„BIJLAGE C

BRUCELLOSE

1.   IDENTIFICATIE VAN HET AGENS

Wanneer aan de hand van een gemodificeerde zuurvaste kleurmethode of een specifieke immuunkleuring de aanwezigheid van morfologisch op Brucella gelijkende micro-organismen kan worden aangetoond in abortusmateriaal, vaginale secreties of melk, geldt dat als afdoende bewijs van brucellose, vooral wanneer deze bevinding wordt ondersteund door de resultaten van serologische tests. De methoden op basis van de polymerasekettingreactie (PCR) bieden extra detectiemogelijheden.

Wanneer mogelijk moet Brucella spp. worden geïsoleerd met behulp van algemene of selectieve media door cultuur uit baarmoedersecretie, geaborteerde foetussen, uiersecretie of geselecteerde weefsels, zoals lymfeknopen en mannelijke en vrouwelijke voortplantingsorganen.

Na isolatie moeten de soort en de biovar worden geïdentificeerd door middel van bacteriofaaglysistests en/of oxidatieve metabolismetests, dan wel culturele, biochemische en serologische criteria van het isolaat. PCR kan zowel een complementaire als een biotyperingsmethode op basis van specifieke genoomsequenties verschaffen.

De gebruikte technieken en media, de standaardisering ervan en de interpretatie van de resultaten moeten in overeenstemming zijn met het Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals van de OIE, zesde editie, 2008, hoofdstuk 2.4.3 (runderbrucellose), hoofdstuk 2.7.2 (schapen- en geitenbrucellose) en hoofdstuk 2.8.5 (varkensbrucellose).

2.   IMMUNOLOGISCHE TESTS

2.1.   Standaarden

2.1.1.   Voor de bereiding van alle antigenen voor gebruik in de Bengaals-roodtest (BRT), de serumagglutinatietest (SAT), de complementbindingsreactie (CBR) en de Abortus-Bang-ringtest (ABR) moet gebruik worden gemaakt van de Weybridgestam nr. 99 of de USDA-stam 1119-3 van Brucella abortus biovar 1.

2.1.2.   Het standaardreferentieserum voor de BRT, de SAT, de CBR en de ABR is het internationale referentiestandaardserum van de OIE (OIEISS) dat vroeger bekend stond onder de naam WHO tweede internationaal anti-Brucella-abortusserum (ISAbS).

2.1.3.   De standaardreferentiesera voor enzymgekoppelde immuunadsorbent-tests (ELISA’s) zijn:

—	het OIEISS,

—	het zwak positieve OIE ELISA standaardserum (OIEELISAWPSS),

—	het sterk positieve OIE ELISA standaardserum (OIEELISASPSS),

—	het negatieve OIE ELISA standaardserum (OIEELISANSS).

2.1.4.   De standaardreferentiesera voor fluorescentiepolarisatietests (FPA’s) zijn:

—	het zwak positieve OIE ELISA standaardserum (OIEELISAWPSS),

—	het sterk positieve OIE ELISA standaardserum (OIEELISASPSS),

—	het negatieve OIE ELISA standaardserum (OIEELISANSS).

2.1.5.   De onder 2.1.3 en 2.1.4 genoemde standaardsera zijn verkrijgbaar bij het communautaire referentielaboratorium voor brucellose of het Veterinary Laboratories Agency (VLA), Weybridge, Verenigd Koninkrijk.

2.1.6.   Het OIEISS, het OIEELISAWPSS, het OIEELISASPSS en het OIEELISANSS zijn de internationale primaire standaarden, waarvan een secundaire nationale referentiestandaard („werkstandaard”) moet worden afgeleid voor elke in 2.1.1 genoemde test die in een lidstaat wordt gebruikt.

2.2.   Enzymgekoppelde immuunadsorbent-tests (ELISA’s) of andere bindingstests voor de opsporing van runderbrucellose in serum of melk

2.2.1.   Materiaal en reagentia

De gebruikte techniek en de interpretatie van de resultaten moeten zijn gevalideerd overeenkomstig de principes die zijn vastgelegd in hoofdstuk 1.1.4 van het Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals van de OIE, zesde editie, 2008, en moeten ten minste laboratoriumonderzoek en diagnostisch onderzoek omvatten.

