1.1.1.1

Coata Elisa-plattorna med rekombinant AHSV-4 VP7 som spätts i en karbonat-bikarbonatbuffert med pH 9,6. Inkubera plattorna över natten vid 4 °C.

1.1.1.2

Skölj plattorna fem gånger med destillerat vatten innehållande 0,01 % (v/v) Tween 20 (tvättlösning). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.

1.1.1.3

Blockera plattorna med fosfatbuffrad koksaltlösning (PBS) (pH 7,2) innehållande 5 % (w/v) skummjölk (Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/brunn, i en timme vid 37 °C.

1.1.1.4

Avlägsna den blockerande lösningen och slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material.

1.1.2.1

De serumprover som ska testas samt positiva och negativa kontrollserum späds 1:25 i PBS innehållande 5 % (w/v) skummjölk och 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl/brunn. Inkubera i en timme vid 37 °C.

Vid titreringen görs en tvåfaldig spädningsserie från 1:25 (100 μl/brunn), ett serum per kolumn på plattan, och detsamma görs med de positiva och negativa kontrollerna. Inkubera i en timme vid 37 °C.

1.1.2.2

Skölj plattorna fem gånger med destillerat vatten innehållande 0,01 % (v/v) Tween 20 (tvättlösning). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.

1.1.3.1

Tillsätt 100 μl/brunn av HRP-konjugerat antihästgammaglobulin som spätts i PBS innehållande 5 % mjölk och 0,05 % Tween 20 (pH 7,2). Inkubera i en timme vid 37 °C.

1.1.3.2

Skölj plattorna fem gånger med destillerat vatten innehållande 0,01 % (v/v) Tween 20 (tvättlösning). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.

1.1.4.1

Tillsätt 200 μl/brunn av kromogen-/substratlösning (10 ml 80,6 mM DMAB [dimetylaminobensaldehyd] och 10 ml 1,56 mM MBTH [3-metyl-2-bensotiazolinhydrazonhydroklorid] och 5 μl H2O2).

Färgutvecklingen stoppas genom tillsats av 50 μl 3N H2SO4 efter cirka 5–10 minuter (innan det negativa kontrollprovet börjar färgas).

Andra kromogener såsom ABTS (2,2′-azino-bis-[3-etylbensotiazolin-6-sulfonsyra]), TMB (tetrametylbensidin) eller OPD (orto-fenyldiamin) kan också användas.

1.1.4.2

Avläs plattorna vid 600 nm (eller 620 nm).

1.2.1

Beräkna cut-off-värdet genom att lägga till 0,06 till det negativa kontrollvärdet (0,06 är standardavvikelsen för en grupp med 30 negativa serum).

1.2.2

Prover som ger absorbansvärden som är lägre än cut-off-värdet ska betraktas som negativa.

1.2.3

Prover som ger absorbansvärden som är högre än cut-off-värdet (+ 0,15) ska betraktas som positiva.

1.2.4

Prover som ger absorbansvärden som ligger mellan negativt och positivt ska betraktas som osäkra och en annan metod måste användas för att bekräfta resultatet.

2.1.1.1

Coata Elisa-plattorna med 50–100 ng rekombinant AHSV-4 VP7 som spätts i en karbonat-bikarbonatbuffert med pH 9,6. Inkubera över natten vid 4 °C.

2.1.1.2

Skölj plattorna tre gånger med PBS 0,1× innehållande 0,135 M NaCl och 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.

2.1.2.1

De serumprover som ska testas samt positiva och negativa kontrollserum späds 1:5 i ett spädningsmedel innehållande 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 och 0,1 % Kathon, 100 μl/brunn. Inkubera i en timme vid 37 °C.

Vid titreringen görs en tvåfaldig spädningsserie av testserumet från 1:10 till 1:280 över åtta brunnar (100 μl/brunn), ett serum per kolumn på plattan, och detsamma görs med de positiva och negativa kontrollerna. Inkubera i en timme vid 37 °C.

2.1.2.2

Skölj plattorna fem gånger med PBS 0,1× innehållande 0,135 M NaCl och 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.

2.1.3.1

Tillsätt 100 μl/brunn av HPR-konjugerade monoklonala antikroppar mot VP7. Denna monoklonala antikropp har i förväg spätts 1:5 000–1:15 000 i en 1:1 lösning av StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics, referens: SZ03) och destillerat vatten. Inkubera i 30 minuter vid 37 °C.

2.1.3.2

Skölj plattorna fem gånger med PBS 0,1× innehållande 0,135 M NaCl och 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Slå försiktigt plattorna mot ett absorberande material för att få bort eventuella tvättrester.

2.2.1

Fastställ hur många procent av varje prov som blockerats (BP) med hjälp av följande formel, där ”Abs” betecknar antikroppar:

2.2.2

Prover som visar ett BP-värde som är högre än 50 % bör betraktas som positiva för AHSV-antikroppar.

2.2.3

Prover som visar ett BP-värde som är lägre än 45 % bör betraktas som negativa för AHSV-antikroppar.

2.2.4

Prover som visar ett BP-värde på 45–50 % bör betraktas som osäkra och måste testas på nytt. Om resultatet återigen är osäkert bör djuren testas på nytt på prover som tas tidigast två veckor efter det att det prov som betraktades som osäkert togs.

—

Fenol-kloroformextraktion av nukleinsyror.

—

Adsorption av nukleinsyror med filtersystem.

—

Adsorption av nukleinsyror med magnetisk partikelteknik.

1.1

1 g vävnadsprov homogeniseras i 1 ml denatureringsmedel (4 M guanidiumtiocyanat, 25 mM natriumcitrat, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5 % sarkosyl).

