31973L0046

CUARTA DIRECTIVA DE LA COMISIÓN

de 5 de diciembre de 1972

por la que se determinan métodos de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales

( 73/46/CEE )

LA COMISIÓN DE LAS COMUNIDADES EUROPEAS ,

Visto el Tratado constitutivo de la Comunidad Económica Europea ,

Vista la Directiva del Consejo , de 20 de julio de 1970 , relativa a la introducción de métodos de toma de muestras y de análisis comunitarios para el control oficial de los alimentos para animales (1) , modificada por la Directiva 72/275/CEE de 20 de julio de 1972 (2) , y , en particular , su artículo 2 ,

Considerando que la Directiva antes mencionada prevé que los controles oficiales de los alimentos para animales dirigidos a comprobar si se respetan las condiciones establecidas en virtud de las disposiciones legales , reglamentarias o administrativas referentes a la calidad y a la composición de los mencionados alimentos se efectúen según los métodos de toma de muestras y de análisis comunitarios ;

Considerando que las Directivas n º 71/250/CEE , n º 71/393/CEE y n º 72/199/CEE de la Comisión , de 15 de junio de 1971 (3) , 18 de noviembre de 1971 (4) y 27 de abril de 1972 (5) , respectivamente , han establecido ya determinados métodos de análisis comunitarios ; que , habida cuenta del grado de avance de los trabajos efectuados desde entonces , es conveniente establecer una cuarta serie de métodos ;

Considerando que las medidas previstas en la presente Directiva se ajustan al dictamen del Comité permanente de la alimentación animal ;

HA ADOPTADO LA PRESENTE DIRECTIVA :

Artículo 1

Los Estados miembros dispondrán que los análisis para los controles oficiales de los alimentos para animales , en lo que se refiere a los contenidos en humedad de las grasas y aceites animales y vegetales , así como a los contenidos en magnesio y en celulosa bruta de los alimentos , se efectuarán según los métodos descritos en el Anexo I de la presente Directiva .

Se aplicará a los métodos descritos en el Anexo I de la presente Directiva las disposiciones generales que figuran en la Parte 1 ( introducción ) del Anexo de la primera Directiva n º 71/250/CEE de la Comisión , de 15 de junio de 1971 .

Artículo 2

Los Estados miembros dispondrán que los análisis para los controles oficiales de los alimentos para animales , en lo que se refiere a sus contenidos en retinol ( vitamina A ) , vitamina ( aneurina , vitamina B1 ) , ácido ascórbico y deshidroascórbico ( vitamina C ) , se efectuarán según los métodos descritos en el Anexo II de la presente Directiva .

Se aplicará a los métodos descritos en el Anexo II de la presente Directiva las disposiciones generales que figuran en la Parte 1 ( Introducción ) del Anexo de la primera Directiva n º 71/250/CEE de la Comisión , de 15 de junio de 1971 , con excepción de la parte relativa a la preparación de la muestra para análisis .

Artículo 3

Los Estados miembros aplicarán a más tardar el 1 de enero de 1974 , las disposiciones legales , reglamentarias o administrativas necesarias para cumplir las disposiciones de la presente Directiva . Informarán de ello inmediatamente a la Comisión .

Artículo 4

Los destinatarios de la presente Directiva serán los Estados miembros ,

Hecho en Bruselas , el 5 de diciembre de 1972 .

Por la Comisión

El Presidente

S. L. MANSHOLT

(1) DO n º L 170 de 3 . 8 . 1970 , p. 2 .

(2) DO n º L 171 de 29 . 7 . 1972 , p. 39 .

(3) DO n º L 155 de 12 . 7 . 1971 , p. 13 .

(4) DO n º L 279 de 20 . 12 . 1971 , p. 7 .

(5) DO n º L 123 de 29 . 5 . 1972 , p. 6 .

ANEXO I

1 . DETERMINACIÓN DE LA HUMEDAD EN LAS GRASAS Y ACEITES ANIMALES Y VEGETALES

1 . Objetivo y campo de aplicación

El método permite determinar el contenido en humedad ( agua y otras materias volátiles ) de las grasas y aceites animales y vegetales .

2 . Principio

La muestra se somete a desecación a 103 ° C hasta que cese la disminución de la masa . La parte de masa se determina pro pesada .

3 . Equipo

3.1 . Recipiente de fondo plano , de material resistente a la corrosión , diámetro : 8 a 9 cm altura : 3 cm aproximadamente

3.2 . Termómetro de mercurio , de bulba reforzada , y cámara de dilatación en la extremidad superior , graduado de 80 ° C aproximadamente a 110 ° C al menos , longitud : 10 cm aproximadamente

3.3 . Baño de arena o placa calorífera eléctrica

3.4 . Desecador , conteniendo un deshidratante eficaz

3.5 . Balanza analítica

4 . Método operatorio

Pesar , con precisión de 1 mg , 20 g aproximadamente de la muestra homogeneizada en el recipiente ( 3.1 ) seco y tarado , conteniendo el termómetro ( 3.2 ) . Calentar sobre el baño de arena o la placa calorífera ( 3.3 ) , agitando constantemente con la ayuda de un termómetro , de forma que la temperatura alcance 90 ° C en 7 minutos aproximadamente .

Reducir la intensidad del calentamiento siguiendo la frecuencia con la que ascienden las burbujas desde el fondo del recipiente . La temperatura no debe exceder de 105 ° C . Continuar agitando , rozando el fondo del recipiente , hasta que cese la formación de burbujas .

Para garantizar la completa eliminación de la humedad , repetir varias veces el calentamiento a 103 ° C más o menos 2 ° C , refrigerando a 93 ° C entre los sucesivos calentamientos . Dejar refrigerar a continuación en el desecador ( 3.4 ) hasta la temperatura ambiente y pesar . Repetir esta operación hasta que la pérdida de masa entre dos pesadas sucesivas no exceda en más de 2 mg .

N.B. Un aumento de la masa de la muestra después de un calentamiento repetido indica una oxidación de la grasa . En este caso , calcular el resultado a partir de la pesada efectuada inmediatamente antes del comienzo del aumento de masa .

5 . Cálculo de los resultados

El contenido en porcentaje de la muestra viene dado por la fórmula :

( M1 - M2 ) · 100/M0

en la que :

M0 = masa , en gramos , de la toma de muestra ,

M1 = masa , en gramos , del recipiente con su contenido , antes de calentamiento ,

M2 = masa , en gramos , del recipiente con su contenido , después del calentamiento .

