Appendiċi I

TRAB TAL-ĦALIB XKUMAT: DETERMINAZZJONI KWANTITATTIVA TAL-FOSFATIDILSERINA U TAL-FOSFATIDILETANOLAMINA

Metodu: kromatografija likwida ta' rendiment għoli (HPLC) f'fażi inversa

1.   SKOP U KAMP TA' APPLIKAZZJONI

Il-metodu jiddeskrivi proċedura għad-determinazzjoni kwantitattiva tal-fosfatidilserina (PS) u tal-fosfatidiletanolamina (PE) fit-trab tal-ħalib xkumat u huwa adattat għad-detezzjoni tas-solidi tax-xorrox tal-butir fit-trab tal-ħalib xkumat.

2.   DEFINIZZJONI

Kontenut ta' fosfatidilserina u ta' fosfatidiletanolammina: il-frazzjoni tal-massa tas-sustanza stabbilita billi tintuża l-proċedura speċifikata hawnhekk. Ir-riżultat huwa mogħti bħala milligrammi ta' dipalmitojl tal-fosfatidiletanolammina (PEDP) għal kull 100 gramma trab.

3.   PRINĊIPJU TAL-METODU

L-estrazzjoni tal-aminofosfolipidi bil-metanol mit-trab tal-ħalib rikostitwit. Id-determinazzjoni tal-fosfatidilserina u tal-fosfatidiletanolammina bħala derivati tal-o-ftaldialdeid (OPA) permezz tal-kromatografija likwida ta' rendiment għoli (HPLC) f'fażi inversa (RP) u tad-detezzjoni tal-fluworexxenza. Il-kwantifikazzjoni tal-kontenut ta' fosfatidilserina u ta' fosfatidiletanolammina fil-kampjun għat-test b'referenza għal kampjun standard li jkun fih ammont magħruf ta' PEDP.

4.   REAĠENTI

Ir-reaġenti kollha għandhom ikunu ta' grad analitiku rikonoxxut. L-ilma għandu jkun iddistillat jew ikun tal-inqas pur b'mod ekwivalenti, sakemm ma jkunx speċifikat mod ieħor.

4.1.   Materjal standard: PEDP, li jkun mill-anqas 99 % pur

Nota: Il-materjal standard għandu jinħażen f'temperatura ta' – 18 °C.

4.2.   Reaġenti għat-tħejjija tal-kampjun standard u għat-tħejjija tal-kampjun għat-test

4.2.1.   Metanol tal-grad HPLC

4.2.2.   Kloroform tal-grad HPLC

4.2.3.   Monoidroklorur tat-triptamina

4.3.   Reaġenti għad-derivatizzazzjoni tal-o-ftaldialdeid

4.3.1.   Idrossidu tas-sodju, soluzzjoni ta' ilma ta' 12 M

4.3.2.   Aċidu boriku, soluzzjoni ta' ilma ta' 0,4 M aġġustata għal pH 10,0 bl-idrossidu tas-sodju (4.3.1)

4.3.3.   2-merkaptoetanol

4.3.4.   O-ftaldialdeid (OPA)

4.4.   Solventi ta' elwizzjoni tal-HPLC

4.4.1.   Is-solventi ta' elwizzjoni għandhom jitħejjew bl-użu ta' reaġenti tal-grad HPLC.

4.4.2.   Ilma tal-grad HPLC

4.4.3.   Metanol ta' purità fluworometrika ttestjata

4.4.4.   Tetraidrofuran

4.4.5.   Diidroġenufosfat tas-sodju

4.4.6.   Aċetat tas-sodju

4.4.7.   Aċidu aċetiku.

5.   APPARAT

5.1.   Miżien analitiku, li jiżen sal-eqreb milligramma (1) u li jkollu riżoluzzjoni ta' 0,1 mg

5.2.   Bekkijiet ta' 25 ml u ta' 100 ml

5.3.   Pipetti ta' millilitru (1 ml) u ta' 10 ml

5.4.   Ħawwad manjetiku

5.5.   Pipetti gradwati ta' 0,2 ml, ta' 0,5 ml u ta' 5 ml

5.6.   Flasks volumetriċi ta' 10 ml, ta' 50 ml u ta' 100 ml

5.7.   Siringi ta' 20 ml u ta' 100 ml

5.8.   Banju ultrasoniku

5.9.   Magna ċentrifuga, li taħdem f'27 000 × g

5.10.   Fjali tal-ħġieġ ta' madwar 5 ml

5.11.   Ċilindru gradwat ta' 25 ml

5.12.   Miter tal-pH, preċiż sa 0,1 unitajiet tal-pH

5.13.   Tagħmir tal-HPLC

5.13.1.   Sistema ta' ppumpjar bi gradjent, li taħdem f'1,0 ml kull minuta f'200 bar

5.13.2.   Apparat li jieħu l-kampjuni b'mod awtomatiku b'kapaċità ta' derivatizzazzjoni

5.13.3.   Ħiter tal-kolonna, li jżomm il-kolonna f'temperatura ta' 30 °C ± 1 °C

5.13.4.   Detettur tal-fluworexxenza, li jaħdem f'tul ta' mewġa tal-eċitazzjoni ta' 330 nm u f'tul ta' mewġa tal-emissjoni ta' 440 nm

5.13.5.   Integratur jew softwer tal-ipproċessar tad-dejta li jkejjel l-erja tal-quċċata

5.13.6.   Kolonna “LiChrospher® — 100” (ta' 250 b'4,6 mm) jew kolonna ekwivalenti ppakkjata bl-ottadeċilsilan (C 18), b'daqs tal-partiċelli ta' 5 μm.

6.   TEĦID TAL-KAMPJUNI

Il-kampjuni għandhom jittieħdu skond l-istandard ISO 707.

7.   PROĊEDURA

7.1.   Tħejjija tas-soluzzjoni standard interna

7.1.1.   Iżen 30,0 ± 0,1 mg ta' monoidroklorur tat-triptamina (4.2.3) ġo flask volumetriku ta' 100 ml (5.6) u żid sal-marka bil-metanol (4.2.1)

7.1.2.   Bil-pipetta (5.3) poġġi millilitru ta' din is-soluzzjoni ġo flask volumetriku ta' 10 ml (5.6) u żid sal-marka bil-metanol (4.2.1) sabiex tikseb konċentrazzjoni tat-triptamina ta' 0,15 mM.

7.2.   Tħejjija tas-soluzzjoni tal-kampjun għat-test

7.2.1.   Iżen 1,000 ± 0,001 g tal-kampjun tat-trab tal-ħalib xkumat ġo bekk ta' 25 ml (5.2). Bil-pipetta (5.3) żid 10 ml ta' ilma ddistillat f'40 °C ± 1 °C u ħawwad b'ħawwad manjetiku (5.4) għal 30 minuta biex tħoll kull boċċa li jista' jkun hemm

7.2.2.   Bil-pipetta (5.5) poġġi 0,2 ml tal-ħalib rikostitwit ġo flask volumetriku ta' 10 ml (5.6), żid 100 μl mis-soluzzjoni tat-triptamina ta' 0,15 mM (7.1) b'siringa (5.7) u żid sal-volum bil-metanol (4.2.1). Ħallat b'attenzjoni billi taqilbu u tissonikah (5.8) għal 15-il minuta

7.2.3.   Għaddih mill-magna ċentrifuga (5.9) f'27 000 g × g għal 10 minuti u iġbor is-supernatant fi fjala tal-ħġieġ (5.10)

Nota: Is-soluzzjoni tal-kampjun għat-test għandha tinħażen f'temperatura ta' 4 °C sa ma ssir l-analiżi tal-HPLC.

7.3.   Tħejjija tas-soluzzjoni standard esterna

7.3.1.   Iżen 55,4 mg ta' PEDP (4.1) ġo flask volumetriku ta' 50 ml (5.6) u żid madwar 25 ml ta' kloroform (4.2.2) billi tuża ċilindru gradwat (5.11). Saħħan il-flask magħluq sa ma dan jilħaq temperatura ta' 50 °C ± 1 °C u ħallat b'attenzjoni sakemm jinħall il-PEDP. Berred il-flask sa ma dan jilħaq temperatura ta' 20 °C, żid sal-volum bil-metanol (4.2.1) u ħallat billi taqilbu

7.3.2.   Bil-pipetta (5.3) poġġi millilitru ta' din is-soluzzjoni ġo flask volumetriku ta' 100 ml (5.6) u żid sal-volum bil-metanol (4.2.1). Bil-pipetta (5.3) poġġi millilitru ta' din is-soluzzjoni ġo flask volumetriku ta' 10 ml (5.6), żid 100 μl (5.7) mis-soluzzjoni tat-triptammina ta' 0,15 mM (7.1) u żid sal-volum bil-metanol (4.2.1). Ħallat billi taqilbu

Nota: Is-soluzzjoni tal-kampjun ta' referenza għandha tinħażen f'temperatura ta' 4 °C sa ma ssir l-analiżi tal-HPLC.

7.4.   Tħejjija tar-reaġent tad-derivatizzazzjoni

Iżen 225,0 ± 0,1 mg tal-OPA (4.3.4) ġo flask volumetriku ta' 10 ml (5.6), żid 0,5 ml (5.5) ta' metanol (4.2.1) u ħawwad b'attenzjoni biex tħoll l-OPA. Żid sal-marka b'soluzzjoni tal-aċidu boriku (4.3.2) u żid 20 μl ta' 2-merkaptoetanol (4.3.3) b'siringa (5.7).

Nota: Ir-reaġent tad-derivatizzazzjoni għandu jinħażen f'temperatura ta' 4 °C fi fjala tal-ħġieġ kannella u jibqa' stabbli ġimgħa.

7.5.   Determinazzjoni bl-HPLC

7.5.1.   Solventi ta' elwizzjoni (4.4)

Solvent A: Soluzzjoni ta' diidroġenufosfat tas-sodju ta' 0,3 mM u soluzzjoni ta' aċetat tas-sodju ta' 3 mM (aġġustata għal pH ta' 6,5 ± 0,1 bl-aċidu aċetiku): metanol: tetraidrofuran = 558:440:2 (v/v/v)

Solvent B: metanol

7.5.2.   Gradjent ta' elwizzjoni ssuġġerit:

Ħin (f'minuti)	Solvent A (f'perċentwali)	Solvent B (f'perċentwali)	Rata tal-fluss (f'ml għal kull minuta)
Ħin tal-bidu	40	60	0
0,1	40	60	0,1
5,0	40	60	0,1
6,0	40	60	1,0
6,5	40	60	1,0
9,0	36	64	1,0
10,0	20	80	1,0
11,5	16	84	1,0
12,0	16	84	1,0
16,0	10	90	1,0
19,0	0	100	1,0
20,0	0	100	1,0
21,0	40	60	1,0
29,0	40	60	1,0
30,0	40	60	0

Nota: Jista' jkun li l-gradjent ta' elwizzjoni jkun irid jinbidel xi ftit biex tinkiseb ir-riżoluzzjoni murija fil-Figura 1.

Temperatura tal-kolonna: 30 °C.

7.5.3.   Volum tal-injezzjoni: 50 μl ta' reaġent tad-derivatizzazzjoni u 50 μl ta' soluzzjoni tal-kampjun

7.5.4.   Ekwilibrazzjoni tal-kolonna

Qabbad is-sistema kuljum, laħlaħ il-kolonna b'100 % tas-solvent B għal 15-il minuta, imbagħad issettjaha għal A:B = 40:60 u ekwilibraha b'millilitru għal kull minuta għal 15-il minuta. Agħmel prova inbjank billi tinjetta l-metanol (4.2.1).

Nota: Qabel ma l-kolonna tinħażen fit-tul, laħlaħha bil-metanol:kloroform = 80:20 (v/v) għal 30 minuta.

7.5.5.   Iddetermina l-kontenut ta' fosfatidilserina u l-kontenut ta' fosfatidiletanolammina fil-kampjun għat-test

7.5.6.   Wettaq is-sekwenza tal-analiżi kromatografiċi u żomm l-istess ħin bejn prova u oħra sabiex tikseb ħinijiet ta' retenzjoni kostanti. Injetta s-soluzzjoni standard esterna (7.3) kull 5 sa 10 soluzzjonijiet tal-kampjun għat-test sabiex tikkalkula l-fattur tar-rispons.

