

III.3   TISLATTUJEN ALKOHOLIJUOMIEN HAIHTUVIEN HAPPOJEN MÄÄRITYS

1.    Soveltamisala

Menetelmä on validoitu laboratorioiden välisessä tutkimuksessa rommille, brandylle, marcille ja hedelmäviinoille tasoilla 30–641 mg/l.

2.    Viittaukset säännöksiin ja määräyksiin

ISO 3696: 1987 Analyyttiseen käyttöön tarkoitettu vesi – Määritelmä ja testimenetelmät

3.    Määritelmät

3.1	Haihtuva happoisuus lasketaan vähentämällä kokonaishappopitoisuudesta haihtumaton happoisuus.

3.2	Kokonaishappopitoisuudella tarkoitetaan titrattavien happojen yhteismäärää.

3.3	Haihtumaton happoisuus on sen jäännöksen happopitoisuus, joka saadaan kun tislattu alkoholijuoma on haihdutettu kuiviin.

4.    Periaate

Kokonaishappopitoisuus ja haihtumaton happoisuus määritetään titraamalla tai potentiometrisesti.

5.    Reagenssit ja materiaalit

Ellei toisin mainita, analyysissä käytetään vain hyväksyttyä analyysilaatua olevia reagensseja ja vähintään kolmannen laatuluokan vettä standardin ISO 3696:1987 määritelmän mukaisesti.

5.1	0,01 M natriumhydroksidiliuos (NaOH)

5.2	Indikaattoriliuosseos: Punnitaan 0,1 g indigokarmiinia ja 0,1 g fenolipunaista. Liuotetaan 40 ml:aan vettä ja täytetään 100 ml:aan etanolilla.

6.    Laitteet ja välineet

Välilliset laboratoriolaitteet, laatuluokan A mittalaseja ja seuraavat:

7.    Näytteenotto ja näytteet

Näytteet varastoidaan huoneenlämpötilassa ennen analyysiä.

8.    Suoritus

8.1   Kokonaishappopitoisuus

8.1.1   Näytteen valmistaminen

Tislattu alkoholijuoma säteilytetään ultraäänellä (ultraäänikäsittely) tai sitä sekoitetaan kaksi minuuttia vakuumissa mahdollisen hiilihapon poistamiseksi.

8.1.2   Titraus

Pipetoidaan 25 ml tislattua alkoholia 500 ml:n erlenmeyerpulloon.

Lisätään noin 200 ml jäähdytettyä keitettyä tislattua vettä (valmistetaan tuoreena päivittäin) ja 2–6 tippaa indikaattoriliuosseosta (5.2).

Titrataan 0,01 M natriumhydroksidiliuoksella (5.1), kunnes värittömän tislatun alkoholijuoman väri muuttuu kellanvihreästä violetiksi ja ruskean tislatun alkoholijuoman väri muuttuu kellanruskeasta punaisenruskeaksi.

Titraus voidaan tehdä myös potentiometrisesti pH 7,5:een.

Käytetyn 0,01 M natriumhydroksidiliuoksen tilavuus on n1 ml.

8.1.3   Laskutoimitus

Kokonaishappopitoisuus (TA), joka ilmaistaan milliekvivalentteina litrassa tislattua alkoholijuomaa, on 0,4 × n1.

Kokonaishappopitoisuus (TA′), joka ilmaistaan milligrammoina etikkahappoa litrassa tislattua alkoholijuomaa, on 24 × n1.

8.2   Haihtumattomat hapot

8.2.1   Näytteen valmistaminen

Haihdutetaan 25 ml tislattua alkoholijuomaa kuiviin:

8.2.2   Titraus

Liuotetaan haihduttamalla saatu jäännös jäähdytettyyn keitettyyn veteen (valmistetaan tuoreena päivittäin), saatetaan se noin 100 ml:aan ja lisätään 2–6 tippaa indikaattoriliuosseosta (5.2).

Titrataan 0,01 M natriumhydroksidiliuoksella (5.1).

Titraus voidaan tehdä myös potentiometrisesti pH 7,5:een.

Käytetyn 0,01 M natriumhydroksidiliuoksen tilavuus on n2 ml.

8.2.3   Laskutoimitus

Haihtumaton happoisuus (FA), joka ilmaistaan milliekvivalentteina litrassa tislattua alkoholijuomaa, on 0,4 × n2.

Haihtumaton happoisuus (FA), joka ilmaistaan milligrammoina etikkahappoa litrassa tislattua alkoholijuomaa, on 24 × n2.

9.    Haihtuvan happoisuuden laskenta

9.1	Ilmaistuna milliekvivalentteina litrassa: Olkoon: TA = kokonaishappopitoisuus milliekvivalentteina litrassa FA = haihtumaton happoisuus milliekvivalentteina litrassa Haihtuva happoisuus (VA) milliekvivalentteina litrassa on yhtä suuri kuin TA – FA

9.2	Ilmaistuna milligrammoina etikkahappoa litrassa: Olkoon: TA′ = kokonaishappopitoisuus milligrammoina etikkahappoa litrassa FA′ = haihtumaton happoisuus milligrammoina etikkahappoa litrassa Haihtuva happoisuus (VA) milligrammoina etikkahappoa litrassa on yhtä suuri kuin TA′ – FA′

9.3	Ilmaistuna grammoina etikkahappoa hehtolitrassa puhdasta 100 til.- %:n alkoholia on yhtä suuri kuin: jossa A on tislatun alkoholijuoman alkoholipitoisuus tilavuusprosentteina.

10.    Menetelmän suoritusarvot (mittaustarkkuus)

10.1   Laboratorioiden välisen testauksen tilastolliset tulokset

Seuraavat tulokset saatiin kansainvälisestä menetelmän suorituskykyä arvioivasta tutkimuksesta, joka toteutettiin kansainvälisesti hyväksyttyjen menetelmien [1] [2] mukaisesti.

Näytetyypit:

A.	Luumuviina; rinnakkaisnäytteet, joista toiseen on lisätty analyyttiä *

B.	Rommi I; rinnakkaiset sokkonäytteet

C.	Rommi II; rinnakkaisnäytteet, joista toiseen on lisätty analyyttiä *

D.	Slivovitz; rinnakkaiset sokkonäytteet

E.	Brandy; rinnakkaiset sokkonäytteet

F.	Puristejäännöksestä tislattu väkevä alkoholijuoma; rinnakkaiset sokkonäytteet

▼M1

V   ANETOLI. TISLATTUJEN ALKOHOLIJUOMIEN TRANS-ANETOLIN KAASUKROMATOGRAFINEN MÄÄRITYS

1   Soveltamisala

Tämä menetelmä soveltuu trans-anetolin määrittämiseen aniksella maustetuista tislatuista alkoholijuomista kapillaarikaasukromatografian avulla.

2   Viittaukset säännöksiin ja määräyksiin

ISO 3696: 1987 Analyyttiseen laboratoriokäyttöön tarkoitettu vesi — Määritelmä ja testimenetelmät

3   Periaate

Tislatun alkoholijuoman trans-anetolikonsentraatio määritetään kaasukromatografisesti. Testattavaan näytteeseen ja konsentraatioltaan tunnettuun vertailuliuokseen lisätään sama määrä sisäistä standardia, esimerkiksi 4-allyylianisolia (estragolia), kun näytteessä ei ole luonnostaan estragolia. Molemmat liuokset laimennetaan 45 % vol etanoliliuoksella ja injektoidaan suoraan kaasukromatografiin. Runsaasti sokereita sisältävät liköörit on uutettava ennen näytteenvalmistusta ja analyysia.

