—

Osaerä: suuremmasta erästä erotettu tietty osa, johon sovelletaan näytteenottomenetelmää. Jokaisen osaerän on oltava fyysisesti erillinen ja yksilöitävissä.

—

Perusnäyte: tutkittavan erän tai osaerän yhdestä ainoasta kohdasta otettu näyte.

—

Kokoomanäyte: kaikkien tutkittavasta erästä tai osaerästä otettujen perusnäytteiden muodostama kokonaisuus.

—

Laboratorionäyte: laboratoriolle tarkoitettu kokoomanäytteen edustava osa tai määrä.

—

Jos tutkittavaan erään sisältyy pienikokoisia kaloja (noin alle 1 kg:n painoisia yksittäisiä kaloja), kokonainen kala otetaan perusnäytteenä mukaan kokoomanäytteeseen. Jos tulokseksi saadun kokoomanäytteen paino on yli 3 kg, perusnäytteet voivat koostua kokoomanäytteen muodostavien kalojen keskiosista, joista kunkin paino on vähintään 100 grammaa. Näytteen homogenointiin käytetään koko se määrä, johon sovelletaan enimmäismäärää.

Kalan painopiste on kalan keskiosassa. Se sijaitsee useimmiten selkäevän kohdalla (jos kalalla on selkäevä) tai kidusaukon ja peräaukon puolivälissä.

—

Jos tutkittavaan erään sisältyy suurempia kaloja (noin yli 1 kg:n painoisia yksittäisiä kaloja), perusnäyte koostuu kalan keskiosasta. Kukin perusnäyte painaa vähintään 100 grammaa.

Keskikokoisista (noin 1–6 kg:n painoisista) kaloista otetaan perusnäyte leikkaamalla kalan keskiosasta viipale, joka ulottuu selkärangasta vatsaan.

Hyvin suurikokoisista (esim. yli 6 kg painavista) kaloista otetaan perusnäyte edestä katsoen oikeanpuoleisesta selkä- ja kylkilihaksesta kalan keskiosasta. Jos kyseisen näytepalan ottaminen kalan keskiosasta merkitsisi merkittävää taloudellista tappiota, voidaan pitää riittävänä, että otetaan erän koosta riippumatta joko kolme perusnäytettä, joista kukin painaa vähintään 350 grammaa, tai vastaavan kokoiset näytteet pyrstön ja pään läheltä, jotta saadaan koko kalan dioksiinipitoisuuden kannalta edustava perusnäyte.

—

Näytteen koostumukseen sovelletaan 4.3 kohdassa vahvistettuja säännöksiä.

—

Jos jokin koko- tai painoluokka on vallitseva (noin 80 prosenttia tai enemmän tuote-erästä), näyte otetaan vallitsevan kokoisista tai painoisista kaloista. Kyseisen näytteen on katsottava edustavan koko tuote-erää.

—

Ellei mikään koko- tai painoluokka ole vallitseva, on varmistettava, että näytteeseen valitut kalat edustavat koko tavaralähetystä. Kyseisiä tapauksia varten annetaan erityisohjeita oppaassa Guidance document of lots of fish containing whole fishes of different size and/or weight (2).

—

lasketaan laajennettu epävarmuus käyttäen kattavuuskerrointa 2, jolloin luotettavuustaso on noin 95 prosenttia. Erä tai osa-erä ei ole säännösten mukainen, jos mitattu arvo (josta on vähennetty mittausepävarmuustekijä U) ylittää sallitun enimmäismäärän. Jos dioksiinipitoisuudet ja dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuudet määritetään erikseen, erillisten analyysitulosten yhteenlaskettua arvioitua laajennettua epävarmuutta on käytettävä dioksiinipitoisuuksien ja dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden pitoisuuksien summana.

—

vahvistetaan päätösraja (CCα) neuvoston direktiivin 96/23/EY täytäntöönpanosta määritysmenetelmien suorituskyvyn ja tulosten tulkinnan osalta 12 päivänä elokuuta 2002 tehdyn komission päätöksen 2002/657/EY (5) säännösten mukaisesti (liitteen 3.1.2.5 kohta – aineet, joille on vahvistettu sallittu raja). Erä tai osaerä ei täytä vaatimuksia, jos mitattu arvo on suurempi tai yhtä suuri kuin CCα.

