---

PRIEDAS

ETALONINIŲ ANALIZĖS METODŲ APRAŠYMAS
I.	Alkoholio tūrinės koncentracijos nustatymas I. priedėlis. : Distiliato ruošimas II. priedėlis. : Distiliato tankio matavimas — A metodas.= Tankio nustatymas piknometru — B metodas.= Elektroninė densimetrija — C metodas.= Densimetrija, naudojant hidrostatines svarstykles
II.	Suminio sausojo ekstrakto kiekio nustatymas gravimetrinės analizės metodu
III.	Lakiųjų cheminių medžiagų ir metanolio nustatymas
III.1.	Bendrosios pastabos
III.2.	Šalutiniai lakieji junginiai: aldehidai, aukštesnieji alkoholiai, etilacetatas ir metanolis (dujų chromatografija)
III.3.	Lakiosios rūgštys ►M2  ————— ◄
IV.	Vandenilio cianido rūgštis (p.m.)
V.	Anetolas ►M1  ————— ◄
VI.	Glicirizo rūgštis ►M1  ————— ◄
VII.	Chalkonai ►M1  ————— ◄
VIII.	Suminis cukrų kiekis ►M2  ————— ◄
IX.	Kiaušinio trynys ►M1  ————— ◄
▼M2
X.	Medienos cheminių junginių – 2-furaldehido, 5-hidroksimetil-2-furaldehido, 5-metil-2-furaldehido, vanilino, alyvų aldehido, koniferilo aldehido, sinapo aldehido, galo rūgšties, elago rūgšties, vanilino rūgšties, alyvų rūgšties ir skopoletino – nustatymas
▼M3
XI.	14C kiekio etanolyje nustatymas
▼B

I.   SPIRITINIŲ GĖRIMŲ ALKOHOLIO KONCENTRACIJOS TŪRIO PROCENTAIS NUSTATYMAS

Įvadas

Etaloninį metodą sudaro dvi dalys:

I priedėlis.

:

Distiliato ruošimas

II priedėlis.

:

Distiliato tankio matavimas

1.   Taikymo sritis

Metodas yra taikomas faktinei spiritinių gėrimų alkoholio koncentracijai tūrio proc. nustatyti.

2.   Normatyvinės nuorodos

ISO 3696:1987: Analizės laboratorijų naudojamas vanduo. Specifikacijos ir bandymo metodai.

3.   Terminai ir apibrėžimai

3.1.

Etaloninė temperatūra: 20 °C temperatūra yra etaloninė temperatūra spiritinių gėrimų alkoholio koncentracijai tūrio proc., tankiui ir savitajam tankiui nustatyti. pastaba. Terminas „esant t °C temperatūrai“ skirtas visiems matavimams (tankio arba alkoholio koncentracijos tūrio proc.), daromiems esant ne etaloninei 20 °C temperatūrai.

3.2.	Tankis: Spiritinio gėrimo tankis – spiritinio gėrimo tūrio vieneto masė vakuume esant 20 °C. Skaičiuojamas kilogramais kubiniam metrui ir užrašomas ρ20 °C arba ρ20.

3.3.

Savitasis tankis: Savitasis tankis – spiritinio gėrimo ir vandens tankių, nustatytų esant 20 °C temperatūrai, santykis. Savitasis tankis žymimas d20 °C/20 °C arba d20/20, arba tiesiog d, jei nėra galimybės supainioti. Analizės sertifikate matuojamas parametras turi būti užrašomas vartojant tik pirmiau minėtus simbolius. pastaba. Žinant tankį ρ20 esant 20 °C temperatūrai, galima gauti savitąjį tankį ρ20 20 °C temperatūrai: ρ20 = 998,203 × d20/20 arba d20/20 = ρ20/998,203, čia 998,203 = vandens tankis esant 20 °C temperatūrai.

3.4.

Faktinė alkoholio koncentracija tūrio proc.: Faktinė spiritinių gėrimų alkoholio koncentracija tūrio proc. yra lygi etilo alkoholio litrų skaičiui 100 l vandens ir alkoholio mišinio, turinčio tokį patį tankį kaip ir alkoholis arba spiritinis gėrimas po distiliavimo. Įvairių vandens ir alkoholio mišinių etaloninės alkoholio koncentracijos tūrio proc. ir tankio esant 20 °C temperatūrai vertės yra pateiktos tarptautinėje lentelėje, kurią Tarptautinė teisinės metrologijos organizacija priėmė kaip Rekomendaciją Nr. 22. Bendroji lygtis, kuri susieja alkoholio koncentraciją tūrio proc. su vandens ir alkoholio mišinio tankiu esant tam tikrai temperatūrai, yra pateikta Komisijos reglamento (EEB) Nr. 2676/90 (OL L 272, 1990 10 3, 1 p.) priedo 3 skyriaus „Alkoholio koncentracija tūrio procentais“ 40 puslapyje arba OIV analizės metodų vadove (1994 m.) (p. 17). pastaba. Likerių ir kremo likerio, kurių alkoholio koncentraciją tūrio proc. tiksliai išmatuoti sunku, ėminiai turi būti sveriami, o alkoholio koncentracija iš pradžių skaičiuojama masės %. Perskaičiavimo formulė: čia ASM = alkoholio koncentracija masės procentais, ρ20 (alkoholio) = 789,24 kg/m3.

4.   Principas

Po distiliavimo alkoholio koncentracija tūrio proc. distiliate nustatoma piknometru, elektroninės densimetrijos metodu arba densimetrijos metodu naudojant hidrostatines svarstykles.

I PRIEDĖLIS. DISTILIATO RUOŠIMAS

1.   Taikymo sritis

Metodas tinka ruošti distiliatus, skirtus faktinei spiritinių gėrimų alkoholio koncentracijai tūrio proc. nustatyti.

2.   Principas

Spiritiniai gėrimai distiliuojami etilo alkoholiui bei kitiems lakiesiems junginiams ir ekstrahuojamoms medžiagoms (medžiagos, kurios nedistiliuojamos) atskirti.

3.   Reagentai ir medžiagos

4.   Įranga ir priemonės

Įprasta laboratorinė įranga, konkrečiai ši aparatūra.

Pastaba.

Pirmiau aprašytas aparatas skirtas ne mažesnio kaip 200 ml tūrio ėminiui. Tačiau mažesnio tūrio (100 ml) ėminį galima distiliuoti mažesnėje kolboje, jei naudojamas apsauginis antgalis arba kitas nuo skysčio išnešimo apsaugantis įtaisas.

5.   Tiriamų ėminių laikymas

Prieš analizę ėminiai laikomi kambario temperatūros sąlygomis.

6.   Darbo eiga

Įžanginė pastaba:

6.1.	Distiliavimo aparatūros tikrinimas Naudojamu aparatu turi būti įmanoma: distiliuojant 200 ml vandens ir alkoholio tirpalo, kurio koncentracija būtų žinoma ir arti 50 tūrio proc., gauti ne didesnį kaip 0,1 tūrio proc. alkoholio nuostolį.

6.2.

Spiritiniai gėrimai, kuriuose alkoholio koncentracija mažesnė negu 50 tūrio proc. Į matavimo kolbą įpilama 200 ml spiritinio gėrimo. Išmatuojama šio tirpalo temperatūra arba užtikrinama etaloninė temperatūra (20 °C). Ėminys supilamas į distiliavimo aparato apvaliadugnę kolbą, o matavimo kolba tris kartus skalaujama maždaug 20 ml distiliuoto vandens. Visos plovimo vandens alikvotinės dalys supilamos į distiliavimo kolbą. Pastaba. Skiedimui pakanka 60 ml vandens, jei sausojo ekstrakto spiritiniame gėrime yra mažiau kaip 250 g/l. Kitais atvejais pirolizei išvengti plovimo vandens tūris turi būti bent 70 ml, jei sausojo ekstrakto kiekis 300 g/l, 85 ml, jei sausojo ekstrakto kiekis 400 g/l, ir 100 ml, jei sausojo ekstrakto kiekis 500 g/l (kai kurie vaisiniai likeriai arba kremo likeriai). Vandens tūris nustatomas proporcingai skirtingiems ėminio tūriams. Į distiliavimo kolbą įdedamos tolygiam virimui užtikrinti skirtos granulės (3.1) (kremo likerių atveju papildomai dedamas priešputis). Distiliatas renkamas į tą pačią 200 ml talpos matavimo kolbą, į kurią įpilama 20 ml distiliuoto vandens. Kolba turi būti dedama į šalto vandens vonią (4.1) (10–15 °C temperatūros spiritiniams gėrimams su anyžiumi). Distiliuojama, vengiant skysčio išnešimo ir suanglėjimo, kolbos turinys retkarčiais maišomas. Baigiama distiliuoti, kai matavimo kolboje surinkto distiliato meniskas yra keliais milimetrais žemiau matavimo kolbos žymės. Distiliatui atvėsus iki pradinės temperatūros 0,5 °C tikslumu, jis skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki žymės ir gerai sumaišomas. Šis distiliatas naudojamas alkoholio koncentracijai tūrio proc. nustatyti (II priedėlis).

6.3.

Spiritiniai gėrimai, kurių alkoholio koncentracija didesnė kaip 50 tūrio proc. 100 ml talpos matavimo kolba matuojama 100 ml spiritinio gėrimo, kuris supilamas į distiliavimo aparato apvaliadugnę kolbą. Matavimo kolba keletą kartų skalaujama distiliuotu vandeniu, plovimo vanduo supilamas į distiliavimo kolbą. Naudojama tiek vandens, kad kolbos turinys būtų maždaug 230 ml tūrio. Į 200 ml talpos matavimo kolbą, kurioje surenkamas distiliatas, įpilama 20 ml distiliuoto vandens. Kolba dedama į šalto vandens vonią (4.1) (10–15 °C temperatūros spiritiniams gėrimams su anyžiumi). Retkarčiais maišant kolbos turinį, distiliuojama tol, kol į 200 ml matavimo kolbą surenkamo distiliato meniskas bus keliais milimetrais žemiau žymės. Distiliatui atvėsus iki pradinės temperatūros 0,5 °C tikslumu, jis skiedžiamas distiliuotu vandeniu iki žymės ir gerai sumaišomas. Šis distiliatas naudojamas alkoholio koncentracijai tūrio proc. nustatyti (II priedėlis). Pastaba. Alkoholio koncentracija tūrio proc. spiritiniame gėrime yra du kartus didesnė už alkoholio koncentraciją distiliate.

II PRIEDĖLIS. DISTILIATO TANKIO MATAVIMAS

A METODAS:   FAKTINĖS SPIRITINIŲ GĖRIMŲ ALKOHOLIO KONCENTRACIJOS TŪRIO PROCENTAIS NUSTATYMAS. MATAVIMAS PIKNOMETRU

A.1.   Principas

Alkoholio koncentracija tūrio proc. nustatoma distiliato tankį matuojant piknometru.

A.2.   Reagentai ir tirpalai

Jei kitaip nenurodyta, analizei naudojami tik patvirtinto analizinio grynumo reagentai ir bent 3 kategorijos vanduo, kaip apibrėžta ISO 3696:1987.

A.2.1.

Natrio chlorido tirpalas (2 % m/V) 1 litrui tirpalo paruošti pasveriama 20 g natrio chlorido ir ištirpinama 1 litre vandens.

A.3.   Įranga ir priemonės

Įprasta laboratorinė aparatūra, ir konkrečiai ši:

1 pastaba. Spiritinių gėrimų tankiui vakuume nustatyti reikia turėti dviejų lėkščių svarstykles, piknometrą ir taros butelį, kurio išorinis tūris būtų toks pat kaip piknometro, kad būtų galima panaikinti plūdrumo ore (oro išstūmimo) kiekvienu konkrečiu momentu reiškinį. Šį paprastą metodą galima taikyti naudojant vienos lėkštės svarstykles, jei plūdrumo ore pokyčiams kontroliuoti taros butelis būtų sveriamas kiekvieną kartą.

A.4.   Darbo eiga

Pradinės pastabos

A.4.1.   Piknometro kalibravimas

Piknometras kalibruojamas, nustatant šiuos parametrus:

A.4.1.1.

Kalibravimas naudojant dviejų lėkščių svarstykles: Nustatoma: —  švaraus sauso piknometro masė (P), —  vandeniu pripildyto piknometro masė esant t °C temperatūrai (P1), —  taros butelio masė (T0). A.4.1.1.1. Pasveriamas švarus, sausas piknometras (P). A.4.1.1.2. Piknometras atsargiai pripildomas kambario temperatūros distiliuotu vandeniu ir įstatomas termometras. Piknometras kruopščiai nusausinamas ir dedamas į termiškai izoliuotą apvalkalą. Distiliuotas vanduo piknometre maišomas apverčiant rezervuarą tol, kol nebesikeičia temperatūros rodmuo. Vandens lygis piknometre sulyginamas su šoninio vamzdelio viršutiniu kraštu. Tiksliai matuojama temperatūra t °C ir, jei reikia, daromos pataisos dėl temperatūros skalės netikslumo. Pasveriamas piknometras su vandeniu (P1). A.4.1.1.3. Pasveriamas taros butelis (T0). A.4.1.1.4. Apskaičiavimas —  Tuščio piknometro masė = P – m, čia m = oro piknometre masė. m = 0,0012 × (P1 – P) 2 pastaba. 0,0012 – sauso oro tankis esant 20 °C temperatūrai ir 760 mm Hg stulpelio slėgiui. —  Piknometro tūris esant 20 °C temperatūrai: čia Ft = faktorius temperatūrai t °C, paimtas iš Europos Komisijos reglamento (EEB) Nr. 2676/90 priedo I skyriaus „Tankis ir savitasis tankis“ I lentelės (p. 10). V20 °C turi būti žinomas 0,001 ml tikslumu. —  Vandens piknometre masė esant 20 °C temperatūrai: čia 0,998203 = vandens tankis esant 20 °C temperatūrai. 3 pastaba. Jei būtina, gali būti naudojama tankio ore reikšmė 0,99715 ir alkoholio koncentracija skaičiuojama naudojant atitinkamą tankio ore reikšmę pateiktą HM Customs and Excise lentelėse.

A.4.1.2.