4   Reagenssit ja materiaalit

Analyysissä käytettyjen reagenssien puhtausasteen on oltava vähintään 98 %. Analyysissä käytetään vain standardin ISO 3696 mukaista vähintään kolmannen laatuluokan vettä.

Vertailukemikaalit on säilytettävä kylmässä (noin 4 oC), pimeässä, alumiinisäiliöissä tai tummissa lasisissa reagenssipulloissa. Tulpissa käytetään mielellään alumiinitiivistettä. Trans-anetoli täytyy ”sulattaa” kiteisestä muodostaan ennen käyttöä, mutta tällöin sen lämpötila ei saa missään vaiheessa ylittää 35 oC:ta.

4.1	96 % vol etanoli (CAS 64-17-5)

4.2	1-metoksi-4-(1-propenyyli)bentseeni; (trans-anetoli) (CAS 4180-23-8)

4.3	4-allyylianisoli, (estragoli) (CAS 140-67-0), ehdotetaan käytettäväksi sisäisenä standardina

4.4	45 % vol etanoli Lisätään 560 g tislattua vettä 378 g:aan 96 % vol etanolia.

4.5

Standardiliuosten valmistaminen Standardiliuoksia säilytetään huoneenlämpötilassa (15–35 oC) pimeässä, alumiinisäiliöissä tai tummissa lasisissa reagenssipulloissa. Tulpassa on oltava mielellään alumiinitiiviste. Trans-anetoli ja 4-allyylianisoli ovat käytännössä veteen liukenemattomia, ja sen vuoksi trans-anetoli ja 4-allyylianisoli täytyy liuottaa pieneen määrään 96 % vol etanolia (4.1) ennen 45 % vol etanolin (4.4) lisäämistä. Varastoliuokset tulee valmistaa uudelleen aina viikon välein. 4.5.1   Standardiliuos A Trans-anetolin varastoliuos (konsentraatio: 2 g/l) Punnitaan 40 mg trans-anetolia (4.2) 20 ml:n mittapulloon (tai 400 mg 200 ml:n pulloon ja niin edelleen). Lisätään hieman 96 % vol etanolia (4.1) ja täytetään tilavuuteen 45 % vol etanolilla (4.4). Sekoitetaan perusteellisesti. 4.5.2   Sisäinen standardi, liuos B Sisäisen standardin, esimerkiksi estragolin varastoliuos (konsentraatio: 2 g/l). Punnitaan 40 mg estragolia (4.3) 20 ml:n mittapulloon (400 mg 200 ml:n pulloon ja niin edelleen). Lisätään hieman 96 % vol etanolia (4.1) ja täytetään tilavuuteen 45 % vol etanolilla (4.4). Sekoitetaan perusteellisesti. 4.5.3   Liekki-ionisaatiodetektorin (FID) vasteen lineaarisuuden tarkistamiseksi käytettävät liuokset Liekki-ionisaatiodetektorin vasteen lineaarisuus on tarkistettava konsentraatioalueella, joka vastaa tislattujen juomien anetolipitoisuutta 0 grammasta litrassa 2,5 grammaan litrassa. Analyysiä tehtäessä analysoitavien tislattujen alkoholijuomien näytteet laimennetaan kymmenkertaisesti (8.3). Menetelmässä kuvattuun analyysiin tarvittavat lineaarisuusstandardiliuokset, jotka vastaavat analysoitavan näytteen trans-anetolikonsentraatioita 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 ja 0,25 g/l, valmistetaan seuraavasti: otetaan 0,5, 1, 1,5, 2 ja 2,5 ml varastoliuosta A (4.5.1) ja pipetoidaan ne erillisiin 20 ml:n mittapulloihin. Pipetoidaan kuhunkin pulloon 2 ml sisäistä standardiliuosta B (4.5.2). Täytetään merkkiviivaan 45 % vol etanolilla (4.4) ja pullojen sisältö sekoitetaan perusteellisesti. Nollaliuosta (8.4) käytetään 0 g/l -liuoksena. 4.5.4   Standardilious C Pipetoidaan 2 ml standardiliuosta A (4.5.1) 20 ml:n mittapulloon. Lisätään 2 ml sisäistä standardia, liuosta B (4.5.2) ja täytetään merkkiin 45 % vol etanolilla (4.4). Sekoitetaan perusteellisesti.

5   Laitteet ja välineet

6   Kromatografian ajo-olosuhteet

Kolonnin tyypin ja dimensioiden sekä kaasukromatografin ajo-olosuhteiden tulee olla sellaiset, että anetoli ja sisäinen standardi erottuvat toisistaan ja mahdollisista mittausta häiritsevistä yhdisteistä. Esimerkissä 5.3 esitetyn kolonnin tyypilliset olosuhteet ovat seuraavat:

7   Näytteet

Näytteet on säilytettävä huoneenlämpötilassa suojassa valolta ja kylmältä.

8   Mittauksen suoritus

8.1   Estragolin tutkiminen näytteestä

Jotta voidaan varmistua siitä, ettei näytteessä ole luonnostaan estragolia, näyte analysoidaan sisäistä standardia lisäämättä. Jos näytteessä on luonnostaan estragolia, täytyy valita jokin toinen sisäinen standardi (esimerkiksi mentoli).

Pipetoidaan 2 ml näytettä 20 ml:n mittapulloon ja tilavuus täytetään merkkiin 45 % vol etanolilla (4.4). Sekoitetaan perusteellisesti.

8.2   Tutkittavien näytteiden valmistaminen

Pipetoidaan 2 ml näytettä 20 ml:n mittapulloon ja lisätään 2 ml sisäistä standardia, liuosta B (4.5.2). Täytetään merkkiin 45 % vol etanolilla (4.4) ja pullon sisältö sekoitetaan perusteellisesti.

8.3   Nollanäyte

Pipetoidaan 2 ml sisäistä standardia, liuosta B (4.5.2) 20 ml:n mittapulloon ja täytetään merkkiin 45 % vol etanolilla (4.4). Sekoitetaan perusteellisesti.

8.4   Lineaarisuuden testaus

Ennen analyysin aloittamista tulee varmistaa liekki-ionisaatiodetektorin (FID) vasteen lineaarisuus analysoimalla peräkkäin kolme rinnakkaisnäytettä kustakin lineaarisuusstandardiliuoksesta (4.5.3).

Integraattorin piikkien pinta-alojen tai piikkien korkeuksien perusteella piirretään kuvaaja, jonka akseleina on standardin emoliuoksen konsentraatio (g/l) ja suhdeluku R.

R = trans-anetolipiikin korkeus tai pinta-ala jaettuna estragolipiikin korkeudella tai pinta-alalla.

Kuvaajan pitäisi olla lineaarinen.

8.5   Määrittäminen

Injektoidaan nollanäyte (8.3), sen jälkeen standardiliuos C (4.5.4), sen jälkeen yksi lineaarisuusstandardi (4.5.3), joka toimii laadunvalvontanäytteenä (se voidaan valita tutkittavan näytteen todennäköisen trans-anetolipitoisuuden mukaan), sitten viisi tutkittavaa näytettä (8.2). Jokaisen viiden tutkittavan näytteen jälkeen injektoidaan lineaarisuusnäyte (laadunvalvontanäyte) analyysin stabiiliuden varmistamiseksi.

9   Vastekertoimen laskeminen

Mitataan joko piikkien pinta-alat (integraattorin tai tietojenkäsittelyjärjestelmän avulla) tai piikkien korkeudet (manuaalinen määritys) trans-anetolin ja sisäisen standardin piikeille.

