«B.   DETERMINAÇÃO DOS TEORES DE DIOXINAS (PCDD/PCDF) E DE PCB

CAPÍTULO I

MÉTODOS DE AMOSTRAGEM E INTERPRETAÇÃO DOS RESULTADOS ANALÍTICOS

1.   OBJETO E ÂMBITO DE APLICAÇÃO

As amostras destinadas ao controlo oficial dos teores de dibenzo-p-dioxinas policloradas (PCDD), dibenzofuranos policlorados (PCDF), bifenilos policlorados (PCB) sob a forma de dioxina (1) e de PCB não semelhantes a dioxinas nos alimentos para animais devem ser colhidas em conformidade com os métodos descritos no anexo I. Devem aplicar-se as exigências quantitativas respeitantes ao controlo de substâncias ou produtos repartidos uniformemente nos alimentos, tal como se estabelece no ponto 5.1 do anexo I. As amostras globais assim obtidas são consideradas representativas dos lotes ou sublotes dos quais foram colhidas. A observância dos limites máximos fixados na Diretiva 2002/32/CE deve ser estabelecida em função dos teores determinados nas amostras de laboratório.

Para efeitos da presente parte B, aplicam-se as definições estabelecidas no anexo I da Decisão 2002/657/CE da Comissão (2).

Para além destas definições, para efeitos do disposto na presente parte B, são aplicáveis as seguintes definições:

“Métodos de pré-seleção”, os métodos utilizados para a seleção de amostras com teores de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina que excedam os limites máximos, ou os níveis de ação. Devem apresentar uma elevada capacidade de processamento de amostras com uma boa relação custo-eficácia, aumentando assim a oportunidade de descobrir novos incidentes com elevada exposição e riscos para a saúde dos consumidores. Os métodos de pré-seleção devem basear-se em métodos bioanalíticos ou de CG-EM. Os resultados de amostras que ultrapassam o valor-limite destinados a verificar a conformidade com o limite máximo devem ser controlados por uma reanálise completa da amostra original através de um método de confirmação.

“Métodos de confirmação”, os métodos que fornecem informações completas ou complementares que permitem a identificação e quantificação inequívocas de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina no limite máximo ou, em caso de necessidade, no nível de ação. Estes métodos utilizam a cromatografia gasosa/espectrometria de massa de alta resolução (GC-HRMS) ou a cromatografia gasosa/espectrometria de massa em tandem (GC-MS/MS).

2.   Conformidade do lote ou do sublote com o LIMITE MÁXIMO

2.1.   No que se refere a PCB não semelhantes a dioxinas

O lote está conforme com o limite máximo se o resultado analítico não for superior ao limite máximo de PCB não semelhantes a dioxinas estabelecido na Diretiva 2002/32/CE, tomando em consideração a incerteza da medição.

O lote não está conforme com o limite máximo se o resultado analítico no limite superior (3), confirmado por análise em duplicado (4), for superior ao limite máximo estabelecido na Diretiva 2002/32/CE, tomando em consideração a incerteza da medição. A média de duas determinações, tendo em conta a incerteza da medição, é utilizada para verificar a conformidade.

A incerteza da medição deve ser tida em consideração de acordo com uma das seguintes abordagens:

—	calculando a incerteza expandida, utilizando um fator de expansão de 2, que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %. Um lote ou sublote não está conforme se o valor medido menos U for superior ao limite máximo,

—	estabelecendo o limite de decisão (CCα) em conformidade com o ponto 3.1.2.5 do anexo I da Decisão 2002/657/CE. Um lote ou sublote não está conforme se o valor medido for igual ou superior ao CCα.

Os parágrafos 1, 2 e 3 são aplicáveis ao resultado analítico obtido na amostra para controlo oficial. No caso de análises para efeitos de direito de recurso ou de procedimentos de arbitragem, são aplicáveis as normas nacionais.

2.2.   No que se refere a PCDD/F e a PCB sob a forma de dioxina

O lote está conforme com os limites máximos se o resultado de uma única análise,

—	realizada por um método de pré-seleção com uma taxa de falsos resultados conformes inferior a 5 %, indicar que o teor não excede o respetivo limite máximo de PCDD/F nem da soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina fixado na Diretiva 2002/32/CE,

—	realizada por um método de confirmação, não excede o respetivo limite máximo de PCDD/F nem da soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina fixado na Diretiva 2002/32/CE, tendo em conta a incerteza da medição.

Em relação aos ensaios de pré-seleção, deve ser estabelecido um valor-limite para decidir da conformidade da amostra com os respetivos limites máximos fixados quer para PCDD/F, quer para a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina.

O lote não está conforme com o limite máximo se o resultado analítico do limite superior (5), obtido por um método de confirmação e confirmado por análise em duplicado, for superior ao limite máximo estabelecido na Diretiva 2002/32/CE, tomando em consideração a incerteza da medição (6). A média de duas determinações, tendo em conta a incerteza da medição, é utilizada para verificar a conformidade.

A incerteza da medição deve ser tida em consideração de acordo com uma das seguintes abordagens:

—

calculando a incerteza expandida, utilizando um fator de expansão de 2, que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %. Um lote ou sublote não está conforme se o valor medido menos U for superior ao limite máximo. No caso de uma determinação em separado dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina, a soma da incerteza expandida estimada dos resultados analíticos separados dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina deve ser utilizada para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina,

—	estabelecendo o limite de decisão (CCα) em conformidade com o ponto 3.1.2.5 do anexo I da Decisão 2002/657/CE. Um lote ou sublote não está conforme se o valor medido for igual ou superior ao CCα.

Os parágrafos 1 e 4 são aplicáveis ao resultado analítico obtido na amostra para controlo oficial. No caso de análises para efeitos de direito de recurso ou de procedimentos de arbitragem, são aplicáveis as normas nacionais.

3.   Resultados superiores aos níveis de ação estabelecidos no Anexo II da Diretiva 2002/32/CE

Os níveis de ação servem de instrumento para a seleção de amostras nos casos em que é necessário identificar uma fonte de contaminação e adotar medidas com vista à sua redução ou eliminação. Os métodos de pré-seleção devem estabelecer valores-limite adequados para a seleção daquelas amostras. Caso sejam necessários esforços importantes para identificar a fonte e reduzir ou eliminar a contaminação, pode afigurar-se adequado confirmar a superação dos níveis de ação por uma análise em duplicado mediante um método de confirmação e tendo em conta a incerteza da medição (7).

CAPÍTULO II

Preparação das amostras e requisitos respeitantes aos métodos de análise utilizados no controlo oficial dos teores de dioxinas (PCDD/PCDF) e de PCB sob a forma de dioxina em alimentos para animais

1.   Âmbito de aplicação

Os requisitos expostos no presente capítulo devem ser aplicados quando se analisarem alimentos para animais para efeitos de controlo oficial dos teores de dibenzo-p-dioxinas policloradas, dibenzofuranos policlorados (PCDD/F) substituídos nas posições 2,3,7 e 8 e de bifenilos policlorados (PCB) sob a forma de dioxina e para outros fins regulamentares.