Kalibravimo metodas naudojant dviejų lėkščių svarstykles: A.4.1.2.1.  Ant kairiosios svarstyklių lėkštės dedamas taros butelis, ant dešiniosios svarstyklių lėkštės – švarus ir sausas piknometras su kamščiu. Masės sulyginamos, ant lėkštės su piknometru dedant svarsčius: p gramų. A.4.1.2.2.  Į piknometrą atsargiai įpilamas kambario temperatūros distiliuotas vanduo ir įstatomas termometras; piknometras kruopščiai nusausinamas ir įdedamas į termiškai izoliuotą apvalkalą; maišomas apverčiant rezervuarą tol, kol nebesikeičia temperatūros rodmuo. Vandens lygis tiksliai sulyginamas su šoninio vamzdelio viršutiniu kraštu. Šoninis vamzdelis nuvalomas, įstatomas kamštis; tiksliai matuojama temperatūra t °C ir, jei reikia, daromos pataisos dėl temperatūros skalės netikslumo. Pasveriamas vandeniu pripildytas piknometras, masė p’ (gramais), reikalinga pusiausvyrai pasiekti. A.4.1.2.3.  Apskaičiavimas —  Tuščio piknometro masė = p + m, čia m = oro piknometre masė. m = 0,0012 × (p – p’) —  Piknometro tūris esant 20 °C temperatūrai: čia Ft = faktorius temperatūrai t °C, paimtas iš Europos Komisijos reglamento (EEB) Nr. 2676/90 priedo I skyriaus „Tankis ir savitasis tankis“ I lentelės (p. 10). V20 °C turi būti žinomas 0,001 ml tikslumu. —  Vandens piknometre masė esant 20 °C temperatūrai: čia 0,998203 = vandens tankis esant 20 °C temperatūrai.

A.4.2.   Alkoholio koncentracijos ėminyje nustatymas

A.5.   Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

A.5.1.

Tarplaboratorinio tyrimo statistiniai rezultatai Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas [1] [2]. Tarplaboratorinių bandymų metai 1997 Laboratorijų skaičius 20 Ėminių skaičius 6 Ėminiai A B C D E F Laboratorijų, atmetus riktus, skaičius 19 20 17 19 19 17 Riktų skaičius (laboratorijų) 1 – 2 1 1 3 Priimtų rezultatų skaičius 38 40 34 38 38 34 Vidutinė vertė tūrio proc. 23,77 40,04 40,29 39,20 42,24 57,03 26,51 (*)     42,93 (*) 45,73 (*) 63,03 (*) Pakartojamumo standartinis nuokrypis (Sr) tūrio proc. 0,106 0,176 0,072 0,103 0,171 0,190 Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDr) % 0,42 0,44 0,18 0,25 0,39 0,32 Pakartojamumo ribinė vertė (r) tūrio proc. 0,30 0,49 0,20 0,29 0,48 0,53 Atkuriamumo standartinis nuokrypis (SR) tūrio proc. 0,131 0,236 0,154 0,233 0,238 0,322 Atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDR) % 0,52 0,59 0,38 0,57 0,54 0,53 Atkuriamumo ribinė vertė (R) tūrio proc. 0,37 0,66 0,43 0,65 0,67 0,90 Ėminių tipas A Vaisių likeris; dviejų skirtingų koncentracijos verčių ėminiai (*). B Brendis; aklieji dvigubi ėminiai. C Viskis; aklieji dvigubi ėminiai. D Grapa; dviejų skirtingų koncentracijos verčių ėminiai (*). E Akvavitas; dviejų skirtingų koncentracijos verčių ėminiai (*). F Romas; dviejų skirtingų koncentracijos verčių ėminiai (*).

B METODAS.   FAKTINĖS SPIRITINIŲ GĖRIMŲ ALKOHOLIO KONCENTRACIJOS TŪRIO PROCENTAIS NUSTATYMAS – MATAVIMAS ELEKTRONINIU DENSIMETRU (ĖMINIO CELĖS REZONANSINIO VIRPESIŲ DAŽNIO MATAVIMO PRINCIPAS)

B.1.   Principas

Skysčio tankis nustatomas elektroniniu būdu matuojant U vamzdelio virpesių dažnį. Tankiui išmatuoti ėminys pilamas į osciliatoriaus sistemą, kurios savitasis virpesių dažnis kinta atsižvelgiant į pridėtą masę.

B.2.   Reagentai ir tirpalai

Jei kitaip nenurodyta, analizei naudojami tik patvirtinto analizinio grynumo reagentai ir bent 3 kategorijos vanduo, kaip apibrėžta ISO 3696:1987.

B.3.   Aparatūra ir įranga

Įprasta laboratorinė aparatūra, ir konkrečiai ši:

B.4.   Procedūra

B.5.   Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

B.5.1.

Tarplaboratorinio tyrimo statistiniai rezultatai Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas [1] [2]. Tarplaboratorinių bandymų metai 1997 Laboratorijų skaičius 16 Ėminių skaičius 6 Ėminiai A B C D E F Laboratorijų, atmetus riktus, skaičius 11 13 15 16 14 13 Riktų skaičius (laboratorijų) 2 3 1 – 1 2 Priimtų rezultatų skaičius 22 26 30 32 28 26 Vidutinė vertė tūrio proc. 23,81 40,12 40,35 39,27 42,39 56,99 26,52 (*)     43,10 (*) 45,91 (*) 63,31 (*) Pakartojamumo standartinis nuokrypis (Sr) tūrio proc. 0,044 0,046 0,027 0,079 0,172 0,144 Pakartojamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDr) % 0,17 0,12 0,07 0,19 0,39 0,24 Pakartojamumo ribinė vertė (r) tūrio proc. 0,12 0,13 0,08 0,22 0,48 0,40 Atkuriamumo standartinis nuokrypis (SR) tūrio proc. 0,054 0,069 0,083 0,141 0,197 0,205 Atkuriamumo santykinis standartinis nuokrypis (RSDR) % 0,21 0,17 0,21 0,34 0,45 0,34 Atkuriamumo ribinė vertė (R) tūrio proc. 0,15 0,19 0,23 0,40 0,55 0,58 Ėminių tipas A Vaisių likeris; dviejų skirtingų koncentracijos verčių ėminiai (*). B Brendis; aklieji dvigubi ėminiai. C Viskis; aklieji dvigubi ėminiai. D Grapa; dviejų skirtingų koncentracijos verčių ėminiai (*). E Akvavitas; dviejų skirtingų koncentracijos verčių ėminiai (*). F Romas; dviejų skirtingų koncentracijos verčių ėminiai (*).

C METODAS.   FAKTINĖS SPIRITINIŲ GĖRIMŲ ALKOHOLIO KONCENTRACIJOS TŪRIO PROCENTAIS NUSTATYMAS – MATAVIMAS DENSIMETRIJOS METODU NAUDOJANT HIDROSTATINES SVARSTYKLES

C.1.   Principas

Spiritinių gėrimų alkoholio koncentracija gali būti matuojama densimetrijos metodu naudojant hidrostatines svarstykles, pagrįstu Archimedo dėsniu, pagal kurį kūną skystyje vertikaliai kelianti jėga yra lygi išstumto skysčio sunkio jėgai.

C.2.   Reagentai ir tirpalai

Jei kitaip nenurodyta, analizei naudojami tik patvirtinto analizinio grynumo reagentai ir bent 3 kategorijos vanduo, kaip apibrėžta ISO 3696:1987.

C.2.1.   Tirpalas plūdei plauti (natrio hidroksidas, 30 % m/V)

100 ml tirpalo pagaminti sveriama 30 g natrio hidroksido ir iki žymės praskiedžiama 96 % etanoliu.

C.3.   Įranga ir priemonės

Įprasta laboratorinė aparatūra, ir konkrečiai ši:

C.4.   Darbo eiga

Plūdė ir matavimo cilindras po kiekvieno matavimo plaunami distiliuotu vandeniu, valomi švelniu, nepaliekančiu plaušelių filtruojamuoju popieriumi ir skalaujami tiriamuoju tirpalu. Siekiant išvengti alkoholio garavimo, matavimai turi būti daromi iš karto, kai tik nusistovi prietaiso parodymai.

C.5.   Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

C.5.1.   Tarplaboratorinio tyrimo statistiniai rezultatai

Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas [1] [2].

1 paveikslas. Distiliavimo įranga faktinei spiritinių gėrimų alkoholio koncentracijai tūrio proc. nustatyti
1.1 litro talpos apvaliadugnė kolba su rutulio formos šlifo jungtimi.
2.20 cm aukščio Vigreux tipo rektifikavimo kolona.
3.10 cm ilgio kondensatorius su stačius kraštus turinčiu apvalkalu (West tipo kondensatorius).
4.40 cm aukščio gyvatukinis kondensatorius.

II.   GRAVIMETRINIS SPIRITINIŲ GĖRIMŲ BENDROJO EKSTRAKTO NUSTATYMAS

1.   Taikymo sritis

Reglamente (EEB) Nr. 1576/89 numatyta, kad šis metodas taikomas tik aquavit tipo alkoholiniams gėrimams, kuriuose sauso ekstrakto kiekis ribojamas 15 g/l.

2.   Normatyvinės nuorodos

ISO 3696:1987: Analizės laboratorijų naudojamas vanduo. Specifikacijos ir bandymo metodai.

3.   Apibrėžimas

Suminis sausojo ekstrakto arba suminis sausosios medžiagos kiekis – visų nelakiųjų medžiagų, esant tam tikroms fizikinėms sąlygoms, kiekių suma.

4.   Principas

Sveriamas likutis, susidaręs spiritinį gėrimą išgarinus ant vandens vonios ir išdžiovinus džiovinimo spintoje.

5.   Aparatūra ir įranga

5.1.	Plokščiadugnė cilindrinė 55 mm skersmens garinimo lėkštelė.

5.2.	Verdančio vandens vonia.

5.3.	A klasės 25 ml pipetė.

5.4.	Džiovinimo spinta.

5.5.	Eksikatorius.

5.6.	Analizinės svarstyklės, kurių tikslumas 0,1 mg.

6.   Ėminių ėmimas ir ėminiai

Prieš analizę ėminiai laikomi kambario temperatūros sąlygomis.

7.   Darbo eiga

7.1.

Į iš anksto pasvertą plokščiadugnę cilindrinę garinimo lėkštelę pipete įpilama 25 ml spiritinio gėrimo, turinčio mažiau kaip 15 g/l sausų medžiagų. Pirmą garinimo valandą lėkštelė laikoma ant verdančio vandens vonios dangčio, kad skystis neužvirtų, nes taip galėtų būti nuostolių dėl taškymosi. Dar vieną valandą lėkštelė paliekama tiesiog verdančio vandens vonioje.

7.2.	Džiovinimas baigiamas garinimo lėkštelę dviem valandom įdėjus į 105 ± 3 °C temperatūros džiovinimo spintą. Garinimo lėkštelė atvėsinama eksikatoriuje ir sveriama kartu su turiniu.

8.   Apskaičiavimas

Likučio masė, padauginta iš 40, yra lygi spiritiniame gėrime esančio sausojo ekstrakto kiekiui, kuris turi būti išreikštas g/l vienos dešimtosios tikslumu.

9.   Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

9.1.   Tarplaboratorinio tyrimo statistiniai rezultatai

Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas [1] [2].

III.   SPIRITINIŲ GĖRIMŲ LAKIŲJŲ MEDŽIAGŲ IR METANOLIO NUSTATYMAS

III.1.   BENDROSIOS PASTABOS

1.   Apibrėžimai

Reglamente (EEB) Nr. 1576/89 nustatyta mažiausia lakiųjų junginių, išskyrus etanolį ir metanolį, koncentracija spiritiniuose gėrimuose (rome, vynuoginių spiritiniuose gėrimuose, vaisiniuose spiritiniuose gėrimuose ir t. t.). Tik šiems gėrimams yra priimta nuostata, kad lakiųjų junginių koncentracija atitinka šių medžiagų koncentracijos verčių sumą:

Taikomi šie įprastiniai lakiųjų junginių nustatymo metodai:

2.   Lakiųjų junginių analizė dujų chromatografiniu metodu

Kitų nei pirmiau minėti lakiųjų junginių analizė dujų chromatografiniu metodu gali būti ypač įdomi kaip priemonė nustatyti distiliuojamos žaliavos šaltinį ir faktines distiliavimo sąlygas.

Kai kuriuose spiritiniuose gėrimuose yra aromatinių lakiųjų junginių, būdingų žaliavai, naudojamai alkoholiui gauti, spiritinių gėrimų aromatui ir spiritinio gėrimo gamybos būdui. Šie junginiai yra svarbūs įvertinant reikalavimus, nustatytus Reglamente (EEB Nr. 1576/89.)

III.2.   ŠALUTINIŲ LAKIŲJŲ JUNGINIŲ: ALDEHIDŲ, AUKŠTESNIŲJŲ ALKOHOLIŲ, ETILACETATO IR METANOLIO NUSTATYMAS DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

1.   Taikymo sritis

Šis metodas taikomas 1,1-dietoksimetanui (acetaliui), 2-metilbutan-1-oliui (laisvajam amilo alkoholiui), 3-metilbutan-1-oliui (izoamilo alkoholiui), metanoliui (metilo alkoholiui), etiletanoatui (etilacetatui), butan-1-oliui (n-butanoliui), butan-2-oliui (antriniam butanoliui), 2-metilpropan-1-oliui (izobutilo alkoholiui), propan-1-oliui (n-propanoliui) ir etanaliui (acetaldehidui) spiritiniuose gėrimuose nustatyti dujų chromatografijos metodu. Metode naudojamas vidinis etalonas, pvz., pentan-3-olis. Analičių koncentracija išreiškiama g/100 litrų absoliučiojo alkoholio; produkto alkoholio koncentracija turi būti nustatyta prieš analizę. Šiuo metodu analizuojami šie spiritiniai gėrimai: viskis, brendis, romas, vyno spiritas, vaisių spiritas, vynuogių išspaudų spiritas.

2.   Normatyvinės nuorodos

ISO 3696:1987: Analizės laboratorijų naudojamas vanduo. Specifikacijos ir bandymo metodai.

3.   Apibrėžimas

Šalutinėmis medžiagos – lakiosios medžiagos, kurios susidaro kartu su etanoliu vykstant spiritinių gėrimų rūgimui, distiliavimui ir brendimui.

4.   Principas

Šalutinės spiritinių gėrimų lakiosios medžiagos nustatomos tiesiogiai įšvirkščiant spiritinį gėrimą arba atitinkamai praskiestą spiritinį tirpalą į dujų chromatografijos sistemą (GC). Prieš įšvirkštimą, į spiritinį gėrimą pridedamas atitinkamas vidinis etalonas. Šalutinės lakiosios medžiagos yra atskiriamos programuojant tinkamos kolonėlės temperatūrą ir randamos naudojant liepsnos jonizacijos detektorių (FID). Kiekvienos šalutinės lakiosios medžiagos koncentracija nustatoma pagal vidinį etaloną ir atsako faktorius, kurie gaunami kalibruojant tomis pačiomis chromatografavimo sąlygomis, kurios naudojamos analizuojant spiritinį gėrimą.

