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ANHANG

BESCHREIBUNG DER REFERENZANALYSEMETHODEN
	I.
	II.
	III.
	III.1.
	III.2.
	III.3.
	IV.
	V.
	VI.
	VII.
	VIII.
	IX.
▼M2
	X.
▼M3
	XI.
▼B

I.   BESTIMMUNG DES ALKOHOLGEHALTS IN VOLUMEN VON SPIRITUOSEN

Einleitung

Die Referenzmethode umfasst zwei Anlagen:

Anlage I : Vorbereitung des Destillats

Anlage II : Messung der Volumenmasse des Destillats

1.   Anwendungsbereich

Die Methode eignet sich für die Bestimmung des tatsächlichen Alkoholgehalts in Volumen von Spirituosen.

2.   Normen

ISO 3696:1987 Wasser für Analysezwecke — Spezifikationen und Testverfahren

3.   Benennungen und Definitionen

3.1.

Referenztemperatur: Die Referenztemperatur für die Bestimmung des Alkoholgehalts in Volumen, der Volumenmasse und der relativen Dichte von Spirituosen beträgt 20 °C. Anmerkung 1: Die Angabe „bei t °C“ ist für alle Bestimmungen (der Volumenmasse oder des Alkoholgehalts in Volumen) vorbehalten, die nicht bei der Referenztemperatur 20 °C ausgedrückt sind.

3.2.	Volumenmasse: Volumenmasse ist der Quotient aus der Masse eines bestimmten Volumens in vacuo einer Spirituose bei 20 °C und seinem Volumen, ausgedrückt in Kilogramm/Kubikmeter, Symbol ρ20 °C oder ρ20.

3.3.

Relative Dichte: Relative Dichte bei 20 °C ist das in Dezimalen ausgedrückte Verhältnis der Volumenmasse von Spirituosen bei 20 °C zur Volumenmasse von Wasser bei 20 °C. Ihr Symbol ist d20 °C/20 °C oder d20/20, oder auch d, sofern eine Verwechslung ausgeschlossen ist. Das gemessene Merkmal darf in der Analysenbescheinigung nur anhand der obigen Symbole angegeben werden. Anmerkung 2: Die relative Dichte lässt sich aus der Volumenmasse ρ20 bei 20 °C ableiten: oder , dabei = 998,203 = Volumenmasse des Wassers bei 20 °C.

3.4.

Tatsächlicher Alkoholgehalt in Volumen: Der tatsächliche Alkoholgehalt in Volumen von Spirituosen entspricht der Anzahl Liter Ethylalkohol, die in 100 l eines Wasser-Alkohol-Gemischs mit der gleichen Volumenmasse wie die Spirituose nach Destillation enthalten sind. Die Referenzwerte für den Alkoholgehalt in Volumen (% vol) bei 20 °C nach Maßgabe der Volumenmasse der Wasser-Alkohol-Gemische bei 20 °C entsprechen den Angaben in der von der Internationalen Organisation für das gesetzliche Messwesen in ihrer Empfehlung Nr. 22 verabschiedeten internationalen Tabelle. Die allgemeine Gleichung für die Beziehung zwischen Alkoholgehalt in Volumen und Volumenmasse des Wasser-Alkohol-Gemischs bei einer gegebenen Temperatur geht aus Kapitel 3 „Alkoholgehalt“ des Anhangs der Verordnung (EWG) Nr. 2676/90 (ABl. L 272 vom 3.10.1990, S. 40) bzw. der Sammlung der Analysemethoden des Internationalen Weinamts (1994), S. 17, hervor. Anmerkung 3: Bei Likören und Cremes, deren genaues Volumen sehr schwer zu messen ist, muss die Probe gewogen und zunächst der Alkoholgehalt in Masse berechnet werden. Umrechnungsformel: ASM = Alkoholgehalt in Masse ρ20 (Alkohol) = 789,24 kg/m3

4.   Prinzip

Nach der Destillation wird der Alkoholgehalt in Volumen des Destillats durch Pyknometrie, durch elektronische Dichtemessung oder durch Dichtemessung mit der hydrostatischen Waage bestimmt.

ANLAGE I: VORBEREITUNG DES DESTILLATS

1.   Anwendungsbereich

Das Verfahren eignet sich für die Zubereitung von Destillaten zur Bestimmung des tatsächlichen Alkoholgehalts in Volumen von Spirituosen.

2.   Prinzip

Die Spirituosen werden destilliert, um die Extraktstoffe (nichtdestillierende Stoffe) vom Ethylalkohol und anderen flüchtigen Bestandteilen zu trennen.

3.   Reagenzien und Material

4.   Gerätschaften

Übliches Laborgerät, insbesondere:

Anmerkung:

Der vorstehend beschriebene Apparat ist für eine Probemenge von mindestens 200 ml vorgesehen. Das Gerät kann jedoch durch Verwendung eines kleineren Destillationskolbens auf kleinere Größe eingestellt werden, sofern ein Spritzaufsatz oder eine ähnliche Vorrichtung zur Vermeidung des Mitnahmeeffekts verwendet wird.

5.   Aufbewahrung der Proben

Vor der Analyse werden die Proben bei Raumtemperatur aufbewahrt.

6.   Verfahren

Vorbemerkung:

6.1.	Überprüfung des Destillationsapparats Der verwendete Apparat muss folgende Leistungen erbringen: Bei der Destillation von 200 ml Wasser-Alkohol-Lösung mit bekannter Konzentration von etwa 50 % vol darf der Alkoholverlust nicht mehr als 0,1 % vol betragen.

6.2.

Spirituosen mit einem Alkoholgehalt von weniger als 50 % vol 200 ml der Spirituose werden in einen Messkolben eingemessen. Die Temperatur dieser Flüssigkeit ist aufzuzeichnen oder diese ist bei Standardtemperatur (20 °C) zu halten. Die Probe wird in den Rundbodenkolben des Destillationsapparats gegossen und der Messkolben dreimal mit rund 20 ml destilliertem Wasser ausgespült. Die Spülflüssigkeit ist jeweils mit in den Destillierkolben zu geben. Anmerkung: Bei Spirituosen mit weniger als 250 g/l Trockenextrakt genügt es, mit 60 ml Spülflüssigkeit zu verdünnen; ansonsten ist zur Verhinderung einer Pyrolyse bei 300 g/l Trockenextrakt mit mindestens 70 ml, bei 400 g/l Trockenextrakt mit mindestens 85 ml und bei 500 g/l Trockenextrakt (Fruchtliköre oder Cremes) mit mindestens 100 ml zu verdünnen. Diese Mengen sind anteilmäßig an abweichende Probevolumen anzupassen. Ein wenig Puffergranulat (3.1) (und Schaumverhinderungsemulsion bei Cremes) hinzufügen. In den Original-200-ml-Messkolben, in dem das Destillat aufgefangen wird, werden 20 ml destilliertes Wasser gegeben. Anschließend kommt dieser Kolben in ein Kaltwasserbad (4.1) (10 °C bzw. — bei Spirituosen mit Anis — 15 °C). Die Destillation vornehmen und dabei Mitnahme oder Verbrennen durch gelegentliches Schütteln des Kolbeninhalts vermeiden, bis das Destillationsniveau wenige Millimeter unter dem Eichstrich des Messkolbens liegt. Nachdem die Temperatur des Destillats auf die Ausgangstemperatur ± 0,5 °C gefallen ist, muss bis zum Eichstrich mit destilliertem Wasser aufgefüllt und sorgfältig gemischt werden. Dieses Destillat wird zur Bestimmung des Alkoholgehalts in Volumen (Anlage II) verwendet.

6.3.

Spirituosen mit einem Alkoholgehalt über 50 % vol 100 ml der Spirituosen werden anhand eines 100-ml-Messkolbens abgemessen und in den Rundbodenkolben des Destillationsgeräts übergeführt. Der Messkolben wird mehrfach mit destilliertem Wasser ausgespült und die Spülflüssigkeit jedes Mal mit in den Destillierkolben gegeben. Genügend Wasser verwenden, damit der Kolbeninhalt ungefähr 230 ml erreicht. In einen 200-ml-Messkolben, in dem das Destillat aufgefangen wird, werden 20 ml destilliertes Wasser gegeben. Anschließend kommt dieser Kolben in ein Kaltwasserbad (4.1) (10 °C bzw. — bei Spirituosen mit Anis — 15 °C). Unter gelegentlichem Schütteln destillieren, bis das Destillationsniveau wenige Millimeter unter dem Eichstrich des 200-ml-Messkolbens liegt. Nachdem die Temperatur des Destillats auf die Ausgangstemperatur ± 0,5 °C gefallen ist, muss bis zum Eichstrich mit destilliertem Wasser aufgefüllt und sorgfältig vermischt werden. Dieses Destillat wird zur Bestimmung des Alkoholgehalts in Volumen (Anlage II) verwendet. Anmerkung: Der Alkoholgehalt der Spirituosen ist doppelt so hoch wie der Alkoholgehalt des Destillats.

ANLAGE II: MESSUNG DER VOLUMENMASSE DES DESTILLATS

METHODE A —   BESTIMMUNG DES TATSÄCHLICHEN ALKOHOLGEHALTS IN VOLUMEN DER SPIRITUOSEN DURCH PYKNOMETRIE

A.1.   Prinzip

Der Alkoholgehalt wird anhand der Volumenmasse des pyknometrisch gemessenen Destillats bestimmt.

A.2.   Reagenzien und Material

Falls nichts anderes angegeben ist, sind in der Analyse lediglich Reagenzien von anerkannter Analysequalität und Wasser von mindestens Grad 3 gemäß ISO-Definition 3696:1987 zu verwenden.

A.2.1.

Natriumchloridlösung (2 % w/v) Für einen Liter Lösung sind 20 g Natriumchlorid abzuwiegen und mit Wasser aufzufüllen.

A.3.   Gerät und Ausrüstung

Übliches Laborgerät, insbesondere:

Anmerkung 1:

Die Methode für die Bestimmung der Volumenmasse in vacuo von Spirituosen erfordert den Einsatz einer zweiarmigen Waage, eines Pyknometers und eines Taragefäßes desselben äußeren Volumens, so dass der Luftdruck jederzeit beseitigt werden kann. Mit einer einarmigen Waage läßt sich dieses einfache Verfahren anwenden, wenn das Taragefäß zur Berücksichtigung der zahlreichen Änderungen des Luftdrucks zusätzlich gewogen wird.

A.4.   Verfahren

Vorbemerkungen:

A.4.1.   Eichung des Pyknometers

Die Eichung des Pyknometers umfasst die Bestimmung folgender Parameter:

A.4.1.1.

