„ANEXA C

BRUCELOZĂ

1.   IDENTIFICAREA AGENTULUI

Evidențierea prin colorare modificată acid-rezistentă sau imunospecifică a organismelor cu morfologia Brucella aflate în resturi rezultate în urma avortului, secreții vaginale sau lapte oferă o indicație probabilă a brucelozei, în special dacă aceasta este confirmată de testele serologice. Reacția în lanț a polimerazei (PCR) oferă metode suplimentare de detecție.

Oricând este posibil, Brucella spp. ar trebui să fie izolată utilizând medii simple sau selective, prin recoltarea din secreții uterine, fetuși avortați, secreții ale ugerului sau anumite țesuturi, precum ganglioni limfatici și organe reproducătoare masculine și feminine.

După izolare, speciile și biovarul pot fi identificate prin liza fagilor și/sau teste de metabolism oxidativ, în funcție de criterii de cultură, biochimice și serologice. PCR poate asigura o metodă deopotrivă complementară și de biotipizare bazată pe secvențe genomice.

Tehnicile și mediile utilizate, standardizarea și interpretarea rezultatelor trebuie să fie conforme celor specificate în Manualul de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre, ediția a șasea, 2008, capitolul 2.4.3 (bruceloza bovină), capitolul 2.7.2 (bruceloza caprină și bovină) și capitolul 2.8.5 (bruceloza porcină).

2.   TESTE IMUNOLOGICE

2.1.   Standarde

2.1.1.   La prepararea tuturor antigenilor utilizați în testul cu roz Bengal (RBT), testul de seroaglutinare (SAT), testul de fixare a complementului (CFT) și testul inelar efectuat pe proba de lapte (MRT) se va utiliza sușa tip Weybridge nr. 99 și USDA 1119-3 ale biovarului 1 de Brucella abortus.

2.1.2.   Serul standard de referință pentru testele RBT, SAT, CFT și MRT va fi serul standard internațional al OIE (OIEISS), cunoscut anterior ca cel de al doilea ser standard internațional anti-Brucella abortus al OMS (ISAbS).

2.1.3.   Serurile standard de referință pentru metodele de imunoabsorbție enzimatică (ELISA) sunt următoarele:

—

OIEISS;

—	serul standard ELISA slab pozitiv al OIE (OIEELISAWPSS);

—	serul standard ELISA puternic pozitiv al OIE (OIEELISASPSS);

—	serul standard ELISA negativ al OIE (OIEELISANSS).

2.1.4.   Serurile standard de referință pentru evaluările fluorescenței în lumină polarizată (FPA) sunt următoarele:

—	serul standard ELISA slab pozitiv al OIE (OIEELISAWPSS);

—	serul standard ELISA puternic pozitiv al OIE (OIEELISASPSS);

—	serul standard ELISA negativ al OIE (OIEELISANSS).

2.1.5.   Serurile standard menționate la punctele 2.1.3 și 2.1.4 sunt furnizate de către laboratorul de comunitar referință pentru bruceloză sau de către Agenția pentru Laboratoare Veterinare [Veterinary Laboratories Agency (VLA)], Weybridge, Marea Britanie.

2.1.6.   OIEISS, OIEELISAWPSS, OIEELISASPSS și OIEELISANSS sunt standarde internaționale principale pe baza cărora se stabilesc, în fiecare stat membru, seruri standard naționale («seruri etalon») pentru fiecare test menționat la punctul 2.1.1.

2.2.   Metodele de imunoabsorbție enzimatică (ELISA) sau alte teste obligatorii de aglutinare pentru detectarea brucelozei bovine în ser sau lapte.

2.2.1.   Material și reactivi

Tehnica utilizată și interpretarea rezultatelor trebuie să fi fost validate în conformitate cu principiile prevăzute în capitolul 1.1.4 din Manualul de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre, ediția a șasea, 2008, și trebuie să includă cel puțin studii de laborator și de diagnostic.