—

On ryhdyttävä toimiin ristikontaminaation välttämiseksi kussakin näytteenoton ja analyysin vaiheessa.

—

Näytteet on varastoitava ja kuljetettava lasista, alumiinista, polypropyleenistä tai polyetyleenistä valmistetuissa säiliöissä. Paperipölyjäämät on poistettava astiasta. Lasitavarat on huuhdeltava liuottimella, joka varmennetusti ei sisällä dioksiineja tai josta on ennalta tarkastettu dioksiinien pitoisuudet.

—

Näytteiden varastointi ja kuljetus on järjestettävä niin, että elintarvikenäyte pysyy koskemattomana.

—

Mikäli aiheellista, kukin laboratorionäyte hienonnetaan ja sekoitetaan perinpohjaisesti menetelmällä, jonka on osoitettu saavan aikaan täysin homogeenisen tuloksen (esim. hienonnus 1 mm:n siivilän läpäiseviksi hiukkasiksi). Liian kosteat näytteet on kuivattava ennen hienontamista.

—

On suoritettava ilman näytettä tehtävä nolla-analyysi, jossa käydään läpi kaikki analyysin vaiheet.

—

Uuttamisessa käytettävän näytteen painon on oltava riittävä herkkyysvaatimusten täyttämiseksi.

—

Tarkasteltavien tuotteiden yhteydessä käytettävät näytteiden valmistelumenetelmät on validoitava kansainvälisesti hyväksyttyjen suuntaviivojen mukaisesti.

—

Kalan nahka on poistettava, koska enimmäispitoisuus koskee nahatonta lihaa. On kuitenkin välttämätöntä, että kaikki lihan ja rasvakudoksen jäänteet kaavitaan huolellisesti ja täydellisesti nahan sisäpuolelta ja nämä jäänteet lisätään tarkastettavaan näytteeseen.

—

Laboratorioiden on osoitettava menetelmän suorituskyky kyseisellä mittausalueella, esimerkiksi 0,5 ×, 1 × ja 2 × mitattava taso, jolla toistettujen mittausten hajonta on hyväksyttävä. Ks. hyväksymisvaatimuksia koskevat tiedot 5 kohdasta.

—

Varmistusmenetelmän määritysrajan tulee olla noin yksi viidesosa mitattavasta tasosta.

—

Sisäistä laadunvalvontaa varten on mitattava säännöllisesti nollanäytteitä tai näytteitä, joihin on lisätty analyyttiä, tai erityisiä kontrollinäytteitä mieluiten varmennetuilla vertailuaineilla.

—

Laboratorion pätevyys osoitetaan osallistumalla jatkuvasti hyvin tuloksin laboratorioiden välisiin tutkimuksiin, jotka koskevat dioksiinien ja dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden määrittämistä rehu- tai elintarvikematriiseissa.

—

Asetuksen (EY) N:o 882/2004 säännösten mukaisesti laboratorioiden on oltava ISO-oppaan 58 mukaisesti toimivan tunnustetun laitoksen hyväksymiä, millä varmistetaan, että laboratoriot soveltavat analyyttistä laadunvarmistusta. Laboratorioiden hyväksyntä on tehtävä EN ISO/IEC 17025 -standardin mukaisesti.

—

Hyvä herkkyys ja matalat toteamisrajat. PCDD:t ja PCDF:t ovat erittäin myrkyllisiä yhdisteitä, joten ne on pystyttävä havaitsemaan jo määrinä, joiden suuruus on pikogrammoja TEQ (pikogramma = 10-12 g). PCB-yhdisteiden tiedetään esiintyvän suurempina pitoisuuksina kuin PCDD- ja PCDF-yhdisteiden. Useimpien PCB-yhdisteiden osalta herkkyydeksi riittää jo nanogrammoina (10-9 g) ilmaistava alue. Niitä toksisempien dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden (erityisesti ei-orto-yhdisteiden) mittauksessa herkkyyden on oltava samaa luokkaa kuin PCDD- ja PCDF-yhdisteiden kohdalla.

