---

PRILOG

OPIS REFERENTNIH ANALITIČKIH METODA
I.	Određivanje alkoholne jakosti po volumenu Dodatak I. : Priprema destilata Dodatak II. : Mjerenje gustoće destilata — Metoda A = piknometrija — Metoda B = elektronska denzimetrija — Metoda C = denzimetrija uz korištenje hidrostatske vage
II.	Određivanje ukupnog suhog ekstrakta gravimetrijom
III.	Određivanje hlapivih spojeva i metanola
III.1.	Opće napomene
III.2.	Hlapivi srodni spojevi: aldehidi, viši alkoholi, etil acetat i metanol (plinska kromatografija)
III.3.	Hlapiva kiselost ►M2  ————— ◄
IV.	Cijanovodična kiselina (p.m.)
V.	Anetol ►M1  ————— ◄
VI.	Glicirizinska kiselina ►M1  ————— ◄
VII.	Kalkoni ►M1  ————— ◄
VIII.	Ukupni šećeri ►M2  ————— ◄
IX.	Žumanjak ►M1  ————— ◄
▼M2
X.	Određivanje spojeva iz drveta: furfural, 5-hidroksimetilfurfural, 5-metilfurfural, vanilin, siringaldehid, koniferaldehid, sinapaldehid, galna kiselina, elagična kiselina, vanilinska kiselina, siringična kiselina i skopoletin
▼M3
XI.	Određivanje sadržaja izotopa ugljika 14C u etanolu
▼B

I.    ODREÐIVANJE ALKOHOLNE JAKOSTI PO VOLUMENU JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA

Uvod

Referentna metoda uključuje dva Dodatka:

Dodatak I. : Priprema destilata

Dodatak II. : Mjerenje gustoće destilata

1.    Svrha

Ova metoda je prikladna za određivanje stvarne alkoholne jakosti po volumenu jakih alkoholnih pića.

2.    Referentni standardi

ISO 3696:1987: Voda za upotrebu u analitičkim laboratorijima – Zahtjevi i metode ispitivanja.

3.    Izrazi i definicije

3.1.

Referentna temperatura: Referentna temperatura za određivanje alkoholne jakosti po volumenu, gustoći i specifičnoj težini jakih alkoholnih pića je 20 °C. Napomena 1.: Izraz „na °C” rezerviran je za sva određivanja (gustoće ili alkoholne jakosti po volumenu) koja su izražena u temperaturi koja nije referentna temperatura od 20 °C.

3.2.	Gustoća: Gustoća je masa po jedinici volumena jakih alkoholnih pića na 20 °C u vakuumu. Izražava se u kilogramima po kubičnom metru, a njezin simbol je ρ20 °C ili ρ20.

3.3.

Relativna gustoća: Relativna gustoća je omjer, izražen kao decimalni broj, gustoće jakih alkoholnih pića na 20 °C i gustoće vode na istoj temperaturi. Označava se simbolom d20 °C/20 °C ili d20/20, ili samo s d kad ne postoji mogućnost zabune. Svojstvo koje je mjereno mora se navesti na certifikatu, a pritom se smiju koristiti samo gore navedeni simboli. Napomena 2.: Relativna gustoća se može dobiti iz gustoće ρ20 na 20 °C: sau gdje je 998,203 gustoća vode na 20 °C.

3.4.

Stvarna alkoholna jakost po volumenu: Stvarna alkoholna jakost po volumenu jakih alkoholnih pića jednaka je broju litara etilnog alkohola u 100 litara mješavine vode i alkohola koja ima istu gustoću kao i alkohol ili jako alkoholno piće nakon destilacije. Referentne vrijednosti za alkoholnu jakost po volumenu (vol. %) na 20 °C u odnosu na gustoću na 20 °C za različite mješavine vode i alkohola koje se moraju koristiti su one vrijednosti koje su dane u međunarodnoj tablici koju je usvojila Međunarodna organizacija za zakonsko mjeriteljstvo (International Legal Metrology Organisation) u svojoj Preporuci br. 22. Opća jednadžba koja se odnosi na alkoholnu jakost po volumenu i gustoći mješavine vode i alkohola na zadanoj temperaturi dana je na stranici 40. poglavlja 3. „Alkoholna jakost po volumenu” Priloga Uredbi Komisije (EEZ) br. 2676/90 (SL L 272, 3.10.1990., str. 1.) ili u priručniku za metode analize OIV-a (1994.) (str. 17.). Napomena 3.: Za likere i krem likere čiji je volumen teško točno izmjeriti, uzorak se mora izvagati, a alkoholna jakost se prvo računa po masi. Jednadžba za konverziju: gdje je JAM = alkoholna jakost po masi, ρ20 (alkohol) = 789,24 kg/m3

4.    Načelo rada

Nakon destilacije, alkoholna jakost po volumenu destilata određuje se piknometrijom, elektronskom denzimetrijom ili denzimetrijom uz upotrebu hidrostatske vage.

---

DODATAK I.: PRIPREMA DESTILATA

1.    Područje primjene

Ova metoda je prikladna za pripremu destilata koji se koriste za određivanje stvarne alkoholne jakosti po volumenu jakih alkoholnih pića.

2.    Načelo rada

Jaka alkoholna pića se destiliraju kao bi se odvojio etilni alkohol i drugi hlapivi spojevi iz ekstrakta (supstanci koje se ne destiliraju).

3.    Reagensi i materijali

4.    Uređaji i aparatura

Uobičajena laboratorijska oprema, a naročito sljedeće:

Napomena: Gore opisani uređaj je namijenjen za uzorak od najmanje 200 ml. Međutim, manji uzorci (100 ml) se mogu destilirati upotrebom manjih destilacijskih tikvica, pod uvjetom da se koristi zvono za destilaciju ili neki drugi uređaj za sprečavanje prelaska smjese tekućine i pare u hladilo.

5.    Skladištenje uzoraka za ispitivanje

Uzorci se skladište na sobnoj temperaturi prije analize.

6.    Postupak

Uvodna napomena:

6.1.	Provjera aparature za destilaciju. Aparatura mora imati sljedeća svojstva: Destilacija 200 ml otopine vode i alkohola poznate koncentracije, volumnog udjela približno 50 % ne smije uzrokovati gubitak alkohola veći od volumnog udjela 0,1 %.

6.2.

Jaka alkoholna pića s jakosti ispod 50 % vol. Odmjeri se 200 ml jakog alkoholnog pića u odmjernu tikvicu. Zabilježi se temperatura tekućine, ili se održava na standardnoj temperaturi (20 °C). Uzorak se izlije u tikvicu s okruglim dnom uređaja za destilaciju, a odmjerna tikvica se ispere s tri alikvota od koji svaki sadrži približno 20 ml destilirane vode. Svaki alikvot vode za ispiranje doda se sadržaju destilacijske tikvice. Napomena: Ovo razrjeđivanje sa 60 ml dovoljno je za jaka alkoholna pića koja sadrže manje od 250 g suhog ekstrakta po litri. U protivnom, da bi se spriječila piroliza, volumen vode za ispiranje mora biti najmanje 70 ml ako je koncentracija suhog ekstrakta 300 g/l, 85 ml ako je koncentracija suhog ekstrakta 400 g/l te 100 ml ako je koncentracija suhog ekstrakta 500 g/l (neki voćni likeri ili kreme). Ti se volumeni podese proporcionalno različitim volumenima uzoraka. Doda se nekoliko kuglica za vrenje (3.1) (i sredstvo protiv pjenjenja za emulzijske likere). Ulije se 20 ml destilirane vode u originalnu odmjernu tikvicu od 200 ml koja će se koristiti za čuvanje destilata. Ta se tikvica zatim mora staviti u hladnu vodenu kupelj (4.1) (10 do 15 °C za jaka alkoholna pića s okusom anisa). Destilira se, izbjegavajući miješanje tekućine s parom i karbonizaciju, uz povremeno miješanje sadržaja tikvice, dok razina destilata nije nekoliko milimetara ispod kalibracijske oznake na odmjernoj tikvici. Kad temperatura ovog destilata padne unutar 0,5 °C od početne temperature tekućine, dopuni se do oznake destiliranom vodom i dobro promiješa. Ovaj destilat se koristi za određivanje alkoholne jakosti po volumenu (Dodatak II.)

6.3.

Jaka alkoholna pića s jakosti iznad 50 % vol. Odmjeri se 100 ml jakog alkoholnog pića u odmjernu tikvicu od 100 ml i izlije u tikvicu s okruglim dnom uređaja za destilaciju. Odmjerna tikvica se ispere nekoliko puta destiliranom vodom i ispirci se dodaju sadržaju destilacijske tikvice s okruglim dnom. Mora se koristiti dovoljno vode da sadržaj tikvice dosegne približno 230 ml. Izlije se 20 ml destilirane vode u odmjernu tikvicu od 200 ml koja će se koristiti za čuvanje destilata. Ta se tikvica zatim mora staviti u hladnu vodenu kupelj (4.1) (10 do 15 °C za jaka alkoholna pića s okusom anisa). Destilira se, uz povremeno miješanje destilata, dok se razina destilata ne spusti nekoliko milimetara ispod kalibracijske oznake na odmjernoj tikvici od 200 ml. Kad temperatura ovog destilata padne unutar 0,5 °C od početne temperature tekućine, dopuni se do oznake destiliranom vodom i dobro promiješa. Ovaj destilat se koristi za određivanje alkoholne jakosti po volumenu (Dodatak II.) Napomena: Alkoholna jakost po volumenu jakog alkoholnog pića je dva puta veća od alkoholne jakosti destilata.

---

DODATAK II.: MJERENJE GUSTOĆE DESTILATA

METODA A:    ODREĐIVANJE STVARNE ALKOHOLNE JAKOSTI PO VOLUMENU JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA — MJERENJE PIKNOMETRIJOM

A.1.    Načelo rada

Alkoholna jakost po volumenu dobije se iz gustoće destilata izmjerene piknometrijom.

A.2.    Reagensi i materijali

Tijekom analize, ako nije drukčije određeno, koriste se samo reagensi potvrđene analitičke kvalitete i voda čiji stupanj kvalitete je najmanje 3 u skladu s definicijom iz standarda ISO 3696:1987.