2.2.2.   Standardizarea testului

2.2.2.1.   Standardizarea procedurii de test pentru eșantioane individuale de ser:

(a)	o prediluție (1) de 1/150 a serului OIEISS sau o prediluție de 1/2 a serului OIEELISAWPSS sau o prediluție de 1/16 a serului OIEELISASPSS realizate într-un ser negativ (sau într-un amestec de seruri negative) trebuie să producă o reacție pozitivă;

(b)	o prediluție de 1/600 a serului OIEISS sau o prediluție de 1/8 a serului OIEELISAWPSS sau o prediluție de 1/64 a serului OIEELISASPSS realizate într-un ser negativ (sau într-un amestec de seruri negative) trebuie să producă o reacție negativă;

(c)	serul OIEELISANSS trebuie să producă întotdeauna o reacție negativă.

2.2.2.2.   Standardizarea procedurii de test pentru eșantioane de ser amestecate:

(a)

o prediluție de 1/150 a serului OIEISS, sau o prediluție de 1/2 a serului OIEELISAWPSS sau o prediluție de 1/16 a serului OIEELISASPSS realizate într-un ser negativ (sau într-un amestec de seruri negative) și diluate din nou în seruri negative cu un factor de diluare identic numărului de seruri care constituie amestecul trebuie să producă o reacție pozitivă;

(b)	serul OIEELISANSS trebuie să producă întotdeauna o reacție negativă;

(c)	testul trebuie să fie în măsură să detecteze prezența unei infecții la un singur animal din grupul de animale de la care s-au combinat eșantioanele de ser.

2.2.2.3.   Standardizarea procedurii de test pentru eșantioane de lapte sau zer amestecat:

(a)

o prediluție de 1/1 000 a serului OIEISS sau prediluție de 1/16 a serului OIEELISAWPSS sau o prediluție de 1/125 a serului OIEELISASPSS realizate într-un ser negativ (sau într-un amestec de seruri negative) și diluate din nou în proporție de 1/10 în lapte negativ trebuie să producă o reacție pozitivă;

(b)	serul OIEELISANSS diluat în proporție de 1/10 în lapte negativ trebuie să producă întotdeauna o reacție negativă;

(c)	testul trebuie să fie în măsură să detecteze prezența unei infecții la un singur animal din grupul de animale de la care s-au combinat eșantioanele de lapte sau zer.

2.2.3.   Condițiile de utilizare a testelor ELISA în diagnosticul pentru bruceloza bovină:

2.2.3.1.   Dacă se utilizează condițiile de calibrare pentru testele ELISA descrise la punctele 2.2.2.1 și 2.2.2.2 pe eșantioane de ser, sensibilitatea de diagnostic a ELISA va fi egală sau superioară celei din testul RBT sau a testului CFT, având în vedere situația epidemiologică în care este utilizat.

2.2.3.2.   Dacă se utilizează condițiile de calibrare pentru testele ELISA descrise la punctul 2.2.2.3 pe eșantioane de lapte amestecat, sensibilitatea de diagnostic a ELISA va fi egală sau superioară celei din testul MRT, având în vedere nu doar situația epidemiologică, ci și efectivele medii și ridicate ale sistemelor de creștere a animalelor prevăzute.

2.2.3.3.   Dacă testele ELISA sunt utilizate în scopuri de certificare în conformitate cu articolul 6 alineatul (1) sau pentru înființarea și menținerea unui statut al șeptelului în conformitate cu anexa A partea II punctul 10, amestecul eșantioanelor de ser trebuie să fie realizat astfel încât rezultatele testelor să poată fi raportate în manieră clară la diferitele animale de la care provine laptele inclus în amestec. Orice test de confirmare trebuie să se efectueze pe eșantioanele de ser recoltate de la animale individuale.

2.2.3.4.   Testele ELISA pot fi aplicate la un eșantion de lapte recoltat din laptele colectat de la o fermă cu cel puțin 30 % de vaci de lapte aflate în perioada de lactație. Dacă se utilizează această metodă, trebuie să se ia măsuri pentru ca eșantioanele recoltate pentru a fi examinate să fie raportate în manieră clară la diferitele animale de la care provine laptele. Orice test de confirmare trebuie să se efectueze pe eșantioanele de ser recoltate de la animale individuale.

