”BILAGA I

EGENSKAPER HOS OLIVOLJA

Kategori

Fettsyraetylestrar (FAEE) (mg/kg) (*)

Syrahalt (%) (*)

Peroxidtal (mEq O2/kg) (*)

Vaxer (mg/kg) (*)

2-glycerilmonopalmitat (%)

Stigmastadiener (mg/kg) (1)

Skillnader: ECN 42 (HPLC) och ECN 42 (2) (teoretisk beräkning)

K232 (*)

K268 eller K270 (*)

Delta-K (*)

Organoleptisk bedömning Defekternas medianvärde (Md) (*)

Organoleptisk bedömning Medianvärde för fruktighet (Mf) (*)

1. Extra jungfruolja

FAEE ≤ 40 (skördeåret 2013–2014) (3) FAEE ≤ 35 (skördeåret 2014–2015) FAEE ≤ 30 (skördeåren efter 2015)

≤ 0,8

≤ 20

≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 %

≤ 0,05

≤ |0,2|

≤ 2,50

≤ 0,22

≤ 0,01

Md = 0

Mf > 0

≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14 %

2. Jungfruolja

—

≤ 2,0

≤ 20

≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 %

≤ 0,05

≤ |0,2|

≤ 2,60

≤ 0,25

≤ 0,01

Md ≤ 3,5

Mf > 0

≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14 %

3. Bomolja

—

> 2,0

—

(4)

≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 %

≤ 0,50

≤ |0,3|

—

—

—

Md > 3,5 (5)

—

≤ 1,1 om totalhalten palmitinsyra > 14 %

4. Raffinerad olivolja

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 %

—

≤ |0,3|

—

≤ 1,10

≤ 0,16

—

—

≤ 1,1 om totalhalten palmitinsyra > 14 %

5. Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 0,9 om totalhalten palmitinsyra ≤ 14 %

—

≤ |0,3|

—

≤ 0,90

≤ 0,15

—

—

≤ 1,0 om totalhalten palmitinsyra > 14 %

6. Oraffinerad olivolja av pressrester

—

—

—

(6)

≤ 1,4

—

≤ |0,6|

—

—

—

—

—

7. Raffinerad olivolja av pressrester

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 1,4

—

≤ |0,5|

—

≤ 2,00

≤ 0,20

—

—

8. Olivolja av pressrester

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 1,2

—

≤ |0,5|

—

≤ 1,70

≤ 0,18

—

—

Kategori

Fettsyrasammansättning (7)

Totalt transolein-isomerer (%)

Totalt isomerer av translinolsyra + isomerer av translinolensyra (%)

Sterolsammansättning

Summa steroler (mg/kg)

Erytrodiol och uvaol (%) (**)

Myrsyra (%)

Linolensyra (%)

Eikosansyra (%)

Eikosensyra (%)

Behensyra (%)

Lignocerinsyra (%)

Kolesterol (%)

Brassikasterol (%)

Kampesterol (8) (%)

Stigmasterol (%)

App sitosterol (%) (9)

Delta-7-stigmastenol (8) (%)

1. Extra jungfruolja

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Kamp.

≤ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

2. Jungfruolja

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Kamp.

≤ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

3. Bomolja

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

—

≤ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5 (10)

4. Raffinerad olivolja

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Kamp.

≤ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

5. Olivolja bestående av raffinerad olivolja och jungfruolja

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< Kamp.

≤ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

6. Oraffinerad olivolja av pressrester

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

—

≤ 93,0

≤ 0,5

≥ 2 500

> 4,5 (11)

7. Raffinerad olivolja av pressrester

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Kamp.

≤ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 800

> 4,5

8. Olivolja av pressrester

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< Kamp.

≤ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 600

> 4,5

Anm:

a)	Analysresultaten ska anges med samma antal decimalers noggranhet som anges för varje egenskap. Den sista siffran ska avrundas uppåt om efterföljande siffra är högre än 4.

b)	Det räcker med att en enda av egenskaperna inte motsvarar det angivna värdet för att en olja ska klassas i en annan kategori eller förklaras ej uppfylla renhetskraven enligt denna förordning.

c)

Egenskaper markerade med asterisk (*) och som avser oljans kvalitet anger - för bomolja, att båda gränsvärdena samtidigt får skilja sig från de angivna värdena, - för jungfruoljor, att oljan måste byta kategori om ett eller flera av dessa gränsvärden inte är uppfyllt, men att den förblir klassad inom en kategori för jungfruolja.

d)	Egenskaper markerade med två asterisker (**) anger, för all olivolja av pressrester, att båda gränsvärdena samtidigt får skilja sig från de angivna värdena.

”Tillägg

Beslutsschema

Beslutsschema avseende kampesterol för jungfruolja och extra jungfruolja:

4,0 % < Kampesterol ≤ 4,5 %

Stigmasterol ≤ 1,4 %

Δ-7-stigmastenol ≤ 0,3 %

Övriga parametrar ska uppfylla de gränsvärden som fastställs i denna förordning.

Beslutsschema avseende delta-7-stigmastenol för

—	Extra jungfruolja och jungfruolja 0,5 % < Δ-7-stigmastenol ≤ 0,8 % Kampesterol ≤ 3,3 % App. β-sitosterol/ (campest + Δ7stig) ≥ 25 Stigmasterol ≤ 1,4 % Δ ECN42 ≤ |0,1|

Övriga parametrar ska uppfylla de gränsvärden som fastställs i denna förordning.

—	Olivolja av pressrester (oraffinerad och raffinerad) 0,5 < Δ -7-stigmastenol ≤ 0,7 Δ ECN42 ≤ |0,40| Stigmasterol ≤ 1,4 % Övriga parametrar inom gränsvärdena

”BILAGA Ia

PROVTAGNING AV OLIVOLJA OCH OLIVOLJA AV PRESSRESTER SOM LEVERERAS I DETALJHANDELSFÖRPACKNINGAR

Denna metod för provtagning tillämpas på partier av olivolja och olivolja av pressrester i detaljhandelsförpackningar. Olika provtagningsmetoder tillämpas beroende på om detaljhandelsförpackningen innehåller mer än 5 liter eller inte.

Med parti avses ett antal försäljningsenheter som producerats, framställts och förpackats under sådana förhållanden att oljan i var och en av dessa enheter kan anses vara homogen med avseende på samtliga analysegenskaper. Identifikationen av ett parti ska ske i enlighet med Europaparlamentets och rådets direktiv 2011/91/EU (1).

Med delprov avses den volym olja som ingår i en detaljhandelsförpackning och tas från ett slumpvis utvalt ställe i partiet.

1.   PARTIDELPROVETS INNEHÅLL

1.1.   Detaljhandelsförpackningar om högst 5 liter

Med partidelprov för detaljhandelsförpackningar om högst 5 liter avses antalet delprov som tagits från ett parti i enlighet med tabell 1.

Tabell 1

Ett partidelprov ska åtminstone omfatta följande

Om detaljhandelsförpackningen rymmer	Ska partidelprovet omfatta olja från
a) minst 1 liter	a) 1 detaljhandelsförpackning
b) mindre än 1 liter	b) det lägsta antal förpackningar som krävs för att uppnå en total volym på minst 1,0 liter

Det antal förpackningar som avses i tabell 1 och som ska utgöra ett partidelprov kan ökas av varje medlemsstat i enlighet med dess egna behov (t.ex. om en organoleptisk bedömning utförs av ett annat laboratorium än det som gjorde de kemiska analyserna, kontrollanalysen, osv.).

1.2.   Detaljhandelsförpackningar som överstiger 5 liter

Med partidelprov för detaljhandelsförpackningar som överstiger 5 liter avses en representativ del av det totala delprovet, vilken erhålls genom ett reduktionsförfarande och i enlighet med tabell 2. Partidelprovet måste bestå av flera exempel.

Med exempel av ett partidelprov avses var och en av de förpackningar som utgör partidelprovet.

Tabell 2

Minsta antalet delprover som ska väljas ut

Antal förpackningar i varje parti	Minsta antal delprover som ska väljas ut
Upp till 10	1
Fr.o.m. … 11 t.o.m. 150	2
Fr.o.m. … 151 t.o.m. 500	3
Fr.o.m. … 501 t.o.m. 1 500	4
Fr.o.m. … 1 501  t.o.m. 2 500	5
> 2 500 per 1 000 förpackningar	1 extra delprov

För att minska volymen av förpackningar homogeniseras innehållet i delproverna för beredningen av partidelprovet. De olika delproven hälls i en gemensam behållare för homogenisering genom omrörning, så att de bäst skyddas från luften.

Innehållet i partidelprovet ska hällas i flera förpackningar med en kapacitet på minst 1,0 liter som var och en utgör ett exempel av partidelprovet.

Antalet partidelprover kan ökas av varje medlemsstat i enlighet med dess egna behov (t.ex. om en organoleptisk bedömning utförs av ett annat laboratorium än det som gjorde de kemiska analyserna, kontrollanalysen, osv.).

Varje förpackning måste fyllas på ett sätt som minimerar luftlagret längst upp och sedan lämpligt förslutas och förseglas för att säkerställa att produkten är skyddad mot åverkan.

Dessa exempel ska märkas för att säkerställa en korrekt identifiering.

2.   ANALYSER OCH RESULTAT

2.1.

Varje partidelprov ska delas upp i laboratorieprover enligt punkt 2.5 i standarden EN ISO 5555 och analyseras enligt ordningsföljden i det beslutsschema som anges i bilaga Ib eller i någon annan slumpmässig ordning.

2.2.

Om samtliga analysresultat överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts, ska hela partiet förklaras överensstämma med gällande krav. Om ett enskilt analysresultat inte överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts, ska hela partiet förklaras inte överensstämma med gällande krav.

3.   KONTROLL AV VILKEN KATEGORI PARTIET TILLHÖR

3.1.