Eichung bei Verwendung einer einarmigen Waage Bestimmung —  der Masse des sauberen, trockenen Pyknometers (P), —  der Masse des mit Wasser gefüllten Pyknometers bei t °C (P1), —  der Masse des Taragefäßes (T0). A.4.1.1.1. Das saubere trockene Pyknometer (P) wird gewogen. A.4.1.1.2. Das Pyknometer wird sorgfältig mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gefüllt, und das Thermometer wird angebracht. Das Pyknometer wird sorgfältig abgewischt und in den Mantel mit Wärmeisolierung gesetzt. Das Gefäß wird durch Umkehren so lange geschüttelt, bis die am Thermometer abgelesene Temperatur konstant ist. Das Pyknometer wird dann exakt auf den oberen Rand des seitlichen Röhrchens eingestellt. Die Temperatur t °C wird sorgfältig abgelesen und gegebenenfalls um die Ungenauigkeit der Thermometerskala korrigiert. Das mit Wasser gefüllte Pyknometer (P1) wird gewogen. A.4.1.1.3. Das Taragefäß (T0) wird gewogen. A.4.1.1.4. Berechnung —  Gewicht des leeren Pyknometers = P – m, dabei ist m die Masse der im Pyknometer enthaltenen Luft m = 0,0012 × (P1 – P) Anmerkung 2: 0,0012 ist die Volumenmasse der trockenen Luft bei 20 °C und einem Druck von 760 mm Hg. —  Volumen des Pyknometers bei 20 °C: dabei ist Ft der Faktor für die Temperatur t °C aus Tabelle I von Kapitel 1 „Volumenmasse und relative Dichte“ des Anhangs der Verordnung (EWG) Nr. 2676/90 (S. 10). V20 °C muss mit einer Genauigkeit von ± 0,001 ml bekannt sein. —  Masse des Wassers im Pyknometer bei 20 °C: dabei ist 0,998203 die Volumenmasse des Wassers bei 20 °C. Anmerkung 3: Erforderlichenfalls kann die Volumenmassse der Luft von 0,99715 verwendet und der Alkoholgehalt im Verhältnis zu dem entsprechenden Massenwert berechnet werden, der aus den „HM Customs and Excise tables in air“ abgelesen werden kann.

A.4.1.2.

Eichverfahren bei Verwendung einer zweiarmigen Waage A.4.1.2.1.  Das Taragefäß wird auf die linke Schale der Waage und das saubere und trockene Pyknometer mit seinem „Auffangstöpsel“ auf die rechte Schale der Waage gestellt. Das Gleichgewicht wird hergestellt, indem auf die Pyknometer-Schale gekennzeichnete Massestücke, d. h. „p“-Gramm, gesetzt werden. A.4.1.2.2.  Das Pyknometer wird sorgfältig mit destilliertem Wasser bei Raumtemperatur gefüllt und und das Thermometer angebracht. Das Pyknometer wird sorgfältig abgewischt und in den Mantel mit Wärmeisolierung gesetzt. Das Gefäß wird durch Umkehren so lange geschüttelt, bis die am Thermometer abgelesene Temperatur konstant ist. Das Pyknometer wird dann exakt auf den oberen Rand des seitlichen Röhrchens eingestellt. Dieses seitliche Röhrchen wird abgewischt, der Auffangstöpsel aufgesetzt; die Temperatur t °C wird sorgfältig abgelesen und gegebenenfalls um die Ungenauigkeit der Thermometerskala korrigiert. Das mit Wasser gefüllte Pyknometer wird gewogen; dabei ist p′ die Masse in Gramm, die zur Herstellung des Gleichgewichts erforderlich ist. A.4.1.2.3.  Berechnung —  Gewicht des leeren Pyknometers = p + m, dabei ist m die im Pyknometer enthaltene Luftmasse. m = 0,0012 × (p – p′). —  Volumen des Pyknometers bei 20 °C: dabei ist Ft der Faktor für die Temperatur t °C aus Tabelle I von Kapitel 1 „Volumenmasse und relative Dichte“ des Anhangs der Verordnung (EWG) Nr. 2676/90 (S. 10). V20 °C wird auf ± 0,001 ml genau berechnet. —  Masse des im Pyknometer bei 20 °C enthaltenen Wassers: dabei ist 0,998203 die Volumenmasse des Wassers bei 20 °C.

A.4.2.   Bestimmung des Alkoholgehalts der Probe

A.5.   Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

A.5.1.   Statistische Ergebnisse des Ringversuchs

Bei einem internationalen Ringversuch ergaben sich nach einem international abgestimmten Verfahren [1] [2] folgende Daten:

METHODE B —   BESTIMMUNG DES TATSÄCHLICHEN ALKOHOLGEHALTS VON SPIRITUOSEN — ELEKTRONISCHE DICHTEMESSUNG (GESTÜTZT AUF DIE FREQUENZ DER SCHWINGUNG IN DER ZELLE EINES BIEGESCHWINGERS)

B.1.   Prinzip

Die Volumenmasse der Flüssigkeit wird durch die elektronische Messung der Schwingungen eines schwingenden U-Rohrs bestimmt. Zur Durchführung dieser Messung wird die Probe in ein Schwingungssystem gegeben, dessen Eigenfrequenz durch die Masse der eingeführten Substanz verändert wird.

B.2.   Reagenzien und Material

Falls nichts anderes angegeben ist, sind in der Analyse lediglich Reagenzien von anerkannter Analysequalität und Wasser von mindestens Grad 3 gemäß ISO 3696:1987 zu verwenden.

B.3.   Gerät und Ausrüstung

Übliches Laborgerät, insbesondere:

B.4.   Verfahren

B.5.   Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

B.5.1.   Statistische Ergebnisse des Ringversuchs

Bei einem internationalen Ringversuch ergaben sich nach einem international abgestimmten Verfahren [1] [2] folgende Daten:

METHODE C —   BESTIMMUNG DES TATSÄCHLICHEN ALKOHOLGEHALTS DER SPIRITUOSEN DURCH DICHTEMESSUNG MIT DER HYDROSTATISCHEN WAAGE

C.1.   Prinzip

Der Alkoholgehalt von Spirituosen kann densimetrisch mit Hilfe der hydrostatischen Waage nach dem Archimedes-Prinzip gemessen werden, dem zufolge ein in eine Flüssigkeit eintauchender Körper durch diese einen Auftrieb erfährt, der gleich dem Gewicht der verdrängten Flüssigkeit ist.

C.2.   Reagenzien und Material

Falls nichts anderes angegeben ist, sind während der Analyse nur Reagenzien von anerkannter Analysequalität und Wasser von mindestens Grad 3 gemäß ISO 3696:1987 zu verwenden.

C.2.1.   Schwimmerreinigungslösung (Natriumhydroxid, 30 % w/v)

Für die Zubereitung von 100 ml Lösung werden 30 g Natriumhydroxid gewogen und mit Ethanol von 96 % vol aufgefüllt.

C.3.   Gerät und Ausrüstung

Übliches Laborgerät, insbesondere:

Anmerkung 1:

Auch eine zweiarmige Waage kann verwendet werden; das Prinzip ist in Kapitel 1 „Volumenmasse und relative Dichte“ des Anhangs der Verordnung (EWG) Nr. 2676/90 (S. 7) beschrieben.

C.4.   Verfahren

Zwischen jeder Messung sind Schwimmer und Messzylinder mit destilliertem Wasser zu reinigen, mit weichem, fusselfreiem Laborpapier anzuwischen und mit der Lösung, deren Volumenmasse zu bestimmen ist, zu spülen. Die Messungen sind durchzuführen, sobald die Apparatur wieder im Gleichgewicht ist, um den Alkoholverlust durch Verdampfen zu beschränken.

C.5.   Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

C.5.1.   Statistische Ergebnisse des Ringversuchs

Bei einem internationalen Ringversuch ergaben sich nach einem international abgestimmten Verfahren [1] [2] folgende Daten:

Schaubild 1: Destillationsgerät zur Messung des tatsächlichen Alkoholgehalts in Volumen von Spirituosen
1.1-1-Normalschliffkolben mit genormtem Rundglasstöpsel.
2.20-cm-Vigreux-Rektifizierkolonne.
3.10-cm-West-Kondensator mit geradem Rand.
4.40-cm-Schlangenkühler.

II.   BESTIMMUNG DES GESAMT-TROCKENEXTRAKTS VON SPIRITUOSEN DURCH GRAVIMETRIE

1.   Anwendungsbereich

Entsprechend der Verordnung (EWG) Nr. 1576/89 ist diese Methode lediglich für Aquavit vorgesehen, bei dem der Trockenextrakt nicht mehr als 15 g/l betragen darf.

2.   Normen

ISO 3696:1987: Wasser für Analysezwecke — Spezifikationen und Testverfahren

3.   Definition

Der Gesamt-Trockenextrakt oder die Gesamt-Trockensubstanz stellt die Gesamtmenge aller Substanzen dar, die sich unter bestimmten physikalischen Bedingungen nicht verflüchtigen.

4.   Prinzip

Der nach Verdampfen der Spirituose über kochendem Wasserbad und Trocknen im Trockenofen verbleibende Rückstand wird gewogen.

5.   Gerät und Ausrüstung

6.   Probenahmen und Proben

Die Proben werden vor der Analyse bei Raumtemperatur aufbewahrt.

7.   Verfahren

8.   Berechnung

Die Rückstandsmasse vervielfältigt mit 40 entspricht dem in der Spirituose enthaltenen Trockenextrakt und wird bis zu einer Dezimalstelle in g/l ausgedrückt.

9.   Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

9.1.   Statistische Ergebnisse des Ringversuchs

Bei einem internationalen Ringversuch ergaben sich nach einem international abgestimmten Verfahren [1] [2] folgende Daten:

III.   BESTIMMUNG DER FLÜCHTIGEN BESTANDTEILE VON SPIRITUOSEN

III.1.   ALLGEMEINE BEMERKUNGEN

1.   Definitionen

In der Verordnung (EWG) Nr. 1576/89 sind für eine Reihe von Spirituosen (Rum, Branntwein aus Weinbauerzeugnissen, Obstbrand usw.) ein Mindestgehalt an flüchtigen Bestandteilen außer Ethylalkohol und Methanol festgesetzt worden. Lediglich für diese Reihe von Getränken werden die genannten Werte herkömmlicherweise als äquivalent zur Summe der Konzentrationen folgender Stoffe angesehen:

Die herkömmlichen Methoden zur Bestimmung der flüchtigen Bestandteile sind folgende:

2.   Analyse der flüchtigen Bestandteile durch Gaschromatographie

Gaschromatographische Untersuchungen anderer als der oben genannten flüchtigen Bestandteile können sich als besonders aufschlussreiches Mittel zur Bestimmung sowohl des Ursprungs des bei der Destillation verwendeten Rohmaterials als auch der tatsächlichen Destillationsbedingungen erweisen.

