I PRIEDAS

BAKTERIJOS CLAVIBACTER MICHIGANENSIS (Smith) Davis et al. ssp. SEPEDONICUS (Spieckermann et Kotthoff) Davis et al., SUKELIANČIOS ŽIEDINĮ PUVINĮ, DIAGNOZAVIMO, NUSTATYMO IR IDENTIFIKAVIMO TYRIMO PLANAS

TYRIMO PLANO TAIKYMO SRITIS

Pateiktame plane aprašomos įvairios procedūros, taikomos:

i)	bulvių stiebagumbių ir augalų žiedinio puvinio diagnozei;

ii)	Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus bulvių stiebagumbiuose ir augaluose nustatyti;

iii)	Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus (C. m. subsp. sepedonicus) identifikuoti.

PAGRINDINIAI PRINCIPAI

Įvairios tinkamiausios metodikos, patvirtinti reagentai ir duomenys apie pasirengimą testui bei kontrolines medžiagas pateikiami priedėliuose. Laboratorijų, dalyvavusių optimizuojant ir tvirtinant metodikas, sąrašas pateikiamas 1 priedėlyje.

Metodikose numatyta karantine laikomą organizmą ir gyvybingas C.m. subsp. sepedonicus kultūras naudoti kaip kontrolines medžiagas, todėl tinkamomis karantino sąlygomis ir oficialių augalų karantino įstaigų išduotose licencijose atitinkamomis nurodytomis sąlygomis reikės atlikti procedūras, taikant atitinkamą atliekų pašalinimo metodą.

Testavimo parametrai privalo užtikrinti nuolatinį ir atkartojamą C. m. subsp. sepedonicus aptikimo lygmenį, esant nustatytoms pasirinktų metodų detekcijos slenkstinėms riboms.

Privaloma tiksliai paruošti teigiamas kontrolines medžiagas.

Atliekant tyrimą atsižvelgus į reikalaujamas metodo jautrumo slenkstines ribas taip pat daroma prielaida, kad reikia pasirinkti teisingus nustatymus, atlikti įrangos kalibravimą ir techninę priežiūrą, rūpestingai tvarkyti ir saugoti reagentus ir imtis visų priemonių, kad būtų išvengta kryžminio bandinių užsikrėtimo, t. y. teigiamus kontrolinius bandinius atskirti nuo tiriamųjų bandinių. Siekiant išvengti administracinių ir kitokių klaidų, ypač susijusių su ženklinimu etiketėmis ir dokumentų tvarkymu, privaloma taikyti kokybės kontrolės standartus.

Įtarus organizmo buvimą, kaip nurodyta Direktyvos 93/85/EEB 4 straipsnio 2 dalyje, daroma prielaida, kad atliekant bandinio diagnostinį arba atrankos testą gaunamas teigiamas rezultatas, kaip nurodyta vaizduojamose diagramose.

Jei pirmojo atrankos testo (IF arba PGR/FISH) rezultatas teigiamas, tai įtariamas užkrėtimas C. m. subsp. sepedonicus ir privaloma atlikti antrąjį atrankos testą. Jei antrojo atrankos testo rezultatas teigiamas, tai įtarimas (įtariamas organizmo buvimas) patvirtinamas ir būtina toliau atlikti tyrimą pagal nurodytą planą. Jei antrojo atrankos testo rezultatas neigiamas, tada bandinys nėra laikomas užkrėstu C. m. subsp. sepedonicus.

Taigi 4 straipsnio 2 dalyje nurodyto IF testo rezultatas yra teigiamas, kaip apibrėžta pagal IF testo parodymus, patvirtintus atlikus atrankos testą (PGR/FISH).

Jei organizmo buvimas patvirtinamas, tai padaroma prielaida, kaip nurodyta Direktyvos 93/85/EEB 5 straipsnio 1 dalyje, kad buvo išskirta ir identifikuota patogeninė grynoji C. m. subsp. sepedonicus kultūra.