Los resultados inferiores a 0,05 % deben referirse por la mención « menos del 0,05 % » .

Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre una misma muestra no debe exceder del 0,05 % en valor absoluto .

2 . DETERMINACIÓN DEL MAGNESIO

- por espectrofotometría de absorción atómica -

1 . Objetivo y ámbito de aplicación

El método permite determinar el magnesio en la alimentación animal . Está especialmente indicado para determinar los contenidos en magnesio inferiores al 5 % .

2 . Principio

La muestra se incinera y se pone en solución en el ácido clorhídrico diluido . Si no contiene sustancias orgánicas , se pone directamente en solución en el ácido clorhídrico . La solución es diluida y el contenido en magnesio se determina por espectrofotometría de absorción atómica a 285,2 nm , por comparación con las soluciones de calibrado .

3 . Reactivos

3.1 . Acido clorhídrico p.a. , d : 1,16

3.2 . Acido clorhídrico p.a. , d : 1,19

3.3 . Magnesio , en cinta o hilo , o sulfato de magnesio MgSO4 . 7H2 O p.a. secado en vacío a la temperatura ambiente .

3.4 . Solución de sal de estroncio ( cloruro o nitrato ) al 2,5 por ciento ( p/v ) de estroncio ( = 76,08 g de SrCl2 . 6 H2O p.a./1 o 60,38 g de Sr (NO3)2 p. a./1 )

3.5 . Solución de calibrado de magnesio : pesar , con precisión de 1 mg , 1 g de magnesio ( 3.3 ) , separando previamente y con cuidado de su película de óxido , o una cantidad correspondiente de sulfato de magnesio ( 3.3 ) , introducirlo en un matriz aforado de 1 000 ml , añadir 80 ml de ácido clorhídrico ( 3.1 ) , dejar disolver y completar a 1 000 ml con agua , 1 ml de dicha solución contiene 1 000 mg de magnesio

4 . Equipo

4.1 . Crusoles de incineración de platino , cuarzo o porcelana

4.2 . Horno de barro eléctrico , con termostato

4.3 . Espectrofotómetro de absorción atómica

5 . Método operatorio

5.1 . Puesta en solución

5.1.1 . Alimentos constituidos exclusivamente por sustancias minerales

Pesar con precisión de 1 mg , 5 g de la muestra e introducirlos en un matraz aforado de 500 ml con 250 a 300 ml de agua . Añadir 40 ml de ácido clorhídrico ( 3.1 ) , llevar a ebullición y mantener el líquido en ebullición lenta durante 30 minutos . Dejar refrigerar , completar el volumen mediante agua , homogeneizar y filtrar en un vaso seco a través de un filtro de pliegue seco . Rechazar los 30 primeros ml del filtrado .

En presencia de silicio , tratar 5 g de la muestra mediante una cantidad suficiente ( 15 a 30 ml ) de ácido clorhídrico ( 3.2 ) y evaporar en seco sobre un baño de agua . Continuar tal como se indica en 5.1.2 , a partir de la tercera frase .

5.1.2 . Alimentos constituidos esencialmente por sustancias minerales

Pesar , con precisión de 1 mg , 5 mg de la muestra en un crisol de incineración e incinerar a 550 ° C en el horno de barro hasta la obtención de cenizas exentas de partículas carbónicas . Para eliminar el silicio , añadir a las cenizas una cantidad suficiente ( 15 a 30 ml ) de ácido clorhídrico ( 3.2 ) y evaporar en seco sobre un baño de agua . Secar a continuación durante una hora en la estufa a 105 ° C . Volver a tomar el residuo mediante 10 ml de ácido clorhídrico ( 3.1 ) y transferir con la ayuda de agua caliente a un matraz aforado de 500 ml . Llevar a ebullición , dejar refrigerar y completar el volumen mediante agua . Homogeneizar y filtrar en un vaso seco a través de un filtro de pliegues seco . Rechazar los 30 primeros ml del filtrado .

5.1.3 . Alimentos formados esencialmente por sustancias orgánicas

Pesar , con precisión de 1 mg , 5 g de la muestra en un crisol de incineración e incinerar en un horno de barro , hasta la obtención de cenizas exentas de partículas carbonosas . Recoger las cenizas mediante 5 ml de ácido clorhídrico ( 3.2 ) , evaporar en seco sobre un baño de agua y secar a continuación durante una hora en la estufa a 105 ° C , para insolubilizar el silicio . Recoger el residuo mediante 5 ml de ácido clorhídrico ( 3.1 ) , transvasar con ayuda de agua caliente en un matraz aforado de 250 ml , llevar a ebullición , dejar refrigerar y completar el volumen mediante agua . Homogeneizar y filtar en un vaso seco a través de un filtro de pliegues seco . Rechazar los 30 primeros milímetros del filtrado .

5.2 . Medición de la absorción atómica

Preparar , diluyendo la solución de calibrado ( 3.5 ) mediante agua , al menos 5 soluciones de referencia de concentraciones crecientes , escogidas en función de la zona de medida óptima del espectrofotómetro . Añadir a cada solución 10 ml de solución de sal de estroncio ( 3.4 ) y completar a continuación al volumen de 100 ml mediante agua .

Diluir mediante agua una parte alícuota del filtrado obtenido en 5.1.1 , 5.1.2 o 5.1.3 de forma que se obtenga una concentración en magnesio comprendida en los límites de concentración de las soluciones de referencia . La concentración en ácido clorhídrico de dicha solución no debe exceder de 0,4 N . Añadir 10 ml de solución de sal de estroncio ( 3.4 ) y completar a continuación al volumen a 100 ml mediante agua .

Medir la absorción de la solución que haya de determinarse y de las soluciones de referencia mediante la longitud de onda de 285,2 nm .

6 . Cálculos de los resultados

Calcular la cantidad de magnesio de la muestra a partir de las soluciones de referencia . Expresar el resultado en porcentaje de la muestra .

Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder del 5 por ciento en valor relativo .

3 . DETERMINACIÓN DE LA CELULOSA BRUTA

1 . Objetivo y campo de aplicación

El método permite determinar , en la alimentación animal , las materias orgánicas exentas de grasas e insolubles en medio ácido y en medio alcalino , convencionalmente designadas bajo el nombre de celulosa bruta .

