PRÍLOHA I

Metódy testovania na detekciu a identifikáciu špecifikovaného škodcu uvedené v článku 3 ods. 2

1.   Testovanie pomocou spór

Na detekciu a identifikáciu sa používajú letné spórangiá a zimné spóry, ktoré sa získavajú z pôdy po preosievaní alebo priamo z rastlinného materiálu.

2.   Metódy na detekciu škodcu

Na extrakciu spór špecifikovaného škodcu z pôdy sa používa jedna z týchto metód:

a)	metóda preosievania pôdy, ako ju opisuje Pratt (1976) (1);

b)	metóda preosievania pôdy, ako ju opisuje van Leeuwen et al. (2005) (2);

c)	technika zónovej odstredivky na spracovanie vzoriek s vysokou priepustnosťou, ako je opisuje Wander et al. (2007) (3).

3.   Metódy identifikácie

Po extrakcii sa spóry špecifikovaného škodcu identifikujú jednou z týchto metód:

a)	morfologická identifikácia pod svetelným mikroskopom pri zväčšení 100 – 400 x;

b)	konvenčný test PCR s použitím primerov na základe Lévesque et al. (2001) (4) a van den Boogert et al. (2005) (5);

c)	test PCR v reálnom čase, pri ktorom sa používajú primery a sondy podľa van Gent-Pelzer et al. (2010) (6);

d)	test PCR v reálnom čase, pri ktorom sa používajú primery a sondy podľa Smith et al. (2014) (7).

4.   Životaschopnosť zimných spór

Stanovenie životaschopnosti zimných spór možno dosiahnuť mikroskopickým vyšetrením alebo biologickou analýzou. Životaschopnosť spórangií sa môže stanoviť mikroskopickým vyšetrením spórangií naložených v laktofenole alebo vo vode (Przetakiewicz 2015) (8). Spórangiá s granulovým obsahom alebo s mierne zaoblenou protoplazmou sa môžu považovať za životaschopné. Trvale plazmolizované alebo bez viditeľného obsahu sa považujú za mŕtve.

Ako alternatíva alebo v prípade pochybností sa môže vykonať biologická analýza opísaná v bode 3 prílohy IV.

5.   Určenie patotypov

Na určenie patotypov sú potrebné čerstvé nádory.

Inokulum určené na test sa vytvorí jednou z týchto metód:

a)

metóda SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), pozostávajúca z týchto dvoch krokov: i) produkcia inokula; Staré (hnedé) tkanivo nádora sa rozdrví na menšie kusy a pri izbovej teplote sa suší na vzduchu, až kým nestvrdne. Tvrdé tkanivo sa rozomelie buď ručne, alebo mechanicky. Mletý materiál sa na sucho preosieva, pričom sa zachytáva frakcia od 25 do 75 μm a následne sa extrahuje chloroformovou metódou Pratt (1976)1; ii) produkcia čerstvých nádorov Približne 10 mg extrahovaných zimných spór sa roztrúsi na povrch 10 ml sterilnej destilovanej vody v malej plastovej Petriho miske a inkubuje sa v tme pri teplote 20 °C až do vyklíčenia. Hľuzy zemiakov s malými klíčkami s dĺžkou približne 1 až 2 mm sa umiestnia do priehľadných plastových nádob potiahnutých vlhkým vláknitým papierom s označenými klíčkami smerujúcimi nahor. Klíčky sa pomocou striekačky obkrúžia roztavenou vazelínou. Kruh musí byť neprerušený a dostatočne vysoký, aby udržal spórovú suspenziu a nedochádzalo k jej úniku. 10 ml spór klíčiacich zimných spór sa ďalej zriedi sterilnou vodou na 20 ml a pomocou pipety alebo stlačenej fľaše sa umiestni do vnútra kruhov, až kým sa klíček úplne neponorí do spórovej suspenzie. Plastové nádoby sa uzavrú viečkami a inkubujú sa 4 dni pri teplote 10 °C, potom sa nádoby otvoria, inokulum a vazelínové kruhy sa odstránia a nádoby sa premiestnia do zahmleného skleníka s teplotou 15 až 18 °C (16 hodín svetla);

b)	metóda Spiekermann & Kothoff (1924) (9);

c)	metóda Potoček et al. (1991) (10);

d)	metóda Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925 (11); Lemmerzahl 1930 (12); Noble and Glynne 1970 (13)).