1.   VAIZDUOJAMOSIOS DIAGRAMOS PRISTATYMAS

1.1.   Žiedinio puvinio diagnozavimo bulvių stiebagumbiuose ir augaluose planas

Ši tyrimo tvarka taikoma tiriant bulvių stiebagumbius ir augalus, turinčius arba įtariamus turint tipinių žiedinio puvinio simptomų. Ją taikant atliekamas greitosios atrankos testas, patogeno išskyrimas iš užkrėsto vaskuliarinio audinio ir pasėjimas į kultūrinę terpę ir, gavus teigiamą rezultatą, C. m. subsp. sepedonicus kultūros identifikavimas.

1.2.   Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus nustatymo ir identifikavimo besimptomiuose bulvių stiebagumbių bandiniuose planas

Principas

Testavimo tvarka skirta bulvių stiebagumbių latentinėms infekcijoms nustatyti. Išskiriant patogeną, ypač tipiškų kolonijų atveju, o vėliau tvirtinant jo kolonijų grynumą, kaip C. m. subsp. sepedonicus atveju, privaloma papildomai atlikti du atrankos testus, pagrįstus skirtingais biologijos principais, ir gauti teigiamą rezultatą. Tik vieno atrankos testo teigiamo rezultato nepakanka, kad būtų galima įtarti bandinį.

Atrankos ir išskyrimo testų slenkstinė nustatymo jautrumo riba turėtų siekti 103–104 ląstelių/ml pakartotinai suspenduotose nuosėdose, naudojamose kaip teigiami kontroliniai bandiniai atliekant kiekvieną testų seriją.

1.3.   Clavibacter michiganensis ssp. sepedonicus nustatymo ir identifikavimo besimptomiuose bulvių augaluose planas

2.   VIZUALINIS ŽIEDINIO PUVINIO SIMPTOMŲ TYRIMAS

2.1.   Bulvių augalai

Europos klimato sąlygomis simptomai labai retai stebimi lauke ir dažnai tik vegetacijos laikotarpio pabaigoje. Be to, šie simptomai dažnai yra paslėpti ir (arba) painiojami su kitomis ligomis, senėjimu ar mechaniniais augalų pažeidimais. Taigi, atliekant patikrinimus lauko sąlygomis, labai lengva simptomų nepastebėti. Vytimo simptomai labai skiriasi nuo rudojo puvinio simptomų; paprastai vytimas vyksta labai lėtai ir iš pradžių stebimas tik lapų pakraščiuose. Jauni užkrėsti lapai toliau auga, išskyrus užkrėstas lapo dalis, kurios auga lėčiau. Dėl to susiformuoja keistų formų lapai. Lapų, patyrusių pažeidimą dėl kotelio gilesnių vaskuliarinių audinių vystymosi blokavimo, žalia spalva dažnai išblunka ir juose susidaro geltonos ir oranžinės spalvos zonos tarp lapo gyslų. Pažeisti lapai, sudėtinių lapų lapeliai ir netgi koteliai gali visiškai sunykti. Dažnai lapų ir stiebagumbių dydis sumažėja. Išimtiniais atvejais augai būna žemaūgiai. Simptomų spektro spalvotus atvaizdus galima rasti tinklavietėje http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