2 . Principio

La muestra , en su caso desgrasada se trata sucesivamente mediante soluciones en ebullición de ácido sulfúrico y de hidróxido de potasio de concentraciones determinadas . El residuo se separa pro filtración sobre amianto , se lava , se seca , se pesa y se calcina a 900 ° C . La pérdida de peso resultante de la calcinación corresponde a la celulosa bruta de la toma de muestras .

3 . Reactivos

3.1 . Acido sulfúrico 0,26 N

3.2 . Amianto tratado : añadir a un amianto para crisol de Gooch alrededor de cinco veces su peso de ácido clorhídrico diluido ( 1 vol. de ácido clorhídrico , de d : 1,19 + 3 vol. de agua ) . Hacer hervir la mezcla durante 45 minutos aproximadamente , dejar refrigerar , filtrar sobre embudo Buechner . Lavar el residuo primero con agua , hasta la desaparición de ácido clorhídrico en las aguas de lavado , y a continuación a la acetona ( 3.6 ) . Secar el amianto en la estufa y calcinarla después durante 2 h a 900 ° C . Dejar refrigerar y conservar en un frasco tapado . El amianto tratado de esta forma puede ser utilizado varias veces . Debe responder a las disposiciones dadas en 5.1 a propósito de la prueba en blanco .

3.3 . Emulsión de antiespuma ( silicona , por ej. )

3.4 . Solución de hidróxido de potasio 0,23 N

3.5 . Acido clorhídrico 0,5 N

3.6 . Acetona , pura

3.7 . Eter dietílico , puro

4 . Equipo

4.1 . Vasos de 600 ml al menos , marcados con puntos de referencia al nivel de 200 ml

4.2 . Discos de porcelana , diámetro : 80 mm aproximadamente , espesador : 4 mm aproximadamente , perforados por 32 agujeros de 4 mm aproximadamente de diámetro

4.3 . Matraces de vacío de 2 l aproximadamente , de tapón de caucho , marcados con puntos de referencia al nivel de los 800 ml y provistos de un embudo de cristal de 120 mm de diámetro

4.4 . Placas filtrantes , diámetro 40 mm aproximadamente , espesor : 4 mm aproximadamente , con el borde oblícuo adaptado al cono del embudo ( 4.3 ) perforados por alrededor de 16 agujeros de 4 mm aproximadamente de diámetro y recubiertos por una red metálica de mallas de 1 mm aproximadamente de lado . Las placas y rejas metálicas deben ser inalterables a los ácidos y a los alcalinos

4.5 . Crisoles de incineración de platino o de cuarzo

4.6 . Horno de barro eléctrico , con termostato

4.7 . Desecador

4.8 . Filtro de amianto : poner en suspensión 2 g de amianto ( 3.2 ) en 100 ml de agua . Filtra en vacío sobre una placa filtrante recubierta de una reja metálica ( 4.4 ) y situada en el embudo de un matraz de vacío ( 4.3 ) . Recoger el filtrado y filtrar de nuevo sobre el mismo filtro . Eliminar el filtrado

5 . Método operatorio

Pesar 3 g de la muestra , con precisión de 1 mg , y 2 g de amianto tratado ( 3.2 ) en un vaso ( 4.1 ) , añadir 200 ml de ácido sulfúrico ( 3.1 ) y algunas gotas de emulsión de anatiespuma ( 3.3 ) . Llevar rápidamente a ebullición y dejar hervir durante 30 minutos exactamente . Para mantener el volumen constante , cubrir el vaso con un dispositivo refrigerador , tal como un matraz de fondo redondo de 500 ml sometido a una circulación de aire frío . Interrumpir la ebullición añadiendo 50 ml aproximadamente de agua fría y filtrar inmediatamente en vacío sobre un filtro de amianto previamente preparado como se indica en 4.8 .

Lavar el residuo mediante 5 porciones de 100 ml aproximadamente de agua muy caliente para obtener un volumen final de filtrado de 800 ml . Transferir cuantitativamente el residuo en un vaso ( 4.1 ) previamente provisto de un disco de porcelana ( 4.2 ) para regularizar la ebullición . Añadir 200 ml de solución de hidróxido de potasio ( 3.4 ) . Llevar rápidamente a ebullición y dejar hervir durante 30 minutos exactamente . Añadir 50 ml aproximadamente de agua fría y filtrar inmediatamente en vacío sobre un nuevo filtro de amianto previamente preparado como se indica en 4.8 . Lavar el residuo con ayuda de agua muy caliente hasta neutralidad de las aguas de lavado ( prueba con papel de tornasol ) , después en tres ocasiones mediante la acetona ( 3.6 ) ( en total 100 ml aproximadamente de acetona ) .

Transferir cuantitativamente el residuo a un crisol de incineración ( 4.5 ) , dilacerarlo , si fuera necesario , y secar en la estufa a 130 ° C hasta peso constante .

Dejar refrigerar en desecador y pesar rápidamente . Introducir a continuación el crisol en el horno de barro ( 4.6 ) y dejar calcinar durante 30 minutos a 900 ° C . Dejar refrigerar en desecador y pesar rápidamente .

Efectuar una prueba en blanco aplicando el mismo método operatorio al amianto tratado ( 3.2 ) , en ausencia de la muestra . La pérdida de peso resultante de la calcinación de los 6 g de amianto no debe ser superior a 10 mg .

6 . Cálculo de los resultados

El contenido en celulosa bruta en porcentaje de la muestra lo da la fórmula :

( ( a - b ) · 100/3 )

en la que :

a = pérdida de peso en la calcinación , cuando la determinación ,

b = pérdida de peso en la calcinación , cuando la prueba en blanco .

Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos terminaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder de :

0,3 en valor absoluto , para los contenidos en celulosa bruta inferiores al 10 % ;

3 % , en valor relativo , para los contenidos en celulosa bruto iguales o superiores al 10 % .

7 . Observaciones

7.1 . Los alimentos que contengan más del 10 % de materias grasas deben ser desgrasados previamente la análisis mediante éter dietílico . Con tal fin , situar la toma de muestras ( 3 g pesados con precisión de 1 mg ) sobre un filtro de amianto ( 4.8 ) . Cubrir 3 veces con aproximadamente 50 ml de éter dietílico ( 3.7 ) y filtrar cada vez en vacío con precaución . Transvasar cuantitativamente la toma de muestras desgrasada y el amianto a un vaso ( 4.1 ) y continuar el análisis como se indica en 5 .