—

Hyvä selektiivisyys (spesifisyys). PCDD- ja PCDF-yhdisteet sekä dioksiinin kaltaiset PCB:t on voitava erottaa lukuisista muista uuttamisessa mukana tulevista ja mahdollisesti häiriöitä aiheuttavista yhdisteistä, joiden pitoisuudet voivat olla moninkertaisia verrattuna tarkasteltavien yhdisteiden pitoisuuksiin. Kaasukromatografia-massaspektrometriamenetelmissä (GC-MS) on pystyttävä tarvittaessa erottelemaan eri yhdisteet, kuten toksiset yhdisteet (esim. seitsemäntoista 2,3,7,8-substituoitua PCDD- ja PCDF-yhdistettä ja dioksiinin kaltaiset PCB:t) muista yhdisteistä. Biotestien pitää pystyä määrittämään TEQ-arvot valikoiden PCDD- ja PCDF-yhdisteiden ja dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden summana.

—

Hyvä tarkkuus (oikeellisuus ja täsmällisyys). Määrityksessä on pystyttävä antamaan pätevä arvio aineen todellisesta pitoisuudesta näytteessä. Hyvä tarkkuus (mittauksen tarkkuus: mittauksen tuloksen ja mittaussuureen todellisen tai annetun arvon läheisyys) on välttämätöntä, jotta voidaan välttää näytteen analyysin tuloksen hylkääminen TEQ-arvion heikon luotettavuuden perusteella. Tarkkuus ilmaistaan oikeellisuutena (varmennetusta materiaalista mitatun tutkittavan aineen määrän keskiarvon ja sen varmennetun arvon erotus prosentteina tästä arvosta) ja täsmällisyytenä (RSDR on uusittavissa olosuhteissa saaduista tuloksista laskettu suhteellinen standardipoikkeama).

—

Analyysimenetelmän validoimiseksi on aivan menetelmän alussa eli esimerkiksi ennen uuttamista lisättävä 13C-merkittyjä 2,3,7,8-kloorisubstituoituja sisäisiä PCDD/F-standardiaineita ja 13C-merkittyjä sisäisiä dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden standardiaineita. Vähintään yhtä näistä yhdisteistä on lisättävä kutakin tetra–oktakloorattua PCDD/F-homologiryhmää kohden ja vähintään yhtä näistä yhdisteistä kutakin dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden homologiryhmää kohden (tai vaihtoehtoisesti vähintään yhtä näistä yhdisteistä kutakin PCDD/F:ien ja dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden valvonnassa käytettyä massaspektrillä määritettyä ionia kohden.) Ainakin varmistusmenetelmien yhteydessä on käytettävä kaikkia 17:ää 13C-merkittyä 2,3,7,8-kloorisubstituoitua sisäistä PCDD/F-standardiainetta ja kaikkia 12:ta 13C-merkittyä sisäistä dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden standardiainetta.

Suhteelliset vastetekijät on asianmukaista kalibrointiliuosta käyttäen määritettävä myös niille aineille, joiden osalta ei lisätä 13C-merkittyä analogia.

—

Kasviperäisten elintarvikkeiden ja alle 10 prosenttia rasvaa sisältävien eläinperäisten elintarvikkeiden kohdalla sisäiset standardiaineet on lisättävä ennen uuttamista. Yli 10 prosenttia rasvaa sisältävien eläinperäisten elintarvikkeiden kohdalla ne taas voidaan lisätä joko ennen uuttamista tai rasvauuttamisen jälkeen. Uuttamisen tehokkuus on validoitava asianmukaisesti riippuen siitä, missä vaiheessa sisäiset standardiaineet lisätään, ja siitä, ilmoitetaanko tulokset tuotteessa vai rasvassa olevan pitoisuuden perusteella.

—

Ennen GC-MS-analyysia on lisättävä 1 tai 2 saantostandardiainetta.