A.2.1.

Otopina natrijeva klorida (2 %-tna, m/V) Za pripremu 1 litre, odvagne se 20 g natrijeva klorida i otopi u vodi do tako da volumen otopine bude 1 l.

A.3.    Uređaji i oprema

Uobičajena laboratorijska oprema, a naročito sljedeće:

Napomena 1.: Metoda za određivanje gustoće u vakuumu jakih alkoholnih pića zahtijeva upotrebu vage s dvije plitice, piknometra i tara posude istog vanjskog volumena kako bi se u svakom trenutku poništio učinak tlaka zraka. Ova jednostavna tehnika se može koristiti i s vagom s jednom pliticom, pod uvjetom da se tara posuda izvaže ponovo kako bi se pratilo povećanje tlaka zraka tijekom vremena.

A.4.    Postupak

Uvodne napomene:

A.4.1.   Umjeravanje piknometra

Piknometar se umjerava određivanjem sljedećih parametara:

A.4.1.1.

Umjeravanje upotrebom vage s jednom pliticom: Odredi se: —  masa čistog, suhog piknometra (P), —  masa piknometra napunjenog vodom na t °C (P1), —  masa tara posude (T0). A.4.1.1.1. Izvaže se čisti i suhi piknometar (P). A.4.1.1.2. Piknometar se pažljivo napuni destiliranom vodom na temperaturi okoliša i priključi se termometar. Piknometar se pažljivo osuši krpom i stavi u toplinski izoliranu posudu. Miješa se okretanjem spremnika do stalne temperature na termometru. Razina se točno podesi do gornjeg ruba bočne cijevi. Pažljivo se očita temperatura t °C te, ako je potrebno, ispravi za bilo kakvu netočnost na temperaturnoj skali. Izvaže se piknometar napunjen vodom (P1). A.4.1.1.3. Izvaže se tara posuda (T0). A.4.1.1.4. Izračunavanje —  Tara praznog piknometra = P – m gdje je m masa zraka u piknometru. m = 0,0012 × (P1 – P) Napomena 2.: 0,0012 je gustoća suhog zraka na 20 °C pri tlaku od 760 mm Hg —  Volumen piknometra na 20 °C: gdje je HUF faktor za temperaturu t °C uzet iz tablice I. poglavlja.1 „Gustoća i relativna gustoća” Priloga Uredbi (EEZ) br. 2676/90 (str. 10). V20 °C se mora odrediti s točnošću od 0,001 ml. —  Masa vode u piknometru na 20 °C: gdje je 0,998203 gustoća vode na 20 °C. Napomena 3.: Ako je potrebno, može se koristiti vrijednost gustoće u zraku, 0,99715, a alkoholna jakost izračunati s obzirom na vrijednosti gustoće u zraku iz tablica službi za carine i trošarine Ujedinjene Kraljevine.

A.4.1.2.

Metoda za kalibriranje uz upotrebu vage s dvije plitice: A.4.1.2.1.  Tara posuda se stavi na lijevu pliticu, a čisti, suhi piknometar s prihvatnim čepom na desnu pliticu. Uravnoteže se postavljanjem utega na stranu piknometra: p grama. A.4.1.2.2.  Piknometar se pažljivo napuni destiliranom vodom na temperaturi okoliša i priključi se termometar; piknometar se pažljivo osuši krpom i stavi u plašt s toplinskom izolacijom. Miješa se okretanjem spremnika do konstantne temperature na termometru. Razina se točno podesi do gornjeg ruba bočne cijevi. Očisti se bočna cijev, namjesti prihvatni čep, pažljivo očita temperatura t °C te, ako je potrebno, podesi temperaturna skala. Izvaže se piknometar napunjen vodom, a p’ je masa uravnoteženja u gramima. A.4.1.2.3.  Izračunavanje —  Tara praznog piknometra = p + m gdje je m masa zraka u piknometru. m = 0,0012 × (p – p’) —  Volumen piknometra na 20 °C: gdje je HUF faktor za temperaturu t °C uzet iz tablice I. poglavlja 1. „Gustoća i relativna gustoća” Priloga Uredbi (EEZ) br. 2676/90 (str. 10.). V20 °C se mora odrediti s točnošću od 0,001 ml. —  Masa vode u piknometru na 20 °C: gdje je 0,998203 gustoća vode na 20 °C.

A.4.2.   Određivanje alkoholne jakosti uzorka za ispitivanje

A.5.    Svojstva metode (preciznost)

A.5.1.   Statistički rezultati međulaboratorijskog ispitivanja

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog ispitivanja svojstava metode koje je provedeno u skladu s međunarodno dogovorenim postupcima [1] [2].

METODA B:    ODREĐIVANJE STVARNE ALKOHOLNE JAKOSTI PO VOLUMENU JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA – MJERENJE ELEKTRONSKOM DENZIMETRIJOM (KOJA SE TEMELJI NA OSCILACIJI REZONANTNE FREKVENCIJE UZORKA U OSCILACIJSKOJ ĆELIJI)

B.1.    Načelo rada

Gustoća tekućine se određuje elektronskim mjerenjem oscilacija vibrirajuće U-cijevi. Uzorak se za potrebe mjerenja dodaje oscilirajućem sustavu, čija se specifična frekvencija oscilacije mijenja zbog dodane mase.

B.2.    Reagensi i materijali

Tijekom analize, ako nije drukčije navedeno, koriste se samo reagensi utvrđene analitičke kvalitete i stupnja kvalitete vode od najmanje 3, kako je određeno u standardu ISO 3696:1987.

B.3.    Uređaji i oprema

Uobičajena elektronska oprema, a posebno:

B.4.    Postupak

B.5.    Svojstva metode (preciznost)

B.5.1.   Statistički rezultati međulaboratorijskog ispitivanja

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog ispitivanja svojstava metode koje je provedeno u skladu s međunarodno dogovorenim postupcima [1] [2].

METODA C:    ODREĐIVANJE STVARNE ALKOHOLNE JAKOSTI PO VOLUMENU JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA – MJERENJE DENZIMETRIJOM UZ UPOTREBU HIDROSTATSKE VAGE

C.1.    Načelo rada

Alkoholna jakost jakih alkoholnih pića se može odrediti denzimetrijom uz pomoć hidrostatske vage slijedeći Arhimedov zakon po kojem svako tijelo uronjeno u tekućinu dobiva vertikalni uzgon koji je jednak masi istisnute tekućine, (tj. svako tijelo uronjeno u tekućinu prividno gubi na masi onoliko koliko iznosi masa tijelom istisnute tekućine.)

C.2.    Reagensi i materijali

Tijekom analize, osim ako nije drukčije navedeno, koriste se samo reagensi utvrđene analitičke kvalitete i stupnja kvalitete vode od najmanje 3, kao što je definirano u standardu ISO 3696:1987.

C.2.1.   Otopina za čišćenje plovka (natrijev hidroksid, 30 %-tna m/V)

Za pripremu 100 ml, odvagne se 30 g natrijeva hidroksida i dopuni do oznake etanolom volumnog udjela 96 %.

C.3.    Uređaji i oprema

Uobičajena laboratorijska oprema, a naročito sljedeće:

Napomena 1.: Moguća je i upotreba vage s dvije plitice; način rada je opisan u poglavlju 1. „Gustoća i relativna gustoća” Priloga Uredbi (EEZ) br. 2676/90 (str. 7.).

C.4.    Postupak

Plovak i menzura se moraju čistiti između svakog mjerenja destiliranom vodom, osušiti mekanim laboratorijskim papirom koji ne pušta vlakna te isprati otopinom kojoj se mora odrediti gustoća. Mjerenje se mora izvršiti čim se postigne stabilnost uređaja kako bi se ograničio gubitak alkohola isparavanjem.

C.5.    Svojstva metode (preciznost)

C.5.1.   Statistički rezultati međulaboratorijskog ispitivanja

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog ispitivanja svojstava metode koje je provedeno u skladu s međunarodno dogovorenim postupcima [1] [2].

1.Tikvica s okruglim dnom od 1 litre sa standardiziranim oblim spojem od brušenog stakla

2.20 cm rektifikacijska kolona Vigreux

3.10 cm hladilo West s ravnim rubom

4.40 cm spiralna cijev za hlađenje

II.    ODREĐIVANJE UKUPNOG SUHOG EKSTRAKTA U JAKIM ALKOHOLNIM PIĆIMA GRAVIMETRIJOM

1.    Područje primjene

Uredba (EEZ) br. 1576/89 predviđa ovu metodu samo za akvavit gdje je suhi ekstrakt ograničen na 15 g/l.

2.    Referentni standardi

ISO 3696:1987: Voda za upotrebu u analitičkom laboratoriju — Zahtjevi i metode ispitivanja.

3.    Definicija

Ukupni suhi ekstrakt ili ukupna suha tvar uključuje sve tvari koje nisu hlapive u određenim fizikalnim uvjetima.

4.    Načelo rada

Vaganje ostatka nakon isparavanja jakog alkoholnog pića u kipućoj vodenoj kupelji i sušenja u sušioniku.

5.    Uređaji i oprema

6.    Uzorkovanje i uzorci

Uzorci se drže na sobnoj temperaturi prije analize.

7.    Postupak

8.    Izračunavanje

Masa ostatka pomnožena s 40 jednaka je suhom ekstraktu u jakom alkoholnom piću i mora se izraziti u g/l do jednog decimalnog mjesta.

9.    Svojstva metode (preciznost)

9.1.   Statistički rezultati međulaboratorijskog ispitivanja

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog ispitivanja svojstava metode koje je provedeno u skladu s međunarodno dogovorenim postupcima [1] [2].

