1.1.1.1.

Pokryte platničky ELISA rekombinantom AHSV-4 VP7 rozpusteným v karbonátovom/bikarbonátovom tlmivom roztoku, pH 9,6. Platničky inkubujte cez noc pri teplote 4 °C.

1.1.1.2.

Platničky opláchnite päťkrát destilovanou vodou obsahujúcou 0,01 % (v/v) Tween 20 (čistiaci roztok). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

1.1.1.3.

Platničky blokujte fosfátovým slaným tlmivým roztokom (PBS) pH 7,2 + 5 % (w/v) odstredeného mlieka (sušené odstredené mlieko NestléTM), 200 μl/jamku 1 hodinu pri teplote 37 °C.

1.1.1.4.

Odstráňte blokujúci roztok a jemne pritlačte platničky na savý materiál.

1.1.2.1.

Testované vzorky séra, pozitívne a negatívne kontrolné séra sa rozpustia 1:25 v PBS + 5 % (w/v) odstredeného mlieka + 0,05 % (v/v) Tween 20, 100 μl/jamku. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.

Pri titrácii urobte dvojnásobné riedenie 1: 25 (100 μl/jamku), jedno sérum na jeden stĺpec platničky, a to isté vykonajte s pozitívnou a negatívnou kontrolou. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.

1.1.2.2.

Platničky opláchnite päťkrát destilovanou vodou obsahujúcou 0,01 % (v/v) Tween 20 (čistiaci roztok). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

1.1.3.1.

Dajte 100 μl/jamku chrenovej peroxidázy (HRP) konjugovanej s anti-konským gama-globulínom rozpusteným v PBS + 5 % mlieku + 0,05 % Tween 20, pH 7,2. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.

1.1.3.2.

Platničky opláchnite päťkrát destilovanou vodou obsahujúcou 0,01 % (v/v) Tween 20 (čistiaci roztok). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

1.1.4.1.

Pridajte 200 μl/jamku chromogénového/substrátového roztoku (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetyl aminobenzaldehyd) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metyl-2-benzo-tiazolin hydrazon hydrochlorid) + 5 μl H2O2).

Vyvolávanie farby sa zastaví pridaním 50 μl 3N H2SO4 po približne 5 až 10 minútach (predtým, ako sa začne sfarbovať negatívna kontrola).

Tiež je možné použiť aj iné chromogény ako ABTS (2,2′-Azino-bis-[3-etylbenzotiazolin-6- kyselina sulfónová], TMB (tetrametyl benzidín) alebo OPD (orto-fenyldiamín).

1.1.4.2.

Odčítajte pri 600 nm (alebo 620 nm).

1.2.1.

Vypočítajte medznú hodnotu pripočítaním 0,06 k hodnote negatívnej kontroly (0,06 je štandardná odchýlka odvodená zo skupiny 30 negatívnych sér).

1.2.2.

Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú absorpčné hodnoty nižšie než je medzná hodnota, sa považujú za negatívne.

1.2.3.

Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú absorpčné hodnoty vyššie než je medzná hodnota + 0,15, sa považujú za pozitívne.

1.2.4.

Skúšobné vzorky, pri ktorých sa uvádzajú prostredné absorpčné hodnoty, sú nerozhodné a na potvrdenie výsledku je potrebné použiť inú metódu.

2.1.1.1.

Pokryte platničky ELISA rekombinantým AHSV-4 VP7 (50 – 100 ng) rozpusteným v karbonátovom/bikarbonátovom tlmivom roztoku, pH 9,6. Inkubujte cez noc pri teplote 4 °C.

2.1.1.2.

Platničky trikrát premyte vo fosfátovom soľnom tlmivom roztoku (PBS) 0,1 × obsahujúcom 0,135 M NaCl a 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

2.1.2.1.

Testované vzorky séra a pozitívne a negatívne kontrolné séra sa rozpustia v pomere 1:5 v rozpúšťadle obsahujúcom 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween 20 a 0,1 % Kathon, 100 μl/jamku. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.

Pri titrácii urobte dvojnásobné riedenie testovaného séra od 1:10 do 1:280 v 8 jamkách (100 μl/jamku), jedno sérum na jeden stĺpec platničky, a to isté vykonajte s pozitívnou a negatívnou kontrolou. Inkubujte hodinu pri teplote 37 °C.

2.1.2.2.

Platničky päťkrát premyte vo fosfátovom soľnom tlmivom roztoku (PBS) 0,1× obsahujúcom 0,135 M NaCl a 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

2.1.3.1.