7.2 . Los alimentos que contengan materias grasas no directamente extraibles deben ser desgrasados , como se indica en 7.1 , y sometidos , además , a un nuevo desgrasado tras el lavado del residuo del ataque ácido .

Con tal fin , lavar el residuo de dicho ataque tres veces con acetona ( 3.6 ) ( en total 100 ml , luego 3 veces 50 ml de éter dietílico ( 3.7 ) . Transvasar a continuación cuantitativamente el residuo a un vaso ( 4.1 ) y continuar el análisis como se indica en el 5 º apartado segundo ( tratamiento por la solución de hidróxido de potasio ) .

7.3 . En el caso de alimentos ricos en calcio ( más de 2 % de calcio ) , colocar la toma muestra ( 3 g pesados con precisión de 1 mg ) en un vaso ( 4.1 ) con 100 ml de ácido clorhídrico 0,5 N ( 3.5 ) y dejar reposar en frío durante 5 minutos . Filtrar inmediatamente y lavar con agua fría . Utilizar como adyuvante de filtración los 2 g de amianto previstos para la ebullición con el ácido sulfúrico . Si la filtración se mostrara como difícil , diluir la suspensión con acetona . Proceder seguidamente como se indica en 5 .

ANEXO II

1 . DETERMINACIÓN DEL RETINOL ( VITAMINA A )

1 . Objetivo y campo de aplicación

El método permite determinar el retinol ( vitamina A ) en los alimentos , los concentrados y los premezclas . El límite inferior de la determinación es de 10 000 UI/kg para los alimentos altamente pigmentados y de 4 000 UI/kg para el resto de los productos (1) . Los productos se clasificarán aquí en dos grupos , según su contenido supuesto en retinol :

Grupo A : contenido inferiores a 200 000 UI/kg ,

Grupo B : contenidos iguales o superiores a 200 000 UI/kg .

2 . Principio

La muestra se hidroliza en caliente mediante una solución de hidróxido de potasio en medio etanólico y en presencia de un antioxidante o en atmósfera de nitrógeno . La mezcla se somete a la extracción por 1,2-dicloretano . El extracto se evapora en seco y se recoge por el éter de petróleo . La solución se cromatografía sobre columna de óxido de aluminio ( para los productos del grupo B , la cromatografía sólo se requiere en determinados casos ) . El retinol se determina mediante espectrofotometría a 610 nm tras el desarrollo de un complejo coloreado según la reacción de Carr-Price , en el caso de los productos del grupo A ; por espectrofotometría en l'UV a 325 nm en el caso de los productos del grupo B .

3 . Reactivos

a ) empleados para el análisis de los productos de los grupos A y B

3.1 . Etanol al 96 % ( v/v )

3.2 . Solución al 10 % ( p/v ) de ascorbato de sodio p.a. , o

3.3 . Azote , purificado

3.4 . Solución al 50 % ( p/v ) de hidróxido de potasio p.a.

3.5 . Solución de hidróxido de potasio 1 N

3.6 . Solución de hidróxido de potasio 0,5 N

3.7 . 1,2-dicloretano p.a.

3.8 . Eter de petróleo , puro , ebullición 30-50 ° C . Si fuera necesario , purificar como se indica . Agitar 1 000 ml de éter de petróleo con porciones de 20 ml ácido sulfúrico concentrado hasta que el ácido se mantenga incoloro . Eliminar el ácido y lavar el éter sucesivamente con 500 ml de agua , dos veces con 250 ml de una solución al 10 % de hidróxido de sodio y tres veces 500 ml de agua . Eliminar la capa acuosa , secar el éter durante 1 hora sobre carbón activo y sulfato de sodio de aluminio , filtrar y destilar .

3.9 . Oxido de aluminio , estandarizado según Brockmann : calcinar durante 8 h a 750 ° C , refrigerar en desecador y conservar en frasco de cristal marrón , de tapón esmerilado . Antes del empleo en cromatografía , humedecer como se indica : introducir en un frasco de cristal marrón 10 g de óxido de aluminio y 0,7 ml de agua , tapar herméticamente , volver a calentar durante 5 minutos en un baño de agua hirviendo siempre con energía . Dejar refrigerar agitándolo . Comprobar la actividad del óxido de aluminio así preparado sometiendo al análisis según 5.3 y 5.4 una cantidad conocida de retinol de calibrado patrón muestra ( 3.17 )

3.10 . Oxido de aluminio básico , grado de actividad I

3.11 . Eter dietílico , puro . Eliminar los peróxidos y los restos de agua mediante cromatografía sobre columna de óxido de aluminio básico ( 3.10 ) ( 25 g de óxido de aluminio para 250 ml de éter dietílico )

3.12 . Soluciones de éter de petróleo ( 3.8 ) al 4 , 8 , 12 , 16 y 20 % ( v/v ) de éter dietílico ( 3.11 )

3.13 . Solución de sulfuro de sodio 0,5 moles en la glicerina al 70 % ( v/v ) preparada a partir del sulfuro de sodio p.a.

b ) utilizados exclusivamente para el análisis de los productos del grupo A

3.14 . Benceno p.a. , cristalizable

3.15 . Cloroformo p.a. Eliminar el etanol , el fosgeno y los restos de agua mediante cromatografía sobre columna de óxido de aluminio básico ( 3.10 ) ( 50 g de óxido de aluminio para 200 ml de cloroformo ) conviene cromatografiar una segunda vez los 50 primeros ml del eluido )

3.16 . Reactivo según Carr-Price . Agitar 25 g aproximadamente de tricloruro de antimonio p.a. ( conservado en desecador ) con 100 ml de cloroformo ( 3.15 ) hasta la saturación de la solución . Un paso débil de tricloruro no estorba . Añadir 2 ml de anhídrido acético p.a. Conservar en el frigorífico en un frasco de cristal marrón con tapón esmerilado . Período de conservación : varias semanas

3.17 . Retinol de muestra patrón , controlado por espectrofotometría

c ) utilizados exclusivamente para el análisis de los productos del grupo B

3.18 . Isopropanol , para cromatografía

4 . Equipo

4.1 . Baño de agua

4.2 . Aparato rotativo de evaporación en vacío , con matraces redondos de diferentes capacidades

