ANEXĂ

PLANURI DE PRELEVARE DE PROBE ȘI METODE DE DIAGNOSTIC PENTRU DEPISTAREA ȘI CONFIRMAREA PREZENȚEI SEPTICEMIEI HEMORAGICE VIRALE (SHV) ȘI A NECROZEI HEMATOPOIETICE INFECȚIOASE (NHI)

INTRODUCERE

Prezenta anexă:

(a)	prevede orientări și cerințe minime aplicabile planurilor de prelevare de probe și metodelor de diagnostic pentru depistarea și confirmarea prezenței septicemiei hemoragice virale (SHV) și a necrozei hematopoietice infecțioase (NHI);

(b)	integrează dispozițiile anexelor B și C la Directiva 91/67/CEE privind aprobarea și menținerea aprobării zonelor și exploatațiilor în zonele neaprobate;

(c)	stabilește dispozițiile referitoare la diagnosticul corect al SHV și NHI și la recunoașterea oficială a statutului de zonă aprobată și de exploatații aprobate în zone neaprobate, în conformitate cu articolele 5 și 6 din Directiva 91/67/CEE;

(d)

este destinată atât autorităților responsabile de controlul SHV și NHI, cât și personalului laboratoarelor care efectuează testele corespunzătoare pentru aceste boli. În consecință, se pune accent pe procedurile de prelevare de probe, principiile și aplicările testelor de laborator și evaluarea rezultatelor acestora, ca și pe tehnicile de laborator detaliate. Cu toate acestea, la nevoie, laboratoarele pot aduce modificări testelor descrise în prezenta anexă sau pot utiliza teste diferite, cu condiția să poată fi dovedite o sensibilitate și o specificitate echivalente.

Partea I stabilește planurile de prelevare de probe și metodele de diagnostic pentru supravegherea SHV și NHI în vederea obținerii și menținerii statutului de zonă aprobată sau de exploatație aprobată într-o zonă neaprobată.

Partea II descrie procedurile de diagnostic pentru confirmarea SHV și NHI în caz de suspiciune.

Partea III stabilește criteriile și orietările aplicabile unui program de inspecții sanitare oficiale pentru a se dovedi absența anterioară a SHV și/sau NHI.

Partea IV furnizează recomandările cu privire la procedura aplicabilă titrării virusurilor SHV și NHI pentru a se verifica sensibilitatea culturilor celulare la infecție.

Acronimele și abrevierile sunt enumerate în partea V.

PARTEA I

Planuri de prelevare de probe și metode de diagnostic pentru supravegherea SHV și NHI în vederea obținerii și menținerii aprobării unei zone sau a unei exploatații într-o zonă neaprobată

I.   Inspecții și prelevare de probe

1.   Dispozițiile generale referitoare la inspecțiile sanitare clinice, la colectarea și selectarea probelor pentru supravegherea zonelor sau exploatațiilor situate în zone neaprobate în scopul obținerii sau menținerii aprobării în ceea ce privește SHV și/sau NHI

Inspecțiile sanitare clinice și prelevarea de probe din țesuturile de pește și/sau lichid ovarian care trebuie efectuate în zonele sau exploatațiile situate în zonele neaprobate în scopul obținerii sau menținerii aprobării în ceea ce privește SHV și/sau NHI, în conformitate cu anexele B și C la Directiva 91/67/CEE, sunt rezumate în tabelele 1A, 1B și 1C. Alte modalități sunt fixate în partea I.I.2-I.I.4. Tabelele 1A și 1B nu se aplică noilor exploatații și nici exploatațiilor care își reîncep activitățile cu pești, icre sau gameți provenind dintr-o zonă aprobată sau dintr-o exploatație aprobată dintr-o zonă neaprobată, cu condiția ca acestea să îndeplinească cerințele stabilite de Directiva 91/67/CEE, anexa C, partea I.A.6(a) sau I.A.6(b) sau II.A.3(a) sau II.A.3(b).

Inspecțiile clinice trebuie să fie efectuate în perioada octombrie-iunie sau în orice moment în care temperatura apei este mai mică de 14 °C. Atunci când exploatațiile trebuie să facă obiectul unei inspecții clinice cel puțin de două ori pe an, intervalul dintre inspecții trebuie să fie de cel puțin patru luni. Toate unitățile de producție (bazine, cuve, viviere etc.) trebuie să fie supuse unei inspecții pentru stabilirea prezenței peștilor morți, agonici sau cu comportament anormal. Trebuie să se acorde o atenție deosebită punctelor de evacuare a apei, în care peștii agonici au tendința de a se acumula datorită curentului.

Peștii de la care se prelevează probe sunt selecționați după cum urmează:

—

În cazul în care sunt prezenți păstrăvi curcubeu, numai peștii din această specie sunt selecționați pentru prelevare de probe. În cazul în care nu sunt prezenți păstrăvi curcubeu, proba trebuie să se compună din pești din toate celelalte specii prezente, în măsura în care aceste specii sunt sensibile la virusul SHV și/sau NHI (definite în anexa A la Directiva 91/67/CEE a Consiliului). Speciile trebuie să fie reprezentate proporțional în probă.

—	În cazul în care se utilizează mai mult de o sursă de apă pentru producția de pește, peștii care reprezintă toate sursele de apă trebuie să fie incluși în probă.