9.1   Vastekertoimen (RFi) laskeminen

Vastekerroin lasketaan seuraavasti:

missä:

Ci	on trans-anetolin konsentraatio standardiliuos A:ssa (4.5.1)

Cis	on sisäisen standardin konsentraatio standardiliuos B:ssä (4.5.2)

pinta-ala i

on trans-anetolin piikin pinta-ala (tai korkeus)

pinta-ala is

on sisäisen standardin piikin pinta-ala (tai korkeus)

RFi lasketaan standardiliuoksen C (4.5.4) viidestä rinnakkaismäärityksestä.

9.2   Vasteen lineaarisuuden tutkimiseen käytettävien lineaarisuusstandardien analysointi

Injektoidaan lineaarisuusstandardiliuokset (4.5.3).

9.3   Näytteen analysointi

Injektoidaan tutkittava näyteliuos (8.2).

10   Tulosten laskeminen

Trans-anetolin konsentraatio lasketaan seuraavasta kaavasta:

missä:

ci	on tutkittavan näytteen trans-anetolikonsentraatio

Cis	on sisäisen standardin konsentraatio standardiliuos B:ssä (4.5.2)

Pinta-ala tai korkeusi

on trans-anetolin piikin pinta-ala tai korkeus

Pinta-ala tai korkeusis

on sisäisen standardin piikin pinta-ala tai korkeus

RFi	on vastekerroin (laskettu kohdan 9.1 mukaisesti)

Trans-anetolikonsentraatio ilmoitetaan grammoina litrassa yhden desimaalin tarkkuudella.

11   Laadunvarmistus ja laadunvalvonta

Kromatogrammien tulee olla sellaiset, että anetoli ja sisäinen standardi erottuvat toisistaan ja mahdollisista mittausta häiritsevistä yhdisteistä. RFi-arvo lasketaan standardiliuoksen C (4.5.4) viidestä rinnakkaismäärityksestä. Jos variaatiokerroin (CV % = (keskihajonta/keskiarvo)*100)) on välillä ± 1 %, RFi:n keskiarvo hyväksytään.

Edellä olevaa laskutoimitusta on käytettävä laadunvalvontanäytteen trans-anetolin konsentraation laskemiseen.

Jos laadunvalvontanäytteen tuloksista laskettu keskiarvo poikkeaa vähemmän kuin ± 2,5 % sen teoreettisesta arvosta, tutkittavien näytteiden tulokset voidaan hyväksyä.

12   Runsaasti sokeria sisältävän alkoholinäytteen ja liköörinäytteen käsittely ennen kaasukromatografianalyysiä

Alkoholi on uutettava runsaasti sokeria sisältävästä alkoholipitoisesta juomasta, jotta trans-anetolikonsentraatio voidaan analysoida kapillaarikaasukromatografisesti.

12.1   Periaate

Otetaan liköörinäytteestä määräosuus ja lisätään siihen sisäinen standardi, jonka pitoisuus on samaa suuruusluokkaa kuin trans-anetolin pitoisuus liköörissä. Näytteeseen lisätään natriumfosfaatin dodekahydraattia ja vedetöntä ammoniumsulfaattia. Saatu seos ravistetaan hyvin ja jäähdytetään, jolloin syntyy kaksi kerrosta. Näistä ylempi, alkoholikerros, otetaan talteen. Tästä alkoholikerroksesta otetaan määräosuus, joka laimennetaan 45 % vol etanolilla (4.4) (huomautus: tässä vaiheessa ei lisätä sisäistä standardia, koska se on jo lisätty). Saatu liuos analysoidaan kaasukromatografisesti.

12.2   Reagenssit ja materiaalit

Uutossa käytetään vain reagensseja, joiden puhtaus on vähintään 99 %.

12.3   Laitteet ja välineet

Erlenmeyerkolveja, jääkaappi.

12.4   Suoritus

12.4.1   Estragolin tutkiminen näytteestä

Jotta voidaan varmistua siitä, ettei näytteessä ole luonnostaan estragolia, tehdään nollauutto (12.4.2), jossa näyte analysoidaan ilman sisäistä standardia. Jos näytteessä on luonnostaan estragolia, täytyy valita jokin toinen sisäinen standardi.

12.4.2   Uutto

Pipetoidaan 5 ml 96 % vol etanolia (4.1) erlenmeyerkolviin, punnitaan samaan kolviin 50 mg sisäistä standardia (4.3) ja lisätään 50 ml näytettä. Lisätään 12 g vedetöntä ammoniumsulfaattia (12.2.1) ja 8,6 g kaksiemäksistä natriumfosfaatin dodekahydraattia (12.2.2). Suljetaan erlenmeyerkolvi tulpalla.

Ravistetaan kolvia vähintään 30 minuutin ajan. Mekaanista ravistuslaitetta voidaan käyttää, ei kuitenkaan teflonpinnoitettua magneettisauvaa, koska osa trans-anetolista imeytyy tefloniin. Huomaa, että liuokseen lisätyt suolat eivät liukene täysin.

Suljettu kolvi pannaan jääkaappiin (T < 5 oC) vähintään kahden tunnin ajaksi.

Tämän jälkeen pullossa pitää olla kaksi selvästi erillistä kerrosta ja kiinteä jäännös. Alkoholikerroksen tulee olla kirkas. Jos se ei ole kirkas, pullo pannaan takaisin jääkaappiin, kunnes kerrokset ovat erottuneet selvästi.

Kun alkoholikerros on kirkas, otetaan siitä varovasti määräosuus (esimerkiksi 10 ml) ja varotaan koskemasta vesikerrokseen. Määräosuus pannaan tummaan pulloon, joka suljetaan huolella.

12.4.3   Analysoitavan uuttonäytteen valmistaminen

Uutteen (12.4.2) annetaan lämmetä huoneenlämpötilaan.

Otetaan 2 ml huoneenlämpötilaan temperoitua uutetta ja pipetoidaan se 20 ml:n mittapulloon. Täytetään merkkiin 45 % vol etanolilla (4.4) ja sekoitetaan huolellisesti.

12.5   Määrittäminen

Noudatetaan kohdassa 8.5 esitettyä menettelyä.

12.6   Tulosten laskeminen

Tulokset lasketaan seuraavan kaavan avulla:

missä:

mis	on kohdassa (12.4.2) punnitun sisäisen standardin (4.3) määrä (mg)

V	on tutkittavan näytteen tilavuus (50 ml)

RFi	on vastekerroin (9.1)

pinta-alai

on trans-anetolin piikin pinta-ala

pinta-alais

on sisäisen standardin piikin pinta-ala

Tulokset ilmoitetaan grammoina litrassa yhden desimaalin tarkkuudella.

12.7   Laadunvarmistus ja laadunvalvonta

Noudatetaan kohdassa 11 esitettyä menettelyä.

13   Menetelmän suorituskykyä kuvaavat ominaisuudet (tarkkuus)

Laboratorioiden välisen testauksen tilastolliset tulokset:

VI   GLYSYRRITSIINIHAPPO. GLYSYRRITSIINIHAPON MÄÄRITTÄMINEN NESTEKROMATOGRAFISESTI

1   Soveltamisala

Tämä menetelmä soveltuu glysyrritsiinihapon määrittämiseen aniksella maustetuista tislatuista alkoholijuomista korkean suorituskyvyn nestekromatografian (HPLC) avulla. Neuvoston asetuksessa (ETY) N:o 1576/89 täsmennetään, että aniksella maustetun tislatun alkoholijuoman tulee sisältää glysyrritsiinihappoa vähintään 0,05 ja enintään 0,5 grammaa litrassa, jotta siitä voidaan käyttää nimitystä ”pastis”.

2   Viittaukset säännöksiin ja määräyksiin

ISO 3696: 1987 Analyyttiseen laboratoriokäyttöön tarkoitettu vesi — Määritelmä ja testimenetelmät

3   Periaate

Glysyrritsiinihapon konsentraatio määritetään nestekromatografisesti (HPLC) UV-detektion avulla. Standardiliuos ja testattava näyte suodatetaan ja ne injektoidaan suoraan nestekromatografiin.