Nota: Naddaf il-kolonna billi tlaħlaħha b'100 % tas-solvent B (7.5.1) għal mill-inqas 30 minuta kull 20 sa 25 prova.

7.6.   Mod ta' integrazzjoni

7.6.1.   Il-quċċata tal-PEDP

Il-PEDP jiġi elwit bħala quċċata waħda. Ikkalkula l-erja tal-quċċata permezz ta' integrazzjoni “valley-to-valley”.

7.6.2.   Il-quċċata tat-triptamina

It-triptamina tiġi elwita bħala quċċata waħda (ara Figura 1). Iddetermina l-erja tal-quċċata permezz ta' integrazzjoni “valley-to-valley”.

7.6.3.   Gruppi ta' qċaċet tal-fosfatidilserina u tal-fosfatidiletanolammina

Bil-kundizzjonijiet deskritti (Figura 1), il-fosfatidilserina (PS) tiġi elwita bħala żewġ qċaċet ewlenin li ma jkunux riżolti għalkollox ippreċeduti minn quċċata minuri. Il-fosfatidiletanolammina (PE) tiġi elwita bħala tliet qċaċet ewlenin li ma jkunux riżolti għalkollox. Iddetermina l-erja kollha ta' kull grupp ta' qċaċet u bħala linja bażi ħu dik murija fil-Figura 1.

8.   KALKOLU TAR-RIŻULTATI U ESPRESSJONI TAGĦHOM

Il-kontenut ta' fosfatidilserina u ta' fosfatidiletanolammina fil-kampjun għat-test għandu jiġi kkalkulat kif ġej:

C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2))

fejn:

C	=	il-kontenut ta' fosfatidilserina jew ta' fosfatidiletanolammina fil-kampjun għat-test (f'milligrammi għal kull 100 gramma ta' trab);
A1	=	l-erja tal-quċċata tal-PEDP tas-soluzzjoni tal-kampjun standard (7.3);
A2	=	l-erja tal-quċċata tal-fosfatidilserina jew tal-fosfatidiletanolammina tas-soluzzjoni tal-kampjun għat-test (7.2);
T1	=	l-erja tal-quċċata tat-triptamina tas-soluzzjoni tal-kampjun standard (7.3);
T2	=	l-erja tal-quċċata tat-triptamina tas-soluzzjoni tal-kampjun għat-test (7.2).

9.   PREĊIŻJONI TAL-METODU

Nota: Il-valuri tar-ripetibbiltà ġew ikkalkulati skont l-Istandard Internazzjonali tal-IDF (*).

9.1.   Ripetibbiltà

Id-devjazzjoni standard relattiva tar-ripetibbiltà, li tesprimi l-varjabbiltà tar-riżultati analitiċi indipendenti li l-istess operatur jikseb bl-użu tal-istess apparat bl-istess kundizzjonijiet u fuq l-istess kampjun għat-test f'intervall qasir taż-żmien, ma għandhiex taqbeż it-2 % b'mod relattiv. Jekk jinkisbu żewġ determinazzjonijiet b'dawn il-kundizzjonijiet, id-differenza relattiva bejn iż-żewġ riżultati ma għandhiex tkun ta' iktar minn 6 % tal-medja aritmetika tar-riżultati.

9.2.   Riproduċibbiltà

Jekk l-operaturi jiksbu żewġ determinazzjonijiet f'laboratorji differenti bl-użu ta' apparat differenti u b'kundizzjonijiet differenti, għall-analiżi tal-istess kampjun għat-test, id-differenza relattiva bejn iż-żewġ riżultati ma għandhiex tkun ta' iktar minn 11 % tal-medja aritmetika tar-riżultati.

10.   BIBLIJOGRAFIJA

10.1.   Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., “Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids”. Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).

Figura 1

Profil tal-HPLC tad-derivati tal-OPA tal-fosfatidilserina (PS) u tal-fosfatidiletanolammina (PE) f'estratt tal-metanol tat-trab tal-ħalib xkumat rikostitwit. Qed jiġi rrappurtat il-mod ta' integrazzjoni tal-qċaċet tal-PS, tal-PE u tat-triptamina (l-istandard intern)

Appendiċi II

ID-DETEZZJONI TAX-XORROX TAT-TAMES FIT-TRAB TAL-ĦALIB XKUMAT GĦALL-ĦŻIN PUBBLIKU BID-DETERMINAZZJONI TAL-KASEINOMAKROPEPTIDI PERMEZZ TAL-KROMATOGRAFIJA LIKWIDA TA' RENDIMENT GĦOLI (L-HPLC)

1.   SKOP U KAMP TA' APPLIKAZZJONI

Dan il-metodu jippermetti d-detezzjoni tax-xorrox tat-tames fit-trab tal-ħalib xkumat maħsub għall-ħżin pubbliku bid-determinazzjoni tal-kaseinomakropeptidi.

2.   REFERENZA

L-Istandard Internazzjonali ISO 707 - “Milk and milk products – Guidance on sampling” (“Ħalib u prodotti tal-ħalib – Gwida dwar it-teħid tal-kampjuni”).

3.   DEFINIZZJONI

Il-kontenut ta' solidi tax-xorrox tat-tames huwa ddefinit bħala l-perċentwali skont il-massa kif stabbilit mill-kontenut ta' kaseinomakropeptidi bil-proċedura deskritta.

4.   PRINĊIPJU

—	Ir-rikostituzzjoni tat-trab tal-ħalib xkumat, it-tneħħija tax-xaħam u tal-proteini bl-aċidu trikloroaċetiku, u wara ċ-ċentrifugazzjoni jew il-filtrazzjoni;

—	Id-determinazzjoni tal-kwantità ta' kaseinomakropeptidi (CMP) fis-supernatant permezz tal-kromatografija likwida ta' rendiment għoli (l-HPLC);

—	L-evalwazzjoni tar-riżultat miksub għall-kampjuni b'referenza għall-kampjuni standard li jkunu magħmulin minn trab tal-ħalib xkumat biż-żieda ta' perċentwali magħruf tat-trab tax-xorrox jew mingħajr din iż-żieda.

5.   REAĠENTI

Ir-reaġenti kollha għandhom ikunu ta' grad analitiku rikonoxxut. L-ilma li jintuża għandu jkun iddistillat jew ikun tal-inqas pur b'mod ekwivalenti.

5.1.   Soluzzjoni ta' aċidu trikloroaċetiku

Ħoll 240 gramma ta' aċidu trikloroaċetiku (CCl3COOH) fl-ilma u żid sa 1 000 ml. Is-soluzzjoni għandha tkun ċara u bla kulur.

5.2.   Soluzzjoni tal-elwent ta' pH 6,0

Ħoll 1,74 g ta' idroġenufosfat tad-dipotassju (K2HPO4), 12,37 g ta' diidroġenufosfat tal-potassju (KH2PO4) u 21,41 g ta' sulfat tas-sodju (Na2SO4) f'madwar 700 ml ilma. Jekk ikun hemm bżonn aġġusta s-soluzzjoni sa pH ta' 6,0, billi tuża soluzzjoni ta' aċidu fosforiku jew ta' idrossidu tal-potassju.

Żid sa 1 000 ml bl-ilma u omoġenizza.

Nota: Il-kompożizzjoni tal-elwent tista' tiġi aġġornata biex tikkonforma maċ-ċertifikat tal-istandards jew tar-rakkomandazzjonijiet tal-manifattur tal-materjal tal-ippakkjar tal-kolonna.

Qabel tużaha, għaddi s-soluzzjoni tal-elwent minn ġo filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm.

5.3.   Solvent tat-tlaħliħ

Ħallat volum wieħed ta' aċetonitril (CH3CN) ma' disa' volumi ilma. Qabel tużaha, għaddi t-taħlita minn ġo filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm.

Nota: Jista' jintuża kwalunkwe solvent ieħor tat-tlaħliħ b'effett ta' batteriċida li ma jnaqqasx l-effiċjenza tar-riżoluzzjoni tal-kolonni.

5.4.   Kampjuni standard

5.4.1.   Trab tal-ħalib xkumat li jissodisfa r-rekwiżiti ta' dan ir-Regolament (jiġifieri [0])

5.4.2.   L-istess trab tal-ħalib xkumat adulterat b'5 % (m/m) trab tax-xorrox tat-tip tat-tames li jkollu kompożizzjoni standard (jiġifieri [5]).

6.   APPARAT

6.1.   Miżien analitiku

6.2.   Magna ċentrifuga fakultattiva li tilħaq forza ċentrifugali ta' 2 200 gramma, mgħammra b'tubi taċ-ċentrifugazzjoni magħluqin b'għatu jew b'tapp li jesgħu madwar 50 ml

6.3.   Xejker mekkaniku

6.4.   Ħawwad manjetiku

6.5.   Imbiebet tal-ħġieġ b'dijametru ta' madwar 7 cm

6.6.   Karti filtru ta' filtrazzjoni medja b'dijametru ta' madwar 12,5 cm

6.7.   Tagħmir tal-filtrazzjoni magħmul mill-ħġieġ b'filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm

6.8.   Pipetti gradwati li minnhom jgħaddu 10 ml (tal-Klassi A tal-istandard ISO 648 jew tal-istandard ISO/R 835), jew sistema ta' distribuzzjoni li minnha jgħaddu 10,0 ml f'żewġ minuti

6.9.   Sistema ta' distribuzzjoni li minnha jgħaddu 20,0 ml ta' ilma f'temperatura ta' madwar 50 °C

6.10.   Banjumarija termostatiku ssettjat f'temperatura ta' 25C ± 0,5 °C

6.11.   Tagħmir tal-HPLC, magħmul minn dan li ġej:

6.11.1.

Pompa

6.11.2.

Injettatur li jitħaddem bl-idejn jew b'mod awtomatiku, li jkun jesa' bejn 15 u 30 μl

6.11.3.

Żewġ kolonni tat-tip TSK 2 000-SW f'serje (b'tul ta' 30 cm u dijametru intern ta' 0,75 cm) jew kolonni ekwivalenti (pereżempju kolonna waħda tat-tip TSK 2 000-SWxl u kolonna waħda tat-tip Agilent Technologies Zorbax GF 250), u prekolonna (ta' 3 cm b'0,3 cm) ippakkjata bl-I 125 jew b'materjal ta' effettività ekwivalenti

6.11.4.

Forn termostatiku tal-kolonna ssettjat f'temperatura ta' 35 °C ± 1 °C

6.11.5.

Detettur tal-ultravjola b'tul ta' mewġa varjabbli li jippermetti kejl f'205 nm b'sensittività ta' 0,008 Å

6.11.6.

Integratur li jintegra “valley-to valley” Nota: Tista' taħdem bil-kolonni f'temperatura ambjentali, imma l-qawwa tar-riżoluzzjoni tagħhom tkun ftit iktar baxxa. F'dak il-każ, jenħtieġ li t-temperatura ma tvarjax b'aktar minn ± 5 °C f'kull sensiela partikulari ta' analiżi.

7.   TEĦID TAL-KAMPJUNI

7.1.   Il-kampjuni għandhom jittieħdu skont il-proċedura stabbilita fl-Istandard Internazzjonali ISO 707. Madanakollu, l-Istati Membri jistgħu jużaw metodu ieħor tat-teħid tal-kampjuni, dejjem jekk dan ikun konformi mal-prinċipji tal-istandard imsemmi hawn fuq

7.2.   Aħżen il-kampjun f'kundizzjonijiet li jaqtgħu barra kull taħsir jew tibdil fil-kompożizzjoni.

8.   PROĊEDURA

8.1.   Tħejjija tal-kampjun għat-test

Ittrasferixxi t-trab tal-ħalib għal ġo kontenitur li jkun jesa' madwar id-doppju tal-volum tat-trab, li jkollu għatu li ma tgħaddix l-arja minnu. Agħlaq il-kontenitur mill-ewwel. Ħallat it-trab tal-ħalib sewwa permezz ta' inverżjoni ripetuta tal-kontenitur.

