„PRILOGA 1

ZNAČILNOSTI OLJČNEGA OLJA

Kategorija

Etilni estri maščobnih kislin (FAEE) (mg/kg) (*)

Vsebnost kislin (%) (*)

Peroksidno število (mekv O2/kg) (*)

Voski (mg/kg) (**)

2-gliceril monopalmitat (%)

Stigmastadieni mg/kg (1)

Razlika: ECN42 (HPLC) in ECN42 (2) (teoretičen izračun)

K232 (*)

K268 ali K270 (*)

Delta-K (*)

Organoleptično ocenjevanje Mediana napake (Md) (*)

Organoleptično ocenjevanje Mediana sadežnosti (Mf) (*)

1. Ekstra deviško oljčno olje

FAEE ≤ 40 (proizvodno leto 2013–2014) (3) FAEE ≤ 35 (proizvodno leto 2014–2015) FAEE ≤ 30 (proizvodna leta po letu 2015)

≤ 0,8

≤ 20

≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 %

≤ 0,05

≤ |0,2|

≤ 2,50

≤ 0,22

≤ 0,01

Md = 0

Mf > 0

≤ 1,0, če je skupni % palmitinske kisline > 14 %

2. Deviško oljčno olje

—

≤ 2,0

≤ 20

≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 %

≤ 0,05

≤ |0,2|

≤ 2,60

≤ 0,25

≤ 0,01

Md ≤ 3,5

Mf > 0

≤ 1,0, če je skupni % palmitinske kisline > 14 %

3. Lampante oljčno olje

—

> 2,0

—

(4)

≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 %

≤ 0,50

≤ |0,3|

—

—

—

Md > 3,5 (5)

—

≤ 1,1, če je skupni % palmitinske kisline > 14 %

4. Rafinirano oljčno olje

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 %

—

≤ |0,3|

—

≤ 1,10

≤ 0,16

—

—

≤ 1,1, če je skupni % palmitinske kisline > 14 %

5. Oljčno olje – mešanica rafiniranega oljčnega olja in deviškega oljčnega olja

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 0,9, če je skupni % palmitinske kisline ≤ 14 %

—

≤ |0,3|

—

≤ 0,90

≤ 0,15

—

—

≤ 1,0, če je skupni % palmitinske kisline > 14 %

6. Surovo olje iz oljčnih tropin

—

—

—

(6)

≤ 1,4

—

≤ |0,6|

—

—

—

—

—

7. Rafinirano olje iz oljčnih tropin

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 1,4

—

≤ |0,5|

—

≤ 2,00

≤ 0,20

—

—

8. Olje iz oljčnih tropin

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 1,2

—

≤ |0,5|

—

≤ 1,70

≤ 0,18

—

—

Kategorija

Sestava maščobnih kislin (7)

Transoleinski izomeri skupaj (%)

Translinolni + translinolenski izomeri skupaj (%)

Sestava sterolov

Steroli skupaj (mg/kg)

Eritrodiol in uvaol (%) (**)

Miristinska (%)

Linolenska (%)

Arašidova (%)

Eikozanojska (%)

Behenska (%)

Lignocerinska (%)

Holesterol (%)

Brasikasterol (%)

Kampesterol (8) (%)

Stigmasterol (%)

APP β-sitosterol (%) (9)

Delta-7-stigmastenol (8) (%)

1. Ekstra deviško oljčno olje

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

2. Deviško oljčno olje

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

3. Lampante oljčno olje

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5 (10)

4. Rafinirano oljčno olje

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

5. Oljčno olje – mešanica rafiniranega oljčnega olja in deviškega oljčnega olja

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

6. Surovo olje iz oljčnih tropin

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 2 500

> 4,5 (11)

7. Rafinirano olje iz oljčnih tropin

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 800

≤ 4,5

8. Olje iz oljčnih tropin

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 600

> 4,5

Opombe:

(a)	Rezultate analiz je treba navesti na enako število decimalnih mest natančno, kot je določeno za posamezno značilnost. Zadnjo števko v številki je treba povečati za ena, če je naslednja števka večja od 4.

(b)	Če samo ena značilnost ni v skladu z navedenimi vrednostmi, se lahko olje razvrsti v drugo kategorijo ali se deklarira kot neustrezno glede čistosti za namene te uredbe.

(c)

Značilnosti, ki so označene z zvezdico (*) in se nanašajo na kakovost olja, pomenijo: – da so za lampante oljčno olje lahko ustrezne mejne vrednosti hkrati različne od navedenih vrednosti; – da je za deviška oljčna olja neupoštevanje samo ene od mejnih vrednosti vzrok za spremembo kategorije, vendar olje ostane razvrščeno v eno od kategorij deviških oljčnih olj.

(d)	Značilnosti, označene z dvema zvezdicama (**), pomenijo, da sta za vse vrste olja iz oljčnih tropin lahko obe ustrezni mejni vrednosti hkrati različni od navedenih vrednosti.

„Dodatek

Drevo odločanja

Drevo odločanja za vsebnost kampesterola v deviških in ekstra deviških oljčnih oljih:

4,0 % < kampesterol ≤ 4,5 %

stigmasterol ≤ 1,4 %

Δ-7-stigmastenol ≤ 0,3 %

Drugi parametri so skladni z mejnimi vrednostmi, določenimi v tej uredbi.

Drevo odločanja za vsebnost delta-7-stigmastenola v:

—	ekstra deviških in deviških oljčnih oljih 0,5 % < Δ-7-stigmastenol ≤ 0,8 % kampesterol ≤ 3,3 % App. β-sitosterol/ (kamp. + Δ-7-stig.) ≥ 25 stigmasterol ≤ 1,4 % Δ ECN42 ≤ |0,1|

Drugi parametri so skladni z mejnimi vrednostmi, določenimi v tej uredbi.

—	oljih iz oljčnih tropin (surovih in rafiniranih) 0,5 < Δ-7-stigmastenol ≤ 0,7 Δ ECN42 ≤ |0,40| stigmasterol ≤ 1,4 % drugi parametri so znotraj mejnih vrednosti

„PRILOGA Ia

VZORČENJE OLJČNEGA OLJA ALI OLJA IZ OLJČNIH TROPIN, DOSTAVLJENEGA V IZVIRNEM PAKIRANJU

Ta metoda vzorčenja se uporablja za serije oljčnega olja ali olja iz oljčnih tropin v izvirnem pakiranju. Uporabljajo se različne metode vzorčenja, odvisno od tega, ali izvirno pakiranje presega 5 litrov ali ne.

„Serija“ pomeni skupek prodajnih enot, ki se proizvajajo, izdelujejo in pakirajo v takih okoliščinah, da se olje, ki ga vsebuje vsaka prodajna enota, šteje za homogeno v smislu vseh analitičnih značilnosti. Posamezne serije se določijo v skladu z Direktivo 2011/91/EU Evropskega parlamenta in Sveta (1)

„Posamični vzorec“ pomeni količino olja v izvirnem pakiranju, ki je vzeta iz naključnega dela serije.

1.   VSEBINA PRIMARNEGA VZORCA

1.1   Izvirno pakiranje, ki ne presega 5 litrov

„Primarni vzorec“ za izvirno pakiranje, ki ne presega 5 litrov, pomeni število posamičnih vzorcev, vzetih iz serije, v skladu s tabelo 1.

Tabela 1

Najmanjši primarni vzorec mora vsebovati naslednje

Če je prostornina izvirnega pakiranja	Primarni vzorec mora zajemati olje iz
(a) 1 liter ali več	(a) 1 izvirnega pakiranja
(b) manj kot 1 liter	(b) najmanjšega števila pakiranj s skupno prostornino vsaj 1,0 litra

Število pakiranj iz tabele 1, ki predstavljajo primarni vzorec, lahko vsaka država članica po lastnih potrebah poveča (na primer zaradi organoleptičnega ocenjevanja v drugem laboratoriju, kot je tisti, ki je izvedel kemijske analize, ponovljeno analizo itd.).

1.2   Izvirno pakiranje, ki presega 5 litrov

„Primarni vzorec“ za izvirno pakiranje, ki presega 5 litrov, pomeni reprezentativen del vseh posamičnih vzorcev, pridobljen z zmanjšanjem, v skladu s tabelo 2. Primarni vzorec mora biti sestavljen iz različnih primerov.

„Primer“ primarnega vzorca pomeni vsako od pakiranj, ki sestavljajo primarni vzorec.

Tabela 2

Najmanjše število posamičnih vzorcev, ki jih je treba izbrati

Število pakiranj v seriji	Najmanjše število posamičnih vzorcev, ki jih je treba izbrati
Do vključno 10	1
Od 11 do 150	2
Od 151 do 500	3
Od 501 do 1 500	4
Od 1 501 do 2 500	5
> 2 500 na 1 000 pakiranj	1 dodaten posamični vzorec

Da bi se zmanjšala prostornina vzorčenih izvirnih pakiranj, se vsebina vzorčenih posamičnih vzorcev homogenizira za pripravo primarnega vzorca. Odmerki različnih posamičnih vzorcev se prelijejo v skupno posodo za homogenizacijo z mešanjem, kar zagotavlja najboljšo zaščito pred zrakom.

Vsebino primarnega vzorca je treba preliti v več pakiranj z najmanjšo prostornino 1,0 litra, pri čemer vsako pakiranje predstavlja primer primarnega vzorca.

Število primarnih vzorcev lahko vsaka država članica po lastnih potrebah poveča (na primer zaradi organoleptičnega ocenjevanja v drugem laboratoriju, kot je tisti, ki je izvedel kemijske analize, ponovljeno analizo itd.).

Vsako pakiranje je treba napolniti tako, da je zračna plast na vrhu čim manjša, nato pa ustrezno zapreti in zatesniti, tako da je proizvod zaščiten pred nedovoljenimi posegi.

Te primere je treba zaradi pravilne identifikacije označiti.

2.   ANALIZE IN REZULTATI

2.1

Vsak primarni vzorec je treba razdeliti na laboratorijske vzorce v skladu s točko 2.5 standarda EN ISO 5555 in analizirati po vrstnem redu, kot je prikazan v drevesu odločanja iz Priloge Ib, ali po kakršnem koli drugem naključnem vrstnem redu.

2.2

Če so vsi rezultati analiz v skladu z značilnostmi deklarirane kategorije olja, se celotna serija deklarira kot skladna. Če eden od rezultatov analiz ni v skladu z značilnostmi deklarirane kategorije olja, se celotna serija deklarira kot neskladna.