4   Reagenssit ja materiaalit

Analyysissä käytetään vain HPLC-laadun reagensseja, absoluuttista etanolia ja standardin ISO 3696 mukaista vähintään kolmannen laatuluokan vettä.

4.1	96 % vol etanoli (CAS 64-17-5)

4.2	Ammoniumglysyrritsinaatti, C42H62O16.NH3 (glysyrritsiinihapon ammoniumsuola) (Molekyylipaino 839.98) (CAS 53956-04-0): puhtaus vähintään 90 %. (glysyrritsiinihapon molekyylipaino 822,94)

4.3	Jääetikka, CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.4	Metanoli, CH3OH (CAS 67-56-1)

4.5	50 % vol etanoli 1 000  ml:aa varten (20 °C): —  96 % vol etanolia (4.1): 521 ml —  vettä (2.0): 511 ml.

4.6

HPLC-eluenttien valmistus. 4.6.1   Eluentti A (esimerkki) 80 tilavuusosaa vettä (2.0) 20 tilavuusosaa jääetikkaa (4.3). Poistetaan kaasut eluentista viiden minuutin ajan. Huomaa: Jos käytettävää vettä ei ole mikrosuodatettu, on suositeltavaa suodattaa valmistettu eluentti orgaanisten liuottimien suodattimella, jonka huokoskoko on 0,45 μm tai pienempi. 4.6.2   Eluentti B Metanoli (4.4)

4.7

Standardiliuosten valmistaminen Kaikki standardiliuokset täytyy uusia kahden kuukauden välein. 4.7.1   Vertailuliuos C Punnitaan 0,1 mg:n tarkkuudella 25 mg ammoniumglysyrritsinaattia (4.2) 100 ml:n mittapulloon. Lisätään hieman 50 % vol etanolia (4.5) ja liuotetaan ammoniumglysyrritsinaatti. Kun se on liuennut, täytetään pullo merkkiin asti 50 % vol etanolilla (4.5). Suodatetaan orgaanisille liuottimille tarkoitetulla suodattimella. 4.7.2   Laitteiston vasteen lineaarisuuden tarkistamiseen käytettävät standardiliuokset 1,0 g/l varastoliuos valmistetaan punnitsemalla 0,1 mg:n tarkkuudella 100 g ammoniumglysyrritsinaattia 100 ml:n mittapulloon. Lisätään hieman 50 % vol etanolia (4.5) ja liuotetaan ammoniumglysyrritsinaatti. Kun se on liuennut, täytetään pullo merkkiin asti 50 % vol etanolilla (4.5). Valmistetaan vähintään neljä muuta liuosta, jotka vastaavat 0,05, 0,1, 0,25 ja 0,5 g/l ammoniumglysyrritsinaattia, pipetoimalla 5 ml, 10 ml, 25 ml ja 50 ml 1,0 g/l:n varastoliuosta erillisiin 100 ml:n mittapulloihin. Täytetään pullo merkkiin asti 50 % vol etanolilla (4.5) ja sekoitetaan perusteellisesti. Suodatetaan orgaanisille liuottimille tarkoitetulla suodattimella.

5   Laitteet ja välineet

5.1   Analyysilaitteisto

5.2	Integraattori tai piirturi, jonka suorituskyky vastaa laitteiston muita osia.

5.3	Kolonni (esimerkki): Materiaali: ruostumaton teräs tai lasi Sisähalkaisija: 4—5 mm Pituus: 100—250 mm Stationäärifaasi: silloitettu silika (mieluiten pallomainen), jossa on funktionaalinen oktadekyyliryhmä (C18), maksimi hiukkaskoko: 5 μm.

5.4	Laboratoriolaitteet 5.4.1 Analyysivaaka, jonka tarkkuus on 0,1 mg 5.4.2 A-laadun lasisia mittavälineitä 5.4.3 Pienille tilavuuksille sopiva mikromembraanisuodatuslaitteisto

6   Kromatografian ajo-olosuhteet

7   Suoritus

7.1   Alkoholijuomanäytteen valmistus.

Suodatetaan tarvittaessa orgaanisille liuottimille tarkoitetulla suodattimella (huokoskoko: 0,45 μm).

7.2   Määrittäminen

Kun kromatografin olosuhteet ovat stabiloituneet:

8   Menetelmän suorituskykyä kuvaavat ominaisuudet (tarkkuus)

Laboratorioiden välisen testauksen tilastolliset tulokset:

VII   KALKONIT. PASTIKSEN KALKONIEN NESTEKROMATOGRAFINEN MÄÄRITYS

1   Soveltamisala

Tämän menetelmän avulla voidaan määrittää, onko aniksella maustetussa juomassa kalkoneita vai ei. Kalkonit ovat lakritsijuuressa (Glycyrrhiza glabra) luontaisesti esiintyviä, flavonoideihin kuuluvia väriaineita.

Jotta aniksella maustetusta tislatusta alkoholijuomasta voidaan käyttää nimitystä ”pastis”, sen tulee sisältää kalkoneita (asetus (ETY) N:o 1576/89).

2   Viittaukset säännöksiin ja määräyksiin

ISO 3696: 1987 Analyyttiseen laboratoriokäyttöön tarkoitettu vesi — Määritelmä ja testimenetelmät

3   Periaate

Valmistetaan vertailuaineena käytettävä lakritsiuuteliuos. Kalkonien esiintyminen tai niiden puuttuminen määritetään nestekromatografisesti (HPLC) UV-detektion avulla.

4   Reagenssit ja materiaalit

Analyysissä on käytettävä vain HPLC-laadun reagensseja. Etanolin pitoisuuden tulee olla 96 % vol. Analyysissä käytetään vain standardin ISO 3696 mukaista vähintään kolmannen laatuluokan vettä.

4.1	96 % vol etanoli (CAS 64-17-5)

4.2	Asetonitriili, CH3CN (CAS 75-05-8)

4.3	Vertailuaine: Glycyrrhiza glabra (lakritsijuuri) Jauhetaan lakritsijuuri (Glycyrrhiza glabra) karkeaksi. Sauvamaisten partikkelien keskimääräiset dimensiot: pituus 10—15 mm, paksuus 1—3 mm.

4.4	Natriumasetaatti, CH3COONa (CAS 127-09-3)

4.5	Jääetikka, CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.6

Liuosten valmistaminen 4.6.1   50 % vol etanoli 1 000  ml:aa varten (20 °C): —  96 % vol etanolia (4.1): 521 ml —  vettä (2.0): 511 ml. 4.6.2   Eluentti A: asetonitriili Asetonitriili (4.2), HPLC-laatu. 4.6.3.   Eluentti B: 0,1 M natriumasetaattipuskuriliuos, pH 4,66 Punnitaan 8,203 g natriumasetaattia (4.4), lisätään 6,005 g jääetikkaa (4.5) ja täytetään tilavuus 1 000  ml:ksi vedellä (2) mittapullossa.

5   Referenssiuutteen valmistaminen glycyrrhiza glabrasta (4.3)

5.1	Punnitaan 10 g jauhettua lakritsijuurta (Glycyrrhiza glabra) (4.3) ja pannaan jauhe pyöreäpohjaiseen tislauskolviin. —  Lisätään 100 ml 50 % vol etanolia (4.6.1). —  Keitetään tunnin ajan palautusjäähdyttimen kanssa. —  Suodatetaan. —  Otetaan suodos talteen myöhempää käyttöä varten.