2.2.2.   Standaardisatie van de test

2.2.2.1.   Standaardisatie van de testprocedure voor individuele serummonsters:

a)	een 1/150 voorverdunning (1) van het OIEISS of een 1/2 voorverdunning van het OIEELISAWPSS of een 1/16 voorverdunning van het OIEELISASPSS in negatief serum (of in een negatief mengmonster van sera) moet positief reageren;

b)	een 1/600 voorverdunning van het OIEISS of een 1/8 voorverdunning van het OIEELISAWPSS of een 1/64 voorverdunning van het OIEELISASPSS in negatief serum (of in een negatief mengmonster van sera) moet negatief reageren;

c)	het OIEELISANSS moet steeds negatief reageren.

2.2.2.2.   Standaardisatie van de testprocedure voor mengmonsters van sera:

a)

een 1/150 voorverdunning van het OIEISS of een 1/2 voorverdunning van het OIEELISAWPSS of een 1/16 voorverdunning van het OIEELISASPSS in negatief serum (of in een negatief mengmonster van sera) en vervolgens opnieuw verdund in negatieve sera met een factor die overeenkomt met het aantal monsters in het mengmonster, moet positief reageren;

b)	het OIEELISANSS moet steeds negatief reageren;

c)	de test moet toereikend zijn voor het aantonen van een infectie bij één dier van de groep dieren waarvan de serummonsters tot een mengmonster zijn samengevoegd.

2.2.2.3.   Standaardisatie van de testprocedure voor mengmonsters van melk of wei:

a)	een 1/1 000 voorverdunning van het OIEISS of een 1/16 voorverdunning van het OIEELISAWPSS of een 1/125 voorverdunning van het OIEELISASPSS in negatief serum (of in een negatief mengmonster van sera) en vervolgens opnieuw verdund in een verhouding 1/10 in negatieve melk, moet positief reageren;

b)	het OIEELISANSS, verdund in een verhouding 1/10 in negatieve melk, moet steeds negatief reageren;

c)	de test moet toereikend zijn voor het aantonen van een infectie bij één dier van een groep dieren waarvan de melk- of weimonsters tot een mengmonster zijn samengevoegd.

2.2.3.   Voorschriften voor het gebruik van de ELISA’s voor de diagnose van runderbrucellose

2.2.3.1.   Bij toepassing van de in de punten 2.2.2.1 en 2.2.2.2 voor serummonsters genoemde kalibratievoorschriften voor ELISA’s, met inachtneming van de epizoötiologische situatie waarin de test wordt toegepast, moet de diagnostische gevoeligheid van de ELISA ten minste gelijk zijn aan die van de BRT of de CBR.

2.2.3.2.   Bij toepassing van de in punt 2.2.2.3 voor mengmonsters van melk genoemde kalibratievoorschriften voor de ELISA, met inachtneming van niet alleen de epizoötiologische situatie maar ook de gemiddelde en de te verwachten extreme veehouderijsystemen, moet de diagnostische gevoeligheid van de ELISA ten minste gelijk zijn aan die van de ABR.

2.2.3.3.   Wanneer een ELISA wordt gebruikt voor certificeringsdoeleinden overeenkomstig artikel 6, lid 1, of voor het bepalen en handhaven van de gezondheidsstatus van een beslag overeenkomstig bijlage A, deel II, punt 10, moet het vormen van mengmonsters van serum zo worden uitgevoerd dat de testresultaten onomstotelijk kunnen worden gerelateerd aan elk individueel dier in het mengmonster. Tests ter bevestiging moeten worden uitgevoerd op serummonsters van individuele dieren.

2.2.3.4.   De ELISA’s kunnen worden gebruikt op een verzamelmelkmonster genomen op een bedrijf met ten minste 30 % lacterende melkkoeien. Indien die methode wordt toegepast, moeten maatregelen worden genomen om ervoor te zorgen dat de voor onderzoek genomen monsters onomstotelijk kunnen worden gerelateerd aan elk individueel dier waarvan melk is verkregen. Tests ter bevestiging moeten worden uitgevoerd op serummonsters van individuele dieren.