För att kontrollera vilken kategori ett parti tillhör får den behöriga myndigheten öka det antal partidelprover som tas i olika delar av partiet i enlighet med följande tabell: Tabell 3 Antal partidelprov beroende på partiets storlek Partiets storlek (liter) Antal partidelprover Färre än 7 500 2 Från 7 500 till 25 000 3 Från 25 000 till 75 000 4 Från 75 000 till 125 000 5 Från 125 000 och uppåt 6 + 1 för varje ytteligare 50 000 liter Varje delprov som utgör ett partidelprov ska tas från ett sammanhängande ställe i partiet. Det är nödvändigt att notera platsen för varje partidelprov och märka det på ett entydigt sätt. Framställningen av varje partidelprov ska utföras enligt de förfaranden som anges i punkterna 1.1 och 1.2. Varje partidelprov ska sedan underkastas de analyser som avses i artikel 2.1.

3.2.

När ett av resultaten av de analyser som avses i artikel 2.1 på minst ett partidelprov inte överensstämmer med egenskaperna för den kategori olja som uppgetts, ska hela partiet förklaras inte överensstämma med gällande krav.”

”BILAGA Ib

BESLUTSSCHEMA FÖR KONTROLL AV ATT ETT PROV AV OLIVOLJA ÖVERENSSTÄMMER MED DEN KATEGORI SOM UPPGETTS

Tabell 1

EXTRA JUNGFRUOLJA

(kvalitetskriterier)

Syrahalt %

≤ 0,8

> 0,8

Peroxidtal value mEq O2/kg

≤ 20

> 20

UV-spektrofotometri

K270 ≤ 0,22

K270 > 0,22

UV-spektrofotometri

ΔK ≤ 0,01

ΔK > 0,01

UV-spektrofotometri

K232 ≤ 2,50

K232 > 2,50

Organoleptisk bedömning

medianvärde fruktighet > 0

och

medianvärde defekter=0

medianv. frukt. = 0

medianv. frukt. > 0

och

medianv. defekter > 0

Etylestrar*

ja

nej

Kvalitetskriterierna motsvarar den kategori som uppgetts.

Gå till tabell 3. (renhetskriterier)

Oljan överensstämmer inte med den kategori som uppgetts.

(a)

Oljan överensstämmer inte med den kategori som uppgetts.

(b)

* ≤ 40 mg/kg 2013/2014

≤ 35 mg/kg 2014/2015

≤ 30 mg/kg från skördeåret 2015/2016

Tabell 2

Jungfruolja

(kvalitetskriterier)

Syrahalt %

≤ 2,0

> 2,0

Peroxidtal mEq O2/kg

≤ 20

> 20

UV-spektrofotometri

K270 ≤ 0,25

K270 > 0,25

UV-spektrofotometri

Δ K ≤ 0,01

Δ K > 0,01

UV-spektrofotometri

K232 ≤ 2,60

K232 > 2,60

Organoleptisk bedömning

Medianv. fruktigh. > 0

och

medianv. defekter ≤ 3,5

Medianv. fruktigh. = 0

eller

medianv. fruktigh. > 0

medianv. defekter > 3,5

Uppfyller värdena för ovanstående parametrar kvalitetskriterierna för extra jungfruolja?

(tabell 1)

NEJ

JA

Kvalitetskriterierna motsvarar den kategori som uppgetts.

Gå till tabell 3 (renhetskriterier)

Oljan överensstämmer inte med den kategori som uppgetts

(a)

Oljan överensstämmer inte med den kategori som uppgetts

(b)

Tabell 3

Extra jungfruolja och jungfruolja

(renhetskriterier)

Kvalitetskriterier (tabellerna 1 och 2)

JA

NEJ

3,5-Stigmastadiener mg/kg

≤ 0,05

> 0,05

Transiomerer av fettsyror (%)

tC18:1 ≤ 0,05

t(C18:2 + C18:3) ≤ 0,05

tC18:1 > 0,05

t(C18:2 + C18:3) > 0,05

Fettsyrahalt

JA

NEJ

Δ ECN42

≤ |0,2|

> |0,2|

Steroler: sammansättning och totalhalt

JA

NEJ

Erytrodiol + uvaol (%)

≤ 2,0

2,0 > E+U ≤ 4,5

> 4,5

Vaxer1 mg/kg

≤ 150

> 150

Olivoljan överensstämmer med den kategori som uppgetts

Oljan överensstämmer inte med den kategori som uppgetts

Oljan överensstämmer inte med den kategori som uppgetts

(a)

Oljan överensstämmer inte med den kategori som uppgetts

Oljan överensstämmer inte med den kategori som uppgetts

(b)

1C42+C44+C46

”Tillägg 1

Jämförelsetabell mellan bilagorna till denna förordning och de analyser som avses i beslutsschemat

— Syrahalt	Bilaga II	Bestämning av fria fettsyror, metod vid låg temperatur
— Peroxidtal	Bilaga III	Bestämning av peroxidtalet
— UV-spektrofotometri	Bilaga IX	Spektrofotometrisk analys
— Organoleptisk bedömning	Bilaga XII	Organoleptisk bedömning av jungfruolja
— Etylestrar	Bilaga XX	Metod för bestämning av halten av vaxer, fettsyrametylestrar och fettsyraetylestrar med kapillärgaskromatografi
— 3,5-stigmastadiener	Bilaga XVII	Metod för bestämning av stigmastadiener i vegetabiliska oljor
— Transisomerer av fettsyror	BILAGA X A och	Analys av metylestrar av fettsyror med gaskromatografi
	BILAGA X B	Beredning av metylestrar av fettsyror
— Fettsyrahalt	BILAGA X A och	Analys av metylestrar av fettsyror med gaskromatografi
	BILAGA X B	Beredning av metylestrar av fettsyror
— ΔECN42	Bilaga XVIII	Bestämning av triglyceridsammansättningen i ECN 42 (skillnad mellan HPLC-data och teoretisk halt)
— Steroler: sammansättning och totalhalt — Erytrodiol och uvaol	Bilaga V	Bestämning av sammansättningen och halten av steroler och triterpendialkoholer genom gaskromatografi med kapillärkolonn
— Vaxer	Bilaga IV	Bestämning av vaxhalten genom gaskromatografi med kapillärkolonn
— Alifatiska alkoholer	Bilaga XIX	Bestämning av halten alifatiska alkoholer genom gaskromatografi med kapillärkolonn
— Mättade fettsyror i 2-ställning	Bilaga VII	Bestämning av procentandelen 2-glycerylmonopalmitat

”BILAGA V

BESTÄMNING AV SAMMANSÄTTNINGEN OCH HALTEN AV STEROLER OCH TRITERPENDIALKOHOLER GENOM GASKROMATOGRAFI MED KAPILLÄRKOLONN

1.   SYFTE

Metoden avser bestämning av de enskilda och totala sterol- och triterpendialkoholhalterna hos olivolja och olivolja av pressrester.

2.   PRINCIP

Olja med tillsats av α-kolestanol som intern standard, förtvålas med kaliumhydroxid i etanollösning och de oförtvålbara ämnena extraheras sedan med etyleter.

Sterol- och triterpendialkoholfraktionen separeras från de oförtvålbara ämnena genom tunnskiktskromatografi på en basisk kiselgelplatta. De fraktioner som återvunnits från kiselgelen överförs till trimetylsilyletrar och analyseras genom gaskromatografi med kapillärkolonn.

3.   UTRUSTNING

Sedvanlig laboratorieutrustning, i synnerhet följande:

3.1.	250 ml kolv försedd med återflödeskylare med slipade anslutningsfogar.

3.2.	500 ml separertratt.

3.3.	250 ml kolvar.

3.4.	Komplett apparatur för tunnskiktskromatografi med 20 × 20 cm glasplattor.

3.5.	UV-lampa: 254 eller 366 nm.

3.6.	Mikrosprutor, 100 och 500 μl.

3.7.	En cylindrisk filtrertratt med poröst membran G 3 (porositet 15–40 μm) och med en diameter på ca 2 cm, ett djup på 5 cm som passar för vakuumfiltrering, med hanslipning.

3.8.	50 ml vakuum-E-kolv med slipad glashals som kan användas för filtrertratten (punkt 3.7).

3.9.	10 ml provrör med konisk botten och glaspropp.

3.10.

Gaskromatograf lämpad för användning med kapillärkolonn med splitinjektion, bestående av 3.10.1. termostatstyrd kolonnugn som kan hålla den önskade temperaturen med en noggrannhet av ± 1°C, 3.10.2. injektor med inställbar temperatur och försedd med ett förångningselement av glas med silaniserad yta och splitsystem, 3.10.3. Flamjoniseringsdetektor. 3.10.4. System för datainsamling lämpligt för användning tillsammans med flamjoniseringsdetektorn (punkt 3.10.3.) som kan ställas in på manuell integration.

3.11.

Kapillärkolonn med kiseldioxid med en längd på 20 till 30 meter, innerdiameter 0,25 till 0,32 mm, belagd med 5 % difenyl - 95 % dimetylpolysiloxan (SE-52 eller SE-54 stationär fas eller motsvarande), med en enhetlig filmtjocklek mellan 0,10 och 0,30 μm.

3.12.

Mikrospruta på 10 μl, för gaskromatografi, med härdad nål lämplig för splitinjektion.

3.13.

Exsickator med kalciumklorid.

4.   REAGENS

4.1.

Kaliumhydroxid, minst 85 %.

4.2.

Kaliumhydroxid, circa 2 N, i etanol. Lös 130 g kaliumhydroxid (punkt 4.1) under kylning i 200 ml destillerat vatten och späd sedan till 1 liter med etanol (punkt 4.10). Förvara lösningen i väl tillslutna, mörka flaskor som lagras i högst två dagar.

4.3.

Etyleter, av analyskvalitet.

4.4.

Kaliumhydroxid, circa 0,2 N, i etanol. Lös 13 g kaliumhydroxid (punkt 4.1) i 20 ml destillerat vatten och späd till 1 liter med etanol (punkt 4.10).

4.5.

Vattenfritt natriumsulfat, av analyskvalitet.

4.6.

Glasplattor (20 × 20 cm) täckta med kiselgel utan flouresceinsindikator, tjocklek 0,25 mm (finns i handeln färdiga för användning).

4.7.

Toluen, av kromatografisk kvalitet.

4.8.

Aceton, av kromatografisk kvalitet.

4.9.

n-Hexan, av kromatografisk kvalitet.

4.10.

Etyleter, av kromatografisk kvalitet.

4.11.

Etanol av analytisk kvalitet.

4.12.