—

Saantojen valvonta on välttämätöntä. Varmistusmenetelmissä sisäisten standardien saantojen tulee olla 60–120 prosenttia. Pienemmät saantoarvot voidaan hyväksyä erityisesti hepta- ja oktakloorattujen dibentsodioksiinien ja dibentsofuraanien osalta, kunhan niiden vaikutus TEQ-arvoon on enintään 10 prosenttia TEQ-arvon kokonaismäärästä (perustana PCDD/F:ien ja dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden summa). Seulontamenetelmissä saantojen tulee olla 30–140 prosenttia.

—

Dioksiinit on erotettava häiriöitä aiheuttavista klooratuista yhdisteistä, esimerkiksi muista kuin dioksiinin kaltaisista PCB-yhdisteistä ja klooratuista bifenyylieettereistä, soveltuvilla kromatografiatekniikoilla (mieluiten florisil-, alumiinioksidi- ja/tai hiilikolonneilla).

—

Isomeerien erotuksen kaasukromatografian avulla on oltava riittävä (1,2,3,4,7,8-HxCDF:n ja 1,2,3,6,7,8-HxCDF:n välisen laakson korkeus ei saa ylittää 25 prosenttia).

—

Dioksiinien määrittämiseen on käytettävä EPA-menetelmän 1613 versiota B (Tetra- through octa-chlorinated dioxins and furans by isotope dilution HRGC/HRMS) tai vastaavat tehokkuuskriteerit täyttävää menetelmää.

—

Suurimman ja pienimmän arvon välinen ero saa olla enintään 20 prosenttia elintarvikkeilla, joiden dioksiinipitoisuus on noin 1 pg WHO-TEQ rasvagrammaa kohti (perustana PCDD/PCDF:ien ja dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden summa). Vähärasvaisiin elintarvikkeisiin on sovellettava vastaavia vaatimuksia pitoisuuden ollessa noin 1 pg WHO-TEQ tuotteen painogrammaa kohti. Pienemmillä pitoisuuksilla – esim. 0,50 pg WHO-TEQ tuotegrammaa kohti – suurimpien ja pienimpien arvojen ero voi olla 25–40 prosenttia.

—

Kussakin koesarjassa on käytettävä nollanäytettä ja vertailunäytettä (-näytteitä), jotka uutetaan ja testataan samaan aikaan identtisissä oloissa. Vertailunäytteen vasteen on oltava selvästi kohonnut verrattuna nollanäytteeseen.

—

Lisäksi on käytettävä mitattavan tason 0,5- ja 2-kertaista arvoa edustavia vertailunäytteitä, joilla osoitetaan testin toimivuus halutulla mittausalueella mitattavan tason kontrollia varten.

—

Muita matriiseja testattaessa on osoitettava vertailunäytteiden sopivuus mieluiten ottamalla mukaan näytteitä, joiden TEQ-arvoksi on korkearesoluutioisella kaasukromatografia-massaspektrometrialla määritetty vertailunäytteen arvoa lähellä oleva arvo, taikka käyttämällä arvoltaan vastaavaksi säädettyä nollanäytettä.

—

Koska sisäisiä standardiaineita ei voida käyttää biotesteissä, on tehtävä toistettavuustestejä, jotta saadaan tietoja yksittäisen koesarjan keskihajonnasta. Vaihtelukertoimen on oltava pienempi kuin 30 prosenttia.

—

Biotestien osalta on määriteltävä kohdeyhdisteet, mahdolliset häiriöt sekä suurimmat hyväksyttävät nollatasot.

—

Seulontaan voidaan käyttää GC-MS-menetelmiä ja biotestimenetelmiä. GC-MS-menetelmien osalta vaatimuksina on käytettävä 6 kohdassa esitettyjä vaatimuksia. Solupohjaisten biotestien erityisvaatimukset esitetään tämän liitteen 7.3 kohdassa ja testisarjapohjaisten biotestien erityisvaatimukset liitteen 7.4 kohdassa.