2.2.   Bulvių stiebagumbiai

Pirminiai simptomai yra tam tikras audinio skaidrumas arba peršviečiamumas, neminkštėjimas aplink vaskuliarinę sistemą, ypač prie viršūnės. Vaskuliarinis žiedas prie viršūnės gali būti šiek tiek tamsesnės spalvos negu paprastai. Pirmasis lengvai nustatomas simptomas – vaskuliarinis žiedas yra gelsvas, o švelniai paspaudus gumbą iš indų pradeda sunktis į sūrio konsistenciją panaši medžiaga. Šioje besisunkiančioje medžiagoje yra milijonai bakterijų. Šioje stadijoje vaskuliarinis audinys gali paruduoti ir stiebagumbio simptomai yra panašūs į Ralstonia solanacearum sukeliamo rudojo puvinio simptomus. Iš pradžių šie simptomai gali būti matomi tik vienoje žiedo dalyje, nebūtinai prie viršūnės, ir palaipsniui gali išplisti visame žiede. Užkratui plintant, vaskuliarinis audinys žūva; išorinė žievės dalis gali atsiskirti nuo vidinės žievės. Vėlesnėse užkrėtimo stadijose stiebagumbio paviršiuje atsiranda įtrūkimų, kurių pakraščiai dažnai būna raudonai rudi. Neseniai Europoje buvo užregistruota keletas atvejų, kai žievės centro puvinys, susidarantis tuo pačiu metu, kaip ir vaskuliarinis žiedas, sąlygojo tuščiaviduriškumo ir nekrozės atsiradimą. Antrinis užkrėtimas bakterijomis arba grybais gali užmaskuoti simptomus ir gali būti sunku, netgi neįmanoma, vėlyvuosius žiedinio puvinio simptomus atskirti nuo kitų stiebagumbių puvinių. Gali pasitaikyti ir netipiškų simptomų. Simptomų spektro spalvotus atvaizdus galima rasti tinklavietėje http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main

3.   BANDINIO PARUOŠIMAS

3.1.   Bulvių stiebagumbiai

Pastaba:

—

Standartinis vienam testui skirto bandinio dydis - 200 stiebagumbių. Intensyvesnės imties atveju reikia atlikti daugiau šio dydžio bandinio testų. Dėl didesnio stiebagumbių skaičiaus viename bandinyje neįmanoma arba sunku aiškinti rezultatus. Tačiau šią tvarką galima taikyti mažesniems nei 200 stiebagumbių bandiniams, turint mažiau stiebagumbių.

—	Visų toliau aprašytų aptikimo metodų patvirtinimas pagrįstas 200 stiebagumbių bandinių tyrimu.

—	Toliau aprašytą bulvių ekstraktą taip pat galima naudoti aptinkant bulvių rudojo puvinio sukėlėją - bakteriją Ralstonia solanacearum.

Galima atlikti išankstinį apdorojimą prieš bandinio paruošimą:

Nuplauti stiebagumbius. Naudoti atitinkamus dezinfektantus (chloro junginius, kai PGR naudojama visiškai pašalinti patogeno DNR) ir detergentus, skirtus kiekvienam bandiniui. Stiebagumbiai išdžiovinami oru. Ši plovimo tvarka ypač naudinga (bet jos taikyti nereikalaujama), kai naudojami bandiniai, turintys dirvožemio perteklių ir kai būtina atlikti PGR testą arba taikyti kitą tiesioginį DNR išskyrimo metodą.

3.1.1.   Kiekvieno stiebagumbio viršūnės oda pašalinama švariu ir dezinfekuotu skalpeliu arba daržovėms pjaustyti skirtu peiliu taip, kad vaskuliarinis audinys taptų matomas. Kruopščiai išpjaunamas stiebagumbio viršūnės vaskuliarinio audinio gabaliukas taip, kad nevaskuliarinio audinio būtų kuo mažiau (žr. tinklavietę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Pastaba:

Atskirti bet kurį stiebagumbį su įtariamais žiedinio puvinio simptomais ir ištirti atskirai.

Jei šalinant stiebagumbio viršūnę pastebimi įtariami žiedinio puvinio simptomai, nupjovus stiebagumbio dalį prie viršūnės reikia vizualiai apžiūrėti stiebagumbį. Bet kurį perpjautą stiebagumbį reikia laikyti dvi dienas kambario temperatūroje, kad šis sukamštėtų, o vėliau laikyti karantino sąlygomis (4–10 °C temperatūroje), kol bus atlikti visi testai. Visus vienam bandiniui priklausančius stiebagumbius (įskaitant stiebagumbius su įtariamais simptomais) reikėtų laikyti taip, kaip nurodyta II priede.