Dajte 100 μl/jamku monoklonálnej protilátky anti-VP7 konjugovanej chrenovou peroxidázou. Táto monoklonálna protilátka bola vopred rozpustená v pomere 1:5 000 až 1:15 000 v roztoku 1:1 StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics; odkaz: SZ03) v destilovanej vode. Inkubujte 30 minút pri teplote 37 °C.

2.1.3.2.

Platničky päťkrát premyte vo fosfátovom soľnom tlmivom roztoku (PBS) 0,1 × obsahujúcom 0,135 M NaCl a 0,05 % (v/v) Tween 20 (PBST). Na odstránenie zvyšnej vody platničky jemne pritlačte na savý materiál.

2.2.1.

Stanovte blokujúce percento (BP) každej vzorky pomocou nasledujúceho vzorca, kde „Abs“ znamená protilátky:

2.2.2.

Vzorky vykazujúce hodnotu BP vyššiu ako 50 % by sa mali považovať za pozitívne pre protilátky AHSV.

2.2.3.

Vzorky vykazujúce hodnotu BP nižšiu ako 45 % by sa mali považovať za negatívne pre protilátky AHSV.

2.2.4.

Vzorky vykazujúce hodnotu BP medzi 45 % a 50 % by sa mali považovať za nerozhodné a musia sa nanovo otestovať. Ak bude výsledok opäť nerozhodný, zvieratá by sa mali nanovo otestovať na vzorkách odobratých nie skôr ako dva týždne po odobratí vzorky, ktorá sa považovala za nerozhodnú.

—

fenol-chloroformová extrakcia nukleových kyselín,

—

adsorpcia nukleových kyselín na filtračný systém,

—

adsorpcia nukleových kyselín na systém magnetických lôžok.

1.1.

1 g vzorky tkaniva sa homogenizuje v 1 ml denaturovaného roztoku (4 M tiokyanatan guanidínu, 25 mM citranu sodného, 0,1 M 2-merkaptoetanolu, 0,5 % sarkosyl).

1.2.

Do supernatantu sa po centrifugácii pridá 1 μg RNA z kvasiniek, 0,1 ml 2 M citranu sodného s pH 4, 1 ml fenolu a 0,2 ml chloroformu/zmesi izoamylalkoholu (49:1).

1.3.

Suspenzia sa silno pretrasie a schladí na ľade na 15 minút.

1.4.

Po centrifugácii je RNA prítomná vo vodnej fáze extrahovaná fenolom, vyzrážaná etanolom a resuspendovaná v sterilnej vode.

—

priamy primer

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

—

reverzný primer

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

—

TaqMan MGB sonda

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1.

Koncentrácia vzorky primeru sa rozpustí na pracovnú koncentráciu 8 μM („pracovná vzorka primeru 8 μM“) a sonda sa rozpustí na pracovnú koncentráciu 50 μM („pracovná vzorka sondy 50 μM“). Je potrebné navrhnúť usporiadanie testovacej platničky, ktorá sa vloží do softvéru v stroji na polymerázovú reťazovú reakciu v reálnom čase. Použitím daného usporiadania ako vodidla sa 2,5 μl každej pracovnej vzorky primeru 8 μM pridá do každej jamky, ktorá bude obsahovať vzorky RNA, pozitívne a/alebo negatívne kontroly (konečná koncentrácia primeru bude 1 μM v 20 μl zmesi RT-PCR). Platnička je uložená na ľade.

2.1.2.

S priamym a reverzným primerom sa zmieša 2 μl izolovanej RNA (skúšobné vzorky a pozitívna kontrola) alebo 2 μl vody bez obsahu RNázy v negatívne reagujúcich kontrolách. Táto zmes sa denaturuje ohrevom na 95 °C počas 5 minút, po čom nasleduje rýchle ochladenie na ľade počas aspoň 5 minút.

2.1.3.

Podľa pokynov výrobcu sa pre niekoľko vzoriek, ktoré sa budú testovať, pripraví príslušný objem zmesi „master mix“ v jednom kroku na polymerázovú reťazovú reakciu spojenú s reverznou transkripciou v reálnom čase. 0,1μl pracovnej vzorky sondy 50 μM sa pridá do každej jamky s obsahom vzoriek RNA (konečná koncentrácia sondy bude 0,25 μM v každej jamke s obsahom vzoriek RNA),13 μl zmesi „master mix“ v jednom kroku na polymerázovú reťazovú reakciu spojenú s reverznou transkripciou v reálnom čase sa rozdelí do každej jamky na platničke polymerázovej reťazovej reakcie, ktorá obsahuje denaturované primery a RNA.

2.1.4.

