1.

Testna metoda za določanje motnjave in prepustnosti roženice goveda (BCOP) je testna metoda in vitro, ki se pod določenimi pogoji in z določenimi omejitvami uporablja za razvrščanje snovi in zmesi med ‚jedke in zelo dražilne za oči‘ (1) (2) (3). Pri tej testni metodi so zelo dražilne snovi tiste snovi, ki povzročajo poškodbe oči, ki se pri zajcu ohranijo najmanj 21 dni po aplikaciji. Čeprav testa in vivo na očeh zajcev ne more nadomestiti popolnoma, se test BCOP priporoča kot del stopenjske testne strategije za regulativno razvrščanje in označevanje za posebna področja uporabe (4)(5). Testne snovi in zmesi (6) se lahko razvrstijo med jedke ali zelo dražilne snovi za oči, ne da bi bilo potrebno opraviti dodatno testiranje na zajcih. Snov z negativnim testnim rezultatom bi bilo treba testirati na zajcih s pomočjo sekvenčne testne strategije, ki je določena v testni smernici OECD 405 (7) (poglavje B. 5 te priloge).

2.

V tej testni metodi so opisani postopki za oceno potencialne jedkosti in močne dražilnosti testne snovi za oči glede na njeno sposobnost, da v izolirani roženici goveda povzroča motnjavo in povečano prepustnost. Toksični učinki na roženico se merijo z: (i) zmanjšanim prenosom svetlobe (motnjava) in (ii) povečanim prehajanjem barvila natrijevega fluoresceina (prepustnost). Oceni motnjave in prepustnosti roženice po aplikaciji testne snovi skupaj pomenita dražilnost in vitro (IVIS), ki se uporablja za razvrstitev testne snovi v različne stopnje draženja.

3.

S testno metodo BCOP so bile testirane tudi dražilne snovi, ki povzročajo poškodbe oči, ki izginejo v manj kot 21 dnevih, in nedražilne snovi. Vendar natančnost in zanesljivost testne metode BCOP pri snoveh iz teh dveh kategorij nista bili ocenjeni formalno.

4.

Opredelitve so navedene v dodatku I.

5.

Ta testna metoda temelji na protokolu testne metode BCOP Medagencijskega usklajevalnega odbora za validacijo alternativnih metod (ICCVAM)(8), ki je bil pripravljen po mednarodni študiji o validaciji (4)(5)(9), pri kateri sta sodelovala Evropski center za validacijo alternativnih metod (ECVAM) in Japonski center za validacijo alternativnih metod (JaCVAM). Protokol temelji na informacijah, ki jih je prispeval Inštitut za raziskave in vitro (IIVS), in protokolu INVITTOX 124 (10), ki se je uporabil pri predvalidacijski študiji o preskusu BCOP, ki je bila opravljena med leti 1997–1998 in ki jo je sponzorirala Evropska skupnost. Oba protokola temeljita na testni metodologiji BCOP, o kateri je prvi poročal Gautheron et al. (11).

6.

Opredeljene omejitve za to testno metodo temeljijo na visokem številu lažno pozitivnih rezultatov za alkohole in ketone ter visokem številu lažno negativnih rezultatov za trdne snovi, zbranih v podatkovni zbirki za validacijo (glej točko 44) (5). Če se snovi iz teh kemijskih in fizikalnih razredov izključijo iz podatkovne zbirke, se natančnost BCOP v sistemih za razvrščanje snovi EU, EPA in GHS bistveno izboljša (5). Pri tem preskusu (tj. za ugotavljanje izključno jedkih in zelo dražilnih snovi za oči) lažno negativni rezultati niso kritični, saj bi se take snovi nato preskušale na zajcih ali, odvisno od regulativnih zahtev, z drugimi ustrezno potrjenimi testi in vitro, pri katerih se uporablja sekvenčna testna strategija, ki temelji na teži dokazov. Poleg tega nekaterih kemijskih ali proizvodnih razredov (npr. zmesi) s trenutno validacijsko podatkovno zbirko ni bilo mogoče ustrezno oceniti. Vendar pa bi lahko preskuševalci to testno metodo uporabili pri vseh vrstah testnega materiala (tudi pri zmeseh), pri čemer bi bil pozitiven rezultat sprejemljiv kot indikator za jedko ali zelo dražilno snov za oči. Pozitivne rezultate, pridobljene z uporabo alkoholov ali ketonov, je treba razlagati previdno, saj obstaja tveganje, da so vanje vključeni tudi lažno pozitivni rezultati.

7.

Pri vseh postopkih na očesih in roženicah goveda je treba upoštevati veljavna pravila in postopke testnega urada o ravnanju z živalskim materialom, kamor spadajo med drugim tudi tkiva in tkivne tekočine. Priporočajo se splošni previdnostni ukrepi za laboratorije (12).

8.

Čeprav testna metoda upošteva nekatere učinke, ocenjene s testno metodo za ugotavljanje dražilnih snovi na očeh zajcev, in do določene mere tudi njihovo resnost, je kljub temu omejena, saj ne upošteva poškodb veznice in šarenice. Čeprav tudi same reverzibilnosti poškodb roženice s preskusom BCOP ni mogoče oceniti, je bilo na podlagi študij na očeh zajcev kljub temu predlagano, da se oceni prvotna globina poškodbe roženice ter tako razlikuje med ireverzibilnimi in reverzibilnimi učinki (13). Treba je tudi opozoriti, da s testno metodo BCOP ni mogoče oceniti potencialne sistemske toksičnosti, povezane z izpostavljenostjo oči.

9.

Trenutno potekajo prizadevanja za nadaljnjo karakterizacijo uporabnosti in omejitev preskusa BCOP za ugotavljanje lažje dražilnih in nedražilnih snovi (glej tudi točko 45). Uporabnikom se priporoča, da organizacijam za validacijo zagotovijo vzorce in/ali podatke za uradno oceno morebitnih prihodnjih uporab testne metode BCOP, vključno za ugotavljanje lažje dražilnih in nedražilnih snovi.

10.

Laboratoriji, ki ta preskus opravljajo prvič, morajo uporabiti kemikalije za preverjanje usposobljenosti iz dodatka 2. Te kemikalije uporabijo, da dokažejo, da so tehnično sposobni izvajati testno metodo BCOP, preden podatke o testu BCOP predložijo za regulativno razvrstitev nevarnosti.

11.