5.2	Otetaan lakritsiuute suodattimesta. —  Pannaan uute pyöreäpohjaiseen tislauskolviin. —  Lisätään 100 ml 50 % vol etanolia (4.6.1). —  Keitetään tunnin ajan palautusjäähdyttimen kanssa. —  Suodatetaan. Otetaan suodos talteen myöhempää käyttöä varten.

5.3	Lakritsijuuren uuttaminen täytyy tehdä kolme kertaa peräkkäin.

5.4	Yhdistetään saadut kolme suodosta.

5.5	Haihduta yhdistettyjen suodosten (5.4) liuotinfaasi pyöröhaihduttimessa.

5.6	Liuota uutejäämä (5.5) 100 ml:aan 50 % vol etanolia (4.6.1).

6   Laitteet ja välineet

6.1   Analyysilaitteisto

6.2	Integraattori tai piirturi, jonka suorituskyky vastaa analyysilaitteiston muita osia

6.3	Kolonni Materiaali: ruostumaton teräs tai lasi Sisähalkaisija: 4—5 mm Stationäärifaasi: silloitettu silika, jossa on funktionaalinen oktadekyyliryhmä (C18), hiukkaskoko: enintään 5 μm.

6.4

Normaalit laboratoriolaitteet, muun muassa seuraavat: 6.4.1  Analyysivaaka. (tarkkuus ± 0,1 mg) 6.4.2  Palautusjäähdyttimellä varustettu tislauslaitteisto, esimerkiksi: —  250 ml:n pyörökolvi, jossa on lasihiosliitäntä, —  30 cm pitkä palautusjäähdytin, —  lämmönlähde (sopivan järjestelyn avulla on vältettävä uutettavan aineen hajoaminen tai kiinnipalaminen). 6.4.3  Pyöröhaihdutin 6.4.4  Suodatuslaitteisto (esimerkiksi Büchner-suppilo)

6.5

Kromatografian ajo-olosuhteet (esimerkki) 6.5.1 Eluenttien A (4.6.2) ja B (4.6.3) gradienttiohjelma —  Ajetaan gradientti 20/80 (v/v):sta 50/50 (v/v):een 15 minuutin aikana. —  Ajetaan gradientti 50/50 (v/v):sta 75/25 (v/v):een 5 minuutin aikana. —  Ajetaan isograattisesti 75/25 (v/v) 5 minuutin ajan. —  Kolonnin annetaan stabiloitua injektointien välillä. —  Ajetaan isograattisesti 20/80 (v/v) 5 minuutin ajan. 6.5.2 Virtausnopeus: 1 ml/min 6.5.3 UV-detektorin asetukset: Detektori tulee asettaa aallonpituudelle 370 nm, jotta voidaan havaita kalkonit, ja sen jälkeen aallonpituudelle 254 nm glysyrritsiinihapon havaitsemiseksi. Huomaa: Aallonpituus tulee muuttaa (370 nm:sta 254 nm:iin) 30 s ennen kuin glysyrritsiinihapon piikki alkaa eluoitua.

7   Mittauksen suoritus

7.1   Alkoholijuomanäytteen valmistus

Suodatetaan orgaanisille liuottimille tarkoitetulla suodattimella (huokoskoko: 0,45 μm).

7.2.   Lakritsin jäännösuutteen (5.6) laimentaminen

Laimennetaan ennen analyysiä yhteen kymmenesosaan 50 % vol alkoholilla (4.6.1).

7.3   Määrittäminen

8   Tyypillinen pastiksen kromatogrammi

Kuva 1

Edellä kuvatulla menetelmällä saatu kromatogrammi, josta näkyy kalkonien esiintyminen pastiksessa. Piikit 1—8 ovat kalkonien piikkejä ja piikki 9 on glysyrritsiinihappo.

9   Menetelmän suorituskykyä kuvaavat ominaisuudet (tarkkuus)

Laboratorioiden välisen testauksen tulokset:

▼M2

VIII   SOKERIN KOKONAISMÄÄRÄ

1.    Soveltamisala

HPLC–RI-menetelmää sovelletaan sokerin kokonaismäärän (ilmaistuna inverttisokerina) määrittämiseen tislatuissa alkoholijuomissa, lukuun ottamatta munaa ja maitotuotteita sisältäviä liköörejä.

Menetelmä on validoitu laboratorioiden välisessä tutkimuksessa pastikselle, tislatulle anikselle, kirsikkaliköörille, tuotteelle crème de … (jota seuraa käytetyn hedelmän tai raaka-aineen nimi) ja crème de cassisille tasoilla 10,86–509,7 g/l. Laitteiston vasteen lineaarisuus todistettiin kuitenkin konsentraatioalueelle 2,5–20,0 g/l.

Tätä menetelmää ei ole tarkoitettu alhaisten sokeritasojen määrittämiseen.

2.    Viittaukset säännöksiin ja määräyksiin

ISO 3696: 1987 Analyyttiseen käyttöön tarkoitettu vesi – Määritelmä ja testimenetelmät

3.    Periaate

Sokeriliuosten tutkimus korkean suorituskyvyn nestekromatografialla liuosten glukoosi-, fruktoosi, sakkaroosi-, maltoosi- ja laktoosipitoisuuksien määrittämiseksi.

Menetelmä käyttää kiinteää alkyyliamiinifaasia ja differentiaalirefraktometriä ja se esitetään esimerkkinä. Stationäärifaasina voidaan käyttää myös anioninvaihtohartseja.

4.    Reagenssit ja materiaalit

4.1	Glukoosi (CAS 50-99-7), puhtaudeltaan vähintään 99 %.

4.2	Fruktoosi (CAS 57-48-7), puhtaudeltaan vähintään 99 %.

4.3	Sakkaroosi (CAS 57-50-1), puhtaudeltaan vähintään 99 %.

4.4	Laktoosi (CAS 5965-66-2), puhtaudeltaan vähintään 99 %.

4.5	Maltoosi-monohydraatti (CAS 6363-53-7), puhtaudeltaan vähintään 99 %.

4.6	Puhdas asetonitriili (CAS 75-05-8) HPLC-määritystä varten.

4.7	Tislattua tai demineralisoitua vettä, mieluiten mikrosuodatettua.

4.8

Liuottimia (esimerkki) Eluentti muodostuu seuraavista: 75 tilavuusosaa asetonitriilia (4.6) 25 tilavuusosaa tislattua vettä (4.7) Ennen käyttöä johdetaan heliumia hitaasti 5–10 minuutin ajan kaasujen poistamiseksi. Jos käytettävää vettä ei ole mikrosuodatettu, liuotin olisi suodatettava orgaanisten liuottimien suodattimella, jonka huokoskoko on 0,45 μm tai pienempi.

4.9	Absoluuttinen etanoli (CAS 64-17-5)

4.10	Etanoliliuos (5 %, v/v).

4.11

Standardin kantaliuoksen valmistaminen (20 g/l) Mitataan 2 g jokaista määritettävää sokeria (4.1–4.5) ja siirretään ne 100 ml:n mittapulloon. (Huom. 2,11 g maltoosi-monohydraattia vastaa 2 g:aa maltoosia). Täytetään 100 ml:aan 5 til.- %:n alkoholiliuoksella (4.10), ravistetaan ja säilytetään noin + 4 °C:ssa. Uusi kantaliuos valmistetaan kerran viikossa.

4.12	Työstandardiliuosten valmistaminen (2,5, 5,0, 7,5, 10,0 ja 20,0 g/l) Laimennetaan kantaliuos 20 g/l (4.11) 5 til.- %:n alkoholiliuoksella (4.10), jolloin saadaan viisi työstandardia: 2,5, 5,0, 7,5, 10,0 ja 20,0 g/l. Suodatetaan suodattimella, jonka huokoskoko on 0,45 μm tai pienempi (5.3).