III.    ODREĐIVANJE HLAPIVIH SUPSTANCI I METANOLA U JAKIM ALKOHOLNIM PIĆIMA

III.1.   OPĆE NAPOMENE

1.    Definicije

Uredba (EEZ) br. 1576/89 određuje najmanje razine hlapivih spojeva, osim etanola i metanola, za niz alkoholnih pića (rum, jaka alkoholna pića na temelju vina i vinove loze, voćne rakije itd.). Samo za ovu skupinu pića se konvencionalno smatra da su te razine jednake zbroju koncentracija:

Sljedeće metode su konvencionalne metode za mjerenje hlapivih spojeva:

2.    Analiza hlapivih spojeva plinskom kromatografijom

Analiza hlapivih spojeva plinskom kromatografijom, osim spojeva koji su navedeni u prethodnom tekstu, može se pokazati posebno zanimljivom kao sredstvo za određivanje kako podrijetla sirovine koja se koristi u destilaciji, tako i stvarnih uvjeta destilacije.

Neka jaka alkoholna pića sadrže druge hlapive komponente, kao što su aromatski spojevi, koji su karakteristični za sirovine koje se koriste za dobivanje alkohola, aromu jakog alkoholnog pića i specifičnosti pripreme jakih alkoholnog pića. Ti su spojevi važni za procjenu zahtjeva određenih Uredbom (EEZ) br. 1576/89.

III.2.   ODREĐIVANJE SRODNIH HLAPIVIH SPOJEVA PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM: ALDEHIDA, VIŠIH ALKOHOLA, ETIL ACETATA I METANOLA

1.    Područje primjene

Ova metoda je prikladna za određivanje 1,1-dietoksietana (acetala), 2-metil butan-1-ola (aktivnog amilnog alkohola), 3-metil butan-1-ola (izoamilnog alkohola), metanola (metilnog alkohola), etil etanoata (etil acetata), butan-1-ola (n-butanola), butan-2-ola (sec-butanola), 2-metil propan-1-ola (izobutil alkohola), propan-1-ola (n-propanola) i etanala (acetaldehida) u jakim alkoholnim pićima primjenom plinske kromatografije. U ovoj se metodi koristi interni standard, na primjer pentan-3-ol. Koncentracije analita se izražavaju u gramima na 100 litara apsolutnog alkohola; alkoholna jakost proizvoda mora se odrediti prije analize. Jaka alkoholna pića koja se mogu analizirati primjenom ove metode su viski, brandy, rum, rakija od grožđa, voćna rakija i lozovača.

2.    Referentni standardi

ISO 3696:1987: Voda za upotrebu u analitičkom laboratoriju — Zahtjevi i metode ispitivanja.

3.    Definicija

Srodni spojevi su hlapive supstance koje nastaju uz etanol tijekom fermentacije, destilacije i zrenja jakih alkoholnih pića.

4.    Načelo rada

Srodni spojevi u jakim alkoholnim pićima se određuju direktnim ubrizgavanjem alkoholnog pića ili prikladno razrijeđenog jakog alkoholnog pića u sustav za plinsku kromatografiju (GC). Prije ubrizgavanja jakom alkoholnom piću se doda odgovarajući interni standard. Srodni spojevi se odvajaju temperaturnim programiranjem na odgovarajućoj koloni, a detektiraju primjenom detektora za plamenu ionizaciju. Koncentracija svakog srodnog spoja određuje se s obzirom na interni standard iz faktora odgovora, koji se dobiju tijekom kalibriranja pod istim kromatografskim uvjetima kakvi se primjenjuju i u analizi jakih alkoholnih pića.

5.    Reagensi i materijali

Ako nije drukčije navedeno, koriste se samo reagensi čija čistoća je veća od 97 %, a koji su nabavljeni od dobavljača koji posjeduje ISO certifikat i koji su popraćeni potvrdom o čistoći te ne sadrže druge srodne spojeve pri test razrjeđenju (to se može potvrditi injektiranjem pojedinačnih standarda srodnog spoja pri test razrjeđenju uz kromatografske uvjete kao pod točkom 6.4.), te samo voda čija je kvaliteta najmanje 3 u skladu sa standardom ISO 3696. Acetal i acetaldehid se moraju držati na tamnom mjestu i temperaturi < 5 °C. Svi drugi reagensi mogu se držati na sobnoj temperaturi.

▼M3

▼B

6.    Uređaji i aparatura

7.    Uzorkovanje i uzorci

8.    Postupak (koji se koristi za validiranu metodu)

9.    Izračunavanje

Može se koristiti automatizirani sustav za obradu podataka, pod uvjetom da se podaci mogu provjeriti na temelju načela koja su opisana u donjoj metodi.

Izmjere se visine ili površine vršaka za srodni spoj i vršci internog standarda.

10.    Osiguranje kakvoće i kontrola (korišteni za validiranu metodu)

Primjenom gore navedene jednadžbe (2) izračuna se koncentracija svakog srodnog spoja u otopinama standarda za provjeru sustava koje su pripremljene postupkom opisanim pod točkama od 8.1.1. do 8.1.4. Primjenom jednadžbe (3) izračuna se postotak iskorištenja ciljne vrijednosti. Ako su analitički rezultati unutar ± 10 % njihovih teoretskih vrijednosti za svaki srodni spoj, analiza se može nastaviti. Ako nisu, mora se istražiti uzrok odstupanja te poduzeti potrebne korektivne mjere.

11.    Svojstva provođenja metode (preciznost)

Statistički rezultati međulaboratorijskog ispitivanja: sljedeće tablice daju vrijednosti za sljedeće spojeve: etanal, etil acetat, acetal, ukupni etanal, metanol, butan-2-ol, propan-1-ol, butan-1-ol, 2-metil-propan-1-ol, 2-metil-butan-1-ol i 3-metil-butan-1-ol.

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog ispitivanja svojstava metode koje je provedeno u skladu s međunarodno dogovorenim postupcima.

▼M2

III.3.   ODREĐIVANJE HLAPIVE KISELOSTI JAKIH ALKOHOLNIH PIĆA

1.    Područje primjene

Metoda je validirana u međulaboratorijskom ispitivanju za rum, brandy, rakiju od komine i rakiju od voća na razinama u rasponu od 30 mg/l do 641 mg/l.

2.    Referentni standardi

ISO 3696: 1987 Voda za analitičku uporabu – Specifikacija i metode ispitivanja.

3.    Definicije

3.1.	Hlapiva kiselost izračunava se oduzimanjem fiksne kiselosti od ukupne kiselosti.

3.2.	Ukupna kiselost jest zbroj titracijskih kiselosti.

3.3.	Fiksna kiselost jest kiselost rezidua preostalog nakon isparavanja jakog alkoholnog pića do suhoće.

4.    Načelo

Ukupna kiselost i fiksna kiselost utvrđuju se titracijom ili potenciometarskom titracijom.

5.    Reagensi i materijali

Tijekom analize, osim ako nije drukčije navedeno, upotrebljavaju se samo reagensi priznate analitičke kvalitete i stupnja kvalitete vode od najmanje 3, kako je definirano u normi ISO 3696:1987.

5.1.	0,01 M otopina natrijeva hidroksida (NaOH)

5.2.	Otopina miješanog indikatora: Odvagne se 0,1 g bojila indigo carmine i 0,1 g fenol crvene. Rastopi ih se u 40 ml vode i do 100 ml napuni etanolom.

6.    Uređaji i oprema

Neizravna laboratorijska oprema, stakleni pribor A razreda i sljedeće:

7.    Uzorkovanje i uzorci

Uzorci se skladište na sobnoj temperaturi prije analize.

8.    Postupak

8.1.   Ukupna kiselost

8.1.1.   Priprema uzorka

Jako alkoholno piće ozračuje se ultrazvukom ili miješanjem dvije minute u vakuumu kako bi se iz njega uklonio ugljikov dioksid ako je to potrebno.

8.1.2.   Titracija

U Erlenmeyerovu tikvicu od 500 ml pipetira se 25 ml jakog alkoholnog pića.

Doda se oko 200 ml ohlađene prokuhane destilirane vode (svakodnevno svježe pripremljene) i dvije do šest kapi otopine miješanog indikatora (5.2.).

Titrira se s 0,01 M otopine natrijeva hidroksida (5.1.) sve dok se boja ne promijeni iz žutozelene u ljubičastu kod bezbojnih jakih alkoholnih pića, odnosno iz žutosmeđe u crvenosmeđu u slučaju jakih alkoholnih pića smeđe boje.

Titracija može biti i potenciometarska, do pH od 7,5.

Volumen 0,01 M dodane otopine natrijevog hidroksida označiti s n1 ml.

8.1.3.   Izračun

Ukupna kiselost (engl. total acidity, TA) izražena u miliekvivalentima po litri jakog alkoholnog pića odgovara 0,4 × n1.

Ukupna kiselost (TA) izražena u miligramima octene kiseline po litri jakog alkoholnog pića odgovara 24 × n1.

8.2.   Fiksna kiselost

8.2.1.   Priprema uzorka

Ispariti 25 ml jakog alkoholnog pića do suhoće.

8.2.2.   Titracija

Otopiti rezidue preostale nakon isparavanja ohlađenom prokuhanom destiliranom vodom (svakodnevno svježe pripremljenom) i dopuniti do približno 100 ml te dodati dvije do šest kapi otopine miješanog indikatora (5.2.).

Titrirati s 0,01 M otopine natrijeva hidroksida (5.1.).

Titracija može biti i potenciometarska, do pH od 7,5.

Volumen 0,01 M dodane otopine natrijevog hidroksida označiti s n2 ml.

8.2.3.   Izračun

Fiksna kiselost (engl. fixed acidity, FA) izražena u miliekvivalentima po litri jakog alkoholnog pića odgovara 0,4 × n2.

Fiksna kiselost (FA) izražena u miligramima octene kiseline po litri jakog alkoholnog pića odgovara 24 × n2.

9.    Izračun hlapive kiselosti

9.1.	Izraženo u miliekvivalentima po litri: Neka je: TA = ukupna kiselost u miliekvivalentima po litri FA = fiksna kiselost u miliekvivalentima po litri Hlapiva kiselost, VA (engl. volatile acidity) u miliekvivalentima po litri odgovara: TA – FA

9.2.	Izraženo u miligramima octene kiseline po litri: Neka je: TA′ = ukupna kiselost u miligramima octene kiseline po litri FA′ = fiksna kiselost u miligramima octene kiseline po litri Hlapiva kiselost, VA u miligramima octene kiseline po litri odgovara: TA′ – FA′

9.3.	Izraženo u gramima octene kiseline po hektolitru čistog stopostotnog alkohola odgovara: pri čemu je A alkoholna jakost po volumenu jakog alkoholnog pića.