8.2.   Porzjon tal-kampjun għat-test

Iżen 2,000 g ± 0,001 g tal-kampjun għat-test f'tubu taċ-ċentrifugazzjoni (6.2) jew fi flask magħluq adattat (50 ml).

8.3.   Tneħħija tax-xaħam u tal-proteini

8.3.1.   Żid 20,0 ml ta' misħun (b'temperatura ta' 50 °C) mal-porzjon tal-kampjun għat-test. Ħoll it-trab billi tħawdu għal ħames minuti bl-użu ta' xejker mekkaniku (6.3). Qiegħed it-tubu fil-banjumarija (6.10) u ħallih jekwilibra ruħu sa ma jilħaq temperatura ta' 25 °C

8.3.2.   F'żewġ minuti żid 10,0 ml tas-soluzzjoni ta' aċidu trikloroaċetiku (5.1) li jkollha temperatura ta' madwar 25 °C, filwaqt li tħawwad bil-qawwa bl-għajnuna ta' ħawwad manjetiku (6.4). Qiegħed it-tubu f'banjumarija (6.10) u ħallih għal 60 minuta

8.3.3.   Għaddi s-soluzzjoni mill-magna ċentrifuga (6.2) f'2 200 g għal 10 minuti, jew għaddiha minn ġo karta filtru (6.6), u armi l-ewwel 5 ml tal-filtrat.

8.4.   Determinazzjoni permezz tal-kromatografija

8.4.1.   Injetta 15 sa 30 μl ta' supernatant jew ta' filtrat (8.3.3) imkejjel b'mod preċiż fit-tagħmir tal-HPLC (6.11) li jkun qiegħed jaħdem b'rata tal-fluss ta' 1,0 ml ta' soluzzjoni tal-elwent (5.2) kull minuta.

Nota 1: Tista' tintuża rata oħra tal-fluss skont id-dijametru intern tal-kolonni li jintużaw jew l-istruzzjonijiet tal-manifattur tal-kolonna.

Nota 2: Laħlaħ il-kolonni bl-ilma waqt kull interruzzjoni. Is-soluzzjoni tal-elwent (5.2) tħalliha qatt fihom.

Qabel kull interruzzjoni ta' aktar minn 24 siegħa, laħlaħ il-kolonni bl-ilma, imbagħad aħsilhom bis-soluzzjoni (5.3) għal mill-anqas tliet sigħat b'rata tal-fluss ta' 0,2 ml kull minuta.

8.4.2.   Ir-riżultati tal-analiżi kromatografika tal-kampjun għat-test [E] jinkisbu fil-forma ta' kromatogramma li fiha kull quċċata hija identifikata mill-ħin ta' retenzjoni tagħha (RT), kif ġej:

Il-quċċata II:	It-tieni quċċata tal-kromatogramma b'RT ta' madwar 12,5-il minuta.
Il-quċċata III:	It-tielet quċċata tal-kromatogramma, li tikkorrispondi għas-CMP, b'RT ta' 15,5-il minuta.

L-għażla tal-kolonna (jew tal-kolonni) tista' taffettwa l-ħinijiet ta' retenzjoni tal-qċaċet individwali b'mod konsiderevoli.

L-integratur (6.11.6) jikkalkula awtomatikament l-erja A ta' kull quċċata:

AII:	l-erja tal-quċċata II;
AIII:	l-erja tal-quċċata III.

Huwa essenzjali li tiġi eżaminata d-dehra ta' kull kromatogramma qabel ma ssir l-interpretazzjoni kwantitattiva sabiex tiġi identifikata kull anomalija li jista' jkun hemm minħabba xi ħsara fl-apparat jew fil-kolonni jew minħabba l-oriġini u n-natura tal-kampjun li jkun qed jiġi analizzat.

F'każ ta' dubju, irrepeti l-analiżi.

8.5.   Kalibrazzjoni

8.5.1.   Applika eżatt l-istess proċedura deskritta fil-punti 8.2 sa 8.4.2 għall-kampjuni standard (5.4)

Uża soluzzjonijiet li jkunu tħejjew dak il-ħin, għaliex is-CMP jiddegradaw f'ambjent li jkun 8 % trikloroaċetiku. Hu stmat li, f'temperatura ta' 30 °C, ikun hemm telf ta' 0,2 % kull siegħa.

8.5.2.   Qabel id-determinazzjoni tal-kampjuni permezz tal-kromatografija, ikkundizzjona l-kolonni billi tinjetta b'mod ripetut il-kampjun standard (5.4.2) fis-soluzzjoni (8.5.1) sakemm l-erja tal-quċċata u l-ħin ta' retenzjoni tiegħu li jikkorrispondu għas-CMP ikunu kostanti.

8.5.3.   Iddetermina l-fatturi tar-rispons R billi tinjetta l-istess volum ta' filtrati (8.5.1) bħal dak użat għall-kampjuni.

9.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

9.1.   Metodu tal-kalkolu u formuli

9.1.1.   Kalkolu tal-fatturi tar-rispons R:

Il-quċċata II:

RII = 100/(AII[0])

fejn:

RII	=	il-fatturi tar-rispons tal-qċaċet II;
AII[0]	=	l-erji tal-qċaċet II tal-kampjun standard [0] miksubin fil-punt 8.5.3.

Il-quċċata III:

RIII = W/(AIII[5] – AIII[0])

fejn:

RIII	=	il-fattur tar-rispons tal-quċċata III;
AIII[0] u AIII[5]	=	l-erji tal-quċċata III fil-kampjuni standard [0] u [5] rispettivament miksubin fil-punt 8.5.3;
W	=	il-kwantità ta' xorrox fil-kampjun standard [5], jiġifieri 5.

9.1.2.   Kalkolu tal-erja relattiva tal-qċaċet fil-kampjun [E]:

SII[E] = RII × AII[E]

SIII[E] = RIII × AIII[E]

SIV[E] = RIV × AIV[E]

fejn:

SII[E], SIII[E] u SIV[E]	=	l-erji relattivi tal-qċaċet II, III u IV rispettivament fil-kampjun [E];
AII[E] u AIII[E]	=	l-erji tal-qċaċet II u III rispettivament fil-kampjun [E] miksubin fil-punt 8.4.2;
RII u RIII	=	il-fatturi tar-rispons ikkalkulati fil-punt 9.1.1.

9.1.3.   Kalkolu tal-ħin relattiv ta' retenzjoni tal-quċċata III fil-kampjun [E]:

RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5])

fejn:

RRTIII[E]	=	il-ħin relattiv ta' retenzjoni tal-quċċata III fil-kampjun [E];
RTIII[E]	=	il-ħin ta' retenzjoni tal-quċċata III fil-kampjun [E] miksub fil-punt 8.4.2;
RTIII[5]	=	il-ħin ta' retenzjoni tal-quċċata III fil-kampjun ta' kontroll [5] miksub fil-punt 8.5.3.

9.1.4.   L-esperimenti wrew li hemm relazzjoni lineari bejn il-ħin relattiv ta' retenzjoni tal-quċċata III, jiġifieri RRTIII[E] u l-perċentwali ta' trab tax-xorrox miżjud sa 10 %.

—	Meta l-kontenut tax-xorrox ikun ta' > 5 %, l-RRTIII[E] jkun ta' < 1,000;

—	meta l-kontenut tax-xorrox ikun ta' ≤ 5 %, l-RRTIII[E] jkun ta' ≥ 1,000.

L-inċertezza permessa għall-valuri ta' RRTIII hija ta' ± 0,002.

Normalment il-valur ta' RRTIII[0] ftit jiddevja minn 1,034. Il-valur jista' joqrob lejn l-1,000, imma dejjem għandu jkun iktar minn hekk, skont il-kundizzjoni tal-kolonni.

9.2.   Kalkolu tal-perċentwali ta' trab tax-xorrox tat-tames fil-kampjun:

W = SIII[E] – [1,3 + (SIII[0] – 0,9)]

fejn:

W	=	il-perċentwali m/m ta' xorrox tat-tames fil-kampjun [E];
SIII[E]	=	l-erja relattiva tal-quċċata III tal-kampjun għat-test [E] miksuba fil-punt 9.1.2;
1,3	=	l-erja medja relattiva tal-quċċata III espressa fi grammi ta' xorrox tat-tames għal kull 100 g stabbiliti fit-trab tal-ħalib xkumat mhux adulterat ta' diversi oriġini. Din iċ-ċifra nkisbet b'mod sperimentali;
SIII[0]	=	l-erja relattiva tal-quċċata III li hi daqs RIII × AIII[0]. Dawn il-valuri jinkisbu fil-punt 9.1.1 u fil-punt 8.5.3 rispettivament;
(SIII[0] – 0,9)	=	il-korrezzjoni li għandha ssir fl-erja medja relattiva 1,3 meta l-valur ta' SIII[0] ma jkunx ta' 0,9. B'mod sperimentali, l-erja medja relattiva tal-quċċata III tal-kampjun ta' kontroll [0] hija ta' 0,9.

9.3.   Preċiżjoni tal-proċedura

9.3.1.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet li l-istess analista jwettaq fl-istess ħin jew wieħed wara l-ieħor malajr bl-użu tal-istess apparat fuq materjal identiku tat-testijiet, ma għandhiex taqbeż iż-0,2 % m/m.

9.3.2.   Riproduċibbiltà

Id-differenza bejn żewġ riżultati speċifiċi indipendenti, miksubin f'żewġ laboratorji differenti fuq materjal identiku tat-testijiet, ma għandhiex taqbeż iż-0,4 % m/m.

9.4.   Interpretazzjoni

9.4.1.   Assumi li m'hemmx xorrox jekk l-erja relattiva tal-quċċata III, jiġifieri SIII[E], espressa fi grammi ta' xorrox tat-tames għal kull 100 g tal-prodott, hija ta' ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9)

fejn:

2,0	huwa l-valur massimu permess għall-erja relattiva tal-quċċata III filwaqt li jitqiesu l-erja medja relattiva tal-quċċata III, jiġifieri 1,3, l-inċertezza minħabba l-varjazzjonijiet fil-kompożizzjoni tat-trab tal-ħalib xkumat u r-riproduċibbiltà tal-metodu (9.3.2);
(SIII[0] – 0,9)	hija l-korrezzjoni li għandha ssir meta l-valur tal-erja SIII[0] ma jkunx ta' 0,9 (ara l-punt 9.2).

9.4.2.   Jekk l-erja relattiva tal-quċċata III, jiġifieri SIII[E], tkun ta' > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) u l-erja relattiva tal-quċċata II, jiġifieri SII[E], tkun ta' ≤ 160, iddetermina l-kontenut ta' xorrox tat-tames hekk kif indikat fil-punt 9.2.

9.4.3.   Jekk l-erja relattiva tal-quċċata III, jiġifieri SIII[E], tkun ta' > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) u l-erja relattiva tal-quċċata II, jiġifieri SII[E], tkun ta' ≤ 160, iddetermina l-kontenut totali ta' proteini (P %), u mbagħad eżamina l-graffs 1 u 2.

9.4.3.1.   Id-dejta li nkisbet wara li ġew analizzati l-kampjuni tat-trab tal-ħalib xkumat mhux adulterat b'kontenut totali għoli ta' proteini nġabret fil-graffs 1 u 2.

Il-linja kontinwa tirrappreżenta r-rigressjoni lineari, li l-koeffiċjenti tagħha jiġu kkalkulati billi jintuża l-metodu tal-inqas kaxex.

Il-linja dritta miksura tistabbilixxi l-limitu massimu tal-erja relattiva tal-quċċata III, u bil-probabbiltà li dan il-limitu ma jinqabiżx f'90 % tal-każijiet.

L-ekwazzjonijiet għal-linji dritti miksurin fil-graffs 1 u 2 huma:

SIII = 0,376 P % – 10,7	(għal-linja tal-graff 1),
SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93	(għal-linja tal-graff 2),

rispettivament, fejn:

SIII	l-erja relattiva tal-quċċata III, ikkalkulata jew skont il-kontenut totali ta' proteini jew skont l-erja relattiva tal-quċċata SII[E];
P %	il-kontenut totali ta' proteini, espress bħala perċentwali skont il-piż;
SII[E]	l-erja relattiva tal-kampjun ikkalkulata fil-punt 9.1.2.