Testna metoda BCOP je organotipski model, ki zagotavlja kratkoročno ohranjanje običajne fiziološke in biokemijske funkcije roženice goveda in vitro. Pri tej testni metodi se poškodba, ki jo povzroči testna snov, oceni tako, da se spremembe motnjave in prepustnosti roženice merijo kvantitativno z opacitometrom oziroma spektrofotometrom vidne svetlobe. Obe meritvi se uporabita za izračun IVIS, na podlagi katerega se dodeli kategorija nevarnosti dražilnosti in vitro, s pomočjo katere se predvidi potencialni dražilni učinek testne snovi in vivo (glej merila za odločanje).

12.

Pri testni metodi BCOP se uporabljajo izolirane roženice oči sveže zaklanega goveda. Motnjava roženice se meri kvantitativno in ustreza količini svetlobe, ki prodre skozi roženico. Prepustnost se meri kvantitativno in ustreza količini barvila natrijevega fluoresceina, ki prodre skozi celotno debelino roženice in ga zazna medij v zadnjem delu držala. Testne snovi se dodajo v sprednji del držala za roženico in se tako aplicirajo na epitelno površino roženice. Dodatek 3 vsebuje opis in sliko držala, ki se uporablja za BCOP. Držala za roženico ponujajo na trgu različna podjetja, laboratoriji pa jih lahko izdelajo tudi sami.

13.

Govedo, ki se zakolje v klavnicah, je običajno namenjeno za človeško prehrano ali druge komercialne uporabe. Pri testih BCOP se kot vir roženic uporabljajo samo zdrave živali, primerne za vstop v prehransko verigo. Ker so goveda glede na pasmo, starost in spol različno težka, ni priporočene teže za zakol.

14.

Velikost roženice se lahko pri očeh različno starih živali razlikuje. Roženice z vodoravnim premerom > 30,5 mm in centralno debelino roženice (CCT) ≥ 1 100 μm ima običajno govedo, starejše od osem let, roženice z navpičnim premerom < 28,5 mm in CCT < 900 μm pa običajno govedo, mlajše od pet let (14). Zato se oči goveda, starejšega od 60 mesecev, običajno ne uporabljajo. Oči goveda, mlajšega od 12 mesecev, se običajno prav tako ne uporabljajo, saj še niso popolnoma razvite, debelina in premer roženice pa sta bistveno manjša kot pri očeh starejšega goveda. Kljub temu se lahko uporabljajo roženice mladih živali (tj. starih od šest do 12 mesecev), saj ima njihova uporaba nekatere prednosti, npr. večja razpoložljivost, manjši starostni razpon in manjša nevarnost izpostavljenosti goveji spongiformni encefalopatiji za osebje klavnice (15). Ker bi bilo nadaljnje ocenjevanje učinka, ki ga imata velikost in debelina roženice na odzivnost jedkih in zelo dražilnih snovi za oči, koristno, se uporabnike spodbuja, da sporočijo približno starost in/ali težo živali, katerih roženice so uporabili v študiji.

15.

Oči odvzame osebje klavnice. Da bi čim bolj zmanjšali mehanske in druge vrste poškodb oči, jih morajo odvzeti takoj po zakolu. Da oči ne bi bile izpostavljene potencialno dražilnim snovem, osebje klavnice pri spiranju glav živali ne sme uporabljati detergentov.

16.

Oči je treba dati v dovolj veliko posodo, jih preliti s Hanksovo uravnoteženo raztopino soli (HBSS) in prepeljati v laboratorij tako, da se njihovo stanje čim manj poslabša in/ali da ne pride do bakterijske okužbe. Ker se oči odvzamejo med zakolom, lahko pridejo v stik s krvjo in drugimi biološkimi snovmi, vključno z bakterijami in drugimi mikroorganizmi. Zato mora biti tveganost okužbe čim manjša (tj. posoda, v kateri so oči, se mora hraniti na mokrem ledu, HBSS, ki se uporablja za hrambo oči med prevozom, pa je treba dodati antibiotike [tj. 100 IU/mL penicilina in 100 μg/mL streptomicina]).

17.

Čas med odvzemom oči in uporabo roženic mora biti pri BCOP čim krajši (običajno se odvzamejo in uporabijo isti dan) in ne sme vplivati na zanesljivost testnih rezultatov. Ti temeljijo na merilih za izbor oči ter pozitivnih in negativnih kontrolnih reakcijah. Vsa očesa, uporabljena v preskusu, morajo pripadati isti skupini oči, odvzeti na določen dan.

18.

Po prihodu v laboratorij se oči skrbno pregledajo, ali so poškodovane, vključno s povečano motnjavo, praskami in neovaskularizacijo. Uporabljajo se lahko samo roženice nepoškodovanih oči.

19.

Kakovost vsake roženice se oceni tudi v poznejši fazi preskusa. Roženice z motnjavo več kot sedem enot motnjave (OPOMBA: opacitometer je treba kalibrirati v skladu s standardi za določevanje enot motnjave, glej dodatek 3) je treba po enournem kalibriranju izločiti.

20.

Vsaka testna skupina (testna snov, primerjalne negativne in pozitivne kontrole) je sestavljena iz najmanj treh oči. Pri preskusu BCOP je treba za negativno kontrolo uporabiti tri roženice. Ker se roženice odstranijo s celotnega zrkla in pritrdijo v držala za roženice, se lahko zaradi artefaktov, ki nastanejo zaradi prijemanja, vrednosti motnjave in prepustnosti v posameznih primerih spremenijo (tudi pri negativni kontroli). Poleg tega se vrednosti motnjave in prepustnosti roženic z negativno kontrolno reakcijo uporabljajo za korigiranje vrednosti motnjave in preglednosti predmeta testiranja in pozitivnih kontrolnih vzorcev pri izračunih IVIS.

21.

Nepoškodovane roženice se secirajo tako, da se ohrani 2 do 3 mm širok rob beločnice, kar olajša nadaljnje ravnanje, pri čemer je treba paziti, da se epitelij in endotelij roženice ne poškodujeta. Izolirane roženice se pritrdijo v posebej za to izdelana držala, sestavljena iz sprednjega in zadnjega dela držala, na katera je roženica pripeta z epitelno oziroma endotelno stranjo. Oba dela držala se do roba napolnita z ogretim Eaglovim minimalnim osnovnim medijem EMEM (najprej zadnji del držala), pri čemer je treba zagotoviti, da se ne tvorijo mehurčki. Naprava se nato ekvilibrira pri 32 ± 1 °C najmanj eno uro, da se roženice ekvilibrirajo z medijem in da se doseže čim bolj normalna presnova (približna temperatura na površini roženice znaša in vivo 32 °C).

22.