2.3.   Testul de fixare a complementului (CFT)

2.3.1.   Antigenul reprezintă o suspensie bacteriană în soluție de fenol-salin [NaCl 0,85 % (m/v) și fenol la 0,5% (v/v)] sau într-un tampon veronal. Antigenii pot fi furnizați în stare concentrată cu condiția ca factorul de diluție utilizat să fie indicat pe eticheta flaconului. Antigenul trebuie să fie stocat la o temperatură de 4 °C. Nu se congelează.

2.3.2.   Serurile trebuie să fie inactivate după cum urmează:

—	serul bovin: la o temperatură între 56-60 °C, timp de 30-50 minute;

—	serul porcin: la o temperatură de 60 °C, timp de 30-50 minute.

2.3.3.   Pentru a obține o reacție satisfăcătoare în cadrul procedurii de testare, se va utiliza o doză de complement superioară dozei minime necesare pentru o hemoliză completă.

2.3.4.   Următoarele controale vor fi efectuate în timpul testului de fixare a complementului:

(a)	controlul efectului anticomplementar al serului;

(b)	controlul antigenului;

(c)	controlul hematiilor sensibilizate;

(d)	controlul complementului;

(e)	controlul sensibilității la începutul reacției cu ajutorul unui ser pozitiv;

(f)	controlul specificității reacției cu ajutorul unui ser negativ.

2.3.5.   Calcularea rezultatelor

Serul OIEISS conține 1 000 unități internaționale CFT (ICFTU) per ml. Dacă serul OIEISS este testat prin una dintre metodele menționate, rezultatul este exprimat sub forma unui titru (de exemplu, cea mai înaltă diluție directă a serului OIEISS, care produce 50 % hemoliză, TOIEISS). Rezultatul testului pentru serul de test dat ca titru (TSERTEST) trebuie să fie exprimat în ICFTU per ml. Pentru a converti exprimarea unui titru în ICFTU, factorul (F) necesar pentru a converti un titru de ser de test necunoscut (TSERTEST), testat prin această metodă, în exprimare ICFTU, se află din formula:

F = 1 000 × 1/TOIEISS

iar conținutul unităților internaționale CFT per ml de ser de test (ICFTUSERTEST), din formula:

ICFTUTESTSERUM = F × TTESTSERUM

2.3.6.   Interpretarea rezultatelor

Un ser care conține 20 sau mai multe ICFTU per ml va fi considerat pozitiv.

2.4.   Testul inelar efectuat pe proba de lapte (MRT)

2.4.1.   Antigenul reprezintă o suspensie bacteriană în soluție de fenol-salin [NaCl 0,85 % (m/v) și fenol la 0,5 % (v/v)] colorat cu hematoxilină. Antigenul trebuie să fie stocat la o temperatură de 4 °C. Nu se congelează.

2.4.2.   Sensibilitatea antigenului trebuie să fie standardizată în raport cu serul OIEISS, astfel încât antigenul să producă o reacție pozitivă cu o diluție de 1/500 a serului OIEISS în lapte negativ și o reacție negativă într-o diluție de 1/1 000.

2.4.3.   Testul inelar trebuie să fie efectuat pe eșantioane reprezentative ale conținutului fiecărui recipient de lapte și ale fiecărui rezervor de exploatare din fermă.

2.4.4.   Eșantioanele de lapte nu trebuie să fi fost congelate, încălzite sau agitate violent.

2.4.5.   Reacția trebuie să se realizeze utilizând una dintre metodele următoare:

—	pe o coloană de lapte de cel puțin 25 mm înălțime și pe un volum de lapte de 1 ml, la care s-au adăugat 0,03 ml sau 0,05 ml din unul dintre antigenii standard colorați;

—	pe o coloană de lapte de cel puțin 25 mm înălțime și pe un volum de lapte de 2 ml, la care s-au adăugat 0,05 ml din unul dintre antigenii standard colorați;

—	pe un volum de lapte de 8 ml, la care s-au adăugat 0,08 ml din unul dintre antigenii standard colorați.

2.4.6.   Amestecul de lapte și antigen trebuie să fie incubat la 37 °C timp de 60 minute, cu seruri etalon pozitive și negative. Sensibilitatea testului este sporită dacă incubația este menținută la 4 °C timp de 16-24 ore.