5.   Reagentai ir medžiagos

Jei kitaip nenurodyta, naudojami didesnio kaip 97 % grynumo klasės reagentai, pirkti iš ISO patvirtinto tiekėjo, turintys grynumo sertifikatus ir neturintys kitų šalutinių junginių, esant bandyme taikomam praskiedimui (tai galima patvirtinti įšvirkštus atskirų šalutinių junginių etalonus, esant bandyme taikomam praskiedimui ir analizuojant GC sąlygomis, aprašytomis 6.4) ir bent 3 kategorijos vanduo, kaip apibrėžta ISO 3696. Acetalis ir acetaldehidas turi būti laikomi tamsoje, esant < 5 °C temperatūrai, visi kiti reagentai laikomi kambario temperatūros sąlygomis.

5.1.	Absoliutusis etanolis (CAS 64-17-5).

5.2.	Metanolis (CAS 67-56-1).

5.3.	Propan-1-olis (CAS 71-23-8).

5.4.	►C1  2-metilpropan-1-olis (CAS 78-83-1). ◄

5.5.	Tinkami vidiniai etalonai: pentan-3-olis (CAS 584-02-1), pentan-1-olis (CAS 71-41-0), 4-metilpentan-1-olis (CAS 626-89-1) arba metilnonanoatas (CAS 1731-84-6).

5.6.	2-metilbutan-1-olis (CAS 137-32-6).

5.7.	3-metilbutan-1-olis (CAS 123-51-3).

5.8.	Etilacetatas (CAS 141-78-6).

5.9.	Butan-1-olis (CAS 71-36-3).

5.10.

Butan-2-olis (CAS 78-92-2)

5.11.

Acetaldehidas (CAS 75-07-0).

5.12.

Acetalis (CAS 105-57-7).

5.13.

40 % V/V etanolio tirpalas 400 ml/l etanolio tirpalui paruošti į 1 litro talpos matavimo kolbą įpilama 400 ml etanolio (5.1) ir skiedžiama distiliuotu vandeniu iki žymės ir sumaišoma.

▼M3

5.13a.

Absoliutusis etanolis (CAS 64–17–5), naudojamas tik žemės ūkio kilmės etilo alkoholiui.

▼B

5.14.

Etaloninių tirpalų ruošimas ir laikymas (metodika taikoma patvirtintam metodui). Visi etaloniniai tirpalai laikomi esant < 5 °C temperatūrai ir turi būti iš naujo ruošiami kas mėnesį. Komponentų ir tirpalų masė turėtų būti užrašoma 0,1 mg tikslumu. 5.14.1. Etaloninis tirpalas A Garavimui kiek įmanoma sumažinti į 100 ml matavimo kolbą iš pradžių įpilama apie 60 ml etanolio tirpalo (5.13), pipete įpilami lentelėje nurodyti tirpalai, mišinys iki žymės skiedžiamas etanolio tirpalu (5.13) ir gerai sumaišomas. Užrašoma tuščios kolbos, pridėtų komponentų ir suminė galutinė kolbos turinio masė. Junginiai Tūris (ml) Metanolis (5.2) 3,0 Propan-1-olis (5.3) 3,0 2-metilpropan-1-olis (5.4) 3,0 2-metilbutan-1-olis (5.6) 3,0 3-metilbutan-1-olis (5.7) 3,0 Etilacetatas (5.8) 3,0 Butan-1-olis (5.9) 3,0 Butan-2-olis (5.10) 3,0 Acetaldehidas (5.11) 3,0 Acetalis (5.12) 3,0 1 pastaba. Siekiant kiek įmanoma sumažinti nuostolius dėl garavimo, acetalį ir acetaldehidą būtų geriau pilti paskutinius. ▼M3 5.14.1a. Etaloninis tirpalas A, naudojamas tik žemės ūkio kilmės etilo alkoholiui, yra ruošiamas reagentus, kuriuose aukštesniųjų alkoholių kiekiai yra mažesni, pilant pipete, kad būtų gauti etaloniniai tirpalai, kurių koncentracija artima teisės aktais nustatytoms žemės ūkio kilmės etilo alkoholio ribinėms vertėms. ▼B 5.14.2. Etaloninis tirpalas B Į 100 ml talpos matavimo kolbą, įpilama apie 80 ml etanolio tirpalo (5.13), pipete įpilama 3 ml pentan-3-olio arba kito tinkamo vidinio etalono (5.5), iki žymės skiedžiama etanolio tirpalu (5.13) ir gerai sumaišoma. Užrašoma kolbos, įpilto pentan-3-olio arba kito vidinio etalono ir suminė kolbos turinio masė. ▼M3 5.14.2a. Etaloninis tirpalas B, naudojamas tik žemės ūkio kilmės etilo alkoholiui, ruošiamas tinkamą vidinį etaloną, kurio kiekiai yra mažesni, pilant pipete, kad būtų gauti etaloniniai tirpalai, kurių koncentracija artima teisės aktais nustatytoms žemės ūkio kilmės etilo alkoholio ribinėms vertėms. ▼B 5.14.3. Etaloninis tirpalas C Į 100°ml talpos matavimo kolbą įpilama apie 80°ml etanolio tirpalo (5.13). Pipete įpilama 1 ml tirpalo A (5.14.1) ir 1 ml tirpalo B (5.14.2). Iki žymės skiedžiama etanolio tirpalu (5.13) ir gerai sumaišoma. Užrašoma kolbos, kiekvieno pridėto komponento ir suminė galutinė kolbos turinio masė. 5.14.4. Etaloninis tirpalas D Analizės tęstinumui užtikrinti, ruošiamas kokybės kontrolės etalonas, naudojant pirmiau paruoštą etaloną A (5.14.1). Į 100 ml talpos kolbą įpilama apie 80 ml etanolio tirpalo (5.13) ir pipete įpilama 1 ml tirpalo A (5.14.1). Iki žymės skiedžiama etanolio tirpalu (5.13) ir gerai sumaišoma. Užrašoma kolbos, kiekvieno pridėto komponento ir suminė galutinė kolbos turinio masė. 5.14.5. Etaloninis tirpalas E Į 100 ml talpos kolbą įpilama apie 80 ml etanolio (5.13), pipete pripilama 10 ml tirpalo B (5.14.2), iki žymės skiedžiama etanolio tirpalu (5.13) ir gerai sumaišoma. Užrašoma kolbos, kiekvieno pridėto komponento ir suminė galutinė kolbos turinio masė. 5.14.6. Etaloniniai tirpalai FID atsako tiesiškumui tikrinti. Atskirai į 100 ml talpos kolbas įpilama apie 80 ml etanolio tirpalo (5.13), pipete pilama 0, 0,1, 0,5, 1,0, 2,0 ml tirpalo A (5.14.1) ir po 1 ml tirpalo B (5.14.2), iki žymės skiedžiama etanolio tirpalu (5.13) ir gerai sumaišoma. Užrašoma kolbos, kiekvieno pridėto komponento ir suminė galutinė kolbos turinio masė. 5.14.7. Kokybės kontrolės (QC) etaloninis tirpalas Į svėrimo indą pipete įpilama 9 ml etaloninio tirpalo D (5.14.4) ir 1 ml etaloninio tirpalo E (5.14.5), gerai sumaišoma. Užrašoma kolbos, kiekvieno pridėto komponento ir suminė galutinė kolbos turinio masė.

6.   Aparatūra ir įranga

6.1.	Aparatūra tankiui ir alkoholio koncentracijai matuoti.

6.2.	Analizinės svarstyklės, kuriomis būtų galima sverti keturių ženklų po kablelio tikslumu.

6.3.	Dujų chromatografas su programuojama temperatūra, sujungtas su liepsnos jonizacijos detektoriumi ir integratoriumi arba kita duomenų apdorojimo įranga, tinkama smailių plotui arba aukščiui matuoti.

6.4.

Dujų chromatografijos kolonėlė (-ės), galinti (-ios) atskirti analites taip, kad individualių junginių (išskyrus 2-metilbutan-1-olį ir 3-metilbutan-1-olį) mažiausias atskyrimas būtų ne mažesnis kaip 1,3. 2 pastaba. Tinkamų kolonėlių ir GC sąlygų pavyzdžiai: 1.  Prieškolonėlė 1 m × 0,32 mm vidinio skersmens (v.s.) prijungiama prie CP-WAX 57 CB tipo kolonėlės 50 m × 0,32 mm v.s., padengtos 0,2 μm storio plėvele (stabilizuotas polietilenglikolis), toliau Carbowax 400 tipo kolonėlė 50 m × 0,32 mm v.s., padengta 0,2 μm storio plėvele. (Kolonėlės jungiamos suspaudžiama jungtimi). Nešiklis ir jo slėgis: helis (135 kPa) Kolonėlės temperatūra: 17 min. laikoma 35 °C, nuo 35 °C iki 70 °C didinama 12 °C/min., 25 min. laikoma 70 °C Inžektoriaus temperatūra: 150 °C Detektoriaus temperatūra: 250 °C Įšvirkščiamas tūris: 1 μl, padalinimas nuo 20:1 iki 100:1 2.  Prieškolonėlė 1 m × 0,32 mm v.s. prijungiama prie CP-WAX 57 CB tipo kolonėlės 50 m × 0,32 mm v.s., padengtos 0,2 μm storio plėvele (stabilizuotas polietilenglikolis). (Prieškolonėlė prijungiama suspaudžiama jungtimi). Nešiklis ir jo slėgis: helis (65 kPa) Kolonėlės temperatūra: 10 min. laikoma 35 °C, nuo 35 °C iki 110 °C didinama 5 °C/min., nuo 110 °C iki 190 °C didinama 30 °C/min., 2 min. laikoma 190 °C. Inžektoriaus temperatūra: 260 °C. Detektoriaus temperatūra: 300 °C. Įšvirkščiamas tūris: 1 μl, padalinimas 55:1 3.  Įkrautinė kolonėlė (5 % CW 20M, Carbopak B), 2 m × 2 mm v.s. Kolonėlės temperatūra: 4 min. laikoma 65 °C, nuo 65 °C iki 140 °C didinama 10 °C/min., nuo 140 °C iki 150 °C didinama 5 °C/min., 3 min. laikoma 150 °C. Inžektoriaus temperatūra: 65 °C. Detektoriaus temperatūra: 200 °C. Įšvirkščiamas tūris: 1 μl

7.   Ėminio ėmimas ir ėminiai

7.1.	Laboratorinis ėminys Gavus ėminius, nustatoma kiekvieno jų alkoholio koncentracija (6.1).

8.   Darbo eiga (naudojama patvirtintam metodui)

8.1.

Bandinys 8.1.1. Pasveriamas tinkamas uždengtas svėrimo indas ir užrašoma jo masė. 8.1.2. Į kolbą pipete įpilama 9 ml laboratorinio ėminio ir užrašoma masė (MSAMPLE). 8.1.3. Įpilama 1 ml etaloninio tirpalo E (5.14.5) ir užrašoma masė (MIS). 8.1.4. Tiriamasis tirpalas gerai supurtomas (apverčiant mažiausiai 20 kartų). Siekiant sumažinti galimus lakiųjų medžiagų nuostolius, prieš analizę ėminiai turi būti laikomi esant mažesnei kaip 5 °C temperatūrai.

8.2.

Tuščiasis bandymas 8.2.1. Svarstyklėmis keturių skaičių po kablelio tikslumu (6.2) pasveriamas tinkamas uždengtas svėrimo indas ir užrašoma jo masė. 8.2.2. Į kolbą pipete įpilama 9 ml 400 ml/l koncentracijos etanolio tirpalo (5.13) ir užrašoma masė. 8.2.3. Į kolbą pipete įpilama 1 ml etaloninio tirpalo E (5.14.5) ir užrašoma masė. 8.2.4. Tiriamasis tirpalas gerai supurtomas (apverčiant mažiausiai 20 kartų). Siekiant sumažinti galimus lakiųjų medžiagų nuostolius, prieš analizę ėminiai turi būti laikomi esant mažesnei kaip 5 °C temperatūrai.

8.3.	Pradinis tyrimas Etaloninis tirpalas C (5.14.3) įpurškiamas taip, kad visų analičių atskyrimo faktorius būtų ne mažesnis kaip 1,3 (išskyrus 2-metilbutan-1-olį ir 3-metilbutan-1-olį).

8.4.

Kalibravimas Kalibravimas turėtų būti tikrinamas pagal toliau pateiktą metodiką. Reikia užtikrinti, kad atsakas būtų tiesinis nuosekliai analizuojant tris kartus kiekvieną iš tiesiškumo etaloninių tirpalų (5.14.6), turinčių vidinio etalono (IS). Pagal kiekvienam įpurškimui integratoriumi gautą smailių plotą arba jų aukštį apskaičiuojamas kiekvieno šalutinio junginio santykis R ir braižomas grafikas, vaizduojantis R ir šalutinio junginio bei vidinio etalono (IS) koncentracijos verčių santykio funkciją. Gautas grafikas turėtų būti tiesė, kurios koreliacijos koeficientas mažiausiai 0,99.

8.5.

Nustatymas Įšvirkščiama etaloninio tirpalo C (5.14.3) ir 2 QC etaloniniai tirpalai (5.14.7). Toliau įšvirkščiami nežinomos koncentracijos ėminiai (paruošti pagal 8.1 ir 8.2), ir analizės stabilumui užtikrinti kas 10 ėminių įšvirkščiamas vienas QC etalonas. Kas 5 ėminius įšvirkščiamas vienas etaloninis tirpalas C (5.14.3).

9.   Apskaičiavimas

Galima naudoti duomenų automatizuoto gavimo sistemą, jei duomenis galima patikrinti taikant toliau aprašyto metodo principus.

Matuojami šalutinio junginio ir vidinio etalono smailių plotai arba aukščiai.

9.1.

Atsako faktoriaus skaičiavimas. Pagal etaloninio tirpalo C (5.14.3) įpurškimo chromatogramą, kiekvieno šalutinio junginio atsako faktoriai apskaičiuojami taikant 1 lygtį: čia: IS = vidinis etalonas, Šalutinio junginio koncentracija = šalutinio junginio koncentracija tirpale C (5.14.3), IS koncentracija = vidinio etalono koncentracija tirpale C (5.14.3). 9.1.2. Ėminio analizė Taikant toliau pateiktą 2 lygtį apskaičiuojama kiekvieno šalutinio junginio koncentracija ėminiuose. (2) Šalutinio junginio koncentracija čia: MSAMPLE = ėminio masė (8.1.2), MIS = vidinio etalono masė (8.1.3), IS koncentracija = vidinio etalono koncentracija tirpale E (5.14.5), RF = atsako faktorius, gautas pagal (1) lygtį. 9.1.3. Kokybės kontrolės etaloninio tirpalo analizė Naudojant toliau pateiktą 3 lygtį, apskaičiuojama kiekvieno šalutinio junginio, esančio kokybės kontrolės etalonuose (5.14.7), regeneravimo ieškomosios vertės procentinė dalis: QC etalono analitės koncentracija skaičiuojama naudojant 1 ir 2 lygtis.

9.2.