Etylacetat av analytisk kvalitet.

4.13.

Referenslösning för tunnskiktskromatografi: kolesterol eller fytosterol, och Erytrodiol 5 % lösning i etylacetat (punkt 4.11).

4.14.

2,7-diklorflourecein, 0,2 %, i etanollösning. Denna görs lätt basisk genom att tillsätta ett par droppar 2 N alkoholisk kaliumhydroxidlösning (punkt 4.2).

4.15.

Vattenfri pyridin, av kromatografisk kvalitet (se Anmärkning 5).

4.16.

Hexametyldisilasan av analyskvalitet.

4.17.

Trimetylklorosilan av analyskvalitet.

4.18.

Provlösningar av steroltrimetylsilyletrar. Bereds omedelbart före användning av steroler och erytrodiol som erhållits från oljor som innehåller dem.

4.19.

α-Kolestanol, renhet över 99 % (renheten måste kontrolleras genom analys med gaskromatografi)

4.20.

α-kolestanol som intern standard, 0,2 % lösning (m/V) i etylacetat (punkt 4.11).

4.21.

Fenolftaleinlösning, 10 g/l i etanol (punkt 4.10).

4.22.

Bärgas: väte eller helium, av gaskromatografisk kvalitet.

4.23.

Hjälpgaser: väte, helium, kväve och luft, av gaskromatografisk kvalitet.

4.24.

n-Hexan (punkt 4.9)/etyleter (punkt 4.10): blandning 65:35 (V/V).

4.25.

Silyleringsreagens, bestående av en blandning 9:3:1 (V/V/V) av pyridin/hexametyldisilasan/trimetylklorosilan.

5.   UTFÖRANDE

5.1.   Beredning av oförtvålbara ämnen

5.1.1.   Med hjälp av en 500 μl mikrospruta (punkt 3.6) införs i 250 ml kolven (punkt 3.1) en volym α-kolestanol som intern standard (punkt 4.20) innehållande en mängd kolestanol motsvarande ca 10 % av sterolhalten i provet. Exempelvis tillsätts 500 μl α-kolestanollösning (punkt 4.20) per 5 g prov när det gäller olivolja och 1 500 μl för olivolja av pressrester. Indunsta till torrhet under en försiktig ström av kväve i ett varmt vattenbad. Kyl kolven. Väg upp 5±0,01 g torrt filtrerat prov i kolven.

Anmärkning 1:

Animaliska eller vegetabiliska oljor och fetter som innehåller betydande kvantiteter av kolesterol kan visa en topp med en retentionstid som är nära den för kolestanol. Om detta inträffar måste sterolfraktionen analyseras dubbelt med och utan intern standard.

5.1.2.   Tillsätt 50 ml 2 N kaliumhydroxid i etanollösning (punkt 4.2) och lite pimpsten. Sätt på återflödeskylaren och värm till svag kokning tills förtvålning inträder (lösningen blir klar). Fortsätt upphettningen under ytterligare 20 minuter, och tillsätt sedan 50 ml destillerat vatten från toppen av återflödeskylaren. Ta bort kylaren och kyl kolven till ca 30 °C.

5.1.3.   Överför kolvens innehåll kvantitativt till en 500 ml separertratt (punkt 3.2) genom att använda flera portioner destillerat vatten (50 ml). Tillsätt cirka 80 ml etyleter (punkt 4.10). Skaka omsorgsfullt i ungefär 60 sekunder och frigör regelbundet trycket genom att vända upp och ned på separertratten och öppna avstängningsventilen. Låt stå tills de två faserna har separerats fullständigt (Anmärkning 2).

Överför därefter tvållösningen så fullständigt som möjligt i en annan separertratt. Genomför ytterligare två extraheringar av vatten-alkoholfasen på samma sätt med användande av 60–70 ml etyleter (punkt 4.10).

Anmärkning 2: Eventuell emulsion kan förstöras genom tillsats av små kvantiteter etanol (punkt 4.11).

5.1.4.   Samla de tre eterextrakten i en separertratt som innehåller 50 ml vatten. Fortsätt att tvätta med vatten (50 ml) till dess att tvättvattnet inte längre ger en rosa färg vid tillsättning av en droppe fenolftaleinlösning (punkt 4.21).

När tvättvattnet har avlägsnats, filtrera på vattenfritt natirumsulfat (punkt 4.5) ner i en i förväg vägd 250 ml kolv, och tvätta därefter tratten och filtret med små mängder etyleter (punkt 4.10).

5.1.5.   Låt lösningsmedlet avdunsta genom destillation i rotationsindunstare vid 30 °C under vakuum. Tillsätt 5 ml aceton och avlägsna det flyktiga lösningsmedlet helt i en svag luftström. Torka återstoden i torkskåp vid 103 ± 2 °C i 15 minuter. Kyl i exsickator och väg med 0,1 mg noggrannhet.

5.2.   Separation av sterol- och triterpendialkoholfraktionen (erytrodiol + uvaol)

5.2.1.   Beredning av de basiska plattorna för tunnskiktskromatografi. Sänk ner kiselgelplattorna (punkt 4.6) circa 4 cm i 0,2 N kaliumhydroxidetanollösning (punkt 4.5) i 10 sekunder och låt sedan torka i dragskåp i två timmar varefter de placeras i ett torkskåp vid 100 °C i en timme.

Ta ut plattorna från torkskåpet och förvara dem i en exsickator (punkt 3.13) med kalciumklorid tills de ska användas (plattor som behandlas på detta sätt måste användas inom 15 dagar).

Anmärkning 3:

Om kiselelplattor används för att separera sterolfraktionen behöver inte de oförtvålbara fraktionerna behandlas med aluminumoxid. På det här sättet kan alla sura föreningar (fettsyror och andra) behållas på identifieringslinjen och sterolbandet separeras klart från de alifatiska alkoholernas och triterpenalkoholernas band.

5.2.2.   Fyll på n-hexan/etyleterblandningen (punkt 4.24) (Anmärkning 4) i framkallningskammaren till ett djup av circa 1 cm. Stäng kammaren med tillhörande lock och låt stå svalt ca en halvtimme så att jämnvikten vätska/gas inställer sig. Remsor av filtrerpapper som doppas ner i eluenten kan placeras på insidorna av kammaren. Detta minskar framkallningstiden med ca en tredjedel och åstadkommer en jämnare eluering av komponenterna.

Anmärkning 4:

Framkallningsblandningen ska bytas för varje test för att få exakt reproducerbara elueringsförhållanden. En blandning av 50:50 (V/V) av n-hexan/etyleter kan också användas.

5.2.3.   Förbered en circa 5 % lösning av de oförtvålbara ämnena (punkt 5.1.5) i etylacetat (punkt 4.12) och stryk ut med 100 μl mikrosprutan 0,3 ml av lösningen smalt och jämnt på den nedre delen (2 cm) av kromatografiplattan. Placera i linje med strykningen 2 till 3 μl av referenslösningen (4.13) så att sterol- och triterpendialkoholbandet kan identifieras efter framkallning.

5.2.4.   Placera plattan i framkallningskammaren som iordningställts enligt punkt 5.2.2. Rumstemperaturen ska hållas mellan 15 och 20 °C (Anmärkning 5). Stäng kammaren omedelbart med locket och påbörja elueringen tills lösningsmedlets främre kant når till ca 1 cm från övre änden av plattan. Ta ut plattan ur framkallningskammaren och låt lösningsmedlet avdunsta i en ström av varmluft eller genom att plattan får ligga en kort stund i dragskåp.

Anmärkning 5: Högre temperatur kan försämra separationen.

5.2.5.   Spraya plattan lätt och jämnt med 2,7-diklorfloureceinlösningen (punkt 4.14) och låt torka. När plattan betraktas i ultraviolett ljus kan sterol- och triterpendialkoholbanden identifieras genom att de ligger i höjd med fläckarna som erhållits från referenslösningen (punkt 4.13). Markera änden av banden längs kanterna av flouroscensen med svart blyerts (se TLC-platta, figur 3).

5.2.6.   Skrapa med hjälp av en metallspatel bort kiselgelen från det markerade området. Placera det finfördelade materialet som tagits bort i filtrertratten (punkt 3.7). Tillsätt 10 ml het etylacetat (punkt 4.12), blanda omsorgsfullt med metallspateln under vakuum och filtrera i E-kolven (punkt 3.8) som är ansluten till filtrertratten.

Tvätta återstoden i kolven tre gånger med etyleter (punkt 4.3) (circa 10 ml varje gång) och samla upp filtratet i samma kolv som är ansluten till filtrertratten, Indunsta filtratet till en volym på 4–5 ml och överför resterande lösning till det tidigare vägda 10 ml provröret (punkt 3.9), låt indunsta fullständigt under lätt uppvärmning, i svagt kväveflöde, fyll på nytt genom att använda några droppar aceton (punkt 4.8) och indunsta till torrhet.

Återstoden i provröret består av sterol- och triterpendialkoholfraktionerna.

5.3.   Preparering av trimetylsilyletrarna

5.3.1.   Tillsätt silyleringsreagensen (punkt 4.25) (Anmärkning 6), i förhållandet 50 μl för varje mg steroler och triterpendialkoholer, i provröret som innehåller sterol- och triterpenfraktionen. Undvik upptag av fuktighet (Anmärkning 7).

Anmärkning 6:

Lösningar som är klara för användning finns i handeln. Andra silyleringsreagensen, såsom bistrimethylsilyltrifluoracetamid + 1 % trimetylklorosilan, som måste spädas med lika stor volym vattenfri pyridin finns också i handeln.

Pyridinet kan ersättas med samma mängd acetonitril.

5.3.2.   Sätt proppen i provröret, skaka försiktigt (utan att vända på det) tills föreningarna är helt lösta. Låt stå i minst 15 minuter i rumstemperatur och centrifugera sedan i ett par minuter. Den klara lösningen är nu färdig för analys med gaskromatografi.

Anmärkning 7:

Eventuell bildning av en svag opalescens är normal och inverkar inte. Bildandet av en vit flockning eller rosafärgning är tecken på närvaro av fukt och sönderfall hos reagensen. Om detta inträffar ska testet upprepas (endast om hexametyldisilazan/trimetylklorsilan används).