10.    Svojstva metode (preciznost)

10.1.   Statistički rezultati međulaboratorijskog ispitivanja

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog ispitivanja svojstava metode koje je provedeno u skladu s međunarodno dogovorenim postupcima [1] [2].

Vrste uzoraka:

A	brandy od šljiva; razina razdiobe*

B	rum I.; dvostruke slijepe probe

C	rum II.; razina razdiobe*

D	šljivovica; dvostruke slijepe probe

E	brandy; dvostruke slijepe probe

F	rakija od komine; dvostruke slijepe probe

▼M1

V.    ANETOL. ODREĐIVANJE TRANS-ANETOLA U ALKOHOLNIM PIĆIMA PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1.    Područje primjene

Ova je metoda prikladna za određivanje trans-anetola u alkoholnim pićima s aromom anisa primjenom kapilarne plinske kromatografije.

2.    Referentni standardi

ISO 3696:1987 Voda za uporabu u analitičkom laboratoriju – Specifikacije i metode ispitivanja.

3.    Načelo rada

Koncentracija trans-anetola alkoholnog pića određuje se plinskom kromatografijom (GC). Ista količina internog standarda, npr. 4-alilanizola (estragola) kada estragol nije prirodno prisutan u uzorku, dodaje se uzorku za ispitivanje i referentnoj otopini trans-anetola poznate koncentracije te se oba razrijede pomoću 45 %-tne otopine etanola i injektiraju izravno u sustav za plinsku kromatografiju (GC). Prije pripreme uzoraka i analize likera koji sadrže veće količine šećera potrebna je ekstrakcija.

4.    Reagensi i materijali

Tijekom analize koriste se samo reagensi čija je čistoća najmanje 98 %. Mora se koristiti voda čiji je stupanj kakvoće najmanje 3 prema definiciji standarda ISO 3696.

Referentne kemikalije trebaju se čuvati na hladnom (na 4 °C) i tamnom mjestu, u aluminijskim spremnicima ili u bočicama za reagense od obojenog (jantarnog) stakla. Poželjno je da zatvarači imaju aluminijsku brtvu. Potrebno je „otopiti” trans-anetol iz kristalnog stanja prije uporabe, ali u tom slučaju njegova temperatura nikada ne smije prijeći 35 °C.

4.1.	Etanol 96 % vol. (CAS 64-17-5)

4.2.	1-metoksi-4-(1-propenil) benzen; (trans-anetol) (CAS 4180-23-8)

4.3.	4-alilanizol, (estragol) (CAS 140-67-0), preporučeni interni standard (IS)

4.4.	Etanol 45 % vol. Doda se 560 g destilirane vode u 378 g etanola 96 % vol.

4.5.

Priprema standardnih otopina Sve standardne otopine moraju se čuvati na sobnoj temperaturi (od 15 do 35 °C), na tamnom mjestu, u aluminijskim spremnicima ili u bočicama za reagense od obojenog (jantarnog) stakla. Poželjno je da zatvarači imaju aluminijsku brtvu. Trans-anetol i 4-alilanizol praktički su netopivi u vodi te je stoga neophodno otopiti trans-anetol i 4-alilanizol u određenoj količini 96 %-tnog etanola (4.1.) prije dodavanja 45 %-tnog etanola (4.4.). Radne otopine moraju se pripremati svježe svaki tjedan. 4.5.1.   Standardna otopina A Radna otopina trans-anetola (koncentracija: 2 g/L) Odvagne se 40 mg trans-anetola (4.2) u odmjernu tikvicu od 20 ml (ili 400 mg u 200 ml itd.). Doda se određena količina 96 %-tnog etanola (4.1), nadopuni do oznake s 45 %-tnim etanolom (4.4.) te dobro promiješa. 4.5.2.   Interna standardna otopina B Radna interna standardna otopina, npr. estragol (koncentracija: 2 g/L) Odvagne se 40 mg estragola (4.3) u odmjernu tikvicu od 20 ml (400 mg u 200 ml itd.). Doda se određena količina 96 %-tnog etanola (4.1), nadopuni do oznake 45 %-tnim etanolom (4.4) te dobro promiješa. 4.5.3.   Otopine koje se koriste za provjeru linearnosti odziva plamenog ionizacijskog detektora (FID) Linearnost odziva plamenog ionizacijskog detektora (FID-a) mora se provjeriti za analizu, uzimajući u obzir raspon koncentracija trans-anetola u alkoholnim pićima od 0 g/L do 2,5 g/L. U postupku analize, nepoznati uzorci alkoholnih pića koji se moraju analizirati razrijede se 10 puta (8.3.). Za uvjete analize opisane u metodi, radne otopine koje odgovaraju koncentracijama od 0, 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 i 0,25 g/L trans-anetola u uzorku koji se mora analizirati pripreme se kako slijedi: uzme se 0,5, 1, 1,5, 2 i 2,5 ml radne otopine A (4.5.1.) i pipetira u odvojene odmjerne tikvice od 20 ml; u svaku se tikvicu pipetira 2 ml interne standardne otopine B (4.5.2.), nadopuni do oznake 45 % -tnim etanolom (4.4.) te dobro promiješa. Otopine slijepe probe (8.4.) koriste se kao 0 g/L otopina. 4.5.4.   Standardna otopina C Uzme se 2 ml standardne otopine A (4.5.1.) i pipetira u odmjernu tikvicu od 20 ml, zatim se doda 2 ml interne standardne otopine B (4.5.2.), dopuni do oznake 45 % -tnim etanolom (4.4.) te dobro promiješa.

5.    Aparatura i oprema

6.    Kromatografski uvjeti

Vrsta i dimenzije stupca te uvjeti plinske kromatografije moraju biti takvi da su anetol i interni standard odvojeni jedan od drugog i od svih interferirajućih tvari. Uobičajeni uvjeti za stupac iz primjera u 5.3. su:

7.    Uzorci

Uzorci se moraju čuvati na sobnoj temperaturi, zaštićeni od svjetla i hladnoće.

8.    Postupak

8.1.   Pretraživanje uzorka na estragol

Za provjeru je li estragol prirodno prisutan u uzorku, mora se napraviti analiza slijepe probe bez dodatka bilo kojeg internog standarda. Ako je estragol prirodno prisutan, tada se mora odabrati neki drugi interni standard (na primjer, mentol).

U odmjernu tikvicu od 20 ml pipetira se 2 ml uzorka, nadopuni do oznake 45 %-tnim etanolom (4.4.) te dobro promiješa.

8.2.   Priprema nepoznatih uzoraka

U odmjernu tikvicu od 20 ml pipetira se 2 ml uzorka, zatim se doda 2 ml interne standardne otopine B (4.5.2.), nadopuni do oznake 45 %-tnim etanolom (4.4.) te dobro promiješa.

8.3.   Slijepa proba

U odmjernu tikvicu od 20 ml pipetira se 2 ml interne standardne otopine B (4.5.2.), nadopuni do oznake 45 %-tnim etanolom (4.4.) te dobro promiješa.

8.4.   Ispitivanje linearnosti

Prije početka analize mora se provjeriti linearnost odziva plamenog ionizacijskog detektora (FID-a) sukcesivnom trostrukom analizom svake standardne otopine za provjeru linearnosti (4.5.3.).

Iz površine pikova ili visine pikova integratora za svako se injektiranje napravi grafički prikaz koncentracije njihove matične otopine u g/L prema omjeru R za svaku.

R = visina ili površina pika za trans-anetol podijeljena s visinom ili površinom pika za estragol.

Mora se dobiti linearna krivulja.

8.5.   Određivanje

Ubrizga se otopina slijepe probe (8.3.), zatim standardna otopina C (4.5.4.) i jedna od standardnih otopina za provjeru linearnosti (4.5.3.) koja će djelovati kao uzorak za kontrolu kakvoće (može se odabrati s obzirom na vjerojatnu koncentraciju trans-anetola u nepoznatom uzorku) te pet nepoznatih uzoraka (8.2.); umetne se uzorak za provjeru linearnosti (kontrolu kakvoće) nakon svakih pet nepoznatih uzoraka kako bi se osigurala analitička stabilnost.

9.    Računanje faktora odziva

Mjere se ili površine pika (pomoću integratora ili drugog sustava za obradu podataka) ili visine pika (ručna integracija) za pikove trans-anetola i internog standarda.

9.1.   Računanje faktora odziva (RFi)

Faktor odziva računa se kako slijedi

RFi = (C i/površina ili visinai)*(površina ili visinais/C is)

gdje je:

C i	koncentracija trans-anetola u standardnoj otopini A (4.5.1.)

C is	koncentracija internog standarda u standardnoj otopini B (4.5.2.)

površinai

površina (ili visina) pika trans-anetola

površinais

površina (ili visina) pika internog standarda

RFi se računa iz pet uzoraka otopine C (4.5.4.).

9.2.   Analiza otopina za ispitivanje linearnosti odziva

Ubrizgaju se otopine za ispitivanje linearnosti odziva (4.5.3.).

9.3.   Analiza uzorka

Ubrizga se otopina nepoznatog uzorka (8.2.).

10.    Računanje rezultata

Formula za izračun koncentracije trans-anetola je sljedeća:

c i = C is * (površina ili visinai/površina ili visinais)*RFi

gdje je:

c i	nepoznata koncentracija trans-anetola

C is	koncentracija internog standarda u nepoznatoj tvari (4.5.2.)

Površina ili visinai

površina ili visina pika trans-anetola

Površina ili visinais

površina ili visina pika internog standarda

RFi	koeficijent odziva (izračunan kao pod 9.1.)

Koncentracija trans-anetola izražava se u gramima po litri, na jednu decimalu.

11.    Osiguranje i kontrola kakvoće

Kromatogrami moraju biti takvi da su anetol i interni standard odvojeni jedan od drugog i od svih interferirajućih tvari. Vrijednost RFi izračuna se iz rezultata za pet injektiranja otopine C (4.5.4.). Ako je koeficijent varijacije (CV %=(standardno odstupanje/srednja vrijednost)*100)) unutar plus ili minus 1 %, prosječna vrijednost RFi je prihvatljiva.