—

În cazul în care sunt prezenți pești agonici, cu comportament anormal sau care au murit recent (încă nedescompuși), aceștia trebuie să fie selecționați în primul rând. În cazul în care acești pești nu sunt prezenți, proba trebuie să fie compusă din pești cu aspect normal, sănătoși, colectați în așa fel încât toate părțile exploatației și toate clasele de vârstă grupate pe ani să fie reprezentate proporțional în probă.

2.   Dispoziții specifice, inclusiv în materie de prelevare de probe, referitoare la supravegherea zonelor sau exploatațiilor din zone neaprobate în scopul obținerii sau menținerii aprobării în ceea ce privește SHV și/sau NHI.

1.   O zonă sau o exploatație într-o zonă neaprobată, plasată sub controlul serviciilor oficiale, poate obține aprobarea în ceea ce privește SHV și/sau NHI, cu condiția să se supună unuia dintre cele două programe care urmează:

(a)

Modelul A – Program de supraveghere de doi ani După cel puțin doi ani de absență a oricărui semn clinic sau de altă natură a SHV și/sau NHI, totalitatea exploatațiilor din zonă sau orice exploatație dintr-o zonă neaprobată, care urmează a fi aprobată, trebuie să facă obiectul unei inspecții sanitare de două ori pe an timp de doi ani. În cursul acestei perioade de control de doi ani care precede obținerea aprobării, trebuie să fie urmărită absența semnelor clinice sau de altă natură ale SHV și/sau NHI și trebuie prelevate probe în vederea examinării, în conformitate cu tabelul 1A. De asemenea, probele trebuie să fie selecționate, pregătite și examinate în conformitate cu dispozițiile părților I.I-I.IV și examenele de laborator trebuie să furnizeze rezultate negative cu privire la SHV și/sau NHI sau

(b)

Modelul B – Program de supraveghere de doi ani cu număr redus de probe În urma unui program de inspecții sanitare oficiale care dovedesc absența SHV și/sau NHI cel puțin în decursul ultimilor patru ani, totalitatea exploatațiilor din zonă sau orice exploatație dintr-o zonă neaprobată, care urmează a fi aprobate, trebuie să facă obiectul unei inspecții sanitare de două ori pe an timp de doi ani. În cursul acestei perioade de control de doi ani care precedă obținerea aprobării, trebuie să fie urmărită absența semnelor clinice sau de altă natură ale SHV și/sau NHI și trebuie prelevate probe în vederea examinării, în conformitate cu tabelul 1B. De asemenea, probele trebuie să fie selecționate, pregătite și examinate în conformitate cu dispozițiile părților I.I-I.IV și examenele de laborator trebuie să furnizeze rezultate negative cu privire la SHV și/sau NHI. Pentru ca un program de inspecții sanitare să poată fi recunoscut de către serviciile oficiale ca dovedind absența anterioară a SHV și/sau NHI, acesta trebuie să îndeplinească criteriile și să respecte orietările directoare stabilite în partea III.

2.   Dispoziții speciale care se aplică aprobării unor noi exploatații sau unor exploatații care își reîncep activitatea cu pești, icre sau gameți provenind dintr-o zonă aprobată sau dintr-o exploatație aprobată într-o zonă neaprobată.

Noile exploatații și exploatațiile care își reîncep activitatea cu pești, icre sau gameți provenind dintr-o zonă aprobată sau dintr-o exploatație aprobată într-o zonă neaprobată pot obține aprobarea, în conformitate cu cerințele stabilite de Directiva 91/67/CEE, anexa C, partea I.A.6(a)/(b) sau II.A.3(a) sau II.A.3(a)/(b). În consecință, dispozițiile de prelevare de probe stabilite în modelele A și B de mai sus [părțile I.I.2.1(a) și I.I.2.1(b)] nu se aplică acestor exploatații.

3.   Programe de supraveghere pentru menținerea aprobării în ceea ce privește SHV și/sau NHI

În vederea menținerii aprobării pentru o zonă sau o exploatație într-o zonă neaprobată în ceea ce privește SHV și/sau NHI, trebuie să se efectueze inspecții și prelevări de probe în vederea examinării în conformitate cu tabelul 1C. Probele trebuie să fie selecționate, preparate și examinate în conformitate cu dispozițiile părților I.I-I.IV și rezultatele examenelor de laborator trebuie să fie negative cu privire la SHV și/sau NHI.

3.   Pregătirea și expedierea probelor de pește

Înainte de a fi trimise sau transferate către laborator, fragmentele de organe ce urmează a fi examinate trebuie să fie prelevate cu ajutorul unor instrumente de disecție plasate în tuburi de plastic sterile care conțin mediul de transport, adică mediu de cultură celulară care conține 10 % ser fetal bovin și antibiotice. Combinația de 200 UI de penicilină, 200 μg de streptomicină și 200 μg de kanamicină pe mililitru (ml) este recomandabilă, dar se pot folosi și alte antibiotice a căror eficacitate este dovedită. Țesuturile care trebuie examinate sunt splina, rinichiul anterior și, de asemenea, fie inima, fie encefalul. În anumite cazuri, trebuie examinat lichidul ovarian (tabelele 1A-1C).

Lichid ovarian sau fragmente de organe din cel mult zece pești (tabelele 1A-1C) pot fi reunite într-un tub steril care conține cel puțin 4 ml de mediu de transport, ceea ce reprezintă o probă globală. Țesuturile pentru fiecare probă trebuie să cântărească cel puțin 0,5 grame.