Po ekvilibriranju se v oba dela držala doda svež, ogret medij EMEM, za vsako roženico pa se zabeležijo izhodiščne vrednosti motnjave. Roženice z makroskopskimi poškodbami tkiva (npr. praskami, pigmentacijo, neovaskularizacijo) ali motnjavo, večjo od sedem enot, se zavržejo. Nato se izračuna povprečna motnjava vseh ekvilibriranih roženic. Za negativno kontrolo (ali kontrolo s topilom) se izberejo najmanj tri roženice, katerih motnjava je blizu povprečni motnjavi vseh roženic. Preostale roženice se nato razdelijo na skupino za nadaljnje testiranje in skupino za pozitivne kontrole.

23.

Ker je toplotna kapaciteta vode večja od zraka, zagotavlja voda stabilnejše temperaturne pogoje za inkubacijo. Zato se priporoča, da se držalo za roženico in njegova vsebina hranita v vodni kopeli pri 32 ± 1 °C. Lahko se uporabljajo tudi inkubatorji za vzdrževanje temperature zraka, če zagotavljajo stabilno temperaturo (tj. s predčasnim segrevanjem držal in medijev).

24.

Vodita se dva različna testna protokola - eden za tekočine in površinsko aktivne snovi (trdne snovi ali tekočine) ter eden za površinsko neaktivne snovi (trdne snovi).

25.

Tekočine se testirajo nerazredčene, medtem ko se površinsko aktivne snovi testirajo v 10-odstotni koncentraciji w/v in 0,9-odstotni raztopini natrijevega klorida, destilirani vodi ali drugem topilu, za katerega je dokazano, da nima škodljivih učinkov na testni sistem. Poltrdne snovi, kreme in voski se navadno testirajo kot tekočine. Če se uporabljajo druge koncentracije raztopin, jih je treba ustrezno utemeljiti. Roženice so izpostavljene tekočinam in površinsko aktivnim snovem 10 minut. Če je čas izpostavljenosti drugačen, ga je treba ustrezno znanstveno utemeljiti.

26.

Površinsko neaktivne trdne snovi se navadno testirajo kot 20-odstotne raztopine ali suspenzije v 0,9-odstotni raztopini natrijevega klorida, destilirani vodi ali drugem topilu, za katerega je dokazano, da nima škodljivih učinkov na testni sistem. V določenih okoliščinah in če je znanstveno utemeljeno, se lahko trdne snovi testirajo tudi nerazredčene z neposredno aplikacijo na površino roženice, pri čemer se uporablja odprta metoda (glej točko 29). Roženice so izpostavljene trdnim snovem štiri ure; če je znanstveno utemeljeno, se lahko tako kot pri tekočinah in površinsko aktivnih snoveh čas izpostavljenosti spremeni.

27.

Uporabljajo se lahko različne testne metode, odvisno od fizikalnih in kemijskih lastnosti testne snovi (tj. trdna, tekoča, viskozna ali neviskozna tekočina). Najpomembnejše je zagotoviti, da testna snov dovolj dobro pokriva epitelno površino in da se med spiranjem ustrezno odstrani. Zaprta metoda se navadno uporablja za neviskozne do nekoliko viskozne testne snovi, medtem ko se odprta metoda navadno uporablja za polviskozne in viskozne tekoče testne tekočine in nerazredčene trdne snovi.

28.

Pri zaprti metodi se prek dozirnih odprtin na zgornji površini v sprednji del držala doda toliko testne snovi (750 μL), da ta prekrije epitelno stran roženice, odprtine pa se nato za čas izpostavljenosti zatesnijo s tesnilnimi čepki. Treba je zagotoviti, da je vsaka roženica testni snovi izpostavljena dovolj dolgo.

29.

Pri odprti metodi se pred testiranjem s sprednjega dela držala odstranita obroček za zapiranje okenca in stekleno okence. Kontrolna ali testna snov (750 μL ali dovolj testne snovi, da je prekrita celotna roženica) se aplicira neposredno na epitelno površino roženice z mikropipeto. Če se testna snov težko pipetira, se lahko za lažje doziranje testno snov nanese s pipeto za neposredno izpodrivanje tlaka. Konica pipete za neposredno izpodrivanje tlaka se vstavi v dozirno konico brizgalke, da se material napolni v konico za izpodrivanje pod tlakom. Če se potisni bat počasi sprošča, se vlečni bat pipete pomakne navzgor. Če se v konici pipete začnejo tvoriti zračni mehurčki, se predmet testiranja odstrani (izvrže) in postopek ponovi, dokler konica ni polna in v njej ni zračnih mehurčkov. Po potrebi se lahko uporabi običajna brizgalka (brez igle), saj omogoča merjenje natančne količine testne snovi in lažjo aplikacijo na epitelno površino roženice. Po doziranju se na sprednji del držala ponovno namesti stekleno okence in tako ponovno ustvari zaprt sistem.

30.

Po izpostavljenosti se testna snov, snov za negativno kontrolo ali snov za pozitivno kontrolo odstrani iz sprednjega dela držala, epitelij pa se najmanj trikrat (oziroma dokler testna snov ni več vidna) spere z EMEM (ki vsebuje fenol rdeče). Za spiranje se uporablja medij, ki vsebuje fenol rdeče, saj se lahko s spreminjanjem barv v fenol rdečem nadzoruje, ali je bilo spiranje kislih ali alkalnih materialov učinkovito. Če je fenol rdeče še vedno obarvano (rumeno ali vijoličasto) ali če je testna snov še vedno vidna, se roženice sperejo več kot trikrat. Ko v mediju ni več testne snovi, se roženice še zadnjič sperejo z EMEM (brez fenol rdečega). EMEM (brez fenol rdečega) se uporabi pri zadnjem spiranju, da se zagotovi, da je bilo fenol rdeče odstranjeno iz sprednjega dela držala pred merjenjem motnjave. Nato se sprednji del držala ponovno napolni s svežim EMEM brez fenol rdečega.

31.

Pri tekočinah ali površinsko aktivnih snoveh se roženice po spiranju dajo v inkubator še za dve dodatni uri pri 32 ± 1 °C. V določenih okoliščinah je po izpostavljenosti koristna tudi daljša inkubacija, vendar je to odvisno od vsakega posameznega primera. Roženice, ki se testirajo s trdnimi snovmi, se po štirih urah izpostavljenosti temeljito sperejo, vendar pri njih nadaljnja inkubacija ni potrebna.

32.

Po končani inkubaciji, ki sledi izpostavljenosti (pri tekočinah in površinsko aktivnih snoveh), oziroma po koncu štiriurne izpostavljenosti (pri površinsko neaktivnih trdnih snoveh) se zabeležita motnjava in prepustnost vsake roženice. Poleg tega se vsaka roženica pregleda vizualno in zabeležijo vsa pomembnejša opažanja (npr. lupljenje tkiva, prisotnost preostale testne snovi, neenotni vzorci motnjave). Ta opažanja so lahko pomembna, saj se lahko odražajo v odklonih, ki jih izmeri opacitometer.