Platnička sa umiestni do termocykléru v reálnom čase naprogramovaného na reverznú transkripciu a zistenie amplifikácie/fluorescencie cDNA. Podmienky amplifikácie pozostávajú z kroku prvej reverznej transkripcie pri teplote 48 °C počas 25 minút, po čom nasleduje 10 minút pri teplote 95 °C („hot start“) a 40 cyklov po 15 sekúnd pri teplote 95 °C, 35 sekúnd pri teplote 55 °C a 30 sekúnd pri teplote 72 °C (alebo 40 cyklov pri teplote 97 °C po 2 sekundy a pri teplote 55 °C po 30 sekúnd, ak sa použijú reagenty a termocyklér umožňujúci rýchle reakcie). Údaje o fluorescencii sa získajú pri konečnom kroku pri teplote 55 °C.

2.1.5.

Ak sa získajú atypické amplifikačné krivky, skúška sa nepovažuje za platnú a treba ju zopakovať.

Vzorky sa považujú za pozitívne v prípade, ak hodnota Ct (číslo cyklu, pri ktorom fluorescencia vytvorená pri reakcii prekročí prahovú hodnotu fluorescencie) bude nižšia než stanovená prahová hodnota Ct (35) v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie (Ct ≤ 35) alebo jej rovná.

Vzorky sa považujú za nerozhodné v prípade, ak hodnota Ct bude vyššia ako stanovená prahová hodnota Ct (35) v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie (Ct ≥ 35).

Vzorky sa považujú za negatívne v prípade, ak sa získa horizontálna amplifikačná krivka, ktorá neprekročí líniu prahovej hodnoty v rámci 40 cyklov polymerázovej reťazovej reakcie.

—

priamy primer

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

—

reverzný primer

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

—

TaqMan MGB sonda

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1.

Pracovné roztoky zmesi primeru a sondy sú vytvorené v koncentrácii 25 × v 5 μΜ pre priame primery a 3 μΜ pre sondu. Je potrebné navrhnúť usporiadanie testovacej platničky, ktorá sa vloží do softvéru v stroji na polymerázovú reťazovú reakciu v reálnom čase. Použitím daného usporiadania sa do príslušných jamiek platničky pridá 5 μl vzoriek RNA vrátane testovacích vzoriek a pozitívnych a negatívnych kontrol.

2.2.2.

RNA sa denaturuje ohrevom na 95 °C počas 5 minút, po čom nasleduje rýchle ochladenie na ľade počas aspoň 3 minút.

2.2.3.

Podľa pokynov výrobcu sa pre niekoľko vzoriek, ktoré sa budú testovať, pripraví príslušný objem zmesi „master mix“ v jednom kroku na polymerázovú reťazovú reakciu spojenú s reverznou transkripciou v reálnom čase. 1 μl 25 × pracovného roztoku zmesi primeru-sondy (z bodu 2.2.1 vyššie) sa zahrnie do zmesi „master mix“ s cieľom dosiahnuť konečnú koncentráciu každej jamky 200 nM pre každý primer a 120 nM pre sondu. 20 μl zmesi „master mix“ sa rozdelí do každej jamky na platničke polymerázovej reťazovej reakcie, ktorá obsahuje denaturovanú RNA.

2.2.4.

Platnička sa umiestni do termocykléru v reálnom čase naprogramovaného na reverznú transkripciu a zistenie amplifikácie/fluorescencie cDNA podľa odporúčania výrobcov. Podmienky amplifikácie pozostávajú napríklad z kroku prvej reverznej transkripcie pri teplote 48 °C počas 10 minút, po čom nasleduje 10 minút pri teplote 95 °C a 40 cyklov po 15 sekúnd pri teplote 95 °C a 45 sekúnd pri teplote 60 °C.

2.2.5.

Vzorky sa považujú za pozitívne v prípade, ak normalizovaná fluorescencia pre skúšku AHSV polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou prekročí prahovú hodnotu 0,1 pri 36 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie vo všetkých replikátoch vzorky.

Vzorky sa považujú za nerozhodné v prípade, ak normalizovaná fluorescencia pre skúšku AHSV polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou prekročí prahovú hodnotu 0,1 pri 36 až 40 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie v ktoromkoľvek replikáte vzorky.

Vzorky sa považujú za negatívne v prípade, ak normalizovaná fluorescencia pre skúšku AHSV polymerázovej reťazovej reakcie spojenej s reverznou transkripciou neprekročila prahovú hodnotu 0,1 pri 40 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie vo všetkých replikátoch vzorky a v prípade, ak normalizovaná fluorescencia v prípade chránenej syntetickej externej kontrolnej skúšky prekročila prahovú hodnotu 0,1 pri 33 cykloch polymerázovej reťazovej reakcie.“