Na určenie všetkých patotypov, o ktorých je známe, že sú pre Úniu relevantné [1(D1), 2(G1), 6(O1), 18(T1) a 38(Nevşehir)], sa použije diferenciálny test na stanovenie infekcie s rôznymi odrodami špecifikovanej rastliny, ako sa uvádza v tabuľke. Test sa vykoná podľa protokolu uvedeného v písmene d) (metóda Glynne-Lemmerzahl).

Selektívna citlivosť kultivarov zemiakov na určenie patotypov huby S. endobioticum

Kultivar	Patotypy huby S. endobioticum
	1(D1)	2(G1)	6(O1)	18(T1)	38(Nevşehir)
Tomensa/Evora/Deodara	S	S	S	S	S
Irga/Producent	R	S	S	S	S
Talent	R	R*	R*	S	S
Saphir	R	S	R	R	S
Ikar/Gawin/Karolin/Belita	R	R	R	R	R
„S“: náchylný „R“: odolný *: poukazuje na slabú náchylnosť odrody na hubu S. endobioticum („výskyt sorusových polí bez nekrózy a vytvárania nádorov“).

---

(1)  Pratt MA. 1976. A wet-sieving and flotation technique for the detection of resting sporangia of Synchytrium endobioticum in soil. Annals of Applied Biology 82: 21 – 29.

(2)  van Leeuwen GCM, Wander JGN, Lamers J, Meffert JP, van den Boogert PHJF, Baayen RP. 2005. Direct examination of soil for sporangia of Synchytrium endobioticum using chloroform, calcium chloride and zinc sulphate as extraction reagents. EPPO Bulletin 35: 25 – 31.

(3)  Wander JGN, van den Berg W, van den Boogert PHJF, Lamers JG, van Leeuwen GCM, Hendrickx G, Bonants P. 2007. A novel technique using the Hendrickx centrifuge for extracting winter sporangia of Synchytrium endobioticum from soil. European Journal of Plant Pathology 119: 165 – 174.

(4)  Lévesque CA, de Jong SN, Ward LJ & de Boer SH (2001) Molecular phylogeny and detection of Synchytrium endobioticum, the causal agent of potato wart. Canadian Journal of Plant Pathology 23: 200 – 201.

(5)  van den Boogert PHJF, van Gent-Pelzer MPE, Bonants PJM, de Boer SH, Wander JGN, Lévesque CA, van Leeuwen GCM, Baayen RP. 2005. Development of PCR-based detection methods for the quarantine phytopathogen Synchytrium endobioticum, causal agent of potato wart disease. European Journal of Plant Pathology 113: 47 – 57.

(6)  van Gent-Pelzer MPE, Krijger M, Bonants PJM. 2010. Improved real-time PCR assay for the detection of the quarantine potato pathogen, Synchytrium endobioticum, in zonal centrifuge extracts from soil and in plants. European Journal of Plant Pathology 126: 129 – 133.

(7)  Smith DS, Rocheleau H, Chapados JT, Abbott C, Ribero S, Redhead SA, Lévesque CA, De Boer SH. 2014. Phylogeny of the genus Synchytrium and the development of TaqMan PCR assay for sensitive detection of Synchytrium endobioticum in soil. Phytopathology 104: 422 – 432.

(8)  Przetakiewicz, J. 2015. The Viability of Winter Sporangia of Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. From Poland. American Journal of Potato Research 92:704-708.

(9)  Spieckermann A, Kothoff P. 1924. Testing potatoes for wart resistance. Deutsche Landwirtschaftliche Presse 51: 114 – 115.

(10)  Potoček J, Krajíčková K, Klabzubová S, Krejcar Z, Hnízdil M, Novák F, Perlová V. 1991. Identification of new Synchytrium endobioticum (Schilb.) Perc. pathotypes in Czech Republic. Ochrana Rostlin 27: 191 – 205.

(11)  Glynne MD. 1925. Infection experiments with wart disease of potatoes. Synchytrium endobioticum. Annals of Applied Biology 12: 34 – 60.

(12)  Lemmerzahl J. 1930. A new simplified method for inoculation of potato cultivars to test for wart resistance. Züchter 2: 288 – 297.

(13)  Noble M, Glynne MD. 1970. Wart disease of potatoes. FAO Plant Protection Bulletin 18: 125 – 135.

PRÍLOHA II

Vzor prieskumu uvedeného v článku 3

Vzor na predloženie prieskumu týkajúceho sa rakoviny zemiakov, pokiaľ ide o úrodu zemiakov za rok predchádzajúci roku, v ktorom sa správa podáva.