5.    Laitteet ja välineet

5.1   Korkean suorituskyvyn nestekromatografiajärjestelmä (HPLC), jolla saadaan perusviivaresoluutio kaikista sokereista.

5.1.1

Korkean suorituskyvyn nestekromatografi, jossa on 6-porttinen injektioventtiilli ja 10 μl:n silmukka tai muu automaattinen tai manuaalinen laite, jotta voidaan luotettavasti injektoida mikrotilavuuksia.

5.1.2

Pumppujärjestelmä, jolla voidaan saavuttaa ja ylläpitää vakiomääräinen tai ohjelmoitu virtausnopeus erittäin tarkasti.

5.1.3

Differentiaalirefraktometri.

5.1.4

Integraattori tai piirturi, jonka suorituskyky vastaa laitteiston muita osia.

5.1.5

Esikolonni: Sopivan esikolonnin kiinnittämistä analyysikolonniin suositellaan.

5.1.6

Kolonni (esimerkki): Materiaali: ruostumaton teräs tai lasi. Sisähalkaisija: 2–5 mm. Pituus: 100–250 mm (hiukkaskoon mukaan), esimerkiksi 250 mm, jos hiukkasten halkaisija on 5 μm. Stationäärifaasi: silikaan sidotut alkyyliamiinien funktionaaliset ryhmät, hiukkaskoko enintään 5 μm.

5.1.7

Kromatografian ajo-olosuhteet (esimerkki) Eluentti (4.8), virtausnopeus: 1 ml/minuutti Detektio: Differentiaalirefraktometri. Detektori kytketään päälle muutama tunti ennen käyttöä, jotta sen voidaan varmistaa olevan täysin vakaa. Vertailukyvetti on täytettävä eluentilla.

5.2	Analyysivaaka, jonka tarkkuus on 0,1 mg.

5.3	Pienille tilavuuksille sopiva suodatuslaitteisto, jossa on 0,45 μm:n mikromembraani.

6.    Näytteen säilytys

Vastaanotetut näytteet varastoidaan huoneenlämpötilassa ennen analyysiä.

7.    Suoritus

7.1   A OSA: Näytteen valmistus

7.1.1

Ravistetaan näytettä.

7.1.2

Näyte suodatetaan suodattimella, jonka huokoskoko on 0,45 μm tai pienempi (5.3).

7.2   B OSA: Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (HPLC)

7.2.1   Määritys

Injektoidaan 10 μl standardiliuoksia (4.12) ja näytteitä (7.1.2). Suoritetaan analyysi sopivia kromatografiaolosuhteita käyttäen, joista on edellä annettu esimerkki.

7.2.2

Jos näytteen jonkin piikin pinta-ala (tai korkeus) on suurempi kuin kaikkien konsentroiduimman standardin vastaava piikki, näyte on laimennettava tislatulla vedellä ja on tehtävä uusi määritys.

8.    Laskutoimitus

Verrataan standardiliuoksen ja alkoholijuoman kromatogrammeja keskenään. Tunnistetaan piikit niiden retentioaikojen perusteella. Mitataan pinta-alat (tai korkeudet) konsentraatioiden laskemiseksi ulkoisen standardin menetelmällä. Näytteen mahdollinen laimennus otetaan huomioon.

Lopputulos on sakkaroosin, maltoosin, laktoosin, glukoosin ja fruktoosin summa ilmaistuna inverttisokerina g/l.

Inverttisokeri määritellään kaikkien esiintyvien monosakkaridien ja pelkistävien disakkaridien summana, johon on lisätty esiintyvästä sakkaroosista laskettu glukoosin ja fruktoosin stoikiometrinen määrä.

Inverttisokeri (g/l)

=

glukoosi (g/l) + fruktoosi (g/l) + maltoosi (g/l) + laktoosi (g/l) + (sakkaroosi (g/l) × 1,05)

1,05

=

(fruktoosin molekyylipaino + glukoosin molekyylipaino) / sakkaroosin molekyylipaino

9.    Menetelmän suoritusarvot (mittaustarkkuus)

9.1   Laboratorioiden välisen testauksen tilastolliset tulokset

Seuraavat tulokset saatiin kansainvälisestä menetelmän suorituskykyä arvioivasta tutkimuksesta, joka toteutettiin kansainvälisesti hyväksyttyjen menetelmien [1] [2] mukaisesti.

▼M1

IX   MUNANKELTUAINEN. MUNANKELTUAISPITOISUUDEN FOTOMETRINEN MÄÄRITTÄMINEN TISLATUISTA ALKOHOLIJUOMISTA

1   Soveltamisala

Menetelmä soveltuu munankeltuaispitoisuuden määrittämiseen munalikööristä ja munaa sisältävästä likööristä, kun pitoisuus on välillä 40—250 g/l.

2   Viittaukset säännöksiin ja määräyksiin

ISO 3696: 1897 Analyyttiseen laboratoriokäyttöön tarkoitettu vesi — Määritelmä ja testimenetelmät

3   Periaate

Munankeltuaisen etanoliin liukenevat fosforiyhdisteet uutetaan ja ne määritetään fotometrisesti fosforimolybdaattikompleksina.

4   Reagenssit ja materiaalit

5   Laitteet ja välineet

6   Näytteet

Näytteet varastoidaan huoneenlämpötilassa ennen analyysiä.

7   Mittauksen suoritus

7.1   Näytteenvalmistus

7.2   Fosfaatin fotometrinen määritys

7.2.1   Vertailuliuos

7.2.2   Näyteliuos

7.2.3   Kalibrointikäyrä

8   Tulosten laskeminen

Munankeltuaispitoisuus (g/l) lasketaan seuraavasta kaavasta:

missä:

110	muuntokerroin 100 g:ssa munankeltuaista olevan P2O5:n kokonaismäärän (g) laskemiseksi,

mg P2O5

kalibrointikäyrästä saatu arvo,

tiheys

munapohjaisen liköörin massa tilavuusyksikköä kohti (g/ml) 20 °C:n lämpötilassa,

E	punnittu munapohjaisen liköörin määrä (g),

40	tuhkaliuoksen 5 ml:n osuudesta tuleva laimennuskerroin.

9   Menetelmän suorituskykyä kuvaavat ominaisuudet (tarkkuus)

Laboratorioiden välisen testauksen tilastolliset tulokset:

▼C1

X    SEURAAVIEN PUUAINEKSESSA ESIINTYVIEN YHDISTEIDEN MÄÄRITYS TISLATUISSA ALKOHOLIJUOMISSA KORKEAN SUORITUSKYVYN NESTEKROMATOGRAFIALLA (HPLC): FURFURAALI, 5-HYDROKSIMETYYLIFURFURAALI, 5-METYYLIFURFURAALI, VANILLIINI, SYRINGYYLIALDEHYDI, KONIFERYYLIALDEHYDI, SINAPYYLIALDEHYDI, GALLUSHAPPO, ELLAGIHAPPO, VANILLIINIHAPPO, SYRINGIINIHAPPO JA SKOPOLETIINI

▼M2

1.    Soveltamisala

Tätä menetelmää sovelletaan furfuraalin, 5-hydroksimetyylifurfuraalin, 5-metyylifurfuraalin, vanilliinin, syringyylialdehydin, koniferyylialdehydin, sinapyylialdehydin, gallushapon, ellagihapon, vanilliinihapon, syringiinihapon ja skopoletiinin määrittämiseksi korkean suorituskyvyn nestekromatografialla.

2.    Viittaukset säännöksiin ja määräyksiin

Määritysmenetelmä, jonka Kansainvälisen viinijärjestön (OIV) yleiskokous on tunnustanut ja julkaissut viitteellä OIV-MA-BS-16: R2009.