33.

Vsak poskus vključuje primerjalno negativno kontrolo ali kontrolo s topilom/vehiklom ter pozitivno kontrolo.

34.

Pri testiranju 100-odstotne tekoče snovi se v testno metodo BCOP vključi primerjalna negativna kontrola (npr. 0,9-odstotna raztopina natrijevega klorida ali destilirane vode), da se ugotovijo nespecifične spremembe testnega sistema in zagotovijo izhodiščne vrednosti za končne točke preskusa. Ta kontrola tudi zagotavlja, da preskusni pogoji ne povzročajo dražilnih reakcij.

35.

Pri testiranju razredčene tekočine, površinsko aktivne ali trdne snovi se v testno metodo BCOP vključi primerjalna kontrolna skupina s topilom/vehiklom, da se ugotovijo nespecifične spremembe testnega sistema in zagotovijo izhodiščne vrednosti za končne točke preskusa. Uporablja se lahko samo topilo/vehikel, za katerega je dokazano, da nima škodljivih učinkov na testni sistem.

36.

Pri vsakem poskusu se kot primerjalna pozitivna kontrola vključi tudi znana dražilna snov za oči, da se zagotovi, da se sproži želena reakcija. Ker se pri tej testni metodi preskus BCOP uporablja za ugotavljanje jedkih ali zelo dražilnih snovi za oči, mora biti referenčna snov pri pozitivni kontroli snov, ki pri tej testni metodi povzroči močno reakcijo. Da se zagotovi, da se odkloni pri reakcijah pozitivne kontrole ocenjujejo v daljšem obdobju, stopnja dražilnega učinka ne sme biti prevelika.

37.

Primera pozitivnih kontrol za tekoče testne snovi sta dimetilformamid ali 1-odstoten natrijev hidroksid. Primer pozitivne kontrole za trdno testno snov je 20-odstoten w/v imidazol v 0,9-odstotni raztopini natrijevega klorida.

38.

Primerjalne snovi so primerne za ocenjevanje potencialnih dražilnih učinkov, ki jih imajo neznane kemikalije določenega kemijskega ali proizvodnega razreda na oči, ali za ocenjevanje relativnega potencialnega draženja dražilne snovi za oko v določenem razponu dražilnih reakcij.

39.

Motnjava je odvisna od količine svetlobe, ki prodre skozi roženico. Motnjava roženice se meri kvantitativno s pomočjo opacitometra, pri čemer se meri neprekinjeno.

40.

Prepustnost je odvisna od količine barvila natrijevega fluoresceina, ki prodre skozi vse celične sloje roženice (tj. od epitelija na zunanji površini roženice do endotelija na notranji površini roženice). V sprednji del držala za roženico, na katerega je pripeta epitelna stran roženice, se doda 1 mL raztopine natrijevega fluoresceina (4 ali 5 mg/mL pri testiranju tekočin in površinsko aktivnih snovi oziroma površinsko neaktivnih snovi), medtem ko se zadnji del držala, na katerega je pripeta endotelna stran roženice, napolni s svežim EMEM. Držalo se nato da v inkubator v vodoravnem položaju za 90 ± 5 minut pri 32 ± 1 °C. Količina natrijevega fluoresceina, ki prodre v zadnji del držala, se meri kvantitativno s pomočjo spektrofotometrije UV/VIS. Spektrofotometrične meritve pri 490 nm se beležijo kot neprekinjeno merjene vrednosti optične gostote (OD490) ali absorbance. Prepustnost fluorosceina se določa z vrednostmi OD490, ki so bile izmerjene s spektrofotometrom vidne svetlobe pri standardni dolžini poti 1 cm.

41.

Namesto spektrofotometra se lahko uporablja tudi čitalec 96-mestnih mikrotiterskih plošč, pod pogojem, da: (i) se lahko določi linearno merilno območje čitalca za določevanje vrednosti fluroesceina OD490 in (ii) če se v 96-mestni mikrotiterski plošči uporablja dovolj veliko vzorcev fluoresceina, da se zagotovijo vrednosti OD490, ki ustrezajo standardni dolžini poti 1 cm (za to so lahko potrebne popolnoma napolnjene posode [navadno 360 μL]).

42.

Po korigiranju vrednosti motnjave in povprečne prepustnosti (OD490) za vrednosti ozadja za motnjavo in vrednosti prepustnosti negativne kontrole OD490 se vrednosti povprečne motnjave in prepustnosti OD490 za vsako testno skupino združijo v empirično izpeljani formuli, s katero se izračuna vrednost draženja in vitro (IVIS) za vsako testno skupino, kot sledi:

IVIS = povprečna vrednost motnjave + (15 × povprečna vrednost prepustnosti OD490)

Po Sini et al. (16) je bila ta formula izpeljana na podlagi laboratorijskih in medlaboratorijskih študij. Podatki, zbrani med multilaboratorijsko študijo za 36 spojin, so bili ocenjeni z multivariantno analizo, s katero se je določila najustreznejša enačba za primerjanje podatkov in vivo ter in vitro. Analizo so opravili znanstveniki dveh različnih podjetij in izpeljali skoraj identični enačbi.

43.

Vrednosti motnjave in prepustnosti je treba oceniti tudi neodvisno, da se ugotovi, ali testna snov skozi eno od dveh končnih točk učinkuje jedko ali zelo dražilno (glej merila za odločanje).

44.

Snov z IVIS ≥ 55,1 velja za jedko ali zelo dražilno snov. Kot je navedeno pod točko 1, je treba testno snov, ki ni opredeljena kot jedka ali zelo dražilna za oči, zaradi razvrščanja in označevanja dodatno testirati. V primerjavi s podatki testne metode in vivo na očeh zajcev, razvrščenih po sistemih za razvrščanje EPA (1), EU (2) ali GHS (3), je splošna natančnost testne metode BCOP 79-odstotna (113/143) do 81-odstotna (119/147), delež lažno pozitivnih rezultatov 19-odstoten (20/103) do 21-odstoten (22/103) ter delež lažno negativnih rezultatov 16-odstoten (7/43) do 25-odstoten (10/40). Če se iz podatkovne zbirke izključijo snovi določenega kemijskega (npr. alkoholi, ketoni) ali fizikalnega razreda, je natančnost testa BCOP po sistemih za razvrščanje EU, EPA in GHS 87-odstotna (72/83) do 92-odstotna (78/85), delež lažno pozitivnih rezultatov 12-odstoten (7/58) do 16-odstoten (9/56) ter delež lažno negativnih rezultatov 0-odstoten (0/27) do 12-odstoten (3/26).