1.2

Efter centrifugering tillsätts 1 μg jäst-RNA, 0,1 ml 2 M natriumacetat (pH 4), 1 ml fenol och 0,2 ml av en kloroform-isoamylalkoholblandning (49:1) till supernatanten.

1.3

Suspensionen skakas kraftigt och kyls på is i 15 minuter.

1.4

Efter centrifugering extraheras det RNA som finns i vattenfasen med fenol, fälls ut med etanol och återsuspenderas i sterilt vatten.

—

Framåtriktad primer:

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

—

Bakåtriktad primer:

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

—

MGB-TaqMan-prob:

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1

Stamlösningarna för primrarna späds till arbetslösningar på 8 μM, medan proben späds till en arbetslösning på 50 μM. En mall för testplattan bör utformas och läggas in i programvaran för realtids PCR-instrumentet. 2,5 μl av arbetslösningen för varje primer (på 8 μM) tillsätts varje brunn som enligt mallen ska innehålla RNA-prover, positiva och/eller negativa kontroller (primerns slutkoncentration kommer att vara 1 μM i 20 μl RT-PCR-mix). Plattan förvaras på is.

2.1.2

2 μl isolerat RNA (prover och positiv kontroll) eller 2 μl RNas-fritt vatten (negativ kontroll) blandas med framåtriktade och bakåtriktade primrar. Blandningen denatureras genom upphettning i 5 minuter vid 95 °C, följt av en snabb kylning på is i minst 5 minuter.

2.1.3

Bered enligt tillverkarens anvisningar den volym av mastermix för ettstegs realtids RT-PCR som är lämplig för det antal prover som ska testas. 0,1 μl av arbetslösningen för proben (på 50 μM) tillsätts varje brunn med RNA-prover (probens slutkoncentration kommer att vara 0,25 μM i varje brunn med RNA-prover). 13 μl mastermix för ettstegs realtids RT-PCR tillsätts varje brunn i PCR-plattan innehållande denaturerade primrar och denaturerat RNA.

2.1.4

Plattan placeras i en realtids termocykler programmerad för omvänd transkription och cDNA amplifiering/fluorescensdetektion. Amplifieringsförhållandena består av ett första steg med omvänd transkription i 25 minuter vid 48 °C, följt av 10 minuter vid 95 °C (hot start) och 40 cykler på 15 sekunder vid 95 °C, 35 sekunder vid 55 °C och 30 sekunder vid 72 °C (eller 40 cykler på 2 sekunder vid 97 °C och 30 sekunder vid 55 °C om termocykler och reagenser för snabba reaktioner används). Fluorescensdata samlas in vid slutet av steget vid 55 °C.

2.1.5

Testet betraktas som ogiltigt om atypiska amplifieringskurvor erhålls och ska i så fall upprepas.

Prover betraktas som positiva om Ct-värdet (cykelnummer då fluorescensen i en reaktion passerar tröskelvärdet för fluorescens) är lägre än eller lika med det fastställda Ct-värdet (35) inom 40 PCR-cykler (Ct ≤ 35).

Prover betraktas som osäkra om Ct-värdet är högre än det fastställda Ct-värdet (35) inom 40 PCR-cykler (Ct ≥ 35).

Prover betraktas som negativa om en horisontell amplifieringskurva erhålls som inte passerar tröskelvärdet inom 40 PCR-cykler.

—

Framåtriktad primer:

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

—

Bakåtriktad primer:

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

—

MGB-TaqMan-prob:

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1

Stamlösningen för primer-probblandningen är koncentrerad 25× och innehåller 5 μΜ framåtriktade och bakåtriktade primrar och 3 μΜ prob. En mall för testplattan bör utformas och läggas in i programvaran för realtids PCR-instrumentet. 5 μl RNA-prover (inklusive testprover samt positiva och negativa kontroller) tillsätts de lämpliga brunnarna enligt mallen.

2.2.2

RNA:t denatureras genom upphettning i 5 minuter vid 95 °C, följt av en snabb kylning på is i minst 3 minuter.

2.2.3

Bered enligt tillverkarens anvisningar den volym av mastermix för ettstegs realtids RT-PCR som är lämplig för det antal prover som ska testas. 1 μl av 25× stamlösningen för primer-probblandningen (se punkt 2.2.1) tillsätts mastermixen, vilket ger en slutkoncentration på 200 nM/brunn för varje primer och 120 nM/brunn för proben. 20 μl mastermix tillsätts varje brunn i PCR-plattan innehållande denaturerat RNA.

2.2.4

Plattan placeras i en realtids termocykler programmerad för omvänd transkription och cDNA amplifiering/fluorescensdetektion enligt tillverkarens anvisningar. Amplifieringsförhållandena består exempelvis av ett första steg med omvänd transkription i 10 minuter vid 48 °C, följt av 10 minuter vid 95 °C och 40 cykler på 15 sekunder vid 95 °C och 45 sekunder vid 60 °C.

2.2.5

Prover betraktas som positiva om den normaliserade fluorescensen för AHSV RT-PCR-testet överstiger ett tröskelvärde på 0,1 inom 36 PCR-cykler i alla replikat av ett prov.

Prover betraktas som osäkra om den normaliserade fluorescensen för AHSV RT-PCR-testet överstiger ett tröskelvärde på 0,1 mellan PCR-cyklarna 36 och 40 i minst ett replikat av ett prov.

Prover betraktas som negativa om den normaliserade fluorescensen för AHSV RT-PCR-testet inte överstiger ett tröskelvärde på 0,1 inom 40 PCR-cykler i alla replikat av ett prov och om den normaliserade fluorescensen för det patentskyddade syntetiska externa kontrolltestet överstiger ett tröskelvärde på 0,1 inom 33 PCR-cykler.”