4.3 . Tubos para cromatografía , de cristal ( longitud : 300 mm , diámetro interior : 13 mm aproximadamente )

4.4 . Espectrofotómetro con cubetas de 10 mm de espesor ( de cuarzo para mediciones en l'UV )

4.5 . Lámpara UV , 365 nm

5 . Método operatorio

N.B. Las manipulaciones no deben hacerse bajo la luz directa , si fuera necesario en un aparato de cristal marrón

5.1 . Toma de muestras

Efectuar una toma de muestras de la muestra finamente dividida , proporcional al contenido supuesto en vitamina A , o sea :

0,1 a 1,0 g para las concentraciones ( contenidos superiores a 20 000 UI/kg ) ,

3,0 a 5,0 g para las premezclas ( contenidos comprendidos entre 400 y 20 000 UI/g ,

10 a 20 sg para las mezclas minerales ,

30 g para los productos del grupo A .

Introducir inmediatamente la toma de muestras en un matraz de 500 ml de tapón esmerilado .

5.2 . Hidrólisis y extracción (2)

Añadir sucesivamente a la toma de muestras 40 ml de etanol ( 3.1 . ) , 2 ml de solución de ascorbato de sodio ( 3.2 ) (3) , 10 ml de solución de hidróxido de potasio ( 3.4 . ) y 2 ml de solución de sulfuro de sodio ( 3.13 ) .

Calentar durante 30 minutos a 70-80 ° C bajo refrigerante de reflujo y dejar refrigerar a continuación bajo corriente de agua . Añadir 50 ml de etanol ( 3.1 ) y 100 ml ( tomados con la pipeta ) de 1,2-dicloretano ( 3.7 ) . Agitar enérgicamente y de cantar el líquido sobrenadante en una ampolla de decantación . Añadir en la ampolla 150 ml de solución de hidróxido de potasio ( 3.5 ) , agitar durante 10 segundos y dejar reposar hasta la separación de las fases . Recoger la fase de dicloretánica ( fase inferior ) en una ampolla de decantación , añadir 40 ml de solución de hidróxido de potasio ( 3.6 ) , agitar durante 10 segundos y dejar reposar hasta la separación de las fases . Recoger la fase dicloretánica en una ampolla de decantación y lavar 6 a 8 veces con ayuda de porciones de 40 ml de agua , hasta la ausencia de álcali ( prueba de fenoltaleina ) . Recoger la fase dicloretánica y eliminar los últimos restos de agua con ayuda de bandas de papel filtro .

Evaporar en seco una parte alícuota de la solución , en vacío y sobre baño de agua a la temperatura de 40 ° C . Recoger rápidamente el residuo con 5 ml de éter de petróleo ( 3.8 ) .

Para los productos del grupo A , cromatografiar como se indica en 5.3.1 .

Para los productos del grupo B , transvesar la solución a un matraz aforado de 50 ml , completar al volumen con éter de petróleo ( 3.8 ) homogeneizar y medir la densidad óptica como se indica en 5.4.2 .

5.3 . Cromatografía

5.3.1 . Productos del grupo A

Llenar un tubo para cromatografía ( 4.3 . ) , hasta una , altura de 200 mm , de óxido de aluminio ( 3.9 ) previamente impregnado de éter de petróleo ( 3.8 ) . Introducir en el tubo la solución en 5.2 y añadir inmediatamente 20 ml de éter de petróleo ( 3.8 ) . Eluir sucesivamente por porciones de 10 ml de las soluciones de éter de petróleo al 4 , 8 , 12 , 16 y 20 por ciento de éter dietílico ( 3.12 ) , en vacio parcial o bajo presión , la velocidad de salida habrá de ser de 2 a 3 gotas por segundo .

El caroteno se eluirá en primer lugar (4) . El retinol se eluye generalmente por la solución de éter de petróleo al 20 por ciento de éter dietílico ( 3.12 ) . La elusión se controla bajo luz UV ( breve irradiación de la columna por una lámpara de mercurio ) . La banda fluorescente del retinol se separa netamente de las bandas amarillas de xantófila que la siguen . Recoger la fracción del eluido que contiene el retinol en un erlenmeyer .

5.3.2 . Productos del grupo B

La cromatografía sólo debe efectuarse cuando las mediciones de la densidad óptica obtenidas en 5.4.2 no sean conformes con las disposiciones indicadas en 5.4.2 .

Si se hiciese patente la cromatografía , introducir en la columna cromatográfica una parte alícuota de la solución en el éter de petróleo obtenido en 5.2 , con un contenido de aproximadamente 500 UI de retinol , y cromatografiar como se indica en 5.3.1 .

5.4 . Medición de la densidad óptica

5.4.1 . Productos del grupo A

Evaporar en seco , en vacío , el eluado que contiene el retinol , obtenido en 5.3.1 . Recoger el residuo con 2 ml de benceno ( 3.14 ) . Tomar 0,3 ml de dicha solución y añadir 3 ml del reactivo según Carr-Price ( 3.16 ) . Se desarrolla una coloración azul . Medir la densidad óptica mediante el espectrómetro a 610 nm , 30 segundos exactamente después del principio de reacción . Determinar el contenido en retinol , refiriéndose a una curva de calibrado obtenida a partir de soluciones bencénicas de concentraciones crecientes en retinol de patrón tratados con el reactivo según Carr-Price [ de 2 a 16 UI de vitamina A de patrón ( 3.17 ) con 0,3 ml de benceno ( 3.14 ) + 3 ml de reactivo según Carr-Price ( 3.16 ) ] . La curva de calibrado debe controlarse regularmente y durante breves intervalos de tiempo con la ayuda de la muestra y de una solución recién preparada del reactivo según Carr-Price .

5.4.2 . Productos del grupo B

Tomar la parte alícuota de la solución en el éter de petróleo obtenido en 5.2 , con un contenido aproximado de 200 UI de retinol . Evaporar en seco , en vacío , y recoger el residuo con 25 ml de isopropanol ( 3.18 ) . Medir la densidad óptica con el espectrofotómetro a 325 , 310 y 334 nm . El máximo de absorción se sitúa a 325 nm . El contenido en retino A de la solución se calcula tal como sigue :

E325 . 18,30 = UI de retinol

Sin embargo , las relaciones de las densidades ópticas

E310 : E325 y E334 : E325

deben ser de 6 : 7 = 0,857 .