2.3.   Complementbindingsreactie (CBR)

2.3.1.   Het antigeen bestaat uit een bacteriesuspensie in een fysiologische zoutoplossing (0,85 % NaCl (m/v)) met 0,5 % (v/v) fenol), of in een veronalbufferoplossing. De antigenen mogen geconcentreerd worden aangeleverd, op voorwaarde dat op het etiket van de fles de vereiste verdunningsfactor is aangegeven. Het antigeen moet worden opgeslagen bij 4 °C en mag niet worden bevroren.

2.3.2.   De sera moeten als volgt worden geïnactiveerd:

—	runderserum: 30-50 minuten bij 56-60 °C,

—	varkensserum: 30-50 minuten bij 60 °C.

2.3.3.   Voor het verkrijgen van een juiste reactie dient een complementdosis te worden gebruikt die groter is dan de voor een volledige hemolyse vereiste minimumdosis.

2.3.4.   Bij de uitvoering van de complementbindingsreactie moeten telkens de volgende controles worden verricht:

a)	controle van het anticomplementaire effect van het serum;

b)	controle van het antigeen;

c)	controle van de gesensibiliseerde rode bloedcellen;

d)	controle van het complement;

e)	controle van de gevoeligheid met gebruikmaking van een positief controleserum vanaf het begin van de reactie;

f)	controle van de specificiteit van de reactie met gebruikmaking van een negatief serum.

2.3.5.   Berekening van de resultaten

Het OIEISS bevat 1 000 internationale complementbindingsreactie-eenheden (ICFTU) per ml. Indien het OIEISS wordt getest met een bepaalde methode wordt het resultaat gegeven als een titer (d.w.z. de hoogste directe verdunning van het OIEISS die resulteert in 50 % hemolyse, TOIEISS). Het als titer (TTESTSERUM) weergegeven testresultaat voor het testserum moet worden uitgedrukt in ICFTU per ml. De factor (F) die nodig is om de titer van een onbekend testserum (TTESTSERUM) dat met die methode is getest om te rekenen in ICFTU, wordt verkregen aan de hand van de formule:

F = 1 000 × 1/TOIEISS

en de hoeveelheid ICFTU per ml testserum (ICFTUTESTSERUM) aan de hand van de formule:

ICFTUTESTSERUM = F × TTESTSERUM

2.3.6.   Interpretatie van de resultaten

Een serum met 20 of meer ICFTU per ml wordt als positief aangemerkt.

2.4.   Abortus-Bang-ringtest (ABR)

2.4.1.   Het antigeen bestaat uit een bacteriesuspensie in een fysiologische zoutoplossing (0,85 % NaCl (m/v)) met 0,5 % (v/v) fenol), gekleurd met hematoxyline. Het antigeen moet worden opgeslagen bij 4 °C en mag niet worden bevroren.

2.4.2.   De gevoeligheid van het antigeen moet worden gestandaardiseerd ten opzichte van het OIEISS op zodanige wijze dat een 1/500 verdunning van het OIEISS in negatieve melk positief reageert, terwijl een 1/1 000 verdunning negatief reageert.

2.4.3.   De ringtest moet worden uitgevoerd op monsters die zijn genomen uit de inhoud van elke melkbus of uit de inhoud van elke melktank van het bedrijf.

2.4.4.   De melkmonsters mogen niet bevroren noch verhit zijn en mogen evenmin heftig zijn geschud.

2.4.5.   De reactie moet worden uitgevoerd volgens een van de volgende methoden:

—	op een melkkolom met een hoogte van ten minste 25 mm en op een hoeveelheid melk van 1 ml waaraan 0,03 ml, dan wel 0,05 ml van een gestandaardiseerd gekleurd antigeen is toegevoegd;

—	op een melkkolom met een hoogte van ten minste 25 mm en op een hoeveelheid melk van 2 ml waaraan 0,05 ml van een gestandaardiseerd gekleurd antigeen is toegevoegd;

—	op een hoeveelheid melk van 8 ml waaraan 0,08 ml van een gestandaardiseerd gekleurd antigeen is toegevoegd.

2.4.6.   Het mengsel van melk en antigeen moet gedurende 60 minuten bij 37 °C worden geïncubeerd, samen met de positieve en de negatieve werkstandaarden. Een daaropvolgende incubatie bij 4 °C gedurende 16 à 24 uur verhoogt de gevoeligheid van de test.