Verschiedene Spirituosen enthalten andere flüchtige Bestandteile wie Aromabestandteile, die für die jeweils zur Alkoholgewinnung verwendeten Ausgangsstoffe, das Aroma der Spirituose und die besonderen Merkmale der Spirituosenzubereitung kennzeichnend sind. Diese Bestandteile sind für die Beurteilung der Anforderungen nach Verordnung (EWG) Nr. 1576/89 von Bedeutung.

III.2.   BESTIMMUNG DER FLÜCHTIGEN AROMABESTANDTEILE VON SPIRITUOSEN DURCH GASCHROMATOGRAPHIE

1.   Anwendungsbereich

Diese Methode eignet sich für die Bestimmung von 1,1-Diethoxyethan (Azetal), Methyl-2-Butanol-1 (Amylalkohol), Methyl-3-Butanol-1 (Isoamylalkohol), Methanol (Methylalkohol), Ethylethanoat (Ethylazetat), Butanol-1 (n-Butanol), Butan-2 (Trockenbutanol), Methyl-2-Propanol-1 (Isobutylalkohol), Propanol-1 (n-Propanol) und Ethanal (Azetaldehyd) in Spirituosen mittels Gaschromatographie. Bei der Methode wird ein interner Standard, z. B. Pentanol-3, verwendet. Die Analytenkonzentrationen werden als Gramm je 100 Liter Alkohol abs. ausgedrückt; der Alkoholgehalt des Erzeugnisses muss vor der Analyse bestimmt werden. Mit dieser Methode können folgende Spirituosen analysiert werden: Whisky, Brandy, Rum, Branntwein, Obstbrand und Tresterbrand.

2.   Normen

ISO 3696:1987: Wasser für Laboranalysenverwendung — Spezifikationen und Testmethoden.

3.   Definition

Aromabestandteile sind während der Gärung, Destillation und Reifung von Spirituosen gleichzeitig mit Ethanol gebildete flüchtige Stoffe.

4.   Prinzip

Aromabestandteile in Spirituosen werden durch Direkteinspritzung der Spirituose oder einer entsprechend verdünnten Spirituose in einen Gaschromathographen (CG) bestimmt. Der Spirituose wird vor der Einspritzung ein angemessener interner Standard hinzugefügt. Die Aromabestandteile werden mit Hilfe eines Temperaturprogramms an geeigneter Kolonne abgetrennt und mit dem Flammenionisationsdetektor (FID) nachgewiesen. Dabei wird die Konzentration des einzelnen Aromabestandteils gegenüber dem internen Standard anhand von Reaktionsfaktoren bestimmt, die bei der Eichung unter identischen Chromatographiebedingungen wie bei der Analyse der Spirituose festgestellt werden.

5.   Reagenzien und Material

Wenn nichts anderes angegeben ist, werden lediglich Reagenzien mit einer Reinheit von über 97 %, die bei einem von der ISO zugelassenen Lieferanten erworben wurden, für die ein Reinheitszeugnis gilt und die anlässlich der Testverdünnung frei von anderen Aromabestandteilen sind (dies lässt sich durch Einspritzung einzelner Aromabestandteilstandards bei Testverdünnung unter Gaschromatographiebedingungen gemäß 6.4 bestätigen), und ausschließlich Wasser von mindestens Grad 3 gemäß Definition ISO 3696 verwendet. Azetal und Azetaldehyd müssen im Dunkeln bei weniger als 5 °C, alle anderen Reagenzien bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.

▼M3

▼B

6.   Gerät und Ausrüstung

7.   Probenahmen und Proben

8.   Verfahren (Verfahren für die validierte Methode)

9.   Berechnung

Für die Behandlung der Daten kann ein automatisches System verwendet werden, sofern die Daten anhand der in nachstehender Methode beschriebenen Prinzipien überprüfbar sind.

Für die Peaks der Aromabestandteile und der internen Standards sind entweder die Peakflächen oder die Peakhöhen zu messen.

10.   Qualitätssicherung und -kontrolle (bei der validierten Methode)

Mit obiger Gleichung (2) wird die Konzentration des einzelnen Aromabestandteils in den Qualitätskontrollstandardlösungen, wie sie nach dem Verfahren gemäß 8.1.1 bis 8.1.4 hergestellt wurden, errechnet. Mit der Gleichung (3) wird der Rückgewinnungssatz des Zielwertes errechnet. Liegen die erzielten Ergebnisse innerhalb ± 10 % der theoretischen Werte der einzelnen Aromabestandteile, so kann die Analyse fortgesetzt werden. Falls nicht, muss nach der Ursache für die Ungenauigkeit gesucht und entsprechende Abhilfe geschaffen werden.

11.   Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

Statistische Ergebnisse des Ringversuchs: In den nachstehenden Tabellen sind die Werte für folgende Verbindungen zusammengefasst: Ethanal, Ethylazetat, Azetal, Gesamtethanal, Methanol, Butanol-2, Propanol-1, Butanol-1, Methyl-2-Propanol-1, Methyl-2-Butanol-1, Methyl-3-Butanol-1.

Bei einem internationalen Ringversuch ergaben sich nach einem international abgestimmten Verfahren folgende Daten:

▼M2

III.3.   BESTIMMUNG FLÜCHTIGER SÄURE IN SPIRITUOSEN

1.    Anwendungsbereich

Die Methode wurde durch einen Ringversuch für Rum, Brandy, Obstbrände und Obsttrester bei Konzentrationen von 30 mg/l bis 641 mg/l validiert.

2.    Normen

ISO 3696:1987 Wasser für Analysezwecke — Spezifikationen und Testverfahren.

3.    Definitionen

3.1.	Die flüchtige Säure wird berechnet durch Subtraktion der nichtflüchtigen Säure von der Gesamtsäure.

3.2.	Die Gesamtsäure entspricht der Summe der titrierbaren Säuren.

3.3.	Der Gehalt an nichtflüchtigen Säuren entspricht dem Säuregehalt des Verdampfungsrückstands der Spirituose.

4.    Prinzip

Gesamtsäure und nichtflüchtige Säure werden durch Titration oder Potentiometrie bestimmt.

5.    Reagenzien und Material

Falls nichts anderes angegeben ist, sind für die Analyse nur Reagenzien von anerkannter Analysequalität und Wasser, das mindestens der Kategorie 3 gemäß den Begriffsbestimmungen nach ISO 3696:1987 entspricht, zu verwenden.

5.1.	Natriumhydroxidlösung (NaOH), 0,01 M.

5.2.	Mischindikatorlösung: 0,1 g Indigocarmin und 0,1 g Phenolrot abwiegen. In 40 ml Wasser auflösen und mit Ethanol auf 100 ml auffüllen.

6.    Gerät und Ausrüstung

Indirekte Laborapparatur, Volumenmessgeräte aus Glas der Kategorie A und Folgendes:

7.    Probenahmen und Proben

Die Proben werden vor der Analyse bei Raumtemperatur gelagert.

8.    Verfahren

8.1.   Gesamtsäure

8.1.1.   Vorbereitung der Probe

Falls erforderlich, wird die Spirituose zur Beseitigung des Kohlendioxids mindestens zwei Minuten lang unter Vakuum gerührt, oder das Kohlendioxid wird durch Ultraschallbestrahlung entfernt.

8.1.2.   Titration

25 ml der Spirituose in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben pipettieren.

Etwa 200 ml abgekühltes, abgekochtes destilliertes Wasser (täglich frisch zubereitet) sowie 2 bis 6 Tropfen der Mischindikatorlösung (5.2) zugeben.

Mit der 0,01 M Natriumhydroxidlösung (5.1) bis zum Farbumschlag von Gelb-Grün nach Violett bei farblosen Spirituosen bzw. von Gelb-Braun zu Rot-Braun bei braunen Spirituosen titrieren.

Es kann ebenfalls eine potentiometrische Titration bei pH 7,5 vorgenommen werden.

Das Volumen in ml an Natronlauge 0,01 M, das hinzugefügt wurde, wird als n1 bezeichnet.

8.1.3.   Berechnung

Die Gesamtsäure (TA), ausgedrückt in Milliäquivalenten je Liter Spirituose, entspricht 0,4 × n1.

Die Gesamtsäure (TA′), ausgedrückt in mg Essigsäure je Liter Spirituose, entspricht 24 × n1.

8.2.   Gebundene Säure

8.2.1.   Vorbereitung der Probe

25 ml der Spirituose zur Trockne eindampfen:

8.2.2.   Titration

Den Verdampfungsrückstand in abgekühltem, abgekochtem destilliertem Wasser (täglich frisch zubereitet) auflösen und auf etwa 100 ml auffüllen; 2 bis 6 Tropfen der Mischindikatorlösung (5.2) zugeben.

Mit der 0,01 M Natriumhydroxidlösung (5.1) titrieren.

Es kann ebenfalls eine potentiometrische Titration bei pH 7,5 vorgenommen werden.

Das Volumen in ml an Natronlauge 0,01 M, das hinzugefügt wurde, wird als n2 bezeichnet.

8.2.3.   Berechnung

Die nichtflüchtige Säure (FA), ausgedrückt in Milliäquivalenten je Liter Spirituose, entspricht 0,4 × n2.

Die nichtflüchtige Säure (FA), ausgedrückt in mg Essigsäure je Liter Spirituose, entspricht 24 × n2.

9.    Berechnung des Gehalts an flüchtigen Säuren

9.1.	Angabe in Milliäquivalenten je Liter: TA = Gesamtsäuregrad in Milliäquivalenten je Liter FA = Gehalt an nichtflüchtigen Säure in Milliäquivalenten je Liter Der Gehalt an flüchtigen Säuren, VA, in Milliäquivalenten je Liter entspricht: TA – FA

9.2.	Angabe in mg Essigsäure je Liter: TA′ = Gesamtsäure in mg Essigsäure je Liter FA′ = nichtflüchtige Säure in mg Essigsäure je Liter Flüchtige Säure, VA, in mg Essigsäure je Liter entspricht: TA′ – FA′

9.3.	Angabe in g Essigsäure je hl reiner Alkohol 100 Vol.- %: Dabei entspricht A dem volumetrischen Alkoholgehalt der Spirituose.