A monitorização da presença de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina nos alimentos para animais pode ser realizada com dois métodos analíticos diferentes:

a)

Métodos de pré-seleção O objetivo dos métodos de pré-seleção é selecionar as amostras com teores de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina que excedam os limites máximos, ou os níveis de ação. Os métodos de pré-seleção devem apresentar uma elevada capacidade de processamento de amostras com uma boa relação custo-eficácia, aumentando assim a oportunidade de descobrir novos incidentes com elevada exposição e riscos para a saúde dos consumidores. A sua aplicação deverá ter como objetivo evitar falsos resultados conformes. Podem incluir métodos bioanalíticos e métodos GC/MS. Os métodos de pré-seleção comparam o resultado analítico com um valor-limite, fornecendo uma decisão do tipo sim/não sobre a eventual superação do limite máximo ou do nível de ação. É necessário que a concentração de PCDD/F e a soma de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina em amostras suspeitas de não conformidade com os limites máximos seja determinada/confirmada por um método de confirmação. Além disso, os métodos de pré-seleção podem fornecer uma indicação dos teores de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina presentes na amostra. Caso sejam aplicados métodos de pré-seleção bioanalíticos, o resultado é expresso em equivalentes bioanalíticos (BEQ), ao passo que se forem aplicados métodos físico-químicos de GC-MS, o resultado é expresso em equivalentes de toxicidade (TEQ). Os resultados dos métodos de pré-seleção indicados numericamente são adequados para demonstrar a conformidade ou a suspeita de não conformidade ou a superação dos níveis de ação e apresentar uma indicação da gama de valores em caso de seguimento através de métodos de confirmação. Não são adequados para fins como a avaliação dos níveis de base, na estimativa de ingestão, no acompanhamento das tendências temporais dos níveis ou na reavaliação dos níveis de ação e dos limites máximos.

b)

Métodos de confirmação Os métodos de confirmação permitem a identificação e quantificação inequívocas de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina presentes numa amostra, bem como fornecem uma informação exaustiva ao nível dos congéneres. Por conseguinte, estes métodos permitem o controlo dos limites máximos e dos níveis de ação, incluindo a confirmação de resultados obtidos por métodos de pré-seleção. Além disso, os resultados podem ser utilizados para outros fins, como é o caso da determinação de níveis baixos de contaminação de base na monitorização dos alimentos para animais, do acompanhamento das tendências temporais, da avaliação da exposição e da construção de uma base de dados para uma eventual reavaliação dos níveis de ação e dos limites máximos. São também importantes para o estabelecimento de padrões de congéneres com vista a identificar a fonte de uma eventual contaminação. Tais métodos utilizam GC-HRMS. Para confirmar a conformidade ou não conformidade com o limite máximo pode também ser utilizar-se a GC-MS/MS.

2.   Antecedentes

Para o cálculo de concentrações de equivalente de toxicidade (TEQ), as concentrações de cada substância numa determinada amostra devem ser multiplicadas pelos respetivos fatores de equivalência equivalentes de toxicidade (FET) (ver nota de rodapé (1) do capítulo I), sendo subsequentemente somadas para darem a concentração total de compostos sob a forma de dioxina expressos em TEQ.

Para efeitos da presente parte B, por limite de quantificação específico aceite de um congénere individual, entende-se o teor mais baixo do analito que pode ser medido com uma certeza estatística razoável, preenchendo os critérios de identificação tal como descritos em normas reconhecidas internacionalmente, por exemplo, na norma EN 16215:2012 (Alimentação animal — determinação de dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina por GC-HRMS e de PCB indicadores por GC/HRMS) e/ou nos métodos EPA 1613 e 1668, na sua forma revista.

O limite de quantificação de cada congénere individual pode ser identificado como

a)	A concentração de um analito no extrato de uma amostra que produz uma resposta instrumental a dois iões diferentes a ser monitorizada com um rácio S/N (sinal/ruído) de 3:1 para o sinal de dados em bruto menos intensivo; ou

b)

Se, por motivos de ordem técnica, o cálculo sinal/ruído não fornecer resultados fiáveis, o ponto de concentração mais baixo na curva de calibração, que apresenta um desvio aceitável (≤ 30 %) e coerente (medidos pelo menos no início e no final de uma série de amostras analíticas) em relação ao fator de resposta relativa média calculado para todos os pontos da curva de calibração em cada série de amostras. O LOQ é calculado a partir do ponto de concentração mais baixo tendo em conta a recuperação de padrões internos e a quantidade da amostra.

Os métodos de pré-seleção bioanalíticos não darão resultados ao nível do congénere, mas apenas uma indicação (8) do valor TEQ, expresso em equivalentes bioanalíticos (BEQ) no sentido de reconhecer o facto de que nem todos os compostos presentes num extrato de amostra que produzem uma resposta no teste podem cumprir todos os requisitos do princípio de TEQ.

Os métodos de pré-seleção e de confirmação apenas podem ser aplicados para o controlo de uma determinada matriz se os métodos forem suficientemente sensíveis para detetar fiavelmente teores no limiar de intervenção ou no limite máximo.

3.   Requisitos de garantia da qualidade

3.1.   Devem ser tomadas medidas para evitar a contaminação cruzada em cada etapa do procedimento de amostragem e de análise.

3.2.   As amostras devem ser conservadas e transportadas em recipientes de vidro, alumínio, polipropileno ou polietileno, adequados para o armazenamento sem qualquer influência nos teores de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina das amostras. Devem ser removidos do recipiente da amostra os vestígios de poeiras de papel.

3.3.   O armazenamento e o transporte das amostras devem ser realizados de modo a manter a integridade da amostra de alimentos para animais.

3.4.   Desde que relevante, cada amostra de laboratório deve ser finamente triturada e cuidadosamente misturada, mediante um processo que tenha demonstrado alcançar uma homogeneização completa (por exemplo, trituração que permita passar por um crivo de 1 mm). As amostras devem ser exsicadas antes da trituração, caso o teor em humidade seja demasiado elevado.

3.5.   Deve proceder-se ao controlo dos reagentes, do material de vidro e do equipamento relativamente a uma eventual influência nos resultados baseados em TEQ ou em BEQ.

3.6.   Deve ser efetuada uma análise em branco através da realização de todo o procedimento analítico, omitindo apenas a amostra.

3.7.   Relativamente aos métodos bioanalíticos, devem testar-se todo o material de vidro e os solventes utilizados na análise para verificar se estão isentos de compostos que interfiram com a deteção de compostos-alvo na gama de trabalho. O material de vidro deve ser enxaguado com solventes ou aquecido a temperaturas adequadas para remover da sua superfície vestígios de PCDD/F, de compostos sob a forma de dioxina e de compostos interferentes.

3.8.   A quantidade da amostra utilizada para a extração deve ser suficiente para cumprir os requisitos relativos a uma gama de trabalho suficientemente baixa, incluindo as concentrações dos limites máximos ou do limiar de intervenção.