Túto tabuľku použite len na výsledky prieskumu v prípade zemiakov zozbieraných vo vašej krajine.

Členský štát alebo oblasť

Kategória zemiakov

Celková obrábaná plocha (ha)

Vizuálna prehliadka hľúz

Laboratórne testovanie

Ďalšie informácie

Počet vzoriek

Počet dávok

Veľkosť vzorky

Obdobie odberu vzoriek

Počet podozrivých

Počet vzoriek

Veľkosť vzoriek

Druh testu

Počet pozitívnych

vzoriek

dávok

vzoriek

dávok

Zemiaky na produkciu hľúz na výsadbu

Na spotrebu a na spracovanie

Iné (1) (spresnite)

---

(1)  V prípade krajín s prienikom škodcov by mohlo byť napríklad relevantné uviesť oddelene od všeobecných prieskumov množstvo vzoriek, ktoré sa použili na vyšetrovanie alebo sledovanie ohnísk.

PRÍLOHA III

Protokol na posúdenie odolnosti odrody podľa článku 7 ods. 2

Protokol na posúdenie odolnosti odrody zahŕňa tieto kroky:

1.	Testuje sa minimálne 40 hľúz alebo očiek na odrodu špecifikovanej rastliny. Rozdelia sa do dvoch skupín (opakovaní).

2.	Test vo všeobecnosti trvá dva roky. Ak sa preukáže, že odroda je mimoriadne náchylná na patotyp špecifikovaného škodcu, môže sa dĺžka testu výnimočne skrátiť na jeden rok.

3.	Pred začiatkom testovacej sezóny sa pomocou metód opísaných v prílohe I otestuje čistota inokula.

4.	Súčasťou testu musí byť vždy pozitívna kontrolná vzorka vo forme odrody špecifikovanej rastliny, ktorá je mimoriadne náchylná na patotyp špecifikovaného škodcu, ktorý sa má testovať.

5.

Použije sa jedna z týchto testovacích metód: i) metóda Glynne-Lemmerzahl (Glynne 1925, Lemmerzahl 1930, Noble & Glynne 1970); ii) metóda Spieckermann (Spieckermann & Kothoff 1924); alebo iii) metóda SASA (Science and Advice for Scottish Agriculture), pozostávajúca zo všetkých týchto krokov: — príprava hľúz: Hľuzy sa odstránia z chladiarenského skladu približne 10 dní pred plánovanou inokuláciou, jemne sa umyjú, vysušia a uskladnia v tme pri izbovej teplote, aby sa vyvolalo klíčenie. Do každej inokulácie sa zahrnie silne náchylná odroda („Morene“ alebo odroda s porovnateľnou náchylnosťou), aby slúžila ako pozitívna kontrolná vzorka; — klíčivosť zimných spór: Podmienky na vyvolanie klíčenia zimných spór sa nastavia na 21 dní pred inokuláciou. Približne 10 mg extrahovaných spór sa roztrúsi na povrch 10 ml sterilnej destilovanej vody v malých plastových Petriho miskách a inkubuje sa v tme pri teplote 20 °C až do vyklíčenia. Na inokuláciu sa obsah každej Petriho misky zriedi ďalšími 10 ml sterilnej destilovanej vody; — inokulácia a inkubácia klíčkov: Keď klíčky dosiahnu dĺžku 1 mm, obkrúžia sa vazelínou. Vazelínový kruh musí byť neprerušený, aby udržal spórovú suspenziu a nedochádzalo k jej úniku a dostatočne vysoký na to, aby suspenzia zakrývala klíček. Na každej hľuze sa obkrúži jeden klíček alebo jedna skupina klíčkov. Hľuzy sa umiestnia do plastových nádob potiahnutých vlhkým vláknitým papierom s okrúženými klíčkami smerujúcimi nahor. Vazelínové kruhy sa naplnia spórovou suspenziou pomocou pipety alebo stlačenej fľaše, až kým sa klíček úplne neponorí. Plastové nádoby sa uzavrú viečkami a inkubujú sa 4 dni v tme pri teplote 10 °C, potom sa vazelínové kruhy odstránia a nádoby sa otvorené umiestnia do skleníka s teplotou 15 – 18 °C a pravidelným zahmlievaním (3-krát denne počas 30 minút). V prípadoch, keď infekcia zlyhá, napríklad preto, že klíček zhnil alebo sa nevyvinul, hľuza sa môže opätovne testovať s použitím iného klíčka; — posúdenie: Klíčky sa vyšetria na infekciu 28 dní po inokulácii s použitím stereomikroskopu so zväčšením 10 – 15x a svetelného mikroskopu. Stupeň hodnotenia 4 alebo 5, ako sa uvádza v tabuľke, sa pozoruje na pozitívnej kontrolnej vzorke aspoň na 80 % hľúz. Aspoň jedna hľuza musí vykazovať stupeň hodnotenia 5.