10.    Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

10.1.   Statistische Ergebnisse des Ringversuchs

Bei einem internationalen Ringversuch ergaben sich nach einem international abgestimmten Verfahren [1] [2] folgende Daten:

Art der Proben:

A	Pflaumenbranntwein; Splitwert*

B	Rum I; Blindduplikate

C	Rum II; Splitwert*

D	Sliwowitz; Blindduplikate

E	Brandy; Blindduplikate

F	Tresterbrand; Blindduplikate

▼M1

V.   ANETHOL. BESTIMMUNG VON TRANS-ANETHOL IN SPIRITUOSEN DURCH GASCHROMATOGRAPHIE

1.   Anwendungsbereich

Diese Methode eignet sich für die Bestimmung von trans-Anethol in Spirituosen mit Anis durch Kapillar-Gaschromatographie.

2.   Normen

ISO 3696: 1987 Wasser für analytische Laborzwecke — Spezifikation und Prüfverfahren.

3.   Prinzip

Die trans-Anethol-Konzentration von Spirituosen wird durch Gaschromatographie (GC) bestimmt. Die gleiche Menge eines internen Standards, z. B. 4-Allylanisol (Estragol), wird der Probe und einer trans-Anethol-Referenzlösung mit bekannter Konzentration zugegeben, wenn Estragol nicht natürlicherweise in der zu untersuchenden Probe vorhanden ist; beide werden mit einer 45%igen Ethanollösung verdünnt und direkt in das GC-System eingespritzt. Bei Likören mit hohem Zuckergehalt muss vor der Probenvorbereitung und Analyse eine Extraktion vorgenommen werden.

4.   Reagenzien und Material

Bei der Analyse sind ausschließlich Reagenzien mit einer Reinheit von mindestens 98 % zu verwenden. Es sollte Wasser von mindestens Grad 3 gemäß ISO 3696 verwendet werden.

Referenzsubstanzen sollten gekühlt (4 °C) und lichtgeschützt in Aluminiumbehältern oder in Braunglas-Standflaschen aufbewahrt werden. Die Stopfen sollten mit einer Aluminiumdichtung versehen sein. Trans-Anethol muss vor der Verwendung aus seinem kristallinen Zustand „aufgetaut“ werden, dabei darf die Temperatur aber nie 35 °C übersteigen.

4.1.	Ethanol 96 % vol. (CAS 64-17-5)

4.2.	1-Methoxy-4-(1-propenyl)benzol; (trans-Anethol) (CAS 4180-23-8)

4.3.	4-Allylanisol, (Estragol) (CAS 140-67-0), empfohlener interner Standard (IS)

4.4.	Ethanol 45 % vol. 560 g destilliertes Wasser zu 378 g Ethanol 96 % vol. zugeben.

4.5.

Zubereitung von Standardlösungen Alle Standardlösungen sind bei Zimmertemperatur (15-35 °C) und lichtgeschützt in Aluminiumbehältern oder in Braunglas-Standflaschen aufzubewahren. Der Stopfen sollte mit einer Aluminiumdichtung versehen sein. Da trans-Anethol und 4-Allylanisol in Wasser praktisch unlöslich sind, müssen sie vor der Zugabe von 45%igem Ethanol in etwas 96%igem Ethanol (4.1) gelöst werden. Die Stammlösungen sind jede Woche frisch anzusetzen. 4.5.1.   Standardlösung A Trans-Anetholstammlösung (Konzentration: 2 g/l): 40 mg trans-Anethol (4.2) in einem 20-ml-Messkolben einwiegen (oder 400 mg in 200 ml usw.). Etwas 96%iges Ethanol (4.1) zugeben und mit 45%igem Ethanol (4.4) zur Marke auffüllen, gründlich mischen. 4.5.2.   Interne Standardlösung B Stammlösung des internen Standards, z. B. Estragol (Konzentration: 2 g/l) 40 mg Estragol (4.3) in einem 20-ml-Messkolben einwiegen (oder 400 mg in 200 ml usw.). Etwas 96%iges Ethanol (4.1) zugeben und mit 45%igem Ethanol (4.4) zur Marke auffüllen, gründlich mischen. 4.5.3.   Lösungen zur Überprüfung der Linearreaktion des FID Die Linearreaktion des FID muss für die Analyse bei verschiedenen Konzentrationen von trans-Anethol in Spirituosen (0 bis 2,5 g/l) überprüft werden. Im Analyseverlauf werden die zu analysierenden Blindproben der Spirituosen 10-fach verdünnt. Für die in der Methode beschriebenen Analysebedingungen werden Stammlösungen mit Konzentrationen von 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 und 0,25 g/l trans-Anethol in der zu analysierenden Probe wie folgt zubereitet: 0,5, 1, 1,5, 2 und 2,5 ml der Stammlösung A (4.5.1) in einzelne 20-ml-Messkolben pipettieren; in jeden Kolben 2 ml der internen Standardlösung B (4.5.2) zugeben und mit Ethanol 45 % vol. (4.4) zur Marke auffüllen, gründlich mischen. Als 0 g/l-Lösung wird die Blindlösung (8.4) verwendet. 4.5.4.   Standardlösung C 2 ml Standardlösung A (4.5.1) in einen 20-ml-Messkolben pipettieren, 2 ml interne Standardlösung B (4.5.2) zugeben und mit 45%igem Ethanol (4.4) zur Marke auffüllen, gründlich mischen.

5.   Geräte und Ausrüstung

6.   Chromatographiebedingungen

Die Art und Größe der Säule sowie die GC-Bedingungen sollten so gewählt werden, das Anethol und der interne Standard voneinander und von allen Störsubstanzen getrennt werden. Typische Bedingungen für die unter Nummer 5.3 als Beispiel angeführte Säule sind:

7.   Proben

Proben sollten bei Zimmertemperatur und lichtgeschützt aufbewahrt werden.

8.   Ausführung

8.1.   Untersuchung der Probe auf Estragol

Um sicherzustellen, dass die Probe kein natürliches Estragol enthält, sollte eine Blindprobe ohne Zugabe eines internen Standards analysiert werden. Wenn die Probe natürliches Estragol enthält, ist ein anderer interner Standard zu verwenden (z. B. Methanol).

2 ml der Probe werden in einen 20-ml-Messkolben pipettiert, mit Ethanol 45 % vol. (4.4) zur Marke aufgefüllt und gründlich gemischt.

8.2.   Zubereitung unbekannter Proben

2 ml der Probe werden in einen 20-ml-Messkolben pipettiert, 2 ml interne Standardlösung B (4.5.2) zugegeben, mit 45%igem Ethanol (4.4) zur Marke aufgefüllt und gründlich gemischt.

8.3.   Blindlösung

2 ml interne Standardlösung B (4.5.2) werden in einen 20-ml-Messkolben pipettiert, mit 45%igem Ethanol (4.4) zur Marke aufgefüllt und gründlich gemischt.

8.4.   Linearitätsprüfung

Vor Beginn der Analyse sollte die Linearität des FID überprüft werden, indem jede der Linearitätsstandardlösungen (4.5.3) dreimal hintereinander analysiert wird.

Auf der Grundlage der Integrator-Peakflächen oder Peakhöhen für jede Injektion wird ein Graph ihrer Mutterlösungskonzentration in g/l gegen das Verhältnis R für jede Lösung aufgezeichnet.

R = trans-Anethol-Peakhöhe oder -fläche dividiert durch die Estragol-Peakhöhe oder -fläche.

Dabei sollte sich eine lineare Kurve ergeben.

8.5.   Bestimmung

Die Blindlösung (8.3) wird eingespritzt, darauf die Standardlösung C (4.5.4) und darauf einer der Linearitätsstandards (4.5.3), der als Qualitätskontrollprobe fungieren wird (diese kann unter Berücksichtigung der wahrscheinlichen Konzentration von trans-Anethol in der unbekannten Probe gewählt werden), darauf folgen fünf unbekannte Probenlösungen (8.2). Zur Gewährleistung der analytischen Stabilität ist nach jeweils fünf unbekannten Probenlösungen eine Linearitätsprobe (Qualitätskontrolle) einzufügen.

9.   Berechnung des Reaktionsfaktors

Die Peakflächen (mit einem Integrator oder einem anderen Datenverarbeitungssystem) oder die Peakhöhen (manuelle Integration) für Peaks von trans-Anethol und internem Standard werden gemessen.

9.1.   Berechnung des Reaktionsfaktors (RFi)

Der Reaktionsfaktor wird wie folgt berechnet:

Dabei ist:

Ci	die trans-Anethol-Konzentration in der Standardlösung A (4.5.1)

Cis	die Konzentration des internen Standards in der Standardlösung B (4.5.2)

Flächei

die Fläche (oder Höhe) des trans-Anethol-Peaks

Flächeis

die Fläche (oder Höhe) des internen Standard-Peaks

RFi wird auf der Grundlage der fünf Proben von Lösung C (4.5.4) berechnet.

9.2.   Analyse der Linearitätsprüflösungen

Die Linearitätsprüflösungen (4.5.3) werden eingespritzt.

9.3.   Analyse der Probe

Die Lösung der unbekannten Probe (8.2) wird eingespritzt.

10.   Berechnung der Ergebnisse

Die trans-Anethol-Konzentration wird nach folgender Formel berechnet:

Dabei ist:

ci	die unbekannte trans-Anethol-Konzentration

Cis (4.5.2)

die Konzentration des internen Standards in der unbekannten Probe (4.5.2)

Fläche oder Höhei

die Fläche oder Höhe des trans-Anethol-Peaks

Fläche oder Höheis

die Fläche oder Höhe des internen Standard-Peaks

RFi	der (gemäß Nummer 9.1 berechnete) Reaktionskoeffizient

Die trans-Anethol-Konzentration wird mit einer Dezimalstelle in Gramm pro Liter ausgedrückt.

11.   Qualitätssicherung und -kontrolle

Die Chromatogramme sollten so ausfallen, dass Anethol und der interne Standard voneinander und von allen Störsubstanzen getrennt sind. Der RFi-Wert wird auf der Grundlage der Ergebnisse der fünf Injektionen von Lösung C (4.5.4) berechnet. Liegt der Variationskoeffizient (CV % = (Standardabweichung/Mittelwert)*100)) innerhalb von +/- 1 %, so kann der RFi-Durchschnittswert akzeptiert werden.

Die obige Berechnung sollte zur Berechnung der Konzentration von trans-Anethol in der Probe verwendet werden, die für die Qualitätskontrolle auf der Grundlage der Linearitätskontrolllösungen (4.5.3) gewählt wurde.