3.1.2.   Stiebagumbių viršūnių gabaliukai surenkami į nepanaudotas vienkartines talpyklas, kurias galima uždaryti ir (arba) užplombuoti (tuo atveju, kai jos naudojamos pakartotinai, jau panaudotas talpyklas reikėtų kruopščiai išvalyti ir dezinfekuoti chloro junginiais). Pirmiausia stiebagumbių viršūnių gabaliukus reikėtų nedelsiant apdoroti. Jei tai padaryti neįmanoma, jie saugomi talpykloje, nepridedant buferio, šaltai ne ilgiau kaip 72 valandas arba kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas. Gabaliukų džiūvimas, kamštėjimas ir saprofitinių bakterijų augimas gali kliudyti aptikti žiedinį puvinį sukeliančią bakteriją.

3.1.3.   Stiebagumbio viršūnės gabaliukai apdorojami taikant vieną iš šių procedūrų:

a)	Gabaliukai pamerkiami į pakankamą (apie 40 ml) ekstrahavimo buferinio tirpalo tūrį (3 priedėlis) ir 4 valandas žemesnėje nei 24 °C temperatūroje kratomi rotorine kratykle (50–100 rpm), arba 16–24 valandas šaldomi.

b)

Gabaliukai pakankamame (apie 40 ml) ekstrahavimo buferinio tirpalo tūryje (3 priedėlis) homogenizuojami naudojant maišyklę (pvz., Waring arba Ultra Thurax) arba juos sutraiškant užplombuotame vienkartiniame mirkymo maišelyje (pvz., Stomacher ar Bioreba tvirto polietileno maišelyje, 150 mm × 250 mm; sterilizuotame apšvita) guma dengtu mediniu plaktuku arba atitinkamu malimo prietaisu (pvz., Homex).

Pastaba:

Bandinių kryžminio užsikrėtimo rizika yra ypač didelė, kai bandiniai homogenizuojami naudojant maišyklę. Atsargumo priemonių imamasi stengiantis išvengti aerozolio susidarymo arba nuotėkio išskyrimo metu. Užtikrinama, kad kiekvienam bandiniui būtų naudojami atskiri ką tik sterilizuoti maišyklės peiliai ir indai. Jei atliekamas PGR testas, stengiamasi išvengti DNR pernešimo į talpyklas ar malimo aparatą. Atliekant PGR testą malimą rekomenduojama atlikti vienkartiniuose maišeliuose ir vienkartiniuose vamzdeliuose.

3.1.4.   Viršnuosėdinis skystis nupilamas. Jei jis pernelyg drumstas, yra skaidrinamas lėtai centrifuguojant (ne didesniu kaip 180 g greičiu 10 minučių 4–10 °C temperatūroje) arba filtravimu vakuume (40–100 µm), perplaunant filtrą papildomu (10 ml) ekstrahavimo buferiniu tirpalu (3 priedėlis).

3.1.5.   Bakterijos frakcija koncentruojama centrifuguojant 7 000 g greičiu 15 minučių (arba 10 000 g greičiu 10 minučių) 4–10 °C temperatūroje ir viršnuosėdinis skystis nupilamas nepažeidžiant nuosėdų.

3.1.6.   Nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 1,5 ml nuosėdų buferiniame tirpale (3 priedėlis). Naudojama 500 µl tirpalo C. m. subsp. Sepedonicus tyrimams, 500 µl tirpalo Ralstonia solanacearum tyrimams ir 500 µl tirpalo lyginamiesiems tyrimams. Pripilama sterilaus glicerino į 500 µl lyginamąją ir likutinę bandinio dalis, kad galutinė koncentracija siektų 10–25 % (tūris/tūris), sumaišoma ir saugoma –16–24 °C temperatūroje (savaites) arba –68–86 °C temperatūroje (mėnesius). Tyrimo metu tiriamosios alikvotinės bandinio dalys saugomos 4–10 °C temperatūroje.

Kartotinis sušaldymas ir tirpdymas nerekomenduotini.

Jei ekstraktą reikia vežti, jis pristatomas šaldomoje dėžėje per 24-48 valandas.