2.4.7.   Interpretatie van de resultaten:

a)	negatieve reactie: gekleurde melk, kleurloze room;

b)	positieve reactie: — melk en room op gelijke wijze gekleurd, of — kleurloze melk en gekleurde room.

2.5.   Gebufferde brucella-antigeentest (Bengaals-roodtest (BRT))

2.5.1.   Het antigeen bestaat uit een bacteriesuspensie in een gebufferde brucella-antigeen-verdunningsvloeistof met een pH van 3,65 ± 0,05, gekleurd met Bengaals rood. Het antigeen wordt gebruiksklaar aangeleverd, moet worden opgeslagen bij 4 °C en mag niet worden bevroren.

2.5.2.   Het antigeen wordt bereid zonder rekening te houden met de celconcentratie, maar de gevoeligheid ervan moet worden gestandaardiseerd ten opzichte van het OIEISS op zodanige wijze dat een verdunning van 1/45 van het OIEISS positief reageert en een verdunning van 1/55 negatief reageert.

2.5.3.   De BRT wordt uitgevoerd op de volgende manier:

a)

20-30 μl serum wordt gemengd met eenzelfde volume antigeen op een wit plaatje of op een emailplaatje zodat een diameter van ongeveer 2 cm wordt verkregen. Het mengsel wordt zachtjes geschud gedurende 4 minuten bij omgevingstemperatuur en wordt vervolgens bij goede verlichting onderzocht op agglutinatie;

b)	er mag een geautomatiseerde methode worden gebruikt maar die moet ten minste even gevoelig en nauwkeurig zijn als de manuele methode.

2.5.4.   Interpretatie van de resultaten

Elke zichtbare reactie wordt als positief beschouwd, tenzij er sprake is van overmatige droging aan de randen.

In elke testserie moeten positieve en negatieve werkstandaarden worden opgenomen.

2.6.   Serumagglutinatietest (SAT)

2.6.1.   Het antigeen bestaat uit een bacteriesuspensie in een fysiologische zoutoplossing (0,85 % NaCl (m/v)) met 0,5 % (v/v) fenol).

Er mag geen formaldehyde worden gebruikt.

De antigenen mogen geconcentreerd worden aangeleverd, op voorwaarde dat op het etiket van de fles de vereiste verdunningsfactor is aangegeven.

Aan de antigeensuspensie mag EDTA worden toegevoegd tot een concentratie van 5 mM in de te testen eindverdunning, teneinde het aantal valspositieve resultaten met de serumagglutinatietest te verminderen. Vervolgens moet de pH van de antigeensuspensie worden bijgesteld tot 7,2.

2.6.2.   Het OIEISS bevat 1 000 internationale agglutinatie-eenheden.

2.6.3.   Het antigeen wordt bereid zonder rekening te houden met de celconcentratie, maar de gevoeligheid ervan moet worden gestandaardiseerd ten opzichte van het OIEISS op zodanige wijze dat hetzij een 50 %-agglutinatie optreedt bij een eindverdunning van het OIEISS tussen 1/600 en 1/1 000, hetzij een 75 %-agglutinatie bij een eindverdunning van het OIEISS tussen 1/500 en 1/750.

Het verdient aanbeveling de reactiviteit van nieuwe batches antigeen te vergelijken met reeds vroeger gestandaardiseerde batches antigeen, met gebruikmaking van een set van welomschreven sera.

2.6.4.   De test wordt uitgevoerd in buisjes of in microtiterplaten. Het mengsel van antigeen en serumverdunningen wordt gedurende 16 à 24 uur bij 37 °C geïncubeerd.

Van elk serum moeten ten minste drie verdunningen worden aangelegd. Verdacht serum moet zo worden verdund dat de minimale positieve waarde in het middelste buisje (of het middelste putje van de verdunningsreeks in een microtiterplaat) wordt afgelezen.

2.6.5.   Interpretatie van de resultaten

Het testresultaat van de agglutinatie van een serum wordt uitgedrukt in internationale eenheden (IE) per ml.

Een serum dat ten minste 30 IE per ml bevat, wordt als positief beschouwd.