Dawn l-ekwazzjonijiet huma ekwivalenti għaċ-ċifra ta' 1,3 msemmija fil-punt 9.2.

Id-differenza (T1 u T2) bejn l-erja relattiva SIII[E] li tkun instabet u l-erja relattiva SIII tingħata permezz tal-ekwazzjonijiet li ġejjin: T1 = SIII[E] – [(0,376 P% – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)].

Jekk il-valur ta' T1 u/jew ta' T2	ikun ta' żero jew inqas, ma tkunx tista' tiġi stabbilita l-preżenza tax-xorrox tat-tames.
Jekk il-valuri ta' T1 u ta' T2	ikunu jaqbżu ż-żero, ikun hemm ix-xorrox tat-tames.

Il-kontenut ta' xorrox tat-tames jiġi kkalkulat bl-użu tal-formula li ġejja: W = T2 + 0,91

fejn:

0,91 hija d-distanza fuq l-assi vertikali bejn il-linja dritta sħiħa u l-linja dritta miksura.

Appendiċi III

DETERMINAZZJONI TAS-SOLIDI TAX-XORROX TAT-TAMES FIT-TRAB TAL-ĦALIB XKUMAT

1.   SKOP: ID-DETEZZJONI TAŻ-ŻIEDA TA' SOLIDI TAX-XORROX TAT-TAMES FIT-TRAB TAL-ĦALIB XKUMAT

2.   REFERENZI: L-ISTANDARD INTERNAZZJONALI ISO 707

3.   DEFINIZZJONI

Il-kontenut ta' solidi tax-xorrox tat-tames huwa ddefinit bħala l-perċentwali skont il-massa hekk kif stabbilit mill-kontenut ta' kaseinomakropeptidi bil-proċedura deskritta.

4.   PRINĊIPJU

Il-kampjuni jiġu analizzati għall-kaseinomakropeptide A permezz tal-kromatografija likwida ta' rendiment għoli (l-HPLC) f'fażi inversa. Ir-riżultat jiġi evalwat b'referenza għall-kampjuni standard magħmulin minn trab tal-ħalib xkumat li jkun fih perċentwali ta' trab tax-xorrox li jkun magħruf jew li ma jkunx magħruf. Meta jinkisbu riżultati ogħla minn 1 % (m/m), ifisser li fil-kampjun ikun hemm is-solidi tax-xorrox tat-tames.

5.   REAĠENTI

Ir-reaġenti kollha għandhom ikunu ta' grad analitiku rikonoxxut. L-ilma li jintuża għandu jkun iddistillat jew ikun tal-inqas pur b'mod ekwivalenti. L-aċetonitril għandu jkun ta' kwalità spettroskopika jew tal-HPLC.

5.1.   Soluzzjoni ta' aċidu trikloroaċetiku

Ħoll 240 gramma ta' aċidu trikloroaċetiku (CCl3COOH) fl-ilma u żid sa 1 000 ml. Is-soluzzjoni għandha tkun ċara u bla kulur.

5.2.   Elwenti A u B

Elwent A: 150 ml ta' aċetonitril (CH3CN), 20 ml ta' isopropanol (CH3CHOHCH3) u 1,00 ml ta' aċidu trifluworoaċetiku (TFA, CF3COOH) jitqiegħdu ġo flask volumetriku ta' 1 000 ml. Żid sa 1 000 ml bl-ilma.

Elwent B: 550 ml ta' aċetonitril, 20 ml ta' isopropanol u 1,00 ml ta' TFA jitqiegħdu ġo flask volumetriku ta' 1 000 ml. Żid sa 1 000 ml bl-ilma. Qabel tużaha, għaddi s-soluzzjoni tal-elwent minn ġo filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm.

5.3.   Konservazzjoni tal-kolonna

Wara l-analiżi, il-kolonna titlaħlaħ bl-elwent B (permezz ta' gradjent) u wara titlaħlaħ bl-aċetonitril (permezz ta' gradjent għal 30 minuta). Il-kolonna tinħażen fl-aċetonitril.

5.4.   Kampjuni standard

5.4.1.   Trab tal-ħalib xkumat li jissodisfa r-rekwiżiti għall-ħżin pubbliku (jiġifieri [0]).

5.4.2.   L-istess trab tal-ħalib xkumat adulterat b'5 % (m/m) trab tax-xorrox tat-tip tat-tames li jkollu kompożizzjoni standard (jiġifieri [5]).

5.4.3.   L-istess trab tal-ħalib xkumat adulterat b'50 % (m/m) trab tax-xorrox tat-tip tat-tames li jkollu kompożizzjoni standard (jiġifieri [50]).

6.   APPARAT

6.1.   Miżien analitiku

6.2.   Magna ċentrifuga fakultattiva li tilħaq forza ċentrifugali ta' 2 200 gramma, mgħammra b'tubi taċ-ċentrifugazzjoni magħluqin b'għatu jew b'tapp li jkunu jesgħu madwar 50 ml

6.3.   Xejker mekkaniku

6.4.   Ħawwad manjetiku

6.5.   Imbiebet tal-ħġieġ b'dijametru ta' madwar 7 cm

6.6.   Karti filtru ta' filtrazzjoni medja b'dijametru ta' madwar 12,5 cm

6.7.   Tagħmir tal-filtrazzjoni magħmul mill-ħġieġ b'filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm

6.8.   Pipetti gradwati li minnhom jgħaddu 10 ml (tal-Klassi A tal-istandard ISO 648 jew tal-istandard ISO/R 835), jew sistema ta' distribuzzjoni li minnha jgħaddu 10,0 ml f'żewġ minuti

6.9.   Sistema ta' distribuzzjoni li minnha jgħaddu 20,0 ml ta' ilma f'temperatura ta' madwar 50 °C

6.10.   Banjumarija termostatiku ssettjat f'temperatura ta' 25C ± 0,5 °C

6.11.   Tagħmir tal-HPLC, magħmul minn dan li ġej:

6.11.1.

Sistema ta' ppumpjar bi gradjent binarju

6.11.2.

Injettatur li jitħaddem bl-idejn jew b'mod awtomatiku, li jkun jesa' 100 μl

6.11.3.

Kolonna tat-tip Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 (b'tul ta' 25 cm u dijametru intern ta' 0,46 cm) jew kolonna ekwivalenti tal-fażi inversa b'bażi tas-siliċe u bil-pori wesgħin

6.11.4.

Forn termostatiku tal-kolonna ssettjat f'temperatura ta' 35 °C ± 1 °C

6.11.5.

Detettur tal-ultravjola b'tul ta' mewġa varjabbli li jippermetti kejl f'210 nm b'sensittività ta' 0,02 Å (u, jekk ikun hemm bżonn, jista' jintuża tul ta' mewġa ikbar, sa 220 nm)

6.11.6.

Integratur li jissettja l-integrazzjoni għal-linja bażi komuni jew “valley-to valley” Nota: Tista' taħdem bil-kolonna f'temperatura ambjentali, sakemm din it-temperatura ma tvarjax b'aktar minn 1 °C, inkella jkun hemm wisq varjazzjoni fil-ħin ta' retenzjoni tas-CMPA.

7.   TEĦID TAL-KAMPJUNI

7.1.   Il-kampjuni għandhom jittieħdu skont il-proċedura stabbilita fl-Istandard Internazzjonali ISO 707. Madanakollu, l-Istati Membri jistgħu jużaw metodu ieħor tat-teħid tal-kampjuni, dejjem jekk dan ikun konformi mal-prinċipji tal-istandard imsemmi hawn fuq

7.2.   Aħżen il-kampjun f'kundizzjonijiet li jaqtgħu barra kull taħsir jew tibdil fil-kompożizzjoni.

8.   PROĊEDURA

8.1.   Tħejjija tal-kampjun għat-test

Ittrasferixxi t-trab tal-ħalib għal ġo kontenitur li jkun jesa' madwar id-doppju tal-volum tat-trab, li jkollu għatu li ma tgħaddix l-arja minnu. Agħlaq il-kontenitur mill-ewwel. Ħallat it-trab tal-ħalib sewwa permezz ta' inverżjoni ripetuta tal-kontenitur.

8.2.   Porzjon tal-kampjun għat-test

Iżen 2,00 g ± 0,001 g tal-kampjun għat-test f'tubu taċ-ċentrifugazzjoni (6.2) jew fi flask magħluq adattat (50 ml).

Nota: Fil-każ tat-taħlitiet, iżen ammont tal-kampjun għat-test hekk li l-porzjon tal-kampjun bix-xaħam imneħħi minnu jkun jikkorrispondi għal 2,00 g.

8.3.   Tneħħija tax-xaħam u tal-proteini

8.3.1.   Żid 20,0 ml ta' misħun (b'temperatura ta' 50 °C) mal-porzjon tal-kampjun għat-test. Ħoll it-trab billi tħawdu għal ħames minuti bl-użu ta' xejker mekkaniku (6.3). Qiegħed it-tubu fil-banjumarija (6.10) u ħallih jekwilibra ruħu sa ma jilħaq temperatura ta' 25 °C

8.3.2.   F'żewġ minuti żid b'mod kostanti 10,0 ml tas-soluzzjoni ta' aċidu trikloroaċetiku (5.1) li jkollha temperatura ta' madwar 25 °C, filwaqt li tħawwad bil-qawwa bl-għajnuna ta' ħawwad manjetiku (6.4). Qiegħed it-tubu f'banjumarija (6.10) u ħallih għal 60 minuta

8.3.3.   Għaddi s-soluzzjoni mill-magna ċentrifuga (6.2) f'2 200 g għal 10 minuti, jew għaddiha minn ġo karta filtru (6.6), u armi l-ewwel 5 ml tal-filtrat.

8.4.   Determinazzjoni permezz tal-kromatografija

8.4.1.   Il-metodu tal-HPLC f'fażi inversa jeskludi l-possibbiltà li jkun hemm riżultati pożittivi foloz minħabba l-preżenza tat-trab tax-xorrox aċiduż tal-butir.

8.4.2.   Qabel titwettaq l-analiżi permezz tal-HPLC f'fażi inversa, għandhom jittejbu kemm jista' jkun il-kundizzjonijiet tal-gradjent. Għas-sistemi bi gradjent li jkollhom volum mejjet ta' madwar 6 ml (il-volum mill-punt fejn is-solventi jiltaqgħu sal-volum tal-loop tal-injettatur, b'dan inkluż), 26 minuta ± 2 minuti hu l-aħjar ħin ta' retenzjoni għas-CMPA. Għas-sistemi bi gradjent li jkollhom volum mejjet iktar baxx (pereżempju ta' 2 ml), għandhom jittieħdu 22 minuta bħala l-aħjar ħin ta' retenzjoni.

Ħu soluzzjonijiet tal-kampjuni standard (5.4) b'50 % xorrox tat-tames u mingħajru.

Injetta 100 μl ta' supernatant jew ta' filtrat (8.3.3) fit-tagħmir tal-HPLC li jkun qiegħed jaħdem bil-kundizzjonijiet tal-gradjent esploratorju mogħtija fit-Tabella 1.

Tabella 1

Il-kundizzjonijiet tal-gradjent esploratorju biex tittejjeb kemm jista' jkun il-kromatografija

Ħin (f'minuti)	Fluss (f'ml għal kull minuta)	Perċentwali A	Perċentwali B	Kurva
Ħin tal-bidu	1,0	90	10	*
27	1,0	60	40	lineari
32	1,0	10	90	lineari
37	1,0	10	90	lineari
42	1,0	90	10	lineari

Jekk wieħed iqabbel iż-żewġ kromatogrammi, wieħed għandu jsib fejn tinsab il-quċċata tas-CMPΑ.

Bl-użu tal-formula mogħtija hawn taħt, tista' tiġi kkalkulata l-kompożizzjoni inizjali tas-solvent li għandha tintuża għall-gradjent normali (ara l-punt 8.4.3): % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 1,11

fejn:

RTcmpA	:	il-ħin ta' retenzjoni tas-CMPΑ fil-gradjent esploratorju;
10	:	il-perċentwali B inizjali tal-gradjent esploratorju;
2,5	:	il-perċentwali B fil-punt tan-nofs li minnu jitnaqqas il-perċentwali B fil-punt tal-bidu fil-gradjent normali;
13,5	:	il-ħin fil-punt tan-nofs tal-gradjent esploratorju;
26	:	il-ħin meħtieġ ta' retenzjoni tas-CMPΑ;
6	:	il-proporzjon tal-pendil tal-gradjent esploratorju u tal-gradjent normali;
30	:	il-perċentwali B fil-punt tal-bidu li minnu jitnaqqas il-perċentwali B fis-27 minuta fil-gradjent esploratorju;
27	:	il-ħin tal-prova tal-gradjent esploratorju.