3.   PREVERJANJE KATEGORIJE SERIJE

3.1

Za preverjanje kategorije serije lahko pristojni organ poveča število primarnih vzorcev, vzetih na različnih delih serije, v skladu z naslednjo tabelo: Tabela 3 Število primarnih vzorcev, določeno na podlagi velikosti serije Velikost serije (v litrih) Število primarnih vzorcev Manj kot 7 500 2 Od 7 500 do manj kot 25 000 3 Od 25 000 do manj kot 75 000 4 Od 75 000 do manj kot 125 000 5 125 000 ali več 6 + 1 na vsakih dodatnih 50 000 litrov Vsak posamični vzorec, ki predstavlja primarni vzorec, je treba vzeti na istem mestu v seriji, pri čemer je treba zabeležiti lokacijo vsakega primarnega vzorca in jo nedvoumno identificirati. Vsak primarni vzorec je treba oblikovati v skladu s postopki iz točk 1.1 in 1.2. Nato se za vsak primarni vzorec izvedejo analize iz člena 2(1).

3.2

Če rezultati analiz iz člena 2(1), izvedeni za vsaj en primarni vzorec, niso v skladu z značilnostmi deklarirane kategorije olja, se celotna vzorčena serija deklarira kot neskladna.“

„PRILOGA Ib

DREVO ODLOČANJA ZA PREVERJANJE, ALI JE VZOREC OLJČNEGA OLJA SKLADEN Z DEKLARIRANO KATEGORIJO

Tabela 1

EKSTRA DEVIŠKO OLJČNO OLJE

(merila kakovosti)

Vsebnost kislin %

≤ 0,8

> 0,8

Peroksidno število (mekv O2/kg)

≤ 20

> 20

UV absorbanca

K270 ≤ 0,22

K270 > 0,22

UV absorbanca

ΔK ≤ 0,01

ΔK > 0,01

UV absorbanca

K232 ≤ 2,50

K232 > 2,50

Organoleptična ocena

Med. sadežnosti > 0

in

med. napak = 0

Med. sadežnosti = 0

Med. sadežnosti > 0

in

med. napak > 0

Etilni estri*

da

ne

Vrsta olja, kot je bila deklarirana v zvezi z merili kakovosti

Pojdi na tabelo 3 (merila čistosti)

Olje, ki ni v skladu z deklarirano kategorijo

(a)

Olje, ki ni v skladu z deklarirano kategorijo

(b)

* ≤ 40 mg/kg v proizv. letu 2013/2014

≤ 35 mg/kg v proizv. letu 2014/2015

≤ 30 mg/kg od proizv. leta 2015/2016 naprej

Tabela 2

Deviška oljčna olja

(merila čistosti)

Vsebnost kislin %

≤ 2,0

> 2,0

Peroksidno število (mekv O2/kg)

≤ 20

> 20

UV absorbanca

K270 ≤ 0,25

K270 > 0,25

UV absorbanca

Δ K ≤ 0,01

Δ K > 0,01

UV absorbanca

K232 ≤ 2,60

K232 > 2,60

Organoleptična ocena

Med. sadežnosti > 0

in

med. napak ≤ 3,5

Med. sadežnosti = 0

ali

med. sadežnosti > 0

med. napak > 3,5

Ali vrednosti zgornjih parametrov izpolnjujejo merila kakovosti ekstra deviškega oljčnega olja?

(tabela 1)

NE

DA

Vrsta olja, kot je bila deklarirana v zvezi z merili kakovosti

Pojdi na tabelo 3 (merila čistosti)

Olje, ki ni v skladu z deklarirano kategorijo

(a)

Olje, ki ni v skladu z deklarirano kategorijo

(b)

Tabela 3

Ekstra deviška in deviška oljčna olja

(merila čistosti)

Merila kakovosti (tabeli 1 in 2)

DA

NE

3,5-stigmastadieni (mg/kg)

≤ 0,05

> 0,05

Vsebnost trans-izomerov maščobnih kislin (%)

tC18:1 ≤ 0,05

t(C18:2 + C18:3) ≤ 0,05

tC18:1 > 0,05

t(C18:2 + C18:3) > 0,05

Vsebnost maščobnih kislin

DA

NE

Δ ECN42

≤ |0,2|

> |0,2|

Sestava sterolov in skupni steroli

DA

NE

Eritrodiol + uvaol (%)

≤ 2,0

2,0 > E+U ≤ 4,5

> 4,5

Voski1 (mg/kg)

≤ 150

> 150

Vrsta olja, ki je v skladu z deklarirano kategorijo

Olje, ki ni v skladu z deklarirano kategorijo

Olje, ki ni v skladu z deklarirano kategorijo

(a)

Olje, ki ni v skladu z deklarirano kategorijo

Olje, ki ni v skladu z deklarirano kategorijo

(b)

1C42+C44+C46

„Dodatek 1

Tabela ekvivalentnosti med prilogami k tej uredbi in analizami iz drevesa odločanja

— Vsebnost kislin	Priloga II	Določanje prostih maščobnih kislin, metoda v hladnem
— Peroksidno število	Priloga III	Določanje peroksidnega števila
— UV absorbanca	Priloga IX	Spektrofotometrična analiza
— Organoleptična ocena	Priloga XII	Organoleptična ocena deviškega oljčnega olja
— Etilni estri	Priloga XX	Metoda za določanje vsebnosti voskov, metilnih estrov maščobnih kislin in etilnih estrov maščobnih kislin s kapilarno plinsko kromatografijo
— 3,5-stigmastadieni	Priloga XVII	Metoda določanja stigmastadienov v rastlinskih oljih
— Trans-izomeri maščobnih kislin	Priloga X A in	Analiza metilnih estrov maščobnih kislin s plinsko kromatografijo
	Priloga X B	Priprava metilnih estrov maščobnih kislin
— Vsebnost maščobnih kislin	Priloga X A in	Analiza metilnih estrov maščobnih kislin s plinsko kromatografijo
	Priloga X B	Priprava metilnih estrov maščobnih kislin
— ΔECN42	Priloga XVIII	Določanje sestave trigliceridov z ECN42 (razlika med podatki HPCL in teoretično vsebnostjo)
— Sestava sterolov in steroli skupaj — Eritrodiol in uvaol	Priloga V	Določanje sestave in vsebnosti sterolov in triterpenskih dialkoholov s kapilarno plinsko kromatografijo
— Voski	Priloga IV	Določanje vsebnosti voskov s kapilarno plinsko kromatografijo
— Alifatski alkoholi	Priloga XIX	Določanje vsebnosti alifatskih alkoholov s kapilarno plinsko kromatografijo
— Nasičene maščobne kisline na položaju 2	Priloga VII	Določanje deleža 2-gliceril monopalmitata

„PRILOGA V

DOLOČANJE SESTAVE IN VSEBNOSTI STEROLOV IN TRITERPENSKIH DIALKOHOLOV S KAPILARNO PLINSKO KROMATOGRAFIJO

1.   PODROČJE UPORABE

Metoda opisuje postopek za določanje posamezne in skupne vsebnosti sterolov in triterpenskih dialkoholov v oljčnih oljih in oljih iz oljčnih tropin.

2.   PRINCIP

Olje z dodanim α-holestanolom kot internim standardom se umili s kalijevim hidroksidom in etanolno raztopino, neumiljive snovi pa se nato ekstrahirajo z etilnim etrom.

Sterolni in triterpenski dialkoholni frakciji se ločita od neumiljivih snovi s tankoplastno kromatografijo na z lugom obdelani silikagelni plošči. Frakcije, dobljene iz silikagela, se pretvorijo v trimetilsililne etre in se nato analizirajo s kapilarno plinsko kromatografijo.

3.   OPREMA

Običajna laboratorijska oprema in zlasti:

3.1	250 ml bučka s povratnim hladilnikom in priključki iz steklenih obrusov.

3.2	500 ml lij ločnik.

3.3	250 ml bučke.

3.4	Celotna oprema za analizo s tankoplastno kromatografijo s steklenimi ploščami 20 × 20 cm.

3.5	Ultravijolična svetilka z valovno dolžino 254 ali 366 nm.

3.6	100 μl in 500 μl mikrobrizgalki.

3.7	Cilindrični filtrirni lij s porozno frito G3 (poroznosti 15–40 μm), premera približno 2 cm in globine 5 cm, z nastavkom, primernim za filtriranje v vakuumu, in priključkom z zunanjim obrusom.

3.8	50 ml presesalna erlenmajerica s priključkom z notranjim obrusom za uporabo s filtrirnim lijem (točka 3.7).

3.9	10 ml epruveta s koničnim dnom in steklenim zamaškom.

3.10

Plinski kromatograf, primeren za uporabo s kapilarno kolono, s sistemom za vbrizgavanje z deljenjem vzorca, ki ga sestavljajo: 3.10.1 termostatirana komora za kolone, ki lahko ohranja želeno temperaturo do ± 1 °C natančno; 3.10.2 temperaturno nastavljiv injektor z uparjalnim elementom iz persilaniziranega stekla in sistemom za vbrizgavanje z deljenjem vzorca; 3.10.3 plamensko-ionizacijski detektor; 3.10.4 sistem za zajemanje podatkov, ki je primeren za uporabo s plamensko-ionizacijskim detektorjem (točka 3.10.3) in omogoča ročno integracijo.

3.11	Kvarčna kapilarna kolona, dolžine 20 do 30 m, notranjega premera 0,25 do 0,32 mm, pokrita s 5 % difenil- in 95 % dimetilpolisiloksana (stacionarna faza SE-52 ali SE-54 ali podobno) enakomerne debeline med 0,10 in 0,30 μm.

3.12	10 μl mikrobrizgalka za plinsko kromatografijo z nesnemljivo iglo, primerno za vbrizgavanje z deljenjem vzorca.

3.13	Eksikator, napolnjen s kalcijevim dikloridom.

4.   REAGENTI

4.1

Kalijev hidroksid (minimalne koncentracije 85 %).

4.2

Etanolna raztopina kalijevega hidroksida, približno 2 N. Raztopite 130 g kalijevega hidroksida (točka 4.1) s hlajenjem v 200 ml destilirane vode in potem do enega litra dodajte etanol (točka 4.10). Raztopino hranite v dobro zamašenih temnih steklenicah, in sicer največ dva dni.

4.3

Etilni eter čistoče za analizo.

4.4

Etanolna raztopina kalijevega hidroksida, približno 0,2 N. Raztopite 13 g kalijevega hidroksida (točka 4.1) v 20 ml destilirane vode in do enega litra dodajte etanol (točka 4.10).

4.5

Brezvodni natrijev sulfat čistoče za analizo.

4.6

Steklene plošče (20 × 20 cm), premazane s silikagelom, brez indikatorja fluorescence debeline 0,25 mm (ki so naprodaj, pripravljene za uporabo).

4.7

Toluen kromatografske čistoče.

4.8

Aceton kromatografske čistoče.

4.9

n-heksan kromatografske čistoče.

4.10

Etilni eter kromatografske čistoče.

4.11

Etanol čistoče za analizo.

4.12

Etilacetat čistoče za analizo.

4.13

Referenčna raztopina za tankoplastno kromatografijo: holesterol ali fitosteroli in 5-odstotna raztopina eritrodiola v etilacetatu (točka 4.11).