Gornji se izračun mora koristiti za računanje koncentracije trans-anetola u uzorku koji je odabran za kontrolu kakvoće iz otopina za kontrolu linearnosti (4.5.3.).

Ako su srednji izračunati rezultati iz analize otopina za kontrolu linearnosti koje su odabrane za uzorke interne kontrole kakvoće (IQC) unutar plus ili minus 2,5 % njihove teoretske vrijednosti, tada se mogu prihvatiti rezultati za nepoznate uzorke.

12.    Obrada uzorka alkoholnog pića koji sadrži veću količinu šećera i uzorka likera prije analize plinskom kromatografijom

Ekstrakcija alkohola iz alkoholnog pića koje sadrži veću količinu šećera kako bi se mogla odrediti koncentracija trans-anetola primjenom kapilarne plinske kromatografije.

12.1.   Načelo rada

Uzme se alikvot uzorka likera i doda mu se interni standard čija je koncentracija slična koncentraciji analita (trans-anetola) u likeru. Tome se doda natrijev fosfat dodekahidrat i bezvodni amonijev sulfat. Dobivena se mješavina dobro promiješa i ohladi, nastaju dva sloja, a gornji alkoholni sloj se ukloni. Uzme se alikvot tog alkoholnog sloja i razrijedi 45 %-tnom otopinom etanola (4.4.) (Napomena: u ovoj se fazi ne dodaje nijedan interni standard, budući da je već dodan). Dobivena se otopina analizira plinskom kromatografijom.

12.2.   Reagensi i materijali

Tijekom ekstrakcije se koriste samo reagensi čija je čistoća veća od 99 %.

12.3.   Aparatura i oprema

Konusne tikvice, tikvice za odjeljivanje, hladnjak.

12.4.   Postupak

12.4.1.   Pretraživanje uzorka na estragol

Kako bi bili sigurni da estragol nije prirodno prisutan u uzorku, mora se izvršiti ekstrakcija slijepe probe (12.6.2.) i analiza bez dodavanja bilo kojeg internog standarda. Ako je estragol prirodno prisutan, tada se mora odabrati neki drugi interni standard.

12.4.2.   Ekstrakcija

U konusnu se tikvicu pipetira 5 ml 96 %-tnog etanola (4.1.); u ovu se tikvicu odvagne 50 mg internog standarda (4.3.) i doda 50 ml uzorka. Doda se 12 g amonijeva sulfata, bezvodnog (12.2.1.) i 8,6 g dibazičnog natrijeva fosfata, dodekahidrata (12.2.2.). Konusna tikvica se začepi.

Tikvica se mućka najmanje 30 minuta. Može se koristiti i mehanički uređaj za mućkanje, ali ne i magnetni mješač obložen teflonom, jer teflon upija određenu količinu analita. Dodane soli neće se potpuno otopiti.

Začepljena se tikvica stavi u hladnjak (T < 5 °C) na najmanje 2 sata.

Nakon toga trebaju nastati dva odvojena tekuća sloja i čvrsti ostatak. Alkoholni sloj treba biti bistar; ako nije, stavi se ponovno u hladnjak dok ne postane bistar.

Kada alkoholni sloj postane bistar, pažljivo se uzme alikvot (npr. 10 ml) bez narušavanja vodenog sloja, stavi u bočicu od jantarnog stakla i zatvori sigurnosnim zatvaračem.

12.4.3.   Priprema ekstrahiranog uzorka za analizu

Pusti se da ekstrakt (12.4.2.) dosegne sobnu temperaturu.

Uzme se 2 ml alkoholnog sloja ekstrahiranog uzorka regulirane temperature i pipetira u odmjernu tikvicu od 20 ml, nadopuni do oznake 45 %-tnim etanolom (4.4.) i dobro promiješa.

12.5.   Određivanje

Slijedi se postupak opisan pod 8.5.

12.6.   Računanje rezultata

Za računanje rezultata koristi se sljedeća formula:

gdje je:

m is	masa uzetog internog standarda (4.3.) (12.4.2.) (u miligramima)

V	volumen nepoznatog uzorka (50 ml)

RFi	faktor odziva (9.1.)

površinai

površina pika trans-anetola

površinais

površina pika internog standarda

Rezultati se izražavaju u gramima po litri, na jednu decimalu.

12.7.   Kontrola i osiguranje kakvoće

Slijedi se postupak opisan pod 11. gore.

13.    Svojstva metode (preciznost)

Statistički rezultati interlaboratorijskog ispitivanja:

VI.    GLICIRIZNA KISELINA. ODREĐIVANJE GLICIRIZNE KISELINE PRIMJENOM VISOKODJELOTVORNE TEKUĆINSKE KROMATOGRAFIJE

1.    Svrha

Ova metoda je prikladna za određivanje glicirizne kiseline u alkoholnim pićima s aromom anisa primjenom visokodjelotvorne tekućinske kromatografije (HPLC). Uredba (EEZ) br. 1576/89 određuje da svako alkoholno piće s aromom anisa koje se naziva „pastis” mora sadržavati između 0,05 i 0,5 g glicirizne kiseline po litri.

2.    Referentni standardi

ISO 3696: 1987 Voda za uporabu u analitičkom laboratoriju – Specifikacije i metode ispitivanja.

3.    Načelo rada

Koncentracija glicirizne kiseline se određuje pomoću visokodjelotvorne tekućinske kromatografije (HPLC) s UV detekcijom. Standardna otopina i probni uzorak filtriraju se i odvojeno injektiraju izravno u sustav HPLC-a.

4.    Reagensi i materijali

Tijekom analize, koriste se samo reagensi za HPLC, apsolutni etanol i voda čiji stupanj kakvoće iznosi 3 prema definiciji standarda ISO 3696.

4.1.	Etanol 96 % vol. (CAS 64-17-5).

4.2.	Amonij glicirizinat, C42H62O16.NH3 (amonijeva sol glicirizne kiseline) (Relativna molekulska masa 839,98) (CAS 53956-04-0): čistoća najmanje 90 % (Relativna molekulska masa: glicirizinska kiselina 822,94).

4.3.	Ledena octena kiselina, CH3COOH (CAS 64-19-7).

4.4.	Metanol, CH3OH (CAS 67-56-1).

4.5.	Etanol 50 % vol. Za 1 000 ml na 20 °C: —  96 %-tni etanol (4.1.): 521 ml —  voda (2.0.): 511 ml.

4.6.

Priprema HPLC otopina za eluciju 4.6.1.   Otapalo za eluciju A (primjer) 80 dijelova (po volumenu) vode (2.0.) 20 dijelova (po volumenu) octene kiseline (4.3.). Otapalo za eluciju degazira se u trajanju od pet minuta. Napomena: Ako voda koja se koristi nije mikrofiltrirana, preporučuje se filtrirati pripremljeno otapalo za eluciju na filteru za organska otapala s veličinom pora koja je manja ili jednaka 0,45 μm. 4.6.2.   Otapalo za eluciju B Metanol (4.4.).

4.7.

Priprema standardnih otopina Sve standardne otopine moraju se svježe pripremiti nakon dva mjeseca. 4.7.1.   Referentna otopina C U odmjernu tikvicu od 100 ml odvagne se 25 mg amonijeva glicirizinata (4.2) s točnošću od 0,1 mg. Doda se etanol 50 % vol. (4.5.) i otopi amonijev glicirizinat. Kad je otopljen, dopuni se do oznake etanolom 50 % vol. (4.5.). Filtrira se kroz filtar za organska otapala. 4.7.2.   Standardne otopine koje se koriste za provjeru linearnosti odziva uređaja Radna otopina od 1,0 g/L se pripremi odvagom s točnošću od 0,1 mg, 100 mg amonijeva glicirizinata u odmjernu tikvicu od 100 ml. Doda se etanol 50 % vol. (4.5.) i otopi amonijev glicirizinat. Kad je otopljen, nadopuni se do oznake etanolom 50 % vol. (4.5.). Pripreme se najmanje četiri druge otopine koje odgovaraju 0,05, 0,1, 0,25 i 0,5 g/L amonijeva glicirizinata pipetiranjem 5 ml, 10 ml, 25 ml, odnosno 50 ml radne otopine masene koncentracije 1,0 g/L u odvojene odmjerne tikvice od 100 ml. Nadopuni se do oznake etanolom 50 % vol. (4.5.) i dobro promiješa. Sve se otopine filtriraju kroz filtar za organska otapala.

5.    Aparatura i oprema

5.1.   Sustav za odjeljivanje

5.2.	Računalni integrator ili uređaj za snimanje čiji rad je kompatibilan s ostatkom sustava.

5.3.	Kolona (primjer): Materijal: nehrđajući čelik ili staklo Unutarnji promjer: 4 do 5 mm Duljina: 100 do 250 mm Stacionarna faza: umreženi silicijev dioksid s (poželjno sferičnom) oktadecilnom funkcijskom grupom (C18), najveća veličina čestica: 5 μm.

5.4.	Laboratorijska oprema 5.4.1. Analitička vaga s preciznošću očitavanja od 0,1 mg 5.4.2. Odmjerno stakleno posuđe razine A 5.4.3. Mirkomembranski filtri za male volumene.

6.    Kromatografski uvjeti

7.    Postupak

7.1.   Priprema uzorka alkoholnog pića

Filtrira se, ako je potrebno, kroz filtar za organska otapala (promjer pora: 0,45 μm).

7.2.   Određivanje

Kad se stabiliziraju kromatografski uvjeti,

8.    Svojstva metode (preciznost)

Statistički rezultati međulaboratorijskog ispitivanja:

VII.    KALKONI. VISOKODJELOTVORNA TEKUĆINSKA KROMATOGRAFIJA ZA PROVJERU PRISUSTVA KALKONA U PASTISU

1.    Svrha

Ova je metoda prikladna za određivanje prisutnosti kalkona u alkoholnim pićima s aromom anisa. Kalkoni su prirodna bojila iz skupine flavonoida koji se nalaze u slatkom korijenu (Glycyrrhiza glabra).

Da bi se alkoholno piće s aromom anisa moglo zvati „pastis”, mora sadržavati kalkone (Uredba (EEZ) br. 1576/89).