3.1.7.   Siekiant išvengti užsikrėtimo, būtina, kad visi C. m. subsp. sepedonicus teigiami kontroliniai bandiniai ir tiriamieji bandiniai būtų apdorojami atskirai. Šitaip daroma tiriant visas IF plokšteles ir atliekant visus testus.

3.2.   Bulvių augalai

Pastaba:

Kad būtų aptiktos latentinės C. m. subsp. sepedonicus populiacijos, rekomenduojama tirti sudėtinius bandinius. Ši tvarka gali būti sėkmingai taikoma tiriant 200 stiebo dalių sudėtinius bandinius. Atliekant apžiūras, rekomenduojama naudoti statistiškai patikimą tiriamosios augalo populiacijos bandinį.

3.2.1.   Nuo kiekvieno stiebo pagrindo virš pat dirvos sluoksnio atpjaunamas 1–2 cm segmentas švariu dezinfekuotu peiliu arba genėjimui skirtu sekatoriumi.

Stiebo segmentai trumpai dezinfekuojami 70 % etanoliu ir nedelsiant išdžiovinami sugeriamuoju popieriumi.

Stiebo segmentai surenkami į uždarą sterilią talpyklą šia bandinių imties tvarka:

3.2.2.   Stiebo segmentai apdorojami taikant vieną iš šių procedūrų:

a)	Segmentai pamerkiami į pakankamo tūrio (apytiksliai 40 ml) ekstrahavimo buferinį tirpalą (3 priedėlis) ir 4 valandas maišomi besisukančia kratykle (50–100 rpm greičiu) mažesnėje nei 24 °C temperatūroje arba šaldomi 16–24 valandas.

b)

Apdorojami nedelsiant, sumalant segmentus tvirtame mirkymo maišelyje (pvz., Stomacher arba Bioreba), įpylus atitinkamą ekstrakcijos buferinio tirpalo kiekį (3 priedėlis) guma dengtu plaktuku arba atitinkamu malimo aparatu (pvz., Homex). Jei šito padaryti neįmanoma, kamieno segmentai saugomi šaltai ne ilgiau kaip 72 valandas arba kambario temperatūroje ne ilgiau kaip 24 valandas.

3.2.3.   Leidus susidaryti nuosėdoms per 15 minučių, viršnuosėdinis skystis nupilamas.

3.2.4.   Paprastai vėliau nereikalaujama skaidrinti ekstrakto arba koncentruoti bakterinės frakcijos, tačiau tai galima atlikti filtruojant ir (arba) centrifuguojant, kaip aprašyta 3.1.4–3.1.6 skirsniuose.

3.2.5.   Neskiestas arba koncentruotas bandinio ekstraktas padalijamas į dvi lygias dalis. Viena ekstrakto dalis tiriama 4–10 °C temperatūroje, o kita saugoma 10–25 % (tūris/tūris) steriliame glicerine –16–24 °C temperatūroje (savaites) arba –68–86 °C temperatūroje (mėnesius) iki paskesnio tyrimo pradžios.

4.   IMUNOFLUORESCENCINĖS ANALIZĖS (IF) TESTAS

Principas

Imunofluorescencinės analizės testas kaip svarbiausias atrankos testas, rekomenduojamas taikyti dėl jo tinkamumo pasiekti reikalaujamas slenkstines vertes.

Kai IF testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, PGR ir FISH testą reikia atlikti kaip antrąjį atrankos testą. Kai IF testas atliekamas kaip antrasis atrankos testas ir IF rezultatai teigiami, reikia atlikti paskesnį testavimą pagal vaizduojamąją diagramą, kad būtų baigta analizė.

Pastaba:

Visada naudoti polikloninius antikūnus, kai IF testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas. Jei naudojant polikloninius antikūnus IF testo rezultatai teigiami, paskesnė atranka naudojant monokloninius antikūnus suteiktų daugiau specifiškumo, tačiau gali būti ne tokia jautri.