8.4.3.   Ħu soluzzjonijiet tal-kampjuni għat-test

Injetta 100 μl ta' supernatant jew ta' filtrat (8.3.3) imkejjel b'mod preċiż fit-tagħmir tal-HPLC li jkun qiegħed jaħdem b'rata tal-fluss ta' 1,0 ml ta' soluzzjoni tal-elwent (5.2) kull minuta.

Il-kompożizzjoni tal-elwent fil-bidu tal-analiżi tinkiseb mill-punt 8.4.2. Normalment din tkun qrib ta' A:B = 76:24 (5.2). Eżatt wara l-injezzjoni jinbeda gradjent lineari, li wara 27 minuta jispiċċa f'żieda ta' 5 % fil-perċentwali ta' B. Wara jinbeda gradjent lineari, li f'ħames minuti jġib il-kompożizzjoni tal-elwent għal 90 % ta' B. Din il-kompożizzjoni tinżamm għal ħames minuti, imbagħad, permezz ta' gradjent lineari, f'ħames minuti tinbidel għal dik tal-bidu. L-injezzjoni li jkun imiss tkun tista' ssir kwarta wara li jkunu ntlaħqu l-kundizzjonijiet tal-bidu, skont il-volum intern tas-sistema ta' ppumpjar.

Nota 1: Il-ħin ta' retenzjoni tas-CMPA għandu jkun ta' 26 minuta ± 2 minuti. Dan jista' jintlaħaq billi tvarja l-kundizzjonijiet tal-bidu u tat-tmiem tal-ewwel gradjent. Madanakollu, id-differenza fil-perċentwali B fil-kundizzjonijiet tal-bidu u fil-kundizzjonijiet tat-tmiem tal-ewwel gradjent għandha tibqa' ta' 5 % ta' B.

Nota 2: L-elwenti għandu jitneħħilhom biżżejjed gass u għandhom ukoll jinżammu nieqsa mill-gass. Dan huwa essenzjali biex is-sistema ta' ppumpjar bi gradjent taħdem sewwa. Id-devjazzjoni standard tal-ħin ta' retenzjoni tal-quċċata tas-CMPA għandha tkun ta' inqas minn 0,1 ta' minuta (n = 10).

Nota 3: Il-kampjun ta' referenza [5] għandu jiġi injettat kull ħames kampjuni u jintuża biex jiġi kkalkulat fattur ġdid tar-rispons R (9.1.1).

8.4.4.   Ir-riżultati tal-analiżi kromatografika tal-kampjun għat-test (E) jinkisbu fil-forma ta' kromatogramma li fiha l-quċċata tas-CMPA tiġi identifikata mill-ħin ta' retenzjoni tagħha ta' madwar 26 minuta.

L-integratur (6.11.6) jikkalkula awtomatikament l-għoli tal-quċċata, H, tal-quċċata tas-CMPA. F'kull kromatogramma għandu jiġi ċċekkjat fejn tinsab il-linja bażi. L-analiżi jew l-integrazzjoni għandha ssir mill-ġdid jekk il-linja bażi tkun ġiet lokalizzata ħażin.

Nota: Jekk il-quċċata tas-CMPA tkun imbiegħda biżżejjed mill-qċaċet l-oħrajn għandha tintuża l-allokazzjoni tal-linja bażi “valley-to valley”, inkella għandek tiġbed linji perpendikulari għal linja bażi komuni, li għandha tibda f'punt li jkun qrib il-quċċata tas-CMPA (u b'hekk mhux fil-ħin t = 0 minuti).Uża l-istess tip ta' integrazzjoni għall-istandard u għall-kampjuni u, jekk tuża linja bażi komuni, iċċekkja li din tkun konsistenti fl-istandard u fil-kampjuni.

Huwa essenzjali li tiġi eżaminata d-dehra ta' kull kromatogramma qabel ma ssir l-interpretazzjoni kwantitattiva sabiex tiġi identifikata kull anomalija li jista' jkun hemm minħabba xi ħsara fl-apparat jew fil-kolonna jew minħabba l-oriġini u n-natura tal-kampjun li jkun qed jiġi analizzat. F'każ ta' dubju, irrepeti l-analiżi.

8.5.   Kalibrazzjoni

8.5.1.   Applika eżatt il-proċedura deskritta fil-punti 8.2 sa 8.4.4 għall-kampjuni standard (5.4.1 sa 5.4.2). Uża soluzzjonijiet li jkunu tħejjew dak il-ħin, għaliex is-CMP jiddegradaw f'ambjent ta' 8 % ta' aċidu trikloroaċetiku f'temperatura ambjentali. F'temperatura ta' 4 °C, is-soluzzjoni tibqa' stabbli għal 24 siegħa. Fil-każ ta' xi serje twila ta' analiżi, tajjeb li jintuża tilar imberred għall-kampjuni fl-injettatur awtomatiku.

Nota: Il-punt 8.4.2. jista' jitħalla barra jekk il-perċentwali B fil-kundizzjonijiet tal-bidu jkun magħruf mill-analiżi li jkunu saru qabel.

Il-kromatogramma tal-kampjun ta' referenza [5] għandha tkun l-istess bħal dik murija fil-Figura 1. F'din il-figura, qabel il-quċċata tas-CMPA hemm żewġ qċaċet żgħar. Huwa essenzjali li tinkiseb separazzjoni simili.

8.5.2.   Qabel id-determinazzjoni tal-kampjuni permezz tal-kromatografija, injetta 100 μl tal-kampjun standard mingħajr xorrox tat-tames [0] (5.4.1)

Fil-kromatogramma ma għandux ikun hemm quċċata fil-ħin ta' retenzjoni tal-quċċata tas-CMPA.

8.5.3.   Iddetermina l-fatturi tar-rispons R billi tinjetta l-istess volum ta' filtrat (8.5.1) bħal dak użat għall-kampjuni.

9.   ESPRESSJONI TAR-RIŻULTATI

9.1.   Metodu tal-kalkolu u formuli

9.1.1.   Kalkolu tal-fattur tar-rispons R:

Il-quċċata tas-CMPA: R = W/H

fejn:

R	=	il-fattur tar-rispons tal-quċċata tas-CMPA;
H	=	l-għoli tal-quċċata tas-CMPA;
W	=	il-kwantità ta' xorrox fil-kampjun standard [5].

9.2.   Kalkolu tal-perċentwali ta' trab tax-xorrox tat-tames fil-kampjun

W(E) = R × H(E)

fejn:

W(E)	=	il-perċentwali (m/m) ta' xorrox tat-tames fil-kampjun (E);
R	=	il-fattur tar-rispons tal-quċċata tas-CMPA (9.1.1);
H(E)	=	l-għoli tal-quċċata tas-CMPA tal-kampjun (E).

Jekk il-valur ta' W(E) ikun ikbar minn 1 % u d-differenza bejn il-ħin ta' retenzjoni u dak tal-kampjun standard [5] tkun ta' inqas minn 0,2 ta' minuta, allura fil-kampjun hemm is-solidi tax-xorrox tat-tames.

9.3.   Preċiżjoni tal-proċedura

9.3.1.   Ripetibbiltà

Id-differenza bejn ir-riżultati ta' żewġ determinazzjonijiet li l-istess analista jwettaq fl-istess ħin jew wieħed wara l-ieħor malajr bl-użu tal-istess apparat fuq materjal identiku tat-testijiet, ma għandhiex taqbeż iż-0,2 % m/m.

9.3.2.   Riproduċibbiltà

Mhux stabbilita.

9.3.3.   Linearità

Minn 0 sa 16 % ta' xorrox tat-tames għandha tinkiseb relazzjoni lineari b'koeffiċjent tal-korrelazzjoni ta' > 0,99.

9.4.   Interpretazzjoni

Il-limitu ta' 1 % jinkludi l-inċertezza minħabba r-riproduċibbiltà.

Figura 1

L-istandard Ni—4.6

ANNESS VI

Metodi għall-analiżi tal-butir li jkun jinsab fil-ħżin privat

Parametru	Metodu
Xaħam (6)	L-istandard ISO 17189 jew il-parti 3 tal-istandard ISO 3727
Ilma	Il-parti 1 tal-istandard ISO 3727
Solidi bla xaħam (minbarra l-melħ)	Il-parti 2 tal-istandard ISO 3727
Melħ	L-istandard ISO 15648

ANNESS VII

Metodi għall-analiżi tat-trab tal-ħalib xkumat li jkun jinsab fil-ħżin privat

Parametru	Metodu
Xaħam	L-istandard ISO 1736
Proteina	Il-parti 1 tal-istandard ISO 8968
Ilma	L-istandard ISO 5537

ANNESS VIII

Metodi għall-analiżi tal-ġobon li jkun jinsab fil-ħżin privat

1.

Il-metodu tal-analiżi stabbilit fl-Appendiċi għandu jintuża biex ikun żgurat li l-ġobon magħmul biss mill-ħalib tan-nagħaġ, mill-ħalib tal-mogħoż jew mill-ħalib tal-buflu jew minn taħlita ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu ma jkunx fih kaseina tal-ħalib tal-baqar. Jitqies li jkun hemm il-kaseina tal-ħalib tal-baqar jekk il-kontenut tal-kaseina tal-ħalib tal-baqar fil-kampjun analizzat ikun daqs dak tal-kampjun ta' referenza li fih 1 % ta' ħalib tal-baqar, jew ikun ogħla minnu, hekk kif stabbilit fl-Appendiċi.

2.

Jistgħu jintużaw il-metodi msemmijin fil-paragrafu 1 biex tiġi nnutata l-kaseina tal-ħalib tal-baqar fil-ġobon dejjem jekk: (a) il-limitu ta' detezzjoni jkun ta' massimu ta' 0,5 %; u (b) ma jkunx hemm riżultati pożittivi foloz; u (c) il-kaseina tal-ħalib tal-baqar tkun tista' tiġi nnutata bis-sensittività meħtieġa anke wara perjodi twal ta' maturazzjoni, kif jista' jiġri fil-kundizzjonijiet kummerċjali tas-soltu. Jekk ma jkunx issodisfat xi wieħed mir-rekwiżiti msemmijin hawn fuq, għandhom jintużaw il-metodi stabbiliti fl-Appendiċi.

Appendiċi

METODU GĦAD-DETEZZJONI TAL-ĦALIB U TAL-KASEINAT TAL-BAQAR FIL-ĠOBON MAGĦMUL MILL-ĦALIB TAN-NAGĦAĠ, MILL-ĦALIB TAL-MOGĦOŻ JEW MILL-ĦALIB TAL-BUFLU JEW MINN TAĦLITA TA' ĦALIB TAN-NAGĦAĠ, TA' ĦALIB TAL-MOGĦOŻ U TA' ĦALIB TAL-BUFLU

1.   SKOP

Id-detezzjoni tal-ħalib u tal-kaseinat tal-baqar fil-ġobon magħmul mill-ħalib tan-nagħaġ, mill-ħalib tal-mogħoż jew mill-ħalib tal-buflu jew minn taħlita ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu permezz tal-iffukar iżoelettriku tal-kaseini γ wara l-plażminoliżi.

2.   KAMP TA' APPLIKAZZJONI

Il-metodu huwa adattat għad-detezzjoni sensittiva u speċifika tal-ħalib u tal-kaseinat tal-baqar, ittrattati bis-sħana jew le, f'ġobon frisk u mmaturat magħmul mill-ħalib tan-nagħaġ, mill-ħalib tal-mogħoż jew mill-ħalib tal-buflu jew minn taħlita ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu. Huwa mhuwiex adattat għad-detezzjoni tal-adulterazzjoni tal-ħalib u tal-ġobon permezz tal-konċentrati tal-proteini tax-xorrox tal-ħalib tal-baqar ittrattati bis-sħana.