Cuando una de dichas relaciones se separe sensiblemente de dicho valor ( < 0,830 u > 0,880 ) , la medición de las densidades ópticas debe precederse por una cromatografía , según el procedimiento indicado en 5.3.2 . Si la medición de las densidades ópticas efectuada tras la cromatografía indica que las relaciones antes mencionadas se separan todavía de forma sensible del valor 0,857 ( < 0,830 ó > 0,880 ) , la determinación debe efectuarse según el procedimiento indicado para los productos del grupo A .

6 . Cálculo de los resultados

Calcular el contenido en retinol de la muestra teniendo en cuenta el peso de la toma muestras y de las diluciones efectuadas a lo largo del análisis . Expresar el resultado en UI de retinol por kg .

Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder :

- del 20 % , en valor relativo , para los contenidos en retinol inferiores a 75 000 UI/kg ,

- de 15 000 UI para los contenidos comprendidos entre 75 000 y 150 000 UI/kg ,

- del 10 % , en valor relativo , para los contenidos comprendidos entre 150 000 y 250 000 UI/kg ,

- de 25 000 UI para los contenidos comprendidos entre 250 000 y 500 000 UI/kg ,

- del 5 % , en valor relativo , para los contenidos superiores a 500 000 UI/kg .

2 . DETERMINACIÓN DE LA TIAMINA ( ANEURINA , VITAMINA B1 )

1 . Objetivo y campo de aplicación

El método permite determinar la tiamina ( aneurina , vitamina B1 ) en los alimentos , los concentrados y las premezclas . El límite interior de la determinación es de 5 ppm .

2 . Principio

La muestra se trata en caliente con ácido sulfúrico diluido e hidrolizado a continuación por vía enzimática . La solución obtenida se somete a una oxidación alcalina . El tiocromo formado se extrae por el isobutanol y se determina por fluorimetría .

3 . Reactivos

3.1 . Solución de patrón de tiamina a 100 mg/ml : disolver 112,3 mg de clorhidrato de tiacina muy puro , previamente desecado en vacío hasta llegar a peso constante , en 1 000 ml de ácido sulfúrico 0,2 N ( 3.2 ) . En frío y en la oscuridad , dicha solución se mantiene estable durante un mes .

3.2 . Acido sulfúrico 0,2 N

3.3 . Metabisulfito de sodio , Na2S2O3 , puro

3.4 . Solución al 20 % ( p/v ) de ferricianuro de potasio p.a.

3.5 . Solución al 25 por ciento ( p/v ) de hidróxido de potasio p.a.

3.6 . Mezcla oxidante : mezclar 2 ml de solución de ferricianuro de potasio ( 3.4 ) con 48 ml de solución de hidróxido de potasio ( 3.5 ) . Dicha mezcla no se conserva más de 4 horas

3.7 . Isobutanol , p.a.

3.8 . Solución de acetato de sodio 2,5 N

3.9 . Preparación multienzimática con contenido en proteasa , fosfatasa y amilasa ( por ejemplo clorasa )

3.10 . Etanol de 96 % ( v/v )

4 . Equipo

4.1 . Baño de agua

4.2 . Centrifugadora ( 3 500 t/m ) con tubos de 30 a 50 ml , provistos de tapones esmerilados

4.3 . Fluorímetro

5 . Método operatorio

5.1 . Hidrólisis enzimática

Introducir en dos matraces aforados A y B de 250 ml unas cantidades idénticas de la muestra finamente dividida , con un contenido de 100 mg aproximadamente de tiamina y 125 ml de ácido sulfúrico ( 3.2 ) . Añadir además , en el matraz A solamente , 1,0 ml de solución de muestra ( 3.1 ) ( muestra interna ) .

Agitar vigorosamente , llevar a los matraces sobre un baño de agua hirviendo y mantenerlos allí durante 15 minutos agitándolo de vez en cuando . Dejar refrigerar hasta 45 ° C aproximadamente . Añadir en cada matraz 20 ml de solución de acetato de sodio ( 3.8 ) y 0,5 g de preparación multienzimática ( 3.9 ) , dejar reposar a continuación durante 20 minutos a la temperatura ambiente . Añadir 20 ml de solución de acetato de sodio ( 3.8 ) , completar al volumen de agua , homogeneizar y filtrar . Recoger los filtrados A y B tras haber eliminado de ellos los 15 primeros ml . Preparar las soluciones siguientes .

5.1.1 . Solución testigo T

Introducir en un tubo de centrifugar ( 4.2 ) , 5 ml de filtrado A y 10 mg aproximadamente de metabisulfito de sodio ( 3.3 ) . Sumergir el tubo durante 15 minutos en un baño de agua hirviendo y dejar a continuación refrigerar hasta la temperatura ambiente .

5.1.2 . Soluciones A ( patrón interno ) y B ( muestra )

Introducir 5 ml del filtrado A en un tubo de centrifugar ( 4.2 ) y 5 ml de filtrado B en otro tubo de centrifugar ( 4.2 ) .

5.2 . Oxidación

Añadir a las soluciones T , A y B 5 ml de la mezcla oxidante ( 3.6 ) y , tras un minuto , 10 ml de isobutanol ( 3.7 ) . Tapar los tubos y agitar vigorosamente durante 5 segundos . Dejar reposar durante un minuto y centrifugar para separar las fases . Tomar en cada tubo 5 ml de la fase isobutanólica sobrenadante , introducirlos respectivamente en matraces aforados de 25 ml , completar al volumen con etanol ( 3.10 ) y homogeneizar ( = extractos T , A y B ) .

5.3 . Medición de la fluorescencia

Efectuar las mediciones a la longitud de onda para lo cual da el fluorímetro una respuesta óptima a la fluorescencia del tiocromo . Irradiar a 365 nm aproximadamente .

Ajustar el instrumento a cero con ayuda del extracto T . Medir la intensidad de la fluorescencia de los extractos A y B .

6 . Cálculo de los resultados

El contenido en mg de tiamina por kg de muestra viene dado por la fórmula :

( d · b ) / ( a - b ) c

en la cual :

a = intensidad de la fluorescencia del extracto A ( patrón interno )

b = intensidad de la fluorescencia del extracto B ( muestra )

c = peso de la toma de muestrasen g

d = cantidad de tiamina en mg añadida a la toma de muestras ( patrón interno ) .

Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder :

del 10 % en valor relativo , para los contenidos inferiores a 500 ppm y

5 % en valor relativo , para los contenidos iguales o superiores a 500 ppm .

3 . DETERMINACIÓN DEL ÁCIDO ASCÓRBICO Y DEL ÁCIDO DESHIDROASCÓRBICO ( VITAMINA C )

1 . Objetivo y campo de aplicación

El método permite determinar la suma de los ácidos ascórbicos y deshidroascórbico ( vitamina C ) en los alimentos , los concentrados y las premezclas . El límite inferior de la determinación es de 5 ppm . Los productos se clasificarán aquí en dos grupos , según su supuesto contenido en vitamina C :

Grupo A : contenidos inferiores a 10 g/kg

Grupo B : contenidos iguales o superiores a 10 g/kg .

2 . Principio

La muestra , puesta en suspensión en una solución diluida de ácido metafosfórico , se somete a la extracción mediante cloroformo . La fase acuosa se trata mediante una solución de 2,6-diclorofenol-indofenol , para transformar el ácido ascórbico en ácido deshidroascórbico , y a continuación mediante una solución de 2,4-dinitrofenilhidracina . La hidrazona formada se extrae mediante una mezcla de acetato de etilo , de ácido acético glacial o de acetona . La solución se cromatografía sobre una columna de gel de silicio , el eludido se evapora en seco y el residuo se disuelve en el ácido sulfúrico diluido . La densidad óptica de la solución se mide mediante el fotómetro de 509 nm .

Para productos del grupo A , el eluido , salido de la cromatografía sobre columna , está sometido , además , a una cromatografía sobre capa delgada para aislar la hidrazona .

3 . Reactivos

3.1 . Solución patrón al 0,05 por ciento de ácido L-ascórbico : disolver 50 mg de ácido L-ascórbico p.a. en 20 ml aproximadamente de solución de ácido metafosfórico ( 3.2 ) y completar a 100 ml con agua . Preparar inmediatamente antes de su empleo

3.2 . Solución al 10 % ( p/v ) de ácido metafosfórico : disolver en el agua 200 g de ácido metafosfórico p.a. , triturados en un mortero y completar a 2 000 ml con agua . Conservar a 4 ° C . Renovar después de una semana

3.3 . Cloroformo p.a.

3.4 . Solución al 0,5 % ( p/v ) de 2,6-diclorofenol-indofenol p.a. Preparar inmediatamente antes de su empleo

3.5 . Auxiliar de filtración ( S. y S. n º 121 o equivalente )

3.6 . Solución ácida al 2 % ( p/v ) de 2,4-dinitrofenilhidracina : disolver 2 g de 2,4-dinitrofenilhidracina en 100 ml de ácido sulfúrico diluido ( 25 ml de ácido sulfúrico p.a. , d : 1,84 , diluidos en 100 ml por el agua ) . En frío , dicha solución se conserva durante una semana

3.7 . Nitrógeno , o

3.8 . Anhídrido carbónico

3.9 . Mezcla de acetato de etilo p.a./ácido acético glacial/acetona p.a. : 96/2/2 en vol

3.10 . Mezcla de diclorometano p.a./ácido acético glacial : 97/3 en vol

3.11 . Gel de silicio , granulometría : 0,05 a 0,2 mm

3.12 . Gel de silicio H , según Stahl , para cromatografía en capa delgada

3.13 . Acido sulfúrico diluido : introducir 105 ml de agua en un matraz aforado de 200 ml , completar al volumen mediante ácido sulfúrico p.a. , d : 1,84

3.14 . Disolvente de elución para cromatografía en capa delgada : mezclar 75 ml de éter dietílico p.a. , 25 ml de acetato de etilo pa y 4,0 ml de ácido acético al 96 % ( p/v ) p.a . Renovar después de 2 o 3 cromatografías

4 . Equipo

4.1 . Baño de agua regulado a 20 ° C por el ultratermostato

4.2 . Centrifugadora ( 3 500 t/m ) con tubos de 40 a 50 ml , provistos de tapones esmerilados .

4.3 . Aparato rotativo , de evaporación en vacío , con matraces de 250 ml

4.4 . Tubos para cromatografía , de cristal ( magnitud : 100 mm , diámetro interior : 20 mm ) , con placa de vidrio poroso ( por ejemplo tubos de Allihn )

4.5 . Espectrofotometría o calorímetro de filtros , con cubetas de 10 mm de espesor

4.6 . Equipo para cromatografía en capa fina , con placas de gel de silicio ( 3.12 ) , espesor de capa : 0,5 a 0,6 mm ( conviene emplear placas preparadas para su utilización ) . Secar las placas durante 2,30 h a 3 h en la estufa a 120-130 ° C . Dejar refrigerar y conservar a continuación en desecador durante una hora al menos antes del empleo

4.7 . Estufa , regulada a 120-130 ° C .

5 . Método operatorio

5.1 . Extracción

Introducir en dos matraces aforados , A y B , de 250 ml de tapón esmerilado , unas cantidades idénticas de la muestra dividida finamente , con un contenido de 200 mg aproximadamente de vitamina C . Añadir , en el matraz A sólo , 0,4 ml de solución patrón ( 3.1 ) y homogeneizar sacudiendo ligeramente ( patrón interno ) .

Añadir en cada matraz 30 ml de cloroformo ( 3.3 ) y 25 ml de solución de ácido metafosfórico ( 3.2 ) a 40 ° C . Agitar brevemente y dejar reposar a continuación durante 10 o 15 minutos . Añadir 25 ml de agua , tapar los matraces , agitar vigorosamente durante 10 segundos y dejar reposar 10 a 15 minutos en el baño de agua ( 4.1 ) . Centrifugar para separar la fase acuosa de la fase clorofórmica . Proseguir las operaciones simultáneamente sobre los extractos acuosos A ( patrón interno ) y B , como se indica a continuación .