Liegen die durchschnittlichen berechneten Ergebnisse aus der Analyse der Linearitätslösung, die als interne Qualitätskontrollprobe (IQC) gewählt wurde, in einer Bandbreite zwischen +/- 2,5 % um ihren theoretischen Wert, so können die Ergebnisse für die unbekannten Proben akzeptiert werden.

12.   Behandlung einer Spirituosenprobe mit hohem Zuckergehalt und einer Likörprobe vor der GC-Analyse

Extraktion von Alkohol aus einer Spirituose mit hohem Zuckergehalt, um die trans-Anethol-Konzentration durch Kapillar-Gaschromatographie bestimmen zu können.

12.1.   Prinzip

Einer aliquoten Menge der Likörprobe wird der interne Standard in einer Konzentration zugesetzt, die mit der des Analyten (trans-Anethol) im Likör vergleichbar ist. Dann werden Natriumphosphat Dodecahydrat und wasserfreies Ammoniumsulfat zugegeben. Die Mischung wird gründlich geschüttelt und gekühlt, wobei sich zwei Schichten bilden; die obere Alkoholschicht wird entfernt. Eine aliquote Menge dieser Alkoholschicht wird mit 45%iger Ethanollösung (4.4) verdünnt (Hinweis: Zu diesem Zeitpunkt wird kein interner Standard zugegeben, da er bereits zugegeben wurde). Die Lösung wird durch Gaschromatographie analysiert.

12.2.   Reagenzien und Material

Bei der Extraktion sind nur Reagenzien mit einer Reinheit von mehr als 99 % zu verwenden.

12.3.   Geräte und Ausrüstung

Erlenmeyerkolben, Trennkolben, Kühlschrank.

12.4.   Verfahren

12.4.1.   Untersuchung der Probe auf Estragol

Um sicherzustellen, dass die Probe kein natürliches Estragol enthält, sollte eine Blindextraktion (12.6.2) und Analyse ohne Zugabe eines internen Standards durchgeführt werden. Wenn die Probe natürliches Estragol enthält, ist ein anderer interner Standard zu verwenden.

12.4.2.   Extraktion

5 ml des 96%igen Ethanols (4.1) werden in einen Erlenmeyerkolben pipettiert; in diesen Kolben werden 50 mg des internen Standards (4.3) eingewogen, und 50 ml der Probe werden zugegeben. 12 g Ammoniumsulfat, wasserfrei (12.2.1) und 8,6 g zweibasisches Natriumphosphat, Dodecahydrat (12.2.2) zugeben. Den Erlenmeyerkolben verschließen.

Der Kolben wird mindestens 30 Minuten lang geschüttelt. Eine mechanische Schüttelvorrichtung kann verwendet werden, aber keine teflonbeschichteten Magnetrührer, da das Teflon einen Teil des Analyten absorbieren würde. Zugegebene Salze werden nicht vollständig gelöst.

Der mit Stopfen verschlossene Kolben wird mindestens zwei Stunden in einen Kühlschrank (T < 5 °C) gestellt.

Nach Ablauf dieser Zeit sollten sich zwei getrennte Flüssigkeitsschichten und ein fester Rückstand zeigen. Die Alkoholschicht sollte klar sein; ist dies nicht der Fall, wird der Kolben wieder in den Kühlschrank gestellt, bis eine klare Trennung erreicht ist.

Wenn die Alkoholschicht klar ist, wird — ohne die wässrige Schicht zu stören — vorsichtig eine aliquote Menge (z. B. 10 ml) entnommen und in eine Braunglasampulle überführt. Die Ampulle wird fest verschlossen.

12.4.3.   Vorbereitung der zu analysierenden extrahierten Probe

Den Extrakt (12.4.2) Zimmertemperatur erreichen lassen.

2 ml der Alkoholschicht der extrahierten Probe in einen 20-ml-Messkolben pipettieren, mit 45%igem Ethanol (4.4) zur Marke auffüllen und gründlich mischen.

12.5.   Bestimmung

Das Verfahren gemäß Nummer 8.5 durchführen.

12.6.   Berechnung der Ergebnisse

Die Ergebnisse werden nach folgender Formel berechnet:

Dabei ist:

mis	das Gewicht des verwendeten (12.4.2) internen Standards (4.3) (in mg)

V	das Volumen der unbekannten Probe (50 ml)

RFi	der Reaktionsfaktor (9.1.)

Flächei

die Fläche des trans-Anethol-Peaks

Flächeis

die Fläche des internen Standard-Peaks

Die Ergebnisse werden mit einer Dezimalstelle in Gramm pro Liter ausgedrückt.

12.7.   Qualitätssicherung und -kontrolle

Das Verfahren gemäß Nummer 11 durchführen.

13.   Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

Statistische Ergebnisse des Ringversuchs:

VI.   GLYCYRRHIZINSÄURE. BESTIMMUNG VON GLYCYRRHIZINSÄURE DURCH HOCHLEISTUNGSFLÜSSIGCHROMATOGRAPHIE

1.   Anwendungsbereich

Diese Methode eignet sich für die Bestimmung von Glycyrrhizinsäure in Spirituosen mit Anis durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Nach der Verordnung (EWG) Nr. 1576/89 müssen Spirituosen mit Anis, die die Bezeichnung „Pastis“ tragen, einen Glycyrrhizinsäuregehalt von 0,05 g/l bis 0,5 g/l aufweisen.

2.   Normen

ISO 3696: 1987 Wasser für analytische Laborzwecke — Spezifikation und Prüfverfahren.

3.   Prinzip

Die Glycyrrhizinsäurekonzentration wird durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit UV-Detektor bestimmt. Eine Standardlösung und die Probe werden filtriert und getrennt direkt in das HPLC-System eingespritzt.

4.   Reagenzien und Material

Bei der Analyse sind ausschließlich Reagenzien von HPLC-Qualität, reines Ethanol und Wasser Grad 3 gemäß ISO 3696 zu verwenden.

4.1.	Ethanol 96 % vol. (CAS 64-17-5)

4.2.	Ammoniumglycyrrhizinat, C42H62O16.NH3 (Ammoniumsalz der Glycyrrhizinsäure) (MG 839,98) (CAS 53956-04-0): Reinheit mindestens 90 %. (MG Glycyrrhizinsäure 822,94)

4.3.	Eisessig, CH3COOH (CAS 64-19-7)

4.4.	Methanol, CH3OH (CAS 67-56-1)

4.5.	Ethanol 50 % vol. Herstellung von 1 000  ml bei 20 °C: —  521 ml Ethanol 96 % vol. (4.1), —  511 ml Wasser (2.0).

4.6.

Zubereitung der HPLC-Elutionslösungen 4.6.1.   Elutionslösung A (Beispiel): 80 Volumteile Wasser (2.0) 20 Volumteile Essigsäure (4.3). Das Elutionsmittel wird fünf Minuten lang entgast. Hinweis: Wenn das verwendete Wasser nicht mikrofiltriert wurde, sollte das zubereitete Elutionsmittel durch ein Filter für organische Lösungsmittel mit einer Porengröße von höchstens 0,45 μm filtriert werden. 4.6.2.   Elutionslösung B Methanol (4.4)

4.7.

Zubereitung von Standardlösungen Alle Standardlösungen müssen nach zwei Monaten frisch angesetzt werden. 4.7.1.   Referenzlösung C 25 mg Ammoniumglycyrrhizinat (4.2) werden auf 0,1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen. Etwas Ethanol 50 % vol. (4.5) zugeben und das Ammoniumglycyrrhizinat auflösen. Wenn es gelöst ist, wird mit Ethanol 50 % vol. (4.5) zur Marke aufgefüllt. Durch ein Filter für organische Lösungsmittel filtrieren. 4.7.2.   Standardlösungen (zur Überprüfung der Linearität der Reaktion der Instrumente) Zur Herstellung einer 1,0-g/l-Stammlösung werden 100 mg Ammoniumglycyrrhizinat (4.2) auf 0,1 mg genau in einen 100-ml-Messkolben eingewogen. Etwas Ethanol 50 % vol. (4.5) zugeben und das Ammoniumglycyrrhizinat auflösen. Wenn es gelöst ist, wird mit Ethanol 50 % vol. (4.5) zur Marke aufgefüllt. Mindestens vier weitere Lösungen von 0,05, 0,1, 0,25 und 0,5 g/l Ammoniumglycyrrhizinat herstellen: 5, 10, 25 bzw. 50 ml der 1,0-g/l-Stammlösung in einzelne 100-ml-Messkolben pipettieren, mit Ethanol 45 % vol. (4.4) zur Marke auffüllen und gründlich mischen. Alle Lösungen durch ein Filter für organische Lösungsmittel filtrieren.

5.   Geräte und Ausrüstung

5.1.   Trennsystem

5.2.	Computergestützter Integrator oder Schreiber, dessen Leistungsfähigkeit mit den übrigen Geräten kompatibel ist

5.3.	Säule (Beispiel): Werkstoff: rostfreier Stahl oder Glas Innendurchmesser: 4-5 mm Länge: 100-250 mm Stationäre Phase: octadecylmodifiziertes (C18) Kieselgel, vorzugsweise kugelförmig, mit einer max. Korngröße von 5 μm.

5.4.	Laborgeräte 5.4.1. Analysenwaage, Genauigkeit 0,1 mg 5.4.2. Laborglasgeräte, Genauigkeitsklasse A 5.4.3. Mikromembran-Filtervorrichtung für kleine Volumina

6.   Chromatographiebedingungen

7.   Verfahren

7.1.   Vorbereitung der Spirituosenprobe

Erforderlichenfalls durch ein Filter für organische Lösungsmittel filtrieren (Porengröße: 0,45 μm).

7.2.   Bestimmung

Nach Stabilisierung der Chromatographiebedingungen

8.   Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

Statistische Ergebnisse des Ringversuchs:

VII.   CHALKONE. HOCHLEISTUNGSFLÜSSIGCHROMATOGRAPHIE ZUM NACHWEIS VON CHALKONEN IN PASTIS

1.   Geltungsbereich

Mit dieser Methode kann untersucht werden, ob Spirituosen mit Anis Chalkone enthalten oder nicht. Chalkone sind natürliche Farbstoffe aus der Familie der im Süßholz (Glycyrrhiza glabra) vorkommenden Flavonoide.

Spirituosen mit Anis dürfen nur dann als „Pastis“ bezeichnet werden, wenn sie Chalkone enthalten. (Verordnung (EWG) Nr. 1576/89).