45.

Tudi če jedke ali zelo dražilne testne snovi za oči ni mogoče razvrstiti, so lahko podatki, pridobljeni z BCOP in testom in vivo na očeh zajcev ali primerno validiranim testom in vitro, koristni za nadaljnje ocenjevanje primernosti in omejitev testne metode BCOP za določanje nejedkih in ne zelo dražilnih snovi (trenutno se pripravljajo smernice za uporabo testnih metod in vitro za ugotavljanje toksičnosti za oči).

46.

Test se šteje za sprejemljivega, če je pri pozitivni kontroli vrednost IVIS znotraj dveh standardnih odklonov veljavne povprečne vrednosti iz preteklih testov, ki jo je treba posodobiti najmanj vsake tri mesece oziroma vedno, kadar opravljajo test laboratoriji, ki redko opravljajo teste (tj. manj kot enkrat mesečno). Reakcije negativne kontrole s topilom/vehiklom morajo dati vrednosti motnjave in prepustnosti, ki so manjše od veljavnih zgornjih omejitev vrednosti ozadja za motnjavo in prepustnosti roženic goveda, testiranih z zadevnimi negativnimi kontrolami ali kontrolami s topilom/vehiklom.

47.

V poročilu o testu je treba navesti naslednje informacije (če so pomembne za izvedbo študije):

testne in kontrolne snovi

podatki o naročniku in testnem laboratoriju

utemeljitev testne metode in uporabljenega protokola

celovitost testne metode

postopek za zagotavljanje celovitosti (tj. natančnosti in zanesljivosti) testne metode v daljšem časovnem obdobju (npr. redno testiranje snovi za preverjanje sposobnosti, uporaba podatkov o negativni in pozitivni kontroli iz preteklih testov).

merila za sprejemljivost testa

testni pogoji

rezultati

razprava o rezultatih

sklepne ugotovitve.

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

(2)

Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directive 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No. 1907/2006. OJ L 353, 31.12.2008, p. 1.

(3)

UN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneva: United Nations Publications, 2007.Available:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Available:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(5)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(6)

Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ L 396, 30.12.2006, p. 1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Available:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italy: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

(11)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

(12)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Available:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(13)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

(15)

Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The Lancet 349: 636-641.

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam Appl Toxicol 26:20-31.

(17)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Na voljo:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

1.

Testna metoda na izoliranih očeh piščancev (ICE) je testna metoda in vitro, ki se pod določenimi pogoji in z določenimi omejitvami uporablja za razvrščanje snovi in zmesi med ‚jedke in zelo dražilne za oči‘ (1) (2) (3). V tej testni metodi so zelo dražilne snovi tiste snovi, ki povzročajo poškodbe oči, ki se pri zajcu ohranijo najmanj 21 dni po aplikaciji. Čeprav testa in vivo na očeh zajcev ne more nadomestiti popolnoma, se test ICE priporoča kot del stopenjske testne strategije za regulativno razvrščanje in označevanje za posebna področja uporabe (4) (5). Testne snovi in zmesi (6), ki v tem preskusu dajo pozitiven rezultat, se lahko razvrstijo med jedke ali zelo dražilne snovi za oči, ne da bi bilo potrebno opraviti dodatno testiranje na zajcih. Snov z negativnim rezultatom testa bi bilo treba testirati na zajcih s pomočjo sekvenčne testne strategije, ki je določena v preskusni smernici OECD 405 (7) (poglavje B. 5 te priloge).

2.

V tej testni metodi so opisani postopki za oceno potencialne jedkosti in močne dražilnosti testne snovi za oči glede na njeno sposobnost, da v izoliranem očesu piščanca povzroča toksičnost. Toksični učinki na roženico se merijo z: (i) kvalitativnim ocenjevanjem motnjave, (ii) kvalitativnim ocenjevanjem poškodbe epitelija po aplikaciji fluoresceina (zadrževanje fluoresceina), (iii) kvantitativnim ocenjevanjem povečane debeline (nabreklosti) in (iv) kvantitativnim ocenjevanjem makroskopske morfološke poškodbe na površini. Motnjava roženice, nabreklost in ocenjevanje poškodb po izpostavljenosti testni snovi se najprej ocenijo posamično in nato združijo, da se lahko določi stopnja dražilnosti očesa.

3.

S testno metodo ICE so bile testirane tudi dražilne snovi, ki povzročajo poškodbe oči, ki izginejo v manj kot 21 dneh, in nedražilne snovi. Vendar natančnost in zanesljivost testne metode ICE pri snoveh iz teh dveh kategorij nista bili ocenjeni formalno.

4.

Opredelitve so navedene v dodatku 1.

5.

Ta testna metoda temelji na protokolu (8) testne metode ICE Medagencijskega usklajevalnega odbora za validacijo alternativnih metod (ICCVAM), ki je bil pripravljen po mednarodni študiji o validaciji (4)(5)(9), pri kateri so sodelovali Evropski center za validacijo alternativnih metod (ECVAM), Japonski center za validacijo alternativnih metod (JaCVAM) ter Oddelek za toksikologijo in uporabno farmakologijo nizozemskega Inštituta za raziskave TNO. Protokol temelji na informacijah iz objavljenih protokolov ter protokolu, ki ga uporablja TNO (10) (11) (12) (13) (14).

6.

Opredeljene omejitve za to testno metodo temeljijo na visokem številu lažno pozitivnih rezultatov za alkohole ter visokem številu lažno negativnih rezultatov za trdne in površinsko aktivne snovi (glej točko 47) (4). Če se snovi iz teh kemijskih in fizikalnih razredov izključijo iz podatkovne zbirke, se natančnost ICE v sistemih za razvrščanje EU, EPA in GHS bistveno izboljša (4). Pri tem preskusu (tj. za ugotavljanje izključno jedkih in zelo dražilnih snovi za oči) lažno negativni rezultati niso kritični, saj bi se take snovi nato preskušale na zajcih ali, odvisno od regulativnih zahtev, z drugimi ustrezno potrjenimi testi in vitro, pri katerih se uporablja sekvenčna testna strategija, ki temelji na teži dokazov. Poleg tega nekaterih kemijskih ali proizvodnih razredov (npr. zmesi) s trenutno validacijsko podatkovno zbirko ni bilo mogoče ustrezno oceniti. Vendar pa bi lahko preskuševalci to testno metodo uporabili pri vseh vrstah testnega materiala (tudi pri zmeseh), pri čemer bi bil pozitiven rezultat sprejemljiv kot indikator za jedko ali zelo dražilno snov za oči. Pozitivne rezultate, pridobljene z uporabo alkoholov, je treba razlagati previdno, saj obstaja tveganje, da so vanje vključeni tudi lažno pozitivni rezultati

7.