Naudojami antikūnai, būdingi etaloniniam C. m. subsp. sepedonicus štamui. Rekomenduojama nustatyti kiekvienos naujos antikūnų partijos titrą. Titras apibrėžiamas kaip didžiausias praskiedimas, kuriam esant vyksta reakcija, tiriant homologinio C. m. subsp. sepedonicus štamo 105-106 ląstelių/ml ląstelių suspensiją ir naudojant atitinkamą gamintojo rekomenduojamą fluoresceino izotiocianato (FITC) konjugatą. Neišgrynintų polikloninių arba monokloninių antikūnų titras turėtų būti ne mažesnis kaip 1:2000. Tyrimo metu antikūnus reikėtų praskiesti iki darbinio praskiedimo (DP), artimo jų titrui arba lygaus jam. Naudoti patvirtintus antikūnus (žr. tinklavietę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

Reikėtų tirti tik šviežiai pagamintus ekstraktus. Jei būtina, galima tirti ekstraktus, laikomus glicerine –68 –86 °C temperatūroje. Gliceriną iš bandinio galima pašalinti pridėjus 1 ml nuosėdų buferinio tirpalo (4 priedėlis), pakartotinai centrifuguoti 15 minučių 7 000 g greičiu ir pakartotinai suspenduoti, pripylus nuosėdų buferinio tirpalo lygų tūrį. Dažnai šitai atlikti nebūtina, ypač jei bandiniai fiksuojami ant plokštelės liepsna (žr. 2.2 skirsnį).

Paruošti atskiras teigiamas kontrolines plokšteles, į kurių langelius bus pripilta homologinio arba kurio nors etaloninio C. m. subsp. sepedonicus štamo, suspenduoto bulvių ekstrakte, kaip nurodyta 2 priedėlyje, ir pasirinktinai buferiniame tirpale.

Jei įmanoma, į tos pačios plokštelės langelius turėtų būti pripilama natūraliai užkrėsto audinio preparato (palaikomo liofilizacijos arba šaldymo –16–24 °C temperatūroje būdu) kaip panašaus kontrolinio bandinio.

Bandinių, kurie po ankstesnių tyrimų buvo laikomi neigiamais, ekstraktų dalys turėtų būti naudojamos kaip neigiami kontroliniai bandiniai.

Naudoti daug langelių turinčias mikroskopines plokšteles, pageidautina su 10 langelių, mažiausiai 6 mm skersmens.

Kontrolinis bandinys tiriamas taip pat, kaip ir tiriamasis bandinys.

4.1.   Tyrimui skirtos plokštelės paruošiamos taikant vieną iš šių procedūrų:

i)

Nuosėdos, turinčios santykinai nedaug krakmolo: Standartinis tūris (15 µl tinka dirbti, kai naudojamos plokštelės, kurių langelio skersmuo yra 6 mm, o esant didesniems langeliams, padidinamas tūris) 1:100 praskiestų pakartotinai suspenduotų bulvių nuosėdų lašinamas į pirmąjį langelį. Vėliau nepraskiestų (1/1) pakartotinai suspenduotų nuosėdų panašus tūris lašinamas į vienos tos pačios eilės langelius. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 1 pav.

ii)

Kitų nuosėdų atveju: Pakartotinai suspenduotos nuosėdos praskiedžiamos nuosėdų buferiniame tirpale santykiu 1:10 ir 1:100. Standartinis pakartotinai suspenduotų ir kiekvieno praskiedimo nuosėdų tūris (15 µl tinka dirbti, kai naudojamos plokštelės, kurių langelio skersmuo yra 6 mm, o esant didesniems langeliams, padidinamas tūris) lašinamas į langelius vienoje langelių eilutėje.. Antrojoje eilutėje pakartojamas pirmasis bandinys arba lašinamas antrasis bandinys, kaip parodyta 2 pav.

4.2.   Lašeliai išdžiovinami kambario temperatūroje arba kaitinami 40–45 °C temperatūroje. Bakterinės ląstelės fiksuojamos prie plokštelės kaitinant (15 minučių 60 °C temperatūroje) arba liepsna, 95 % etanoliu arba bet kuria kita antikūnų tiekėjų nurodyta tvarka.