2.   Normen

ISO 3696: 1987 Wasser für analytische Laborzwecke — Spezifikation und Prüfverfahren.

3.   Prinzip

Eine Referenzsüßholzextraktlösung wird hergestellt. Durch Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) mit UV-Detektor wird untersucht, ob Chalkone enthalten sind oder nicht.

4.   Reagenzien und Material

Bei der Analyse sind ausschließlich Reagenzien von HPLC-Qualität, Ethanol 96 % vol. und Wasser Grad 3 gemäß ISO 3696 zu verwenden.

4.1.	Ethanol 96 % vol. (CAS 64-17-5)

4.2.	Acetonitril, CH3CN, (CAS 75-05-8)

4.3.	Referenzsubstanz: Glycyrrhiza glabra: Lakritze, „Süßholz“. Grob zermahlenes Süßholz (Glycyrrhiza glabra). Durchschnittliche Größe der stäbchenförmigen Teilchen: Länge: 10-15 mm; Dicke: 1-3 mm

4.4.	Natriumacetat, CH3COONa, (CAS 127-09-3)

4.5.	Eisessig, CH3COOH, (CAS 64-19-7)

4.6.

Zubereitung der Lösungen 4.6.1.   Ethanol 50 % vol. Zur Herstellung von 1 000  ml bei 20 °C: —  96 % vol. Ethanol (4.1.): 521 ml —  Wasser (2.0.): 511 ml 4.6.2.   Lösungsmittel A: Acetonitril Acetonitril (4.2) HPLC-Qualität. Entgasen. 4.6.3.   Lösungsmittel B: 0,1 M Natriumacetatpufferlösung, pH-Wert 4,66 8,203 g Natriumacetat (4.4) werden in einen Messkolben eingewogen, es werden 6,005 g Eisessig (4.5) zugegeben und mit Wasser (2) auf 1 000  ml aufgefüllt.

5.   Herstellung des Referenzextrakts von Glycyrrhiza glabra (4.3)

5.1.	10 g zerkleinertes Süßholz (Glycyrrhiza glabra) (4.3) werden abgewogen und in einen Destillierkolben gegeben. —  100 ml Ethanol 50 % vol. (4.6.1) werden zugesetzt. —  Es wird eine Stunde lang unter Rücklauf destilliert. —  Filtrieren. —  Das Filtrat aufbewahren.

5.2.	Den Süßholzextrakt aus dem Filter nehmen. —  In einen Destillierkolben geben. —  100 ml Ethanol, 50 % vol. (4.6.1) werden zugesetzt. —  Es wird eine Stunde lang unter Rücklauf destilliert. —  Filtrieren. Das Filtrat aufbewahren.

5.3.	Die Extraktion des Süßholzes ist dreimal hintereinander durchzuführen.

5.4.	Die drei Filtrate werden zusammengeführt.

5.5.	Die Lösungsmittelphase (von 5.4) auf einem Rotationsverdampfer verdampfen.

5.6.	Den gewonnenen Extrakt (von 5.5) mit Hilfe von 100 ml Ethanol, 50 % vol., (4.6.1) aufnehmen.

6.   Geräte und Ausrüstung

6.1.   Trennsystem

6.2.	Computergestützter Integrator oder Schreiber, dessen Leistungsfähigkeit mit den übrigen Geräten kompatibel ist.

6.3.	Säule Werkstoff: rostfreier Stahl oder Glas Innendurchmesser: 4-5 mm Stationäre Phase: octadecylmodifiziertes (C 18) Kieselgel mit einer max. Korngröße von 5 μm (modifizierte Phase).

6.4.

Übliche Laborgeräte, insbesondere: 6.4.1.  Analysenwaage (Genauigkeit: ± 0,1 mg) 6.4.2.  Destillationsapparatur unter Rücklauf, beispielsweise bestehend aus: —  einem 250-ml-Rundkolben mit Normschliff, —  einem Rückflusskühler (30 cm Länge) und —  einer Wärmevorrichtung (jede pyrogene Reaktion der extraktiven Stoffe ist durch eine geeignete Vorrichtung zu vermeiden). 6.4.3.  Rotationsverdampfer 6.4.4.  Filtriervorrichtung (z. B. Büchner-Trichter)

6.5.

Chromatographiebedingungen (Beispiel) 6.5.1. Elutionsmerkmale der Lösungsmittel A (4.6.2) und B (4.6.3): —  Gradient 20/80 (v/v) auf 50/50 (v/v) in 15 Minuten, —  Gradient 50/50 (v/v) auf 75/25 (v/v) in 5 Minuten, —  isokratisch bei 75/25 (v/v), Dauer 5 Minuten, —  Stabilisierung der Säule zwischen zwei Einspritzungen, —  isokratisch bei 20/80 (v/v), Dauer 5 Minuten. 6.5.2. Förderrate: 1 ml/min. 6.5.3. UV-Detektoreinstellungen: Für den Nachweis von Chalkonen ist der Detektor auf 370 nm einzustellen, dann für den Nachweis von Glycyrrhizinsäure auf 254 nm. Hinweis: Die Änderung der Wellenlänge (von 370 nm zu 254 nm) muss 30 Sekunden vor Beginn des Elutionspeaks von Glycyrrhizinsäure vorgenommen werden.

7.   Verfahren

7.1.   Herstellen der Versuchsprobe

Erforderlichenfalls durch ein Filter für organische Lösungsmittel filtrieren (Porengröße: 0,45 μm).

7.2.   Zubereitung des restlichen Süßholzextraktes (5.6)

Vor der Analyse ist eine 1:10-Verdünnung mit Ethanol 50 % (4.6.1) herzustellen.

7.3.   Bestimmung

8.   Charakteristisches Chromatogramm von Pastis

Abbildung 1:

Durch die beschriebene Methode erhaltenes Chromatogramm, das zeigt, dass ein „Pastis“ Chalkone enthält. Die Peaks 1-8 sind Chalkone, Peak 9 ist Glycyrrhizinsäure.

9.   Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

Ergebnisse des Ringversuchs:

▼M2

VIII.   GESAMTZUCKER

1.    Anwendungsbereich

Die HPLC–RI-Methode eignet sich für die Bestimmung der Gesamtzucker (ausgedrückt als Invertzucker) in Spirituosen, mit Ausnahme von Likören, die Ei und Milcherzeugnisse enthalten.

Die Methode wurde in einem Ringversuch für Pastis, Ouzo, Kirschlikör, Crème de (gefolgt vom Namen einer Frucht oder des verwendeten Rohstoffs) und Crème de cassis bei Konzentrationen von 10,86 g/l bis 509,7 g/l validiert. Die Linearität der Empfindlichkeit des Messgeräts war jedoch für den Konzentrationsbereich von 2,5 g/l bis 20,0 g/l nachgewiesen.

Diese Methode eignet sich nicht zur Bestimmung geringer Zuckerkonzentrationen.

2.    Normen

ISO 3696:1987 Wasser für Analysezwecke — Spezifikationen und Testverfahren

3.    Prinzip

Hochleistungsflüssigkeitschromatografische Untersuchungen von Zuckerlösungen zur Bestimmung ihrer Konzentrationen an Glucose, Fructose, Saccharose, Maltose und Lactose.

Bei dieser Methode wird als stationäre Phase ein Alkylamin und für die Detektion ein Brechungsindexdetektor (RI) verwendet. Es handelt sich um ein Beispiel. Als stationäre Phase könnten auch Anionenaustauscherharze verwendet werden.

4.    Reagenzien und Material

4.1.	Glucose (CAS 50-99-7), Reinheit mindestens 99 %.

4.2.	Fructose (CAS 57-48-7), Reinheit mindestens 99 %.

4.3.	Saccharose (CAS 57-50-1), Reinheit mindestens 99 %.

4.4.	Lactose (CAS 5965-66-2), Reinheit mindestens 99 %.

4.5.	Maltose-Monohydrat (CAS 6363-53-7), Reinheit mindestens 99 %.

4.6.	Reines Acetonitril (CAS 75-05-8) für HPLC-Analyse.

4.7.	Destilliertes oder entmineralisiertes Wasser, vorzugsweise mikrofiltriert.

4.8.

Lösungsmittel (Beispiel) Das Elutionsmittel besteht aus 75 Volumenteilen Acetonitril (4.6), 25 Volumenteilen destilliertem Wasser (4.7). Vor Verwendung 5 bis 10 Min. im schwachen Heliumstrom entgasen. Wenn das verwendete Wasser nicht mikrofiltriert wurde, sollte das Lösungsmittel mit einem Filter für organische Lösungsmittel mit einer Maschenweite von höchstens 0,45 μm filtriert werden.

4.9.	Reines Ethanol (CAS 64-17-5)

4.10.

Ethanollösung (Volumenkonzentration = 5 %)

4.11.

Ansetzen der Standard-Stammlösung (20 g/l) Von jedem der zu analysierenden Zucker (4.1 bis 4.5) 2 g abwiegen und verlustfrei in einen 100-ml-Messkolben überführen. (Hinweis: 2,11 g Maltose-Monohydrat entsprechen 2 g Maltose.) Mit der Ethanollösung 5 Vol.- % (4.10) auf 100 ml auffüllen, schütteln und bei etwa + 4 °C lagern. Die Standard-Stammlösung einmal wöchentlich neu anzusetzen.

4.12.

Ansetzen von Standard-Arbeitslösungen (2,5, 5,0, 7,5, 10,0 und 20,0 g/l) Die Stammlösung, 20 g/l, (4.11) mit der 5 Vol.- % Ethanollösung (4.10) zu fünf Standardarbeitslösungen verdünnen: 2,5, 5,0, 7,5, 10,0 und 20,0 g/l. Durch ein Filter mit einer Maschenweite von höchstens 0,45 μm (5.3.) filtrieren.

5.    Gerät und Ausrüstung

5.1.   HPLC-System, das eine Basislinien-Auflösung aller Zucker erreichen kann

5.1.1.

Hochleistungsflüssigkeitschromatograf mit einem 6-Wege-Injektionsventil mit 10-μl-Dosierungsschleife oder einer anderen Dosierungsvorrichtung, automatisch oder manuell, für die zuverlässige Injektion von Mikrovolumina

5.1.2.

Pumpsystem zur Erzielung und Aufrechterhaltung einer konstanten oder programmierten Durchflussmenge mit hoher Genauigkeit

5.1.3.

Differentialrefraktometer

5.1.4.

Computergestützter Integrator oder Schreiber, dessen Leistungsfähigkeit mit den übrigen Geräten kompatibel ist

5.1.5.