4.14

2,7-diklorofluorescein, 0,2-odstotna etanolna raztopina. Naredite rahlo bazično z dodatkom nekaj kapelj alkoholne raztopine 2 N kalijevega hidroksida (točka 4.2).

4.15.

Brezvodni piridin kromatografske čistoče (glej opombo 5).

4.16.

Heksametil disilazan čistoče za analizo.

4.17.

Trimetilklorosilan čistoče za analizo.

4.18

Vzročne raztopine sterolnih trimetilsililnih etrov. Pripravite jih tik pred uporabo iz sterolov in eritrodiola iz olj, ki jih vsebujejo.

4.19

α-holestanol več kot 99-odstotne čistoče (čistost je treba preveriti s plinskokromatografsko analizo).

4.20

0,2-odstotna interna standardna raztopina α-holestanola (m/V) v etilacetatu (točka 4.11).

4.21

Raztopina 10 g/l fenolftaleina v etanolu (točka 4.10).

4.22

Nosilni plin: vodik ali helij plinskokromatografske čistoče.

4.23

Pomožni plini: vodik, helij, dušik in zrak plinskokromatografske čistoče.

4.24

Mešanica n-heksana (točka 4.9) in etilnega etra (točka 4.10) v razmerju 65: 35 (V/V).

4.25

Reagent za sililiranje, sestavljen iz mešanice piridina, heksametildisilizana in trimetilklorosilana v razmerju 9: 3: 1 (V/V/V).

5.   POSTOPEK

5.1   Priprava neumiljivih snovi

5.1.1   S 500 μl mikrobrizgalko (točka 3.6) vnesite v 250 ml bučko (točka 3.1) interno standardno raztopino α-holestanola (točka 4.20), ki vsebuje količino holestanola, ki ustreza približno 10 % vsebnosti sterolov v vzorcu. Na primer za 5 g vzorca oljčnega olja dodajte 500 μl raztopine α-holestanola (točka 4.20), za olje iz oljčnih tropin pa 1 500 μl. Po ohladitvi bučke raztopino odparite do suhega z blagim tokom dušika na parni kopeli, nato pa v isto bučko natehtajte 5 ± 0,01 g suhega filtriranega vzorca.

Opomba 1:

Olja in masti živalskega ali rastlinskega izvora, ki vsebujejo precejšnje količine holesterola, lahko dajo vrh, ki ima retenzijski čas podoben holestanolu. V takem primeru je treba sterolno frakcijo analizirati dvakrat, in sicer z internim standardom in brez njega.

5.1.2   Dodajte 50 ml 2 N etanolne raztopine kalijevega hidroksida (točka 4.2) in nekaj plovca, namestite povratni hladilnik in segrejte na rahlo vretje do končanega umiljenja (raztopina postane bistra). S segrevanjem nadaljujte še nadaljnjih 20 minut in potem z vrha hladilnika dodajte 50 ml destilirane vode, snemite hladilnik in ohladite bučko na približno 30 °C.

5.1.3   Kvantitativno prenesite vsebino bučke v 500 ml lij ločnik (točka 3.2), in sicer z večkratnim spiranjem z destilirano vodo (50 ml). Dodajte približno 80 ml etilnega etra (točka 4.10), močno tresite približno 60 sekund ter postopoma sproščajte pritisk, tako da obrnete lij ločnik in odprete petelinčka. Pustite mirovati, dokler fazi nista popolnoma ločeni (opomba 2).

Nato milnico v celoti prelijte v drug lij ločnik. Iz vodno-alkoholne faze še dvakrat ekstrahirajte, in sicer z uporabo 60 do 70 ml etilnega etra (točka 4.10).

Opomba 2: Emulzijo je mogoče odstraniti z dodajanjem majhnih količin etanola (točka 4.11).

5.1.4   Združite etrske ekstrakte v skupnem liju ločniku, ki vsebuje 50 ml vode. Nadaljujte z izpiranjem (50 ml), dokler izpiralna voda ob dodatku kapljice raztopine fenolftaleina ni več rožnato obarvana (točka 4.21).

Potem ko je izpiralna voda odstranjena, filtrirajte skozi brezvodni natrijev sulfat (točka 4.5) v predhodno stehtani 250 ml bučki, pri tem pa lij in filter izperite z majhnimi količinami etilnega etra (točka 4.10).

5.1.5   Topilo odparite z destilacijo na rotacijskem izparilniku pri 30 °C v vakuumu. Dodajte 5 ml acetona in z blagim tokom zraka v celoti odstranite hlapno topilo. Ostanek sušite v peči 15 minut pri 103 ± 2 °C. Po ohladitvi v eksikatorju ga stehtajte z natančnostjo 0,1 mg.

5.2   Ločevanje sterolne in triterpenske dialkoholne frakcije (eritrodiol + uvaol)

5.2.1   Priprava z lugom obdelanih plošč za tankoplastno kromatografijo: silikagelne plošče (točka 4.6) za 10 sekund potopite približno 4 cm globoko v raztopino 0,2 N etanolnega kalijevega hidroksida (točka 4.5) in jih potem pustite dve uri, da se sušijo v digestoriju, na koncu pa jih dajte v peč na 100 °C za eno uro.

Vzemite jih iz peči in jih do uporabe hranite v eksikatorju, napolnjenem s kalcijevim kloridom (točka 3.13) (na ta način obdelane plošče je treba uporabiti v 15 dneh).

Opomba 3:

Kadar se za ločevanje sterolnih frakcij uporabljajo z lugom obdelane silikagelne plošče, neumiljivih frakcij ni treba tretirati z aluminijevim oksidom. Na ta način se vse sestavine, ki so kisle narave (maščobne kisline in druge), obdržijo na mestu napršitve, pas sterolov pa se jasno loči od pasov alifatskih in triterpenskih alkoholov.

5.2.2   Mešanico heksana in etilnega etra (točka 4.24) (opomba 4) vstavite v razvijalno komoro na globino približno 1 cm. Komoro zaprite z ustreznim pokrovom in jo tako pustite najmanj pol ure na hladnem, da se lahko med hlapi in tekočino ustvari ravnotežje. Trakovi filtrirnega papirja, namočeni v eluent, se lahko položijo na notranje površine komore. To skrajša razvijalni čas za približno eno tretjino ter omogoča enotnejšo in bolj homogeno elucijo sestavin.

Opomba 4:

Razvijalno mešanico je treba zamenjati za vsak preskus, zato da se dosežejo popolnoma ponovljivi pogoji elucije. Kot alternativa se lahko uporabi mešanica n-heksana in etilnega etra v razmerju 50: 50 (V/V).

5.2.3   Pripravite približno 5-odstotno raztopino neumiljivih snovi (točka 5.1.5) v etilacetatu (točka 4.12) ter s pomočjo 100 μl mikrobrizgalke nanesite 0,3 ml raztopine na tanko in homogeno progo na nižjem koncu (2 cm) kromatografske plošče (točka 5.2.1). Vzporedno s progo nanesite 2 do 3 μl materialne referenčne raztopine (točka 4.13), tako da se po razvijanju sterolna in triterpenska dialkoholna pasova lahko identificirata.

5.2.4   Ploščo vstavite v razvijalno komoro, pripravljeno, kot je navedeno v točki 5.2.2. Temperaturo okolja je treba vzdrževati med 15 in 20 °C (opomba 5). Komoro takoj zaprite s pokrovom in pustite, da poteka eluiranje, dokler fronta topila ne doseže razdalje 1 cm od vrhnjega roba plošče. Vzemite ploščo iz razvijalne komore in odparite topilo s tokom vročega zraka ali tako, da ploščo nekaj časa pustite v digestoriju.

Opomba 5: Višja temperatura lahko negativno vpliva na ločevanje.

5.2.5   Rahlo in enakomerno napršite ploščo z raztopino 2,7-diklorofluorosceina (točka 4.14) ter pustite, da se posuši. Če se plošča opazuje pod ultravijolično svetlobo, se sterolna in triterpenska dialkoholna pasova lahko identificirata tako, da se poravnata s pikami, dobljenimi iz referenčne raztopine (točka 4.13). S črnim svinčnikom označite meje pasov vzdolž roba fluorescence (glej tankoplastno kromatografijo na sliki 3).

5.2.6   S kovinsko žličko odstrgajte silikagel na označeni površini. Odstranjen, v fin prah zdrobljen material dajte v filtrirni lij (točka 3.7). Dodajte 10 ml vročega etilacetata (točka 4.12), s kovinsko žličko previdno zmešajte in v vakuumu filtrirajte, tako da filtrat zberete v erlenmajerici (točka 3.8), ki je pritrjena na filtrirni lij.

Ostanek v erlenmajerici trikrat izperite z etilnim etrom (točka 4.3) (vsakokrat približno z 10 ml), tako da zberete filtrat v isti erlenmajerici, ki je pritrjena na lij. Odparite filtrat do prostornine 4 do 5 ml, prenesite preostanek raztopine v predhodno stehtano 10 ml epruveto (točka 3.9), odparite do suhega z rahlim segrevanjem v blagem toku dušika, ponovno dolijte nekaj kapelj acetona (točka 4.8) in spet odparite do suhega.

Ostanek v epruveti mora biti sestavljen iz sterolnih in triterpenskih dialkoholnih frakcij.

5.3   Priprava trimetilsililnih etrov

5.3.1   Reagent za sililiranje (točka 4.25) (opomba 6), v razmerju 50 μl za vsak miligram sterolov in triterpenskih dialkoholov, dodajte v epruveto, ki vsebuje sterolsko in triterpensko dialkoholno frakcijo, tako da se izognete kakršnemu koli vnosu vlage (opomba 7).

Opomba 6:

Raztopine, pripravljene za uporabo, se dobijo v prodaji. Na voljo so tudi drugi reagenti za sililiranje, kot je na primer bis-trimetilsilil trifluoroacetamid + 1-odstoten trimetilklorosilan, ki ga je treba razredčiti z enako količino brezvodnega piridina.

Piridin se lahko zamenja z enako količino acetonitrila.

5.3.2   Zamašite epruveto in jo previdno pretresite (ne da bi jo prevračali), dokler niso sestavine popolnoma raztopljene. Pustite jo pri sobni temperaturi najmanj 15 minut, nato pa nekaj minut centrifugirajte. Prozorna raztopina je pripravljena za plinskokromatografsko analizo.

Opomba 7:

Rahla opalescenca, ki lahko nastane, je normalna in ne povzroča nobenih nepravilnost. Tvorjenje belega flokulata ali pojav rožnate obarvanosti sta znaka prisotnosti vlage ali pokvarjenosti reagenta. V takem primeru je treba preskus ponoviti (le če se uporabi heksametildisilizan/trimetilklorosilan).