5.2 . Oxidación

Tomar con la pipeta 40 ml de la solución acuosa sobrenadante ( ligeramente turbia ) obtenida en 5.1 , introducirlos en un tubo de reacción de tapón esmerilado , añadir 0,5 a 1 ml de solución de 2,6-diclorofenol-indofenol ( 3.4 ) y homogeneizar . Se forma una coloración roja que debe persistir 15 minutos al menos . Añadir a continuación 300 mg aproximadamente de auxiliar de filtración ( 3.5 ) , agitar y filtrar sobre un filtro de pliegues seco . El filtrado no debe ser límpido necesariamente .

5.3 . Reacción con la 2,4-dinitrofenilhidracina y extracción del hidrazono

Tomar con la pipeta 40 ml del filtrado obtenido en 5.2 , introducirlos en un tubo de centrifugar ( 4.2 ) , añadir 2 ml de solución de 2,4-dinitrofenilhidracina ( 3.6 ) y homogeneizar . Hacer pasar rápidamente una corriente de nitrógeno ( 3.7 ) o de ácido carbónico ( 3.8 ) , tapar el tubo y sumergirlo durante 15 horas alrededor ( una noche ) en el baño de agua ( 4.1 ) . Añadir a continuación 3 ml de agua , 20 ml de la mezcla acetato de etilo/ácido acético glacial/acetona ( 3.9 ) y 800 mg aproximadamente de auxiliar de filtración ( 3.5 ) . Tapar el tubo , agitar vigorosamente durante 30 segundos y centrifugar . Introducir 15 ml de la fase sobrenadante en un matraz de evaporación y evaporar bajo presión reducida en el evaporador rotativo ( 4.3 ) hasta obtención de un residuo aceitoso . Disolver el residuo en 2 ml de la mezcla acetato de etilo/ácido acético glacial/acetona ( 3.9 ) volviendo a calentar a 30 ° C , dejar refrigerar , añadir 10 ml de la mezcla diclorometano/ácido acético glacial ( 3.10 ) y homogeneizar .

5.4 . Cromatografía sobre columna

Llenar un tubo para cromatografía ( 4.4 ) hasta una altura de 30 mm , de la mezcla diclorometano/ácido acético glacial ( 3.10 ) . Poner en suspensión ( agitando vigorosamente ) 5 g de gel de silicio ( 3.11 ) a 30 ml de la mezcla diclovometano/ácido acético glacial ( 3.10 ) , verter la suspensión en el tubo . Dejar que se deposite y agitarlo después bajo una débil presión de nitrógeno ( 3.7 ) .

Transvasar al tubo la solución obtenida en 5.3 , lavar el matraz con una pequeña cantidad de la mezcla diclorometano/ácido gloacial ( 3.10 ) y transvasar al tubo , rellenar éste a continuación con la mezcla ( 3.10 ) y proseguir el lavado de la columna con la misma mezcla ( 3 a 4 porciones de 5 ml aproximadamente ) hasta la obtención de un eluido incoloro . Eliminar la fracción del eluido coloreado en amarillo .

Eluir la zona rojiza en la cabeza de la columna mediante la mezcla acetato de tilo/ácido acético glacial/acetona ( 3.9 ) , recoger el eluido y evaporarlo en seco .

5.4.1 . Para los productos del grupo A ( contenidos en vitamina C inferiores a 10 g/kg ) disolver el residuo en 2,0 ml de la mezcla acetato de etilo/ácido acético glacial/acetona ( 3.9 ) y proceder inmediatamente a la cromatografía en capa fina como se indica en el punto 5.5 .

5.4.2 . Para los productos del grupo B ( contenidos en vitamina C iguales o superiores a 10 g/kg ) , recoger el residuo aceitoso con 4,0 ml de ácido sulfúrico diluido ( 3.13 ) , agitar vigorosamente para disolver completamente el residuo y proceder a la medición de la densidad óptica indicada en 5.6 .

5.5 . Cromatografía en capa fina

Efectuar las operaciones indicadas a continuación por duplicado . Dejar que se deposite en forma de marca sobre la plaza de cromatografía en capa fina ( 4.6 ) 0,5 ml de solución obtenida en 5.4.1 . Desarrollar durante 20 minutos como mínimo en el ácido del disolvente de elución ( 3.14 ) , en cubeta saturada , hasta la separación clara de la zona del hidrozono de color rosa . Dejar secar al aire . Delimitar la zona rosa , rasparla con una espátula y transvasar cuantitativamente la masa pulverizada a un tubo para cromatografía ( 4.4 ) .

Eluir sucesivamente una vez mediante 2 ml y dos veces mediante 1,5 ml de la mezcla acetato de etilo/ácido acético glacial/acetona ( 3.9 ) . Recoger el eluido en un pequeño matraz ( la última fracción debe ser incolora ) . Evaporar en seco , recoger el residuo aceitoso mediante 4,0 ml de ácido sulfúrico diluido ( 3.13 ) , agitar vigorosamente para disolver completamente el residuo y proceder a la medición de la densidad óptica .

5.6 . Medición de la densidad óptica

Medir la densidad óptica mediante el fotómetro a 509 nm , 20 o 30 minutos después de haberse puesto en solución el residuo en el ácido sulfúrico . Efectuar las mediciones por comparación con el ácido sulfúrico diluido ( 3.13 ) .

5.7 . Prueba en blanco

Efectuar una prueba en blanco aplicando el mismo método operatorio no existiendo muestra .

6 . Cálculo de los resultados

El contenido en g de vitamina C por kg de muestra está dado por la fórmula :

( c - a ) · 2/ ( b - c ) · 10 d

en la que :

a = densidad óptica del blanco

b = densidad óptica de la solución del patrón interno

c = densidad óptica de la solución de la muestra

d = peso en gramos de la toma de muestras

Repetibilidad

La diferencia entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra no debe exceder del 10 % en valor relativo , para los contenidos en vitamina C inferiores a 10 g/kg y del 5 % en valor relativo , para todos los contenidos iguales o superiores a 10 g/kg .

(1) 1 UI = 0,3 mg de retinol .

(2) Para los alimentos de lantancia y los productos que tienen tendencia a aglomerarse o a hincharse , duplicar la cantidad de reactivos indicados en 5.2 primer y segundo párrafo .

(3) La adición de ascorbato de sodio no es necesaria cuando la hidrólisis se efectúe en atmósfera de nitrógeno .

(4) El contenido de caroteno puede determinarse por la medida de la densidad óptica a 450 nm ; E 1 % /1 cm = 2 600 .