Vorsäule Es wird empfohlen, die Analysesäule mit einer geeigneten Vorsäule zu verbinden.

5.1.6.

Säule (Beispiel) Material: rostfreier Stahl oder Glas Innendurchmesser: 2-5 mm Länge: 100-250 mm (je nach Partikelgröße der Packung), z. B. 250 mm bei einer Partikelgröße von 5 μm Stationäre Phase: an Kieselgel gebundene funktionelle Alkylamingruppen, Partikelgröße höchstens 5 μm.

5.1.7.

Chromatografiebedingungen (Beispiel) Elutionsmittel (4.8.), Strömungsgeschwindigkeit: 1 ml/min Detektion: Differentialrefraktometrie Um sicherzustellen, dass der Detektor vollkommen stabil ist, sollte er einige Stunden vor Verwendung eingeschaltet werden. Die Referenzzelle muss mit dem Elutionsmittel gefüllt sein.

5.2.	Analysenwaage, Genauigkeit 0,1 mg

5.3.	Mikromembran-Filtervorrichtung (0,45 μm) für kleine Volumina

6.    Lagerung der Proben

Die Proben sollten nach Erhalt bis zur Analyse bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.

7.    Verfahren

7.1.   TEIL A: Vorbereitung der Probe

7.1.1.

Die Probe schütteln.

7.1.2.

Die Probe durch ein Filter mit einer Maschenweite von höchstens 0,45 μm (5.3) filtrieren.

7.2.   TEIL B: HPLC

7.2.1.   Bestimmung

10 μl der Standardlösungen (4.12) und der Proben (7.1.2) injizieren. Die Analyse unter geeigneten Chromatografiebedingungen, z. B. wie oben beschrieben, durchführen.

7.2.2.

Sollte ein Peak einer Probe eine größere Fläche (oder Höhe) aufweisen als der entsprechende Peak der Standardlösung mit der höchsten Konzentration, ist die Probe mit destilliertem Wasser zu verdünnen und erneut zu analysieren.

8.    Berechnung

Die Chromatogramme der Standardlösung und der Spirituose sind zu vergleichen. Die Peaks sind nach ihren Retentionszeiten zu identifizieren. Ihre Flächen (oder Höhen) messen und die Konzentrationen nach der Methode des externen Standards berechnen. Dabei sind etwaige Verdünnungen der Probe zu berücksichtigen.

Das Endergebnis ist die Summe von Saccharose, Maltose, Lactose, Glucose und Fructose, ausgedrückt als Invertzucker in g/l.

Invertzucker wird berechnet als Summe der vorhandenen Monosaccharide und reduzierenden Disaccharide zuzüglich der aus der vorhandenen Saccharose errechneten stöchiometrischen Menge Glucose und Fructose.

Invertzucker (g/l)

=

Glucose (g/l) + Fructose (g/l) + Maltose (g/l) + Lactose (g/l) + (Saccharose (g/l) × 1,05)

1,05

=

(Molekulargewicht von Fructose + Molekulargewicht von Glucose)/Molekulargewicht von Saccharose

9.    Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

9.1.   Statistische Ergebnisse des Ringversuchs

Bei einem internationalen Ringversuch ergaben sich nach einem international abgestimmten Verfahren [1] [2] folgende Daten:

▼M1

IX.   EIGELB. BESTIMMUNG DER EIGELBKONZENTRATION IN SPIRITUOSEN — PHOTOMETRISCHE METHODE

1.   Geltungsbereich

Die Methode ist geeignet für die Bestimmung von Eigelbkonzentrationen zwischen 40 und 250 g/l in Eierlikör und Likör mit Eizusatz.

2.   Normen

ISO 3696: 1897 Wasser für analytische Laborzwecke — Spezifikation und Prüfverfahren.

3.   Prinzip

Die ethanollöslichen Phosphorverbindungen im Eigelb werden extrahiert und als Phosphormolybdatkomplex photometrisch bestimmt.

4.   Reagenzien und Material

5.   Geräte und Ausrüstung

6.   Proben

Die Proben werden vor der Analyse bei Zimmertemperatur gelagert.

7.   Verfahren

7.1.   Vorbereitung der Probe

7.2.   Photometrische Phosphatbestimmung

7.2.1.   Vergleichslösung

7.2.2.   Probenlösung

7.2.3.   Eichkurve

8.   Berechnung der Ergebnisse

Der Eigelbgehalt in g/l wird nach folgender Formel berechnet:

Dabei ist:

110	Umrechnungsfaktor für Gesamtgehalt an P2O5 in g in 100 g Eigelb,

mg P2O5

anhand der Eichkurve festgestellter Wert,

Dichte

Masse je Volumeneinheit (g/ml) des Eierlikörs bei 20 °C,

E	Gewicht des Eierlikörs in g,

40	Verdünnungsfaktor für einen aliquoten Teil von 5 ml der Aschelösung.

9.   Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

Statistische Ergebnisse des Ringversuchs:

▼M2

X.   BESTIMMUNG DER FOLGENDEN AUS HOLZ AUSTRETENDEN VERBINDUNGEN IN SPIRITUOSEN DURCH HOCHLEISTUNGSFLÜSSIGKEITSCHROMATOGRAFIE (HPLC): FURFURAL, HYDROXYMETHYL-5-FURFURAL, METHYL-5-FURFURAL, VANILLIN, SYRINGALDEHYD, CONIFERALDEHYD, SINAPALDEHYD, GALLUSSÄURE, ELLAGSÄURE, VANILLINSÄURE, SYRINGASÄURE UND SCOPOLETIN

1.    Anwendungsbereich

Die Methode dient der Bestimmung von Furfural, Hydroxymethyl-5-furfural, Methyl-5-furfural, Vanillin, Syringaldehyd, Coniferaldehyd, Sinapaldehyd, Gallussäure, Ellagsäure, Vanillinsäure, Syringasäure und Scopoletin durch Hochleistungsflüssigkeitschromatografie.

2.    Normen

Von der Generalversammlung der Internationalen Organisation für Rebe und Wein (OIV) anerkannte und unter OIV-MA-BS-16: R2009 veröffentlichte Analysemethode.

3.    Prinzip

Bestimmung durch Hochleistungsflüssigkeitschromatografie (HPLC) mit Detektion durch UV-Spektrophotometrie in mehreren Wellenlängen und durch Spektrofluorimetrie.

4.    Reagenzien

Die Reagenzien müssen Analysequalität haben. Das verwendete Wasser muss destilliertes Wasser oder von mindestens gleichwertiger Reinheit sein. Es wird empfohlen, mikrofiltriertes Wasser mit einer Resistivität von 18,2 M Ω.cm zu verwenden.

4.1.	Alkohol 96 Vol.- %

4.2.	Methanol in HPLC-Qualität (Lösungsmittel B)

4.3.	Essigsäure 0,5 % (Lösungsmittel A)

4.4.	Mobile Phasen: (nur als Beispiel) Lösungsmittel A (0,5 %ige Essigsäure) und Lösungsmittel B (reines Methanol) über eine Membran filtern (Maschenweite 0,45 μm). Falls erforderlich in Ultraschallwanne entgasen.

4.5.	Standardmaterial, mindestens 99 % rein: Furfural, Hydroxymethyl-5-furfural, Methyl-5-furfural, Vanillin, Syringaldehyd, Coniferaldehyd, Sinapaldehyd, Gallussäure, Ellagsäure, Vanillinsäure, Syringasäure und Scopoletin

4.6.

Standardlösung: Das Standardmaterial wird in einer wässrigen Alkohollösung zu 50 Vol.- % gelöst. Die Konzentration in der Standardlösung beträgt: Furfural: 5 mg/l; Hydroxymethyl-5-furfural: 10 mg/l; Methyl-5-furfural: 2 mg/l; Vanillin: 5 mg/l; Syringaldehyd: 10 mg/l; Coniferaldehyd: 5 mg/l; Sinapaldehyd: 5 mg/l; Gallussäure: 10 mg/l; Ellagsäure: 10 mg/l; Vanillinsäure: 5 mg/l; Syringasäure: 5 mg/l; Scopoletin: 0,5 mg/l.

5.    Geräte

Übliche Laborgeräte sowie

5.1.

Hochleistungsflüssigkeitschromatograf, der mit Binärgradient betrieben werden kann und folgende Ausstattung aufweist: 5.1.1.  Ein spektrophotometrischer Detektor, mit dem Messungen bei Wellenlängen von 260 bis 340 nm vorgenommen werden können. Vorzugsweise wird mit einem Detektor für mehrere Wellenlängen gearbeitet, zum Beispiel mit einem Diodenarray, um die Reinheit der Peaks bestätigen zu können. 5.1.2.  Ein spektrofluorimetrischer Detektor, Wellenlänge für die Anregung: 354 nm, Wellenlänge für die Emission: 446 nm (zur Feinbestimmung von Scopoletin; es ist aber auch bei 313 nm durch Spektrophotometrie bestimmbar.) 5.1.3.  Eine Injektionsvorrichtung zum Injizieren von Proben zu 10 oder 20 μl 5.1.4.  Eine HPLC-Säule vom Typ RP C18, Granulometrie höchstens 5 μm

5.2.	Spritzen für HPLC

5.3.	Membranfilter für kleine Mengen

5.4.	Rechner oder Schreiber, dessen Leistung mit den Geräten kompatibel ist. Er muss vor allen Dingen mehrere Erfassungskanäle aufweisen.

6.    Verfahren

6.1.   Vorbereitung der einzuspritzenden Lösung

Die Standardlösung und die Spirituose werden, falls erforderlich, über eine Membran gefiltert, deren Maschenweite höchstens 0,45 μm beträgt.

6.2.

Parameter für die Chromatografie: Die Analyse bei Raumtemperatur mit der unter 5.1 genannten Ausrüstung durchführen, dabei die mobilen Phasen (4.4) mit einem Durchsatz von etwa 0,6 ml pro Minute nach folgendem Programm verwenden (nur als Beispiel): Zeit: 0 min 50 min 70 min 90 min Lösungsmittel A (Wasser-Säure): 100 % 60 % 100 % 100 % Lösungsmittel B: (Methanol): 0 % 40 % 0 % 0 % Zur Vermeidung von Co-Elutionen ist dieser Gradient in einigen Fällen jedoch zu ändern.

6.3.

Bestimmung 6.3.1. Das Standardmaterial getrennt, dann gemischt injizieren. Die Betriebsparameter so anpassen, dass der Auflösungsfaktor der Peaks bei allen Verbindungen mindestens gleich 1 ist. 6.3.2. Die wie in 6.1 vorbereitete Probe injizieren. 6.3.3. Die Fläche der Peaks der Standardlösung und der Spirituose messen und die Konzentration berechnen.