5.4   Plinskokromatografska analiza

5.4.1   Predhodni postopki, kondicioniranje kapilarne kolone

5.4.1.1

Kolono (točka 3.11) pritrdite na plinski kromatograf, in sicer vstopni del na injektor z deljenjem vzorca, izhodnega pa na detektor. Opravite splošne preglede plinskega kromatografa (tesnjenje tokokroga plinov, učinkovitost detektorja, učinkovitost sistema za vbrizgavanje z deljenjem vzorca in sistema beleženja itd.).

5.4.1.2.

Če kolono uporabljate prvič, je priporočljivo, da jo kondicionirate, in sicer tako, da skozi kapilarno kolono spustite blag tok plina, nato pa vključite plinski kromatograf in začnete postopno segrevanje do temperature najmanj 20 °C nad delovno temperaturo (opomba 8). To temperaturo vzdržujte najmanj dve uri, nato pa vzpostavite delovne pogoje (nastavitev pretoka plina in deljenja vzorca, vžig plamena, priključitev na računalniški sistem, prilagoditev temperature kolone, detektorja in injektorja itd.) in beležite signal z občutljivostjo, ki je najmanj dvakrat večja od tiste, ki je predvidena za analize. Potek bazne linije mora biti linearen, brez kakršnih koli vrhov, in ne sme imeti odklona. Negativen premočrtni odklon kaže na slabo tesnjenje med kolono in instrumentom, pozitiven odklon pa na slabo kondicionirano kolono. Opomba 8: Temperatura kondicioniranja mora vedno biti najmanj 20 °C nižja od najvišje temperature, določene za uporabljeno stacionarno fazo.

5.4.2   Izbor delovnih pogojev

5.4.2.1

Delovni pogoji so naslednji: — temperatura kolone: 260 ± 5 °C, — temperatura injektorja: 280–300 °C, — temperatura detektorja: 280–300 °C, — linearna hitrost nosilnega plina: 20 do 35 cm/s za helij, 30 do 50 cm/s za dušik, — delilno razmerje: od 1: 50 do 1: 100, — občutljivost instrumenta: 4- do 16-kratna minimalna atenuacija, — občutljivost beleženja: 1 do 2 mV celotne skale, — količina vbrizgane snovi: 0,5 do 1 μl raztopine TMSE. Ti pogoji se lahko spremenijo glede na značilnosti kolone in plinskega kromatografa, tako da se dobijo kromatogrami, ki izpolnjujejo naslednje zahteve: — retenzijski čas β-sitosterola mora biti 20 ± 5 minut, — vrh za kampesterol mora biti: za oljčno olje (povprečna vsebnost 3 %) 20 ± 5 % celotne skale; za sojino olje (povprečna vsebnost 20 %) 80 ± 10 % celotne skale, — vsi prisotni steroli morajo biti ločeni. Poleg tega, da so ločeni, morajo biti vrhovi tudi popolnoma razdvojeni, tj. signal vrha se mora pred začetkom novega vrha vrniti na bazno linijo. Vendar je nepopolna resolucija sprejemljiva pod pogojem, da se vrh pri TRR 1.02 (sitostanol) lahko količinsko opredeli s pomočjo pravokotnice.

5.4.3   Analizni postopek

5.4.3.1

Z 10 μl mikrobrizgalko odmerite 1 μl heksana, 0,5 μl zraka in 0,5 do 1 μl vzorčne raztopine. Dvignite bat mikrobrizgalke, tako da se igla izprazni. Iglo potisnite skozi membrano injektorja in po eni do dveh sekundah raztopino hitro vbrizgajte in potem po približno petih sekundah iglo počasi izvlecite. Uporabi se lahko tudi avtomatski injektor.

5.4.3.2

Beležite, dokler TMSE prisotnih triterpenskih dialkoholov popolnoma ne eluirajo. Bazna linija mora vedno ustrezati zahtevam (točka 5.4.1.2).

5.4.4   Identifikacija vrhov

Identificirajte posamezne vrhove na podlagi retenzijskih časov in s primerjavo z mešanico sterolnih in triterpenskih dialkoholnih TMSE, analiziranih v enakih pogojih (glej Dodatek).

Steroli in triterpenski dialkoholi eluirajo v naslednjem zaporedju: holesterol, brasikasterol, ergosterol, 24-metilen holesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ7-kampesterol, Δ5,23-stigmastadienol, klerosterol, ß-sistosterol, sitostanol, Δ5-avenasterol, Δ5,24-stigmastadienol, Δ7-stigmastenol, Δ7-avenasterol, eritrodiol in uvaol.

Retenzijska časa za ß-sitosterol za koloni SE-52 in SE-54 sta prikazana v tabeli 1.

Sliki 1 in 2 prikazujeta tipične kromatograme nekaterih olj.

5.4.5   Kvantitativna ocena

5.4.5.1

Z računalniškim sistemom izračunajte površine vrhov za α-holestanol ter sterole in triterpenske dialkohole. Ne upoštevajte vrhov za tiste spojine, ki niso vključene med tiste, navedene v tabeli 1 (ergosterol se ne računa). Za odzivni faktor α-holestanola je treba šteti, da je enak 1.

5.4.5.2

Izračunajte koncentracijo vsakega posameznega sterola v mg/kg maščobe: pri čemer je: Ax = površina vrha za sterol x, izračunana z računalniškim sistemom; As = površina vrha za α-holestanol, izračunana z računalniškim sistemom; ms = masa dodanega α-holestanola, v miligramih; m = masa vzorca, uporabljenega za določanje, v gramih.

6.   IZRAŽANJE REZULTATOV

6.1

Zabeležite posamezne koncentracije sterola kot mg/kg maščobe in njihovo vsoto kot „steroli skupaj“. Sestavo vsakega posameznega sterola ter eritrodiola in uvaola je treba izraziti na eno decimalno mesto natančno. Vsoto skupnih sterolov je treba izraziti brez decimalk.

6.2

Izračunajte delež za vsak posamezni sterol iz razmerja med ustrezno površino vrha in površino vseh vrhov za sterol ter eritrodiol in uvaol: pri čemer je: Ax = površina vrha x; ΣA = površina vseh vrhov za sterol.

6.3.

Navidezni β-sitosterol: Δ5-23-stigmastadienol + klerosterol + β-sitosterol + sitostanol + Δ5-avenasterol + Δ5-24-stigmastadienol.

6.4.

Izračunajte delež eritrodiola in uvaola: pri čemer je ΣA = površina vseh vrhov za sterol, izračunana z računalniškim sistemom; Er = površina vrha za eritrodiol, izračunana z računalniškim sistemom; Uv = površina vrha za uvaol, izračunana z računalniškim sistemom.

„Dodatek

Določanje linearne hitrosti plina

Pri nastavitvi plinskega kromatografa na normalne delovne pogoje vbrizgajte 1 do 3 μl metana (ali propana) in izmerite čas, ki ga plin potrebuje za pot skozi kolono, od trenutka vbrizganja do trenutka, ko se pojavi vrh (tM).

Linearna hitrost v cm/s je podana z L/tM, pri čemer je L dolžina kolone v centimetrih in tM izmerjeni čas v sekundah.

Tabela 1

Relativni retenzijski časi sterolov

Vrh	Identifikacija		Relativni retenzijski čas
			Kolona SE 54	Kolona SE 52
1	holesterol	Δ-5-holesten-3ß-ol	0,67	0,63
2	holestanol	5α-holestan-3ß-ol	0,68	0,64
3	brasikasterol	[24S]-24-metil-Δ-5,22-holestadien-3ß-ol	0,73	0,71
*	ergosterol	[24S]-24-metil-Δ5-7-22-holestatrien-3β-ol	0,78	0,76
4	24-metilen-holesterol	24-metilen-Δ-5,24-holestadien-3ß-o1	0,82	0,80
5	kampesterol	(24R)-24-metil-Δ-5-holesten-3ß-ol	0,83	0,81
6	kampestanol	(24R)-24-metil-holestan-3ß-ol	0,85	0,82
7	stigmasterol	(24S)-24-etil-Δ-5,22-holestadien-3ß-ol	0,88	0,87
8	Δ-7-kampesterol	(24R)-24-metil-Δ-7-holesten-3ß-ol	0,93	0,92
9	Δ-5,23-stigmastadienol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,23-holestadien-3ß-ol	0,95	0,95
10	klerosterol	(24S)-24-etil-Δ-5,25-holestadien-3ß-ol	0,96	0,96
11	ß-sitosterol	(24R)-24-etil-Δ-5-holesten-3ß-ol	1,00	1,00
12	sitostanol	24-etil-holestan-3ß-ol	1,02	1,02
13	Δ-5-avenasterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-holesten-3ß-ol	1,03	1,03
14	Δ-5-24-stigmastadienol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,24-holestadien-3ß-ol	1,08	1,08
15	Δ-7-stigmastenol	(24R,S)-24-etil-Δ-7-holesten-3ß-ol	1,12	1,12
16	Δ-7-avenasterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-7-holesten-3ß-ol	1,16	1,16
17	eritrodiol	5α-olean-12-en-3β28-diol	1,41	1,41
18	uvaol	Δ12-ursen-3β28-diol	1,52	1,52

Slika 1

Plinski kromatogram sterolnih in triterpenskih dialkoholnih frakcij lampante oljčnega olja (z dodanim notranjim standardom)

Slika 2

Plinski kromatogram sterolnih in triterpenskih dialkoholnih frakcij rafiniranega oljčnega olja (z dodanim notranjim standardom)

Slika 3

Tankoplastna kromatografija olja iz oljčnih tropin s površino, s katere je treba odstraniti silikagel za določitev sterolov in triterpenskih dialkoholov

1 –

skvalen

2 –	triterpenski in alifatski alkoholi

3 –	steroli in triterpenski dialkoholi

4 –	začetne in proste maščobne kisline

„PRILOGA XII

METODA MEDNARODNEGA SVETA ZA OLJKE ZA ORGANOLEPTIČNO OCENJEVANJE DEVIŠKEGA OLJČNEGA OLJA

1.   NAMEN IN PODROČJE UPORABE

Namen te mednarodne metode je določiti postopek za ocenjevanje organoleptičnih značilnosti deviškega oljčnega olja v smislu točke 1 Priloge XVI k Uredbi (ES) št. 1234/2007 in na podlagi teh značilnosti določiti način za razvrščanje olj. Metoda vsebuje tudi navedbe za neobvezno etiketiranje.

Opisana metoda se uporablja samo za deviško oljčno olje ter njegovo razvrščanje ali etiketiranje glede na intenzivnost odkritih napak in sadežnosti, kot jo določi skupina izbranih, usposobljenih in preverjenih pokuševalcev, ki sestavljajo ocenjevalno komisijo.

Metoda vsebuje tudi navedbe za neobvezno etiketiranje.

V tej prilogi se uporabljajo najnovejše razpoložljive različice standardov Mednarodnega sveta za oljke.

