„PRILOGA C

BRUCELOZA

1.   DOLOČITEV POVZROČITELJA

Dokaz mikroorganizmov z morfologijo brucel z modificiranim barvanjem za acidorezistentne bakterije ali imunskospecifičnim barvanjem v zavrženem materialu, vaginalnih izcedkih ali mleku daje dokaz za domnevo bruceloze, zlasti če je podprt s serološkimi testi. Metode verižne reakcije s polimerazo (PCR) zagotavljajo dodatne preskuse za odkrivanje.

Kadar koli je možno, je treba Brucella spp. prek kulture iz vaginalnih izcedkov, zavrženih zarodkov, izcedkov iz vimena ali izbranih tkiv, kot so bezgavke ter moški in ženski reproduktivni organi, osamiti z uporabo običajnih ali selektivnih gojišč.

Po osamitvi se določita vrsta in biovar z lizo z bakteriofagom in/ali testi oksidativnega metabolizma, gojiščno preiskavo ter biokemičnimi in serološkimi merili. PCR lahko s pomočjo posebnih genomskih sekvenc služi kot dopolnilna metoda in kot metoda ribotipizacije.

Uporabljene tehnike in sredstva, njihova standardizacija in razlaga rezultatov morajo biti v skladu s tistimi, opredeljenimi v Priročniku za diagnostične teste in cepiva za kopenske živali OIE, šesta izdaja, 2008, poglavje 2.4.3. (goveja bruceloza), poglavje 2.7.2 (ovčja in kozja bruceloza) in poglavje 2.8.5 (prašičja bruceloza).

2.   IMUNOLOŠKI TESTI

2.1   Standardi

2.1.1   Za pripravo vseh antigenov, uporabljanih v rose bengal testu (RBT), seroaglutinacijskem testu (SAT), reakciji vezanja komplementa (RVK) in mlečnem prstanastem preskusu (MPP), se mora uporabljati Brucella abortus biovar 1 Weybridge sev št. 99 ali USDA sev 1119-3.

2.1.2   Standardni referenčni serum za RBT, SAT, RVK in MPP je mednarodni standardni referenčni serum OIE (OIEISS), prej imenovan drugi mednarodni standardni serum proti Brucella abortus WHO (ISAbS).

2.1.3   Standardni referenčni serumi za encimskoimunske teste (teste ELISA) so:

—

OIEISS,

—	šibek pozitivni OIE ELISA standardni serum (OIEELISAWPSS),

—	močan pozitivni OIE ELISA standardni serum (OIEELISASPSS),

—	negativni OIE EISA standardni serum (OIEELISANSS).

2.1.4   Standardni referenčni serumi za teste s fluorescentnimi označevalci (teste FPA) so:

—	šibek pozitivni OIE ELISA standardni serum (OIEELISAWPSS),

—	močan pozitivni OIE ELISA standardni serum (OIEELISASPSS),

—	negativni OIE EISA standardni serum (OIEELISANSS).

2.1.5   Standardni serumi, navedeni v 2.1.3 in 2.1.4, so na voljo pri Referenčnem laboratoriju Skupnosti za brucelozo ali Veterinary Laboratories Agency (VLA), Weybridge, Združeno kraljestvo.

2.1.6   OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS in OIEELISANSS so primarni mednarodni standardi, iz katerih se morajo določiti sekundarni nacionalni referenčni standardi (‚delovni standardi‘) za vsak test iz 2.1.1 v vsaki državi članici.

2.2   Encimskoimunski testi (ELISA testi) ali drugi testi z markiranimi protitelesi za odkrivanje goveje bruceloze v serumu ali mleku

2.2.1   Material in reagenti

Uporabljena tehnika in razlaga rezultatov morata biti validirani v skladu z načeli iz poglavja 1.1.4 Priročnika za diagnostične teste in cepiva za kopenske živali OIE, šesta izdaja, 2008, in morata vključevati najmanj laboratorijske in diagnostične študije.