3.    Periaate

Määritys korkean suorituskyvyn nestekromatografialla (HPLC) käyttäen ilmaisimena ultraviolettispektrofotometriaa useilla aallonpituuksilla sekä spektrofluorometriaa.

4.    Reagenssit

Reagenssien on oltava analyysilaatua. Veden on oltava tislattua tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa. On paras käyttää mikrosuodatettua vettä, jonka ominaisvastus on 18,2 M Ω.cm.

4.1	96 til.- %:n alkoholi.

4.2	HPLC-laadun metanoli (liuotin B).

4.3	Etikkahappo laimennettuna 0,5 til.- %:iin (liuotin A).

4.4	Liikkuvat faasit: (vain esimerkki). Liuotin A (0,5 %:n etikkahappo) ja liuotin B (puhdas metanoli). Suodatetaan kalvosuodattimen (0,45 μm) läpi. Poistetaan tarvittaessa kaasut ultraäänihauteessa.

4.5	Vertailustandardi, puhtaudeltaan vähintään 99 %: furfuraali, 5-hydroksimetyylifurfuraali, 5-metyylifurfuraali, vanilliini, syringyylialdehydi, koniferyylialdehydi, sinapyylialdehydi, gallushappo, ellagihappo, vanilliinihappo, syringiinihappo ja skopoletiini.

4.6

Vertailuliuos: Standardiainekset liuotetaan 50 til- %:n vesi-alkoholiliuokseen. Vertailuliuoksen lopullisten konsentraatioiden on oltava seuraavat: furfuraali: 5 mg/l; 5-hydroksimetyylifurfuraali: 10 mg/l; 5-metyylifurfuraali 2 mg/l; vanilliini: 5 mg/l; syringyylialdehydi: 10 mg/l; koniferyylialdehydi: 5 mg/l; sinapyylialdehydi: 5 mg/l; gallushappo: 10 mg/l; ellagihappo: 10 mg/l; vanilliinihappo: 5 mg/l; syringiinihappo 5 mg/l; skopoletiini: 0,5 mg/l.

5.    Välineistö

Tavanomainen laboratoriovälineistö

5.1

Korkean suorituskyvyn nestekromatografi, jolla voidaan tehdä kahden liuoksen gradientti ja jossa on: 5.1.1  spektrofotometridetektori, jolla voidaan mitata aallonpituuksia 260–340 nm. Piikkien puhtauden varmistamiseksi on kuitenkin parempi työskennellä usean aallonpituuden detektorilla, johon on kytketty diodirividetektori tai vastaava. 5.1.2  spektrofotometridetektori – heräteaallonpituus 354 nm, emissioaallonpituus: 446 nm (skopoletiinin jäämien havaitsemiseen; ne voidaan havaita myös spektrofotometrillä aallonpituudella 313 nm). 5.1.3  injektiolaite, jolla voidaan syöttää (esimerkiksi) 10 tai 20 μL testinäytettä. 5.1.4  HPCL-kolonni, tyyppiä RP C18, hiukkaskoko enintään 5 μm.

5.2	HPLC-ruiskuja.

5.3	Laite pienten volyymien kalvosuodatusta varten.

5.4	Integraattori tai piirturi, jonka suorituskyky vastaa laitteiston kaikkia muita osia ja jossa on erityisesti useita tiedonkeruukanavia.

6.    Suoritus

6.1   Injektoitavan liuoksen valmistus

Vertailuliuos ja alkoholijuoma suodatetaan tarvittaessa kalvon läpi, jonka huokoskoko on enintään 0,45 μm.

6.2

Kromatografiset suoritusolosuhteet: määritys tehdään huonelämpötilassa kohdassa 5.1 kuvatuin välinein käyttäen mobiilifaaseja (4.4), joiden virtaus on noin 0,6 ml minuutissa seuraavilla grandienteilla (vain esimerkki): Aika: 0 min 50 min 70 min 90 min liuotin A (vesi-happo): 100 % 60 % 100 % 100 % liuotin B (metanoli): 0 % 40 % 0 % 0 % Huom. Joissakin tapauksissa tätä gradienttia on muutettava mukana eluoitumisen estämiseksi.

6.3

Määritys 6.3.1 Injektoidaan vertailustandardit erikseen ja sitten sekoitettuina. Mukautetaan suoritusolosuhteita niin, että kaikkien yhdisteiden piikkien resoluutiotekijät ovat vähintään 1. 6.3.2 Injektoidaan valmistettu näyte (6.1). 6.3.3 Mitataan vertailuliuoksen ja alkoholijuoman piikkien pinta-ala ja lasketaan konsentraatiot.

7.    Tulosten ilmoittaminen

Jokaisen aineksen konsentraatio ilmaistaan mg/l.

8.    Menetelmän suoritusarvot (tarkkuus)

Seuraavat tulokset saatiin vuonna 2009 erilaisille tislatuille alkoholijuomille tehdystä kansainvälisestä menetelmän suorituskykyä arvioivasta tutkimuksesta, joka toteutettiin kansainvälisesti hyväksyttyjen menetelmien [1] [2] mukaisesti.

8.1   Furfuraali

8.2   5-hydroksimetyylifurfuraali

8.3   5-metyylifurfuraali

8.4   Vanilliini

8.5   Syringyylialdehydi

8.6   Koniferyylialdehydi

8.7   Sinapyylialdehydi

8.8   Gallushappo

8.9   Ellagihappo

8.10   Vanilliinihappo

8.11   Syringiinihappo

8.12   Skopoletiini

▼M3

XI    ETANOLIN 14C-PITOISUUDEN MÄÄRITTÄMINEN

1.    Johdanto

Etanolin 14C-pitoisuuden määrityksellä voidaan erottaa fossiilisista alkuaineista peräisin oleva alkoholi (synteesialkoholi) ja nykyisistä alkuaineista peräisin oleva alkoholi (käymisalkoholi).

2.    Määritelmä

Etanolin 14C -pitoisuutta pidetään tässä kuvattua menetelmää tai standardissa EN 16640 kuvattua menetelmää C käyttäen määritettynä 14C-pitoisuutena.

Elävien kasvien yhteyttämä ilmakehän luonnollinen 14C-pitoisuus (vertailuarvo) ei ole vakioarvo. Tämän vuoksi vertailuarvo määritetään etanolista, joka on peräisin edellisten kasvukausien raaka-aineista. Tämä vuotuinen vertailuarvo määritetään standardin EN 16640 mukaisesti. Vertailuarvoksi voidaan kuitenkin hyväksyä myös muu vertailuarvo, jos se on akkreditointielimen vahvistama.

3.    Periaate

14C -pitoisuus määritetään alkoholinäytteistä, joiden etanolipitoisuus on vähintään 85 paino-%, suoraan nestetuikelaskennalla.

4.    Reagenssit

4.1   Tolueenituikeaine

5,0 g 2,5-difenyylioksatsolia (PPO).

0,5 g p-bis[4-metyyli-5-fenyylioksatsoli(2)]-bentseeni (dimetyyli-POPOP) litrassa analyyttista laatua olevaa tolueenia.

Voidaan käyttää myös kaupallisesti saatavaa tämän koostumuksen mukaista käyttövalmista tolueenituikeainetta.

4.2    14C-standardi

n-heksadekaani 14C, jonka aktiivisuus on noin 1 × 106 dpm/g (noin 1,67 × 106 cBq/g) ja määritetyn aktiivisuuden taattu tarkkuus ± 2 suht-%.