2.   OSNOVNI SPLOŠNI BESEDNJAK ZA ORGANOLEPTIČNO ANALIZO

Glej standard IOC/T.20/Dok. št. 4 „Organoleptična analiza: osnovni splošni besednjak“

3.   POSEBNI BESEDNJAK

3.1   Negativne lastnosti

Pregreto/morklja Značilna aroma olja iz oljk, ki so bile zložene ali skladiščene v takšnih pogojih, da so dosegle visoko stopnjo anaerobne fermentacije, ali olja, ki je ob pretakanju v rezervoarjih ali sodih ostalo v stiku z usedlinami, pri katerih je prav tako prišlo do anaerobne fermentacije.

Plesnivo – vlažno – zemlja Značilna aroma olja iz oljk, na katerih so se zaradi večdnevnega skladiščenja v vlagi razvile plesni in kvasovke, ali olja iz oljk, ki so bile pobrane umazane z zemljo ali blatom in niso bile oprane.

Zakisano/kiselkasto Značilna aroma nekaterih olj, ki spominja na vino ali kis. Aroma nastane zaradi aerobne fermentacije oljk ali ostankov oljčne drozge v nepravilno opranih slojnicah, kar povzroči nastanek ocetne kisline, etilacetata in etanola.

Žarko Aroma olj, pri katerih je prišlo do intenzivne oksidacije.

Zmrznjene oljke (vlažen les) Značilna aroma olj iz oljk, ki so na drevju zmrznile.

3.2   Druge negativne lastnosti

Segreto ali Značilna aroma olj, ki so jih med predelavo preveč in/ali predolgo

zažgano segrevali, zlasti med termičnim mešanjem oljčne drozge pod neustreznimi temperaturnimi pogoji.

Seno – les Značilna aroma nekaterih olj iz suhih oljk.

Grobo Grob in gost občutek pri nekaterih starih oljih, ki ob pokušanju obložijo ustno votlino.

Strojno olje Aroma olja, ki spominja na dizel, maščobe ali mineralna olja.

Rastlinska voda Aroma, ki jo olje pridobi ob daljšem stiku s fermentirano rastlinsko vodo.

Slanica Aroma olja iz oljk, hranjenih v slanici.

Kovinsko Aroma, ki spominja na kovino. Značilna je za olje, ki je bilo med mletjem, mešanjem, stiskanjem ali skladiščenjem dolgo v stiku s kovinskimi površinami.

Športa Značilna aroma olja iz oljk, stiskanih v novih športah. Razlikuje se glede na to, ali so slojnice izdelane iz zelenega ali posušenega materiala.

Črvivo Aroma olja iz oljk, ki so jih napadle ličinke oljčne muhe (Bactrocera oleae).

Kumara Aroma olja, ki nastane, kadar je olje predolgo neprepustno zaprto, zlasti v pločevinkah, in jo pripisujejo nastanku 2,6-nonadienala.

3.3   Pozitivne lastnosti

Sadežno Skupek vonjev, ki je odvisen od sorte oljk ter izvira iz zdravih in svežih zrelih ali nezrelih oljk. Zaznava se neposredno in/ali retronazalno.

Grenko Značilen osnovni okus olja iz zelenih olj ali oljk na stopnji zorenja. Zaznava se s papilami, ki so na korenu jezika v obliki črke V.

Pikantno Skeleč tipni občutek v ustih, značilen za olja, proizvedena na začetku proizvodnega leta, v glavnem iz še nezrelih oljk. Zaznava se v celotni ustni votlini, zlasti v grlu.

3.4   Neobvezna terminologija za etiketiranje

Vodja ocenjevalne komisije lahko na zahtevo potrdi, da so ocenjena olja skladna z opredelitvami in intervali, ki glede intenzivnosti in zaznavanja lastnosti ustrezajo izrazom v nadaljevanju.

Pozitivne lastnosti (sadežno, grenko in pikantno): glede na intenzivnost zaznavanja: intenzivno, če je mediana lastnosti višja od 6, srednje, če je mediana lastnosti med 3 in 6, lahko, če je mediana lastnosti nižja od 3.

Sadežno Skupek vonjev, ki je odvisen od sorte oljk ter izvira iz zdravih in svežih oljk, pri katerih ne prevladuje niti sadežnost zelenih oljk niti sadežnost zrelih oljk. Zaznava se neposredno in/ali retronazalno.

Sadežno – zeleno Skupek vonjev, ki spominja na zelene sadeže, je odvisen od sorte oljk ter izvira iz zdravih in svežih zelenih oljk. Zaznava se neposredno in/ali retronazalno.

Sadežno – zrelo Skupek vonjev, ki spominja na zrele sadeže, je odvisen od sorte oljk ter izvira iz zdravih in svežih oljk. Zaznava se neposredno in/ali retronazalno.

Uravnoteženo Olje, ki ni neuravnoteženo v smislu vonja, okusa in tipnega občutka v ustih ter pri katerem je mediana lastnosti grenko in/ali pikantno za dve točki višja od mediane lastnosti sadežno.

Blago olje Olje, pri katerem je mediana lastnosti grenko in pikantno nižja ali enaka 2.

4.   KOZARCI ZA DEGUSTACIJO OLJA

Glej standard IOC/T.20/Dok. št. 5 „Kozarci za degustacijo olja“.

5.   PROSTOR ZA OCENJEVANJE

Glej standard IOC/T.20/Dok. št. 6 „Navodila za ureditev prostora za ocenjevanje“.

6.   DODATKI

Da bi lahko pokuševalci pravilno opravili svojo nalogo, morajo biti v vsaki kabini zagotovljeni in zlahka dostopni naslednji dodatki:

—	kozarci (standardizirani), ki vsebujejo vzorce, so oštevilčeni s kodo, pokriti z urnim steklom in hranjeni pri temperaturi 28 ± 2 °C,

—	ocenjevalni list (glej sliko 1) v tiskani obliki (ali elektronski, če so izpolnjeni pogoji za ocenjevalni list), vključno z navodili za njegovo uporabo, če je to potrebno,

—	kemični svinčnik ali pisalo z neizbrisljivim črnilom,

—	pladnji s koščki jabolka in/ali vodo, vodo z dodanim ogljikovim dioksidom in/ali prepečencem,

—	kozarec vode sobne temperature,

—	list s splošnimi pravili iz oddelkov 8.4 in 9.1.1,

—	pljuvalniki.

7.   VODJA OCENJEVALNE KOMISIJE IN POKUŠEVALCI

7.1   Vodja ocenjevalne komisije

Vodja ocenjevalne komisije mora biti ustrezno usposobljen in imeti strokovno znanje o vrstah olj, s katerimi se bo med delom srečeval. Ima ključno vlogo v ocenjevalni komisiji ter je odgovoren za njeno organizacijo in delovanje.

Vodja ocenjevalne komisije mora imeti osnovno znanje o delu z orodji za organoleptično analizo, organoleptične izkušnje, mora biti natančen pri pripravi, organizaciji in izvedbi pokušenj ter mora znati te pokušnje potrpežljivo in znanstveno načrtovati in izvesti.

Vodja ocenjevalne komisije ima izključno odgovornost za izbiro, usposabljanje in preverjanje pokuševalcev za določitev ravni njihovih sposobnosti. To pomeni, da je odgovoren za oceno pokuševalcev, ki mora biti vedno objektivna ter za katero mora vodja oblikovati posebne postopke na podlagi pokušenj in zanesljivih meril za sprejem ali zavrnitev. Glej standard IOC/T.20/Dok. št. 14 „Navodila za izbiro, usposabljanje in preverjanje kvalificiranih pokuševalcev deviških oljčnih olj“.

Vodja ocenjevalne komisije je odgovoren za uspešnost komisije in posledično za njeno oceno, za katero mora zagotoviti zanesljiva in objektivna dokazila. V vsakem primeru mora biti vedno zmožen dokazati, da so metoda in pokuševalci pod nadzorom. Priporočljivo je redno usposabljanje ocenjevalne komisije (IOC/T.20/Dok. št. 14, točka 5).

Vodja ocenjevalne komisije ima končno odgovornost za vodenje njenih evidenc. Slednje morajo biti vedno sledljive. Poleg tega mora vodja izpolnjevati zahteve glede zagotavljanja kakovosti, ki so določene v mednarodnih standardih za organoleptično analizo, in zagotoviti, da so vzorci ves čas anonimni.

Vodja ocenjevalne komisije je odgovoren za inventuro opreme, potrebne za izpolnitev specifikacij te metode, pri tem pa mora zagotoviti, da je ta oprema ustrezno očiščena in vzdrževana, o čemer mora imeti pisna dokazila, vključno z dokazilom o izpolnjevanju pogojev za pokušanje.

Vodja ocenjevalne komisije je odgovoren za sprejem in shranjevanje vzorcev, ko prispejo v laboratorij, ter njihovo shranjevanje po pokušanju. Pri tem mora zagotoviti, da so vzorci ves čas anonimni in ustrezno shranjeni, za kar mora oblikovati pisne postopke za zagotovitev sledljivosti in zanesljivosti celotnega procesa.

Poleg tega je vodja ocenjevalne komisije odgovoren za pripravo, kodiranje in predstavitev vzorcev pokuševalcem v skladu z ustreznim načrtom pokušanja in predhodno določenimi protokoli ter za zbiranje in statistično obdelavo podatkov, ki jih pridobijo pokuševalci.

Vodja ocenjevalne komisije je odgovoren za razvoj in oblikovanje kakršnih koli drugih postopkov, ki so morda potrebni za izpolnitev tega standarda in zagotovitev pravilnega delovanja komisije.

Vodja ocenjevalne komisije mora poiskati načine, kako primerjati rezultate komisije z rezultati drugih komisij, ki so analizirale deviško oljčno olje, da bi ugotovil, ali komisija deluje pravilno.

Vodja ocenjevalne komisije mora spodbujati člane komisije, tako da spodbuja njihovo zanimanje in radovednost ter konkurenco med njimi. V ta namen se zelo priporoča, da vodja zagotavlja neovirano izmenjavo informacij s člani komisije, tako da jih obvešča o vseh opravljenih nalogah in dobljenih rezultatih. Poleg tega vodja zagotavlja, da njegovo mnenje ostane anonimno, in ne dovoli drugim vodjem, da bi vsiljevali svoja merila drugim pokuševalcem.

Vodja ocenjevalne komisije pravočasno povabi pokuševalce in odgovori na kakršna koli poizvedovanja glede izvedbe pokušenj, vendar pri tem ne razkrije nobenega mnenja o vzorcu.