2.2.2   Standardizacija testa

2.2.2.1   Standardizacija postopka testa za posamezne vzorce seruma:

(a)	predrazredčina 1/150 (1) OIEISS, predrazredčina 1/2 OIEELISAWPSS ali predrazredčina 1/16 OIEELISASPSS morajo v negativnem serumu (ali negativnem skupinskem vzorcu serumov) dati pozitivno reakcijo;

(b)	predrazredčina 1/600 OIEISS, predrazredčina 1/8 OIEELISAWPSS ali predrazredčina 1/64 OIEELISASPSS morajo v negativnem serumu (ali negativnem skupinskem vzorcu serumov) dati negativno reakcijo;

(c)	OIEELISANSS mora vedno dati negativno reakcijo.

2.2.2.2   Standardizacija postopka testa za skupinske vzorce serumov:

(a)	predrazredčina 1/150 OIEISS, predrazredčina 1/2 OIEELISAWPSS ali predrazredčina 1/16 OIEELISASPSS morajo v negativnem serumu (ali negativnem skupinskem vzorcu serumov) in ponovno razredčene v negativnih serumih s številom vzorcev, ki sestavljajo skupinski vzorec, dati pozitivno reakcijo;

(b)	OIEELISANSS mora vedno dati negativno reakcijo;

(c)	test mora zadostovati za odkrivanje okužbe ene same živali v skupini živali, iz katere so zbrani vzorci seruma v skupinski vzorec.

2.2.2.3   Standardizacija postopka testa za skupinske vzorce mleka ali sirotke:

(a)	predrazredčina 1/1 000 OIEISS, predrazredčina 1/16 OIEELISAWPSS ali predrazredčina 1/125 OIEELISASPSS morajo v negativnem serumu (ali negativnem skupnem vzorcu serumov) in ponovno razredčene 1/10 v negativnem mleku dati pozitivno reakcijo;

(b)	OIEELISANSS, razredčen 1/10 v negativnem mleku, mora vedno dati negativno reakcijo;

(c)	test mora zadostovati za odkrivanje okužbe ene same živali v skupini živali, iz katere so zbrani vzorci mleka ali sirotke za skupinski vzorec.

2.2.3   Pogoji za uporabo ELISA testov za diagnozo goveje bruceloze:

2.2.3.1   Z uporabo pogojev za kalibracijo ELISA testov vzorcev seruma iz točk 2.2.2.1 in 2.2.2.2 je diagnostična občutljivost ELISA testa enaka ali večja kot občutljivost RBT ali RVK, ob upoštevanju epidemiološke situacije, pri kateri je uporabljen.

2.2.3.2   Z uporabo pogojev za kalibracijo ELISA testa skupinskih vzorcev mleka iz točke 2.2.2.3 je diagnostična občutljivost ELISA testa enaka ali večja kot občutljivost MPP, ob upoštevanju ne samo epidemiološke situacije, temveč tudi povprečnih in pričakovanih ekstremnih sistemov reje.

2.2.3.3   Če se ELISA testi uporabljajo za certificiranje v skladu s členom 6(1) ali za ugotavljanje in vzdrževanje statusa črede v skladu s Prilogo A(II)(10), je treba zbiranje vzorcev seruma v skupinski vzorec izvesti tako, da bodo rezultati testa nesporno povezani s posamezno živaljo, vključeno v skupinski vzorec. Kateri koli test za potrditev se mora opraviti na vzorcih seruma, odvzetih posameznim živalim.

2.2.3.4.   ELISA testi se lahko uporabljajo na vzorcu mleka iz mleka, ki ga odda kmetija in v katerem je zajetih vsaj 30 % krav mlekaric, ki niso presušene. Če se uporablja navedena metoda, je treba z ukrepi zagotoviti, da je mogoče preiskovane vzorce nesporno povezati s posameznimi živalmi, od katerih je mleko pridobljeno. Kateri koli test za potrditev se mora opraviti na vzorcih seruma, odvzetih posameznim živalim.