6.	Všetky hľuzy sa posúdia a priradí sa im stupeň hodnotenia odolnosti od 1 do 5, ako sa uvádza v tabuľke.

7.

Každá testovaná odroda sa zaradí do odolnej skupiny („silne odolná“, „odolná“, „mierne náchylná“ alebo „mimoriadne náchylná“) podľa rozsahu stupňov hodnotenia pozorovaného v rámci príslušnej populácie jednotlivých testovaných hľúz alebo očiek: i) odroda sa považuje za „silne odolnú“, ak všetky hľuzy vo všetkých opakovaniach majú stupeň hodnotenia 1; ii) odroda sa považuje za odolnú, ak všetky hľuzy vo všetkých opakovaniach majú stupeň hodnotenia od 1 do 3; iii) odroda sa považuje za „mierne náchylnú“, ak jedna alebo viac hľúz získajú stupeň hodnotenia 4 (ak len jedna hľuza získa stupeň hodnotenia 4, test sa môže zopakovať, aby sa vylúčila nečistota v dávke odrody); iv) odroda sa považuje za „mimoriadne náchylnú“, ak aspoň jedna hľuza v jednom opakovaní získala stupeň hodnotenia 5. Zápis pri štandardnom prideľovaní stupňa hodnotenia v prípade testovaných populácií zemiakov Stupeň hodnotenia Skupina odolnosti Stupeň odolnosti Opis 1 R1 Silne odolná Včasná obranná nekróza; žiadna viditeľná tvorba sorusu. 2 R1 Odolná Neskorá obranná nekróza; tvorba sorusu je čiastočne viditeľná, sorusy sú nevyvinuté alebo nekrotické pred zrelosťou. 3 R2 Málo odolná Veľmi neskorá obranná nekróza; vyvinul sa jeden zrelý sorus alebo sorusové polia, ale úplne obklopené nekrózou; je prípustných maximálne päť letných sorusov, jasná nekróza v iných častiach toho istého kusu hľuzy. Žiadna tvorba nádorov alebo zimných spór. Pri rozhodovaní medzi skupinami 3 a 4 môže byť potrebné pripraviť tenké podložné sklíčka s infikovaným tkanivom: ak sa nevyskytujú žiadne zimné spóry, stupeň hodnotenia musí byť 3. 4 S1 Mierne náchylné Rozptýlené infekcie; sorusy alebo sorusové polia bez nekrózy, nízky počet; neskorá nekróza sa môže vyskytovať na iných miestach infekcie na klíčku; klíček môže vykazovať mierne malformácie (zhrubnutie). Vyskytujú sa kľudové (zimné) spórangiá. Pri rozhodovaní medzi skupinami 3 a 4 môže byť potrebné pripraviť tenké podložné sklíčka s infikovaným tkanivom: ak sa vyskytujú zimné spóry, stupeň hodnotenia je 4. 5 S2 Mimoriadne náchylné Vysoká hustota infikovaných polí, početné zrelé sorusy a sorusové polia bez nekrózy, polia s vysokou hustotou infikovaných miest bez nekrózy, dominantná tvorba nádorov.

PRÍLOHA IV

Podmienky zrušenia opatrení, ako sa uvádza v článku 9

1.   Podmienky na zrušenie opatrení

1.1.

Minimálne po 50 rokoch od poslednej detekcie výskytu špecifikovaného škodcu, ak v zamorenej zóne existuje neprerušený záznam o plodinách, z ktorého vyplýva, že ustanovenia článku 6 ods. 2 a 3 boli splnené počas celého obdobia a že zamorená zóna nebola využívaná ako trvalý trávny porast.

1.2.