Galutinė rezultatų išraiška Rezultatai iš μg/g perskaičiuojami į g/100 litrų absoliučiojo alkoholio perskaičiuojami taikant 4 lygtį: (4) Koncentracija g/100 litrų absoliutaus alkoholio = koncentracija (μg/g) × ρ × 10/(koncentracija (tūrio proc.)) × 1 000 , čia ρ = tankis kg/m3. Rezultatai pateikiami 3 reikšmingais skaitmenimis ir bent vienos dešimtosios tikslumu, pvz., 11,4 g/100 litrų absoliutaus alkoholio.

10.   Kokybės užtikrinimas ir kontrolė (naudojama patvirtintam metodui)

Taikant (2) lygtį, apskaičiuojama kiekvieno šalutinio junginio, esančio kokybės kontrolės etaloniniuose tirpaluose, paruoštuose taikant 8.1.1–8.1.4 metodikas, koncentracija. Naudojant (3) lygtį, apskaičiuojama ieškomosios vertės regeneravimo procentinė dalis. Jei kiekvieno šalutinio junginio analizės rezultatas yra lygus teorinei vertei ± 10 %, analizę galima tęsti. Priešingu atveju, turėtų būti daromas tyrimas, siekiant nustatyti netikslumo priežastį, ir prireikus taikomas taisomasis veiksmas.

11.   Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

Tarplaboratorinio bandymo statistiniai rezultatai. Lentelėse pateikiamos šių junginių vertės: etanalio, etilacetato, acetalio, viso etanalio, metanolio, butan-2-olio, propan-1-olio, butan-1-olio, 2-metilbutan-1-olio, 3-metilbutan-2-olio.

Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas.

▼M2

III.3.   SPIRITINIŲ GĖRIMŲ LAKIOJO RŪGŠTINGUMO NUSTATYMAS

1.    Taikymo sritis

Metodas buvo patvirtintas atliekant tarplaboratorinį romo, brendžio, vaisių išspaudų ir vaisių spiritinių gėrimų tyrimą esant koncentracijai nuo 30 mg/l iki 641 mg/l.

2.    Norminės nuorodos

ISO 3696:1987. Analizės vanduo. Apibūdinimas ir bandymo metodai.

3.    Apibrėžtys

3.1.	Lakusis rūgštingumas apskaičiuojamas iš suminio rūgštingumo atėmus pastovųjį rūgštingumą.

3.2.	Suminį rūgštingumą sudaro titruojamojo rūgštingumo verčių suma.

3.3.	Pastovusis rūgštingumas yra iki sausojo likučio išgarinto spiritinio gėrimo rūgštingumas.

4.    Principas

Suminis rūgštingumas ir pastovusis rūgštingumas nustatomi titravimo arba potenciometriniu metodu.

5.    Reagentai ir medžiagos

Jei nenurodyta kitaip, analizei turi būti naudojami tik patvirtinti analiziškai gryni reagentai ir bent 3 klasės vanduo, apibrėžtas ISO 3696:1987.

5.1.	0,01 mol/l natrio hidroksido tirpalas (NaOH)

5.2.	Mišriojo indikatoriaus tirpalas: Pasveriama 0,1 g indigokarmino ir 0,1 g fenolio raudonojo. Ištirpinama 40 ml vandens ir skiedžiama iki 100 ml etanoliu.

6.    Aparatūra ir įranga

Pagalbinė laboratorinė aparatūra, A klasės stikliniai indai ir ši įranga:

7.    Ėminių ėmimas ir ėminiai

Ėminiai prieš analizę laikomi kambario temperatūroje.

8.    Procedūra

8.1.   Suminis rūgštingumas

8.1.1.   Ėminio paruošimas

Prireikus pašalinti anglies dioksidą, spiritinis gėrimas veikiamas ultragarsu (apdorojimo ultragarsu metodas) arba dvi minutes maišomas vakuume.

8.1.2.   Titravimas

Į 500 ml kūginę kolbą pipete įpilami 25 ml spiritinio gėrimo.

Įpilama maždaug 200 ml atvėsinto virinto distiliuoto vandens (ruošiamo iš naujo kasdien) ir įlašinami 2–6 lašai mišriojo indikatoriaus tirpalo (5.2).

Titruojama 0,01 mol/l natrio hidroksido tirpalu (5.1), kol žaliai geltona spalva pasikeičia į violetinę, jei titruojami bespalviai spiritiniai gėrimai, arba rudai geltona spalva pasikeičia į raudonai rudą, jei titruojami rudos spalvos spiritiniai gėrimai.

Taip pat galima titruoti potenciometriniu metodu iki pH 7,5.

Tarkime, kad buvo įpilta n1 ml 0,01 mol/l natrio hidroksido tirpalo.

8.1.3.   Skaičiavimas

Suminis rūgštingumas (SR), išreikštas miliekvivalentais litrui spiritinio gėrimo, yra lygus 0,4 × n1.

Suminis rūgštingumas (SR′), išreikštas mg acto rūgšties litrui spiritinio gėrimo, yra lygus 24 × n1.

8.2.   Pastovusis rūgštingumas

8.2.1.   Ėminio paruošimas

25 ml spiritinio gėrimo išgarinama iki sausojo likučio:

8.2.2.   Titravimas

Po išgarinimo likęs likutis ištirpinamas atvėsintame virintame distiliuotame vandenyje (ruošiamas iš naujo kasdien), gautas tirpalas skiedžiamas maždaug iki 100 ml ir įlašinami 2–6 lašai mišriojo indikatoriaus tirpalo (5.2).

Titruojama 0,01 mol/l natrio hidroksido tirpalu (5.1).

Taip pat galima titruoti potenciometriniu metodu iki pH 7,5.

Tarkime, kad buvo įpilta n2 ml 0,01 mol/l natrio hidroksido tirpalo.

8.2.3.   Skaičiavimas

Pastovusis rūgštingumas (PR), išreikštas miliekvivalentais litrui spiritinio gėrimo, yra lygus 0,4 × n2.

Pastovusis rūgštingumas (PR′), išreikštas mg acto rūgšties litrui spiritinio gėrimo, yra lygus 24 × n2.

9.    Lakiojo rūgštingumo skaičiavimas

9.1.	Išreiškiant miliekvivalentais litrui: tarkime, kad: SR – suminis rūgštingumas miliekvivalentais litrui, PR – pastovusis rūgštingumas miliekvivalentais litrui. Lakusis rūgštingumas LR, miliekvivalentais litrui, yra lygus: SR – PR.

9.2.	Išreiškiant mg acto rūgšties litrui: tarkime, kad: SR′ – suminis rūgštingumas mg acto rūgšties litrui, PR′ – pastovusis rūgštingumas mg acto rūgšties litrui. Lakusis rūgštingumas LR′, mg acto rūgšties litrui, yra lygus: SR′ – PR′.

9.3.	Išreiškiant g acto rūgšties hl grynojo 100 % tūrio alkoholio, rūgštingumas yra lygus: , čia: A – spiritinio gėrimo tūrinė alkoholio koncentracija.

10.    Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

10.1.   Tarplaboratorinio tyrimo statistiniai rezultatai

Šie duomenys buvo gauti atliekant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas [1] [2].

Ėminių tipai:

A	Slyvų spiritas; dviejų skirtingų koncentracijos verčių ėminiai*

B	Romas I; kartotiniai kontroliniai ėminiai

C	Romas II; dviejų skirtingų koncentracijos verčių ėminiai*

D	Slivovica; kartotiniai kontroliniai ėminiai

E	Brendis; kartotiniai kontroliniai ėminiai

F	Vynuogių išspaudų spiritas; kartotiniai kontroliniai ėminiai

▼M1

V.   ANETOLAS. TRANS-ANETOLO NUSTATYMAS SPIRITINIUOSE GĖRIMUOSE DUJŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU

1.   Taikymo sritis

Šis metodas tinka nustatyti trans-anetolą anyžių skonio spiritiniuose gėrimuose, taikant kapiliarinės dujų chromatografijos metodą.

2.   Normatyvinės nuorodos

ISO 3696: 1987 Analizės laboratorijų naudojamas vanduo. Specifikacijos ir bandymo metodai.

3.   Metodo esmė

Trans-anetolo koncentracija spiritiniuose gėrimuose nustatoma dujų chromatografijos (DC) metodu. Į mėginį ir į žinomos koncentracijos trans-anetolo etaloninį tirpalą dedamas vienodas kiekis vidinio standarto, pvz., 4-alilanizolo (estragolo), jei estragolo natūraliai nėra mėginyje, abu tirpalai praskiedžiami 45 % etanolio tirpalu ir tiesiogiai įpurškiami į DC sistemą. Likeriai, turintys didelius cukrų kiekius, prieš mėginio ruošimą ir analizę turi būti ekstrahuojami.

4.   Reagentai ir medžiagos

Analizei naudojami cheminiai reagentai, kurių grynumas būtų ne mažesnis nei 98 %. Naudojamas vanduo turėtų būti bent 3 kategorijos, kaip apibrėžta ISO 3696.

Etaloninės medžiagos turi būti laikomos šaltai (esant 4 °C), apsaugotos nuo šviesos, aliuminio induose arba dažyto stiklo (gintaro spalvos) cheminių reagentų buteliuose. Būtų gerai, jei kamščiai turėtų sandarinantį dangtelį iš aliuminio. Prieš naudojant kristalinis trans-anetolas turi būti „išlydytas“, tai darant temperatūra niekuomet neturi būti didesnė kaip 35 °C.

4.1.	96 % tūrio etanolis (CAS 64-17-5)

4.2.	1-metoksi-4-(1-propenil benzenas; (trans-anetolas) (CAS 4180-23-8)

4.3.	4-alilanizolas, (estragolas) (CAS 140-67-0), pasiūlytas vidinis standartas (VS)

4.4.	45 % tūrio etanolis Įpilkite 560 g distiliuoto vandens į 378 g 96 % tūrio etanolio.

4.5.

Etaloninių tirpalų ruošimas Visi etaloniniai tirpalai turi būti laikomi esant kambario temperatūrai (15–35 °C), apsaugoti nuo šviesos, aliuminio induose arba dažyto stiklo (gintaro spalvos) cheminių reagentų buteliuose. Būtų gerai, jei kamščiai turėtų sandarinantį dangtelį iš aliuminio. Trans-anetolas ir 4-alilanizolas beveik netirpsta vandenyje, todėl prieš pilant į juos 45 % etanolį (4.4), trans-anetolą ir 4-alilanizolą reikia ištirpinti nedideliame kiekyje 96 % etanolio (4.1). Pradiniai tirpalai turi būti gaminami iš naujo kiekvieną savaitę. 4.5.1.   Etaloninis A tirpalas Pradinis trans-anetolo tirpalas (koncentracija: 2 g/l) Į 20 ml matavimo kolbą pasverkite 40 mg trans-anetolo (4.2) (arba 400 mg į 200 ml ir t. t.). Įpilkite nedidelį tūrį 96 % etanolio (4.1) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite. 4.5.2.   Vidinio standarto B tirpalas Pradinis vidinio standarto, pvz., estragolo, tirpalas (koncentracija: 2 g/l) Į 20 ml matavimo kolbą pasverkite 40 mg estragolo (4.3) (arba 400 mg į 200 ml ir t. t.). Įpilkite nedidelį tūrį 96 % etanolio (4.1) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite. 4.5.3.   Tirpalai, naudojami liepsnos jonizacinio detektoriaus (FID) atsako tiesiškumui tikrinti Prieš analizę turi būti patikrintas FID atsako tiesiškumas, atsižvelgiant į tai, kad trans-anetolo koncentracijos spiritiniuose gėrimuose verčių intervalas yra 0 g/l–2,5 g/l. Pagal analizės metodiką analizei skirti nežinomi spiritinių gėrimų mėginiai skiedžiami 10 kartų (8.3). Esant metode aprašytoms analizės sąlygoms, pradiniai tirpalai, atitinkantys 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2, ir 0,25 g/l trans-anetolo koncentracijos analizuojamame mėginyje vertes, ruošiami taip: pipete paimkite 0,5, 1, 1,5, 2 ir 2,5 ml pradinio A tirpalo (4.5.1) ir supilkite į atskiras 20 ml matavimo kolbas; į kiekvieną kolbą pipete įpilkite 2 ml vidinio standarto B tirpalo (4.5.2) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite. Kaip tuščiojo bandymo tirpalas (8.4) naudojamas 0 g/l koncentracijos tirpalas. 4.5.4.   Etaloninis C tirpalas Pipete paimkite 2 ml etaloninio A tirpalo (4.5.1) ir supilkite į 20 ml matavimo kolbą, įpilkite 2 ml vidinio standarto B tirpalo (4.5.2) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite.

5.   Aparatūra ir įranga

5.1.	Kapiliarinis dujų chromatografas su liepsnos jonizaciniu detektoriumi (FID) ir integratoriumi arba kita duomenų apdorojimo sistema, galinčia matuoti smailių aukštį arba plotą, ir automatiniu mėginių tiekėju arba su įranga, reikalinga mėginiui įpurkšti rankiniu būdu.

5.2.	Dalijantis/nedalijantis inžektorius

5.3.	Kapiliarinė kolonėlė, pvz.: ilgis – 50 m, vidinis skersmuo – 0,32 mm, plėvelės storis – 0,2 μm, nejudančioji fazė: FFAP – TPA (tereftalio rūgštimi) modifikuoto polietilenglikolio tinklinės struktūros akytas polimeras.

5.4.	Įprasta laboratorijos įranga: A markės tūrio matavimo stikliniai indai, analizinės svarstyklės (preciziškumas: ± 0,1 mg).

6.   Chromatografinės analizės sąlygos

Kolonėlės tipas bei matmenys ir DC sąlygos turi būti tokios, kad anetolas ir vidinis standartas būtų atskirti vienas nuo kito ir nuo visų trukdančių medžiagų. Tipinės sąlygos, naudojant 5.3 pavyzdžio kolonėlę, yra tokios:

6.1.	Nešiklis: analiziškai grynas helis

6.2.	Srautas – 2 ml/min

6.3.	Inžektoriaus temperatūra – 250 °C

6.4.	Detektoriaus temperatūra – 250 °C

6.5.	Krosnies temperatūros sąlygos: izoterminės, 180 °C, trukmė 10 min

6.6.	Įpurškiamas tūris: 1 μl, srauto dalijimas – 1:40.

7.   Mėginiai

Mėginiai turi būti laikomi esant kambario temperatūrai, apsaugoti nuo šviesos ir šalčio.

8.   Darbo eiga

8.1.   Mėginio atranka dėl estragolo

Siekiant patikrinti, ar mėginyje nėra natūralios kilmės estragolo, turi būti daroma tuščiojo bandinio analizė, nepridedant jokio vidinio standarto. Jei yra natūralios kilmės estragolo, turi būti pasirinktas kitas vidinis standartas (pvz., mentolis).

Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimkite 2 ml mėginio ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite.

