«ANEXO C

BRUCELOSE

1.   IDENTIFICAÇÃO DO AGENTE

A demonstração, através de coloração ácido-resistente modificada ou imunospecífica, de organismos com a morfologia da Brucella em material de aborto, corrimentos vaginais ou no leite constitui um dado sugestivo de brucelose, especialmente se for corroborada por testes serológicos. Os métodos de polimerização em cadeia (PCR) constituem também meios adicionais de detecção.

Sempre que possível, a Brucella spp. deve ser isolada com recurso a meios simples ou selectivos por cultura de corrimentos uterinos, fetos abortados, secreções do úbere ou tecidos seleccionados, tais como nódulos linfáticos e órgãos reprodutores masculinos e femininos.

Após o isolamento, há que identificar a espécie e biovar, através de lise com fagos e/ou de testes do metabolismo oxidativo ou critérios de cultura, bioquímicos e serológicos. A PCR pode constituir um método quer complementar quer de biotipagem, com base em sequências genómicas específicas.

A técnica e meios utilizados, a sua normalização e a interpretação dos resultados devem ser conformes às especificações dos capítulos 2.4.3 (brucelose bovina), 2.7.2 (brucelose ovina e caprina) e 2.8.5 (brucelose suína) da sexta edição (2008) do Manual de testes de diagnóstico e vacinas da OIE.

2.   TESTES IMUNOLÓGICOS

2.1.   Normas

2.1.1.   Para a preparação de todo o antigénio utilizado nos testes do Rosa Bengala (RBT), de sero-aglutinação (SAT), de fixação do complemento (CFT) e do anel em leite (MRT) deve usar-se a estirpe n.o 99 (Weybridge) ou 1119-3 (USDA) da Brucella abortus biovar 1.

2.1.2.   O soro-padrão de referência para os testes RBT, SAT, CFT e MRT é o soro-padrão de referência internacional do OIE (OIEISS), anteriormente designado segundo soro-padrão anti-Brucella abortus da OMS (ISAbS).

2.1.3.   Os soros-padrão de referência para os ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) são os seguintes:

—

o OIEISS

—	o soro-padrão ELISA fracamente positivo do OIE (OIEELISAWPSS),

—	o soro-padrão ELISA fortemente positivo do OIE (OIEELISASPSS),

—	o soro-padrão ELISA negativo do OIE (OIEELISANSS).

2.1.4.   Os soros-padrão de referência para os ensaios com fluorescência polarizada (FPA) são os seguintes:

—	o soro-padrão ELISA fracamente positivo do OIE (OIEELISAWPSS),

—	o soro-padrão ELISA fortemente positivo do OIE (OIEELISASPSS),

—	o soro-padrão ELISA negativo do OIE (OIEELISANSS).

2.1.5.   Os soros-padrão enumerados nos pontos 2.1.3 e 2.1.4 encontram-se disponíveis no laboratório comunitário de referência para a brucelose ou na Veterinary Laboratories Agency (VLA) de Weybridge (Reino Unido).

2.1.6.   O OIEISS, o OIEELISAWPSS, o OIEELISASPSS e o OIEELISANSS são padrões primários internacionais, a partir dos quais devem ser estabelecidos padrões secundários de referência nacionais de soros (“padrões de trabalho”) para cada um dos testes referidos no ponto 2.1.1 em cada um dos Estados-Membros.

2.2.   Ensaios de imunoabsorção enzimática (ELISA) ou outras provas de aglutinação para a detecção da brucelose bovina no soro ou no leite.

2.2.1.   Material e reagentes

A técnica utilizada e a interpretação dos resultados devem ter sido validadas em conformidade com os princípios estabelecidos no capítulo 1.1.4 da sexta edição (2008) do Manual de testes de diagnóstico e vacinas da OIE e tem de, no mínimo, abranger testes laboratoriais e de diagnóstico.

2.2.2.   Normalização do teste

2.2.2.1.   Normalização do procedimento de teste de amostras séricas específicas:

a)	uma pré-diluição de 1:150 (1) do OIEISS, de 1:2 do OIEELISAWPSS ou de 1:16 do OIEELISASPSS utilizando-se um soro negativo (ou um agregado de soros negativos) tem de apresentar uma reacção positiva;

b)	Uma pré-diluição de 1:600 do OIEISS, de 1:8 do OIEELISAWPSS ou de 1:64 do OIEELISASPSS utilizando-se um soro negativo (ou um agregado de soros negativos) tem de apresentar uma reacção negativa;

c)	O OIEELISANSS tem de apresentar sempre uma reacção negativa.