2.4.7.   Interpretarea rezultatelor:

(a)	reacție negativă: lapte colorat, smântână incoloră;

(b)	reacție pozitivă: — lapte și smântână colorate identic; sau — lapte incolor și smântână colorată.

2.5.   Testul cu antigen brucelic tamponat [testul cu roz Bengal (RBT)]

2.5.1.   Antigenul constă într-o suspensie bacteriană într-un diluant antigen brucelic tamponat cu un pH de 3,65 ± 0,05, colorat cu roz Bengal. Antigenul se livrează pregătit de utilizare și trebuie să fie stocat la 4 °C. Nu se congelează.

2.5.2.   Antigenul se prepară fără a se face referire la concentrația celulară, dar sensibilitatea sa trebuie să fie standardizată în raport cu serul OIEISS, astfel încât antigenul să producă o reacție pozitivă cu o diluție a serului de 1/45 și o reacție negativă cu diluție de 1/55.

2.5.3.   Testul RBT se va desfășura astfel:

(a)	serul (20-30 μl) este amestecat cu un volum egal de antigen pe o placă albă sau placă emailată pentru a produce o zonă de aproximativ 2 cm în diametru. Amestecul este agitat ușor timp de patru minute la temperatură ambientală, apoi se iluminează corespunzător pentru a observa aglutinarea;

(b)	o metodă automată este permisă, dar trebuie să beneficieze de același grad de sensibilitate și acuratețe ca metoda manuală.

2.5.4.   Interpretarea rezultatelor

Orice reacție vizibilă va fi considerată a fi pozitivă, cu excepția situației în care există uscare excesivă în jurul marginilor.

În fiecare serie de teste vor fi incluse seruri etalon pozitive și negative.

2.6.   Testul de seroaglutinare (SAT)

2.6.1.   Antigenul reprezintă o suspensie bacteriană în soluție de fenol-salin [NaCl 0,85 % (m/v) și fenol la 0,5 % (v/v)].

Nu se folosește formaldehidă.

Antigenii pot fi furnizați în stare concentrată cu condiția ca factorul de diluție utilizat să fie indicat pe eticheta flaconului.

La suspensia de antigen se poate adăuga EDTA până la obținerea unei diluări finale de 5 mM pentru a reduce rezultatele pozitive false ale testului de seroaglutinare. Ulterior, pH-ul trebuie să fie reajustat la 7,2 în suspensia de antigen.

2.6.2.   Serul OIEISS conține 1 000 unități internaționale de aglutinare.

2.6.3.   Antigenul se prepară fără a se face referire la concentrația celulară, dar sensibilitatea sa trebuie să fie standardizată în raport cu serul OIEISS, astfel încât antigenul să producă o aglutinare a serului de 50 % cu o diluție finală a serului între 1/600-1/1 000 sau o aglutinare de 75 % cu o diluție finală a serului între 1/500-1/750.

Se recomandă compararea reactivității noilor loturi de antigen și a loturilor standardizate anterior cu ajutorul unui grup de seruri definite.

2.6.4.   Testul se va efectua în tuburi sau pe microplăci. Amestecul de antigen și diluții de ser va fi incubat la 37 °C timp de 16-24 ore.

Se vor pregăti cel puțin trei diluții pentru fiecare ser. Diluțiile de ser suspect trebuie să fie făcute astfel încât citirea reacției la limita de pozitivitate se va face în tubul median (sau în cavitățile intermediare în cazul metodei microplăcilor).

2.6.5.   Interpretarea rezultatelor:

Gradul de aglutinare a Brucella într-un ser se va exprima în UI per ml.

Un ser care conține 30 sau mai multe UI per ml este considerat a fi pozitiv.

2.7.   Testul de evaluare a fluorescenței în lumină polarizată (FPA)

2.7.1.   Testul FPA poate fi efectuat în tuburi de sticlă sau pe o placă cu 96 de cavități. Tehnica utilizată, standardizarea acesteia și interpretarea rezultatelor trebuie să fie conforme celor specificate în capitolul 2.4.3 (bruceloză bovină) din Manualul de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre, ediția a șasea, 2008, al OIE.