8.2.   Nežinomų mėginių ruošimas

Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimkite 2 ml mėginio, įpilkite 2 ml vidinio standarto B tirpalo (4.5.2) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite.

8.3.   Tuščiasis bandymas

Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimkite 2 ml vidinio standarto B tirpalo B (4.5.2) ir praskieskite iki žymės 45 % tūrio etanoliu (4.4), gerai sumaišykite.

8.4.   Tiesiškumo tikrinimas

Prieš analizės pradžią turi būti patikrintas FID atsako tiesiškumas, tris kartus paeiliui analizuojant kiekvieną tiesiškumo tikrinimo etalono tirpalą (4.5.3).

Pagal smailių ploto arba aukščio vertes, gautas kiekvienam įpurškimui, nubraižykite grafiką, vaizduojantį pradinio tirpalo koncentraciją g/l kaip R santykio funkciją.

R – trans-anetolo ir estragolo smailių aukščio arba ploto santykis.

Gautas grafikas turi būti tiesė.

8.5.   Nustatymas

Įšvirkškite tuščiojo bandinio tirpalą (8.3), po jo etaloninį C tirpalą (4.5.4), vieną iš etalonų tiesiškumui nustatyti (4.5.3), kuris būtų kokybės kontrolės mėginys (jis gali būti pasirinktas atsižvelgiant į numanomą trans-anetolo koncentracija nežinomame mėginyje), ir penkis nežinomos koncentracijos tirpalus (8.2); norint užtikrinti analizės stabilumą, po penkių nežinomos koncentracijos mėginių įšvirkškite tiesiškumo (kokybės kontrolės) mėginį.

9.   Atsako faktoriaus apskaičiavimas

Išmatuokite trans-anetolo ir vidinio standarto smailių plotą (naudodami integratorių arba kitą duomenų apdorojimo sistemą) arba smailių aukštį (rankinis integravimas).

9.1.   Atsako faktoriaus (RFi) apskaičiavimas

Atsako faktorius apskaičiuojamas taip:

RFi = (Ci/plotas arba aukštisi)*(plotas arba aukštisis/Cis)

čia:

Ci	trans-anetolo koncentracija etaloniniame A tirpale (4.5.1)

Cis	vidinio standarto koncentracija etaloniniame B tirpale (4.5.2)

plotasi

trans-anetolo smailės plotas (arba aukštis)

plotasis

vidinio standarto smailės plotas (arba aukštis)

RFi apskaičiuojamas pagal penkis C tirpalo mėginius (4.5.4).

9.2.   Atsako tiesiškumo tikrinimo tirpalų analizė

Įšvirkškite atsako tiesiškumo tikrinimo tirpalus (4.5.3).

9.3.   Mėginio analizė

Įšvirkškite nežinomo mėginio tirpalą (8.2).

10.   Rezultatų apskaičiavimas

Trans-anetolo koncentracijai apskaičiuoti naudojama ši formulė:

ci = Cis * (plotas arba aukštisi/plotas arba aukštisis)*RFi

čia:

ci	nežinoma trans-anetolo koncentracija

Cis	vidinio standarto nežinomame tirpale koncentracija (4.5.2)

plotas arba aukštisi

trans-anetolo smailės plotas arba aukštis

plotas arba aukštisis

vidinio standarto smailės plotas arba aukštis

RFi	atsako faktorius (apskaičiuotas kaip 9.1)

Trans-anetolo koncentracija išreiškiama gramais litre vieno ženklo po kablelio tikslumu.

11.   Kokybės užtikrinimas ir kontrolė

Chromatogramos turėtų būti tokios, kad anetolas ir vidinis standartas būtų atskirti vienas nuo kito ir nuo kitų trukdančių medžiagų. RFi vertė apskaičiuojama pagal rezultatus, gautus penkis kartus įpurškiant C tirpalą C (4.5.4). Jei variacijos koeficiento (CV % = (standartinis nuokrypis/vidutinė vertė)*100)) vertė skiriasi ne daugiau kaip ± 1 %, RFi vidutinė vertė yra priimtina.

Šis skaičiavimas turi būti naudojamas apskaičiuoti trans-anetolo koncentraciją mėginyje, kuris kokybės kontrolei buvo pasirinktas iš tiesiškumo kontrolės tirpalų (4.5.3).

Jei vidutiniai rezultatai, gauti analizuojant tiesiškumo tikrinimo tirpalą, pasirinktą kokybės kontrolės vidiniu standartu, ir jų teorinės vertės skiriasi ne daugiau kaip ± 2,5 %, nežinomiems mėginiams gauti rezultatai gali būti priimti.

12.   Spiritinio gėrimo, turinčio didelį cukraus kiekį, ir likerio mėginių apdorojimas prieš DC analizę

Alkoholio ekstrahavimas iš spiritinio gėrimo, turinčio didelį cukraus kiekį, kad būtų galima nustatyti trans-anetolo koncentraciją, taikant kapiliarinės dujų chromatografijos metodą.

12.1.   Metodo esmė

Paimama likerio mėginio alikvotinė dalis ir į ją įdedama vidinio standarto, kurio koncentracija būtų panaši į analitės (trans-anetolo) koncentraciją likeryje. Į šį tirpalą įdedama natrio fosfato dodekahidrato ir amonio sulfato. Gautas mišinys gerai supurtomas ir atšaldomas, susidaro du sluoksniai, viršutinis alkoholinis sluoksnis nupilamas. Paimama alikvotinė šio alkoholinio tirpalo dalis ir praskiedžiama 45 % etanolio tirpalu (4.4). (Pastaba: šioje stadijoje vidinio standarto nededama, nes jis jau yra įdėtas.) Gautas tirpalas analizuojamas dujų chromatografijos metodu.

12.2.   Reagentai ir medžiagos

Ekstrahuodami naudokite cheminius reagentus, kurių grynumas yra didesnis kaip 99 %.

12.2.1.

Amonio sulfatas, bevandenis (CAS 7783-20-2).

12.2.2.

Natrio dihidrofosfato dodekahidratas (CAS 10039-32-4).

12.3.   Aparatūra ir įranga

Kūginės kolbos, šaldytuvas.

12.4.   Darbo eiga

12.4.1.   Mėginio atranka dėl estragolo

Siekiant patikrinti, ar mėginyje nėra natūralios kilmės estragolo, turi būti daromas tuščiojo bandinio ekstrahavimas (12.6.2) ir analizė, nepridedant jokio vidinio standarto. Jei yra natūralios kilmės estragolo, turi būti pasirinktas kitas vidinis standartas.

12.4.2.   Ekstrahavimas

Į kūginę kolbą pipete įpilkite 5 ml 96 % etanolio (4.1), pasverkite į šią kolbą 50 mg vidinio standarto (4.3), ir įpilkite 50 ml mėginio. Įdėkite 12 g bevandenio amonio sulfato (12.2.1) ir 8.6 g natrio dihidrofosfato dodekahidrato (12.2.2). Kūginę kolbą užkimškite.

Purtykite kolbą bent 30 min. Galima naudoti mechaninę purtyklę, bet ne teflonu dengtą magnetinės maišyklės strypą, kadangi teflonas absorbuos tam tikrą analitės dalį. Atkreipkite dėmesį,, kad įdėtos druskos visiškai neištirpsta.

Užkimštą kolbą bent dviem valandom padėkite į šaldytuvą (T < 5 °C).

Pasibaigus šiam laikui turi būti du atskiri skysčio sluoksniai ir kietos nuosėdos. Alkoholinis sluoksnis turėtų būti skaidrus; jei neskaidrus, padėkite vėl į šaldytuvą tol, kol sluoksniai aiškiai atsiskirs.

Kai alkoholinis sluoksnis pasidaro skaidrus, atsargiai paimkite alikvotinę jo dalį (pvz., 10 ml), nepajudindami vandeninio sluoksnio, supilkite ją į gintarinės spalvos buteliuką, kurį gerai užkimškite.

12.4.3.   Ekstrahuoto mėginio ruošimas analizei

Leiskite ekstraktui (12.4.2) sušilti iki kambario temperatūros.

Į 20 ml matavimo kolbą pipete paimkite 2 ml kambario temperatūros ekstrahuoto mėginio alkoholinio sluoksnio tirpalo, praskieskite iki žymės 45 % etanoliu (4.4) ir gerai sumaišykite.

12.5.   Nustatymas

Darykite pagal metodiką, nurodytą 8.5 punkte.

12.6.   Rezultatų apskaičiavimas

Rezultatams apskaičiuoti naudokite šią formulę:

Ci = (mis/V)* (plotasi/plotasis) *RFi

čia:

mis	paimta vidinio standarto (4.3) masė (miligramais) (12.4.2)

V	nežinomo mėginio tūris (50 ml)

RFi	atsako faktorius (9.1)

plotasi

trans-anetolo smailės plotas

plotasis

vidinio standarto smailės plotas

Rezultatai išreiškiami gramais litre vieno ženklo po kablelio tikslumu.

12.7.   Kokybės užtikrinimas ir kontrolė

Darykite pagal metodiką, apibrėžta pirmiau 11 punkte.

13.   Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

Statistiniai tarplaboratorinio tyrimo rezultatai:

šiose lentelėse pateiktos anetolui gautos vertės.

Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas.

Pastis (anyžių likeris):

Mėginių tipas:

A	pastis, aklieji (nežinomi) dvigubi mėginiai

B	pastis, aklieji dvigubi mėginiai

C	pastis, aklieji dvigubi mėginiai

D	pastis, aklieji dvigubi mėginiai

E	pastis, pavienis mėginys

F	pastis, pavienis mėginys

Kiti spiritiniai gėrimai su anyžiumi:

Mėginių tipas:

G	ouzo (graikų anyžių spiritinis gėrimas), dviejų skirtingų koncentracijų mėginiai (*)

H	anis (anyžių degtinė), aklieji dvigubi mėginiai

I	likeris su anyžiaus skoniu, dvigubi mėginiai

J	likeris su anyžiaus skoniu, dvigubi mėginiai.

VI.   GLICIRIZO RŪGŠTIS. GLICIRIZO RŪGŠTIES NUSTATYMAS TAIKANT EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODĄ

1.   Taikymo sritis

Šis metodas tinka nustatyti glicirizo rūgščiai spiritiniuose gėrimuose su anyžiumi, taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą (HPLC). Reglamentas (EEB) Nr. 1576/89 nustato, kad visuose spiritiniuose gėrimuose su anyžiumi, vadinamuose pastis, turi būti 0,05–0,5 g/l glicirizo rūgšties.

2.   Normatyvinės nuorodos

ISO 3696: 1987 Analizės laboratorijų naudojamas vanduo. Specifikacijos ir bandymo metodai.

3.   Metodo esmė

Glicirizo rūgšties koncentracija nustatoma taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą (HPLC) ir radimą UV detektoriumi. Etaloninis tirpalas ir mėginys filtruojami ir atskirai įšvirkščiami į HPLC sistemą.

4.   Reagentai ir medžiagos

Analizei naudokite tik HPLC markės cheminius reagentus, absoliutųjį etanolį ir bent 3 kategorijos vandenį, kaip apibrėžta ISO 3696.

4.1.	Etanolis 96 % tūrio (CAS 64-17-5).

4.2.	Amonio glicirizatas, C42H62O16.NH3 (glicirizo rūgšties amonio druska) (Mol. masė – 839,98) (CAS 53956-04-0) – grynumas ne mažesnis kaip 90 % (Glicirizo rūgšties mol. masė – 822,94).

4.3.	Ledinė acto rūgštis, CH3COOH (CAS 64-19-7).

4.4.	Metanolis, CH3OH (CAS 67-56-1).

4.5.	50 % tūrio etanolis Ruošiant 1 000  ml esant 20 °C: —  96 % tūrio etanolio (4.1) – 521 ml —  vandens (2.0) – 511 ml.

4.6.

HPLC eliuavimo tirpalų ruošimas 4.6.1.   Eliuavimo tirpiklis A (pavyzdys) 80 dalių (tūrio) vandens (2.0) 20 dalių (tūrio) acto rūgšties (4.3). Nudujinkite eliuavimo tirpiklį bent penkias minutes. Pastaba: Jei naudojamas vanduo nebuvo filtruojamas per mikrofiltrą, patartina paruoštąjį eliuavimo tirpiklį filtruoti per organiniams tirpikliams skirtą filtrą, kurio akučių dydis būtų 0,45 μm arba mažesnis. 4.6.2.   Eliuavimo tirpiklis B Metanolis (4.4).

4.7.

Etaloninių tirpalų ruošimas Po dviejų mėnesių visi etaloniniai tirpalai turi būti ruošiami iš naujo. 4.7.1.   Etaloninis tirpalas C Į 100 ml matavimo kolbą pasverkite 0,1 mg tikslumu 25 mg amonio glicirizato (4.2). Įpilkite truputį 50 % tūrio etanolio (4.5) ir ištirpinkite amonio glicirizatą. Jam ištirpus, praskieskite iki žymės 50 % tūrio etanoliu (4.5). Filtruokite per organiniams tirpikliams skirtą filtrą. 4.7.2.   Etaloniniai tirpalai, naudojami prietaisų atsako tiesiškumui tikrinti Paruošiamas 1,0 g/l pradinis tirpalas, į 100 ml matavimo kolbą 0,1 mg tikslumu pasveriant 25 mg amonio glicirizato. Įpilkite truputį 50 % tūrio etanolio (4.5) ir ištirpinkite amonio glicirizatą. Jam ištirpus, praskieskite iki žymės 50 % tūrio etanoliu (4.5). Paruošiami bent keturi kiti tirpalai, atitinkantys 0,05, 0,1, 0,25 ir 0,5 g/l amonio glicirizato, į atskiras 100 ml matavimo kolbas pipete įpilant 5 ml, 10 ml, 25 ml ir 50 ml 1,0 g/l pradinio tirpalo. Praskieskite kolbų turinį iki žymės 50 % tūrio etanoliu (4.5) ir gerai sumaišykite. Visus tirpalus filtruokite per organiniams tirpikliams skirtą filtrą.

5.   Aparatūra ir įranga

5.1.   Atskyrimo sistema

5.1.1.

Efektyvusis skysčių chromatografas.

5.1.2.

Pumpavimo sistema, kuri labai preciziškai galėtų užtikrinti nekintamo dydžio arba programuojamą srautą.

5.1.3.

UV spektrofotometrinio radimo sistema, nustatyta 254 nm bangos ilgiui.

5.1.4.

Tirpiklių nudujinimo sistema.

5.2.	Skaičiuojamasis integratorius arba savirašis, kurio veikimas būtų suderintas su likusia sistemos dalimi.

5.3.	Kolonėlė (pavyzdys): medžiaga: nerūdijantis plienas arba stiklas, vidinis skersmuo: 4–5 mm, ilgis: 100–250 mm, nejudamoji fazė: tinklinės struktūros silicio dioksido, skiepyto oktadecilo funkcine grupe (C18), dalelės (geriau sferinės), didžiausias dalelių dydis – 5 μm.