5.4.   Analys med gaskromatografi

5.4.1.   Förberedelser, iordningställande av kapillärkolonn.

5.4.1.1.

Montera kolonnen (punkt 3.11) i gaskromatografen genom att kolonnens inlopp ansluts till splitinjektorn och kolonnens utlopp till detektorn. En allmän kontroll av gaskromatografen genomförs (gasanslutningarna ska vara täta, detektorn i fullgott skick, splitsystem och registreringssystem fungerarande etc).

5.4.1.2.

Om kolonnen används för första gången rekommenderas det att den först prepareras: En liten mängd gas får flyta genom kolonnen och sedan kopplas gaskromatografen på och en gradvis upphettning genomförs tills temperaturen är minst 20 °C över drifttemperaturen (Anmärkning 8). Denna temperatur bibehålls i minst två timmar och sedan ställs kromatografen iordning för driftförhållanden (inställning av gasflöde och splittning, tändning av flamman, anslutning till databehandlingssystemet, inställning av temperaturen i kolonnen, detektorn och injektorn), och registrera signalen med en känslighet som är minst två gånger högre än den som beräknas för analysen. Baslinjen ska vara linjär, utan några toppar av något slag, och får inte visa tecken på drift. Negativ rak drift av linjen är tecken på otäta kolonnanslutningar, medan en positivt drift tyder på otillräcklig preparering av kolonnen. Anmärkning 8: Temperaturen vid prepareringen ska vara minst 20 °C lägre än den maximitemperatur som specificeras för den stationära fas som används.

5.4.2.   5.4.2 Val av analysparametrar.

5.4.2.1.

Analysparametrarna väljs enligt följande: — Kolonntemperatur: 260 ± 5 °C. — Injektortemperatur: 280–300 °C. — Detektortemperatur: 280–300 °C. — Linjär hastighet för bärgasen: helium 20–35 cm/s, väte 30–50 cm/s. — Splitförhållande 1:50–1:100. — Instrumentets känslighet: 4–16 gånger högre än minimikänsligheten. — Registreringskänslighet: 1–2 mV fullt skalutslag. — Kvantitet av det injicerade ämnet: 0,5–1 μl TMSE-lösning. Dessa parametrar kan ändras beroende på egenskaperna hos kolonnen och gaskromatografen för att få kromatogram som uppfyller följande krav: — Retentionstiden för ß-sitosteroltoppen bör vara 20 ± 5 minuter. — Kampesteroltoppen bör vara följande: för olivolja (medelhalt 3 %) 20 ± 5 % av fullt utslag, för sojaolja (medelhalt 20 %) 80 ± 10 % av fullt utslag. — Alla närvarande steroler måste separeras. Förutom att separeras måste alla toppar vara helt och hållet synliga, dvs varje toppkurva ska återvända till baslinjen innan nästa topp ritas. Ofullständig upplösning kan emellertid tolereras under förutsättning att toppen vid RRT 1,02 (sitostanol) kan kvantifieras med hjälp av topphöjden.

5.4.3.   Analysförfarande

5.4.3.1.

Sug med hjälp av en 10 μl mikrospruta upp 1 μl hexan, sug in 0,5 μl luft och sedan 0,5–1 μl av provlösningen. Dra ut kolven ur sprutan ytterligare så att kanylen töms. Stick in kanylen genom membranet i injektorn och spruta snabbt efter en till två sekunder in innehållet och drag sedan sakta ut kanylen efter ca fem sekunder. En automatisk injektor kan även användas.

5.4.3.2.

Genomför registreringen tills de närvarande triterpendialkoholernas TMSE har eluerats fullständigt. Baslinjen måste fortsätta att uppfylla kraven (punkt 5.4.1.2).

5.4.4.   Identifiering av toppar

Identifiera individuella toppar på grundval av retentionstiderna och genom jämförelse med blandningen av sterol- och triterpendialkohol-TMSE, som analyseras med samma parametrar (se tillägget).

Sterolerna och triterpendialkoholerna elueras i följande ordning: kolesterol, brassikasterol, ergosterol, 24-metylenkolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, erytrodiol och uvaol.

Retentionstiderna för sitosterol för SE-52- och SE-54-kolonner framgår av tabell 1.

Figurerna 1 och 2 visar typiska kromatogram för en del oljor.

5.4.5.   Kvantitativ utvärdering

5.4.5.1.

Beräkna areorna för α-kolestanol- och sterol- och triterpendialkoholtopparna med hjälp av databehandlingssystemet. Bortse från toppar för föreningar som inte finns med (ergosterol ska inte beräknas) bland de som är upptagna i tabell 1. Responsen för α-kolestanol ska vara lika med 1.

5.4.5.2.

Beräkna koncentrationen för varje sterol i mg/100 g fett enligt följande: där Ax = arean av sterol x, enligt beräkning av databehandlingssystemet As = arean av toppen för α-kolestanol, enligt beräkning av databehandlingssystemet ms = massan av tillsatt α-kolestanol i milligram m = massan av det prov som använts för bestämningen, i gram.

6.   RESULTAT

6.1.

Ange de enskilda sterolkoncentrationerna i milligram per 100 g fett och summan av dem som "summan av sterolerna". Sammansättningen av var och en av de enskilda sterolerna och av erytrodiol och uvaol bör uttryckas med en decimals noggrannhet. Sammansättningen av summan av sterolerna ska anges utan decimal.

6.2.

Beräkna procentandelen av varje enskild sterol som förhållandet mellan arean av den aktuella toppen och summan av areorna av topparna för sterolerna och erytrodiol och uvaol: där: Ax = topparea för x ΣA = total topparea för sterolerna

6.3.

Apparent β-sitosterol: Δ5-23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4.

Beräkna den procentuella andelen erytrodiol och uvaol: där ΣA = summan av areorna för sterol enligt beräkning av databehandlingssystemet Er = arean för erytrodiol enligt beräkning av databehandlingssystemet Uv = arean för uvaol enligt beräkning av databehandlingssystemet

”Tillägg

Bestämning av den linjära hastigheten hos gasen

Spruta in 1–3 μl metan (eller propan) i gaskromatografen under vanliga ???analysparametrar??? och mät den tid det tar för gasen att passera kolonnen från insprutningsögonblicket till den tidpunkt då toppen framträder (tM).

Den linjära hastigheten i cm/s erhålls genom L/tM där L är kolonnens längd i cm och tM är den uppmätta tiden i sekunder.

Tabell 1

Relativa retentionstiden för steroler

Topp	Identifiering		Relativ retentionstid
			SE 54 kolumn	SE 52 kolumn
1	Kolesterol	Δ-5-kolesten-3ß-ol	0,67	0,63
2	Kolestanol	5α-kolestan-3ß-ol	0,68	0,64
3	Brassikasterol	[24S]-24-metyl-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol	0,73	0,71
*	Ergosterol	[24S] 24 metyl Δ5-7-22 kolestatrien 3ß-ol	0,78	0,76
4	24-metylenkolesterol	24-metylen-Δ-5,24-kolestadien-3ß-o1	0,82	0,80
5	Kampesterol	[24R]-24-metyl-Δ-5-kolesten-3ß-ol	0,83	0,81
6	Kampestanol	[24R]-24-metylkolestan-3ß-ol	0,85	0,82
7	Stigmasterol	[24S]-24-etyl-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol	0,88	0,87
8	Δ-7-kampesterol	[24R]-24-metyl-Δ-7-kolesten-3ß-ol	0,93	0,92
9	Δ-5,23-stigmastadienol	[24R,S]-24-etyl-Δ-5,23-koIestadien-3ß-ol	0,95	0,95
10	Klerosterol	[24S]-24-etyl-Δ-5,25-kolestadien-3ß-ol	0,96	0,96
11	ß-sitosterol	[24R]-24-etyl-Δ-5-kolesten-3ß-ol	1,00	1,00
12	Sitostanol	24-etyl-kolestan-3ß-ol	1,02	1,02
13	Δ-5-avenasterol	[24Z]-24-etyliden-Δ-5-kolesten-3ß-ol	1,03	1,03
14	Δ-5-24-stigmastadienol	[24R,S]-24-etyl-Δ-5,24-kolestadien-3ß-ol	1,08	1,08
15	Δ-7-stigmastenol	[24R,S]-24-etyl-Δ-7-kolesten-3ß-ol	1,12	1,12
16	Δ-7-avenasterol	[24Z]-24-etyliden-Δ-7-kolesten-3ß-ol	1,16	1,16
17	Erytrodiol	5α olean-12en-3ß28-diol	1,41	1,41
18	Uvaol	Δ12-ursen-3ß28-diol	1,52	1,52

Figur 1

Gaskromatogram för sterol- och triterpendialkoholfranktionen av raffinerad olivolja (som tillsatts intern standard)

Figur 2

Gaskromatogram för sterol- och triterpendialkoholfranktionen av en bomolja (som tillsatts intern standard)

Figur 3

TLC-platta av olivolja av pressrester med det område som måste skrapas för att bestämma förekomsten av steroler och triterpendialkoholer

1 –

Skvalen

2 –	Triterpenalkoholer och alifatiska alkoholer

3 –	Steroler och triterpendialkoholer

4 –	???Start??? och fria fettsyror

”BILAGA XII

INTERNATIONELLA OLIVOLJERÅDETS METOD FÖR ORGANOLEPTISK BEDÖMNING AV JUNGFRUOLJA

1.   SYFTE OCH TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Avsikten med denna internationella metod är att fastställa ett förfarande för att bedöma organoleptiska egenskaper hos jungfruolja i enlighet med punkt 1 i bilaga XVI till förordning (EG) nr 1234/2007 och en metod för att klassificera jungfruolja på grundval av dessa egenskaper. Metoden innehåller dessutom anvisningar för en frivillig märkning.

Den angivna metoden är bara tillämplig på jungfruoljor och deras klassificering eller märkning med avseende på hur intensiva de uppfattade defekterna är och med avseende på fruktighet och övriga positiva egenskaper, vilket fastställs av en utvald grupp utbildade provsmakare, som utgör en panel.

Metoden innehåller dessutom anvisningar för en frivillig märkning.

Den senaste tillgängliga versionen av Olivoljerådets standarder, som nämns i denna bilaga.