3.9.   Os procedimentos específicos para preparação de amostras utilizados para os produtos em causa devem seguir orientações aceites internacionalmente.

4.   Requisitos aplicáveis aos laboratórios

4.1.   Em conformidade com o disposto no Regulamento (CE) n.o 882/2004, os laboratórios devem ser acreditados por um organismo reconhecido que opere em conformidade com o Guia ISO 58, a fim de assegurar que aplicam a garantia de qualidade analítica. Os laboratórios devem ser acreditados em conformidade com a norma EN ISO/IEC 17025.

4.2.   A competência de um laboratório deve ser comprovada pelo êxito da sua participação contínua em estudos interlaboratoriais para a determinação de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina nas matrizes relevantes de alimentos para animais e nas gamas de concentrações.

4.3.   Os laboratórios que aplicam métodos de pré-seleção para o controlo de rotina de amostras devem estabelecer uma estreita cooperação com os laboratórios que aplicam o método de confirmação, tanto para o controlo da qualidade como para a confirmação do resultado analítico de amostras suspeitas.

5.   Requisitos básicos a cumprir pelo procedimento analítico para determinação de dioxinas (PCDD/F) e de PCB sob a forma de dioxina

5.1.   Gama de trabalho baixa e limites de quantificação

No que diz respeito aos PCDD/F, as quantidades detetáveis devem ser da gama dos femtogramas superiores (10–15 g) devido à extrema toxicidade de alguns destes compostos. Para a maioria dos congéneres de PCB, o limite de quantificação na gama dos nanogramas (10-9 g) já é suficiente. Quanto à medição dos congéneres de PCB sob a forma de dioxina mais equivalentes de toxicidade (designadamente, os congéneres não-orto substituídos), o limite inferior da gama de trabalho deve atingir os níveis baixos dos picogramas (10–12 g). Para todos os restantes congéneres de PCB, é suficiente o limite de quantificação na gama dos nanogramas (10–9 g).

5.2.   Seletividade (especificidade) elevada

5.2.1.   É necessário estabelecer uma distinção entre PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina e inúmeros compostos co-extraídos e eventualmente interferentes, presentes em concentrações que podem atingir várias ordens de grandeza superiores às dos analitos requeridos. Nos métodos de GC-MS, é necessária uma diferenciação entre vários congéneres, nomeadamente entre congéneres equivalentes de toxicidade (por exemplo, os dezassete PCDD/F substituídos nas posições 2,3,7 e 8 e os doze PCB sob a forma de dioxina) e outros congéneres.

5.2.2.   Os métodos bioanalíticos devem ser capazes de detetar os compostos-alvo como a soma de PCDD/F e/ou de PCB sob a forma de dioxina. A limpeza (clean-up) das amostras destina-se à remoção de compostos conducentes a falsos resultados não conformes ou compostos que possam diminuir a resposta, provocando falsos resultados conformes.

5.3.   Exatidão elevada (rigor e precisão, recuperação aparente do bioensaio)

5.3.1.   No que diz respeito aos métodos GC-MS, a determinação deve fornecer uma estimativa válida da verdadeira concentração numa amostra. É necessária uma elevada exatidão para se evitar a rejeição do resultado da análise de uma amostra devido à reduzida fiabilidade do valor TEQ determinado. A exatidão é expressa em termos de rigor (diferença entre o valor médio medido para um analito num material certificado e o respetivo valor certificado, expresso em percentagem deste valor) e de precisão (RSDR, desvio-padrão relativo, calculado a partir de resultados obtidos em condições de reprodutibilidade).

5.3.2.   No que diz respeito aos métodos bioanalíticos, deve determinar-se a recuperação aparente do bioensaio. Por recuperação aparente do bioensaio, entende-se o valor BEQ calculado a partir da curva de calibração da TCDD ou do PCB 126 corrigida em função do resultado do ensaio em branco e, em seguida, dividido pelo valor TEQ determinado pelo método de confirmação. Visa corrigir fatores como a perda de PCDD/PCDF e de compostos sob a forma de dioxina durante as fases de extração e de limpeza, compostos co-extraídos que aumentam ou diminuem a resposta (efeitos agonísticos e antagónicos), a qualidade do ajustamento da curva, ou diferenças entre os valores dos fatores de equivalência equivalentes de toxicidade (FET) e da potência relativa (REP). A recuperação aparente do bioensaio é calculada a partir de amostras de referência apropriadas com padrões de congéneres representativos próximos do teor requerido.

5.4.   Validação na gama do limite máximo e medidas gerais de controlo da qualidade

5.4.1.   Os laboratórios devem demonstrar o desempenho de um método na gama do limite máximo (por exemplo, 0,5 vezes, 1 vez e 2 vezes o limite máximo) com um coeficiente de variação aceitável para análises repetidas, durante o procedimento de validação e durante a análise de rotina.

5.4.2.   Devem realizar-se controlos regulares com ensaios em branco e com amostras enriquecidas ou análises de amostras de controlo (de preferência, se disponível, material de referência certificado) como medidas internas de controlo da qualidade. Devem registar-se e verificar-se os gráficos de controlo da qualidade para ensaios em branco, com amostras enriquecidas, ou análises de amostras de controlo, a fim de garantir que o desempenho analítico está em conformidade com os requisitos.

5.5.   Limite de quantificação

5.5.1.   No que diz respeito ao método bioanalítico de pré-seleção, o estabelecimento do limite de quantificação (LOQ) não é um requisito indispensável, mas deve provar-se que o método é capaz de distinguir entre o valor do ensaio em branco e o valor-limite. Quando se proporciona um valor BEQ, deve estabelecer-se um nível de notificação para lidar com amostras que revelam uma resposta abaixo deste nível. Deve demonstrar-se que o nível de notificação é diferente, pelo menos por um fator de três, das amostras em branco do procedimento, com uma resposta inferior à gama de trabalho. Por conseguinte, deve ser calculado a partir de amostras que contenham os compostos-alvo próximos do teor mínimo exigido, e não a partir de um rácio S/R ou de um ensaio em branco.

5.5.2.   O limite de quantificação (LOQ) de um método de confirmação deve ser de cerca de um quinto do limite máximo.

5.6.   Critérios analíticos

Para se obterem resultados fiáveis de métodos de confirmação ou de pré-seleção, devem ser satisfeitos os seguintes critérios na gama do limite máximo ou do limiar de intervenção, respetivamente, para o valor TEQ ou o valor BEQ, quer determinado como valor TEQ total (como a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina) ou separadamente para PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina.

	Pré-seleção com métodos bioanalíticos ou físico-químicos	Métodos de confirmação
Taxa de falsos resultados conformes (9)	< 5 %
Rigor		- 20 % a + 20 %
Repetibilidade (RSDr)	< 20 %
Reprodutibilidade intralaboratorial (RSDr)	< 25 %	< 15 %

5.7.   Requisitos específicos para métodos de pré-seleção

5.7.1.   Na pré-seleção podem ser utilizados tanto GC-MS como métodos bioanalíticos. Em relação aos métodos GC-MS, devem respeitar-se os requisitos descritos no ponto 6. Quanto aos métodos bioanalíticos baseados em células, os requisitos específicos estão descritos no ponto 7.