5.4.	Laboratorijos įranga 5.4.1. Analizinės svarstyklės, preciziškumas – 0,1 mg 5.4.2. A markės tūrio matavimo stikliniai indai 5.4.3. Mažų tūrių filtravimo per mikromembraną įranga.

6.   Chromatografinės analizės sąlygos

6.1.	Eliuavimo charakteristikos: (pavyzdys) —  srautas: 1 ml/min, —  A tirpiklis = 30 %, —  B tirpiklis = 70 %.

6.2.	Radimas: —  UV = 254 nm.

7.   Darbo eiga

7.1.   Spiritinio gėrimo mėginio ruošimas

Jei būtina, filtruokite per organiniams tirpikliams skirtą filtrą (akučių skersmuo – 0,45 μm).

7.2.   Nustatymas

Nusistovėjus chromatografinės analizės sąlygoms:

čia:

c	analizuojamo spiritinio gėrimo glicirizo rūgšties koncentracija gramais litre

C	etaloninio amonio glicirizato tirpalo koncentracija gramais litre

h	glicirizo rūgšties analizuojamame spiritiniame gėrime smailės plotas (arba aukštis)

H	glicirizo rūgšties etaloniniame tirpale smailės plotas (arba aukštis)

P	etaloninio amonio glicirizato grynumas %

823	glicirizo rūgšties molio masė

840	amonio glicirizato molio masė.

8.   Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

Statistiniai tarplaboratorinio tyrimo rezultatai:

šioje lentelėje pateiktos glicirizo rūgščiai gautos vertės.

Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas.

Mėginių tipas:

A	pastis, aklieji dvigubi mėginiai

B	pastis, dviejų skirtingų koncentracijų mėginiai (*)

C	pastis, aklieji dvigubi mėginiai

D	pastis, aklieji dvigubi mėginiai

E	pastis, aklieji dvigubi mėginiai

VII.   CHALKONAI. EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODAS TIKRINANT CHALKONŲ BUVIMĄ ANYŽIŲ LIKERYJE

1.   Taikymo sritis

Šis metodas tinka nustatyti, ar gėrimuose su anyžiaus skoniu yra chalkonų. Chalkonai –natūralieji flavonoidų šeimos dažikliai, kurių yra saldymedžio šaknyje (Glycyrrhiza glabra).

Kad spiritinis gėrimas su anyžiumi galėtų vadintis pastis, jame turi būti chalkonų (Reglamentas (EEB) Nr. 1576/89).

2.   Normatyvinės nuorodos

ISO 3696: 1987 Analizės laboratorijų naudojamas vanduo. Specifikacijos ir bandymo metodai.

3.   Metodo esmė

Paruošiamas etaloninis saldymedžio šaknies ekstrakto tirpalas. Chalkonų buvimas arba nebuvimas nustatomas taikant efektyviosios skysčių chromatografijos metodą (HPLC) ir radimą UV detektoriumi.

4.   Reagentai ir medžiagos

Analizei naudokite tik HPLC markės cheminius reagentus. Etanolis turi būti 96 % tūrio. Turi būti naudojamas bent 3 kategorijos vanduo, kaip apibrėžta ISO 3696

4.1.	Etanolis 96 % tūrio (CAS 64-17-5)

4.2.	Acetonitrilas, CH3CN (CAS 75-05-8)

4.3.	Etaloninė medžiaga: Glycyrrhiza glabra,„saldymedžio šaknis“ Rupiai sumalkite saldymedžio šaknis (Glycyrrhiza glabra). Vidutiniai strypelių pavidalo dalelių matmenys: ilgis: 10–15 mm, storis: 1–3 mm.

4.4.	Natrio acetatas, CH3COONa (CAS 127-09-3)

4.5.	Ledinė acto rūgštis, CH3COOH (CAS 64-19-7)

4.6.

Tirpalų ruošimas 4.6.1.   50 % tūrio etanolis Ruošiant 1 000  ml esant 20 °C: —  96 % tūrio etanolio (4.1) – 521 ml, —  vandens (2.0) – 511 ml. 4.6.2.   A tirpiklis: acetonitrilas HPLC analizinio grynumo acetonitrilas (4.2). Nudujinkite. 4.6.3.   B tirpiklis: 0,1 M natrio acetato buferinis tirpalas, pH 4,66 Pasverkite 8,203 g natrio acetato (4.4), įpilkite 6,005 g ledinės acto rūgšties (4.5) ir matavimo kolboje praskieskite vandeniu (2) iki 1 000  ml.

5.   Etaloninio Glycyrrhiza glabra ekstrakto ruošimas (4.3)

5.1.	Pasverkite 10 g sumaltų saldymedžio šaknų (Glycyrrhiza glabra) (4.3) ir supilkite į apvaliadugnę distiliavimo kolbą, —  įpilkite 100 ml 50 % tūrio etanolio (4.6.1), —  vieną valandą virinkite su grįžtamuoju šaldytuvu, —  filtruokite, —  – filtratą padėkite į šalį vėlesniam naudojimui.

5.2.	Surinkite ekstrahuojamas saldymedžio šaknis nuo filtro, —  supilkite jas į apvaliadugnę distiliavimo kolbą, —  įpilkite 100 ml 50 % tūrio etanolio (4.6.1), —  vieną valandą virinkite su grįžtamuoju šaldytuvu, —  filtruokite. Filtratą padėkite į šalį vėlesniam naudojimui.

5.3.	Saldymedžio šaknys turi būti ekstrahuojamos tris kartus.

5.4.	Sujunkite tris filtratus.

5.5.	Išgarinkite tirpiklį (5.4) sukamuoju garintuvu.

5.6.	Ekstrakto likutį (5.5) surinkite, sunaudodami 100 ml 50 % tūrio etanolio (4.6.1).

6.   Aparatūra ir įranga

6.1.   Atskyrimo sistema.

6.1.1.

Efektyvusis skysčių chromatografas.

6.1.2.

Pumpavimo sistema, kuri galėtų užtikrinti nekintamo dydžio arba programuojamą srautą esant dideliam slėgiui.

6.1.3.

UV/regimosios šviesos spektrofotometrinio radimo sistema, kuri gali būti nustatyta 254 ir 370 nm bangos ilgiui.

6.1.4.

Tirpiklių nudujinimo sistema.

6.1.5.

Kolonėlės krosnis, kuri gali būti nustatyta 40 ± 0,1 °C temperatūrai.

6.2.	Skaičiuojamasis integratorius arba savirašis, kurio veikimas būtų suderintas su likusia sistemos dalimi.

6.3.	Kolonėlė: medžiaga: nerūdijantis plienas arba stiklas, vidinis skersmuo: 4–5 mm, nejudamoji fazė: tinklinės struktūros silicio dioksido, skiepyto oktadecilo funkcine grupe (C18), dalelės (geriau sferinės), didžiausias dalelių dydis – 5 μm (tinklinės struktūros fazės).

6.4.

Įprasta laboratorinė įranga, įskaitant: 6.4.1. analizines svarstykles (preciziškumas: ± 0,1 mg); 6.4.2. distiliavimo aparatą su grįžtamuoju kondensatoriumi, kurį sudaro, pvz.: —  250 ml apvaliadugnė kolba su standartine šlifo jungtimi, —  30 cm ilgio grįžtamasis kondensatorius ir —  šilumos šaltinis (naudojant tinkamą įrangą būtina išvengti bet kokios pirogeninės reakcijos, kurioje dalyvautų ekstrahuojama medžiaga). 6.4.3. Sukamąjį garintuvą. 6.4.4. Filtravimo įranga (t. y. Biuchnerio piltuvas).

6.5.

Chromatografinės analizės sąlygos (pavyzdys). 6.5.1. A (4.6.2) ir B (4.6.3) tirpiklių eliuavimo charakteristikos: —  gradientinis eliuavimas: kitimas nuo 20/80 (V/V) iki 50/50 (V/V) per 15 minučių, —  gradientinis eliuavimas: kitimas nuo 50/50 (V/V) iki 75/25 (V/V) per penkias minutes, —  eliuavimas esant nekintamai 75/25 (V/V) judančiosios fazės sudėčiai, trukmė penkios minutės, —  kolonėlės stabilizavimas tarp mėginių įšvirkštimo, —  eliuavimas esant nekintamai 20/80 (V/V) judančiosios fazės sudėčiai, trukmė penkios minutės. 6.5.2. Srautas – 1 ml/min 6.5.3. UV detektoriaus nustatomieji parametrai: chalkonams rasti detektorius turi būti nustatytas 370 nm, vėliau glicirizo rūgščiai nustatomas 254 nm. Pastaba. Bangos ilgis turi būti pakeistas (370 nm į 254 nm) 30 sekundžių prieš glicirizo rūgšties eliuavimo smailės atsiradimą.

7.   Darbo eiga

7.1.   Spiritinio gėrimo mėginio ruošimas

Filtruokite per organiniams tirpikliams skirtą filtrą (akučių skersmuo – 0,45 μm).

7.2.   Saldymedžio šaknų ekstrakto likučio (5.6) ruošimas

Prieš analizę praskieskite santykiu vienas ir dešimt 50 % tūrio etanoliu (4.6.1).

7.3.   Nustatymas

7.3.1.

Įšvirkškite 20 μl paruošto saldymedžio ekstrakto (7.2). Analizuokite, naudodami pirmiau aprašytas chromatografinės analizės sąlygas (6.5).

7.3.2.

Įšvirkškite 20 μl mėginio (7.1) (spiritinio gėrimo su anyžiaus skoniu mėginys). Analizuokite, naudodami pirmiau aprašytas chromatografinės analizės sąlygas (6.5).

7.3.3.

Palyginkite abi chromatogramas. Chromatogramos chalkonų išėjimo srityje turi būti labai panašios (nustatymas esant 370 nm ir pirmiau aprašytoms analizės sąlygoms) (žr. 1 paveikslą).

8.    Pastis gėrimui būdinga chromatograma

1 paveikslas

Chromatograma, gauta aprašytu metodu, rodo chalkonų buvimą pastis gėrime. 1–8 smailės yra chalkonų smailės, 9 smailė – glicirizo rūgšties.

9.   Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

Tarplaboratorinio tyrimo rezultatai:

šioje lentelėje rodomas chalkonų buvimo arba nebuvimo pastis ir anyžių skonio spiritiniuose gėrimuose nustatymo metodo efektyvumas.

Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas.

Mėginių tipas:

A	pastis, aklieji dvigubi mėginiai

B	pastis, pavienis mėginys

C	pastis, pavienis mėginys

D	pastis (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai

E	pastis (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai

F	likeris su anyžiaus skoniu (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai

G	likeris su anyžiaus skoniu (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai

H	ouzo (be chalkonų), pavienis mėginys

I	ouzo (be chalkonų), pavienis mėginys

J	anis (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai

K	pastis (be chalkonų), aklieji dvigubi mėginiai.

▼M2

VIII.    SUMINIS CUKRŲ KIEKIS

1.    Taikymo sritis

Efektyviosios skysčių chromatografijos ir lūžio rodiklio matavimo (HPLC–RI) metodas taikomas spiritinių gėrimų suminiam cukrų kiekiui nustatyti (jį išreiškiant invertuotojo cukraus kiekiu), išskyrus likerius, kurių sudėtyje yra kiaušinių ir pieno produktų.

Metodas buvo patvirtintas atliekant tarplaboratorinį anyžių likerio (pastis), graikiško anyžių likerio, vyšnių likerio, kremo likerio (nurodant vaisiaus arba naudotos žaliavos pavadinimą) ir juodųjų serbentų kremo likerio tyrimą, esant nuo 10,86 g/l iki 509,7 g/l koncentracijai. Tačiau prietaiso atsako tiesiškumas buvo patvirtintas koncentracijai nuo 2,5 g/l iki 20,0 g/l.

Šis metodas nėra skirtas mažoms cukrų koncentracijos vertėms nustatyti.

2.    Norminės nuorodos

ISO 3696:1987. Analizės vanduo. Apibūdinimas ir bandymo metodai.

3.    Principas

Cukrų tirpalų analizė efektyviosios skysčių chromatografijos metodu, kad būtų nustatyta juose esančios gliukozės, fruktozės, sacharozės, maltozės ir laktozės koncentracija.

Taikant šį metodą, kaip pavyzdys naudojama alkilaminų nejudančioji fazė ir aptikimas diferencinės refraktometrijos metodu. Taip pat kaip nejudančiąją fazę būtų galima naudoti anijonitines dervas.

4.    Reagentai ir medžiagos

4.1.	Gliukozė (CAS 50–99–7), ne mažesnio kaip 99 % grynumo.

4.2.	Fruktozė (CAS 57–48–7), ne mažesnio kaip 99 % grynumo.

4.3.	Sacharozė (CAS 57–50–1), ne mažesnio kaip 99 % grynumo.

4.4.	Laktozė (CAS 5965–66–2), ne mažesnio kaip 99 % grynumo.

4.5.	Maltozės monohidratas (CAS 6363–53–7), ne mažesnio kaip 99 % grynumo.

4.6.	Grynas acetonitrilas (CAS 75–05–8) HPLC analizei.

4.7.	Distiliuotas ar demineralizuotas vanduo, pageidautina filtruotas per mikrofiltrą.

4.8.

Tirpikliai (pavyzdys) Eliuavimo tirpiklį sudaro: 75 tūrio dalys acetonitrilo (4.6), 25 tūrio dalys distiliuoto vandens (4.7). Degazuojama 5–10 minučių leidžiant nestiprią helio srovę. Jei naudojamas vanduo nebuvo filtruotas per mikrofiltrą, tirpiklis turi būti filtruojamas per organiniams tirpikliams skirtą filtrą, kurio akučių dydis lygus 0,45 μm arba mažesnis.

4.9.	Absoliutusis etanolis (CAS 64–17–5).

4.10.

Etanolio tirpalas (5 % tūrio).

4.11.

Pradinio etaloninio tirpalo (20 g/l) paruošimas Pasveriama po 2 g kiekvieno analizuojamo cukraus (4.1–4.5) ir visi svėriniai be nuostolių suberiami į 100 ml matavimo kolbą. (NB. 2,11 g maltozės monohidrato atitinka 2 g maltozės). Skiedžiama iki 100 ml 5 % tūrio etanolio tirpalu (4.10), tirpalas supurtomas ir laikomas maždaug + 4 °C temperatūroje. Naujas pradinis tirpalas ruošiamas kartą per savaitę.

4.12.

Darbinių etaloninių tirpalų paruošimas (2,5; 5,0; 7,5; 10,0 ir 20,0 g/l) Pradinis etaloninis tirpalas 20 g/l (4.11) atitinkamai skiedžiamas 5 % tūrio etanolio tirpalu (4.10), kad būtų gauti penki darbiniai 2,5; 5,0; 7,5; 10,0 ir 20,0 g/l etaloniniai tirpalai. Filtruojami per filtrą, kurio akučių dydis lygus 0,45 μm arba mažesnis (5.3.).