Tuburile sunt introduse în recipiente izolate (de exemplu, cutii de polistiren cu pereți groși) cu o cantitate suficientă de gheață sau „blocuri refrigeratoare” pentru a garanta refrigerarea probelor pe durata transportului către laborator. Se va evita congelarea probelor. Temperatura unei probe pe durata transportului nu trebuie să depășească niciodată 10 °C și recipientul de transport trebuie să mai conțină încă gheață în momentul primirii sau unul sau mai multe blocuri refrigeratoare trebuie să mai fie încă parțial sau total congelate.

Examenul virusologic trebuie să înceapă cât mai curând posibil și cel târziu la 48 de ore după colectarea probelor. În cazuri excepționale (1), examenul virusologic poate începe cel târziu la 72 de ore după colectarea materialului de examinat, cu condiția ca acesta să fie protejat de mediul de transport și să fi fost respectate condițiile de temperatură în timpul transportului (partea I.I.3 punctul 3).

Se pot trimite la laborator pești întregi în cazul în care se pot respecta condițiile de temperatură pe durata transportului. Peștele întreg poate fi ambalat în hârtie absorbantă și, în final, trebuie să fie expediat într-un sac de plastic, refrigerat după indicațiile de mai sus. Se pot trimite, de asemenea, și pești vii.

Ambalarea și etichetarea trebuie să respecte reglementările naționale și internaționale în vigoare în ceea ce privește transportul, după caz.

4.   Colectarea de material diagnostic suplimentar

De comun acord cu laboratorul de diagnostic respectiv, se pot colecta și pregăti și alte țesuturi de pești în vederea examinării suplimentare.

II.   Pregătirea probelor în vederea examenului virusologic

1.   Congelarea în cazuri excepționale

În cazul în care se întâlnesc dificultăți de ordin practic (de exemplu, condiții climatice nefavorabile, zile nelucrătoare, probleme de laborator etc.) care împiedică inocularea celulelor în intervalul de 48 de ore de la colectarea probelor de țesuturi, se admite congelarea acestor probe de țesuturi într-un mediu de cultură celulară la – 20 °C sau la o temperatură inferioară și efectuarea unui examen virusologic în decurs de paisprezece zile. Cu toate acestea, țesuturile nu pot fi congelate și decongelate decât o singură dată înaintea examinării acestora. Se impune ținerea unei evidențe care să indice motivul fiecărei congelări a unor probe de țesuturi (de exemplu furtună, linii celulare moarte etc.).

2.   Omogenizarea organelor

La laborator, țesuturile conținute în tuburi trebuie să fie complet omogenizate (cu ajutorul unui stomaker, mixer sau cu mojar și nisip steril) și plasate apoi în suspensie în mediul de transport de origine.

În cazul în care o probă este constituită din pești întregi sub 4 cm lungime, aceștia ar trebui fragmentați cu ajutorul unui foarfece steril sau al unui scalpel după eliminarea părții corpului care se găsește în spatele orificiului ventral. În cazul în care o probă este constituită din pești întregi de 4 până la 6 cm lungime, se vor colecta și viscerele, inclusiv rinichii. În cazul în care o probă este constituită din pești întregi de mai mult de 6 cm lungime, probele de țesut ar trebui colectate în conformitate cu descrierea din partea I.I.3. Probele de țesut se fragmentează cu ajutorul unui foarfece steril sau al unui scalpel, se omogenizează în conformitate cu descrierea de mai sus și se plasează în suspensie în mediul de transport.

Raportul final între țesuturi și mediul de transport trebuie să fie ajustat în laborator la 1:10.

3.   Centrifugarea omogenatului

Omogenatul este centrifugat într-o centrifugă cu răcire, la o temperatură cuprinsă între 2 și 5 °C, la 2 000-4 000 × g timp de 15 minute iar lichidul supernatant este colectat și tratat, fie timp de 4 ore la 15 °C, fie timp de o noapte la 4 °C cu antibiotice (de exemplu se poate folosi în această etapă 1 mg/ml de gentamicină).

În cazul în care proba a fost expediată într-un mediu de transport (adică sub antibiotice), tratamentul cu antibiotice al lichidului supernatant nu este necesar.

Tratamentul cu antibiotice are drept scop limitarea contaminării bacteriene a probelor și face inutilă orice filtrare prin filtrele cu membrane.

În cazul în care lichidul supernatant colectat este conservat la – 80 °C în intervalul de 48 de ore de la prelevarea de probe, el poate fi reutilizat o singură dată pentru un examen virusologic.

În cazul în care se întâlnesc dificultăți (cum ar fi un incubator defect, probleme cu mediile de cultură celulare etc.) care împiedică inocularea celulelor în cele 48 de ore de la colectarea probelor de țesuturi, se poate congela lichidul supernatant la – 80 °C și se poate efectua un examen virusologic în decurs de paisprezece zile.

Înainte de a inocula celulele, se amestecă lichidul supernatant în proporție egală cu un pool de antiser împotriva serotipurilor indigene ale virusului NPI, diluate corespunzător și se incubează astfel timp de cel puțin o oră la 15 °C sau timp de cel mult 18 ore la 4 °C. Titrul antiserului trebuie să fie de cel puțin 1/2 000 într-un test de neutralizare a plajelor cu 50 %.