3.   PRINĊIPJU TAL-METODU

3.1.   L-iżolament tal-kaseini mill-ġobon u l-istandards ta' referenza

3.2.   It-taħlil tal-kaseini iżolati u s-sottomissjoni għall-qsim permezz tal-plażmina (EC.3.4.21.7)

3.3.   Iffukar iżoelettriku tal-kaseini ttrattati bil-plażmina fil-preżenza tal-urea u t-tilwin tal-proteini

3.4.   L-evalwazzjoni tal-profili tal-kaseini γ2 u γ3 imlewna (prova tal-preżenza tal-ħalib tal-baqar) billi l-profil miksub mill-kampjun jitqabbel ma' dawk miksubin fl-istess ġell mill-istandards ta' referenza li jkun fihom 0 % u 1 % ħalib tal-baqar.

4.   REAĠENTI

Sakemm ma jkunx indikat mod ieħor, għandhom jintużaw biss sustanzi kimiċi ta' grad analitiku. L-ilma għandu jkun iddistillat darbtejn jew ikun pur b'mod ekwivalenti.

Nota: Id-dettalji li ġejjin japplikaw għall-ġellijiet tal-poliakrilammid li jitħejjew f'laboratorju u li jkun fihom l-urea, li jkunu kbar 265 mm b'125 mm b'0.25 mm. Fejn jintużaw ġellijiet ta' daqsijiet u ta' tipi oħrajn, għandu mnejn ikollhom jiġu aġġustati l-kundizzjonijiet tas-separazzjoni.

Iffukar iżoelettriku

4.1.   Reaġenti għall-produzzjoni tal-ġellijiet tal-poliakrilammid li jkun fihom l-urea

4.1.1.   Soluzzjoni ewlenija tal-ġell

Ħoll:

4,85 grammi ta' akrilammid,

0,15 grammi ta' N, N′-metilen-bis-akrilammid (BIS),

48,05 gramma ta' urea, u

15,00-il gramma ta' gliċerol (87 % w/w)

fl-ilma u żid sa 100 ml u erfa' s-soluzzjoni fi flixkun tal-ħġieġ kannella fil-friġġ.

Nota: Tista' tinxtara soluzzjoni tal-akrilammid/BIS imħallta lesta biex tintuża b'mod preferenzjali minflok il-piżijiet iffissati tal-akrilammidi newrotossiċi li qed jiġu kkwotati. Meta t-tali soluzzjoni jkun fiha 30 % w/v ta' akrilammid u 0,8 % w/v ta' BIS, għall-formulazzjoni għandu jintuża volum ta' 16,2 ml minflok il-piżijiet iffissati. Is-soluzzjoni ewlenija tibqa' stabbli għal perjodu massimu ta' għaxart ijiem; jekk din ikollha konduttività ta' aktar minn 5 μS, iddejonizzaha billi tħawwadha ma' 2 g ta' amberlit MB-3 għal 30 minuta, imbagħad għaddiha minn ġo filtru tal-membrana b'pori b'dijametru ta' 0,45 μm.

4.1.2.   Soluzzjoni tal-ġell

Ħejji soluzzjoni tal-ġell billi tħallat l-addittivi u l-amfoliti (*) mas-soluzzjoni ewlenija tal-ġell (ara l-punt 4.1.l):

9,0 ml tas-soluzzjoni ewlenija;

24 mg ta' β-alanina;

500 μl ta' amfolit b'pH ta' 3,5 sa 9,5;

250 μl ta' amfolit b'pH ta' 5 sa 7;

250 μl ta' amfolit b'pH ta' 6 sa 8.

Ħallat is-soluzzjoni tal-ġell u ħalli l-gass joħroġ minnha għal żewġ sa tliet minuti f'banju ultrasoniku jew f'vakwu.

Nota: Ħejji s-soluzzjoni tal-ġell eżatt qabel tferragħha (ara l-punt 6.2).

4.1.3.   Soluzzjonijiet tal-katalizzaturi

4.1.3.1.   N, N, N′ N′ — tetrametiletilendiammina (Temed)

4.1.3.2.   Persulfat tal-ammonju (PER) ta' 40 % w/v:

Ħoll 800 mg ta' PER fl-ilma u żid sa 2 ml.

Nota: Dejjem uża soluzzjoni tal-PER li tkun għadha kemm tħejjiet.

4.2.   Fluwidu ta' kuntatt

Kerosin jew paraffina likwida

4.3.   Soluzzjoni anodika

Ħoll 5,77 g ta' aċidu fosforiku (ta' 85 % w/w) fl-ilma u żidu bl-ilma sa ma jkollok 100 ml.

4.4.   Soluzzjoni katodika

Ħoll 2,00 g ta' idrossidu tas-sodju fl-ilma u żidu bl-ilma sa ma jkollok 100 ml.

Tħejjija tal-kampjun

4.5.   Reaġenti għall-iżolament tal-proteini

4.5.1.   Aċidu aċetiku dilwit (25,0 ml ta' aċidu aċetiku glaċjali miżjud sa 100 ml bl-ilma)

4.5.2.   Diklorometan

4.5.3.   Aċeton

4.6.   Soluzzjoni mewwieta għat-taħlil tal-proteini

Ħoll:

5,75 grammi ta' gliċerol (87 % w/w),

24,03 gramma ta' urea, u

250 milligramma ta' ditijotreitol

fl-ilma u żid sa 50 ml.

Nota: Erfa' s-soluzzjoni fil-friġġ; din tibqa' stabbli għal perjodu massimu ta' ġimgħa.

4.7.   Reaġenti għall-qsim tal-kaseini permezz tal-plażmina

4.7.1.   Soluzzjoni mewwieta tal-karbonat tal-ammonju

Ittitra għal pH 8 soluzzjoni tal-idroġenukarbonat tal-ammonju ta' 0,2 mol/l (1,58 g/100 ml ilma) li jkun fiha l-aċidu etilendiamminatetraaċetiku ta' 0,05 mol/l (l-EDTA, 1,46 g/100 ml) permezz ta' soluzzjoni tal-karbonat tal-ammonju ta' 0,2 mol/l (1,92 g/100 ml ilma) li jkun fiha 0,05 mol/l ta' EDTA.

4.7.2.   Plażmina bovina (EC.3.4.21.7), b'attività ta' mill-inqas 5 U/ml

4.7.3.   Soluzzjoni tal-aċidu aminokaprojku għall-inibizzjoni enzimatika

Ħoll 2,624 g ta' aċidu aminokaprojku (aċidu 6-amino-n-eżanojku) f'100 ml ta' etanol ta' 40 % (v/v).

4.8.   Standards

4.8.1.   L-Istitut tal-Materjali u l-Kejl ta' Referenza tal-Kummissjoni, li jinsab f'B-2440 Geel, il-Belġju, għandu għad-dispożizzjoni standards ta' referenza ċċertifikati ta' taħlita tal-ħalib xkumat tal-mogħoż u tan-nagħaġ mizjud bit-tames li fiha 0 % u 1 % ħalib tal-baqar

4.8.2.   Tħejjija tal-istandards temporanji għal-laboratorju tal-ħalib tal-buflu miżjud bit-tames li fih 0 % u 1 % ħalib tal-baqar

Il-ħalib xkumat jitħejja billi l-ħalib tal-baqar jew tal-buflu bl-ingrossa u mhux ipproċessat jingħadda għal 20 minuta minn magna ċentrifuga f'temperatura ta' 37 °C b'2 500 g. Wara li t-tubu u l-kontenut tiegħu jitberrdu malajr malajr sa ma jilħqu temperatura ta' 6 sa 8 °C, is-saff ta' fuq tax-xaħam jitneħħa kompletament. Biex jitħejja l-istandard ta' 1 % żid 5,00 ml ta' ħalib xkumat tal-baqar ma' 495 ml ta' ħalib xkumat tal-buflu f'bekk ta' litru u aġġusta l-pH għal 6,4 billi żżid l-aċidu lattiku dilwit (ta' 10 % w/v). Aġġusta t-temperatura għal 35 °C u żid 100 μl ta' tames tal-għoġol (attività tat-tames ta' 1: 10 000, jiġifieri ta' madwar 3 000 U/ml), ħawwad għal minuta u mbagħad ħalli l-bekk mgħotti għal siegħa b'fojl tal-aluminju f'temperatura ta' 35 °C sabiex tkun tista' tifforma l-baqta. Wara li tkun iffurmat il-baqta, il-ħalib kollu miżjud bit-tames jiġi lijofilizzat mingħajr ma jiġi omoġenizzat minn qabel u mingħajr ma jitneħħilu x-xorrox. Wara li jiġi lijofilizzat, jintaħan irqiq biex isir trab omoġenju. Biex jitħejja l-istandard ta' 0 %, għandha ssir l-istess proċedura bl-użu tal-ħalib xkumat pur tal-buflu. L-istandards għandhom jinħażnu f'temperatura ta' – 20 °C.

Nota: Huwa rrakkomandat li tiġi ċċekkjata l-purità tal-ħalib tal-buflu permezz tal-iffukar iżoelettriku tal-kaseini ttrattati bil-plażmina qabel jitħejjew l-istandards.

Reaġenti għat-tilwin tal-proteini

4.9.   Fissativ

Ħoll 150 gramma ta' aċidu trikloroaċetiku fl-ilma u żid sa 1 000 ml.

4.10.   Soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin

Żid l-ilma ddistillat ma' 500 ml ta' metanol u 200 ml ta' aċidu aċetiku glaċjali sa ma jkollok 2 000 ml.

Nota: Ħejji s-soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin kuljum; din tista' titħejja billi tħallat l-istess volumi tas-soluzzjonijiet ewlenin tal-metanol ta' 50 % (v/v) u tal-aċidu aċetiku glaċjali ta' 20 % (v/v).

4.11.   Soluzzjonijiet għat-tilwin

4.11.1.   Soluzzjoni għat-tilwin (is-soluzzjoni ewlenija nru 1)

Ħoll 3,0 g ta' Coomassie Brilliant Blue G-250 (C.I. 42655) f'1 000 ml ta' metanol ta' 90 % (v/v) billi tuża ħawwad manjetiku (għal madwar 45 minuta) u għaddi s-soluzzjoni minn ġo żewġ filtri mitwijin ta' veloċità medja.

4.11.2.   Soluzzjoni għat-tilwin (is-soluzzjoni ewlenija nru 2)

Ħoll 5,0 g ta' sulfat tar-ram pentaidrat f'1 000 ml ta' aċidu aċetiku ta' 20 % (v/v).

4.11.3.   Soluzzjoni għat-tilwin (is-soluzzjoni biex taħdem biha)

Ħallat flimkien 125 ml minn kull waħda mis-soluzzjonijiet ewlenin (4.11.1, 4.11.2) eżatt qabel it-tilwin.

Nota: Is-soluzzjoni għat-tilwin għandha titħejja dakinhar li tkun se tintuża.