5.7.2.   Os laboratórios que aplicam métodos de pré-seleção para o controlo de rotina de amostras devem estabelecer uma estreita cooperação com os laboratórios que aplicam o método de confirmação.

5.7.3.   A verificação do desempenho do método de pré-seleção é necessária durante a análise de rotina, por controlo da qualidade analítica e validação contínua do método. Deve existir um programa contínuo para o controlo dos resultados conformes.

5.7.4.   Controlo da eventual supressão da resposta das células e da citotoxicidade

20 % dos extratos de amostras devem ser medidos em pré-seleção de rotina com e sem adição de 2,3,7,8-TCDD, correspondente ao limite máximo ou ao limiar de intervenção, a fim de verificar se a resposta é eventualmente suprimida por substâncias interferentes presentes no extrato da amostra. A concentração medida da amostra enriquecida deve ser comparada com a soma da concentração do extrato não enriquecido mais a concentração do enriquecimento. Se esta concentração medida for inferior, em mais de 25 %, à concentração (soma) calculada, tal é uma indicação de uma potencial supressão do sinal e a respetiva amostra deve ser submetida a análise de confirmação por GC-HRMS. Os resultados devem ser monitorizados em gráficos de controlo de qualidade.

5.7.5.   Controlo da qualidade de amostras conformes

Aproximadamente 2 a 10 % das amostras conformes, dependendo da matriz da amostra e da experiência adquirida no laboratório, deve ser confirmada por GC-HRMS.

5.7.6.   Determinação das taxas de falsos resultados conformes a partir de dados de controlo da qualidade

Deve determinar-se a taxa de falsos resultados conformes obtidos na pré-seleção de amostras abaixo e acima do limite máximo ou do limiar de intervenção. As taxas reais de falsos resultados conformes devem ser inferiores a 5 %. Quando o controlo da qualidade de amostras conformes revelar, pelo menos, 20 resultados confirmados por matriz/grupo de matrizes, devem ser retiradas conclusões sobre a taxa de falsos resultados conformes a partir dessa base de dados. Os resultados das amostras analisadas em ensaios interlaboratoriais ou durante incidentes de contaminação, abrangendo uma gama de concentrações que pode atingir, por exemplo, 2x o limite máximo (LM), podem também ser incluídos no mínimo de 20 resultados para a avaliação da taxa de falsos resultados conformes. As amostras devem abranger os padrões de congéneres mais frequentes, que representem diferentes fontes.

Embora os ensaios de pré-seleção devam, de preferência, ter como objetivo a deteção de amostras superiores ao limiar de intervenção, o critério para determinar as taxas de falsos resultados conformes é o limite máximo, tendo em conta a incerteza de medição do método de confirmação.

5.7.7.   As amostras potencialmente não conformes na pré-seleção devem ser sempre verificadas por uma reanálise completa da amostra inicial por um método de análise de confirmação. Estas amostras podem também servir para avaliar a taxa de falsos resultados não conformes. Relativamente aos métodos de pré-seleção, a taxa de falsos resultados não conformes é a fração de resultados conformes confirmados por análises de confirmação, enquanto na pré-seleção anterior a amostra tinha sido declarada potencialmente não conforme. A avaliação da vantagem do método de pré-seleção baseia-se na comparação das amostras com falsos resultados não conformes com o número total de amostras verificadas. Esta taxa deve ser suficientemente baixa para tornar benéfico o uso do instrumento de pré-seleção.

5.7.8.   Pelo menos nas condições de validação, os métodos bioanalíticos devem fornecer uma indicação válida do valor TEQ, calculado e expresso em BEQ.

Também em relação aos métodos bioanalíticos realizados em condições de repetibilidade, a RSDr intralaboratorial deveria tipicamente ser inferior à reprodutibilidade RSDR.

6.   Requisitos específicos aplicáveis aos métodos GC-MS a respeitar para efeitos de pré-seleção ou de confirmação

6.1.   Diferenças aceitáveis entre o limite superior e o limite inferior dos resultados TEQ-OMS

A diferença entre o limite superior e o limite inferior não deve exceder 20 % no caso de confirmação da superação do limite máximo ou, em caso de necessidade, dos níveis de ação.

6.2.   Controlo das recuperações

6.2.1.   Logo no início do método analítico, por exemplo antes da extração, deve proceder-se à adição de padrões internos de PCDD/F marcados com 13C e substituídos com cloro nas posições 2,3,7 e 8 e de padrões internos de PCB sob a forma de dioxina marcados com 13C, por forma a validar o procedimento analítico. Deve ser adicionado, pelo menos, um congénere para cada grupo homólogo de PCDD/F tetra a octo-clorado e, pelo menos, um congénere para cada grupo homólogo de PCB sob a forma de dioxina (em alternativa, deve ser utilizado para o controlo de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina, pelo menos, um congénere para cada função de registo de iões selecionados pela espectrometria de massa). No caso dos métodos de confirmação, deve utilizar-se a totalidade dos 17 padrões internos de PCDD/F substituídos nas posições 2,3,7 e 8 e marcados com 13C e a totalidade dos 12 padrões internos de PCB sob a forma de dioxina marcados com 13C.

6.2.2.   Também devem ser determinados fatores de resposta relativos no caso dos congéneres para os quais não se adiciona um composto análogo marcado com 13C, através da utilização de soluções de calibração adequadas.

6.2.3.   Em relação aos alimentos para animais de origem vegetal e aos alimentos para animais de origem animal que contenham menos de 10 % de gorduras, a adição de padrões internos é obrigatória antes da extração. Em relação aos alimentos para animais de origem animal que contenham mais de 10 % de gorduras, os padrões internos são adicionados antes ou após a extração de gorduras. Deve ser efetuada uma validação adequada da eficácia da extração, dependendo da fase em que são introduzidos os padrões internos e de os resultados serem notificados com base no produto ou nas gorduras.

6.2.4.   Antes da análise por GC-MS, devem ser adicionados 1 ou 2 padrões de recuperação (substitutos).

6.2.5.   É necessário efetuar o controlo da recuperação. Para os métodos de confirmação, as recuperações de cada padrão interno devem situar-se na gama de 60 % a 120 %. São aceitáveis recuperações inferiores ou superiores para congéneres individuais, nomeadamente para algumas dibenzo-p-dioxinas e alguns dibenzofuranos hepta- e octo-clorados, desde que o seu contributo para o valor TEQ não exceda 10 % do valor TEQ total (com base na soma de PCDD/PCDF e PCB sob a forma de dioxina). Para os métodos de pré-seleção GC-MS, as recuperações devem situar-se na gama de 30 % a 140 %.