2.   ALLMÄN GRUNDLÄGGANDE TERMINOLOGI FÖR SENSORISK ANALYS

Se standard IOC/T.20/Doc. Nr 4 ”Sensorisk analys: Allmän grundläggande terminologi”

3.   SÄRSKILD TERMINOLOGI

3.1.   Negativa egenskaper

Unken/Gyttjig fällning Karakteristisk doft och smak hos olja från oliver som lagts på hög eller lagrats under sådana förhållanden att de är i långt framskriden anaerob jäsning, eller hos olja som varit i kontakt med ”gyttjig” fällning i fat eller tankar och som också har genomgått en process av anaerob jäsning.

Möglig - fuktig - jordig Karaktäristisk doft och smak hos oljor som framställts av frukt där svamp och jäst har utvecklats, beroende på att de lagrats under fuktiga förhållanden i flera dagar eller av olja som framställts av oliver som har samlats in utan att jord eller gyttja tvättats bort.

Vin–vinäger–sur–syrlig Karaktäristisk doft och smak hos vissa oljor som påminner om vin eller vinäger. Detta beror i första hand på en process av anaerob jäsning i oliverna eller i rester av olivmassa i mattor som inte har rengjorts ordentligt, som leder till att det bildas ättiksyra, etylacetat och etanol.

Härsken Doft och smak hos oljor som har genomgått en intensiv oxideringsprocess.

Frostskadade oliver (fuktigt trä) Karaktäristisk doft och smak hos oljor som framställts av oliver som har utsatts för frost på trädet.

3.2.   Andra negativa egenskaper

Värmd eller Karakteristisk doft och smak hos oljor, som orsakats av för hög eller för långvarig uppvärmning.

Bränd Uppvärmning under bearbetningen, i synnerhet när massan blandas termiskt, om detta sker under olämpliga förhållanden.

Hö–trä Karaktäristisk doft och smak hos vissa oljor som framställts av oliver som har torkats.

Rå: En tjock, degliknande förnimmelse i munnen som vissa gamla oljor kan ge.

Fet Doft och smak av olja som påminner om dieselolja, fett eller mineralolja.

Växtvatten Doft och smak som uppstått på grund av längre kontakt med växtvatten som har genomgått en jäsningsprocess.

Saltlake Doft och smak av olja som framställts av oliver som konserverats i saltlösning.

Metallisk Doft och smak som påminner om metall. Den är karaktäristisk för oljor som har varit i längre kontakt med metalliska ytor under krossning, blandning, pressning eller förvaring.

Esparto Karakteristisk doft och smak hos olja som framställts av oliver som pressats i nya espartomattor. Doften och smaken kan variera beroende på om mattorna är tillverkade av färskt eller torkat espartogräs.

Maskig Doft och smak av olja som framställts av oliver som har varit utsatta för kraftiga attacker av larver från olivflugan (Bactrocera Oleae).

Gurka Doft och smak som uppstår när en olja är hermetiskt förpackad under alltför lång tid, särskilt i bleckbehållare, och som anses bero på att 2,6 nonadienal bildats.

3.3.   Positiva egenskaper

Fruktig Uppsättning olfaktoriska smaksensationer karakteristisk för olja som beror på sorten och kommer från friska, färska oliver, antingen mogna eller omogna. Den förnims direkt och/eller via näsans bakre gångar.

Bitter Karaktäristisk primär smak hos oljor som framställts av gröna oliver eller oliver som börjar ändra färg. Den uppfattas med vallgravspapillerna som ligger i V-form på tungan.

Skarp Stickande intryck som är karakteristisk för olja som framställts i början av säsongen, i huvudsak av oliver som fortfarande är omogna. Det kan förnimmas i hela munhålan, i synnerhet i halsen.

3.4.   Frivillig terminologi att använda vid märkning

Den som leder panelen får på begäran intyga att de oljor som bedömts överensstämmer med de definitioner och intervall som motsvarar följande adjektiv med avseende på egenskapernas intensitet och förnimmelsen av dem.

Positiva egenskaper (fruktig, bitter och stark): Enligt förnimmelsens intensitet: Intensiv, om medianvärdet för egenskapen är över 6. Medelstark, om medianvärdet för egenskapen är mellan 3 och 6. Svag, om medianvärdet för egenskapen är under 3.

Fruktig Uppsättning olfaktoriska smaksensationer karakteristisk för olja, som beror på sorten och kommer från friska, färska oliver i vilka varken grön eller mogen fruktighet dominerar. Den förnims direkt och/eller via näsans bakre gångar.

Grönt fruktig Uppsättning olfaktoriska smaksensationer karakteristisk för olja som påminner om gröna frukter och som beror på sorten och kommer från gröna, friska, färska oliver. Den förnims direkt och/eller via näsans bakre gångar.

Moget fruktig Uppsättning olfaktoriska smaksensationer karakteristisk för olja som påminner om mogna frukter och som beror på sorten och kommer från friska, färska oliver. Den förnims direkt och/eller via näsans bakre gångar.

Välbalanserad Olja som inte är obalanserad, med vilket avses de olifaktoriska-gustatoriska och taktila intrycken där medianvärdet för egenskaperna bitter och/eller stark är två poäng högre än medianvärdet för fruktighet.

Mild olja Olja för vilken medianvärdet för egenskaperna bitter och stark är 2 eller lägre.

4.   GLAS FÖR PROVSMAKNING AV OLJA

Se standard IOC/T.20/Doc. Nr 5, ”Glas för provsmakning olja”.

5.   PROVNINGSRUM

Se standard IOC/T.20/Doc. Nr 6, ”Anvisningar för installation av ett provningsrum”.

6.   TILLBEHÖR

Följande tillbehör, som krävs för att provsmakare ska kunna utföra sina uppgifter på ett tillfredsställande sätt, ska tillhandahållas i varje bås och måste ligga inom räckhåll:

—	Glas (standardiserade) innehållande proverna, numrerade med en kod, täckta med ett urglas och förvarade vid 28 °C ± 2 °C.

—	Profilformulär (se figur 1) i pappersformat eller i digital form under förutsättning att villkoren för profilformuläret är uppfyllda, samt anvisningar för användningen vid behov.

—	Kulspetspenna eller outplånligt bläck.

—	Brickor med äppelskivor och/eller vatten, kolsyrehaltigt vatten och/eller skorpor.

—	Glas med rumstempererat vatten.

—	Ett formulär med de allmänna reglerna enligt avsnitt 8.4 och 9.1.1.

—	Spottkoppar.

7.   PANELLEDARE OCH PROVSMAKARE

7.1.   Panelledare

Panelledaren måste vara en person med lämplig utbildning och expertkunskaper om de typer av oljor som han eller hon kommer att stöta på i samband med sitt arbete. Panelledaren är en nyckelfigur i panelen och ansvarar för dess organisation och drift.

Panelledarens arbete kräver grundläggande utbildning om verktyg för sensorisk analys, sensorisk skicklighet, noggrannhet vid förberedelse, organisation och utförande av proven, samt skicklighet och tålamod då det gäller att planera och utföra proverna på ett vetenskapligt sätt.

Panelledaren är den enda ansvariga personen för urval, utbildning och övervakning av provsmakarna för att fastställa deras nivå av skicklighet. Panelledarna är således ansvariga för bedömningen av provsmakarna, som alltid måste vara objektiva och för vilka de måste utarbeta särskilda förfaranden som bygger på provningar och solida kriterier för godkännande och avvisande. Se standard IOC/T.20/Doc. Nr 14, ”Anvisningar för urval, utbildning och kontroll av kvalificerade provsmakare av jungfruolja”.

Panelledaren ansvarar för panelens resultat och därmed även för utvärderingen av den, där de måste presentera tillförlitliga, objektiva bevis. De måste hur som helst visa att metoden och provsmakarna står under kontroll. Periodisk kalibrering av panelen rekommenderas (IOC/T.20/Doc. nr 14, § 5).

Panelledarna har det yttersta ansvaret för att föra panelens protokoll. Dessa protokoll måste alltid vara spårbara. De måste överensstämma med de revisionsförklaringar och kvalitetskrav som fastställs i internationella standarder för sensorisk analys och säkerställa anonymitet hos exemplaren vid alla tidpunkter.

De ska ansvara för inventering och se till att den utrustning och det material som krävs för att uppfylla specifikationerna för denna metod är ordentligt rengjorda och underhålls och ska bevara skriftliga bevis på detta, samt ansvara för överensstämmelsen med testvillkoren.

De ska ansvara för att ta emot och förvara proverna vid ankomsten till laboratoriet samt ansvara för deras förvaring efter proven. De ska då vid varje tidpunkt säkerställa att proverna förblir anonyma och är förvarade på rätt sätt, och de måste för detta syfte utarbeta skriftliga förfaranden för att säkerställa att hela processen är spårbar och ger garantier.

Vidare ansvarar de för att förbereda, koda och presentera proverna för provsmakarna i enlighet med en lämplig försöksplan i enlighet med på förhand fastställda protokoll samt för sammanställning och statistisk bearbetning av de uppgifter som erhållits av provsmakarna.

De ska ansvara för utveckling och utarbetande av alla andra förfaranden som kan krävas för att komplettera denna standard och att se till att panelen fungerar väl.

De måste hitta metoder för att jämföra resultaten från panelen med resultaten från andra paneler som analyserar jungfruolja, för att ta reda på om panelen fungerar väl.

Det åligger panelledaren att motivera panelmedlemmarna genom att uppmuntra deras intresse, nyfikenhet och tävlingslust. Därför rekommenderas de starkt att säkerställa en smidig tvåvägskommunikation med panelmedlemmarna genom att hålla dem informerade om alla uppgifter som de utför och de resultat som erhålls. De ska också se till att deras yttrande inte är känt och ska förhindra eventuella ledare från att hävda sina kriterier framför övriga provsmakare.

De ska kalla provsmakarna i tillräckligt god tid och besvara alla frågor om utförandet av proven, men avstå från att antyda några åsikter om provet.