5.    Aparatūra ir įranga

5.1.   HPLC sistema, kuri visų cukrų smailes galėtų atskirti iki bazinės linijos.

5.1.1.

Efektyvusis skysčių chromatografas su šešių padėčių įpurškimo vožtuvu, turinčiu 10 μl kilpą, arba koks nors kitas automatinis ar rankinis įtaisas mažiems tūriams patikimai įpurkšti.

5.1.2.

Siurbimo sistema, kuria būtų galima labai preciziškai gauti ir užtikrinti pastovų arba programuojamą srautą.

5.1.3.

Diferencinis refraktometras.

5.1.4.

Skaičiuojamasis integratorius arba savirašis, kurio veikimas būtų suderintas su likusia įranga.

5.1.5.

Prieškolonėlė: prie analizės kolonėlės rekomenduojama prijungti tinkamą prieškolonėlę.

5.1.6.

Kolonėlė (pavyzdys): Medžiaga: nerūdijantysis plienas arba stiklas. Vidinis skersmuo: 2–5 mm. Ilgis: 100–250 mm (atsižvelgiant į įkrovos dalelių dydį, pavyzdžiui, 250 mm, jei dalelių skersmuo 5 μm. Nejudančioji fazė: su silicio dioksidu sujungtos alkilamino funkcinės grupės, maksimalus dalelių dydis – 5 μm.

5.1.7.

Chromatografinės analizės sąlygos (pavyzdys). Eliuavimo tirpiklis (4.8.), srautas: 1 ml/min. Aptikimas: diferencinė refraktometrija. Siekiant užtikrinti visišką detektoriaus stabilumą, jį reikėtų įjungti kelias valandas prieš naudojimą. Į palyginamąją kiuvetę turi būti įpilta eliuavimo tirpiklio.

5.2.	Analizinės svarstyklės, kurių tikslumas – 0,1 mg.

5.3.	Mažų tūrių filtravimo įranga, naudojant 0,45 μm mikromembraną.

6.    Ėminių laikymas

Gauti ėminiai prieš analizę laikomi kambario temperatūroje.

7.    Procedūra

7.1.   A DALIS. Ėminių ruošimas

7.1.1.

Ėminys purtomas.

7.1.2.

Ėminys filtruojamas per filtrą, kurio akučių dydis 0,45 μm arba mažesnis (5.3).

7.2.   B DALIS. HPLC

7.2.1.   Nustatymas

Įpurškiama po 10 μl etaloninių tirpalų (4.12) ir ėminių (7.1.2). Analizė atliekama tinkamomis chromatografinės analizės sąlygomis, pavyzdžiui, tokiomis, kurios aprašytos pirmiau.

7.2.2.

Jei kuri nors ėminio smailė būtų didesnio ploto (ar aukščio) nei atitinkama didžiausios koncentracijos etalono smailė, ėminį reikėtų praskiesti distiliuotu vandeniu ir analizuoti iš naujo.

8.    Skaičiavimas

Palyginamos dvi – etaloninio tirpalo ir spiritinio gėrimo – chromatogramos. Smailės nustatomos pagal sulaikymo trukmės vertes. Matuojamas smailių plotas (ar aukštis), kad, taikant išorinio etalono metodą, būtų galima apskaičiuoti koncentracijos vertes. Atsižvelgiama į visus ėminio skiedimo veiksmus.

Galutinis rezultatas yra sacharozės, maltozės, laktozės, gliukozės ir fruktozės kiekio suma, išreikšta invertuotojo cukraus kiekiu (g/l).

Invertuotojo cukraus kiekis apskaičiuojamas kaip visų esamų monosacharidų ir redukuojančiųjų disacharidų suminis kiekis, pridedant stechiometrinį gliukozės ir fruktozės kiekį, apskaičiuotą pagal esamą sacharozės kiekį.

Invertuotasis cukrus (g/l)

=

gliukozė (g/l) + fruktozė (g/l) + maltozė (g/l) + laktozė (g/l) + (sacharozė (g/l) × 1,05)

1,05

=

(fruktozės molekulinė masė + gliukozės molekulinė masė)/sacharozės molekulinė masė

9.    Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

9.1.   Tarplaboratorinio tyrimo statistiniai rezultatai

Šie duomenys buvo gauti atliekant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas [1] [2].

▼M1

IX.   KIAUŠINIO TRYNYS. KIAUŠINIO TRYNIO KONCENTRACIJOS SPIRITINIUOSE GĖRIMUOSE NUSTATYMAS – FOTOMETRINIS METODAS

1.   Taikymo sritis

Šis metodas tinka nustatyti trynio koncentraciją kiaušininiame likeryje ir likeryje su kiaušiniu 40–250 g/l intervale.

2.   Normatyvinės nuorodos

ISO 3696: 1987 Analizės laboratorijų naudojamas vanduo. Specifikacijos ir bandymo metodai.

3.   Metodo esmė

Kiaušinio trynyje esantys etanolyje tirpūs fosforo junginiai ekstrahuojami ir analizuojami fotometriškai kaip fosforo molibdatinis kompleksas.

4.   Reagentai ir medžiagos

4.1.	Du kartus distiliuotas vanduo

4.2.	Diatomitas

4.3.	96 % tūrio etanolis (CAS 64-17-5)

4.4.	15 % magnio acetato (CAS 16674-78-5) tirpalas

4.5.	10 % sieros rūgšties (CAS 7664-93-9) tirpalas

4.6.	1 N sieros rūgšties tirpalas

4.7.	0,16 g/l kalio dihidrofosfato (CAS 778-77-0), KH2PO4, tirpalas

4.8.

Reagentas fosfatui nustatyti: 20 g amonio molibdato (CAS 12054-85-2), (NH4)6Mo7O24.4H2O, ištirpinkite 400 ml vandens esant 50 °C; kitame inde 1 g amonio vanadato (CAS 7803-55-6), NH4VO3, ištirpinkite 300 ml karšto vandens, duokite tirpalui ataušti ir įpilkite į jį 140 ml koncentruotos azoto rūgšties (CAS 7697-37-2). Supilkite abu ataušintus tirpalus į vieną 1 000  ml matavimo kolbą ir praskieskite iki žymės.

5.   Aparatūra ir įranga

5.1.	100 ml kūginė kolba

5.2.	Ultragarso vonia (arba magnetinė maišyklė)

5.3.	100 ml matavimo kolba

5.4.	20 °C vandens vonia

5.5.	Filtras (vatmanas Nr. 4 arba lygiavertis)

5.6.	Porcelianinis (arba platininis) tiglis

5.7.	Verdančio vandens vonia

5.8.	Kaitinamoji plokštė

5.9.	Mufelinė krosnis

5.10.

50 ml matavimo kolba

5.11.

20 ml matavimo kolba

5.12.

Spektrofotometras, nustatytas 420 nm bangos ilgiui

5.13.

1 cm kiuvetė.

6.   Mėginiai

Prieš analizę mėginiai laikomi esant kambario temperatūrai.

7.   Darbo eiga

7.1.   Mėginių ruošimas

7.1.1.

100 ml kūginę kolbą (5.1) pasverkite 10 g mėginio.

7.1.2.

Lėtai mažomis porcijomis įpilkite 70 ml etanolio (4.3), po kiekvieno pridėjimo sukiodami kolbą, ir 15 min pastatykite į ultragarso vonią (5.2) (arba 10 min maišykite magnetine maišykle (5.2) esant kambario temperatūrai).

7.1.3.

Kūginės kolbos turinį perneškite į 100 ml matavimo kolbą (5.3), plaudami etanoliu (4.3). Praskieskite etanoliu (4.3) iki žymės ir pastatykite kolbas į 20 °C vandens vonią (5.4). Praskieskite iki tūrio kalibravimo žymės esant 20 °C.

7.1.4.

Įdėkite truputį diatomito (4.2) ir filtruokite (5.5), išpildami pirmuosius 20 ml.

7.1.5.

25 ml filtrato įpilkite į porcelianinį (arba platininį) tiglį (5.6). Filtratas turi būti koncentruojamas, lėtai garinant verdančio vandens vonioje (5.7), pridėjus 5 ml 15 % magnio acetato tirpalo (4.4).

7.1.6.

Pastatykite tiglius ant kaitinamosios plokštės (5.8) ir kaitinkite tol, kol susidaro sausas likutis.

7.1.7.

Likutį iškaitinkite mufelinėje krosnyje (5.9) esant 600 °C tol, kol pelenai tampa baltais, bet ne trumpiau kaip pusantros valandos, tačiau galima palikti pernakt.

7.1.8.

Pelenus ištirpinkite 10 ml 10 % sieros rūgšties (4.5), tirpalą perneškite į 50 ml matavimo kolbą (5.10), nuplaudami distiliuotu vandeniu (4.1), ir praskieskite distiliuotu vandeniu (4.1) iki žymės esant kambario temperatūrai. Šio pelenų tirpalo 5 ml alikvotinė dalis turi būti naudojama fotometrinei analizei skirto mėginio tirpalui paruošti.

7.2.   Fotometrinis fosfato nustatymas

7.2.1.   Palyginamasis tirpalas

7.2.1.1.

50 ml matavimo kolbą (5.10) įpilkite 10 ml 10 % sieros rūgšties (4.5) ir distiliuotu vandeniu (4.1) praskieskite iki žymės.

7.2.1.2.

20 ml matavimo kolbą (5.11) įpilkite 5 ml šio tirpalo (7.2.1.1), 1 ml 1 N sieros rūgšties (4.6), 2 ml fosfato reagento (4.8) ir iki 20 ml praskieskite distiliuotu vandeniu (4.1).

7.2.1.3.

Užkimškite laisvai įstatytų kamščiu, supurtykite, 10 min šildykite verdančio vandens vonioje (5.7) ir 20 min aušinkite 20 °C vandens vonioje (5.4).

7.2.1.4.

Šio palyginamojo tirpalo įpilkite į 1 cm kiuvetę (5.13).

7.2.2.   Mėginio tirpalas

7.2.2.1.

20 ml matavimo kolbą (5.11) įpilkite pelenų tirpalo (7.1.8) 5 ml alikvotinę dalį, 1 ml 1 N sieros rūgšties (4.6), 2 ml fosfato reagento (4.8) ir iki 20 ml praskieskite distiliuotu vandeniu (4.1).

7.2.2.2.

Užkimškite laisvai įstatytų kamščiu, supurtykite, 10 min šildykite verdančio vandens vonioje (5.7) ir 20 min aušinkite 20 °C vandens vonioje (5.4).

7.2.2.3.

Gautą geltonos spalvos tirpalą iš karto analizuokite spektrofotometru (5.12) 1 cm storio kiuvetėje (5.13) esant 420 nm bangos ilgiui, palyginamuoju tirpalu naudodami (7.2.1.4) tirpalą.

7.2.3.   Kalibravimo kreivė

7.2.3.1.

Kalibravimo kreivei gauti į 20 ml matavimo kolbas (5.11) įpilkite 2 ml alikvotinę fosfato reagento tirpalo (4.8) dalį, į kiekvieną po 1 ml 1 N sieros rūgšties (4.6) ir 0, 2, 4, 6, 8, ir 10 ml kalio dihidrofosfato tirpalo (4.7) ir distiliuotu vandeniu (4.1) praskieskite iki 20 ml žymės.

7.2.3.2.

Užkimškite laisvai įstatytų kamščiu, supurtykite, 10 min šildykite verdančio vandens vonioje (5.7), 20 min aušinkite 20 °C vandens vonioje (5.4) ir analizuokite spektrofotometru (5.12) 1 cm storio kiuvetėje (5.13) esant 420 nm bangos ilgiui, ir palyginamuoju tirpalu naudodami (7.2.1.4) tirpalą.

7.2.3.3.

Kalibravimo kreivės gavimas: Natrio dihidrofosfato tirpalas (ml) 0 2 4 6 8 10 P2O5 (mg) 0 0,167 0,334 0,501 0,668 0,835

8.   Rezultatų apskaičiavimas

Kiaušinio trynio kiekis g/l apskaičiuojamas pagal šią formulę:

čia:

110	suminio P2O5 kiekio g 100 g kiaušinio trynio perskaičiavimo faktorius

mg P2O5

vertė, gauta pagal kalibravimo kreivę

tankis

kiaušininio likerio tūrio vieneto masė (g/ml) esant 20 °C

E	kiaušininio likerio masė g

40	5 ml pelenų tirpalo alikvotinės dalies praskiedimo faktorius.

9.   Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

Statistiniai tarplaboratorinio tyrimo rezultatai:

šioje lentelėje pateiktos kiaušinio tryniui gautos vertės.

Šie duomenys buvo gauti darant tarptautinį metodo efektyvumo charakteristikų tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas.

Mėginių tipai

A	Advocaat (kiaušininis likeris), aklieji dvigubi mėginiai

B	Advocaat, aklieji dvigubi mėginiai

C	Advocaat, aklieji dvigubi mėginiai

D	Advocaat (praskiestas), dviejų skirtingų koncentracijų mėginiai (*)

E	Advocaat, aklieji dvigubi mėginiai

▼M2

X.    MEDIENOS CHEMINIŲ JUNGINIŲ – 2-FURALDEHIDO, 5-HIDROKSIMETIL-2-FURALDEHIDO, 5-METIL-2-FURALDEHIDO, VANILINO, ALYVŲ ALDEHIDO, KONIFERILO ALDEHIDO, SINAPO ALDEHIDO, GALO RŪGŠTIES, ELAGO RŪGŠTIES, VANILINO RŪGŠTIES, ALYVŲ RŪGŠTIES IR SKOPOLETINO – NUSTATYMAS SPIRITINIUOSE GĖRIMUOSE EFEKTYVIOSIOS SKYSČIŲ CHROMATOGRAFIJOS METODU (HPLC)

1.    Taikymo sritis

Metodas susijęs su 2-furaldehido, 5-hidroksimetil-2-furaldehido, 5-metil-2-furaldehido, vanilino, alyvų aldehido, koniferilo aldehido, sinapo aldehido, galo rūgšties, elago rūgšties, vanilino rūgšties, alyvų rūgšties ir skopoletino nustatymu efektyviosios skysčių chromatografijos metodu.

2.    Norminės nuorodos

Analizės metodas, kurį patvirtino Tarptautinės vynuogių ir vyno organizacijos (OIV) Generalinė asamblėja ir OIV paskelbė kaip OIV-MA-BS-16:R2009.

3.    Principas

Nustatymas efektyviosios skysčių chromatografijos metodu (HPLC), aptikimas taikant kelių bangos ilgių ultravioletinės spektrofotometrijos ir spektrofluorimetrijos metodus.