5.   °C

5.1.   Ħġiġiet (ta' 265 mm b'125 mm b'4 mm); romblu tal-lasktu (wiesa' 15-il cm); mejda tal-livellar

5.2.   Folja fejn jitqiegħed il-ġell (ta' 265 mm b'125 mm)

5.3.   Folja li sservi ta' għata (ta' 280 mm b'125 mm). Qabbad strixxa tejp li jwaħħal (ta' 280 mm b'6 mm b'0,25 mm) ma' kull naħa twila ta' din il-folja (ara l-Figura 1)

5.4.   Kamra tal-iffukar elettriku bi pjanċa tat-tkessiħ (pereżempju ta' 265 mm b'125 mm) u provvista tal-elettriku adattata (ta' ≥ 2,5 kV) jew apparat awtomatiku tal-elettroforeżi

5.5.   Krijostatu taċ-ċirkolazzjoni, ikkontrollat b'mod termostatiku f'temperatura ta' 12-il °C ± 0,5 °C

5.6.   Magna ċentrifuga li tista' tiġi aġġustata sa 3 000 g

5.7.   Strixxi tal-elettrodi (twal ≥ 265 mm)

5.8.   Fliexken tal-plastik tat-taqtir għas-soluzzjonijiet anodiċi u katodiċi

5.9.   Applikaturi tal-kampjuni (ta' 10 mm b'5 mm, b'karta filtru tal-visk jew b'adsorbiment baxx tal-proteini)

5.10.   Dixxijiet tal-azzar inossidabbli jew tal-ħġieġ għat-tilwin u għat-tneħħija tat-tilwin (pereżempju tilari għall-għodod ta' 280 mm b'150 mm)

5.12.   Omoġenizzatur bil-vireg aġġustabbli (b'xaft b'dijametru ta' 10 mm), li jkollu spid ta' bejn 8 000 u 20 000 rotazzjoni kull minuta

5.13.   Ħawwad manjetiku

5.14.   Banju ultrasoniku

5.15.   Welder tar-riti

5.16.   Mikropipetti ta' 25 μl

5.17.   Konċentratur b'vakwu jew apparat għal-lijofilizzazzjoni

5.18.   Banjumarija kkontrollat b'mod termostatiku li jista' jiġi aġġustat għal temperatura ta' 35 °C u ta' 40 °C ± 1 °C b'xejker

5.19.   Densitometru li kapaċi jaqra f'medda tal-frekwenza ta' λ = 634 nm

6.   PROĊEDURA

6.1.   Tħejjija tal-kampjun

6.1.1.   Iżolament tal-kaseini

Iżen ammont li huwa ekwivalenti għal massa niexfa ta' 5 g ta' ġobon jew tal-istandards ta' referenza f'tubu taċ-ċentrifugazzjoni ta' 100 ml, żid 60 ml ilma ddistillat u omoġenizza l-kampjun b'omoġenizzatur bil-vireg (bi spid ta' bejn 8 000 u 10 000 rotazzjoni kull minuta). Aġġusta l-kampjun bl-aċidu aċetiku dilwit (4.5.1) biex il-pH jiġi ta' 4,6 u għaddih mill-magna ċentrifuga (fi 3 000 g għal ħames minuti). Ferra' x-xaħam u x-xorrox, omoġenizza r-residwu bi spid ta' 20 000 rotazzjoni kull minuta f'40 ml ta' ilma ddistillat aġġustat bl-aċidu aċetiku dilwit (4.5.1) biex il-pH jiġi ta' 4,5, żid 20 ml ta' diklorometan (4.5.2), erġa' omoġenizza l-kampjun u għaddih mill-magna ċentrifuga (fi 3 000 g għal ħames minuti). Neħħi bi spatula s-saff tal-kaseina li jkun qiegħed bejn il-fażi milwiema u dik organika (ara l-Figura 2) u battal iż-żewġ fażijiet. Omoġenizza mill-ġdid il-kaseina f'40 ml ta' ilma ddistillat (ara hawn fuq) u 20 ml ta' diklorometan (4.5.2) u għaddiha mill-magna ċentrifuga. Irrepeti din il-proċedura sakemm iż-żewġ fażijiet ta' estrazzjoni jitilfu l-kulur (darbtejn jew tlieta). Omoġenizza r-residwu tal-proteini b'50 ml ta' aċeton (4.5.3) u għaddih minn ġo karta filtru mitwija ta' veloċità medja. Aħsel ir-residwu fuq il-filtru b'żewġ porzjonijiet separati ta' 25 ml ta' aċeton kull darba u ħallih jinxef għall-arja jew f'kurrent tan-nitroġenu, imbagħad itħnu fin f'mehrież.

Nota: L-iżolati mnixxfin tal-kaseina għandhom jinżammu f'temperatura ta' – 20 °C.

6.1.2.   Qsim tal-kaseini β permezz tal-plażmina biex jiġu intensifikati l-kaseini γ

Xerred 25 mg tal-kaseini iżolati (6.1.1) f'0,5 ml ta' soluzzjoni mewwieta tal-karbonat tal-ammonju (4.7.1) u omoġenizza għal 20 minuta billi tuża, pereżempju, trattament ultrasoniku. Saħħan għal 40 °C u żid 10 μl ta' plażmina (4.7.2), ħallat u inkuba għal siegħa f'temperatura ta' 40 °C filwaqt li ċċaqlaq b'mod kontinwu. Biex tinibixxi l-enzima, żid 20 μl ta' soluzzjoni tal-aċidu aminokaprojku (4.7.3), imbagħad żid 200 mg ta' urea solida u 2 mg ta' ditijotreitol.

Nota: Biex il-faxex iffukati tal-kaseina jkunu iktar simmetriċi, huwa rrakkomandat li s-soluzzjoni tiġi lijofilizzata wara li jiżdied l-aċidu aminokaprojku u li mbagħad ir-residwi jinħallu f'0,5 ml ta' soluzzjoni mewwieta għat-taħlil tal-proteini (4.6).

6.2.   Tħejjija tal-ġellijiet tal-poliakrilammid li jkun fihom l-urea

Bl-għajnuna ta' ftit taqtiriet tal-ilma, irrombla l-folja fejn jitqiegħed il-ġell (5.2) għal fuq ħġieġa (5.1), filwaqt li tneħħi l-ilma żejjed b'kartaxuga jew b'tixju. Irrombla l-folja li sservi ta' għata (5.3) bis-separaturi (0,25 mm) fuq ħġieġa oħra bl-istess mod. Qiegħed il-ħġieġa b'mod orizzontali fuq mejda tal-livellar.

Żid 10 μl ta' Temed (4.1.3.1) mas-soluzzjoni tal-ġell li tkun ħejjejt u li minnha tkun neħħejt l-arja (4.1.2), ħawwadha u żid 10 μl ta' soluzzjoni tal-PER (4.1.3.2), ħallatha sewwa u ferra' s-soluzzjoni mill-ewwel b'mod unit fiċ-ċentru tal-folja li sservi ta' għata. Qiegħed naħa waħda tal-ħġieġa tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell (bin-naħa tal-folja 'l isfel) fuq il-ħġieġa tal-folja li sservi ta' għata u baxxiha bil-mod il-mod għal fuqha biex tifforma rita tal-ġell uniformi u mingħajr bżieżaq bejn il-folji (ara l-Figura 3). Niżżel b'attenzjoni l-ħġieġa tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell kompletament billi tuża spatula rqiqa u poġġilha tliet ħġiġiet oħra fuqha biex iservu ta' piż. Wara li titlesta l-polimerizzazzjoni (proċess li jieħu madwar 60 minuta), neħħi l-ġell polimerizzat għal fuq il-folja fejn jitqiegħed il-ġell flimkien mal-folja li sservi ta' għata billi tiftaħ il-ħġiġiet minn ma' xulxin. Naddaf in-naħa ta' wara tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell b'attenzjoni biex tneħħi r-residwi tal-ġell u l-urea. Iwweldja s-“sandwiċ tal-ġell” biex tifforma tubu tar-rita u erfa' dan it-tubu fil-friġġ (għal perjodu massimu ta' sitt ġimgħat).

Nota: Il-folja li sservi ta' għata bis-separaturi tista' terġa' tintuża. Il-ġell tal-poliakrilammid jista' jinqata' f'biċċiet iżgħar, li huwa rrakkomandat meta jkun hemm ftit kampjuni jew f'każ li jintuża apparat awtomatiku tal-elettroforeżi (żewġ ġellijiet ta' daqs ta' 4,5 cm b'5 cm).

6.3.   Iffukar iżoelettriku

Issettja t-termostat tat-tkessiħ f'temperatura ta' 12-il °C. Imsaħ in-naħa ta' wara tal-folja fejn jitqiegħed il-ġell bil-kerosin (4.2), imbagħad itfa' ftit taqtiriet tal-kerosin fiċ-ċentru tal-blokka tat-tkessiħ. Wara rrombla s-“sandwiċ tal-ġell” fuqha, bin-naħa fejn jitqiegħed il-ġell 'l isfel, filwaqt li toqgħod attent li tevita l-bżieżaq. Imsaħ il-kerosin żejjed li jista' jkun hemm u neħħi l-folja li sservi ta' għata. Xarrab l-istrixxi tal-elettrodi bis-soluzzjonijiet tal-elettrodi (4.3 u 4.4), aqtagħhom skont it-tul tal-ġell u poġġihom fil-pożizzjonijiet ipprovduti (f'distanza ta' 9,5 cm mill-elettrodi).

Kundizzjonijiet għall-iffukar iżoelettriku:

6.3.1.   Daqs tal-ġell ta' 265 mm b'125 mm b'0,25 mm

Stadju	Ħin (f'minuti)	Vultaġġ (f'V)	Kurrent (f'mA)	Potenza (f'W)	Sigħat volts (f'Vh)
1. Iffukar minn qabel	30	massimu 2 500	massimu 15	kostanti 4	madwar 300
2. Iffukar tal-kampjun (7)	60	massimu 2 500	massimu 15	kostanti 4	madwar 1 000
3. Iffukar finali	60	massimu 2 500	massimu 5	massimu 20	madwar 3 000
	40	massimu 2 500	massimu 6	massimu 20	madwar 3 000
	30	massimu 2 500	massimu 7	massimu 25	madwar 3 000

Nota: Jekk tinbidel il-ħxuna jew il-wisa' tal-ġellijiet, il-valuri tal-kurrent u tal-potenza għandhom jiġu aġġustati b'mod xieraq (pereżempju rdoppja l-valuri tal-kurrent elettriku u tal-potenza jekk jintuża ġell ta' 265 × 125 × 0,5 mm).

6.3.2.   Eżempju ta' programm ta' vultaġġ għall-apparat awtomatiku tal-elettroforeżi (żewġ ġellijiet ta' 5,0 cm b'4,5 cm), bl-elettrodi mingħajr strixxi applikati direttament għall-ġell.

Stadju	Vultaġġ	Kurrent	Potenza	Temperatura	Sigħat volts
1. Iffukar minn qabel	1 000 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	85 Vh
2. Iffukar tal-kampjun	250 V	5,0 mA	2,5 W	8 °C	30 Vh
3. Iffukar	1 200 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	80 Vh
4. Iffukar	1 500 V	5,0 mA	7,0 W	8 °C	570 Vh

Qiegħed l-applikatur tal-kampjuni fl-istadju 2 f'0 Vh.

Neħħi l-applikatur tal-kampjuni fl-istadju 2 f'30 Vh.

6.4.   Tilwin tal-proteini

6.4.1.   Iffissar tal-proteini

Neħħi l-istrixxi tal-elettrodi immedjatament wara li twaqqaf il-magna u poġġi l-ġell immedjatament f'dixx għat-tilwin jew għat-tneħħija tat-tilwin li jkun mimli b'200 ml ta' fissativ (4.9); ħallih hemm għal 15-il minuta, filwaqt li ċċaqalqu l-ħin kollu.

6.4.2.   Hasil u tilwin tal-ħġieġa tal-ġell

Skula kompletament il-fissativ u aħsel il-ħġieġa tal-ġell darbtejn għal 30 sekonda kull darba b'100 ml tas-soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin (4.10). Ferra' s-soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin u imla d-dixx b'250 ml ta' soluzzjoni għat-tilwin (4.11.3); ħalliha tieħu l-kulur għal 45 minuta filwaqt li ċċaqlaqha bil-mod.

6.4.3.   Tneħħija tat-tilwin mill-ħġieġa tal-ġell

Ferra' s-soluzzjoni għat-tilwin, aħsel il-ħġieġa tal-ġell darbtejn bl-użu ta' 100 ml soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin (4.10) kull darba, imbagħad ċaqlaqha b'200 ml soluzzjoni għat-tneħħija tat-tilwin għal 15-il minuta u rrepeti l-istadju tat-tneħħija tat-tilwin mill-anqas darbtejn jew tlieta sakemm l-isfond jiċċara u jkun tilef il-kulur. Imbagħad laħlaħ il-ħġieġa tal-ġell bl-ilma ddistillat (2 × 2 minuti) u ħalliha tinxef għall-arja (għal sagħtejn sa tliet sigħat) jew nixxifha b'hairdryer (għal 10 sa 15-il minuta).

Nota 1: Eżegwixxi t-twaħħil, il-ħasil, it-tilwin u t-tneħħija tat-tilwin f'temperatura ta' 20 °C. Tużax temperaturi għoljin.