2.7.2.   Standardizarea testului

Testul FPA se va standardiza astfel încât:

(a)	serurile OIEELISASPSS și OIEELISAWPSS produc constant rezultate pozitive;

(b)	o prediluție de 1/8 a serului OIEELISAWPSS sau o prediluție de 1/64 a serului OIEELISASPSS, realizate într-un ser negativ (sau într-un amestec de seruri negative) trebuie să producă întotdeauna o reacție negativă;

(c)	serul OIEELISANSS produce întotdeauna o reacție negativă.

În fiecare lot de teste se vor include: un ser etalon puternic pozitiv, slab pozitiv, negativ (calibrat în funcție de serurile etalon ELISA ale OIE).

3.   TESTE COMPLEMENTARE

3.1.   Testul cutanat al brucelozei (BST)

3.1.1.   Condițiile de utilizare ale BST

(a)	Testul cutanat al brucelozei nu va fi utilizat pentru certificarea în vederea comerțului intracomunitar.

(b)	Testul cutanat al brucelozei este unul dintre cele mai specifice teste pentru detectarea brucelozei la animale nevaccinate; cu toate acestea, diagnosticul nu trebuie să se stabilească exclusiv pe baza reacțiilor intradermale pozitive.

(c)	Bovinele care au avut un rezultat negativ la unul dintre testele serologice definite în prezenta anexă, dar au avut o reacție pozitivă la BST, vor fi considerate a fi infectate sau suspecte de infecție.

(d)

Bovinele care au avut un rezultat pozitiv la unul dintre testele serologice definite în prezenta anexă pot fi supuse unui test BST pentru confirmarea interpretării rezultatelor testelor serologice; în special în cazurile în care nu poate fi exclusă o reacție încrucișată cu anticorpi împotriva altor bacterii din șeptelurile de bovine indemne sau oficial indemne de bruceloză.

3.1.2.   Testul trebuie să fie efectuat utilizând un preparat alergenic standardizat și definit care nu conține antigen lipopolizaharidic (LPS) neted, deoarece acesta poate provoca reacții inflamatorii nespecifice sau interfera cu testele serologice ulterioare.

Cerințele privind prepararea de brucelină vor fi conforme cu secțiunea C1 a capitolului 2.4.3 din Manualul de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre, ediția a șasea, 2008, al OIE.

3.1.3.   Procedură de testare

3.1.3.1.   Se va injecta intradermic un volum de 0,1 ml de alergen de bruceloză în pliul caudal, pielea crupei sau în partea laterală a gâtului.

3.1.3.2.   Testul va fi citit după 48-72 ore.

3.1.3.3.   Grosimea pielii la locul injecției se va măsura cu un cutimetru, înaintea injectării și în momentul reexaminării.

3.1.3.4.   Interpretarea rezultatelor:

Reacțiile puternice sunt ușor de recunoscut ca urmare a inflamării și întăririi pielii la nivel local.

Îngroșarea pielii cu 1,5-2 mm va fi considerată ca indicând o reacție pozitivă la BST.

3.2.   Testele de imunoabsorbție enzimatică de competiție (cELISA)

3.2.1.   Condițiile de utilizare a testului cELISA

Testul cELISA nu va fi utilizat pentru certificarea în vederea comerțului intracomunitar.

Bovinele care au avut un rezultat pozitiv la unul dintre testele serologice definite în prezenta anexă pot fi supuse unui test cELISA pentru confirmarea interpretării celorlalte rezultate ale testelor serologice, în special în cazurile în care nu poate fi exclusă , la șeptelurile de bovine indemne sau oficial indemne de bruceloză, o reacție încrucișată cu anticorpi împotriva altor bacterii sau pentru eliminarea reacțiilor cauzate de anticorpi reziduali produși ca urmare a vaccinării cu S19.

3.2.2.   Procedura de testare

Testul se va desfășura în conformitate cu prescrierea descrisă în secțiunea B punctul 2 din capitolul 2.4.3 al Manualului de teste de diagnostic și vaccinuri pentru animale terestre, ediția a șasea, 2008 al OIE.”