Minimálne po 20 rokoch od poslednej detekcie výskytu špecifikovaného škodcu, ak existuje neprerušený záznam o plodinách, z ktorého vyplýva, že ustanovenia článku 6 ods. 2 a 3 boli splnené počas celého obdobia a že zamorená zóna nebola využívaná ako trvalý trávny porast; a — v dvoch biologických analýzach (ako je opísané v bode 3) s náchylnými kultivarmi zemiakov sa nezistili žiadne príznaky infekcie špecifikovaným škodcom; alebo — v jednej biologickej analýze (ako je opísané v bode 3) s náchylnými kultivarmi zemiakov sa nezistili žiadne príznaky infekcie špecifikovaným škodcom a počas priameho vyšetrenia pôdy zo zamorenej zóny mikroskopom po extrakcii spór pomocou jednej z metód uvedených v bode 2 prílohy I sa nezistil výskyt žiadnych životaschopných zimných spór. Schéma, ktorá sa má použiť na získanie pôdy na účely testovania, zahŕňa všetky tieto kroky: — zamorená zóna sa rozdelí na jednotky s rozlohou 0,33 ha; — 60 podvzoriek sa odoberie z každej jednotky do hĺbky 20 cm a rovnomerne rozloží po celej ploche alebo zoskupí podľa známych napadnutých ohnísk; — podvzorky sa dôkladne premiešajú, aby sa získali 3 vzorky na hektár.

2.   Čiastočné zrušenie opatrení

Minimálne po 10 rokoch od poslednej detekcie špecifikovaného škodcu sa v oblastiach zamorenej zóny môže zvažovať čiastočné zrušenie opatrení stanovených v článku 6 v týchto oblastiach, ak existuje neprerušený záznam o plodinách, z ktorého vyplýva, že ustanovenia článku 6 ods. 2 a 3 boli splnené počas celého obdobia a že zamorená zóna nebola využívaná ako trvalý trávny porast, a;

a)	v dvoch biologických analýzach (ako je opísané v bode 3) s náchylnými kultivarmi zemiakov sa nezistia žiadne príznaky infekcie špecifikovaným škodcom; alebo

b)

v jednej biologickej analýze (ako je opísané v bode 3) s náchylnými kultivarmi zemiakov sa nezistili žiadne príznaky infekcie špecifikovaným škodcom a počas priameho vyšetrenia pôdy zo zamorenej zóny mikroskopom po extrakcii spór pomocou jednej z metód uvedených v bode 2 prílohy I sa zistilo najviac 5 životaschopných zimných spór na gram pôdy.

Schéma, ktorá sa má použiť na získanie pôdy na účely testovania, zahŕňa všetky tieto kroky:

—	zamorená zóna sa rozdelí na jednotky s rozlohou 0,33 ha;

—	60 podvzoriek sa odoberie z každej jednotky do hĺbky 20 cm a rovnomerne rozloží po celej ploche alebo zoskupí podľa známych napadnutých ohnísk;

—	podvzorky sa dôkladne premiešajú, aby sa získali 3 vzorky na hektár.

Ak tieto podmienky nie sú splnené, môže sa po čakacej lehote minimálne dvoch rokov opäť zvážiť čiastočné zrušenie opatrení. Pri určovaní dĺžky tejto čakacej lehoty členské štáty zohľadnia úroveň infekcie a/alebo počet detegovaných životaschopných spór.

3.   Biologické analýzy na účely zrušenia opatrení

Niekoľko hľúz špecifikovaných rastlín sa inkubuje v kvetináčoch spolu s najmenej 5 l pôdy pri takej teplote a vlhkosti a takých svetelných podmienkach, ktoré sú priaznivé pre rast zemiakov. Použije sa kultivar, ktorý je silne náchylný na všetky patotypy (napr. Deodara, Evora, Morene, Tomensa, Maritiema, Arran Chief).

Rastúce rastliny zemiakov sa zrežú, keď dosiahnu výšku približne 60 cm. Po približne 100 dňoch sa novovytvorené hľuzy preskúmajú s cieľom zistiť prítomnosť nádorov.

Do testu sa musia vždy zahrnúť negatívne kontrolné vzorky pôdy bez výskytu špecifikovaného škodcu a pozitívne kontrolné vzorky napadnutej pôdy. Test sa považuje za platný, ak sa v hľuzách pozitívnej kontrolnej vzorky vytvoria nádory a v hľuzách negatívnej kontrolnej vzorky sa nevytvoria žiadne nádory. O podmienkach v skleníku, pokiaľ ide o teplotu a vlhkosť, sa vedú záznamy. Nádory, ktoré sa vytvorili v testovacích vzorkách, sa mikroskopicky vyšetria na výskyt letných spórangií a/alebo zimných spór.

Celý test sa vykonáva v podmienkach zabraňujúcich ďalšiemu šíreniu špecifikovaného škodcu.