4.    Reagentai

Turi būti naudojami analiziškai gryni reagentai. Naudojamas distiliuotas ar bent tokio paties grynumo vanduo. Pageidautina naudoti per mikrofiltrą filtruotą vandenį, kurio savitoji elektrinė varža 18,2 ΜΩ · cm.

4.1.	96 % tūrio etanolis.

4.2.	HPLC kokybės metanolis (B tirpiklis).

4.3.	Acto rūgštis, praskiesta iki 0,5 % tūrio (A tirpiklis).

4.4.	Judančiosios fazės (pateiktos tik kaip pavyzdys). A tirpiklis (0,5 % acto rūgštis) ir B tirpiklis (grynas metanolis). Filtruojama per membraną (akučių dydis 0,45 μm). Prireikus degazuojama ultragarso vonioje.

4.5.	Ne mažesnio kaip 99 % grynumo 2-furaldehido, 5-hidroksimetil-2-furaldehido, 5-metil-2-furaldehido, vanilino, alyvų aldehido, koniferilo aldehido, sinapo aldehido, galo rūgšties, elago rūgšties, vanilino rūgšties, alyvų rūgšties ir skopoletino pamatiniai etalonai.

4.6.

Etaloninis tirpalas: etaloninės medžiagos ištirpinamos 50 % tūrio vandeniniame etanolio tirpale. Galutinės etaloninio tirpalo koncentracijos vertės turėtų būti tokios: 2-furaldehido – 5 mg/l; 5-hidroksimetil-2-furaldehido – 10 mg/l; 5-metil-2-furaldehido – 2 mg/l; vanilino – 5 mg/l; alyvų aldehido – 10 mg/l; koniferilo aldehido – 5 mg/l; sinapo aldehido – 5 mg/l; galo rūgšties – 10 mg/l; elago rūgšties – 10 mg/l; vanilino rūgšties – 5 mg/l; alyvų rūgšties – 5 mg/l; skopoletino – 0,5 mg/l.

5.    Aparatūra

Įprasta laboratorinė įranga

5.1.

Didelio efektyvumo skysčių chromatografas, kuris gali veikti binarinio gradiento režimu ir turi: 5.1.1.  spektrofotometrinį detektorių, kuriuo būtų galima matuoti, kai bangos ilgis yra 260–340 nm. Tačiau pageidautina naudoti diodų matricos daugiabangį detektorių ar panašų įtaisą, kad būtų galima patvirtinti smailių grynumą; 5.1.2.  spektrofluorimetrinį detektorių, kurio sužadinimo bangos ilgis – 354 nm, emisijos bangos ilgis – 446 nm (skopoletino pėdsakams nustatyti; jį taip pat galima aptikti spektrofotometriniu metodu, kai bangos ilgis yra 313 nm). 5.1.3.  Įpurškimo įtaisas, kuriuo būtų galima įpurkšti (pavyzdžiui) 10 ar 20 μl tiriamojo ėminio. 5.1.4.  Didelio efektyvumo skysčių chromatografijos kolonėlė, RP C18 tipo, maksimalus dalelių dydis –5 μm.

5.2.	HPLC skirti švirkštai.

5.3.	Mažo tūrio filtravimo per membraną įtaisas.

5.4.	Integratorius-kompiuteris arba savirašis, kurio veikimas būtų suderintas su visa aparatūra, bet pirmiausia jis turi turėti kelis duomenų registravimo kanalus.

6.    Procedūra

6.1.   Įpurškiamo tirpalo ruošimas

Etaloninis tirpalas ir spiritinis gėrimas prireikus filtruojami per membraną, kurios akučių maksimalus skersmuo yra 0,45 μm.

6.2.

Chromatografinės analizės atlikimo sąlygos: analizė atliekama kambario temperatūroje 5.1 punkte nurodyta įranga, naudojant judančiąsias fazes (4.4), kurių srautas maždaug 0,6 ml per minutę pagal toliau pateiktą gradientą (pateiktas tik kaip pavyzdys) Laikas: 0 min 50 min 70 min 90 min A tirpiklis (vanduo ir rūgštis): 100 % 60 % 100 % 100 % B tirpiklis (metanolis): 0 % 40 % 0 % 0 % Atkreipiamas dėmesys į tai, kad tam tikrais atvejais šį gradientą reikėtų keisti, kad būtų išvengta junginių išplovimo kartu.

6.3.

Nustatymas 6.3.1. Atskirai įpurškiami pamatiniai etalonai, o vėliau – jų mišinys. Atlikimo sąlygos suderinamos taip, kad visų junginių smailių skyros faktoriai būtų lygūs bent 1. 6.3.2. Įpurškiamas pagal 6.1 punktą paruoštas ėminys. 6.3.3. Matuojamas visų etaloninio tirpalo ir spiritinio gėrimo smailių plotas ir apskaičiuojamos koncentracijos vertės.

7.    Rezultatų išraiška

Kiekvienos sudedamosios dalies koncentracija išreiškiama mg/l.

8.    Metodo efektyvumo charakteristikos (preciziškumas)

Šie duomenys buvo gauti 2009 m. atliekant įvairių spiritinių gėrimų analizės metodo efektyvumo charakteristikų tarptautinį tyrimą, vykdytą pagal tarptautines suderintas metodikas [1] [2].

8.1.   2-furalaldehidas

8.2.   5-hidroksimetil-2-furaldehidas

8.3.   5-metil-2-furaldehidas

8.4.   Vanilinas

8.5.   Alyvų aldehidas

8.6.   Koniferilo aldehidas

8.7.   Sinapo aldehidas

8.8.   Galo rūgštis

8.9.   Elago rūgštis

8.10.   Vanilino rūgštis

8.11.   Alyvų rūgštis

8.12.   Skopoletinas

▼M3

XI.    14C KIEKIO ETANOLYJE NUSTATYMAS

1.    Įvadas

Nustatant 14C kiekį etanolyje galima atskirti alkoholį, gautą iš iškastinio kuro (sintetinis alkoholis), ir alkoholį, gautą iš paskutinio vegetacijos periodo žaliavų (fermentacijos būdu gautas alkoholis).

2.    Apibrėžtis

14C kiekis etanolyje yra 14C kiekis, nustatytas čia apibūdintu metodu arba standarto EN 16640 C metodo apraše apibūdintu metodu.

Natūralus 14C kiekis atmosferoje (etaloninė vertė), kurį augalai asimiliuoja vegetacijos metu, yra nepastovus. Todėl etaloninė vertė nustatoma pagal jo kiekį etanolyje iš paskutinio vegetacijos laikotarpio žaliavų. Ši metinė etaloninė vertė nustatoma pagal standartą EN 16640. Tačiau gali būti priimama kita etaloninė vertė, jeigu ją sertifikavo akredituota įstaiga.

3.    Principas

14C kiekis alkoholio, kuriame etanolio yra ne mažiau kaip 85 % masės, mėginiuose nustatomas tiesiogiai pagal skysčių scintiliacijos įvykių skaičių.

4.    Reagentai

4.1.   Tolueno scintiliatorius

5,0 g 2,5-difeniloksazolo (PPO)

0,5 g p-bis-[4-metil-5-feniloksazolil(2)]-benzeno (dimetil-POPOP) 1 litre analiziškai gryno tolueno

Gali būti naudojami komerciniai parengti naudoti tokios pačios sudėties tolueno scintiliatoriai.

4.2.    14C etalonas

Maždaug 1 × 106 dpm/g (maždaug 1,67 × 106 cBq/g) aktyvumo n-heksadekanas 14C; garantinė aktyvumo santykinė paklaida neturi viršyti ± 2 %.

4.3.    14C neturintis etanolis

Iš iškastinių žaliavų gautas sintetinis alkoholis, kuriame etanolio yra ne mažiau kaip 85 % masės, yra skirtas fonui nustatyti.

5.    Aparatūra

6.    Darbo eiga

6.1.   Įrangos reguliavimas

Įranga sureguliuojama pagal gamintojo instrukcijas. Matavimo sąlygos yra optimalios, kai kokybės indekso E2/B vertė yra didžiausia.

E – efektyvumas

B – fonas

Optimizuojami tik du matavimo kanalai. Trečiasis paliekamas palyginimo tikslams.

6.2.   Indikatorinių mėgintuvėlių parinkimas

Į didesnį skaičių, nei vėliau prireiks, indikatorinių mėgintuvėlių įpilama po 10 ml 14C neturinčio sintetinio etanolio ir po 10 ml tolueno scintiliatoriaus. Kiekvienas matuojamas ne mažiau kaip 4 kartus po 100 minučių. Mėgintuvėliai, kurių fonas nuo vidutinės vertės skiriasi daugiau nei ± 1 %, nenaudojami. Gali būti naudojami tik nauji gamykliniai tos pačios partijos mėgintuvėliai.

6.3.   Išorinio etalono ir kanalų santykio (IEKS) nustatymas

Derinant kanalus (6.1 punktas), IEKS nustatomas tinkama kompiuterio programa, kai nustatytas efektyvumas. Naudojamas išorinis etalonas yra 137cezis, kuris jau yra integruotas gamintojo.

6.4.   Mėginio paruošimas

Gali būti matuojami priemaišų neturintys mėginiai, kuriuose etanolio yra ne mažiau kaip 85 % masės ir kurie absorbuoja mažesnio nei 450 nm ilgio bangas. Nedidelis esterių ir aldehidų kiekis neturi trikdomojo poveikio. Alkoholio kiekis mėginyje nustatomas iš anksto, aproksimuojant 0,1 % tikslumu.

7.    Mėginių matavimas naudojant išorinį etaloną

7.2.   Matavimas

Po 10 ml kiekvieno mėginio, paruošto pagal 6.4 punktą, pipete įlašinama į atrinktą indikatorinį mėgintuvėlį, kurio fonas patikrintas, ir automatiniu dozatoriumi įpilama po 10 ml tolueno scintiliatoriaus. Mėginiai mėgintuvėliuose gerai sumaišomi tinkamais sukamaisiais judesiais; neleidžiama, kad skystis sudrėkintų užsukamojo dangtelio polietileninį įdėklą. Tokiu pat būdu paruošiamas fonui išmatuoti skirtas mėgintuvėlis su 14C neturinčiu etanoliu iš iškastinių žaliavų. Atitinkamai metinei 14C vertei patikrinti paruošiamas analogiškas etanolio iš paskutinio vegetacijos laikotarpio žaliavų mėginys; tuo tikslu mėgintuvėlio turinys yra sumaišomas su vidiniu etalonu (žr. 8 punktą).

Palyginamasis ir foninis mėginiai yra įdedami į prietaisą matavimo serijos pradžioje, o serijoje turi būti ne daugiau kaip 10 analizei skirtų mėginių. Bendras vieno mėginio matavimo laikas yra mažiausiai 2 kartus po 100 min., o atskiri mėginiai yra matuojami daliniais etapais po 100 min., kad būtų galima pastebėti bet kokį įrangos nuokrypį ar kitokį defektą (vienas ciklas atitinka vieno mėginio 100 min. matavimo laikotarpį).

Kas keturias savaites paruošiami švieži foninis ir palyginamasis mėginiai.

Jei mėginiai yra šiek tiek prislopinti (IEKS yra apie 1,8), tai šios vertės pokytis tik labai nežymiai paveikia efektyvumą. Jei pokytis neviršija ± 5 %, galima tikėtis tokio pat efektyvumo. Labiau prislopintuose mėginiuose, pavyzdžiui, denatūruoto alkoholio, efektyvumą galima nustatyti iš ekstinkcijos koregavimo grafiko. Jei neturima tinkamos kompiuterinės programos, patikimiems rezultatams gauti būtina naudoti vidinį etaloną.

8.    Mėginių matavimas naudojant vidinį etaloną heksadekaną 14C

8.1.   Darbo eiga

Palyginamasis ir foninis (etanolio iš paskutinio vegetacijos laikotarpio žaliavų ir iš iškastinių žaliavų) mėginiai yra matuojami kartu su tiriama medžiaga. Vienas kartotinis mėginys ruošiamas neatrinktame mėgintuvėlyje, į jį kaip vidinio etalono įdedamas tikslus kiekis (30 μl) heksadekano 14C (jo aktyvumas yra apie 26 269 dpm/gC (maždaug 43 782 cBq/gC)). Kitų mėginių paruošimas ir matavimo laikas nurodytas 7.2 punkte, tačiau mėginių su vidiniu etalonu matavimo laikas gali būti sutrumpintas iki maždaug penkių min., iš anksto nustačius 105 impulsų. Matavimo serijoje naudojami du kartotiniai foniniai ir palyginamieji mėginiai; jie į prietaisą dedami matavimo serijos pradžioje.

8.2.   Vidinio etalono ir indikatorinių mėgintuvėlių naudojimas

Siekiant išvengti užtaršos, kai matuojama naudojant vidinį etaloną, indikatorinius mėgintuvėlius ir vidinį etaloną reikia laikyti ir juos paruošti toli nuo tos vietos, kur ruošiami ir matuojami analizei skirti mėginiai. Po matavimo mėgintuvėlius galima panaudoti dar kartą, patikrinus jų foną. Užsukami dangteliai ir mėgintuvėliai su vidiniu etalonu pašalinami.

9.    Rezultatų išraiška

9.1.   Radioaktyvios medžiagos aktyvumo vienetas yra bekerelis: 1 Bq = 1 virsmas per sekundę.

Specifinis radioaktyvumas yra išreiškiamas bekereliais vienam gramui anglies – Bq/gC.

Rezultatus patogiau išreikšti centibekereliais – cBq/gC.

Taip pat galima naudotis literatūroje pateiktais aprašais ir formulėmis, kuriuose naudojamas matavimo vienetas yra dpm. Norint perskaičiuoti atitinkamą vertę į cBq, dpm vertę reikia padauginti iš 100/60.

9.2.   Rezultatų, gautų naudojant išorinį etaloną, išraiška

9.3.   Rezultatų, gautų naudojant vidinį etaloną, išraiška:

9.4.   Santrumpos

cpmpr

=

vidutinis mėginių skaičiaus dydis per visą matavimo laiką.

cpmNE

=

vidutinė fono impulsų vertė, apskaičiuota tuo pačiu būdu.

cpmIS

=

mėginių su vidiniu etalonu skaičiaus dydis.

dpmIS

=

įpilto vidinio etalono kiekis (kalibravimo radioaktyvumas dpm).

V

=

mėginių tūris (ml).

F

=

gryno alkoholio kiekis (g/ml), atitinkantis jo koncentraciją.

Z

=

efektyvumas, atitinkantis IEKS vertę.

1,918

=

alkoholio kiekis gramais, tenkantis gramui anglies.

10.    Metodo patikimumas

10.1.   Pakartojamumas (r)

r = 0,632 cBq/gC; S(r) = ± 0,223 cBq/gC

10.2.   Atkuriamumas (R)

R = 0,821 cBq/gC; S(R) = ± 0,290 cBq/gC