6.3.   Remoção de substâncias interferentes

—	Deve proceder-se à separação entre PCDD/F e compostos clorados interferentes, tais como PCB não semelhantes a dioxina e éteres difenílicos clorados, através de técnicas cromatográficas adequadas (de preferência, com uma coluna de florisil, alumina e/ou carbono).

—	A separação de isómeros por cromatografia gasosa deve ser < 25 % de pico a pico entre 1,2,3,4,7,8-HxCDF e 1,2,3,6,7,8-HxCDF.

6.4.   Calibração com curva padrão

A gama da curva de calibração deve abranger a gama relevante de limite máximo ou dos níveis de ação.

6.5.   Critérios específicos para métodos de confirmação

—

Para GC-HRMS: — Na HRMS, a resolução deve tipicamente ser igual ou superior a 10 000 para todo o intervalo mássico a 10 % do vale. — O cumprimento de outros critérios de identificação e confirmação tal como descritos em normas reconhecidas internacionalmente, por exemplo, na norma EN 16215:2012 (Alimentação animal — determinação de dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina por GC/HRMS e de PCB indicadores por GC/HRMS) e/ou nos métodos EPA 1613 e 1668, na sua forma revista.

—

Para GC-MS/MS: — Verificação de, pelo menos, 2 iões precursores específicos, cada um com um ião-produto de transição correspondente, para todos os analitos marcados e não marcados no âmbito da análise. — Tolerância máxima permitida nas intensidades relativas de iões de ± 15 % para uma seleção de iões-produto de transição em comparação com os valores calculados ou medidos (média de padrões de calibração), aplicando de condições idênticas naMS/MS, em especial a energia de colisão e a pressão de colisão do gás, para cada transição de um analito. — Resolução para cada quádruplo a definir a um nível igual ou superior à resolução da unidade de massa (resolução da unidade de massa: resolução suficiente para separar dois picos com uma diferença de uma unidade de massa), a fim de reduzir ao mínimo as interferências possíveis sobre os analitos a analisar. — Cumprimento de outros critérios tal como descritos em normas reconhecidas internacionalmente, por exemplo, na norma EN 16215:2012 (Alimentação animal — determinação de dioxinas e de PCB sob a forma de dioxina por GC/HRMS e de PCB indicadores por GC/HRMS) e/ou nos métodos EPA 1613 e 1668, na sua forma revista, exceto a obrigação de utilizar GC-HRMS.

7.   Requisitos específicos para métodos bioanalíticos

Os métodos bioanalíticos são métodos baseados na utilização de princípios biológicos, como ensaios com células, ensaios com recetores ou imunoensaios. O presente ponto 7 estabelece requisitos para os métodos bioanalíticos em geral.

Um método de pré-seleção, em princípio, classifica uma amostra como conforme ou suspeita de ser não conforme. Para tal, o valor BEQ calculado é comparado com o valor-limite (ver 7.3). As amostras abaixo do valor-limite são declaradas conformes, as amostras iguais ou acima do valor-limite são declaradas suspeitas de ser não conformes e necessitam de uma análise por um método de confirmação. Na prática, um valor BEQ correspondente a 2/3 do limite máximo pode servir como valor-limite, desde que assegure uma taxa de falsos resultados conformes inferior a 5 % e uma taxa aceitável de falsos resultados não conformes. Com limites máximos distintos para os PCDD/F e para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina, a verificação da conformidade das amostras sem fracionamento requer valores-limite de bioensaio adequados para os PCDD/F. Para a verificação de amostras que excedam os níveis de ação, uma percentagem adequada do respetivo limiar de intervenção serviria como valor-limite.

Além disso, no caso de determinados métodos bioanalíticos, pode ser dado um nível indicativo expresso em BEQ para amostras na gama de trabalho e excedendo o limite de notificação (ver 7.1.1 e 7.1.6).

7.1.   Avaliação da resposta do teste

7.1.1.   Requisitos gerais

—

O cálculo das concentrações a partir de uma curva de calibração da TCDD apresenta uma grande variação [elevado coeficiente de variação (CV)] dos valores nas extremidades inferior e superior da curva. A gama de trabalho é a área em que este CV é inferior a 15 %. A extremidade inferior da gama de trabalho (limite de notificação) deve ser estabelecida em, pelo menos, três vezes o valor dos ensaios em branco do procedimento. A extremidade superior da gama de trabalho é geralmente representada pelo valor EC70 (70 % da concentração efetiva máxima), mas mais abaixo, caso o CV seja superior a 15 % nesta gama. A gama de trabalho é estabelecida durante a validação. Os valores-limite (ver 7.3) devem situar-se dentro da gama de trabalho.

—

As soluções-padrão e os extratos de amostras devem ser testados, pelo menos, em duplicado. No caso de utilização de duplicados, uma solução-padrão ou um extrato-testemunha testado em 4 a 6 cavidades repartidas ao longo da placa deve produzir uma resposta ou concentração (apenas possível na gama de trabalho) com base num CV < 15 %.

7.1.2.   Calibração

7.1.2.1.   Calibração com curva padrão

—	Podem estimar-se os teores das amostras comparando a resposta do teste com uma curva de calibração da TCDD (ou do PCB 126 ou de uma mistura-padrão de PCDD/F/PCB sob a forma de dioxina) para calcular o valor BEQ no extrato e, posteriormente, na amostra.

—

As curvas de calibração devem conter 8 a 12 concentrações (pelo menos, em duplicado), com concentrações suficientes na parte inferior da curva (gama de trabalho). Será dada especial atenção à qualidade do ajustamento da curva na gama de trabalho. Como tal, o valor R2 tem pouco ou nenhum valor para estimar a adequação do ajustamento em regressão não linear. Um melhor ajustamento será alcançado através de uma minimização da diferença entre os teores calculados e os teores observados na gama de trabalho da curva, por exemplo, reduzindo ao mínimo a soma dos quadrados dos desvios.

—

O teor estimado no extrato de amostra é posteriormente corrigido em função do valor BEQ calculado para uma amostra em branco de matriz/solvente (para ter em conta impurezas provenientes de solventes e produtos químicos utilizados) e da recuperação aparente (calculada a partir do valor BEQ de amostras de referência adequadas com padrões de congéneres representativos próximos do limite máximo ou do limiar de intervenção). Para a correção da recuperação, a recuperação aparente deve situar-se dentro da gama exigida (ver ponto 7.1.4). As amostras de referência utilizadas para a correção da recuperação devem cumprir os requisitos indicados no ponto 7.2.

7.1.2.2.   Calibração com amostras de referência

Em alternativa, pode utilizar-se uma curva de calibração preparada a partir de, pelo menos, quatro amostras de referência (ver ponto 7.2.4: um ensaio branco de matriz e três amostras de referência com 0,5x, 1,0x e 2,0x o limite máximo ou o nível de ação), eliminando a necessidade de correção em função do ensaio em branco e da recuperação. Neste caso, a resposta do teste correspondente a 2/3 do limite máximo (ver ponto 7.3) pode ser calculada diretamente a partir destas amostras e servir de valor-limite. Para a verificação de amostras que excedam os níveis de ação, o valor-limite poderia ser uma percentagem adequada destes níveis de ação.