7.2.   Provsmakarna

De personer som fungerar som provsmakare i organoleptiska analyser av olivoljor måste göra detta frivilligt, dvs. godta konsekvenserna av en sådan frivillig handling i form av förpliktelser och avsaknaden av finansiell ersättning. Det är därför tillrådligt att den som önskar delta inkommer med en skriftlig ansökan. Kandidaterna ska väljas ut, utbildas och kontrolleras av panelledaren i enlighet med deras skicklighet när det gäller att skilja mellan likartade prov. Det bör hållas i minnet att deras tillförlitlighet ökar med utbildning.

Provsmakare måste fungera som verkliga sensoriska observatörer och åsidosättta sin personliga smak och endast rapportera om sina sinnesintryck. Därför måste de alltid arbeta under tystnad, på ett avslappnat och ostressat sätt, med största möjliga sensoriska uppmärksamhet riktad mot det prov som de provsmakar.

Mellan 8 och 12 provsmakare krävs för varje provning, men det är klokt att ha några reservprovsmakare för att täcka eventuell frånvaro.

8.   PROVNINGSFÖRHÅLLANDEN

8.1.   Presentation av provet

Det oljeprov som ska analyseras ska presenteras i standardiserade provsmakningsglas som överensstämmer med standarden IOC/T.20/Doc. Nr 5, ”Glas för provsmakning olja”.

Glaset ska innehålla 14-16 ml olja, eller mellan 12,8 och 14,6 g om proverna ska vägas, och det ska vara täckt med ett urglas.

Varje glas ska märkas med en kod bestående av siffror eller en kombination av bokstäver och siffror som slumpmässigt valts ut. Koden kommer att märkas med hjälp av ett luktlöst system.

8.2.   Provtagningstemperatur och oljeprovets temperatur

Oljeprover för provsmakning ska förvaras i glas vid 28 °C ± 2 °C under hela provningen. Denna temperatur har valts eftersom den gör det lättare att följa organoleptiska skillnader än vid rumstemperatur och eftersom de aromatiska föreningar som är typiska för dessa oljor förångas dåligt vid lägre temperaturer, medan högre temperaturer leder till att det bildas flyktiga föreningar som är typiska för uppvärmda oljor. Se standard IOC/T.20/Doc. nr 5 ”Glas för provsmakning av olja” för den metod som måste användas för uppvärmning av proven i glaset.

Provningsrummet måste ha en temperatur på mellan 20 ° och 25 °C (se IOC/T.20/Doc. nr 6.

8.3.   Provningstid

Morgonen är bästa tiden provsmakning oljor. Det har bevisats att det finns optimala perioder under dagen när det gäller perceptionen av smak och lukt. Måltider föregås av en period under vilken den olfaktoriska-gustatoriska känsligheten ökar, medan perceptionen därefter minskar.

Detta kriterium bör dock inte överdrivas så att hunger distraherar provsmakarna och därmed minskar deras förmåga till urskiljning. Därför rekommenderas att provsmakningssessionerna hålls mellan 10.00 på morgonen och 12 på dagen.

8.4.   Provsmakare: allmänna förhållningsregler

Följande rekommendationer gäller för provsmakarnas uppförande under arbetet.

När panelledaren kallar provsmakarna till att delta i en organoleptisk provning bör de kunna delta vid den i förväg fastställda tidpunkten och de ska iaktta följande:

—	De får inte röka eller dricka kaffe minst 30 minuter före den tidpunkt som är fastställd för provningen.

—	De får inte ha använt några dofter, någon kosmetika eller någon tvål vars lukt kan dröja sig kvar till tidpunkten för provningen. De måste använda en oparfymerad tvål för att tvätta händerna, som ska skölja och torka så ofta som är nödvändigt för att eliminera alla lukter.

—	De ska fasta i minst en timme innan provsmakningen genomförs.

—	Om de känner sig fysiskt opassliga, och i synnerhet om deras lukt- eller smaksinne är påverkat, eller om de är under någon psykologisk verkan som hindrar dem från att koncentrera sig på sitt arbete, ska provsmakarna avstå från att provsmaka och ska vederbörligen underrätta panelledaren.

—	När de har uppfyllt ovanstående ska de provsmakarna tyst och under ordnade former inta sin plats i det bås som de tilldelats.

—	De ska noggrant läsa anvisningarna på profilformuläret och inte börja undersöka provet förrän de är fullständigt förberedda på de uppgifter de ska utföra (avslappnade och ostressade). Vid eventuellt tvivel ska de rådfråga panelledaren i enrum.

—	De måste vara tysta när de utför sina uppgifter.

—	De måste hela tiden ha sina mobiltelefoner avstängda för att inte inkräkta på sina kollegors koncentration och arbete.

9.   FÖRFARANDE FÖR ORGANOLEPTISK BEDÖMNING OCH KLASSIFICERING AV JUNGFRUOLJA

9.1.   Provsmakningsteknik

9.1.1.

Provsmakaren ska ta upp glaset och hålla det täckt med urglaset, luta det försiktigt och sedan rotera glaset i detta läge för att väta insidan så mycket som möjligt. När denna fas är genomförd ska provsmakaren ta bort urglaset och lukta på provet med djupa, långsamma andetag för att bedöma oljan. Luktandet får inte överskrida 30 sekunder. Om ingen slutsats dras under den tiden ska de ta en kort paus innan de försöker igen. När det olfaktoriska provet har utförts ska provsmakarna bedöma förnimmelserna som framkallas i gommen (totala, retronasala, gustatoriska och taktila förnimmelser). För att göra detta ska de ta en liten klunk på ca 3 ml olja. Det är mycket viktigt att fördela oljan över hela munhålan från främre delen av munnen och tungan längs sidorna till bakre delen och gomfästet, eftersom det är ett känt faktum att uppfattningen av smaker och taktila förnimmelser varierar i intensitet beroende på området på tungan och gommen. Det bör särskilt påpekas att det är viktigt att en tillräcklig mängd olja sprids mycket sakta över bakre delen av tungan mot strupen medan provsmakaren koncentrerar sig på i vilken ordning de bittra och skarpa upplevelserna förnims. Om inte detta sker kan båda dessa upplevelser missas i en del oljor eller också kan upplevelsen av den bittra smaken döljas av den skarpa. Genom att ta korta, upprepade andetag och dra in luften genom munnen kan provsmakaren inte bara sprida provet ordentligt över hela munhålan utan också uppleva de flyktiga, aromatiska komponenterna via näsans bakre gångar. Den taktila förnimmelsen av skarphet bör beaktas. Därför är det lämpligt att svälja oljan.

9.1.2.

När en jungfruolja ska bedömas organoleptiskt rekommenderas att högst FYRA PROV utvärderas vid samma tillfälle och att högst tre provningssessioner genomförs per dag, för att undvika de kontraster som kan uppstå vid en omedelbar provning av andra prover. Eftersom efterföljande provningar skapar trötthet eller brist på känslighet är det viktigt att använda en produkt som kan ta bort resterna av oljan i munnen från den föregående provningen. Användning av en liten bit äpple rekommenderas, som efter tuggning kan spottas ut i spottkoppen. Sedan sköljs munnen med litet vatten vid rumstemperatur. Minst 15 minuter ska gå mellan slutet av en provning och början av nästa.

9.2.   Provsmakarnas användande av profilformuläret.

Det profilformulär som är avsett att användas av provsmakarna redovisas närmare i figur 1 i denna bilaga.

Varje provsmakare i panelen ska först lukta på och därefter provsmaka (1) den berörda oljan. De ska sedan ange med vilken intensitet som de uppfattar var och en av de negativa och positiva egenskaperna på 10 cm-skalan i det profilformulär som tillhandahålls.

Om provsmakaren upplever negativa egenskaper som inte återfinns i avsnitt 4 ska de anteckna dessa under rubriken "övrigt" och använda det eller de begrepp som bäst beskriver dessa egenskaper.

9.3.   Panelledarnas användning av data

Panelledarna ska samla in de profilformulär som fyllts i av varje provsmakare och kontrollera de intensiteter som angivits för de olika egenskaperna. Om panelledarnas påträffar någon avvikelse ska de uppmana provsmakaren att se över sitt profilformulär, och vid behov upprepa provet.

Panelledaren ska föra in varje panelmedlems bedömningsdata i ett datorprogram som motsvarar standarden IOC/T.20/Doc. Nr 15) för statistisk beräkning av resultaten av analysen, på grundval av en beräkning av deras medianvärde. Se avsnitt 9.4 och tillägget till denna bilaga. Uppgifterna för ett visst prov ska registreras med hjälp av en matris som består av 9 kolumner vilka motsvarar 9 sensoriella egenskaper och av n rader som motsvarar de n panelmedlemmar som använts.

När en defekt uppfattas och förs in under rubriken ”övrigt” av minst 50 % av panelen ska panelledaren beräkna medianvärdet för defekten för att få fram motsvarande klassificering.

Värdet av den robusta variationskoefficient som definierar klassificeringen (defekt med största intensitet och fruktig egenskap) får inte överstiga 20 %.

I annat fall måste panelledaren göra om bedömningen av detta specifika prov vid ett annat provsmakningstillfälle.

Om denna situation uppkommer ofta rekommenderas panelledaren att ge provsmakarna särskild kompletterande utbildning (IOC/T.20/Doc. No 14, § 5) och att använda repeterbarhetsindex och avvikelseindex för att kontrollera panelens resultat (IOC/T.20/Doc. nr 14, § 6).

9.4.   Klassificering av oljan

Oljan ska klassificeras enligt följande kategorier, med defekternas medianvärde och fruktighetens medianvärde som utgångspunkt. Defekternas medianvärde definieras som medianvärdet för den defekt som upplevs mest intensivt. Defekternas medianvärde och medianvärdet för egenskapen fruktighet anges med en decimal.

Klassificeringen av oljan sker genom att jämföra defekternas medianvärde och medianvärdet för egenskapen fruktighet med de referensintervall som anges nedan. Då gränsvärdena för dessa intervall har fastställt med beaktande av metodens felmarginal anses de vara absoluta. Genom programvaran kan klassificeringen visas grafiskt eller i en tabell med statistiska uppgifter.

(a)	Extrajungfruolja: defekternas medianvärde är lika med 0 och medianvärdet för egenskapen fruktighet är större än 0.

(b)	Jungfruolja: defekternas medianvärde är större än 0 men inte större än 3,5 och medianvärdet för egenskapen fruktighet är större än 0.