Pri vseh postopkih na očesih piščancev je treba upoštevati veljavna pravila in postopke testnega urada o ravnanju s človeškim ali živalskim materialom, kamor spadajo med drugim tudi tkiva in tkivne tekočine. Priporočajo se splošni previdnostni ukrepi za laboratorije (15).

8.

Čeprav testna metoda upošteva nekatere učinke na očesa, ocenjene s testno metodo za ugotavljanje dražilnih snovi na očeh zajcev, in do določene mere tudi njihovo resnost, je kljub temu omejena, saj ne upošteva poškodb veznice in šarenice. Čeprav tudi same reverzibilnosti poškodb roženice s testom ICE ni mogoče oceniti, je bilo na podlagi študij na očeh zajcev kljub temu predlagano, da se oceni prvotna globina poškodbe roženice ter tako razlikuje med ireverzibilnimi in reverzibilnimi učinki (16). Treba je tudi opozoriti, da s testno metodo ICE ni mogoče oceniti potencialne sistemske toksičnosti, povezane z izpostavljenostjo oči.

9.

Trenutno potekajo prizadevanja za nadaljnjo karakterizacijo uporabnosti in omejitev testne metode ICE za ugotavljanje lažje dražilnih in nedražilnih snovi (glej tudi točko 48). Uporabnikom se priporoča, da organizacijam za validacijo zagotovijo vzorce in/ali podatke za uradno oceno morebitnih prihodnjih uporab testne metode ICE, vključno za ugotavljanje lažje dražilnih ali nedražilnih snovi za oči.

10.

Laboratoriji, ki ta preskus opravljajo prvič, morajo uporabiti kemikalije za preverjanje usposobljenosti iz dodatka 2. Te kemikalije uporabijo, da dokažejo, da so tehnično sposobni izvajati testno metodo ICE, preden podatke o testu ICE predložijo za regulativno razvrstitev nevarnosti.

11.

Testna metoda ICE je organotipski model, ki zagotavlja kratkoročno ohranjanje piščančjega očesa v in vitro. Pri tej testni metodi se poškodba, ki jo povzroči testna snov, oceni tako, da se določijo nabreklost roženice, njena prepustnost in zadrževanje fluorosceina. Medtem ko se zadnja parametra ocenjujeta kvalitativno, je treba nabreklost roženice oceniti kvantitativno. Vsaka meritev se pretvori v kvantitativen rezultat, ki se uporabi za izračun splošnega indeksa dražilnosti, ali pa se ji dodeli kvalitativna kategorija, ki se uporablja za razred jedkosti in močne dražilnosti za oči in vitro. Oba rezultata se lahko nato uporabita za predvidevanje jedkosti in močne dražilnosti testne snovi za oči in vivo (glej merila za odločanje).

12.

Za ta preskus se običajno uporabljajo oči piščancev, ki so bili zaklani v klavnicah in namenjeni za človeško prehrano, kar pomeni, da poskusne živali niso potrebne. Uporabljajo se samo oči zdravih živali, primernih za vstop v prehransko verigo

13.

Čeprav kontrolirana študija za ocenjevanje najprimernejše starosti piščancev ni bila opravljena, se pri tej testni metodi uporabljajo mladi piščanci, ki so bili zaklani v klavnicah (tj. piščanci, stari približno sedem tednov in težki od 1,5–2,5 kg).

14.

Glave se odstranijo neposredno po omamljanju piščancev, običajno z električnim šokom, in po izkrvavitvi zaradi prereza vratu. Piščanci se morajo nahajati v bližini laboratorija, tako da se njihove glave iz klavnice v laboratorij pripeljejo dovolj hitro, da se njihovo stanje čim manj poslabša in/ali da ne pride do bakterijske okužbe. Čas med odvzemom oči in uporabo glav piščancev mora biti pri testni metodi ICE čim krajši (navadno dve uri) in ne sme vplivati na zanesljivost rezultatov preskusa. Ti temeljijo na merilih za izbor oči ter pozitivnih in negativnih kontrolnih reakcijah. Vsa očesa, uporabljena v preskusu, morajo pripadati isti skupini oči, odvzeti na določen dan.

15.

Ker se očesa secirajo v laboratoriju, se intaktne glave iz klavnice v laboratorij prepeljejo na sobni temperaturi v plastičnih posodah in navlažene s krpami, napojenimi z izotonično fiziološko raztopino.

16.

Oči z močno izhodiščno obarvanostjo s fluoresceinom (tj. > 0,5) ali motno roženico (tj. > 0,5) po izolaciji se zavržejo.

17.

Vsaka testna skupina in primerjalna pozitivna kontrola sta sestavljeni iz najmanj treh oči. Za negativno kontrolo ali kontrolo s topilom (če se namesto fiziološke raztopine uporablja drugo topilo) se uporabi najmanj eno oko.

18.

Skrbno se odstranijo veke, pri čemer je treba paziti, da se roženica ne poškoduje. Celovitost roženice se hitro oceni tako, da se na njeno površino za nekaj sekund aplicira kapljica 2-odstotnega (w/v) natrijevega fluoresceina, površina pa se nato spere z izotonično fiziološko raztopino. Oči, ki jim je bil dodan fluorescein, se nato osvetlijo s špranjsko svetilko, da se roženica ne bi poškodovala (tj. zadrževanje fluoresceina in motnjava roženice ≤ 0,5).

19.

Če je oko nepoškodovano, se izreže iz lobanje, pri čemer je treba paziti, da se roženica ne poškoduje. Zrklo se potegne iz očesne votline potegne tako, da se žmurka zagrabi s kirurškimi prijemalkami, očesne mišice pa se prerežejo z ukrivljenimi škarjami s topo konico. Tako se prepreči, da bi se roženica zaradi prevelikega tlaka poškodovala (tj. artefakti zaradi stisnjenja).

20.

Ko se oko odstrani iz očesne votline, se ga mora še vedno držati viden del vidnega živca. Po odstranitvi iz očesne votline se oko položi na vpojno podlago, nato pa se odrežeta žmurka in preostalo vezno tkivo.

21.