2.2.2.2.   Normalização do procedimento de teste de amostras de agregados de soro:

a)

Uma pré-diluição de 1:150 do OIEISS, de 1:2 do OIEELISAWPSS ou de 1:16 do OIEELISASPSS utilizando-se um soro negativo (ou um agregado de soros negativos), subsequentemente diluída em soros negativos o número de vezes correspondente ao número de amostras que compõem o agregado, tem de apresentar uma reacção positiva;

b)	O OIEELISANSS tem de apresentar sempre uma reacção negativa;

c)	O teste deve ser adequado para detectar dados sugestivos de infecção num só animal de um grupo de animais cujas amostras de soro foram agregadas.

2.2.2.3.   Normalização do procedimento de teste de amostras de agregados de leite ou soro de leite:

a)	uma pré-diluição de 1:1 000 do OIEISS, de 1:16 do OIEELISAWPSS ou de 1:125 do OIEELISASPSS utilizando-se um soro negativo (ou um agregado de soros negativos), subsequentemente diluída a 1:10 em leite negativo, tem de apresentar uma reacção positiva;

b)	O OIEELISANSS diluído a 1:10 em leite negativo tem de apresentar sempre uma reacção negativa;

c)	O teste deve ser adequado para detectar dados sugestivos de infecção num só animal de um grupo de animais cujas amostras de soro foram agregadas.

2.2.3.   Condições de utilização do teste ELISA no diagnóstico da brucelose bovina

2.2.3.1.   Nas condições de calibração indicadas nos pontos 2.2.2.1 e 2.2.2.2 para os testes ELISA de amostras séricas, a sensibilidade diagnóstica dos testes ELISA deve ser superior ou igual à dos testes RBT ou CFT, tendo em conta a situação epidemiológica em que são utilizados.

2.2.3.2.   Nas condições de calibração indicadas no ponto 2.2.2.3 para os testes ELISA de amostras de agregados de leite, a sensibilidade diagnóstica dos testes ELISA deve ser superior ou igual à dos testes MRT, tendo em conta não só a situação epidemiológica, como também os sistemas de criação médios e extremos previstos.

2.2.3.3.   Se os testes ELISA forem utilizados para efeitos de certificação, em conformidade com o disposto no n.o 1 do artigo 6.o, ou para a determinação e manutenção do estatuto dos efectivos, em conformidade com o disposto no ponto II.10 do anexo A, a agregação de amostras séricas deve efectuar-se de molde a que os resultados dos testes possam ser indubitavelmente relacionados com o animal específico incluído no agregado. Os testes de confirmação devem ser efectuados em amostras séricas de animais específicos.

2.2.3.4.   O teste ELISA pode ser utilizado numa amostra de leite retirada de uma colheita de leite proveniente de uma exploração com pelo menos 30 % das vacas leiteiras em lactação. Se se recorrer àquele método, têm de ser tomadas medidas que garantam que as amostras recolhidas para análise possam ser indubitavelmente relacionadas com os animais de que o leite provém. Os testes de confirmação devem ser efectuados em amostras séricas de animais específicos.

2.3.   Teste de fixação do complemento (CFT)

2.3.1.   O antigénio é constituído por uma suspensão bacteriana em fenol-soro fisiológico [NaCl a 0,85 % (m/v) e fenol a 0,5 % (v/v)] ou num tampão veronal. Os antigénios podem ser fornecidos concentrados, desde que o factor de diluição a utilizar esteja indicado no rótulo do frasco. O antigénio deve ser conservado a 4 oC e não deve ser congelado.

2.3.2.   Os soros devem ser inactivados do seguinte modo:

—	soro de bovino: 56 a 60 oC durante 30 a 50 minutos;

—	soro de suíno: 60 oC durante 30 a 50 minutos.

2.3.3.   Para que haja uma reacção genuína no âmbito do teste, deve-se utilizar uma dose complementar superior à dose mínima necessária para a hemólise total.

2.3.4.   O teste de fixação do complemento deve ser sempre acompanhado dos seguintes controlos:

a)	Controlo do efeito anticomplementar do soro;

b)	Controlo do antigénio;

c)	Controlo dos eritrócitos sensibilizados;

d)	Controlo do complemento;

e)	Controlo da sensibilidade no início da reacção, utilizando-se um soro positivo;

f)	Controlo da especificidade da reacção, utilizando-se um soro negativo.

2.3.5.   Cálculo dos resultados

O OIEISS contém 1 000 unidades internacionais CFT (ICFTU) por ml. Se, num dado método, o OIEISS for testado, o resultado deve ser apresentado sob a forma de título (ou seja, a diluição directa mais elevada do OIEISS dando 50 % de hemólise, TOIEISS). O resultado do soro testado, apresentado sob a forma de título (Tsoro testado), deve ser expresso em ICFTU por ml. Para converter o título em ICFTU, o factor (F) necessário para a conversão em ICFTU do título de soro testado (Tsoro testado) por tal método é dado pela seguinte fórmula:

F = 1 000 × 1/TOIEISS

e o teor de unidades internacionais CFT por ml de soro testado (ICFTUsoro testado) é dado pelo seguinte fórmula:

ICFTUSORO TESTADO = F × TSORO TESTADO

2.3.6.   Interpretação dos resultados

É considerado positivo um soro com 20 ou mais UI por ml.