Jei būtina, fiksuotos plokštelės vėliau gali būti saugomos šaltai sausoje dėžėje kiek galima trumpiau (ilgiausiai 3 mėnesius) iki tyrimo.

IF tvarka

i)	Plokštelė, paruošta kaip nurodyta 4.1(i): Paruošiamas antikūnų dukart praskiestų IF buferiniu tirpalu, rinkinys. Į pirmą langelį pripilama 1/2 titro (T/2), į kitus - 1/4 titro (T/4), 1/2 titro, (T/2), titrą (T) ir dukart titro antikūnų (2T).

ii)	Plokštelė, paruošta kaip nurodyta 4.1(ii): Atliekamas antikūnų darbinis praskiedimas (DP) IF buferiniame tirpale. Darbinis praskiedimas turi įtakos antikūnų specifiškumui.

1 pav.   Tiriamosios plokštelės paruošimas pagal 4.1(i) ir 4.3(i)

	Pakartotinai suspenduotų nuosėdų praskiedimai
	1/100	1/1	1/1	1/1	1/1		Pakartotinai suspenduotų nuosėdų praskiedimas
(T = titras)	T/2	T/4	T/2	T	2T		Antiserumų/antikūnų praskiedimai dukart
1 bandinys
	1	2	3	4	5
1 bandinio arba 2 bandinio pakartojimas
	6	7	8	9	10

2 pav.   Tiriamosios plokštelės paruošimas pagal 4.1(ii) ir 4.3(ii)

	Antiserumo/antikūnų darbinis praskiedimas
	1/1	1/10	1/100	tuščias	tuščias		Pakartotinai suspenduotų nuosėdų praskiedimas 1/10
1 bandinys
	1	2	3	4	5
1 bandinio 2 bandinio pakartojimai
	6	7	8	9	10

4.3.1.   Plokštelės išdėliojamos ant drėgno popieriaus. Kiekvienas testuojamasis langelis sklidinai pripildomas praskiestų antikūnų tirpalo. Į kiekvieną langelį pripilamo antikūnų tirpalo tūris turi atitikti bent tiriamojo ekstrakto tūrį.

Antikūnų tiekėjams nepateikus naudojimo instrukcijų, laikomasi šios tvarkos:

4.3.2.   Plokštelės laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus 30 minučių kambario temperatūroje (18–25 °C).

4.3.3.   Nukrėsti nuo kiekvienos plokštelės lašelius ir kruopščiai nuplauti IF buferiniu tirpalu. Perplaunama pripilant IF buferinio tirpalo, turinčio Tween (3 priedėlis), ir laikoma 5 minutes, po to pripilama IF buferinio tirpalo ir laikoma dar 5 minutes. Vengti aerozolio susidarymo arba lašelių pernešimo, dėl kurio gali įvykti kryžminė tarša. Perteklinis vanduo atsargiai pašalinamas nusausinant.

4.3.4.   Plokštelės išdėliojamos ant drėgno popieriaus, į langelius pripilama praskiesto titrui nustatyti naudojamo FITC konjugato. Į langelius pripilamo konjugato tūris turi atitikti pripilamų antikūnų tirpalo tūrį.

4.3.5.   Plokštelės 30 minučių laikomos uždengtos ant drėgno popieriaus kambario temperatūroje (18–25 °C).

4.3.6.   Konjugato lašeliai nukratomi nuo plokštelės. Plokštelė sudrėkinama ir plaunama, kaip aprašyta 4.3.3 skirsnyje.

Atsargiai pašalinamas perteklinis vanduo.

4.3.7.   Į kiekvieną tiriamąjį langelį pipete įlašinama po 5–10 µl 0,1M fosfatinio buferinio glicerino tirpalo arba komercinio priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčio ryškintojo tirpalo (3 priedėlis), ir plokštelė uždengiama dengiamuoju stikleliu.