Nota 2: Jekk ikun ippreferut tilwin tal-fidda aktar sensittiv (pereżempju Kit tat-Tilwin tal-Fidda, Proteini (“Silver Staining Kit, Protein”), Pharmacia Biotech, Nru tal-Kodiċi 17-1150-01), kampjuni ta' kaseina ttrattati bil-plażmina għandhom jiġu dilwiti b'5 mg/ml.

7.   EVALWAZZJONI

L-evalwazzjoni ssir billi jitqabblu l-profili tal-proteini tal-kampjun mhux magħruf mal-istandards ta' referenza dwar l-istess ġell. Id-detezzjoni tal-ħalib tal-baqar fil-ġobon mill-ħalib tan-nagħaġ, mill-ħalib tal-mogħoż u mill-ħalib tal-buflu u minn taħlitiet ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu ssir permezz tal-kaseini γ2 u γ3, li l-punti iżoelettriċi tagħhom ivarjaw bejn pH 6,5 u pH 7,5 (il-Figuri 4 a u b u l-Figura 5). Il-limitu ta' detezzjoni huwa ta' anqas minn 0,5 %.

7.1.   Stima viżwali

Għall-evalwazzjoni viżwali tal-ammont ta' ħalib bovin, huwa rrakkomandat li jiġu aġġustati l-konċentrazzjonijiet tal-kampjuni u tal-istandards biex jinkiseb l-istess livell ta' intensità tal-kaseini γ2 u γ3 ovini, kaprini u/jew tal-bufli (ara “γ2 E, G, B” u“γ3 E, G, B” fil-Figuri 4 a u b u fil-Figura 5). Wara dan, l-ammont ta' ħalib bovin (anqas, daqs jew aktar minn 1 %) fil-kampjun mhux magħruf jista' jiġi aġġudikat direttament billi l-intensità tal-kaseini γ2 u γ3 bovini (ara “γ2 C” u“γ3 C” fil-Figuri 4 a u b u fil-Figura 5) titqabbel ma' dawk tal-istandards ta' referenza ta' 0 % u ta' 1 % (nagħaġ, mogħoż) jew mal-istandards temporanji għal-laboratorju (bufli).

7.2.   Stima densitometrika

Jekk tkun disponibbli, applika d-densitometrija (5.19) għall-kejl tal-proporzjon tal-erja tal-quċċata tal-kaseini γ2 u γ3 bovini ma' dik tal-kaseini γ2 u γ3 ovini, kaprini u/jew tal-bufli (ara l-Figura 5). Qabbel dan il-valur mal-proporzjon tal-erja tal-quċċata tal-kaseini γ2 u γ3 tal-istandard ta' referenza ta' 1 % (nagħaġ, mogħoż) jew mal-istandard temporanju għal-laboratorju (bufli) analizzat fuq l-istess ġell.

Nota: Il-metodu jaħdem b'mod sodisfaċenti jekk ikun hemm sinjal pożittiv ċar għall-kaseini γ2 u γ3 bovini fl-istandard ta' referenza ta' 1 % iżda mhux fl-istandard ta' referenza ta' 0 %. Jekk le, ottimizza l-proċedura billi ssegwi bi preċiżjoni d-dettalji tal-metodu.

Kampjun jitqies li huwa pożittiv jekk il-kaseini γ2 u γ3 bovini jew il-proporzjonijiet tal-erja tal-quċċata korrispondenti jkunu daqs il-livell tal-istandard ta' referenza ta' 1 % jew akbar minnu.

8.   BIBLIJOGRAFIJA

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I., Krause I., Di Luccia A., Bocca A.,“Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins”. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L., “A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting”. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

Krause I., Berner I., Klostermeyer H.,“Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier”. Fi: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P., “Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen”. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

Radola B.J., “Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films”. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Figura 1

Tpinġija skematika tal-folja li sservi ta' għata

Figura 2

Saff ta' kaseina sospiż bejn il-fażi milwiema u dik organika wara ċ-ċentrifugazzjoni

Figura 3

It-teknika tal-“flapping” għall-ikkastjar ta' ġellijiet tal-poliakrilammid irqaq ħafna

a = it-tejp separatur (ta' 0,25 mm); b = il-folja li sservi ta' għata (5.3); c, e = il-ħġiġiet (5.1); d = soluzzjoni tal-ġell (4.1.2); f = il-folja fejn jitqiegħed il-ġell (5.2).

Figura 4a

Iffukar iżoelettriku ta' kaseini minn ħalib tan-nagħaġ u tal-mogħoż li fih ammonti differenti ta' ħalib tal-baqar, ittrattati bil-plażmina.

% CM = il-perċentwali ta' ħalib tal-baqar, C = baqar, E = nagħaġ, G = mogħoż.

Qed jintwera n-nofs ta' fuq tal-ġell IEF.

Figura 4b

Iffukar iżoelettriku tal-kaseini mill-ġobon magħmul minn taħlitiet ta' ħalib tan-nagħaġ, ta' ħalib tal-mogħoż u ta' ħalib tal-buflu li jkun fihom ammonti differenti ta' ħalib tal-baqar u li jkunu ġew ittrattati bil-plażmina.

% CM = il-perċentwali ta' ħalib tal-baqar; 1 + = kampjun li fih 1 % ta' ħalib tal-baqar u spajkjat b'kaseina bovina pura f'nofs il-linja. C = baqar, E = nagħaġ, G = mogħoż, B = bufli.

Qed tintwera d-distanza totali ta' separazzjoni tal-ġell IEF.

Figura 5

Soprapożizzjoni tad-densitogrammi tal-istandards (STD) u tal-kampjuni tal-ġobon magħmul minn taħlita ta' ħalib tan-nagħaġ u ta' ħalib tal-mogħoż wara l-iffukar iżoelettriku

a, b = standards li fihom 0 u 1 % ħalib tal-baqar; c-g = kampjuni tal-ġobon li fihom 0, 1, 2, 3 u 7 % ħalib tal-baqar. C = baqar, E = nagħaġ, G = mogħoż.

In-nofs ta' fuq tal-ġell IEF ġie skannjat b'λ = 634 nm.

ANNESS IX

Evalwazzjoni tal-analiżi

1.   Garanzija tal-kwalità

L-analiżi għandha titwettaq minn laboratorji maħtura skont l-Artikolu 12 tar-Regolament (KE) Nru 882/2004 (**) jew maħtura mill-awtoritajiet kompetenti tal-Istat Membru.

2.   Teħid tal-kampjuni u tilwim dwar ir-riżultati tal-analiżi

1.

It-teħid tal-kampjuni għandu jitwettaq skont ir-Regolament rilevanti għall-prodott inkonsiderazzjoni. Jekk ma jkunx hemm dispożizzjonijiet dwar it-teħid tal-kampjuni previsti b'mod speċifiku għal dan, għandhom jintużaw id-dispożizzjonijiet stabbiliti fl-istandard ISO 707 - “Milk and milk products – Guidance on sampling” (“Ħalib u prodotti tal-ħalib – Gwida dwar it-teħid tal-kampjuni”).

2.

Ir-rapporti tal-laboratorju dwar ir-riżultati tal-analiżi għandu jkollhom biżżejjed informazzjoni biex tkun tista' titwettaq evalwazzjoni tar-riżultati skont l-Appendiċi.

3.

Kampjuni dduplikati għandhom jittieħdu għall-analiżi meħtieġa skont ir-regoli tal-Unjoni.

4.

Jekk tinħoloq tilwima dwar ir-riżultati, l-aġenzija tal-pagamenti għandha teżiġi li l-analiżi meħtieġa dwar il-prodott inkwistjoni terġa' titwettaq, u l-ispejjeż għandhom jitħallsu mill-parti li titlef it-tilwima. L-analiżi msemmija hawn fuq għandha titwettaq bil-kundizzjoni li l-kampjuni dduplikati u ssiġillati tal-prodott ikunu disponibbli u jkunu nħażnu kif xieraq għand l-awtorità kompetenti. Il-manifattur għandu jibgħat talba lill-aġenzija tal-pagamenti biex twettaq l-analiżi fi żmien sebat jiem tax-xogħol wara n-notifika tar-riżultati tal-ewwel analiżi. L-aġenzija tal-pagamenti għandha twettaq l-analiżi fi żmien 21 jum tax-xogħol wara li tkun intlaqgħet it-talba.

5.

Ir-riżultat tal-appell għandu jkun dak definittiv.

6.

Jekk il-manifattur jista' jipprova, fi żmien ħamest ijiem tax-xogħol mit-teħid tal-kampjuni, li l-proċedura tat-teħid tal-kampjuni ma twettqitx korrettament, jekk ikun possibbli dan it-teħid tal-kampjuni għandu jiġi ripetut. Jekk it-teħid tal-kampjuni ma jistax jiġi ripetut, il-konsenja għandha tiġi aċċettata.

Appendiċi

Evalwazzjoni tal-konformità ta' konsenja mal-limitu legali

1.   Prinċipju

F'każ li l-leġiżlazzjoni dwar l-intervent pubbliku u l-ħżin privat tistabilixxi proċeduri ta' teħid tal-kampjuni, dawn il-proċeduri għandhom jiġu segwiti. Fil-każijiet l-oħra kollha għandu jintuża kampjun ta' mill-anqas tliet unitajiet ta' kampjuni meħudin b'mod aleatorju mill-konsenja mibgħuta għall-kontroll. Jista' jitħejja kampjun kompost. Ir-riżultat miksub għandu jitqabbel mal-limiti legali permezz ta' kalkolu ta' intervall ta' kunfidenza ta' 95 % ugwali għad-doppju tad-devjazzjoni standard, fejn id-devjazzjoni standard rilevanti tkun tiddependi fuq jekk (1) il-metodu jkunx ġie vvalidat fl-ambitu tal-kollaborazzjoni internazzjonali b'valuri għal σr u σR, jew (2) fil-każ ta' validazzjoni interna, tkunx ġiet ikkalkulata r-riproduċibbiltà interna. Dan l-intervall ta' kunfidenza mbagħad ikun ugwali għall-inċertezza fil-kejl tar-riżultat.

2.   Il-metodu huwa vvalidat fl-ambitu tal-kollaborazzjoni internazzjonali

F'dan il-każ id-devjazzjoni standard tar-ripetibbiltà σr u d-devjazzjoni standard tar-riproduċibbiltà σR ikunu ġew stabbiliti u l-laboratorju jkun jista' juri l-konformità mal-karatteristiċi tar-rendiment tal-metodu vvalidat.

Ikkalkula l-medja aritmetika tal-kejl ripetut n drabi.

Ikkalkula l-inċertezza tal-kejl estiża (k = 2) ta' bħala

Jekk ir-riżultat finali x tal-kejl ikun ġie kkalkulat bl-użu tal-formula tat-tip x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 jew x = y 1/y 2 f'dawn il-każijiet għandhom jiġu segwiti l-proċeduri normali għall-ikkombinar tad-devjazzjonijiet standard.

Il-konsenja titqies li ma tkunx konformi mal-limitu legali superjuri UL jekk

;

inkella titqies li tkun konformi mal-UL.

Il-konsenja titqies li ma tkunx konformi mal-limitu legali inferjuri LL jekk

;

inkella titqies li tkun konformi mal-LL.

3.   Validazzjoni interna b'kalkolu tad-devjazzjoni standard interna tar-riproduċibbiltà

F'każijiet fejn jintużaw metodi li mhumiex speċifikati f'dan ir-Regolament u fejn ma jkunux ġew stabbiliti miżuri ta' preċiżjoni, għandha titwettaq validazzjoni interna. Fil-formuli għall-kalkolu tal-inċertezza tal-kejl estiża U, minflok σr u σ R , għandhom jintużaw id-devjazzjoni standard interna tar-ripetibbiltà sir u d-devjazzjoni standard interna tar-riproduċibbiltà si R rispettivament.

Ir-regoli li għandhom jiġu segwiti biex tiġi stabbilita l-konformità mal-limitu legali huma kif stabbiliti fil-punt 1. Madanakollu, jekk il-konsenja titqies li ma tkunx konformi mal-limitu legali, il-kejl għandu jiġi ripetut bil-metodu speċifikat f'dan ir-Regolament u r-riżultat jiġi evalwat skont il-punt 1.