2.4.   Teste do anel em leite (MRT)

2.4.1.   O antigénio é constituído por uma suspensão bacteriana em fenol-soro fisiológico [NaCl a 0,85 % (m/v) e fenol a 0,5 % (v/v)] corada com hematoxilina. O antigénio deve ser conservado a 4 oC e não deve ser congelado.

2.4.2.   A sensibilidade do antigénio tem de ser normalizada tomando como padrão o OIEISS, por forma a que o antigénio produza uma reacção positiva numa diluição a 1:500 do OIEISS em leite negativo e uma reacção negativa numa diluição a 1:1 000.

2.4.3.   Devem ser submetidas à prova do anel amostras representativas do conteúdo de cada batedeira ou de cada cisterna de leite da exploração.

2.4.4.   As amostras de leite não devem ter sido congeladas, aquecidas ou sujeitas a agitação violenta.

2.4.5.   A reacção deve efectuar-se de acordo com um dos seguintes métodos:

—	numa coluna de leite de, pelo menos, 25 mm de altura e com um volume de leite de 1 ml, ao qual se adicionaram 0,03 ou 0,05 ml de um dos antigénios corados padronizados,

—	numa coluna de leite de, pelo menos, 25 mm de altura e com um volume de leite de 2 ml, ao qual se adicionaram 0,05 ml de um dos antigénios corados padronizados,

—	num volume de leite de 8 ml ao qual se adicionaram 0,08 ml de um dos antigénios corados padronizados.

2.4.6.   A mistura de leite e antigénio deve ser incubada a 37 oC durante 60 minutos, junto com padrões de trabalho positivos e negativos. A incubação a 4 oC 16 a 24 horas depois aumenta a sensibilidade do teste.

2.4.7.   Interpretação dos resultados:

a)	Reacção negativa: leite corado e nata não corada;

b)	Reacção positiva: — leite e nata com coloração idêntica, ou — leite não corado e nata corada.

2.5.   Teste do antigénio brucélico tamponado [teste do Rosa Bengala (RBT)]

2.5.1.   O antigénio é constituído por uma suspensão bacteriana num diluente de antigénio brucélico tamponado com pH de 3,65 ± 0,05, corada com o corante Rosa Bengala. O antigénio deve ser fornecido pronto a ser utilizado e deve ser armazenado a 4 oC, sem ser congelado.

2.5.2.   O antigénio deve ser preparado sem referência à concentração de células, devendo a sua sensibilidade ser aferida por comparação com o OIEISS, por forma a que o antigénio produza uma reacção positiva com uma diluição sérica de 1:45 e uma reacção negativa com uma diluição de 1:55.

2.5.3.   O teste RBT deve ser efectuado do seguinte modo:

a)	Misturam-se volumes iguais (20-30 μl) de soro e antigénio numa placa de porcelana ou esmaltada, por forma a criar uma zona com aproximadamente 2 cm de diâmetro. A mistura é agitada suavemente durante quatro minutos à temperatura ambiente, pesquisando-se então a aglutinação com uma boa fonte de luz;

b)	Podem ser utilizados métodos automatizados, desde que sejam pelo menos tão sensíveis e precisos como o método manual.

2.5.4.   Interpretação dos resultados

Considera-se positiva qualquer reacção visível, a menos que se verifique dessecação excessiva na periferia.

Todas as séries de testes devem incluir padrões de trabalho positivos e negativos.

2.6.   Teste de sero-aglutinação (SAT)

2.6.1.   O antigénio é uma suspensão bacteriana em fenol-soro fisiológico [NaCl a 0,85 % (m/v) e fenol a 0,5 % (v/v)].

Não deve ser utilizado formaldeído.

Os antigénios podem ser fornecidos concentrados, desde que o factor de diluição a utilizar esteja indicado no rótulo do frasco.

Pode adicionar-se EDTA à suspensão de antigénio, até uma diluição final de 5 mM, para diminuir o número de falsos positivos no teste de sero-aglutinação. Subsequentemente, a suspensão bacteriana deve ser reajustada para um pH de 7,2.

2.6.2.   O OIEISS contém 1 000 unidades internacionais de aglutinação.

2.6.3.   O antigénio deve ser preparado sem referência à concentração de células, devendo a sua sensibilidade ser aferida por comparação com o OIEISS, por forma a que o antigénio produza uma aglutinação de 50 % com uma diluição sérica final de 1:600 a 1:1 000, ou uma aglutinação de 75 % com uma diluição sérica final de 1:500 a 1:750.