Izolirano oko se pritrdi v prijemalko iz nerjavečega materiala, pri čemer mora biti roženica v vodoravnem položaju. Prijemalka se nato prenese v komoro naprave za superfuzijo (16). Prijemalke je treba v napravi za superfuzijo namestiti tako, da je celotna roženica pokrita z izotonično fiziološko raztopino. Temperatura v komorah naprave za superfuzijo mora znašati 32 ± 1,5 °C. Dodatek 3 vsebuje diagram običajne naprave za superfuzijo z očesnimi prijemalkami, ki je na voljo na trgu, laboratoriji pa jo lahko izdelajo tudi sami. Naprava se lahko prilagodi potrebam posameznega laboratorija (tj. za sprejem različnega števila oči).

22.

V napravi za superfuzijo se oči še enkrat pregledajo s špranjsko svetilko, da se zagotovi, da se med seciranjem niso poškodovale. Pri tem se z nastavkom za merjenje globine na špranjski svetilki na apeksu roženice izmeri tudi debelina roženice. Oči z (i) vrednostjo zadržanega fluoresceina > 0,5; (ii) motnjavo roženice > 0,5; ali (iii) dodatnimi znaki poškodb je treba zamenjati. Za oči, ki se na podlagi teh meril ne zavržejo, velja, da se kljub temu zavržejo, če debelina roženice za več kot 10 % odstopa od povprečne vrednosti vseh oči. Uporabniki morajo upoštevati, da lahko špranjske svetilke pri različnih širinah špranje za debelino roženice dajo različne merilne vrednosti. Širino špranje je treba nastaviti na 0,095 mm.

23.

Po pregledu in izločitvi se oči dajo v inkubator za približno 45 do 60 minut, da se pred doziranjem ekvilibrirajo s testnim sistemom. Po ekvilibriranju se kot izhodiščna vrednost za debelino in motnjavo roženice zabeleži nična vrednost (tj. čas = 0). Vrednost fluoresceina, določena pri seciranju, se uporabi kot izhodiščna vrednost za končno točko.

24.

Po meritvi z ničnimi referenčnimi vrednostmi se oko (in držalo) odvzame iz naprave za superfuzijo in da v vodoravni položaj, nato pa se na roženico aplicira testna snov.

25.

Tekoče testne snovi se običajno testirajo nerazredčene, lahko pa se po potrebi tudi razredčijo (tj. kot del koncepta študije). Najpogosteje se kot topilo pri razredčenih snoveh uporablja fiziološka raztopina. Pod kontrolnimi pogoji se lahko uporabljajo tudi druga topila, vendar je treba dokazati, da so primerna.

26.

Tekoče testne snovi se aplicirajo na roženico tako, da je s testno snovjo enakomerno pokrita celotna površina roženice; standardna prostornina je 0,03 mL.

27.

Če je mogoče, je treba trdne testne snovi čim bolj zdrobiti v terilnici s pestilom ali primerljivim orodjem za trenje. Prašek se aplicira na roženico tako, da je njena površina enakomerno pokrita s testno snovjo; standardna količina je 0,03 g.

28.

Testna snov (tekoča ali trdna) se pusti učinkovati 10 sekund, nato pa se spere z očesa s fiziološko raztopino (približno 20 mL) pri sobni temperaturi. Oko (in držalo) se nato ponovno da v napravo za superfuzijo v prvotnem pokončnem položaju.

29.

Vsak poskus vključuje primerjalno negativno kontrolo ali kontrolo s topilom/vehiklom ter pozitivne kontrole.

30.

Pri testiranju 100-odstotnih tekočin ali trdnih snovi se kot primerjalna negativna kontrola pri testni metodi ICE uporablja fiziološka raztopina, da se ugotovijo nespecifične spremembe testnega sistema in da preskusni pogoji ne povzročajo neustreznih dražilnih reakcij.

31.

Pri testiranju razredčenih tekočin se v testno metodo vključi primerjalna kontrolna skupina s topilom/vehiklom, da se ugotovijo nespecifične spremembe testnega sistema in da preskusni pogoji ne povzročajo dražilnih reakcij. Kot je navedeno v točki 25, se lahko uporablja samo topilo/vehikel, za katerega je dokazano, da nima škodljivih učinkov na testni sistem.

32.

Pri vsakem poskusu se kot primerjalna pozitivna kontrola vključi tudi znana dražilna snov za oči, da se zagotovi, da se sproži želena reakcija. Ker se pri tej testni metodi preskus ICE uporablja za ugotavljanje jedkih ali zelo dražilnih snovi, mora biti referenčna snov pri pozitivni kontroli snov, ki pri tej testni metodi povzroči močno reakcijo. Da se zagotovi, da se odkloni pri reakciji pozitivne kontrole ocenjujejo v daljšem časovnem obdobju, stopnja močne reakcije ne sme biti prevelika. Za pozitivno kontrolo je treba zbrati dovolj podatkov o in vitro, da se lahko izračuna statistično določen sprejemljiv razpon pozitivne kontrole. Če za določeno pozitivno kontrolo ni na voljo ustreznih podatkov o testni metodi ICE iz preteklosti, je treba opraviti študije, v katerih se bodo ti podatki zbrali.

33.

Primera pozitivnih kontrol za tekoče testne snovi sta 10-odstotna ocetna kislina ali 5-odstoten benzalkonijev klorid, primera pozitivnih kontrol za trdne testne snovi pa natrijev hidroksid in imidazol.

34.

Primerjalne snovi so primerne za ocenjevanje potencialnih dražilnih učinkov, ki jih imajo neznane kemikalije določenega kemijskega ali proizvodnega razreda na oči, ali za ocenjevanje relativnega potencialnega draženja dražilne snovi za oko v določenem razponu dražilnih učinkov.

35.

Testirane roženice se ocenijo pred testiranjem in nato 30, 75, 120, 180 in 240 minut (± 5 minut) po spiranju, ki se opravi po testiranju. Ti časovni intervali omogočajo ustrezno število meritev med štiriurnim testiranjem in zagotavljajo dovolj časa, da se oči med posameznimi meritvami ustrezno pregledajo.

36.

Končne točke, ki se ocenijo, so motnjava roženice, nabreklost, zadrževanje fluoresceina in morfološki učinki (tj. luknjičast ali odstopljen epitelij). Vse končne točke razen zadrževanja fluoresceina (ki se določi pred testiranjem in 30 minut po izpostavljenosti testni snovi) se določijo pri vsakem navedenem časovnem intervalu.

37.

Priporoča se, da se motnjava roženice, zadrževanje fluoresceina, morfološki učinki in morebitni histopatološki izvidi fotografirajo.

38.

Po štiriurnem pregledu je treba oči hraniti v ustrezni fiksirni raztopini (tj. v nevtralnem formalinskem pufru), da se lahko po potrebi opravi histopatološki pregled.

39.

Nabreklost roženice se določi na podlagi debelin roženice, izmerjenih z optičnim pahimetrom na špranjski svetilki. Izrazi se v odstotkih in izračuna na podlagi izmerjenih debelin roženic s pomočjo naslednje formule:

40.