7.2   Pokuševalci

Osebe, ki delujejo kot pokuševalci pri organoleptičnih pokušnjah oljčnih olj, to počnejo prostovoljno, kar pomeni, da se morajo zavedati obveznosti, ki izhajajo iz takega prostovoljnega dela, in dejstva, da za to ne bodo plačani. Zato je priporočljivo, da kandidati vložijo pisno vlogo. Vodja ocenjevalne komisije izbere, usposablja in preverja kandidate glede na njihove sposobnosti razlikovanja med podobnimi vzorci, pri čemer je treba upoštevati, da se bo njihova natančnost med usposabljanjem povečala.

Pokuševalci morajo delovati kot pravi degustatorji, pri čemer ne smejo upoštevati svojih osebnih okusov, temveč poročati le o občutkih, ki jih zaznavajo. Zato morajo vedno delati v tišini ter sproščeno in brez hitenja, tako da se lahko čim bolj osredotočijo na vzorec, ki ga pokušajo.

Za vsako pokušnjo je potrebnih 8 do 12 pokuševalcev, vendar je priporočljivo, da so na voljo dodatni pokuševalci, ki lahko nadomestijo morebitne odsotne pokuševalce.

8.   POGOJI ZA OCENJEVANJE

8.1   Predstavitev vzorca

Vzorec olja za analizo je predstavljen v standardiziranih kozarcih za degustacijo, ki izpolnjujejo standard IOC/T.20/Dok. št. 5 „Kozarci za degustacijo olja“.

Kozarec vsebuje 14–16 ml olja (ali 12,8–14,6 g, če se vzorci tehtajo) in je pokrit z urnim steklom.

Vsak kozarec je označen s kodo, sestavljeno iz naključno izbranih številk ali kombinacije črk in številk. Koda ne sme imeti nobenega vonja.

8.2   Temperatura prostora za ocenjevanje in vzorca

Vzorci olja, namenjeni pokušanju, se skozi celotno pokušnjo hranijo v kozarcih pri temperaturi 28± 2 °C. Ta temperatura je bila izbrana zato, ker omogoča lažje opazovanje organoleptičnih razlik kot pri sobni temperaturi in ker pri nižjih temperaturah aromatične spojine, značilne za ta olja, slabo izhlapevajo, medtem ko pri višjih temperaturah nastajajo hlapne spojine, značilne za segreta olja. Za metodo, ki jo je treba uporabiti za segrevanje vzorcev v kozarcu, glej standard IOC/T.20/Dok. št. 5 „Kozarci za degustacijo olja“.

Temperatura prostora za ocenjevanje mora biti med 20 in 25 °C (glej IOC/T.20/Dok. št. 6).

8.3   Čas za ocenjevanje

Jutro je najboljši čas za pokušanje olj. Dokazano je, da obstajajo določeni časi v dnevu, ki so optimalni za zaznavanje okusa in vonja. Pred obroki se občutljivost za zaznavanje vonjev in okusov poveča, medtem ko je po obrokih ta občutljivost manjša.

Vendar tega merila ni treba upoštevati do skrajnosti, saj lahko lakota zamoti pokuševalce in zmanjša njihovo sposobnost razlikovanja. Zato se priporoča, da pokušnje potekajo med 10. in 12. uro.

8.4   Pokuševalci: splošna pravila ravnanja

Priporočila v nadaljevanju veljajo za ravnanje pokuševalcev med delom.

Pokuševalci se na vabilo vodje ocenjevalne komisije udeležijo organoleptične pokušnje ob predhodno določenem času in upoštevajo naslednje:

—	Ne kadijo ali pijejo kave vsaj 30 minut pred pokušnjo.

—	Ne smejo predhodno uporabiti nobene dišave, kozmetičnega izdelka ali mila, katerega vonj bi bilo mogoče zaznati tudi med pokušnjo. Roke si morajo umiti z neodišavljenim milom, pri čemer si jih morajo tolikokrat splakniti in posušiti, dokler morebitnega vonja ni več mogoče zaznati.

—	Ne jedo vsaj eno uro pred pokušanjem.

—	Če se pokuševalci fizično ne počutijo dobro, zlasti če je zmanjšan njihov občutek za vonj ali okus, ali če se iz kakršnega koli psihološkega razloga ne morejo osredotočiti na svoje delo, se vzdržijo pokušanja in o tem ustrezno obvestijo vodjo ocenjevalne komisije.

—	Če so pokuševalci izpolnili zgornja priporočila, mirno in tiho zasedejo svoje mesto v dodeljeni kabini.

—	Pazljivo preberejo navodila z ocenjevalnega lista in ne začnejo ocenjevati vzorca, dokler niso popolnoma pripravljeni na nalogo, ki jo morajo opraviti (sproščeno in brez hitenja). V primeru kakršnih koli dvomov bi se morali o tem na samem pogovoriti z vodjo ocenjevalne komisije.

—	Naloge morajo opravljati v tišini.

—	Mobilne telefone morajo imeti ves čas izklopljene, da ne bi motili svojih kolegov pri osredotočanju in delu.

9.   POSTOPEK ZA ORGANOLEPTIČNO OCENJEVANJE IN RAZVRŠČANJE DEVIŠKEGA OLJČNEGA OLJA

9.1   Tehnika pokušanja

9.1.1

Pokuševalci dvignejo kozarec, pokrit z urnim steklom, tako da se ne odkrije, in ga počasi nagnejo. Potem ga zavrtijo, tako da se notranja površina kozarca čim bolj namoči. Ko to storijo, snamejo urno steklo ter s počasnimi in globokimi vdihi vohajo vzorec, da bi ocenili olje. Vzorca ne bi smeli vohati več kot 30 sekund. Če do takrat ne pridejo do nobenega zaključka, po kratkem počitku začnejo znova. Ko je vohanje vzorca končano, pokuševalci ocenijo občutke, ki jih vzorec vzbudi (retronazalni vonj, okus in tipni občutek v ustih). To naredijo tako, da naredijo majhen požirek približno 3 ml olja. Zelo pomembno je, da olje razporedijo po vsej ustni votlini, od sprednjega dela ust in jezika, ob strani proti zadnjemu delu, nebu in grlu, saj je intenzivnost zaznavanja okusov in občutkov v ustih odvisna od območja na jeziku, nebu in grlu. Poudariti je treba, da je bistveno, da pokuševalec ustrezno količino olja zelo počasi razporedi od zadnjega dela jezika proti nebu in grlu, medtem ko se osredotoča na vrstni red zaznave grenkosti in pikantnosti. V nasprotnem primeru se lahko pri nekaterih oljih zgodi, da ni mogoče zaznati niti enega od teh dražljajev ali da pikantnost prekrije grenkost. Kratki in zaporedni vdihi skozi usta pokuševalcu omogočajo, da razporedi vzorec po vsej ustni votlini in retronazalno zazna hlapne aromatične sestavine. Upoštevati je treba tudi tipni občutek pikantnosti v ustih. Zato je priporočljivo olje zaužiti.

9.1.2

Pri organoleptičnem ocenjevanju deviškega oljčnega olja je priporočljivo, da se na vsaki pokušnji ocenijo največ ŠTIRJE VZORCI in da se pokuševalec udeleži največ treh pokušenj na dan, s čimer se izogne kontrastu, do katerega bi prišlo, če bi različne vzorce pokušal neposredno enega za drugim. Ker se zaradi zaporednega pokušanja vzorcev občutljivost zmanjša ali izgubi, je treba ostanke olja odstraniti iz ust. Priporoča se žvečenje majhnega koščka jabolka, ki se lahko potem, ko se prežveči, izpljune v pljuvalnik. Potem se usta splaknejo z vodo sobne temperature. Med koncem ene pokušnje in začetkom druge mora preteči najmanj 15 minut.

9.2   Uporaba ocenjevalnega lista s strani pokuševalcev

Ocenjevalni list, ki ga morajo uporabiti pokuševalci, je podrobneje prikazan na sliki 1 v tej prilogi.

Vsak pokuševalec v ocenjevalni komisiji povoha in pokusi (1) olje, ki se ocenjuje. Nato na 10-centimetrski lestvici na ocenjevalnem listu navede intenzivnost zaznave vsake od negativnih in pozitivnih lastnosti.

Če pokuševalci zaznajo negativne lastnosti, ki niso navedene v oddelku 4, jih zabeležijo v rubriko „Drugo“, pri čemer uporabijo izraz ali izraze, ki te lastnosti najbolj natančno opisujejo.

9.3   Uporaba podatkov s strani vodij ocenjevalnih komisij

Vodja ocenjevalne komisije zbere ocenjevalne liste, ki jih je izpolnil vsak pokuševalec, in preveri intenzivnost posameznih lastnosti. Če ugotovi nepravilnost, od pokuševalca zahteva, da ponovno pregleda svoj ocenjevalni list in po potrebi ponovi pokušnjo.

Vodja ocenjevalne komisije vnese podatke o ocenjevanju, ki jih zagotovi vsak član ocenjevalne komisije, v računalniški program, kot je določen s standardom IOC/T.20/Dok. št. 15, da se na podlagi izračunane mediane statistično izračunajo rezultati analize. Glej oddelek 9.4 in Dodatek k tej prilogi. Podatki za določen vzorec se vnesejo s pomočjo matrike, sestavljene iz 9 stolpcev, ki predstavljajo 9 organoleptičnih lastnosti, in n vrstic, ki predstavljajo n uporabljenih članov ocenjevalne komisije.

Če je ugotovljeno napako v rubriko „Drugo“ vneslo vsaj 50 % ocenjevalne komisije, vodja ocenjevalne komisije izračuna mediano napake in določi ustrezno razvrstitev.

Vrednost grobega koeficienta variacije, ki določa razvrstitev (napaka z največjo intenzivnostjo in lastnostjo sadežno), mora biti enaka ali nižja od 20 %.

V nasprotnem primeru mora vodja ocenjevalne komisije ponoviti oceno določenega vzorca v drugi pokušnji.

Če je to pogost primer, se priporoča, da vodja ocenjevalne komisije zagotovi pokuševalcem posebno dodatno usposabljanje (IOC/T.20/Dok št. 14, točka 5) ter na podlagi indeksa ponovljivosti in indeksa odstopanja preveri uspešnost ocenjevalne komisije (IOC/T.20/Dok. št. 14, točka 6).

9.4   Razvrstitev olja

Olje se razvrsti v skladu s spodaj navedenimi opisi na podlagi mediane napak in mediane lastnosti sadežno. Mediana napak je mediana napake, ki se zazna z največjo intenzivnostjo. Mediana napak in mediana lastnosti sadežno sta izraženi na eno decimalno mesto natančno.

Razvrstitev olja se izvede s primerjavo vrednosti mediane napak in mediane lastnosti sadežno z referenčnimi intervali, navedenimi spodaj. Ker so bile meje intervalov določene ob upoštevanju napak metode, veljajo za absolutne. Programska oprema omogoča prikaz razvrstitve v obliki tabele s statističnimi podatki ali grafa.

(a)	Ekstra deviško oljčno olje: mediana napak je enaka 0, mediana lastnosti sadežno pa je višja od 0.