Tratamentul tuturor celulelor inoculate cu un ser antivirus NPI (virus care, în anumite regiuni ale Europei, este prezent în 50 % din probele de pește) are ca scop împiedicarea apariției în culturile celulare inoculate a unui ECP rezultând din virusul NPI. Acest tratament permite reducerea duratei examenelor virusologice, precum și a numărului de cazuri în care apariția unui ECP ar trebui considerată ca un indicator potențial de SHV sau NHI.

Atunci când probele provin din unități de producție considerate ca fiind indemne de NPI, tratamentul celulelor inoculate cu ser antivirus NPI poate fi omis.

III.   Examen virusologic

1.   Culturi celulare și medii de cultură

Celule BF-2 sau RTG-2 și EPC sau FHM sunt cultivate la temperaturi de la 20 la 30 °C într-un mediu adecvat, de pildă un mediu Eagle's MEM (sau versiuni modificate), adiționat cu 10 % ser fetal bovin și antibiotice în concentrații standard.

Atunci când celulele sunt cultivate în flacoane închise, se recomandă să se tamponeze mediul cu bicarbonat. Mediul folosit pentru cultura celulară în unități deschise poate fi tamponat cu Tris-HCl (23 mM) și cu bicarbonat de sodiu (6 mM). PH-ul trebuie să fie de 7,6 ± 0,2.

Culturile celulare care se folosesc pentru inoculare cu material tisular trebuie să fie de preferință tinere (de 4 până la 48 de ore) și aflate în faza de creștere activă (neconfluente) în momentul inoculării.

2.   Inocularea culturilor celulare

Se inoculează o suspensie de organe tratată cu antibiotice în culturile celulare în două diluții: diluția inițială și o diluție de 1:10 din aceasta, rezultând diluții finale ale materialului tisular într-un mediu de culturi celulare de 1:100 și 1:1 000 (pentru a se evita interferențele omologilor). Trebuie inoculate cel puțin două linii celulare (a se vedea partea I.III.1). Raportul dintre volumul inoculului și volumul mediului de cultură celulară ar trebui să fie de aproximativ 1:10.

Pentru fiecare diluție și fiecare linie celulară, ar trebui să se utilizeze cel puțin 2 cm2 de celule, ceea ce corespunde unui godeu într-o placă de cultură celulară cu 24 de godeuri. Se recomandă utilizarea plăcilor de cultură celulară dar sunt acceptate, de asemenea, și alte suporturi care prezintă o suprafață de creștere similară sau superioară.

3.   Incubarea culturilor celulare

Se incubează culturile celulare inoculate la 15 °C timp de șapte până la zece zile. În cazul în care culoarea mediului de cultură celulară se modifică de la roșu la galben, indicând o acidifiere a mediului, se ajustează pH-ul cu ajutorul unei soluții sterile de bicarbonat sau cu ajutorul unor substanțe echivalente pentru a garanta sensibilitatea celulei la infecția virală.

La fiecare șase luni cel puțin sau în cazul în care se suspectează o scădere a sensibilității celulare, se efectuează titrarea stocurilor de virusuri SHV și NHI congelate, pentru a se verifica sensibilitatea culturilor celulare la infecție. În partea IV este indicată o procedură recomandată.

4.   Microscopia

Culturile celulare inoculate trebuie să fie verificate cu regularitate (cel puțin de trei ori pe săptămână), pentru a se observa apariția unui ECP, cu o mărire de 40 până la 150 de ori. În cazul în care este clară producerea unui ECP, se încep imediat procedurile de identificare a virusului în conformitate cu partea I.IV.

5.   Subcultivarea

În cazul în care nu se produce nici un ECP după o primă incubație de șapte până la zece zile, se procedează la o subcultivare cu culturile celulare proaspete folosindu-se o suprafață celulară similară cu cea din cultura primară.

Părți alicote din mediu (lichid supernatant) provenind de la toate culturile/godeurile care constituie cultura primară se reunesc într-un pool pentru fiecare linie celulară la șapte sau zece zile de la inoculare. Pool-urile respective sunt apoi inoculate în culturile celulare omoloage, nediluate și diluate la 1:10 (rezultând în final diluții ale lichidului supernatant de respectiv 1:10 și 1:100), în conformitate cu descrierea din partea I.III.2. Se pot inocula, de asemenea, părți alicote de 10 % din mediul care constituie cultura primară direct într-un godeu cu culturi celulare proaspete (subcultivare godeu la godeu). Inocularea poate fi precedată de o preincubare a diluțiilor cu antiser împotriva virusului NPI la o diluție corespunzătoare, în conformitate cu descrierea din partea I.II.3.

Se incubează apoi culturile inoculate timp de șapte până la zece zile la 15 °C, ținându-se cont de dispozițiile din partea I.III.4.

În cazul în care se produce un ECP toxic în cursul primelor trei zile după incubație, se poate realiza o subcultivare în acest stadiu, dar în acest caz celulele trebuie să fie incubate timp de șapte zile și supuse unei noi subcultivări urmate de alte șapte zile de incubare. În cazul în care se produce un ECP toxic după trei zile, celulele pot fi pasate o dată și incubate pentru a se ajunge la numărul total de paisprezece zile de la inocularea inițială. Nu trebuie să existe semne de toxicitate în cursul ultimelor șapte zile de incubare.