7.1.3.   Determinação em separado de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina

Os extratos podem ser divididos em frações contendo PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina, permitindo uma indicação separada de valores TEQ (em BEQ) de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina. Convém utilizar, de preferência, uma curva de calibração-padrão do PCB 126 para avaliar os resultados da fração que contém PCB sob a forma de dioxina.

7.1.4.   Recuperações aparentes do bioensaio

A “recuperação aparente do bioensaio” deve ser calculada a partir de amostras de referência adequadas com padrões de congéneres representativos próximos do limite máximo ou do limiar de intervenção e expressa em percentagem do valor BEQ em comparação com o valor TEQ. Em função do tipo de ensaio e do sistema FET (10) utilizado, as diferenças entre os fatores FET e REP relativos aos PCB sob a forma de dioxina podem causar recuperações aparentes baixas para os PCB sob a forma de dioxina em comparação com os PCDD/F. Por conseguinte, no caso de uma determinação em separado de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina, as recuperações aparentes do bioensaio devem ser: para os PCB sob a forma de dioxina, de 20 % a 60 %, para os PCDD/PCDF, de 50 % a 130 % (as gamas aplicam-se à curva de calibração da TCDD). Como o contributo dos PCB sob a forma de dioxina para a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina pode variar entre diferentes matrizes e amostras, as recuperações aparentes do bioensaio para a soma de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina refletem estas gamas e devem situar-se entre 30 % e 130 %. Qualquer implicação que a revisão substantiva dos valores FET tenha para a legislação da União relativa aos PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina exige a revisão destas gamas.

7.1.5.   Controlo das recuperações para a limpeza (clean-up)

A perda de compostos durante a limpeza deve ser verificada durante a validação. Uma amostra em branco enriquecida com uma mistura dos diferentes congéneres deve ser submetida a limpeza (pelo menos, n = 3) e a recuperação e a variabilidade verificadas por um método de confirmação. A recuperação deve situar-se entre 60 % e 120 %, em especial para congéneres que contribuam mais de 10 % para o valor TEQ em várias misturas.

7.1.6.   Limite de notificação

Ao notificar valores BEQ, deve ser determinado um limite de notificação a partir de amostras de matriz pertinentes que envolvam padrões de congéneres típicos, mas não a partir da curva de calibração dos padrões, devido à baixa precisão na gama inferior da curva. Devem ser tidos em conta os efeitos da extração e da limpeza. O limite de notificação deve ser estabelecido em, pelo menos, três vezes o valor dos ensaios em branco do procedimento.

7.2.   Utilização de amostras de referência

7.2.1.   As amostras de referência devem representar a matriz da amostra, os padrões de congéneres e as gamas de concentrações dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina próximos do limite máximo ou do limiar de intervenção.

7.2.2.   Cada série de testes deve comportar um ensaio em branco da matriz e, caso tal não seja possível, um ensaio em branco do procedimento, bem como uma amostra de referência com o limite máximo ou o limiar de intervenção. Estas amostras devem ser extraídas e testadas ao mesmo tempo e em condições idênticas. A amostra de referência deve apresentar uma resposta claramente elevada em comparação com a amostra em branco, assegurando assim a adequação do teste. Estas amostras podem ser utilizadas para as correções em função do ensaio em branco e da recuperação.

7.2.3.   As amostras de referência escolhidas para efetuar uma correção em função da recuperação devem ser representativas das amostras de ensaio, o que significa que os padrões dos congéneres não podem conduzir a uma subestimação dos teores.

7.2.4.   Podem incluir-se amostras de referência suplementares com, por exemplo, teores 0,5x e 2x superiores ao limite máximo ou ao limiar de intervenção, para demonstrar o desempenho correto do teste dentro da gama requerida para o controlo do limite máximo ou do limiar de intervenção. Combinadas, estas amostras podem ser utilizadas para calcular os valores BEQ das amostras de ensaio (ver ponto 7.1.2.2).

7.3.   Determinação de valores-limite

A relação entre os resultados bioanalíticos em BEQ e os resultados do método de confirmação em TEQ deve ser estabelecida, por exemplo, através de experiências de calibração ajustadas em função da matriz, envolvendo amostras de referência enriquecidas a 0, 0,5x, lx e 2x o limite máximo (LM), com seis repetições em cada nível (n = 24)). Os fatores de correção (do ensaio em branco e da recuperação) podem ser estimados a partir desta relação, mas devem ser verificados em conformidade com o ponto 7.2.2.

Devem ser estabelecidos valores-limite para decidir da conformidade da amostra com os limites máximos ou para verificar se os níveis de ação, se relevantes, estão conformes aos respetivos limites máximos ou níveis de ação fixados tanto para os PCDD/F e os PCB sob a forma de dioxina, isoladamente, como para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina. São representados pela extremidade inferior da distribuição dos resultados bioanalíticos (corrigidos em função do ensaio em branco e da recuperação) correspondendo ao limite de decisão do método de confirmação com base num nível de confiança de 95 %, o que implica uma taxa de falsos resultados conformes < 5 %, e uma RSDR < 25 %. O limite de decisão do método de confirmação é o limite máximo, tendo em conta a incerteza de medição.

O valor-limite (em BEQ) pode ser calculado em conformidade com uma das abordagens mencionadas nos pontos 7.3.1, 7.3.2 e 7.3.3 (ver Figura 1).

7.3.1.   Utilização da faixa inferior do intervalo de previsão de 95 % no limite de decisão do método de confirmação:

em que:

BEQDL	o BEQ correspondente ao limite de decisão do método de confirmação, ou seja o limite máximo incluindo a incerteza de medição
sy,x	desvio-padrão residual
t α,f = m-2	fator de Student (α = 5 %, f = graus de liberdade, unilateral)
m	número total de pontos de calibração (índice j)
n	número de repetições em cada nível
xi	concentração da amostra (em TEQ) do ponto de calibração i, determinada por um método de confirmação
	média das concentrações (em TEQ) de todas as amostras de calibração
	parâmetro do quadrado da soma, i = índice do ponto de calibração i

7.3.2.   Cálculo a partir dos resultados bioanalíticos (corrigidos em função do ensaio em branco e da recuperação) de múltiplas análises de amostras (n> 6) contaminadas no limite de decisão do método de confirmação, como a extremidade inferior da distribuição dos dados no valor BEQ médio correspondente:

Valor-limite = BEQDL — 1,64xSDR

em que:

SDR	desvio-padrão dos resultados do bioensaio no BEQDL, medidos em condições de reprodutibilidade intralaboratorial

7.3.3.   Cálculo como valor médio dos resultados bioanalíticos (em BEQ, corrigido em função do ensaio em branco e da recuperação) a partir de análises múltiplas de amostras (n> 6) contaminadas a 2/3 do limite máximo ou do limiar de intervenção, com base na observação de que este nível estará próximo do valor-limite determinado em conformidade com o ponto 7.3.1 ou com o ponto 7.3.2:

Figura 1

Figura 1 Cálculo dos valores-limite com base num nível de confiança de 95 %, o que implica uma taxa de falsos resultados conformes < 5 %, e uma RSDR < 25 %:

1.	a partir da faixa inferior do intervalo de previsão de 95 % no limite de decisão do método de confirmação,

2.	a partir de múltiplas análises de amostras (n≥ 6), contaminadas no limite de decisão do método de confirmação, como a extremidade inferior da distribuição dos dados (representado na figura por uma curva em forma de sino) no valor BEQ médio correspondente.