2.3   Reakcija vezanja komplementa (RVK)

2.3.1   Antigen je suspenzija bakterij v fiziološki raztopini s fenolom (koncentracija NaCl 0,85 % in volumski delež fenola 0,5 %) ali v veronalnem pufru. Koncentrirane antigene se lahko dobavi, če je na etiketi stekleničke naveden faktor razredčenja, ki ga je treba uporabiti. Antigen je treba hraniti na 4 °C in ne zamrznjen.

2.3.2   Serume je treba inaktivirati na naslednji način:

—	goveji serum: 56 do 60 °C za 30 do 50 minut,

—	prašičji serum: 60 °C za 30 do 50 minut.

2.3.3   Da bi se lahko v postopku testa izvedla prava reakcija, se uporabi doza komplementa, ki je višja od minimalno potrebne za popolno hemolizo.

2.3.4   Pri izvajanju reakcije vezanja komplementa je treba vedno opraviti naslednje kontrole:

(a)	kontrola antikomplementarnega delovanja seruma;

(b)	kontrola antigena;

(c)	kontrola senzibiliziranih eritrocitov;

(d)	kontrola komplementa;

(e)	kontrola občutljivosti s pozitivnim serumom na začetku reakcije;

(f)	kontrola specifičnosti reakcije z negativnim serumom.

2.3.5   Izračun rezultatov

OIEISS vsebuje 1 000 internacionalnih RVK enot (ICFTU) na mililiter. Če se v dani metodi testira OIEISS, se rezultat poda kot titer (tj. višje neposredno razredčenje OIEISS da 50 % hemolizo, TOIEISS). Rezultat testa za testirani serum se poda kot titer (TTESTSERUM) in mora biti podan v ICFTU na mililiter. Za pretvorbo vrednosti titra v ICFTU se lahko faktor (F), potreben za pretvorbo titra neznanega, s to metodo testiranega seruma (TTESTSERUM) v ICFTU določi s formulo:

F = 1 000 × 1/TOIEISS

in vsebnost internacionalnih RVK enot na ml testiranega seruma (ICFTUTESTSERUM) s formulo:

ICFTUTESTSERUM = F × TTESTSERUM

2.3.6   Razlaga rezultatov

Serum, ki vsebuje 20 ali več ICFTU na ml, se pojmuje kot pozitiven.

2.4   Mlečni prstanasti preskus (MPP)

2.4.1   Antigen je suspenzija bakterij v fiziološki raztopini s fenolom (koncentracija NaCl 0,85 % in volumski delež fenola 0,5 %), obarvana s hematoksilinom. Antigen je treba hraniti na 4 °C in ne zamrznjen.

2.4.2   Občutljivost antigena je treba standardizirati glede na OIEISS, tako da antigen povzroči pozitivno reakcijo z razredčino 1/500 OIEISS v negativnem mleku, medtem ko mora biti razredčina 1/1 000 negativna.

2.4.3   Prstanasti preskus je treba opraviti na vzorcih, ki so reprezentativni za vsebino vsake posode za mleko ali večjega rezervoarja s kmetije.

2.4.4   Vzorcev mleka se ne sme zamrzniti, greti ali močno stresati.

2.4.5   Reakcija mora biti opravljena z uporabo ene od naslednjih metod:

—	s stolpcem mleka višine vsaj 25 mm in volumnom mleka 1 ml, čemur se doda 0,03 ali 0,05 ml enega izmed standardiziranih obarvanih antigenov,

—	s stolpcem mleka višine vsaj 25 mm in z volumnom mleka 2 ml, čemur se doda 0,05 ml enega izmed standardiziranih obarvanih antigenov,

—	z volumnom mleka 8 ml, čemur se doda 0,08 ml enega izmed standardiziranih obarvanih antigenov.

2.4.6   Mešanico mleka in antigenov je treba 60 minut inkubirati na 37 °C skupaj s pozitivnimi in negativnimi delovnimi standardi. Nadaljnja inkubacija za 16 do 24 ur na 4 °C poveča občutljivost testa.