(b)	Deviško oljčno olje: mediana napak je višja od 0 in enaka ali nižja od 3,5, mediana lastnosti sadežno pa je višja od 0.

(c)	Lampante oljčno olje: mediana napake je višja od 3,5 ali nižja ali enaka 3,5, mediana sadežnosti pa enaka 0.

Opomba 1:

Če je mediana lastnosti grenko in/ali pikantno višja od 5,0, vodja ocenjevalne komisije to navede na potrdilu o pokušnji.

Slika 1

OCENJEVALNI LIST ZA DEVIŠKO OLJČNO OLJE

Intenzivnost zaznavanja napak
Pregreto/morklja (*1)
Plesnivo/vlažno/zemlja (*1)
Zakisano/ kiselkasto (*1)
Zmrznjene oljke (vlažen les)
Žarko
Druge negativne lastnosti:
Deskriptor:	kovinsko  seno  črvivo  grobo  slanica  segreto ali zažgano  rastlinska voda  športa  kumara  strojno olje 
Intenzivnost zaznavanja pozitivnih lastnosti
Sadežno
	zeleno 	zrelo 
Grenko
Pikantno
Ime pokuševalca:			Koda pokuševalca:
Koda vzorca:	Podpis:

„Dodatek

Metoda izračuna mediane in intervalov zaupanja

Mediana

Mediana je realno število Xm, za katerega je značilno, da je verjetnost (p), da so vrednosti distribucije (X) nižje od tega števila (Xm), enaka ali manjša od 0,5 in da je hkrati verjetnost (p), da so vrednosti distribucije (X) enake ali nižje od Xm, enaka ali višja od 0,5. Bolj praktična opredelitev je, da je mediana 50. percentil distribucije števil, urejenih po naraščajočem vrstnem redu. Povedano enostavneje, je mediana vrednost na sredini lihega števila urejenih vrednosti v nizu ali povprečje dveh vrednosti na sredini sodega števila urejenih vrednosti v nizu.

Grobi standardni odklon

Za zanesljivo oceno variabilnosti povprečja je treba upoštevati grobi standardni odklon po Stuartu in Kendallu (4). Formula izraža asimptotičen grobi standardni odklon, tj. grobo oceno variabilnosti upoštevanih podatkov, pri čemer sta N število opažanj in IQR interkvartilni interval, ki zajema točno 50 % primerov določene distribucije verjetnosti.

Interkvartilni interval se izračuna tako, da se izračuna velikost razpona med 75. in 25. percentilom.

Percentil je vrednost Xpc, za katero je značilno, da je verjetnost (p), da so vrednosti distribucije nižje od Xpc, enaka ali manjša od določene stotine in da je hkrati verjetnost (p), da so vrednosti distribucije nižje ali enake Xpc, enaka ali višja od navedene določene stotine. Stotina označuje izbrani delež distribucije. V primeru mediane je ta enak 50/100.

V praksi je percentil vrednost distribucije, ki ustreza določenemu območju, zarisanemu od krivulje distribucije ali gostote. Tako, na primer, 25. percentil predstavlja vrednost distribucije, ki ustreza območju 0,25 ali 25/100.

Pri tej metodi se percentili izračunajo na podlagi dejanskih vrednosti v podatkovni matriki (postopek za izračun percentilov).

Grobi koeficient variacije (%)

CVr% predstavlja čisto število, ki označuje delež variabilnosti analiziranega niza števil. Zato je ta koeficient zelo koristen za preverjanje zanesljivosti članov ocenjevalne komisije.

95-odstotni intervali zaupanja pri mediani

95-odstotni intervali zaupanja (vrednost napake prve vrste je enaka 0,05 ali 5 %) predstavljajo interval, v katerem bi se vrednost mediane lahko spremenila, če bi bilo mogoče preskus ponoviti neštetokrat. V praksi ta interval označuje interval variabilnosti pokušnje pod izbranimi delovnimi pogoji ob predpostavki, da se pokušnja lahko ponovi večkrat. Tako kot pri CVr% ta interval pomaga oceniti zanesljivost pokušnje.

pri čemer je C v primeru 95-odstotnega intervala zaupanja enak 1,96.

Primer izračuna je predstavljen v Prilogi I k standardu IOC/T.20/Dok. št. 15.

Viri

(1)	Wilkinson, L. 1990. Systat: The system for statistics. Evanston, IL.SYSTAT Inc.

(2)	Cicchitelli, G. 1984. Probabilità e Statistica. Maggioli Editore, Rimini.

(3)	Massart, D.L.; Vandeginste, B.G.M.; Deming, Y.; Michotte, L. 1988. Chemometrics. A textbook. Elsevier. Amsterdam.

(4)	Kendall, M.G.; Stuart, A. 1967. The advanced theory of statistics. Vol. 1. Hafner Publishing Co.

(5)	McGill, R.; Tukey, J.W.; Larsen, W.A. 1978. Variation of Box Plots. The American Statistician, 32, (2), str. 12–16.

(6)	IOC/T.28/Dok. št. 1, september 2007, Smernice za akreditacijo laboratorijev za organoleptično ocenjevanje s posebnim poudarkom na oljčnem olju v skladu s standardom ISO/IEC 17025:2005.

(7)	IOC/T.20/Dok. št. 14.

(8)	IOC/T.20/Dok. št. 15.

(9)	ISO/IEC 17025:05.

„PRILOGA XXa

METODA ZA UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI TUJIH OLJ V OLJČNIH OLJIH

1.   PODROČJE UPORABE

Ta metoda se uporablja za ugotavljanje prisotnosti tujih rastlinskih olj v oljčnih oljih. V teh je mogoče ugotoviti prisotnost rastlinskih olj z visoko vsebnostjo linolne kisline (sojino olje, olje iz oljne ogrščice, sončnično olje itd.) in nekaterih rastlinskih olj z visoko vsebnostjo oleinske kisline, kot so lešnikovo olje, sončnično olje z visoko vsebnostjo oleinske kisline in olje iz oljčnih tropin. Ugotovljena raven prisotnosti je odvisna od vrste tujega olja in sorte oljk. Za lešnikovo olje je ugotovljena raven prisotnosti običajno 5–15 %. S to metodo ni mogoče določiti vrste tujih olj, temveč zgolj ugotoviti, ali je oljčno olje pristno ali ne.

2.   PRINCIP

Olje se očisti z ekstrakcijo v trdni fazi na silikagelnih kartušah. Sestava triacilglicerolov (TAG) se določi s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC) z reverzno fazo, in sicer z detektorjem lomnega količnika in propionitrilom kot mobilno fazo. Iz očiščenega olja se z metiliranjem z mrzlo raztopino KOH v metanolu (Priloga X B) pripravijo metilni estri maščobnih kislin, ki se nato analizirajo s kapilarno plinsko kromatografijo z visokopolarnimi kolonami (Priloga X A). Teoretična sestava triacilglicerolov se računalniško izračuna iz sestave maščobnih kislin, in sicer ob upoštevanju naključne razdelitve maščobnih kislin v triacilglicerolu na položajih 1 in 3 ter na položaju 2 in z omejitvami za nasičene maščobne kisline na položaju 2. Pri metodi izračuna gre za drugačen postopek, kot je opisan v Prilogi XVIII. Iz teoretičnih in eksperimentalnih (HPLC) sestav triacilglicerolov se izračuna več matematičnih algoritmov, dobljeni rezultati pa se primerjajo z rezultati iz podatkovne zbirke, sestavljene na podlagi pristnih oljčnih olj.

3.   MATERIALI IN REAGENTI

3.1   Čiščenje olja

3.1.1

25 ml erlenmajerice.

3.1.2

5 ml steklene epruvete z navojnim zamaškom, opremljene s priključkom iz politetrafluoroetilena.

3.1.3

Silikagelne kartuše, 1 g (6 ml), za ekstrakcijo v trdni fazi (na primer proizvajalca Waters iz Massachusettsa v ZDA).

3.1.4

n-heksan čistoče za analizo.

3.1.5

Mešano topilo iz heksana in dietilnega etra (87:13, v/v).

3.1.6

n-heptan čistoče za analizo.

3.1.7

Aceton čistoče za analizo.

3.2   Analiza triacilglicerolov s HPLC

3.2.1

Mikrobrizgalke (50 μl) in igle za vbrizgavanje za HPLC.

3.2.2

Propionitril visoke čistosti ali čistosti za HPLC (na primer proizvajalca ROMIL iz Cambridgea v Združenem kraljestvu), ki se uporablja kot mobilna faza.

3.2.3

Kolona za HPLC (notranjega premera 25 cm x 4 mm), polnjena s fazo RP-18 (delci velikosti 4 μm).

3.3   Priprava metilnih estrov maščobnih kislin

(glej Prilogo X B)

3.3.1

Metanol, ki vsebuje največ 0,5 % vode.

3.3.2

Heptan čistoče za analizo.

3.3.3

2-N raztopina kalijevega hidroksida v metanolu. 1,1 g kalijevega hidroksida raztopite v 10 ml metanola.

3.3.4

5 ml steklene epruvete z navojnim zamaškom, opremljene s priključkom iz politetrafluoroetilena.

3.4   Plinskokromatografska analiza metilnih estrov maščobnih kislin

(Glej metodo za določanje trans-nenasičenih maščobnih kislih s kapilarno plinsko kromatografijo v Prilogi X A).

3.4.1

Mikrobrizgalke (5 μl) in igle za plinskokromatografsko vbrizgavanje.

3.4.2

Vodik ali helij kot nosilni plin.

3.4.3

Vodik in kisik za plamensko-ionizacijski detektor.

3.4.4

Vodik ali helij kot pomožni nosilni plin.

3.4.5

Kvarčna kapilarna kolona (notranjega premera 50–60 m x 0,25–0,30 mm), pokrita s cianopropilpolisiloksansko ali cianopropilfenilsiloksansko fazo (SP-2380 ali podobno) debeline 0,20–0,25 μm.

4.   OPREMA

4.1

Vakuumska naprava za ekstrakcijo v trdni fazi.

4.2

Rotacijski izparilnik.

4.3

Oprema za HPLC, sestavljena iz: 4.3.1 digestorija za mobilno fazo; 4.3.2 injicirnega ventila znamke Rheodyne z 10-μl zanko; 4.3.3 visokotlačne črpalke; 4.3.4 termostatične peči za kolono za HPLC, ki lahko vzdržuje temperature, nižje od sobne (15–20 °C) (na primer vrste Peltier); 4.3.5 detektorja lomnega količnika; 4.3.6 računalniškega sistema za pridobivanje podatkov z integracijskim programom.

4.4

Oprema za kapilarno plinsko kromatografijo, opisana v Prilogi X A, vključno z: 4.4.1. injektorjem z deljenjem vzorca; 4.4.2 plamensko-ionizacijskim detektorjem; 4.4.3 pečjo, pri kateri je mogoče programirati temperaturo; 4.4.4 računalniškim sistemom za pridobivanje podatkov z integracijskim programom.