4.3    14C-vapaa etanoli

Taustan määrityksessä käytettävä fossiilista alkuperää olevista raaka-aineista peräisin olevaa synteesialkoholia, jonka etanolipitoisuus on vähintään 85 paino-%.

5.    Laitteet

6.    Menettely

6.1   Välineistön säätäminen

Välineistö säädetään valmistajan ohjeiden mukaisesti. Mittausolosuhteet ovat optimaaliset, kun arvo E2/B, jota kutsutaan laatuluvuksi, on korkeimmillaan.

E = hyötysuhde (tuotto)

B = tausta (taustakohina)

Ainoastaan kaksi mittauskanavaa optimoidaan. Kolmas mittauskanava jätetään täysin avoimeksi tarkastussyistä.

6.2   Laskentaputkien valitseminen

Täytetään enemmän laskentaputkia kuin myöhemmässä vaiheessa tarvitaan 10 ml:lla 14C-vapaata synteesietanolia ja 10 ml:lla tolueenituikeainetta, mitataan vähintään 4 jaksoa × 100 minuuttia. Hylätään laskentaputket, joiden taustakohina vaihtelee keskiarvosta yli ± 1 suht-%. Käytetään ainoastaan uusia samasta erästä peräisin olevia putkia.

6.3   Ulkoinen standardi/kanava -suhteen määrittäminen

Viritettäessä kanavaa 6.1 kohdan mukaisesti ulkoinen standardi/kanava -suhde määritetään samanaikaisesti käyttäen hyötysuhdekertoimen laskemisessa apuna ollutta tietokoneohjelmaa. Ulkoisena standardina olisi käytettävä cesium-137:ää, jonka valmistaja on jo yhdistänyt kiinteästi.

6.4   Näytteen esikäsittely

Mittauksessa käytetään näytteitä, joiden etanolipitoisuus on vähintään 85 paino-%, joissa ei esiinny epäpuhtauksia ja jotka absorboivat alle 450 nm:ssä. Pienet esteri- tai aldehydijäämät eivät vaikuta häiritsevästi. Näytteen alkoholipitoisuus on aiemmin määritetty noin 0,1 prosentin tarkkuudella.

7.    Näytteiden mittaaminen ulkoisella standardilla

7.2   Mittaus

Pipetoidaan valittuun laskentaputkeen, jonka taustakohina on tarkastettu, aina 10 ml 6.4 kohdan mukaisesti esikäsiteltyä näytettä ja tämän jälkeen lisätään automaattisella annostelulaitteella aina 10 ml tolueenituikeainetta. Laskentaputkien sisältämät näytteet homogenoidaan kiertoliikkeellä huolehtien siitä, että neste ei kostuta kierrekorkin sisäpuolista polyeteenisuojausta. Valmistetaan fossiilisesta 14C-vapaasta etanolista samalla tavoin laskentaputki taustakohinan määrittämistä varten. Vuosittaisen 14C-arvon tarkastamista varten valmistetaan edelliseltä kasvukaudelta peräisin olevasta etanolista kaksoiskappale sekoittamalla laskentaputki sisäiseen standardiin 8 kohdan mukaisesti.

Tarkastus- ja taustakohinanäytteet sijoitetaan mittaussarjan alkuun. Mittaussarjassa ei saa olla yli kymmentä määritettävää näytettä. Mittauksen kokonaisaika näytettä kohti on vähintään 2 × 100 minuuttia ja yksittäisten näytteiden mittaukset suoritetaan aina 100 minuutin osajaksoissa, jotta mahdollinen poikkeama tai muu häiriö voidaan tunnistaa. (Tällä tavoin yksi jakso vastaa aina 100 minuutin mittausväliä näytettä kohti).

Taustakohina- tai tarkastusnäytteet on uusittava 4 viikon välein.

Tämän arvon muuttuminen vaikuttaa vain hieman alhaisen absorbanssin näytteiden (ulkoinen standardi/kanava -suhde noin 1,8) tuottoon. Kun muutos ei ylitä ± 5 suht-%, laskeminen voidaan suorittaa samalla tuotolla. Korkeamman absorbanssin näytteiden, kuten denaturoidut alkoholit, tuotto voidaan laskea absorbanssin korjauskäyrältä. Jos käytettävissä ei ole sopivaa laskentaohjelmaa, mittaus on suoritettava sisäisellä standardilla, jolla tuotto voidaan määrittää yksiselitteisesti.

8.    Näytteiden mittaaminen sisäisellä standardilla heksadekaani14C

8.1   Menettely

Tarkastusnäytteet ja taustakohinanäytteet (nykyinen ja fossiilinen etanoli) sekä tuntematon aine mitataan kaksoiskappaleina. Kaksoiskappalenäyte valmistetaan valikoimattomaan laskentaputkeen, johon on lisätty tarkoin annosteltu määrä (30 μl) heksadekaania14C sisäiseksi standardiksi (lisäaktiivisuus noin 26 269 dpm/gC – noin 43 782 cBq/gC). Muiden näytteiden esikäsittelyn ja mittausajan osalta edetään 7.2 kohdassa kuvatulla tavalla, mutta näytteiden mittausaika sisäisen standardin kanssa voidaan vähentää noin 5 minuuttiin säätämällä laite etukäteen 105 pulssiin. Kaikille mittaussarjan tarkastus- ja taustakohinanäytteille valmistetaan kaksoiskappaleet, jotka sijoitetaan määrityssarjan alkuun.

8.2   Sisäisen standardin ja laskentaputkien käyttö

Jotta vältettäisiin saastuminen suoritettaessa mittauksia sisäisen standardin kanssa, standardin ja laskentaputkien varastointi ja käsittely on hoidettava muussa paikassa kuin määritysnäytteiden esikäsittely ja mittaus. Tarkastettuja taustakohinaputkia voidaan käyttää uudelleen mittauksen jälkeen. Kierrekorkit ja sisäistä standardia sisältävät putket hävitetään.

9.    Tulosten ilmoittaminen

9.1   Radioaktiivisen aineen aktiivisuusyksikkö on becquerel. 1 Bq = 1 hajoaminen/sek.

Erityinen radioaktiivisuus ilmoitetaan becquereleinä suhteessa 1 grammaan hiiltä = Bq/gC.

Käyttökelpoisten tulosten saamiseksi tulokset ilmoitetaan sentti-becquereleinä = cBq/gC.

Dpm:iin perustuvia julkaisuissa tähän asti käytettyjä kuvauksia ja kaavoja voidaan myös käyttää. Vastaavan arvon saamiseksi sentti-becquereleinä (cBq) kerrotaan dpm-tulos kertoimella 100/60.

9.2   Tulosten ilmoittaminen ulkoisella standardilla

9.3   Tulosten ilmoittaminen sisäisellä standardilla

9.4   Lyhenteet

cpmpr

=

näytteiden laskentataajuuden keskiarvo, joka on laskettu mittausten kokonaisaikana

cpmNE

=

samalla tavoin laskettu taustakohinan laskentataajuuden keskiarvo

cpmIS

=

näytteiden laskentataajuus, sisäisellä standardilla.

dpmIS

=

lisätyn sisäisen standardin määrä (kalibroitu radioaktiivisuus dpm)

V

=

käytettyjen näytteiden tilavuus, ml

F

=

puhtaan alkoholin pitoisuus grammoina/ml konsentraation mukaan

Z

=

hyötysuhdekerroin ulkoinen standardi/kanava -suhteen mukaan

1,918

=

grammaa alkoholia/1 g hiiltä

10.    Menetelmän luotettavuus

10.1   Toistettavuus (r)

r = 0,632 cBq/g C; S(r) = ± 0,223 cBq/g C

10.2   Uusittavuus (R)

R = 0,821 cBq/g C; S(R) = ± 0,290 cBq/g C