2.7.   Fluorescentiepolarisatietest (FPA)

2.7.1.   De FPA kan worden uitgevoerd in glazen buisjes of een microtiterplaat met 96 putjes. De gebruikte techniek, de standaardisatie ervan en de interpretatie van de resultaten moeten overeenstemmen met hoofdstuk 2.4.3 (runderbrucellose) van het Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals van de OIE, zesde editie, 2008.

2.7.2.   Standaardisatie van de test

De FPA wordt zo gestandaardiseerd dat:

a)	het OIEELISASPSS en het OIEELISAWPSS consequent positieve resultaten geven.

b)	een 1/8 voorverdunning van het OIEELISAWPSS of een 1/64 voorverdunning van het OIEELISASPSS in negatief serum (of in een negatief mengmonster van sera) steeds negatief reageert;

c)	het OIEELISANSS steeds negatief reageert.

In elke partij tests moeten zijn opgenomen: een sterk positief, een zwak positief en een negatief werkstandaardserum (gekalibreerd ten opzichte van de ELISA-standaardsera van de OIE).

3.   AANVULLENDE TESTS

3.1.   Brucellinetest (Brucellosis Skin Test, BST)

3.1.1.   Voorschriften voor het gebruik van de brucellinetest

a)	De brucellinetest mag niet worden gebruikt in het kader van de certificering voor het intracommunautaire handelsverkeer.

b)	De brucellinetest is een van de meest specifieke tests voor de opsporing van brucellose bij niet-gevaccineerde dieren, maar de diagnose mag niet worden gesteld op basis van positieve intradermale reacties alleen.

c)	Runderen die negatief hebben gereageerd bij een van de in deze bijlage omschreven serologische tests en die positief reageren bij de brucellinetest, worden als besmet of als vermoedelijk besmet beschouwd.

d)

Runderen die positief hebben gereageerd bij een van de in deze bijlage omschreven serologische tests, kunnen aan een brucellinetest worden onderworpen om de interpretatie van de resultaten van de serologische test te bevestigen, vooral wanneer bij brucellosevrije of officieel brucellosevrije beslagen een kruisreactie met antilichamen tegen andere bacteriën niet kan worden uitgesloten.

3.1.2.   De test moet worden uitgevoerd met gebruikmaking van een gestandaardiseerd en gedefinieerd brucellinepreparaat dat geen glad lipopolysacharide(LPS)-antigeen bevat, aangezien dat een niet-specifieke ontstekingsreactie kan veroorzaken of het resultaat van latere serologische tests kan beïnvloeden.

De productievoorschriften voor brucelline moeten beantwoorden aan deel C1 van hoofdstuk 2.4.3 van het Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals van de OIE, zesde editie, 2008.

3.1.3.   Testprocedure

3.1.3.1.   Een hoeveelheid van 0,1 ml brucelline wordt intradermaal geïnjecteerd in de staartplooi, de flankhuid of de zijkant van de nek.

3.1.3.2.   De test wordt afgelezen na 48 à 72 uur.

3.1.3.3.   De dikte van de huid op de plaats van injectie wordt vóór de injectie en bij aflezing met een schuifmaat gemeten.

3.1.3.4.   Interpretatie van de resultaten:

Sterke reacties worden gemakkelijk herkend aan de hand van de lokale zwelling en verharding.

Een huidverdikking van 1,5 à 2 mm moet worden beschouwd als een positieve reactie op de brucellinetest.

3.2.   Competitie-ELISA (cELISA) Voorwaarden voor het gebruik van de cELISA

3.2.1.   Voorschriften voor het gebruik van de cELISA

De cELISA mag niet worden gebruikt in het kader van de certificering voor het intracommunautaire handelsverkeer.

Runderen die positief hebben gereageerd bij een van de in deze bijlage omschreven serologische tests, kunnen aan een cELISA worden onderworpen om de interpretatie van de resultaten van de andere serologische tests te bevestigen, vooral wanneer bij brucellosevrije of officieel brucellosevrije beslagen een kruisreactie met antilichamen tegen andere bacteriën niet kan worden uitgesloten of voor het elimineren van reacties door residuele antilichamen die zijn geproduceerd als gevolg van vaccinatie met S19.

3.2.2.   Testprocedure

De test moet worden uitgevoerd zoals vastgelegd onder B, punt 2, van hoofdstuk 2.4.3 van het Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals van de OIE, zesde editie, 2008.”.