În cazul în care se produce o contaminare bacteriană în ciuda tratamentului cu antibiotice, subcultivarea trebuie să fie precedată de o centrifugare la 2 000-4 000 × g timp de 15 până la 30 de minute, la o temperatură de 2 până la 5 °C, și/sau de o filtrare a lichidului supernatant printr-un filtru de 0,45 μm (membrană cu procent scăzut de absorbție a proteinelor). În afara acestei subcultivări, procedurile sunt aceleași cu cele aplicate în cazul ECP toxice.

IV.   Identificarea virusului

1.   Teste de identificare a virusului

În cazul în care s-a produs un ECP într-o cultură celulară, mediul (lichidul supernatant) este colectat și examinat prin una sau mai multe din tehnicile următoare: neutralizare, IF, ELISA. În cazul în care testele nu au permis identificarea definitivă a virusului într-o săptămână, lichidul supernatant trebuie trimis la un laborator de referință național sau la laboratorul comunitar de referință pentru bolile peștilor, pentru a fi identificat imediat.

2.   Neutralizarea

Se elimină celulele din lichidul supernatant colectat prin centrifugare (2 000-4 000 × g) sau prin filtrare cu un filtru cu membrană (0,45 μm) cu o membrană cu procent scăzut de absorbție a proteinelor, apoi se diluează lichidul supernatant la 1:100 și 1:10 000 într-un mediu de cultură celulară.

Se amestecă părți alicote din cele două diluții ale lichidului supernatant și se incubează separat timp de 60 de minute la 15 °C în părți egale cu următorii reactivi:

—	ser conținând un grup de anticorpi specifici împotriva virusului SHV la o diluție de 1:50 (vol:vol) (2)

—	ser conținând un grup de anticorpi specifici împotriva virusului NHI la o diluție de 1:50 (vol:vol) (2)

—	grup de antiser împotriva serotipurilor indigene ale virusului NPI la o diluție de 1:50 (vol:vol) (2)

—	doar mediu de cultură (control pozitiv)

Pentru fiecare amestec de supernatant, virus și ser, se inoculează cel puțin două culturi celulare cu 50 de μl de amestec de lichid supernatant și de ser și se incubează la 15 °C. Se urmărește apariția unui ECP în conformitate cu partea I.III.4.

Anumite sușe ale virusului SHV nu reacționează la testele de neutralizare. Aceste izolate trebuie identificate prin tehnicile IF sau ELISA.

Se pot aplica și alte teste de neutralizare, în cazul în care eficacitatea acestora este dovedită.

3.   IF

Pentru fiecare izolat viral care trebuie identificat, se însămânțează cel puțin opt lamele sau echivalentul, cu celule a căror densitate să asigure o confluență de aproximativ 60 până la 90 % după 24 de ore de cultură. Celulele EPC sunt recomandate în acest scop datorită aderenței lor ridicate la suprafețele de sticlă, dar se pot folosi și alte linii celulare, ca BF-2, RTG-2 sau FHM.

Atunci când celulele s-au depus pe suprafața de sticlă (aproximativ la o oră după însămânțare) sau atunci când aceste culturi au fost incubate timp de maximum 24 de ore, se inoculează virusul care trebuie identificat. Se inoculează patru culturi la un raport volum la volum de 1:10 și patru culturi la un raport de 1:1 000. Acestea se incubează apoi la 15 °C timp de 20-30 de ore.

După incubare, se clătesc de două ori culturile în mediu Eagle's MEM fără ser, se fixează cu o soluție de 80 % acetonă înghețată și se efectuează reacția IF. Primul strat de reactiv se compune din anticorpi poli- sau monoclonali de referință de calitate. Al doilea strat de reactiv este reprezentat de un antiser conjugat cu fluorocrom preparat împotriva imunoglobulinelor din primul strat. Pentru fiecare dintre antiserurile testate, se folosesc cel puțin o cultură inoculată cu doză crescută și o cultură inoculată cu doză scăzută. Se includ în test martori negativi și pozitivi corespunzători. Se recomandă folosirea unor fluorocromi precum FITC sau TRITC.

Se montează lamele de cultură folosindu-se o soluție de glicerol salin. Se examinează la ultraviolete incidente. Se folosesc oculare de 10 × sau 12 × și obiective de × 25 sau × 40, ale căror aperturi sunt de > 0,7 și respectiv > 1,3.

Tehnica IF descrisă mai sus este indicată cu valoare de exemplu. Se pot aplica și alte tehnici IF (cu privire la culturile celulare, la fixare și la anticorpii de referință de calitate), în cazul în care este dovedită eficacitatea acestora.

4.   ELISA

Se acoperă godeurile din plăcile de microtitrare timp de o noapte cu diluțiile recomandate din fracțiuni de imunoglobuline purificate provenind din seruri de referință de calitate.

Se clătesc godeurile cu un tampon PBS-Tween-20, se adaugă virusul ce urmează să fie identificat, diluat din doi în doi sau din patru în patru, și se lasă să reacționeze cu anticorpii care căptușesc placa timp de 60 de minute la 37 °C. După clătirea cu tamponul PBS-Tween-20, se adaugă anticorpii biotinilați, a căror specificitate corespunde cu cea a anticorpilor care căptușesc placa, și se lasă să reacționeze timp de 60 de minute la 20 °C. După o ultimă clătire, se efectuează vizualizarea enzimei fixate cu ajutorul substraturilor ELISA corespunzătoare (OPD sau altele).

Tehnica ELISA descrisă mai sus, bazată pe biotină-avidină, este indicată cu valoare de exemplu. Ea poate fi înlocuită cu alte variante ale tehnicii ELISA a căror eficacitate a fost dovedită.