2.    Referentni standardi

ISO 3696: 1987 Voda za uporabu u analitičkom laboratoriju – Specifikacije i metode ispitivanja.

3.    Načelo rada

Pripremi se referentna otopina ekstrakta slatkog korijena. Prisutnost ili odsutnost kalkona određuje se visokodjelotvornom tekućinskom kromatografijom (HPLC) s UV detekcijom.

4.    Reagensi i materijali

Tijekom analize, koriste se samo reagensi HPLC čistoće. Etanol treba biti 96 % vol. Treba se koristiti samo voda čiji stupanj kakvoće iznosi 3 prema definiciji standarda ISO 3696.

4.1.	Etanol 96 % vol. (CAS 64-17-5).

4.2.	Acetonitril, CH3CN (CAS 75-05-8)

4.3.	Referentna tvar: Glycyrrhiza glabra: slatki korijen Grubo mljeveni slatki korijen (Glycyrrhiza glabra). Prosječne dimenzije štapićastih čestica: dužina: 10 do 15 mm, debljina: 1 do 3 mm.

4.4.	Natrijev acetat, CH3COONa (CAS 127-09-3)

4.5.	Ledena octena kiselina, CH3COOH (CAS 64-19-7)

4.6.

Priprema otopina 4.6.1.   Etanol 50 % vol. Za 1 000 ml na 20 °C: —  etanol 96 % vol. (4.1.): 521 ml —  voda (2.0.): 511 ml. 4.6.2.   Otapalo A: acetonitril Acetonitril (4.2.) analitičke čistoće za HPLC. Degazira se. 4.6.3.   Otapalo B: 0,1 M puferska otopina natrijeva acetata, pH 4,66. U odmjernu se tikvicu odvagne 8,203 g natrijeva acetata (4.4.), doda 6,005 g ledene octene kiseline (4.5.) i nadopuni do 1 000 ml vodom (2.).

5.    Priprema referentnog ekstrakta iz Glycyrrhiza glabra (4.3)

5.1.	Odvagne se 10 g mljevenog slatkog korijena (Glycyrrhiza glabra) (4.3.) i stavi u destilacijsku tikvicu s okruglim dnom —  doda se 100 ml etanola 50 % vol. (4.6.1.), —  pusti se da vrije u refluksu sat vremena, —  filtrira se. i —  filtrat se odloži za kasniju uporabu.

5.2.	S filtra se skine ekstrakt slatkog korijena, —  stavi u destilacijsku tikvicu s okruglim dnom, —  doda se 100 ml etanola 50 % vol. (4.6.1.), —  pusti se da vrije u refluksu sat vremena, —  filtrira se. Filtrat se odloži za kasniju uporabu.

5.3.	Ekstrakcija slatkog korijena mora se napraviti tri puta za redom.

5.4.	Kombiniraju se tri filtrata.

5.5.	Na rotacijskom isparivaču se ispari otapalo (iz 5.4.).

5.6.	Pokupi se ostatni ekstrakt (iz 5.5.) sa 100 ml etanola 50 % vol. (4.6.1.).

6.    Aparatura i oprema

6.1.   Sustav za odjeljivanje.

6.2.	Računalni integrator ili uređaj za snimanje čiji je rad kompatibilan s ostatkom sustava za odjeljivanje.

6.3.	Kolona Materijal: nehrđajući čelik ili staklo Unutarnji promjer: 4 do 5 mm Stacionarna faza: umreženi silicij dioksid s oktadecilnom funkcijskom grupom (C18), maksimalna veličina čestica: najviše 5 μm (umrežena faza).

6.4.

Uobičajena laboratorijska oprema, uključujući: 6.4.1.  analitičku vagu (preciznost: ± 0,1 mg); 6.4.2.  uređaj za destilaciju s povratnim hladilom koji se sastoji od, na primjer: —  tikvice s okruglim dnom od 250 ml i standardnim spojem od ubrušenog stakla, —  30 cm dugog povratnog hladila, i —  izvora topline (bilo koja pirogena reakcija koja uključuje ekstrakt mora se izbjeći uporabom prikladnog sustava). 6.4.3.  Rotacijski uređaj za isparivanje. 6.4.4.  Filtracija (tj. lijevak Büchner).

6.5.

Kromatografski uvjeti (primjer). 6.5.1. Svojstva elucije otapala A (4.6.2.) i B (4.6.3.): —  pomak s gradijenta 20/80 (V/V) na 50/50 (V/V) u 15 minuta, —  pomak s gradijenta 50/50 (V/V) na 75/25 (V/V) u pet minuta, —  jednaka jakost na 75/25 (V/V) tijekom 5 minuta, —  stabilizacija kolone između injektiranja, —  jednaka jakost na 20/80 (V/V) tijekom pet minuta. 6.5.2. Brzina protoka: 1 ml/minuta. 6.5.3. Podešavanja UV detektora: detektor mora biti podešen na 370 nm za detekciju prisustva kalkona, a zatim na 254 nm za detekciju glicirizne kiseline. Napomena: promjena valne duljine (s 370 nm na 254 nm) mora se izvršiti 30 sekundi prije početka pika elucije glicirizne kiseline.

7.    Postupak

7.1.   Priprema uzorka alkoholnog pića

Filtrira se kroz filtar za organska otapala (promjer pora: 0,45 μm).

7.2.   Priprema ostatnog ekstrakta slatkog korijena (5.6.)

Prije analize napravi se razrjeđenje jedan u deset pomoću etanola 50 % vol. (4.6.1.).

7.3.   Određivanje

8.    Svojstva kromatograma za pastis

Slika 1

Kromatogram dobiven gore opisanom metodom, koji pokazuje prisutnost kalkona u „pastisu”. Pikovi od 1. do 8. su kalkoni, a pik 9 je glicirizinska kiselina.

9.    Svojstva metode (preciznost)

Rezultati međulaboratorijskog ispitivanja:

▼M2

VIII.    UKUPNI ŠEĆER

1.    Područje primjene

Metoda HPLC-RI primjenjiva je za određivanje ukupnog šećera (izraženog kao invertni šećer) u jakim alkoholnim pićima, osim likera koji sadržavaju proizvode od jaja i mlijeka.

Metoda je validirana u međulaboratorijskom ispitivanju za pastis, destilirani anis, liker od trešanja, krem liker od (naziv upotrijebljenog voća ili sirovine) i crème de cassis, u razinama od 10,86 g/l do 509,7 g/l. Međutim, linearnost odziva instrumenta dokazana je za raspon koncentracije od 2,5 g/l do 20,0 g/l.

Ta metoda nije namijenjena određivanju niskih razina šećera.

2.    Referentni standardi

ISO 3696:1987 Voda za analitičku uporabu – Specifikacija i metode ispitivanja.

3.    Načelo

Analiza otopina šećera visokodjelotvornom tekućinskom kromatografijom radi određivanja koncentracija glukoze, fruktoze, saharoze, maltoze i laktoze u njima.

U toj se metodi upotrebljava stacionarna faza alkil amina i određivanje diferencijalnom refraktometrijom i navodi se kao primjer. Moguća bi bila i upotreba smole za anionsku izmjenu kao stacionarne faze.

4.    Reagensi i materijali

4.1.	Glukoza (CAS 50-99-7), čistoće od najmanje 99 %.

4.2.	Fruktoza (CAS 57-48-7), čistoće od najmanje 99 %.

4.3.	Saharoza (CAS 57-50-1), čistoće od najmanje 99 %.

4.4.	Laktoza (CAS 5965-66-2), čistoće od najmanje 99 %.

4.5.	Maltoza-monohidrat (CAS 6363-53-7), čistoće od najmanje 99 %.

4.6.	Čisti acetonitril (CAS 75-05-8) za HPLC analizu.

4.7.	Destilirana ili demineralizirana voda, ako je moguće mikrofiltrirana.

4.8.

Otapala (primjer) Otapalo za eluciju sastoji se od sljedećeg: 75 dijelova po volumenu acetonitrila (4.6.), 25 dijelova po volumenu destilirane vode (4.7.). Radi degaziranja, sporo propuštati helij 5 do 10 minuta prije upotrebe. Ako voda koja se upotrebljava nije mikrofiltrirana, otapalo je potrebno filtrirati s pomoću filtra za organska otapala s veličinom pora koja je manja ili jednaka 0,45 μm.

4.9.	Apsolutni etanol (CAS 64-17-5).

4.10.

Otopina etanola (5 %, v/v).

4.11.

Pripravak matične standardne otopine (20 g/l). Odvagne se 2 g svakog od šećera za analizu (4.1. do 4.5.), prenese ih se bez gubitka u odmjernu tikvicu od 100 ml. (Napomena: 2,11 g maltoze monohidrata je ekvivalent 2 g maltoze). Dopuni se do 100 ml petpostotnom alkoholnom otopinom (4.10.), protrese i čuva na oko + 4 °C. Nova radna otopina priprema se jednom tjedno.

4.12.

Priprema radnih standardnih otopina (2,5, 5,0, 7,5, 10,0 i 20,0 g/l) Razrijedi se matična otopina, 20 g/l (4.11.) petpostotnom alkoholnom otopinom (4.10.) radi dobivanja pet radnih standardnih otopina od 2,5, 5,0, 7,5, 10,0 i 20,0 g/l. Filtrirati s pomoću filtra s veličinom pora koja je manja ili jednaka 0,45 μm (5.3.).

5.    Uređaji i oprema

5.1.   HPLC sustav kojim se može postići rezolucija svih šećera po baznoj liniji.

5.1.1.

Visokodjelotvorni tekućinski kromatograf sa šestostranim ventilom za ubrizgavanje opremljenim petljom od 10 μl ili bilo kojim drugim automatskim ili ručnim uređajem za pouzdano ubrizgavanje mikrovolumena.

5.1.2.

Sustav pumpi koji omogućuje postizanje i održavanje stalne ili programirane brzine protoka s visokom preciznošću.

5.1.3.

Diferencijalni refraktometar.

5.1.4.

Računalni integrator ili uređaj za snimanje čiji rad je kompatibilan s ostatkom sustava.

5.1.5.