7.3.4.   Restrições aos valores-limite:

Os valores-limite baseados no valor BEQ, calculados a partir da RSDR obtida durante a validação com um número limitado de amostras com diferentes padrões de matriz/congéneres, podem ser superiores aos limites máximos ou aos níveis de ação baseados no valor TEQ, devido a uma melhor precisão do que a que é possível em análises de rotina quando um espetro desconhecido de possíveis padrões de congéneres tem de ser controlado. Em tais casos, os valores-limite devem ser calculados a partir de uma RSDR = 25 %, ou, de preferência, a dois terços do limite máximo ou do limiar de intervenção.

7.4.   Características de desempenho

7.4.1.   Uma vez que não se podem utilizar padrões internos nos métodos bioanalíticos, devem ser realizados testes de repetibilidade de métodos bioanalíticos para se obter informações sobre o desvio-padrão numa série de testes e entre séries de testes. A repetibilidade deve ser inferior a 20 % e a reprodutibilidade intralaboratorial inferior a 25 %. Tal deve basear-se nos valores calculados em BEQ após correção em função do ensaio em branco e da recuperação.

7.4.2.   Como parte do processo de validação, o teste deve demonstrar que discrimina entre uma amostra em branco e um teor no valor-limite, permitindo a identificação de amostras acima do valor-limite correspondente (ver ponto 7.1.2).

7.4.3.   Devem ser definidos compostos-alvo, eventuais interferências e limites máximos toleráveis para a amostra em branco.

7.4.4.   O desvio-padrão percentual na resposta ou concentração calculada a partir da resposta (apenas possível na gama de trabalho) de uma determinação em triplicado de um extrato da amostra não pode ser superior a 15 %.

7.4.5.   Os resultados não corrigidos das amostras de referência expressos em BEQ (no ensaio em branco e no limite máximo ou limiar de intervenção) devem ser utilizados para a avaliação do desempenho do método bioanalítico durante um período de tempo constante.

7.4.6.   Devem registar-se e verificar-se os gráficos de controlo da qualidade para ensaios em branco do procedimento e para cada tipo de amostra de referência, a fim de garantir que o desempenho analítico está em conformidade com os requisitos, nomeadamente no tocante aos ensaios em branco do procedimento, no que respeita à diferença mínima requerida em relação à extremidade inferior da gama de trabalho, e, no tocante às amostras de referência, no que respeita à reprodutibilidade intralaboratorial. Os ensaios em branco do procedimento devem ser controlados de modo a evitar falsos resultados conformes quando subtraídos.

7.4.7.   Os resultados das amostras suspeitas obtidas pelos métodos de confirmação e 2 % a 10 % das amostras conformes (mínimo de 20 amostras por matriz) devem ser recolhidos e utilizados para avaliar o desempenho do método de pré-seleção e a relação entre BEQ e TEQ. Esta base de dados pode ser utilizada para efeitos de reavaliação de valores-limite aplicáveis às amostras de rotina para as matrizes validadas.

7.4.8.   Os bons desempenhos do método podem também ser demonstrados pela participação em ensaios interlaboratoriais. Os resultados de amostras analisadas em ensaios interlaboratoriais, abrangendo uma gama de concentrações que pode atingir, por exemplo, 2x o limite máximo, podem ser incluídos na avaliação da taxa de falsos resultados conformes, se um laboratório estiver em condições de demonstrar os seus bons desempenhos. As amostras devem abranger os padrões de congéneres mais frequentes, que representem diferentes fontes.

7.4.9.   Em caso de incidentes, os valores-limite podem ser reavaliados, refletindo a matriz e os padrões de congéneres específicos para cada incidente.

8.   Notificação dos resultados

8.1.   Métodos de confirmação

8.1.1.   Na medida em que o procedimento analítico utilizado o permita, os resultados analíticos devem conter os teores de cada congénere de PCDD/F e PCB sob a forma de dioxina e ser notificados em termos de limite inferior, limite superior e limite médio, a fim de incluir o máximo de informações possível na notificação dos resultados e, deste modo, permitir a interpretação dos resultados de acordo com requisitos específicos.

8.1.2.   O relatório deve incluir o método utilizado para a extração dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina.

8.1.3.   As recuperações de cada padrão interno devem ser disponibilizadas no caso de as recuperações estarem fora da gama mencionada no ponto 6.2.5, se o limite máximo for excedido (neste caso, as recuperações para uma das duas análises em duplicado) e noutros casos mediante pedido.

8.1.4.   Como a incerteza de medição deve ser tida em conta ao decidir da conformidade de uma amostra, este parâmetro deve ser disponibilizado. Assim, os resultados analíticos devem ser notificados enquanto x +/- U, em que x é o resultado analítico e U é a incerteza expandida de medição, utilizando um fator de expansão de 2, o que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %. No caso de uma determinação em separado dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina, a soma da incerteza expandida estimada dos resultados analíticos separados dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina deve ser utilizada para a soma dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina.

8.1.5.   Se a incerteza de medição for tida em conta mediante a aplicação de um CCα (tal como descrito no ponto 2.2 do capítulo I da presente parte B), este parâmetro deve ser mencionado.

8.1.6.   Os resultados devem ser expressos nas mesmas unidades e com, pelo menos, o mesmo número de algarismos significativos que os limites máximos definidos na Diretiva 2002/32/CE.

8.2.   Métodos bioanalíticos de pré-seleção

8.2.1.   O resultado da pré-seleção deve ser expresso como “conforme” ou “suspeito de ser não conforme” (“suspeito”).

8.2.2.   Além disso, pode ser dado um resultado de PCDD/F e/ou de PCB sob a forma de dioxina expresso em BEQ, e não TEQ.

8.2.3.   As amostras com uma resposta inferior ao limite de notificação devem ser indicadas como “inferiores ao limite de notificação”.

8.2.4.   Para cada tipo de matriz da amostra, o relatório deve mencionar o limite máximo ou o limiar de intervenção em que se baseia a avaliação.

8.2.5.   O relatório deve mencionar o tipo de teste aplicado, o princípio de base do teste e o tipo de calibração.

8.2.6.   O relatório deve incluir o método utilizado para a extração dos PCDD/F e dos PCB sob a forma de dioxina.

8.2.7.   Em caso de amostras suspeitas de não conformidade, o relatório deve incluir uma nota sobre as medidas a adotar. É necessário que a concentração de PCDD/F e a soma de PCDD/F e de PCB sob a forma de dioxina nas amostras com teores elevados seja determinada/confirmada por um método de confirmação.