TABEL 1A

Plan de inspecție și de prelevare de probe pentru zonele și exploatațiile din zone neaprobate pentru perioada de control de doi ani care precede obținerea aprobării în ceea ce privește SHV și/sau NHI

(în conformitate cu Directiva 91/67/CEE, anexele B și C și cu dispozițiile stabilite în partea I din prezenta anexă)

	Numărul anual de inspecții clinice (doi ani)	Numărul anual de examene de laborator (doi ani)	Examen de laborator pentru detectarea prezenței virusului (3)
			Numărul de pești în creștere (organe)	Numărul de reproducători (lichid ovarian)
Zone și exploatații continentale
(a) Exploatații cu reproducători	2	2	120 (prima inspecție) (4) 150 (a doua inspecție)	30 (prima inspecție) (5) 0 (a doua inspecție)
(b) Exploatații doar cu reproducători	2	1	0	150 (prima sau a doua inspecție) (5)
(c) Exploatații fără reproducători	2	2	150 (prima și a doua inspecție)	0
Zone și exploatații de coastă
(a) Exploatații cu reproducători	2	2	120 (prima inspecție) 150 (a doua inspecție)	30 (prima inspecție) (5) 0 (a doua inspecție)
(b) Exploatații de salmonide fără reproducători	2	2	30 (prima și a doua inspecție) (6)	0
(c) Exploatații altele decât cele de salmonide fără reproducători	2	2	150 (prima și a doua inspecție)	0
Numărul total de pești/pool: 10.

TABEL 1B

Plan de inspecție și de prelevare de probe pentru perioada de control de doi ani care precedă obținerea aprobării în ceea ce privește SHV și/sau NHI în zonele și exploatațiile din zone neaprobate pentru care s-a dovedit oficial absența anterioară a acestor boli

(în conformitate cu Directiva 91/67/CEE, anexele B și C și cu dispozițiile stabilite în partea I și III din prezenta anexă)

	Numărul anual de inspecții clinice (doi ani)	Numărul anual de examene de laborator (doi ani)	Examen de laborator pentru detectarea prezenței virusului
			Numărul de pești în creștere (organe)	Numărul de reproducători (lichid ovarian)
Zone și exploatații continentale
(a) Exploatații cu reproducători	2	2	0 (prima inspecție) (7) 30 (a doua inspecție)	30 (prima inspecție) (8) 0 (a doua inspecție)
(b) Exploatații doar cu reproducători	2	1	0	30 (prima sau a doua inspecție) (8)
(c) Exploatații fără reproducători	2	2	30 (prima și a doua inspecție)	0
Zone și exploatații de coastă
(a) Exploatații cu reproducători	2	2	0 (prima inspecție) 30 (a doua inspecție)	30 (prima inspecție) (8) 0 (a doua inspecție)
(b) Exploatații de salmonide fără reproducători	2	2	30 (prima sau a doua inspecție) (9)	0
(c) Exploatații altele decât cele de salmonide fără reproducători	2	2	30 (prima și a doua inspecție)	0
Numărul total de pești/pool: 10.

TABEL 1C

Plan de inspecție și de prelevare de probe pentru zonele și exploatațiile din zone neaprobate pentru menținerea aprobării în ceea ce privește SHV și/sau NHI

(în conformitate cu Directiva 91/67/CEE, anexele B și C și cu dispozițiile stabilite în partea I din prezenta anexă)

	Numărul anual de inspecții clinice	Numărul de pești într-un grup de probe pentru examenul de laborator (10)
		Numărul de pești în creștere (organe)	Numărul de reproducători (lichid ovarian)
Zone și exploatații continentale
(a) Exploatații cu reproducători	2	20 (prima sau a doua inspecție)	10 (prima sau a doua inspecție) (11)
(b) Exploatații doar cu reproducători	2	0	30 (prima sau a doua inspecție) (11)
(c) Exploatații fără reproducători	1	30	0
Zone și exploatații de coastă
(a) Exploatații cu reproducători	2	20 (prima sau a doua inspecție)	10 (prima sau a doua inspecție) (11)
(b) Exploatații fără reproducători	1	30 (12)	0
Numărul maxim de pești/pool: 10.

PARTEA II

Proceduri de diagnostic care permit confirmarea SHV și NHI în caz de suspiciune

Se aplică una sau mai multe din următoarele tehnici pentru diagnosticul SHV și al NHI:

—	A. Izolarea convențională a virusului urmată de o identificare serologică a virusului;

—	B. Izolarea virusului cu identificarea serologică simultană a virusului;

—	C. Alte tehnici de diagnostic (IFAT, ELISA).

Confirmarea primului caz de SHV și/sau de NHI în exploatațiile din zone aprobate nu se poate baza exclusiv pe metoda C. Trebuie să se aplice, de asemenea, fie metoda A, fie metoda B.

Materialul tisular destinat examenului virusologic trebuie să fie însoțit în anumite cazuri de material suplimentar în vederea unui examen bacteriologic, parazitologic, histologic sau a altor examene, pentru a permite un diagnostic diferențial.

A.   Izolarea convențională a virusului urmată de o identificare serologică a virusului

I.1.   Selecția probelor

Ar trebui să fie selecționați pentru examinare cel puțin zece pești care prezintă semnele tipice de NHI sau de SHV.

I.2.   Pregătirea și expedierea probelor de pește

A se vedea partea I.I.3.