Povprečna nabreklost roženice vseh testnih oči, izražena v odstotkih, se izračuna v vseh časovnih intervalih. Na podlagi najvišje povprečne vrednosti nabreklosti roženice, ki je bila zabeležena v vseh časovnih intervalih, se za vsako testno snov določi skupna vrednost posamezne kategorije.

41.

Pri izračunu motnjave roženice se upošteva površina najbolj motne roženice. Povprečna motnjava roženice vseh testnih oči se izračuna v vseh časovnih intervalih. Na podlagi najvišje povprečne vrednosti motnjave roženice, ki je bila zabeležena v vseh časovnih obdobjih, se za vsako testno snov določi skupna vrednost za posamezno kategorijo (tabela 1).

Tabela 1

Motnjava roženice

42.

Povprečna vrednost zadržanega fluoresceina se pri vseh testnih očeh izračuna samo za 30-minutno časovno obdobje in se za vsako testno snov dodeli kot skupna vrednost za posamezno kategorijo (tabela 2).

Tabela 2

Zadrževanje fluoresceina

43.

Morfološki učinki vključujejo ‚luknjičaste‘ epitelne celice roženice, ‚odstopljeni‘ epitelij, ‚kosmato‘ roženično površino in ‚prilepljeno‘ testno snov na roženico. Ta opažanja so lahko različno resna in se lahko pojavijo istočasno. Uvrščanje teh opažanj poteka subjektivno glede na razlago raziskovalca.

44.

Rezultate za motnjavo in nabreklost roženice ter zadrževanje fluoresceina je treba oceniti ločeno, da se ustvari razred ICE za vsako končno točko. Razredi ICE za vsako končno točko se nato združijo, da se vsaka testna snov lahko razvrsti v razred dražilnosti.

45.

Po oceni vsake končne točke se na podlagi vnaprej določenega razpona dodelijo razredi ICE. Debelina roženice (tabela 3), motnjava roženice (tabela 4) in zadrževanje fluoresceina (tabela 5) se razlagajo s pomočjo štirih razredov ICE po naslednjih lestvicah:

Tabela 3

Merila ICE za razvrstitev glede na debelino roženice

Tabela 4

Merila ICE za razvrstitev motnjave roženice

Tabela 5

Merila ICE za razvrstitev glede na povprečno vrednost zadržanega fluoresceina

46.

Splošni razred testne snovi za dražilnost in vitro se določi tako, da se za razrede dražilnosti, ki ustrezajo ugotovljenim kategorijam za nabreklost in motnjavo roženice ter zadrževanje fluoresceina, uporabi formula iz tabele 6.

Tabela 6

Splošna razvrstitev za dražilnost in vitro

47.

Kot je navedeno v prvem odstavku, je treba testno snov, ki ni opredeljena kot jedka ali zelo dražilna za oči, zaradi razvrščanja in označevanja dodatno testirati. V primerjavi s podatki testne metode in vivo na očeh zajcev za določanje jedkih ali zelo dražilnih snovi za oči, razvrščenih po EPA (1), EU (2) ali GHS (3), je splošna natančnost testne metode ICE 83-odstotna (120/144) do 87-odstotna (134/154), delež lažno pozitivnih rezultatov 6-odstoten (7/122) do 8-odstoten (9/116) ter delež lažno negativnih rezultatov 41-odstoten (13/32) do 50-odstoten (15/30). Če se iz podatkovne zbirke izključijo snovi nekaterih kemijskih (npr. alkoholi, ketoni) ali fizikalnih razredov (npr. trdne snovi), je natančnost testa ICE po sistemih za razvrščanje EU, EPA in GHS 91-odstotna (75/82) do 92-odstotna (69/75), delež lažno pozitivnih rezultatov 5-odstoten (4/73) do 6-odstoten (4/70) ter delež lažno negativnih rezultatov 29-odstoten (2/7) do 33-odstoten (3/9) (4).

48.

Tudi če jedke ali zelo dražilne testne snovi za oči ni mogoče razvrstiti, so lahko podatki, pridobljeni s ICE in testom in vivo na očeh zajcev ali primerno validiranim testom in vitro, koristni za nadaljnje ocenjevanje primernosti in omejitev testne metode ICE za določanje nejedkih in ne zelo dražilnih snovi (smernice za uporabo testnih metod in vitro za ugotavljanje toksičnosti za oči se pripravljajo).

49.

Test se šteje za sprejemljivega, če dajo primerjalne negativne kontrole s vehiklom/topilom in primerjalne pozitivne kontrole za dražilnost vrednosti, ki spadajo v razrede nedražilnih snovi oziroma razrede zelo dražilnih/jedkih snovi.

50.

V poročilu o testu je treba navesti naslednje informacije (če so pomembne za izvedbo študije):

testne in kontrolne snovi

podatki o naročniku in testnem laboratoriju

utemeljitev testne metode in uporabljenega protokola

celovitost testne metode

postopek za zagotavljanje celovitosti (tj. natančnosti in zanesljivosti) testne metode v daljšem časovnem obdobju (npr. redno testiranje snovi za ugotavljanje sposobnosti, uporaba podatkov o negativni in pozitivni kontroli iz preteklih testov).

merila za sprejemljivost testa

sprejemljiva primerjalna pozitivna in negativna kontrola na podlagi podatkov iz preteklih testov.

testni pogoji

rezultati

razprava o rezultatih

sklepne ugotovitve

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

(2)

Regulation (EC) No 1272/2008 of the European Parliament and of the Council of 16 December 2008 on classification, labelling and packaging of substances and mixtures, amending and repealing Directive 67/548/EEC and 1999/45/EC, and amending Regulation (EC) No. 1907/2006. OJ L 353, 31.12.2008, 1.

(3)

United nations (UN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York and Geneva, 2007. Available at:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(5)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Available:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(6)

Regulation (EC) No 1907/2006 of the European Parliament and of the Council of 18 December 2006 concerning the Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals (REACH), establishing a European Chemicals Agency, amending Directive 1999/45/EC and repealing Council Regulation (EEC) No 793/93 and Commission Regulation (EC) No 1488/94 as well as Council Directive 76/769/EEC and Commission Directives 91/155/EEC, 93/67/EEC, 93/105/EC and 2000/21/EC. OJ L 396, 30.12.2006, p.1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Available:

[http://www.oecd.org/document/40/0, 2340, en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.

(11)

INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). Available:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(12)

Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.

(13)

Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.

(14)

Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.

(15)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Available:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].

(16)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(17)

Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Available:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(19)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Na voljo:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]