2.4.7   Razlaga rezultatov:

(a)	negativna reakcija: obarvano mleko, neobarvana smetana;

(b)	pozitivna reakcija: — enako obarvana mleko in smetana, ali — neobarvano mleko in obarvana smetana.

2.5   Brucella antigen test v pufru (rose bengal test (RBT)

2.5.1   Antigen je suspenzija bakterij v puferirani raztopini za razredčevanje Brucella antigena s pH 3,65 ± 0,05, obarvana z rose bengal barvilom. Antigen se dostavi pripravljen za uporabo, nakar ga je treba hraniti na 4 °C in ne zamrzovati.

2.5.2   Antigen se pripravi ne glede na koncentracijo celic, njegova občutljivost pa mora biti standardizirana glede na OIEISS tako, da antigen povzroči pozitivno reakcijo z razredčino seruma 1/45 in negativno reakcijo z razredčino 1/55.

2.5.3   RBT se izvaja na naslednji način:

(a)	serum (20–30 μl) se pomeša z enakim volumnom antigena na beli keramični ploščici ali plošči iz emajla, da nastane področje s premerom približno 2 cm. Mešanica se na sobni temperaturi nežno ziblje 4 minute, potem pa pri dobrih svetlobnih pogojih opazuje, ali se pojavi aglutinacija;

(b)	uporabi se lahko avtomatizirana metoda, ki pa mora biti vsaj tako občutljiva in točna kot ročna metoda.

2.5.4   Razlaga rezultatov

Kakršna koli vidna reakcija se pojmuje kot pozitivna, razen če je prišlo ob robovih do pretirane izsušitve.

Pri vsaki seriji testov se vključijo pozitivni in negativni delovni standardi.

2.6   Seroaglutinacijski test (SAT)

2.6.1   Antigen je suspenzija bakterij v fiziološki raztopini s fenolom (koncentracija NaCl 0,85 % in volumski delež fenola 0,5 %).

Formaldehida se ne sme uporabljati.

Koncentrirane antigene se lahko dobavi, če je na etiketi stekleničke naveden faktor razredčenja, ki ga je treba uporabiti.

Suspenziji antigena se lahko doda EDTA do 5 mM v končni testni razredčini, da se zmanjša število lažnih pozitivnih rezultatov seroaglutinacijskega testa. Naknadno je treba korigirati pH suspenzije antigena na pH 7,2.

2.6.2   OIEISS vsebuje 1 000 internacionalnih enot aglutininov.

2.6.3   Antigen se pripravi ne glede na koncentracijo celic, njegova občutljivost pa mora biti standardizirana glede na OIEISS tako, da antigen povzroči 1/600 do 1/1 000 ali 75 % aglutinacijo s končno razredčino seruma 1/500 do 1/750.

Priporočljivo bi bilo tudi primerjati reaktivnost novih in prej standardiziranih serij antigena ob pomoči serije definiranih serumov.

2.6.4   Test se naredi v epruvetah ali na mikroploščah. Mešanico antigena in razredčin seruma se inkubira za 16 do 24 ur na 37 °C.

Za vsak serum je treba pripraviti vsaj tri razredčine. Razredčine preiskovanega seruma je treba narediti tako, da se reakcija na meji pozitivnosti odčita v sredinski epruveti (ali vdolbini pri metodi z mikroploščo).

2.6.5   Razlaga rezultatov

Stopnja aglutinacije brucel v serumu mora biti izražena v IE na ml.

Serum, ki vsebuje 30 ali več IE na ml, se pojmuje kot pozitiven.

2.7   Test s fluorescentnimi označevalci (FPA)

2.7.1   FPA se lahko naredi v steklenih epruvetah ali na mikroploščah s 96 vdolbinami. Uporabljene tehnike, njihova standardizacija in razlaga rezultatov morajo biti v skladu s tistimi, opredeljenimi v Priročniku za diagnostične teste in cepiva za kopenske živali OIE, šesta izdaja, 2008, poglavje 2.4.3 (goveja bruceloza).