I.3.   Colectarea de material diagnostic suplimentar

A se vedea partea I.I.4.

II.   Pregătirea de probe pentru examenul virusologic

A se vedea partea I.II.

III.   Examenul virusologic

A se vedea partea I.III.

IV.   Identificarea virusului

A se vedea partea I.IV.

B.   Izolarea virusului cu identificarea serologică simultană a virusului

I.1.   Selecția probelor

A se vedea partea II.A.I.1.

I.2.   Pregătirea și expedierea probelor de pește

A se vedea partea I.I.3.

I.3.   Colectarea de material diagnostic suplimentar

A se vedea partea I.I.4.

II.1.   Omogenizarea organelor

A se vedea partea I.II.2.

II.2.   Centrifugarea omogenatului

Omogenatul este centrifugat într-o centrifugă cu răcire la o temperatură cuprinsă între 2 și 5 °C, la 2 000-4 000 × g timp de 15 minute, iar lichidul supernatant este colectat și tratat timp de patru ore la 15 °C cu antibiotice (de exemplu, cu 1 mg/ml de gentamicină) sau trecut printr-un filtru cu membrană (0,45 μg) (membrană cu procent scăzut de absorbție a proteinelor).

II.3.   Tratarea lichidului supernatant cu antiseruri de diagnostic

Suspensia de organe tratată cu antibiotice sau trecută printr-un filtru cu membrană este diluată la 1:10 și la 1:1 000 într-un mediu de cultură celulară iar părți alicote se amestecă și se incubează timp de 60 de minute la 15 °C cu părți egale din reactivii enumerați în partea I.IV.2.

III.1.   Culturi celulare și medii de cultură

A se vedea partea I.III.1.

III.2.   Inocularea culturilor celulare

Din fiecare amestec de virus și ser (preparat în conformitate cu partea II B II 3), se inoculează cel puțin două godeuri de culturi celulare pentru o linie celulară cu 50 de μl fiecare.

III.3.   Incubarea culturilor celulare

A se vedea partea I.III.3.

III.4.   Microscopia

Se inspectează în fiecare zi culturile celulare inoculate pentru a se descoperi apariția unui ECP la o mărire de 40-150 de ori. În cazul în care formarea unui ECP este inhibată de unul dintre antiserurile folosite, virusul poate fi considerat ca fiind identificat în consecință.

În cazul în care apariția unui ECP nu este inhibată de unul dintre antiseruri, ar trebui să se pună în aplicare procedurile de identificare a virusului în conformitate cu partea I.IV.

III.5.   Subcultivarea

În cazul în care nu se produce nici un ECP după șapte până la zece zile, trebuie pusă în aplicare o subcultivare plecând de la culturile inoculate cu lichidul supernatant și mediul (partea II.B.II.3) în conformitate cu partea I.III.5.

C.   Alte tehnici de diagnostic

Lichidul supernatant preparat după indicațiile din partea I.II.2 poate fi supus tehnicilor IFAT sau ELISA, respectiv în conformitate cu partea I.IV.3 sau cu partea I.IV.4. Aceste tehnici rapide trebuie să fie completate cu un examen virusologic, în conformitate cu A sau B, la mai puțin de 48 de ore de la prelevarea de probe, în cazul în care:

(a)	s-a obținut un rezultat negativ sau în cazul în care

(b)	s-a obținut un rezultat pozitiv cu probe care reprezintă primul caz de NHI sau SHV într-o zonă aprobată.

Materialul tisular poate fi supus și altor tehnici de diagnostic, cum ar fi tehnicile RT-PCR sau IF pe elemente congelate sau imunohistochimia pe material tisular fixat în formol. Aceste tehnici trebuie să fie mereu însoțite de o inoculare a materialului tisular nefixat pe culturi celulare.

PARTEA III

Dovada absenței anterioare a SHV și/sau NHI în zone sau exploatații din zone neaprobate

Orientări și criterii aplicabile unui program de inspecții sanitare oficiale

1.

Un program de inspecții sanitare poate fi pus în aplicare numai: — după executarea unui program de eradicare a SHV și/sau NHI, recunoscut oficial, care implică eliminarea tuturor peștilor din exploatație, curățenia, dezinfecția și secarea înainte de repopulare cu pești provenind din exploatații aprobate sau — în exploatațiile piscicole în care nu a apărut anterior nici o infecție cu virusul SHV sau NHI.

2.	Programul de inspecții sanitare oficiale trebuie să se bazeze pe inspecții clinice și examene de laborator.

3.	Programul trebuie să cuprindă două inspecții sanitare clinice anuale, în conformitate cu orientări indicate în partea I.

4.	Cel puțin cu ocazia uneia dintre inspecțiile anuale, sunt colectate 30 de probe de țesut de pește și/sau de lichid ovarian din fiecare exploatație. Probele sunt selecționate, pregătite și supuse unui examen de laborator, în conformitate cu părțile I, II și IV.

5.	Programul de inspecții sanitare se aplică timp de patru ani cel puțin în toate exploatațiile din zonă sau în exploatația (dintr-o zonă neaprobată) destinată a fi aprobată.

6.	Pentru ca programul să poată fi recunoscut oficial, nu trebuie să se producă sau să fie detectat nici un caz de SHV sau NHI (nici infecție clinică, nici izolare a virusului).

PARTEA IV

Titrarea destinată verificării sensibilității culturilor celulare la infecție

Sunt indicate mai jos proceduri recomandate pentru titrarea menționată în partea I.III.3.