—

On ilmoitettava väärien positiivisten ja väärien negatiivisten tulosten määrä suuressa näytemäärässä enimmäismäärien tai toimintarajojen ala- ja yläpuolella varmistavalla analyysimenetelmällä määritettyyn TEQ-arvoon verrattuna. Todellisten väärien negatiivisten tulosten osuuden on oltava alle 1 prosentti. Väärien positiivisten tulosten määrän pitää olla niin pieni, että seulontavälineen käytöstä on hyötyä.

—

Positiiviset tulokset on aina vahvistettava varmistavalla analyysimenetelmällä (HRGC/HRMS). Lisäksi laajaa TEQ-vaihtelualuetta edustavat näytteet on vahvistettava HRGC/HRMS:llä (noin 2–10 % negatiivisista näytteistä). Tiedot biotestin ja HRGC/HRMS:n tulosten vastaavuudesta on ilmoitettava.

—

Biotestiä suoritettaessa on kussakin testauksessa käytettävä TCDD-viitepitoisuussarjaa tai dioksiinin, furaanin tai dioksiinin kaltaisten PCB-yhdisteiden seosta (täysimittainen annos-vastekuvaaja, jossa R2 > 0,95). Seulonnassa voidaan kuitenkin käyttää matalien pitoisuuksien näytteiden analysointiin laajennettua matalien pitoisuuksien kuvaajaa.

—

Biotestin tulosten valvomiseen vakiomittaisella ajanjaksolla on käytettävä laadunvalvontalomakkeessa TCDD-viitepitoisuutta (noin 3 kertaa määritysraja). Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää vertailunäytteen suhteellista vastetta verrattuna TCDD-kalibrointikäyrään, sillä solukohtainen vaste voi riippua useista eri tekijöistä.

—

Kullekin vertailumateriaalille on luotava laadunvalvontakortti, joka on tarkastettava. Näin varmistetaan, että tulokset vastaavat ohjeita.

—

Erityisesti kvantitatiivisissa laskelmissa on käytetyn näytelaimennuksen oltava vastekäyrän lineaarisella osuudella. Pitoisuudeltaan vastekäyrän lineaarisen osuuden ylittävät näytteet on laimennettava ja testattava uudelleen. Tämän vuoksi kerralla onkin testattava vähintään kolme laimennosta.

—

Prosentuaalinen keskihajonta saa olla enintään 15 prosenttia kunkin näytelaimennoksen kolminkertaisessa määrityksessä ja enintään 30 prosenttia kolmen erillisen kokeen välillä.

—

Toteamisrajan arvoksi voidaan asettaa kolme kertaa nollaliuoksen tai taustavasteen keskihajonnan arvo. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää tausta-arvoa suurempaa vastetta (5 kertaa nollaliuoksen vaste) laskettuna kyseisen päivän kalibrointikäyrältä. Määritysrajaksi voidaan asettaa 5–6 kertaa nollaliuoksen tai tausta-arvon keskihajonta, tai sitten voidaan käyttää selvästi tausta-arvoa suurempaa vastetta (10 kertaa nollaliuoksen vaste) laskettuna kyseisen päivän kalibrointikäyrältä.

—

On varmistettava, että testisarjapohjaiset biotestit ovat riittävän herkkiä ja luotettavia elintarvikkeiden testaukseen.

—

Valmistajan ohjeita näytteen valmistamiselle ja analyyseille on noudatettava.

—

Viimeisen käyttöpäivän ohittaneita testisarjoja ei pidä käyttää.

—

Muitten sarjojen yhteydessä käytettäviksi tarkoitettuja tarvikkeita tai komponentteja ei pidä käyttää.

—

Testisarjoja on säilytettävä annettujen säilytyslämpötilarajojen ja käytettävä annettujen käyttölämpötilarajojen puitteissa.

—

Toteamisraja on immunomäärityksissä 3 kertaa keskihajonta, joka on määritetty 10:llä nollanäytteen toistoanalyysillä ja jaetaan lineaarisen regressiokuvaajan kulmakertoimella.

—

Laboratoriotesteissä on käytettävä vertailustandardeja, jotta taataan, että vastaavuus standardiin nähden on hyväksyttävissä rajoissa.