(c)	Bomolja: defektens medianvärde är större än 3,5 eller defektens medianvärde är 3,5 eller mindre och medianvärdet för fruktighet är 0.

Not 1:

När medianvärdet för egenskapen bitter och/eller skarp är större än 5,0 ska panelledaren ange detta på provningsintyget.

Figur 1

PROFILFORMULÄR FÖR JUNGFRUOLJA

Intensitet med vilken defekterna förnimms
Unken/gyttjig fällning (*1)
Möglig/fuktig/jordig (*1)
Vin-vinäger Sur/syrlig (*1)
Frostskadade oliver (fuktigt trä)
Härsken
Andra negativa egenskaper:
Beskrivande egenskap:	Metallisk  Hö  Maskig  Rå  Saltlake  Värmd eller bränd  Växtvatten  Esparto  Gurka  Fet 
Intensitet med vilken de positiva egenskaperna förnimms
Fruktig
	Grön 	Mogen 
Bitter
Skarp
Provsmakarens namn:			Provsmakarens kod:
Provets kod:	Underskrift:

”Tillägg

Metod för beräkning av medianvärde och konfidensintervall

Medianvärde

Medianen definieras som det reella talet Xm som kännetecknas av att sannolikheten (p) att värdena inom fördelningen (X) är lägre än talet (Xm), är mindre än eller lika med 0,5, samtidigt som sannolikheten (p) att värdena inom fördelningen (X) är mindre än eller lika med Xm är större än eller lika med 0,5. En mer praktisk definition är att medianvärdet är den 50:e percentilen av en uppsättning tal som ordnats i stigande ordning. Enkelt uttryckt är det mittpunkten i en ordnad serie om antalet tal är ojämnt, eller medelvärdet av de två mittpunkterna i en ordnad serie om antalet tal är jämnt.

Robust standardavvikelse

För att få en tillförlitlig uppskattning av spridningen kring medianen används Stuarts och Kendalls metod för uppskattning av robust standardavvikelse (4). Med följande formel beräknas den robusta asymptotiska standardavvikelsen, dvs. den robusta uppskattningen av spridningen hos uppgifterna i fråga, varvid N är antalet observationer och IQR är kvartilavståndet, som omfattar exakt 50 % av elementen i en given sannolikhetsfördelning.

Kvartilavståndet beräknas genom beräkning av skillnaden mellan den 75:e och den 25:e percentilen.

Om percentilen är värdet Xm, som kännetecknas av att sannolikheten (p) att värdena inom fördelningen är lägre än Xpc är mindre än eller lika med ett specifikt hundradelsvärde, samtidigt som sannolikheten (p) att värdena inom fördelningen är mindre än eller lika med Xpc är större än eller lika detta specifika hundradelsvärde. Hundradelsvärdet anger vilken fraktil det rör sig om. När det gäller medianen är detta värde lika med 50/100.

Percentilen är i praktiken det värde i fördelningen som motsvarar ett givet område som avgränsas av fördelningskurvan eller frekvenskurvan. Den 25:e percentilen utgör exempelvis det värde i fördelningen som motsvarar ett område lika med 0,25 eller 25/100.

I denna metod beräknas percentilen på grundval av de verkliga värden som förekommer i datamatrisen (beräkningsmetod för percentiler).

Robust variationskoefficient (%)

CVr% motsvarar ett rent tal som utgör ett mått på den analyserade talseriens spridning. Denna koefficient är därför mycket användbar som ett mått på panelmedlemmarnas tillförlitlighet.

Konfidensintervall på 95 % kring medianvärdet

Konfidensintervall (KI) på 95 % (risken för fel av första slaget uppgår till 0,05 eller 5 %) utgör det intervall inom vilket medianvärdet skulle kunna variera, om det vore möjligt att upprepa försöket ett oändligt antal gånger. I praktiken anger konfidensintervallet hur stor försökets variabilitet är under rådande förhållanden, om man antar att försöket kan upprepas ett flertal gånger. I likhet med CVr% ger konfidensintervallet ett mått på hur tillförlitligt försöket är.

där C = 1,96 för konfidensintervall på 95 %.

Ett exempel på beräkningsbladet finns i bilaga I till standard IOC/T 20/Doc. No 15.

Referenser

(1)	Wilkinson, L. 1990. Systat: The system for statistics. Evanston, IL.SYSTAT Inc.

(2)	Cicchitelli, G. 1984. Probabilità e Statistica. Maggioli Editore, Rimini.

(3)	Massart, D.L.; Vandeginste, B.G.M.; Deming, Y.; Michotte, L. 1988. Chemometrics. A textbook. Elsevier. Amsterdam.

(4)	Kendall, M.G.; Stuart, A. 1967. The advanced theory of statistics. Vol. 1. Hafner Publishing Co.

(5)	McGill, R.; Tukey, J.W.; Larsen, W.A. 1978. Variation of Box Plots. The American Statistician, 32, (2), 12-16.

(6)	IOC/T.28/Doc. No 1 September 2007, Guidelines for the accreditation of sensory testing laboratories with particular reference to virgin olive oil according to standard ISO/IEC 17025:2005.

(7)	IOC/T.20/Doc. No 14.

(8)	IOC/T.20/Doc. No 15.

(9)	ISO/IEC 17025:05.

”BILAGA XXa

METOD FÖR ATT PÅVISA FÖREKOMST AV FRÄMMANDE OLJOR I OLIVOLJA

1.   TILLÄMPNINGSOMRÅDE

Denna metod används för att påvisa förekomst av främmande vegetabiliska oljor i olivolja. Förekomsten av vegetabiliska oljor med en hög halt av linolsyra (sojaolja, rapsolja, solrosolja m.fl.), och vissa vegetabiliska oljor med en hög halt av oljesyra – t.ex. hasselnötsolja, solrosolja med en hög halt av oljesyra och olivolja av pressrester – kan påvisas i olivolja. Den påvisade halten beror på vilken typ av olja och vilken olivsort det rör sig om. För hasselnötsolja kan det ofta påvisas en halt på 5–15 %. Det är med denna metod inte möjligt att fastställa vilken typ av främmande olja som påvisats, utan endast om olivoljan är äkta eller inte.

2.   PRINCIP

Oljan renas genom fastfasextraktion (SPE) på kiselgelpatroner. Triglyceridsammansättningen bestäms med hjälp av högupplösande vätskekromatografi (med omvänd fas), med en refraktionsindexdetektor och med propionitril som mobil fas. Fettsyrametylestrar bereds från renad olja genom metylering med en kall lösning av KOH i metanol (bilaga X B). Estrarna analyseras sedan genom kapillärgaskromatografi med användning av högpolära kolonner (bilaga X A). Den teoretiska triglyceridsammansättningen beräknas med ett datorprogram utifrån fettsyrasammansättningen genom att anta en slumpmässig 1,3- och 2-fördelning av fettsyror i triglyceriden, med restriktioner för mättade fettsyror i 2-ställning. Beräkningsmetoden är en variant av det förfarande som beskrivs i bilaga XVIII. En rad matematiska algoritmer beräknas utifrån teoretiska och experimentella (HPLC) sammansättningar av triglycerid, och de erhållna värdena jämförs med värden i en databas med data från äkta olivolja.

3.   MATERIAL OCH REAGENS

3.1.   Rening av olja

3.1.1.

E-kolvar (25 ml).

3.1.2.

Glasrör (5 ml) med skruvlock försett med teflonpackning.

3.1.3.

Kiselgelpatroner, 1 g (6 ml), för fastfasextraktion (t.ex. Waters, Massachusetts, USA).

3.1.4.

n-hexan, analyskvalitet.

3.1.5.

Lösningsmedelsblandning av hexan/dietyleter (87:13, v/v).

3.1.6.

N-heptan, analyskvalitet.

3.1.7.

Aceton, analyskvalitet.

3.2.   HPLC-analys av triglycerider

3.2.1.

Mikrosprutor (50 μl) och kanyler för HPLC-injicering.

3.2.2.

Propionitril, super renhet eller HPLC-kvalitet (t.ex. ROMIL, Cambridge, Storbritannien), som används som mobil fas.

3.2.3.

HPLC-kolonner (25 cm x 4 mm innerdiameter), packade med RP-18 fas (partikelstorlek 4 μm).

3.3.   Beredning av fettsyrametylestrar

(se bilaga X B)

3.3.1.

Metanol med en vattenhalt på högst 0,5 %.

3.3.2.

Heptan, analyskvalitet.

3.3.3.

En 2N-lösning av kaliumhydroxid i metanol. 1,1 g kaliumhydroxid upplöses i 10 ml metanol.

3.3.4.

Glasrör (5 ml) med skruvlock försett med teflonpackning.

3.4.   GC-analys av fettsyremetylestrar

(Se metoden för bestämning av omättade transfettsyror med hjälp av gaskromatografi på kapillärkolonn i bilaga X A.)

3.4.1

Mikrosprutor (5 μl) och kanyler för GC-injektion.

3.4.2

Väte eller helium som bärgas.

3.4.3

Väte och syre för flamjoniseringsdetektor (FID).

3.4.4

Kväve eller helium som bärgas.

3.4.5.

Kapillärkolonn av kvarts (innerdiameter 50-60 m x 0,25–0,30 mm), belagd med cyanopropylpolysiloxan- eller cyanopropylfenylsiloxanfaser (SP-2380 eller liknande) med en filmtjocklek av 0,20–0,25 μm.

4.   UTRUSTNING

4.1.

Vakuumapparat för fastfasextraktion.

4.2.

Rotationsindunstare.

4.3.

HPLC-utrustning bestående av följande: 4.3.1. Avluftningsapparat för den mobila fasen. 4.3.2. Rheodyninjektor med 10 μl-loop. 4.3.3. Högtryckspump. 4.3.4. Termostatstyrd ugn till HPLC-kolonnen som kan hålla temperaturen under rumstemperatur (15–20 °C), (t.ex. av typen Peltier). 4.3.5. Refraktionsindexdetektor. 4.3.6. Datoriserat system för datainsamling som omfattar ett integrationsprogram.