Pode ser igualmente aconselhável comparar a reactividade dos novos lotes de antigénio com a dos já anteriormente padronizados, através de um painel de soros bem definidos.

2.6.4.   O teste deve ser efectuado em tubos ou em microplacas. A mistura de diluições de antigénio e soro deve ser incubada durante 16 a 24 horas a 37 oC.

Devem ser preparadas pelo menos três diluições para cada soro. As diluições do soro suspeito devem ser feitas de forma a que a leitura da reacção no limite de positividade seja feita no tubo mediano (ou poço, caso seja utilizada uma microplaca).

2.6.5.   Interpretação dos resultados

O grau de aglutinação brucélica do soro deve ser expresso em UI por ml.

É considerado positivo um soro com 30 ou mais UI por ml.

2.7.   Ensaio com fluorescência polarizada (FPA)

2.7.1.   O FPA pode ser efectuado em tubos de vidro ou numa placa de 96 poços. A técnica utilizada, a sua normalização e a interpretação dos resultados têm de ser conformes às especificações do capítulo 2.4.3 (brucelose bovina) da sexta edição (2008) do Manual de testes de diagnóstico e vacinas da OIE.

2.7.2.   Normalização do teste

O FPA deve ser normalizado de forma a que:

a)	O OIEELISASPSS e o OIEELISAWPSS apresentem resultados positivos de forma coerente;

b)	Uma pré-diluição de 1:8 do OIEELISAWPSS ou de 1:64 do OIEELISASPSS utilizando-se um soro negativo (ou um agregado de soros negativos) apresentem sempre uma reacção negativa;

c)	O OIEELISANSS apresente sempre uma reacção negativa.

Devem incluir-se em cada lote de testes: um soro fortemente positivo, um soro fracamente positivo e um soro-padrão de trabalho negativo (calibrados em função dos soros padrão ELISA da OIE).

3.   TESTES COMPLEMENTARES

3.1.   Prova cutânea da brucelose (BST)

3.1.1.   Condições de utilização da BST:

a)	A prova cutânea da brucelose não deve ser utilizada na certificação com vista ao comércio intracomunitário;

b)	A prova cutânea da brucelose é um dos testes mais específicos para a detecção de brucelose em animais não vacinados, no entanto, o diagnóstico não pode assentar apenas em provas intradérmicas positivas;

c)	Devem ser considerados infectados ou suspeitos de estarem infectados os bovinos com resultados negativos num dos testes serológicos definidos no presente anexo e com resultado positivo na BST;

d)

Os bovinos com um resultado positivo num dos testes serológicos definidos no presente anexo podem ser sujeitos à BST, para interpretar os resultados dos testes serológicos, nomeadamente se não puder ser excluída uma reacção cruzada com outras bactérias em efectivos bovinos oficialmente indemnes ou indemnes de brucelose.

3.1.2.   A prova deve utilizar uma preparação normalizada e definida de alérgeno da brucelose isenta de antigénio lipopolissacarídico (LPS) liso, visto que este pode causar reacções inflamatórias inespecíficas ou interferir com testes serológicos subsequentes.

Os requisitos para a produção de Brucellin devem cumprir o disposto na secção C.1 do capítulo 2.4.3 da sexta edição (2008) do Manual de testes de diagnóstico e vacinas da OIE.

3.1.3.   Procedimento de ensaio

3.1.3.1.   Injecta-se intradermicamente na prega caudal, na pele do flanco ou na parte lateral do pescoço 0,1 ml de alérgeno da brucelose.

3.1.3.2.   Procede-se à leitura dos resultados após 48-72 horas.

3.1.3.3.   Antes da injecção e aquando da repetição do exame, mede-se a espessura da pele no local de injecção com um compasso de Vernier.

3.1.3.4.   Interpretação dos resultados:

As reacções fortes são facilmente identificáveis pela tumefacção e endurecimento locais.

Na BST, um aumento da espessura da pele de 1,5 a 2 mm deve ser considerado uma reacção positiva.

3.2.   Ensaio de imunoabsorção enzimática competitiva (cELISA)

3.2.1.   Condições de utilização do ensaio cELISA

O ensaio cELISA não deve ser utilizado com vista à certificação para o comércio intracomunitário;

Os bovinos com um resultado positivo num dos testes serológicos definidos no presente anexo podem ser sujeitos a um ensaio cELISA, para confirmar a interpretação dos resultados dos testes serológicos, nomeadamente se não puder ser excluída uma reacção cruzada com outras bactérias em efectivos bovinos oficialmente indemnes ou indemnes de brucelose nem eliminar reacções devidas a anticorpos residuais produzidos em resposta à vacinação com S19.

3.2.2.   Procedimento de ensaio

O ensaio deve ser efectuado em conformidade com o prescrito na secção B.2 do capítulo 2.4.3 da sexta edição (2008) do Manual de testes de diagnóstico e vacinas da OIE.»