4.5

Računalnik s programom Microsoft EXCEL.

5.   ANALIZNI POSTOPEK

5.1   Čiščenje olja

Silikagelna kartuša za ekstrakcijo v trdni fazi se vstavi v vakuumsko napravo za eluiranje in se v vakuumu izpere s 6 ml heksana. Vakuum se sprosti, da se prepreči, da bi se kolona posušila, pod kartušo pa se postavi erlenmajerica. V kolono se vnese raztopina olja (približno 0,12 g) v 0,5 ml heksana, ki gre skozi kolono ter se nato v vakuumu eluira z 10 ml mešanega topila (točka 3.1.5) iz heksana in dietilnega etra (87:13 v/v). Eluirano topilo se homogenizira, približno polovica količine pa se prelije v drugo erlenmajerico. Obe raztopini se ločeno odparita do suhega v rotacijskem izparilniku pod znižanim pritiskom in pri sobni temperaturi. Za analizo triacilglicerolov se eden od ostankov raztopi v 1 ml acetona (glej prvi odstavek točke 5.2) in prelije v 5 ml stekleno epruveto z navojnim zamaškom. Drugi se raztopi v 1 ml n-heptana in prelije v drugo 5 ml stekleno epruveto z navojnim zamaškom za pripravo metilnih estrov maščobnih kislin.

Opomba: Olje se lahko čisti tudi s silikagelno kolono, kot je opisano v metodi IUPAC 2.507.

5.2   Analiza triacilglicerolov s HPLC

Pripravite sistem HPLC, pri tem pa vzdržujte temperaturo kolone na 20 °C, kot mobilno fazo pa uporabite propionitril, katerega pretok nastavite na 0,6 ml/min. Ko se bazna linija stabilizira, vbrizgajte topilo; če je bazna linija po približno 12 do 25 minutah videti izkrivljena, uporabite drugo vrsto acetona ali mešanico propionitrila in acetona (25: 75), da raztopite vzorec.

Opomba: Nekatere vrste acetona v navedenem časovnem intervalu povzročajo izkrivljanja bazne linije.

Vbrizgajte 10 μl alikvot očiščenega olja, raztopljenega v acetonu (5 %). Pot skozi kolono traja približno 60 minut. Temperaturo peči in/ali pretok je treba prilagoditi, da se doseže kromatogram, podoben tistemu na sliki 1 ter pri katerem trilinolein (vrh 1) eluira pri 15,5 min, resoluciji med paroma LLL/OLLn (vrhova 1 in 2) in OLL/OOLn (vrhova 4 in 5) pa sta dobri.

Višina vrha 2 (OLLn+PoLL) mora doseči vsaj 3 % celotne skale.

5.3   Priprava metilnih estrov maščobnih kislin

Očiščenemu olju, raztopljenemu v 1 ml n-heptana, dodajte 0,1 ml 2 N raztopine kalijevega hidroksida v metanolu. Epruveto čvrsto zamašite. Močno jo tresite 15 sekund, nato pa pustite, da se raztopina razsloji, dokler zgornja plast ne postane bistra (5 minut). Raztopina n-heptana je pripravljena za vbrizganje v plinski kromatogram. Pri sobni temperaturi jo lahko pustite največ 12 ur.

5.4   Plinskokromatografska analiza metilnih estrov maščobnih kislin

Uporabiti je treba postopek, ki je opisan pri metodi za določanje trans-nenasičenih maščobnih kislin (glej Prilogo X A).

Plinskokromatografski sistem se nastavi tako, da je temperatura peči 165 °C. Priporočena temperatura peči je izotermična pri 165 °C za 10 min, nato pa jo je treba zvišati na 200 °C s hitrostjo 1,5 °C/min. Priporočena temperatura injektorja je med 220 °C in 250 °C, da se zmanjša nastajanje trans-nenasičenih maščobnih kislin (glej Prilogo X A). Temperatura detektorja je 250 °C. Kot nosilni plin je treba uporabiti vodik ali helij, tlak v glavi kolone pa mora znašati približno 130 kPa. Količina, ki se vbrizga z deljenjem vzorca, je 1 μl.

Doseči je treba plinskokromatografski profil, ki je podoben tistemu na sliki 2. Posebno pozornost je treba nameniti resoluciji med vrhovoma C18:3 in C20:1 (vrh C18:3 se mora prikazati pred vrhom C20:1). Da bi se dosegli ti pogoji, je treba optimizirati začetno temperaturo in tlak v glavi kolone. Prilagodite pogoje injektorja (temperaturo, delilno razmerje in vbrizgano količino), da zmanjšate razlikovanje med palmitinsko in palmitoleinsko kislino.

Za količinsko opredelitev trans-izomerov mora biti višina vrha C20:0 približno 20 % celotne skale. Če je vrh C18:0 videti izkrivljen, zmanjšajte količino vzorca.

6.   INTEGRACIJA KROMATOGRAFSKIH VRHOV

6.1   Kromatogram HPLC

Slika 1 prikazuje tipični kromatogram HPLC triacilglicerolov v očiščenem oljčnem olju. Za integracijo vrhov je treba slediti trem baznim linijam: in sicer med začetkom vrha 1 in koncem vrha 3, med začetkom vrha 4 in dolino pred vrhom 8 ter med dolino pred vrhom 8 in koncem vrha 18.

Celotna površina je vsota površin vseh (opredeljenih in neopredeljenih) vrhov od 1 do 18. Delež vsakega vrha se izračuna na naslednji način:

Deleži morajo biti izraženi na dve decimalni mesti.

6.2   Plinski kromatogram

Slika 2 prikazuje plinski kromatogram alkilnih estrov maščobnih kislin, dobljen iz očiščenega oljčnega olja. Izračunati je treba deleže naslednjih maščobnih kislin:

palmitinske;	P (C16:0)	=	metilni ester + etilni ester
stearinske;	S (C18:0)	=	metilni ester
palmitoleinske;	Po (C16:1)	=	vsota metilnih estrov obeh cis-izomerov
oleinske;	O (C18:1)	=	vsota metilnih estrov obeh cis-izomerov + etilni ester + trans-izomeri
linolne;	L (C18:2)	=	metilni ester + etilni ester + trans-izomeri
linolenske;	Ln (C18:3)	=	metilni ester + trans-izomeri
arašidove;	A (C20:0)	=	metilni ester
eikozanojske (gondojske);	G (C20:1)	=	metilni ester

Etilni in trans-izomerni estri lahko manjkajo v plinskem kromatografu.

Celotna površina (AT) je vsota površin vseh vrhov v kromatogramu od C14:0 do C24:0, razen vrha, ki se nanaša na skvalen. Delež vsakega vrha se izračuna na naslednji način:

Rezultate je treba izraziti na dve decimalni mesti natančno.

Za izračune z računalniškimi programi ni potrebna normalizacija do 100, saj se to izvede samodejno.

Slika 1

Kromatogram HPLC triacilglicerolov v deviškem oljčnem olju sorte „Chemlali“. Glavne komponente kromatografskih vrhov

(1) LLL; (2) OLLn+PoLL; (3) PLLn; (4) OLL; (5) OOLn+PoOL;

(6) PLL+PoPoO; (7) POLn+PPoPo+PPoL; (8) OOL+LnPP; (9) PoOO;

(10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; (12) PLP;

(13) OOO+PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; (17) SOO;

(18) POS+SLS.

Tabela 1

Podatki o ponovljivosti pri določanju triacilglicerolov (TAG) v deviškem oljčnem olju s HPLC pri temperaturi kolone 20 °C in uporabi propionitrila kot mobilne faze

ECN	Vrhovi HPLC	TAG	Vzorec 1		Vzorec 2		Vzorec 3		Vzorec 4		Vzorec 5
			povprečje (%)	RSOp (%)	povprečje (%)	RSOp (%)	povprečje (%)	RSOp (%)	povprečje (%)	RSOp (%)	povprečje (%)	RSOp (%)
42	1	LLL	0,020	7,23	0,066	5,18	0,095	4,10	0,113	0,95	0,34	1,05
	2	OLLn+ PoLL	0,085	7,44	0,24	1,78	0,26	2,25	0,35	2,02	0,50	2,83
	3	PLLn	0,023	15,74	0,039	5,51	0,057	5,62	0,082	4,35	0,12	6,15
44	4	OLL	0,47	1,52	1,53	0,42	2,62	0,98	3,35	1,05	4,37	1,13
	5	OOLn+ PoOL	1,07	2,01	1,54	0,46	1,61	0,71	1,72	1,07	1,77	2,40
	6	PLL+ PoPoO	0,11	12,86	0,24	4,37	0,65	1,32	1,35	0,73	2,28	1,24
	7	POLn+ PpoPo+ PpoL	0,42	5,11	0,49	2,89	0,55	2,01	0,85	1,83	1,09	1,96
46	8	OOL+ LnPP	6,72	0,63	8,79	0,31	11,21	0,42	13,25	0,33	15,24	0,23
	9	PoOO	1,24	2,86	1,49	0,95	1,63	0,85	2,12	0,45	2,52	0,56
	10	SLL+ PLO	2,70	0,65	4,05	0,70	6,02	0,65	9,86	0,53	11,53	0,31
	11	PoOP+ SpoL+ SOLn+ SpoPo	0,64	4,42	0,69	3,02	0,79	1,23	1,53	0,89	1,70	1,66
48	12+13	OOO+ PLP+ PoPP	49,60	0,07	48,15	0,06	42,93	0,06	33,25	0,10	24,16	0,06
	14	SOL	0,82	1,72	0,92	1,56	1,05	1,32	1,25	1,05	1,60	1,77
	15	POO	22,75	0,25	21,80	0,20	21,05	0,30	20,36	0,35	20,17	0,14
50	16	POP	3,05	0,46	4,56	0,42	4,98	0,52	5,26	0,41	5,57	0,38
	17	SOO	6,87	0,21	5,56	0,33	4,86	0,43	4,12	0,72	3,09	0,69
	18	POS+ SLS	1,73	1,23	1,65	1,10	1,54	0,99	1,49	1,10	1,41	1,00
n = 3 ponovitve RSOp = relativni standardni odklon ponovljivosti

Slika 2

Plinski kromatogram alkilnih estrov maščobnih kislin, dobljen iz olja iz oljčnih tropin s transesterifikacijo z mrzlo raztopino KOH v metanolu

7.   UGOTAVLJANJE PRISOTNOSTI TUJIH OLJ V OLJČNIH OLJIH

Metoda izračuna pri ugotavljanju prisotnosti tujih olj v oljčnem olju s primerjavo med matematičnimi algoritmi in podatkovno zbirko, sestavljeno na podlagi pristnih oljčnih olj, je določena v Prilogi I k standardu IOC/T.20/Dok. št. 25.“