7.    Darstellung der Ergebnisse

Die Konzentration jedes Bestandteils wird in mg/l ausgedrückt.

8.    Leistungsmerkmale der Methode (Präzision)

Die folgenden Angaben stammen aus einer internationalen Studie aus dem Jahr 2009 zur Leistungsfähigkeit der Methode, wobei die Studie gemäß den international anerkannten Verfahren für unterschiedliche Spirituosen durchgeführt wurde [1], [2].

8.1.   Furfural

8.2.   Hydroxymethyl-5-furfural

8.3.   Methyl-5-furfural

8.4.   Vanillin

8.5.   Syringaldehyd

8.6.   Coniferaldehyd

8.7.   Sinapaldehyd

8.8.   Gallussäure

8.9.   Ellagsäure

8.10.   Vanillinsäure

8.11.   Syringasäure

8.12.   Scopoletin

▼M3

XI.    BESTIMMUNG DES 14C-GEHALTS IN ETHANOL

1.    Einführung

Die Bestimmung des 14C-Gehalts in Ethanol ermöglicht die Unterscheidung von Alkohol aus fossilen Rohstoffen (sogenanntem Synthesealkohol) und Alkohol aus rezenten Rohstoffen (sogenanntem Gärungsalkohol).

2.    Begriff

Als 14C-Gehalt von Ethanol gilt der nach der hier beschriebenen Methode oder nach der C-Methode der Norm EN 16640 bestimmte 14C-Gehalt.

Der natürliche 14C-Gehalt der Atmosphäre (Referenzwert), der von den lebenden Pflanzen über Assimilation aufgenommen wird, ist kein konstanter Wert. Der Referenzwert wird daher an Ethanol aus Rohstoffen der jeweils letzten Wachstumsperiode bestimmt. Dieser jährliche Referenzwert wird nach der Norm EN 16640 bestimmt. Ein anderer Referenzwert kann jedoch akzeptiert werden, wenn er von einer akkreditierten Stelle zertifiziert wurde.

3.    Kurzbeschreibung

In alkoholhaltigen Proben mit mindestens 85 %igem Massenanteil an Ethanol wird der 14C-Gehalt direkt durch Flüssigszintillationszählung bestimmt.

4.    Reagenzien

4.1.   Toluolszintillator

5,0 g 2,5-Diphenyloxazol (PPO).

0,5 g p-Bis-[4-methyl-5-phenyloxazolyl(2)]-benzol (Dimethyl-POPOP) in 1 l Toluol in Analysequalität.

Es können auch handelsübliche gebrauchsfertige Toluolszintillatoren dieser Zusammensetzung verwendet werden.

4.2.    14C-Standard.

n-Hexadecan 14C mit einer Aktivität von etwa 1 × 106 dpm/g (etwa 1,67 × 106 cBq/g) und einer garantierten Genauigkeit der bestimmten Aktivität von ± 2 % rel.

4.3.    14C-freies Ethanol.

Synthesealkohol aus Rohstoffen fossiler Herkunft mit mindestens 85 %igem Massenanteil an Ethanol zur Bestimmung des Nulleffekts.

5.    Geräte und Hilfsmittel

6.    Vorbereitung der Messung

6.1.   Geräteeinstellung

Die Geräteeinstellung wird nach den Angaben des jeweiligen Herstellers vorgenommen. Optimale Messbedingungen liegen vor, wenn der Wert E2/B, die sogenannte Gütezahl, ein Maximum aufweist.

E = Efficiency (Zählausbeute)

B = Background (Nulleffekt).

Es werden nur 2 Messkanäle optimiert. Der dritte Messkanal bleibt für Kontrollzwecke voll geöffnet.

6.2.   Selektierung der Zählfläschchen

Eine größere Anzahl von Zählfläschchen als später benötigt wird mit je 10 ml 14C-freiem Syntheseethanol und 10 ml Toluolszintillator gefüllt und jeweils mindestens 4 × 100 Minuten vermessen. Zählfläschchen, die im Nulleffekt um mehr als ± 1 % rel. vom Mittelwert abweichen, werden ausgesondert. Es dürfen nur fabrikneue Zählfläschchen aus derselben Charge verwendet werden.

6.3.   Bestimmung des Externer-Standard-Kanal-Verhältnisses (ESKV)

Bei der Kanal-Einstellung (Nummer 6.1) wird parallel zur Ermittlung der Zählausbeute mithilfe des entsprechenden Rechenprogramms das ESKV bestimmt. Als externer Standard wird 137Cäsium verwendet, das bereits herstellerseits eingebaut ist.

6.4.   Vorbereitung der Probe

Zur Vermessung kommen Proben mit mindestens 85 %igem Massenanteil an Ethanol ohne Verunreinigungen, die unter 450 nm absorbieren. Vom geringen Restgehalt an Aldehyden und Estern gehen keine Störwirkungen aus. Der Alkoholgehalt der Probe wird zuvor mit einer Näherung von 0,1 % bestimmt.

7.    Messung der Proben mit externem Standard

7.2.   Durchführung der Messung

Je 10 ml der gemäß Nummer 6.4 vorbereiteten Proben werden in ein Nulleffekt-kontrolliertes (selektiertes) Zählfläschchen pipettiert und über eine automatische Dosiervorrichtung werden jeweils 10 ml Toluolszintillator hinzugegeben. Durch geeignete Drehbewegungen werden die Proben in den Zählfläschchen homogenisiert, wobei die Flüssigkeit den Polyethyleneinsatz des Schraubverschlusses nicht benetzen darf. Auf die gleiche Art wird zur Ermittlung des Nulleffekts ein Zählfläschchen mit 14C-freiem fossilem Ethanol vorbereitet. Zur Kontrolle in Bezug auf den jeweiligen 14C-Jahreswert wird ein Duplikat von rezentem Ethanol der letzten Wachstumsperiode angesetzt, wobei ein Zählfläschchen mit internem Standard versetzt wird (siehe Nummer 8).

Die Kontroll- und die Nulleffektprobe werden an den Anfang der Messreihe gestellt, die nicht mehr als 10 Analysenproben umfassen darf. Die Gesamtmesszeit pro Probe beträgt mindestens 2 × 100 Minuten, wobei die Vermessung der einzelnen Probe in Teilschritten von jeweils 100 Minuten vorzunehmen ist, um eine eventuell vorhandene Gerätedrift oder anderweitige Störung erkennen zu können. (Ein Zyklus umfasst somit ein Messintervall von 100 Minuten je Probe.)

Die Nulleffekt- und die Kontrollprobe sind alle vier Wochen zu erneuern.

Bei schwach gelöschten Proben (ESKV-Wert etwa 1,8) wird die Zählausbeute durch die Änderung dieses Wertes nur unwesentlich beeinflusst. Liegt die Änderung innerhalb ± 5 % rel., kann mit gleicher Zählausbeute gerechnet werden. Bei stärker gelöschten Proben wie vergällten Alkoholen kann die Zählausbeute über die sogenannte Löschkorrekturkurve ermittelt werden. Steht kein entsprechendes Rechenprogramm zur Verfügung, muss mit internem Standard vermessen werden, wodurch die Zählausbeute eindeutig bestimmt ist.

8.    Messung der Proben mit internem Standard Hexadecan 14C

8.1.   Vorbereitung der Messung

Die Kontroll- und die Nulleffektprobe (rezentes und fossiles Ethanol) sowie das unbekannte Material werden jeweils als Duplikat vermessen. Eine Probe des Duplikats wird in einem nicht selektierten Fläschchen angesetzt und es wird eine genau dosierte Menge (30 μl) Hexadecan 14C als interner Standard zugesetzt (zugesetzte Aktivität etwa 26 269 dpm/gC (etwa 43 782 cBq/gC)). Bei den übrigen Proben ist hinsichtlich Vorbereitung und Messzeit gemäß Nummer 7.2 zu verfahren, wobei bei den Proben mit internem Standard die Messzeit durch die eingestellte Vorwahl von 105 Impulsen auf etwa fünf Minuten begrenzt werden kann. Je Messreihe wird je ein Duplikat der Nulleffekt- und der Kontrollprobe angesetzt und an den Anfang der Messreihe gestellt.

8.2.   Handhabung des internen Standards und der Zählfläschchen

Bei Messungen mit internem Standard muss zur Vermeidung von Kontaminationen die Lagerung und Handhabung desselben räumlich streng getrennt vom Zubereiten und Vermessen der Analysenproben erfolgen. Nach der Messung können die Nulleffekt-kontrollierten Fläschchen wiederverwendet werden. Die Schraubkappen und die den internen Standard enthaltenden Fläschchen müssen verworfen werden.

9.    Auswertung

9.1.   Die Einheit der Aktivität einer radioaktiven Substanz ist Becquerel (1 Bq = 1 Zerfall/Sek.).

Die Angabe der spezifischen Radioaktivität erfolgt in Becquerel je Gramm Kohlenstoff (Bq/gC).

Um besser handhabbare Werte zu erhalten, ist das Ergebnis in Zenti-Becquerel (cBq/gC) anzugeben.

Die in der Literatur anzutreffenden Bezeichnungen und Berechnungsformeln auf dpm-Basis können ebenfalls verwendet werden. Um den entsprechenden Wert in Zenti-Becquerel zu erhalten, muss die dpm-Angabe mit dem Faktor 100/60 multipliziert werden.

9.2.   Auswertung mit externem Standard

9.3.   Auswertung mit internem Standard

9.4.   Es bedeutet

cpmpr

=

die über die gesamte Messzeit gemittelte Probenzählrate

cpmNE

=

die ebenso gemittelte Impulsrate des Nulleffekts

cpmIS

=

die Probenzählrate bei internem Standard

dpmIS

=

die Menge an zugesetztem internem Standard (Eichradioaktivität dpm)

V

=

das Volumen der eingesetzten Proben in ml

F

=

der Gehalt an Gramm Reinalkohol je ml entsprechend seiner Konzentration

Z

=

die Zählausbeute entsprechend dem ESKV-Wert

1,918

=

Gramm Alkohol je Gramm Kohlenstoff

10.    Zuverlässigkeit der Methode

10.1.   Wiederholbarkeit (r)

r = 0,632 cBq/g C; S(r) = ± 0,223 cBq/g C

10.2.   Reproduzierbarkeit (R)

R = 0,821 cBq/g C; S(R) = ± 0,290 cBq/g C