Predkolona: Preporučuje se da predkolona bude pričvršćena na analitičku kolonu.

5.1.6.

Kolona (primjer): Materijal: nehrđajući čelik ili staklo. Unutarnji promjer: 2 – 5 mm. Duljina: 100 – 250 mm (ovisno o veličini čestica punila), na primjer 250 mm ako je promjer čestica 5 μm. Stacionarna faza: funkcionalne skupine alkil amina, vezane na silicijevi dioksid maksimalne veličine čestica od 5 μm.

5.1.7.

Kromatografski uvjeti (primjer): otapalo za eluciju (4.8.), brzina protoka: 1 ml/minuta. Detekcija: diferencijalna refraktometrija. Kako bi se osigurala potpuna stabilnost detektora, potrebno ga je uključiti nekoliko sati prije upotrebe. Referentnu ćeliju potrebno je napuniti otapalom za eluciju.

5.2.	Analitička vaga s preciznošću očitavanja od 0,1 mg.

5.3.	Pribor za filtraciju malih volumena upotrebom mikromembrane od 0,45 μm.

6.    Skladištenje uzoraka

Uzorke se po primitku skladišti na sobnoj temperaturi prije analize.

7.    Postupak

7.1.   DIO A: Priprema uzorka

7.1.1.

Protresti uzorak.

7.1.2.

Filtrirati uzorak kroz filtar s veličinom pora koja je manja ili jednaka 0,45 μm (5.3.).

7.2.   DIO B: HPLC

7.2.1.   Određivanje

Ubrizgati 10 μL standardnih otopina (4.12.) i uzoraka (7.1.2.). Analizu provesti u prikladnim kromatografskim uvjetima, na primjer onima prethodno opisanima.

7.2.2.

Ako određeni vršak uzorka ima veću površinu (ili visinu) od odgovarajućeg vrška u standardu najveće koncentracije, taj bi uzorak trebalo razrijediti destiliranom vodom i ponovno ga analizirati.

8.    Izračun

Usporediti dva kromatograma dobivena za standardnu otopinu i jako alkoholno piće. Identificirati vrške na temelju njihovih vremena retencije. Izmjeriti njihove površine (ili visine) kako bi se izračunala koncentracija metodom vanjskog standarda. Uzeti u obzir sva razrjeđenja uzorka.

Konačni je rezultat zbroj saharoze, maltoze, laktoze, glukoze i fruktoze izražen kao invertni šećer u g/l.

Invertni šećer izračunava se kao zbroj svih prisutnih monosaharida i reducirajućih disaharida uvećan za stehiometrijsku količinu glukoze i fruktoze izračunanu na temelju prisutne saharoze.

Invertni šećer (g/l)

=

glukoza (g/l) + fruktoza (g/l) + maltoza (g/l) + laktoza (g/l) + (saharoza (g/L) × 1,05)

1,05

=

(molekularna masa fruktoze + molekularna masa glukoze)/molekularna masa saharoze

9.    Svojstva metode (preciznost)

9.1.   Statistički rezultati međulaboratorijskog ispitivanja

Sljedeći podaci su dobiveni iz međunarodnog ispitivanja svojstava metode koje je provedeno u skladu s međunarodno dogovorenim postupcima [1] [2].

▼M1

IX.    ŽUMANJAK. ODREĐIVANJE KONCENTRACIJE ŽUMANJKA U ALKOHOLNIM PIĆIMA – FOTOMETRIJSKA METODA

1.    Svrha

Ova je metoda prikladna za određivanje koncentracije žumanjka u rasponu od 40 do 250 g/L u likeru od jaja i likeru s jajetom.

2.    Referentni standardi

ISO 3696:1897 Voda za upotrebu u analitičkom laboratoriju – Specifikacije i metode ispitivanja.

3.    Načelo rada

Fosforni spojevi topivi u etanolu koji se nalaze u žumanjku ekstrahiraju se i analiziraju fotometrijski kao molibdatni fosforni kompleksi.

4.    Reagensi i materijali

5.    Aparatura i oprema

6.    Uzorci

Uzorci se skladište na sobnoj temperaturi prije analize.

7.    Postupak

7.1.   Priprema uzorka

7.2.   Fotometrijsko određivanje fosfata

7.2.1.   Poredbena otopina

7.2.2.   Otopina uzorka

7.2.3.   Kalibracijska krivulja

8.    Izražavanje rezultata

Sadržaj žumanjka u g/L izračuna se pomoću sljedeće formule:

gdje je:

110.	faktor konverzije za ukupni P2O5 u g u 100 g žumanjka

mg P2O5

vrijednost utvrđena kalibracijskom krivuljom

gustoća

masa po jediničnom volumenu (g/ml) likera na bazi žumanjka na 20 °C

E	masa likera na bazi žumanjka u g

40	faktor razrjeđenja za alikvot od 5 ml otopine pepela.

9.    Svojstva metode (preciznost)

Statistički rezultati međulaboratorijskog ispitivanja:

▼M2

X.    ODREĐIVANJE SLJEDEĆIH SPOJEVA IZ DRVETA U JAKIM ALKOHOLNIM PIĆIMA VISOKODJELOTVORNOM TEKUĆINSKOM KROMATOGRAFIJOM (HPLC): FURFURAL, 5-HIDROKSIMETILFURFURAL, 5-METILFURFURAL, VANILIN, SIRINGALDEHID, KONIFERALDEHID, SINAPALDEHID, GALNA KISELINA, ELAGIČNA KISELINA, VANILINSKA KISELINA, SIRINGIČNA KISELINA I SKOPOLETIN

1.    Područje primjene

Metoda se odnosi na određivanje furfurala, 5-hidroksimetilfurfurala, 5-metilfurfurala, vanilina, siringaldehida, koniferaldehida, sinapaldehida, galne kiseline, elagične kiseline, vanilinske kiseline, siringične kiseline i skopoletina visokodjelotvornom tekućinskom kromatografijom.

2.    Normativni izvori

Metoda analize koju je priznala Glavna skupština Međunarodne organizacije za vinovu lozu i vino (OIV), a OIV ju je objavio pod referentnim brojem OIV-MA-BS-16: R2009.

3.    Načelo

Određivanje visokodjelotvornom tekućinskom kromatografijom (HPLC) uz detekciju ultraljubičastom spektrofotometrijom na nekoliko valnih duljina te fluorescentnom spektroskopijom.

4.    Reagensi

Reagensi moraju biti analitičke čistoće. Mora se upotrebljavati destilirana voda ili voda barem jednake čistoće. Najbolje je upotrebljavati mikrofiltriranu vodu otpornosti od 18,2 M Ω.cm.

4.1.	96 %-tni alkohol.

4.2.	Metanol kvalitete primjerene za HPLC (otapalo B).

4.3.	Octena kiselina razrijeđena do 0,5 % volumnog udjela (otapalo A).

4.4.	Pokretne faze: (navedeno samo kao primjer). Otapalo A (0,5 %-tna octena kiselina) i otapalo B (čisti metanol). Filtrirati kroz membranu (poroznosti od 0,45 μm). Degazirati u ultrazvučnoj kupelji ako je to potrebno.

4.5.	Referentni standardi čistoće najmanje 99 %: furfural, 5-hidroksimetilfurfural, 5-metilfurfural, vanilin, siringaldehid, koniferaldehid, sinapaldehid, galna kiselina, elagična kiselina, vanilinska kiselina, siringična kiselina i skopoletin.

4.6.

Referentna otopina: standardne tvari razrjeđuju se u 50 %-tnoj otopini vode i alkohola. Konačne koncentracije u referentnoj otopini trebale bi biti sljedeće: furfural: 5 mg/l; 5-hidroksimetilfurfural: 10 mg/l; 5-metilfurfural 2 mg/l; vanilin: 5 mg/l; siringaldehid 10 mg/l; koniferaldehid 5 mg/l; sinapaldehid; 5 mg/l; galna kiselina 10 mg/l; elagična kiselina 10 mg/l; vanilinska kiselina: 5 mg/l; siringična kiselina 5 mg/l; skopoletin: 0,5 mg/l.

5.    Oprema

Standardna laboratorijska aparatura

5.1.

Visokodjelotvorni tekućinski kromatograf koji može funkcionirati u binarnom gradijentu i opremljen je: 5.1.1.  Spektrofotometrijskim detektorom koji može mjeriti na valnim duljinama od 260 do 340 nm. Međutim, preporučuje se raditi s detektorom za više valnih duljina s diodnim nizom ili sličnim detektorom kako bi se potvrdila čistoća vršaka. 5.1.2.  Detektor za fluorescentnu spektroskopiju – valna duljina ekscitacije: 354 nm, valna duljina emisije: 446 nm (za određivanje tragova skopoletina; moguće ga je detektirati i na 313 nm spektrofotometrijom). 5.1.3.  Uređaj za ubrizgavanje kojim se može unijeti 10 ili 20 μl (na primjer) uzoraka za ispitivanje. 5.1.4.  Kolona visokodjelotvornog tekućinskog kromatografa, tipa RP C18, najveća veličina čestica od 5 μm.

5.2.	Šprice za HPLC.

5.3.	Uređaj za membransku filtraciju malih volumena.

5.4.	Računalni integrator ili uređaj za snimanje čiji je rad kompatibilan sa svom opremom, a posebno mora imati nekoliko ulaznih kanala.

6.    Postupak

6.1.   Priprema otopine za ubrizgavanje

Referentna otopina i jako alkoholno piće filtriraju se, prema potrebi, kroz membranu s najvećim promjerom pora od 0,45 μm.

6.2.

Kromatografski radni uvjeti: analizu je potrebno provoditi na sobnoj temperaturi s pomoću opreme opisane u točki 5.1. upotrebom pokretnih faza (4.4.) s protokom od približno 0,6 ml po minuti u skladu s gradijentom navedenim u nastavku (naveden samo kao primjer): vrijeme: 0 min 50 min 70 min 90 min otapalo A (voda – kiselina): 100 % 60 % 100 % 100 % otapalo B (metanol): 0 % 40 % 0 % 0 % U određenim slučajevima gradijent bi trebalo izmijeniti kako bi se izbjegle koelucije.