2.7.2   Standardizacija testa

FPA se standardizira, da:

(a)	OIEELISASPSS in OIEELISAWPSS dosledno dajeta pozitivni rezultat;

(b)	predrazredčina 1/8 OIEELISAWPSS ali predrazredčina 1/64 OIEELISASPSS v negativnem serumu (ali negativnem skupinskem vzorcu serumov) vedno dasta negativno reakcijo;

(c)	OIEELISANSS vedno da negativno reakcijo.

V vsako serijo testov se vključi naslednje: močan pozitivni, šibek pozitivni, negativni delovni standardni serum (kalibriran glede na OIE EISA standardne serume).

3.   DOPOLNILNI TESTI

3.1   Intrakutani test za brucelozo (Brucellosis skin test – BST)

3.1.1   Pogoji za uporabo BST

(a)	Intrakutani test za brucelozo se ne uporablja v namene certificiranja za trgovino znotraj Skupnosti.

(b)	Intrakutani test za brucelozo je eden najbolj specifičnih testov za zaznavanje bruceloze pri necepljenih živalih; vendar pa diagnoze samo na podlagi pozitivnih intradermalnih reakcij ne smemo postavljati.

(c)	Govedo, ki je bilo v enem od seroloških testov iz te priloge negativno in ki reagira pozitivno na BST, se pojmuje kot okuženo ali za katero se sumi, da je okuženo.

(d)	Govedo, ki je bilo v enem od seroloških testov iz te priloge pozitivno, se lahko testira z BST za podporo razlagi rezultatov seroloških testov; zlasti če se pri čredah, ki so proste ali uradno proste bruceloze, ne more izključiti navzkrižna reakcija s protitelesi proti drugim bakterijam.

3.1.2   Test je treba opraviti z uporabo standardiziranega in definiranega preparata brucelnega alergena, ki ne vsebuje gladkega lipopolisaharidnega (LPS) antigena, ki lahko povzroči nespecifične vnetne reakcije ali moti naknadne serološke teste.

Zahteve za izdelavo brucelina so natančneje opisane v oddelku C1 poglavja 2.4.3 Priročnika za diagnostične teste in cepiva za kopenske živali OIE, šesta izdaja, 2008.

3.1.3   Postopek testa

3.1.3.1   0,1 ml brucelnega alergena se vbrizga intradermalno v obrepno gubo, kožo boka ali ob strani v vrat.

3.1.3.2   Test se odčita po 48–72 urah.

3.1.3.3   Debelina kože na mestu injekcije se izmeri s kutimetrom pred aplikacijo in pri ponovnem pregledu.

3.1.3.4   Razlaga rezultatov:

Močne reakcije se zlahka prepoznajo po lokalni oteklini in zatrdlini.

Zadebelitev kože za 1,5 do 2 mm se pojmuje kot pozitivna reakcija na BST.

3.2   Kompetitivni encimskoimunski test (cELISA)

3.2.1   Pogoji za uporabo cELISA testa

cELISA test za brucelozo se ne uporablja za namene certificiranja za trgovino znotraj Skupnosti.

Govedo, ki je bilo v enem drugem od seroloških testov iz te priloge pozitivno, se lahko testira s cELISA za podporo razlagi drugih rezultatov seroloških testov; zlasti kadar se pri čredah, ki so proste ali uradno proste bruceloze, ne more izključiti navzkrižne reakcije s protitelesi proti drugim bakterijam, ali da se preprečijo reakcije zaradi ostanka protiteles, nastalih zaradi cepljenja s S19.

3.2.2   Postopek testa

Test se izvede v skladu z navodili iz oddelka B(2) poglavja 2.4.3 Priročnika za diagnostične teste in cepiva za kopenske živali OIE, šesta izdaja, 2008.“