Ar trebui să se utilizeze cel puțin două izolate de virus SHV și un izolat de virus NHI. Aceste izolate trebuie să fie reprezentative pentru principalele virusuri din UE (de exemplu în ceea ce privește virusul SHV, un izolat patogen provenind din păstrăv curcubeu în apă dulce și un izolat marin patogen pentru calcan în apă de mare și, în ceea ce privește virusul NHI, o sușă patogenă de păstrăv curcubeu provenind din Europa). Ar trebui să se folosească izolate bine definite provenind din statele membre. Sunt disponibile izolate de referință pe lângă laboratoarele comunitare de referință pentru bolile peștilor.

Loturi de virusuri având un număr redus de pasaje pe culturi celulare se cultivă în flacoane de culturi celulare pe celule BF-2 sau RTG-2 pentru virusul SHV și pe celule EPC pentru virusul NHI. Ar trebui să se folosească un mediu de cultură celulară adiționat cu cel puțin 10 % ser. Se folosește un indicator MOI slab pentru inoculare (< 1).

Atunci când ECP este total, virusul este colectat prin centrifugarea lichidului supernatant al culturii celulare la 2 000 × g timp de cincisprezece minute, sterilizat prin filtrare printr-o membrană de 0,45 μm și repartizat în criotuburi etichetate. Virusul este conservat la – 80 °C.

La o săptămână după congelare, se decongelează în apă rece trei fiole din fiecare virus și se titrează pe liniile celulare respective. Fiecare izolat de virus se decongelează și se titrează cel puțin o dată la șase luni sau în cazul în care se suspectează o scădere a sensibilității liniilor celulare.

Procedurile de titrare trebuie să fie descrise în detaliu și trebuie să se aplice aceeași procedură de fiecare dată.

Titrarea prin diluție limită trebuie să cuprindă cel puțin șase replicări din fiecare serie de diluții. Titrurile sunt comparate cu titrurile obținute anterior. În cazul în care titrul uneia dintre cele trei izolate de virus scade cu un factor de 2 log sau mai mult față de titrul inițial, linia celulară nu mai trebuie să fie folosită în scopuri de supraveghere.

În cazul în care se conservă în laborator linii celulare diferite, fiecare linie trebuie examinată separat.

Registrele cu evidențele de laborator se păstrează cel puțin zece ani.

PARTEA V

Acronime și abrevieri

BF-2	BF-2 Bluegill fry-2 (linie celulară)
ECP	Efect citopatic
LCR	Laborator comunitar de referință pentru bolile peștilor
ELISA	Test imunoenzimatic
EPC	Epithelioma papulosum cyprinii (linie celulară)
FHM	Fathead minnow (linie celulară)
FITC	Fluorescein izotiocianat
Hepes	Acid N-2-hidroxietilpiperazină-N'-2-etan sulfonic
HRP	Peroxidază din hrean
IF	Imunofluorescență
IFAT	Test de imunofluorescență indirectă
NHI(V)	Necroză hematopoietică infecțioasă (virus)
NPI(V)	Necroză pancreatică infecțioasă (virus)
MEM	Mediu minim esențial
MOI	Multiplicity of infection (numărul de particule virale infecțioase adăugate în raport cu un număr cunoscut de celule într-o cultură)
OPD	Ortho phenilen diamine
PBS	Tampon fosfat salin
RTG-2	Rainbow trout gonad (linie celulară)
RT-PCR	Reversed transcriptase polymerase chain reaction
Tris-HCl	Tris-hidroximetil-aminometan-HCl
TRITC	Tetrametil-rodamin-izotiocianat
SHV(V)	Septicemie hemoragică virală (virus)

---

(1)  De exemplu, atunci când peștii provin din zone foarte îndepărtate și nu pot fi expediați în fiecare zi.

(2)  Sau astfel cum s-a specificat de către laboratorul de referință în ceea ce privește citotoxicitatea antiserurilor.

(3)  Se poate folosi și o probă de dimensiuni reduse în conformitate cu tabelul 1B, în cazul în care sunt îndeplinite cerințele menționate în părțile I.I.1, I.I.2.1(b) și în partea III.

(4)  Inspecții clinice.

(5)  În împrejurări excepționale, în cazul în care este imposibil să se obțină lichid ovarian, probele se pot preleva și din organe.

(6)  Probele nu pot fi colectate la mai puțin de trei săptămâni de la transferul peștilor din apa dulce în apa de mare.

Numărul total de pești/pool: 10.

(7)  Inspecții clinice.

(8)  În împrejurări excepționale, în cazul în care este imposibil să se obțină lichid ovarian, probele se pot preleva și din organe.

(9)  Probele nu pot fi colectate la mai puțin de trei săptămâni de la transferul peștilor din apa dulce în apa de mare.

Numărul total de pești/pool: 10.

(10)  În zonele aprobate, probele nu trebuie să fie colectate prin rotație decât în 50 % dintre exploatațiile piscicole în fiecare an. În exploatațiile aprobate din zone neaprobate, probele trebuie să fie colectate în fiecare an.

(11)  În împrejurări excepționale, în cazul în care este imposibil să se obțină lichid ovarian, probele se pot preleva și din organe.

(12)  Probele nu pot fi colectate la mai puțin de trei săptămâni de la transferul peștilor din apa dulce în apa de mare.

Numărul maxim de pești/pool: 10.