CAPÍTULO III

Preparação de amostras e requisitos respeitantes aos métodos de análise utilizados no controlo oficial dos teores de PCB não semelhantes a dioxinas (PCB # 28, 52, 101, 138, 153 e 180)

1.   Âmbito de aplicação

Os requisitos expostos no presente capítulo devem ser aplicados quando se analisarem alimentos para animais para efeitos de controlo oficial dos teores de bifenilos policlorados não semelhantes a dioxinas (PCB não semelhantes a dioxinas) e para outros fins regulamentares.

2.   Métodos de deteção aplicáveis

Cromatografia gasosa/Deteção por captura de eletrões (GC-ECD), GC-LRMS, GC-MS/MS, GC-HRMS ou métodos equivalentes.

3.   Identificação e confirmação dos analitos requeridos

3.1.   Tempo de retenção relativo em relação a padrões internos ou padrões de referência (desvio aceitável de +/- 0,25 %).

3.2.   Deve confirmar-se que houve separação, por cromatografia gasosa, entre os seis PCB indicadores (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 e PCB 180) e as substâncias interferentes, especialmente PCB co-eluídos, em especial se os teores das amostras se situarem na gama dos limites legais e da não conformidade.

[Os congéneres que co-eluem frequentemente são, por exemplo, PCB 28/31, PCB 52/69 e PCB 138/163/164. Em relação à GC-MS, devem também ter-se em conta as eventuais interferências de fragmentos de congéneres mais fortemente clorados.]

3.3.   Requisitos aplicáveis a técnicas GC-MS

Verificação de, pelo menos:

a)	dois iões específicos, para a HRMS,

b)	dois iões específicos de m/z > 200 ou três iões específicos de m/z > 100 para a LRMS,

c)	1 precursor e 2 iões-produto para a MS-MS.

Tolerâncias máximas permitidas para os rácios de abundância relativos a fragmentos de massa selecionados:

Desvio relativo do rácio de abundância de fragmentos de massa selecionados em relação à abundância teórica ou ao padrão de calibração de iões-alvo (ião mais abundante controlado) e de iões qualificadores:

Intensidade relativa de iões qualificadores em relação aos iões-alvo	GC-EI-MS (desvio relativo)	GC-CI-MS, GC-MSn (desvio relativo)
>50 %	± 10 %	± 20 %
>20 % a 50 %	± 15 %	± 25 %
>10 % a 20 %	± 20 %	± 30 %
≤ 10 %	± 50 % (11)	± 50 % (11)

3.4.   Requisitos para técnicas de GC-ECD

Devem confirmar-se os resultados que excedem a tolerância por meio de duas colunas de GC com fases estacionárias de polaridade diferente.

4.   Demonstração do desempenho do método

Deve validar-se o desempenho do método na gama do limite máximo (0,5 a 2 vezes o limite máximo) com um coeficiente de variação aceitável para análises repetidas (ver requisitos aplicáveis à precisão intermédia mencionados no ponto 9).

5.   Limite de quantificação

Os valores dos ensaios em branco não devem ser superiores a 30 % do nível de contaminação correspondente ao teor máximo (12).

6.   Controlo de qualidade

Controlos regulares com ensaios em branco, análise de amostras enriquecidas, amostras de controlo da qualidade, participação em estudos interlaboratoriais em matrizes relevantes.

7.   Controlo das recuperações

7.1.   Devem utilizar-se padrões internos adequados, com propriedades físico-químicas comparáveis às dos analitos requeridos.

7.2.   Adição de padrões internos:

Adição a produtos (antes do processo de extração e limpeza).

7.3.   Requisitos aplicáveis a métodos que utilizem os seis congéneres de PCB indicadores marcados com isótopos:

a)	os resultados devem ser corrigidos em função das recuperações de padrões internos,

b)	as recuperações de padrões internos marcados com isótopos devem situar-se entre 50 % e 120 %,

c)	são aceitáveis recuperações inferiores ou superiores para congéneres individuais cujo contributo para a soma dos seis PCB indicadores seja inferior a 10 %.

7.4.   Requisitos aplicáveis a métodos que não utilizem os seis padrões internos marcados com isótopos ou que utilizem outros padrões internos:

a)	a recuperação de padrões internos deve ser controlada para cada amostra,

b)	as recuperações de padrões internos devem situar-se entre 60 % e 120 %,

c)	os resultados devem ser corrigidos em função das recuperações de padrões internos,

7.5.   As recuperações de congéneres não marcados devem ser verificadas com amostras enriquecidas ou amostras de controlo da qualidade com concentrações na gama do limite máximo. Consideram-se aceitáveis as recuperações destes congéneres se se situarem entre 70 % e 120 %.

8.   Requisitos aplicáveis aos laboratórios

Em conformidade com o disposto no Regulamento (CE) n.o 882/2004, os laboratórios devem ser acreditados por um organismo reconhecido que opere em conformidade com o Guia ISO 58, a fim de assegurar que aplicam a garantia de qualidade analítica. Os laboratórios devem ser acreditados em conformidade com a norma EN ISO/IEC 17025.

9.   Características de desempenho: critérios aplicáveis à soma dos seis PCB indicadores no limite máximo

Rigor	- 30 % a + 30 %
Precisão intermédia (RSD %)	≤ 20 %
Diferença do cálculo entre o limite superior e o limite inferior	≤ 20 %

10.   Notificação dos resultados

10.1.   Na medida em que o procedimento analítico utilizado o permita, os resultados analíticos devem conter os níveis de cada congénere de PCB e ser indicados como limite inferior, limite superior e limite médio, a fim de incluir o máximo de informações possível na notificação dos resultados e, deste modo, permitir a interpretação dos resultados de acordo com requisitos específicos.

10.2.   Deve constar da notificação o método utilizado na extração de PCB e de lípidos.

10.3.   As recuperações de cada padrão interno devem ser disponibilizadas no caso de as recuperações estarem fora da gama mencionada no ponto 7, se o limite máximo for excedido e noutros casos mediante pedido.

10.4.   Como a incerteza de medição deve ser tida em conta ao decidir da conformidade de uma amostra, este parâmetro deve igualmente ser disponibilizado. Assim, os resultados analíticos devem ser notificados enquanto x +/- U, em que x é o resultado analítico e U é a incerteza expandida de medição, utilizando um fator de expansão de 2, o que permite obter um nível de confiança de cerca de 95 %.

10.5.   Se a incerteza de medição for tida em conta mediante a aplicação de um CCα (tal como descrito no ponto 2.1 do capítulo I), este parâmetro deve ser mencionado.

10.6.   Os resultados devem ser expressos nas mesmas unidades e com, pelo menos, o mesmo número de algarismos significativos que os limites máximos definidos na Diretiva 2002/32/CE.»