4.4

Utrustning för kapillärgaskromatografi enligt bilaga X A, försedd med följande: 4.4.1. Separerad injektor. 4.4.2. Flamjoniseringsdetektor (FID). 4.4.3. Ugn med programmerbar temperatur. 4.4.4. Datoriserat system för datainsamling som inbegriper ett integrationsprogram.

4.5.

Dator med Microsoft Excel.

5.   ANALYSFÖRFARANDE

5.1.   Rening av olja

Placera en kiselgelpatron för fastfasextraktion i en elueringsapparat i vakuum och skölj under vakuum med 6 ml hexan. Bryt vakuumet för att undvika att kolonnen torkar och placera en E-kolv under patronen. Tillför olja (ung. 0,12 g) löst i 0,5 ml hexan i kolonnen så att lösningen tränger in i kiselgelen och eluera sedan med 10 ml av blandningen av hexan/dietyleter (87:13 v/v) under vakuum. Homogenisera den eluerade lösningen och häll ungefär hälften av volymen i en annan E-kolv. Låt lösningarna var för sig avdunsta till uttorkning i en rotationsavdunstare under undertryck och i rumstemperatur. För triglyceridanalysen löses en av restprodukterna i 1 ml aceton (se punkt 5.2 första stycket), varpå vätskan hälls i ett 5 ml glasrör med skruvlock. Lös den andra restprodukten i 1 ml n-heptan och häll den i ett annat 5 ml glasrör med skruvlock för beredning av metylestrar av fettsyror.

Anmärkning: Oljan kan renas med hjälp av en kiselgelkolonn i enlighet med IUPAC-metod 2.507.

5,2.   HPLC-analys av triglycerider

Gör i ordning HPLC-systemet. Håll kolonntemperaturen på 20 °C och använd propionitril som mobil fas med en flödeshastighet på 0,6 ml/min. När baslinjen är stabil, injicera lösningen. Om baslinjen blir oregelbunden i området mellan 12-25 min, lös provet med en annan typ av aceton eller en blandning av propionitril och aceton (25:75).

Anmärkning: Vissa typer av aceton ger upphov till oregelbundenheter i baslinjen i ovannämnda område.

Injicera 10 μl av lösningen av renad olja i aceton (5 %). Körningen tar cirka 60 min. Justera ugnstemperaturen och/eller flödeshastigheten för att få ett kromatogram som motsvarar det i figur 1, där trilinolein (topp 1) eluerar vid 15,5 min och upplösningen mellan paren LLL/OLLn (topp 1 och 2) och OLL/OOLn (topp 4 och 5) är god.

Topp 2 (OLLn+PoLL) måste nå en höjd på minst 3 % av fullt skalutslag.

5.3.   Beredning av fettsyrametylestrar

Tillsätt 0,1 ml av en 2N kaliumhydroxidlösning i metanol till lösningen av renad olja i 1 ml n-heptan. Sätt skruvlocket på röret och skruva åt ordentligt. Skaka röret kraftigt i 15 sekunder och låt det sedan stå tills det övre skiktet av lösningen klarnat (5 minuter). Lösningen av n-heptan är färdig att injiceras i gaskromatografen. Lösningen får lämnas i rumstemperatur i högst 12 timmar.

5.4.   GC-analys av metylestrar av fettsyra

Det förfarande som beskrivs i metoden för bestämning av omättade transfettsyror ska användas (se bilaga X A).

Gör i ordning GC-systemet med en ugnstemperatur på 165 °C. Den rekommenderade ugnstemperaturen är isotermisk vid 165 °C i 10 minuter, varefter den kan höjas till 200 °C med 1,5 °C/min. En injektortemperatur på mellan 220 °C och 250 °C rekommenderas för att minimera uppkomsten av transfettsyror (se bilaga X A). Detektortemperaturen ska vara 250 °C. Väte eller helium ska användas som bärgas vid ett kolonntryck på ca 130 kPa. Injektionsvolymen ska vara 1 μl vid separerad injektion.

En GC-profil motsvarande den i figur 2 ska erhållas. Särskild uppmärksamhet måste ägnas upplösningen mellan C18:3 och C20:1 (toppen C18:3 måste formas före C20:1). För att åstadkomma dessa förhållanden måste ursprungstemperaturen och/eller bärgasens tryck optimeras. Justera injektionsförhållandena (temperatur, delningsförhållande och injektionsvolym) för att reducera diskriminering av palmitinsyra och palmitoleinsyra.

Höjden på C20:0-toppen ska motsvara ungefär 20 % av fullt skalutslag för att kvantifiera transisomererna. Om C18:0-toppen är oregelbunden, reducera provmängden.

6.   INTEGRERING AV KROMATOGRAFISKA TOPPAR

6,1.   HPLC-kromatogram

Figur 1 visar ett typiskt HPLC-kromatogram för triglycerider i renad olivolja. För integrering av topparna dras tre baslinjer: den första från början av topp 1 till slutet av topp 3, den andra från början av topp 4 till dalen före topp 8, och den tredje från dalen före topp 8 till slutet av topp 18.

Den totala arean är summan av arean av alla toppar (identifierade och icke identifierade) från topp 1 till topp 18. Procentandelen för varje topp beräknas på följande sätt:

Resultaten anges med två decimaler.

6,2.   GC-kromatogram

Figur 2 visar ett GC-kromatogram av fettsyraalkylestrar som utvunnits ur renad olivolja. Procentsatserna av följande fettsyror beräknas:

Palmitinsyra:	P (C16:0)	=	metylestrar + etylestrar
Stearinsyra:	S (C18:0)	=	metylestrar
Palmitinoljesyra:	Po (C16:1)	=	summan av metylestrarna från de två cisisomererna
Oljesyra:	O (C18:1)	=	summan av metylestrarna från de två cisisomerna + etylestrar + transisomererna
Linolsyra:	L (C18:2)	=	metylestrar + etylestrar + transisomerer
Linolensyra:	L (C18:3)	=	metylestrar + etylestrar + transisomerer
Arakidsyra:	A (C20:0)	=	metylestrar
Gadoljesyra	G (C20:1)	=	metylestrar

Etylestrar och transisomerer kan saknas i GC-kromatogrammet.

Den totala arean (AT) är summan av alla toppar i kromatogrammet från C14:0 till C24:0, utom den topp som motsvarar skvalen. Procentandelen för varje topp beräknas på följande sätt:

Resultaten uttrycks med två decimaler.

Vid beräkningar med hjälp av dator är det inte nödvändigt att normalisera till 100, då detta sker automatiskt.

Figur 1

HPLC-kromatogram av triglycerider i en jungfruolja av märket Chamlali. Viktigaste komponenter i de kromatografiska topparna

(1) LLL; (2) OLLn+PoLL; (3) PLLn; (4) OLL; (5) OOLn+PoOL;

(6) PLL+PoPoO; (7) POLn+PPoPo+PPoL; (8) OOL+LnPP; (9) PoOO;

(10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; (12) PLP;

(13) OOO+PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; (17) SOO;

(18) POS+SLS.

Tabell 1

Repeterbarhetsdata vid bestämning av triglycerider i jungfruolja genom HPLC vid en kolonntemperatur på 20 °C och propionitril som mobil fas

ECN	HPLC-toppar	Triglycerider	Prov 1		Prov 2		Prov 3		Prov 4		Prov 5
			Medelvärde (%)	RSDr (%)	Medelvärde (%)	RSDr (%)	Medelvärde (%)	RSDr (%)	Medelvärde (%)	RSDr (%)	Medelvärde (%)	RSDr (%)
42	1	LLL	0,020	7,23	0,066	5,18	0,095	4,10	0,113	0,95	0,34	1,05
	2	OLLn+ PoLL	0,085	7,44	0,24	1,78	0,26	2,25	0,35	2,02	0,50	2,83
	3	PLLn	0,023	15,74	0,039	5,51	0,057	5,62	0,082	4,35	0,12	6,15
44	4	OLL	0,47	1,52	1,53	0,42	2,62	0,98	3,35	1,05	4,37	1,13
	5	OOLn+ PoOL	1,07	2,01	1,54	0,46	1,61	0,71	1,72	1,07	1,77	2,40
	6	PLL+ PoPoO	0,11	12,86	0,24	4,37	0,65	1,32	1,35	0,73	2,28	1,24
	7	POLn+ PpoPo+ PpoL	0,42	5,11	0,49	2,89	0,55	2,01	0,85	1,83	1,09	1,96
46	8	OOL+ LnPP	6,72	0,63	8,79	0,31	11,21	0,42	13,25	0,33	15,24	0,23
	9	PoOO	1,24	2,86	1,49	0,95	1,63	0,85	2,12	0,45	2,52	0,56
	10	SLL+ PLO	2,70	0,65	4,05	0,70	6,02	0,65	9,86	0,53	11,53	0,31
	11	PoOP+ SpoL+ SOLn+ SpoPo	0,64	4,42	0,69	3,02	0,79	1,23	1,53	0,89	1,70	1,66
48	12+13	OOO+ PLP+ PoPP	49,60	0,07	48,15	0,06	42,93	0,06	33,25	0,10	24,16	0,06
	14	SOL	0,82	1,72	0,92	1,56	1,05	1,32	1,25	1,05	1,60	1,77
	15	POO	22,75	0,25	21,80	0,20	21,05	0,30	20,36	0,35	20,17	0,14
50	16	POP	3,05	0,46	4,56	0,42	4,98	0,52	5,26	0,41	5,57	0,38
	17	SOO	6,87	0,21	5,56	0,33	4,86	0,43	4,12	0,72	3,09	0,69
	18	POS+ SLS	1,73	1,23	1,65	1,10	1,54	0,99	1,49	1,10	1,41	1,00
n = 3 replikat RSDr = Relativ standardavvikelse för repeterbarheten

Figur 2

GC-kromatogram av fettsyraalkylestrar som utvunnits ur olivolja av pressrester genom transesterifiering med en kall lösning av KOH i metanol

7.   METOD FÖR ATT PÅVISA FÖREKOMST AV FRÄMMANDE OLJOR I OLIVOLJA

Den beräkningsmetod för påvisande av främmande oljor i olivolja där matematiska algoritmer jämförs med värden i en databas med data från äkta olivolja beskrivs i bilaga I till standard IOC/T.20/Doc. Nr 25.”