6.3.

Određivanje 6.3.1. Ubrizgati referentne standarde odvojeno, a zatim pomiješano. Prilagoditi radne uvjete kako bi faktori rezolucije vršaka svih spojeva iznosili najmanje 1. 6.3.2. Ubrizgati uzorak pripremljen u skladu s točkom 6.1. 6.3.3. Izmjeriti površinu vršaka u referentnoj otopini i jakom alkoholnom piću te izračunati koncentracije.

7.    Izražavanje rezultata

Izraziti koncentracije svih sastojaka u mg/l.

8.    Svojstva metode (preciznost)

Sljedeći su podatci dobiveni 2009. iz međunarodnog ispitivanja svojstava metode provedenog na više jakih alkoholnih pića u skladu s međunarodno dogovorenim postupcima [1], [2].

8.1.   Furfural

8.2.   5-hidroksimetilfurfural

8.3.   5-metilfurfural

8.4.   Vanilin

8.5.   Siringaldehid

8.6.   Koniferaldehid

8.7.   Sinapaldehid

8.8.   Galna kiselina

8.9.   Elagična kiselina

8.10.   Vanilinska kiselina

8.11.   Siringična kiselina

8.12.   Skopoletin

▼M3

XI.    ODREĐIVANJE SADRŽAJA IZOTOPA UGLJIKA 14C U ETANOLU

1.    Uvod

Određivanje sadržaja izotopa ugljika 14C u etanolu omogućuje razlikovanje alkohola dobivenog iz fosilnih goriva (sintetički alkohol) i alkohola dobivenog iz nedavno dobivenih sirovina (alkohola dobivenog fermentacijom).

2.    Definicija

Sadržaj izotopa ugljika 14C u etanolu smatra se sadržajem izotopa ugljika 14C koji je utvrđen ovdje opisanom metodom ili metodom C opisanom u normi EN 16640.

Prirodni sadržaj izotopa ugljika 14C u atmosferi (referentna vrijednost), koji vegetacija apsorbira asimilacijom, nije stalna vrijednost. Referentna vrijednost stoga se određuje na etanolu dobivenom iz sirovina iz posljednjeg vegetacijskog razdoblja. Ta godišnja referentna vrijednost utvrđuje se u skladu s normom EN 16640. Međutim, može se prihvatiti i druga referentna vrijednost ako ju je certificiralo akreditirano tijelo.

3.    Načelo rada

Sadržaj izotopa ugljika 14C u uzorcima koji sadržavaju alkohol s najmanje 85 % masenog udjela etanola određuje se izravno tekućinskim scintilacijskim brojanjem.

4.    Reagensi

4.1.   Toluenski scintilator

5,0 g 2,5-difeniloksazol (PPO)

0,5 g p-bis-[4-metil-5-feniloksazolil(2)]-benzen (dimetil-POPOP) u 1 litri toluena analitičke kvalitete.

Mogu se upotrebljavati i komercijalni toluenski scintilatori tog sastava spremni za uporabu.

4.2.   Standard za izotop ugljika 14C

n-Heksadekan 14C s aktivnošću od oko 1 × 106 dpm/g (približno 1,67 × 106 cBq/g) i zajamčenom točnošću utvrđene aktivnosti od ± 2 % rel.

4.3.   Etanol koji ne sadržava izotop ugljika 14C

Sintetički alkohol dobiven iz sirovina fosilnog podrijetla s najmanje 85 % masenog udjela etanola, za određivanje pozadine.

5.    Oprema

6.    Postupak

6.1.   Namještanje opreme

Oprema se mora namjestiti u skladu s uputama proizvođača. Mjerni uvjeti optimalni su kad je vrijednost E2/B, indeks kvalitete, na najvećoj mogućoj razini.

E = efficiency (učinkovitost)

B = background (pozadina)

Optimiziraju se samo dva mjerna kanala. Treći je u potpunosti otvoren za potrebe kontrole.

6.2.   Odabir brojačkih cjevčica

Više brojačkih cjevčica nego što će biti potrebno pojedinačno se puni s 10 ml sintetičkog etanola koji ne sadržava izotop ugljika 14C te s 10 ml toluenskog scintilatora. Svaki se mjeri tijekom najmanje 4 ciklusa × 100 minuta. Odbacuju se cjevčice čija pozadina odstupa od srednje vrijednosti za više od ± 1 % rel. Smiju se upotrebljavati samo nove cjevčice iz tvornice i iz iste serije.

6.3.   Određivanje omjera vanjski standard/kanal (ESCR).

Tijekom postupka postavljanja kanala (točka 6.1.) ESCR se određuje s pomoću odgovarajućeg računalnog programa paralelno s određivanjem učinkovitosti. Vanjski standard koji se upotrebljava je 137cezij, koji je proizvođač već ugradio.

6.4.   Priprema uzorka

Mogu se mjeriti uzorci s masenim udjelom etanola od najmanje 85 % i bez nečistoća, koji apsorbiraju na valnim duljinama ispod 450 nm. Mala količina ostataka estera i aldehida nema negativan učinak. Sadržaj alkohola u uzorku prethodno se određuje uz približnu vrijednost od 0,1 %.

7.    Mjerenje uzoraka s pomoću vanjskog standarda

7.2.   Mjerenje

10 ml svakog uzorka pripremljenog u skladu s točkom 6.4. pipetira se u odabranu brojačku cjevčicu s provjerenom pozadinom, a 10 ml toluenskog scintilatora dodaje se s pomoću uređaja za automatsko doziranje. Uzorci u cjevčicama homogeniziraju se odgovarajućim rotacijskim pokretima. Tekućina ne smije doći u doticaj s polietilenskim umetkom u zatvaraču. Za mjerenje pozadine na isti se način priprema brojačka cjevčica koja sadržava etanol fosilnog podrijetla bez izotopa ugljika 14C. Za kontrolu odgovarajuće godišnje vrijednosti izotopa ugljika 14C priprema se duplikat nedavno dobivenog etanola iz posljednjeg vegetacijskog razdoblja, pri čemu se jedna cjevčica miješa s internim standardom (vidjeti točku 8.).

Kontrolni i pozadinski uzorci postavljaju se na početak serije mjerenja koja ne smije sadržavati više od 10 uzoraka za analizu. Ukupno vrijeme mjerenja po uzorku iznosi najmanje 2 × 100 minuta, pri čemu se pojedinačni uzorci mjere u fazama od 100 minuta tako da se može otkriti bilo kakav pomak opreme ili druga neispravnost. (Stoga jedan ciklus odgovara mjernom intervalu od 100 minuta po uzorku).

Pozadinski i kontrolni uzorci svježe se pripremaju svaka četiri tjedna.

U slučaju blago oslabljenih uzoraka (ESCR oko 1,8), promjena te vrijednosti samo neznatno utječe na učinkovitost. Ako je promjena unutar ± 5 % rel., može se očekivati ista učinkovitost. Za više oslabljene uzorke, kao što su denaturirani alkoholi, učinkovitost se može utvrditi s pomoću dijagrama korekcije ekstinkcije. Ako odgovarajući računalni program nije dostupan, koristi se interni standard koji daje nedvosmislen rezultat.

8.    Mjerenje uzoraka s pomoću internog standarda heksadekana 14C

8.1.   Postupak

Kontrolni i pozadinski uzorci (nedavno dobiveni etanol i etanol fosilnog podrijetla) te nepoznati materijal mjere se kao duplikati. Jedan uzorak duplikata priprema se u neodabranoj cjevčici te se točno dozirana količina (30 μl) heksadekana 14C dodaje kao interni standard (dodana aktivnost oko 26 269 dpm/gC približno 43 782 cBq/gC). Za pripremu i vrijeme mjerenja ostalih uzoraka vidjeti točku 7.2., s tim da se vrijeme mjerenja za uzorke s internim standardom može skratiti na oko pet minuta ako se mjerenje prethodno namjesti na 105 impulsa. Za svaku seriju mjerenja upotrebljava se po jedan duplikat pozadinskih i kontrolnih uzoraka koji se postavljaju na početak serije.

8.2.   Rukovanje internim standardom i brojačkim cjevčicama

Kako bi se spriječila kontaminacija pri mjerenju s pomoću internog standarda, oni se moraju skladištiti i njima se mora rukovati daleko od područja na kojem se pripremaju i mjere uzorci za analizu. Nakon mjerenja se cjevčice s provjerenom pozadinom mogu ponovno upotrijebiti. Zatvarači i cjevčice koji sadržavaju interni standard moraju se ukloniti.

9.    Prikaz rezultata

9.1.   Jedinica aktivnosti radioaktivne tvari je bekerel; 1 Bq = 1 raspad/sekunda

Pokazatelj specifične radioaktivnosti izražava se kao bekerel po jednom gramu ugljika = Bq/gC.

Kako bi se dobili praktičniji rezultati, te se vrijednosti izražavaju u centibekerelima = cBq/gC.

Mogu se koristiti i opisi i formule iz literature koje se temelje na vrijednosti dpm. Kako bi se dobile odgovarajuće vrijednosti izražene u cBq, vrijednost dpm samo se pomnoži sa 100/60.

9.2.   Izražavanje rezultata s vanjskim standardom

9.3.   Izražavanje rezultata s internim standardom

9.4.   Pokrate

cpmpr

=

srednja brzina brojanja impulsa uzorka tijekom ukupnog vremena mjerenja

cpmNE

=

srednja brzina brojanja impulsa pozadine izračunana na isti način

cpmIS

=

brzina brojanja impulsa uzoraka s internim standardom

dpmIS

=

količina dodanog internog standarda (kalibracijska radioaktivnost dpm)

V

=

volumen korištenih uzoraka u ml

F

=

sadržaj čistog alkohola u gramima po ml koji odgovara njegovoj koncentraciji

Z

=

učinkovitost koja odgovara vrijednosti ECSR-a

1,918

=

broj grama alkohola po gramu ugljika

10.    Pouzdanost metode

10.1.   Ponovljivost (r)

r = 0,632 cBq/g C; S(r) = ± 0,223 cBq/g C

10.2.   Obnovljivost (R)

R = 0,821 cBq/g C; S(R) = ± 0,290 cBq/g C