IF testo rezultatai:

4.4.1.   Tiriamąsias plokšteles stebėti epifluorescenciniu mikroskopu naudojant filtrus, tinkamus FITC sužadinimui, ir aliejaus arba vandens imersinius tirpalus esant 500–1 000 kartų padidinimui. Langeliai stebimi per dvigubą skersmenį dešiniuosiuose kampuose ir aplink perimetrą. Bandinių, neturinčių arba turinčių nedaug ląstelių, atveju stebima mažiausiai 40 laukelių.

Pirmiausia stebima teigiama kontrolinė plokštelė. Ląstelės turi šviesiai fluorescuoti ir būti visiškai nusidažiusios esant nustatytam antikūnų titrui arba darbiniam praskiedimui. IF testą (4 skirsnis) reikia pakartoti, jei dažymasis nepavyko.

4.4.2.   Tiriamųjų plokštelių tiriamuosiuose langeliuose stebimos šviesiai fluorescuojančios tipiškos morfologijos C. m. subsp. sepedonicus ląstelės (žr. tinklavietę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescencijos intensyvumas privalo būti lygiavertis teigiamo kontrolinio štamo fluorescencijos intensyvumui arba net didesnis už jį esant tam pačiam antikūnų praskiedimui. Į ne visai nusidažiusias ląsteles ar silpnai fluorescuojančias ląsteles nekreipiama dėmesio.

Įtarus kokią nors taršą, testą privaloma pakartoti. Taip gali atsitikti tuo atveju, kai visose vienos partijos plokštelėse matomos teigiamos ląstelės dėl buferinio tirpalo taršos arba dėl to, kad stebimos teigiamos ląstelės (už plokštelės lango ribų) ant plokštelės dangtelio.

4.4.3.   Yra keletas būdingų IF testo specifiškumo problemų. Gali pasitaikyti foninių fluorescuojančių netipiškos morfologijos ląstelių populiacijų ir į C. m. subsp. sepedonicus savo dydžiu bei morfologija panašių kryžmiškai reaguojančių saprofitinių bakterijų, randamų bulvių stiebagumbių viršūnių gabaliukų nuosėdose.

4.4.4.   Tirti tik tipiško dydžio ir morfologijos fluorescuojančias ląsteles esant antikūnų titrui arba darbiniam praskiedimui, kaip nurodyta 4.3.

4.4.5.   IF testo rezultatų aiškinimas:

i)

Jei stebimos šviesiai fluorescuojančios tipiškos morfologijos ląstelės, apskaičiuojamas tipiškų ląstelių viename mikroskopiniame laukelyje vidurkis ir tipiškų ląstelių skaičius pakartotinai suspenduotų nuosėdų viename mililitre (4 priedėlis). Bandiniai, kurių 1 ml yra mažiausiai 5x103 tipiškų ląstelių, laikomi užkrėstais. Reikalaujama juos tirti toliau.

ii)	IF testo rezultatai laikomi neigiamais, kai viename bandinių mililitre yra mažiau nei 5x103 ląstelių, ir toks bandinys laikomas neigiamu. Toliau tirti nereikalaujama.

5.   FLUORESCENCINĖS HIBRIDIZACIJOS IN SITU (FISH) TESTAS

Principas

Kai FISH testas taikomas kaip pirmasis atrankos testas ir nustatoma, kad jis teigiamas, IF testą reikia atlikti kaip antrąjį privalomąjį atrankos testą. Kai FISH testas taikomas kaip antrasis privalomasis testas ir nustatoma, kad jis teigiamas, yra reikalaujama atlikti paskesnį testavimą pagal vaizduojamąją diagramą tam, kad diagnozė būtų baigta.

Pastaba:

Naudoti patvirtintus oligonukleotidų, būdingų C. m. subsp. sepedonicus, bandinius (7 priedėlis). Šiuo metodu atliekant išankstinį testą, bandinių ekstraktuose, kurie anksčiau buvo neigiami, viename mililitre turėtų būti pakartotinai aptinkama mažiausiai 103-104 C. m. subsp. sepedonicus ląstelių.

Ši tvarka pirmiausia turėtų būti taikoma šviežiai paruoštam bandinio ekstraktui, tačiau ją galima taikyti ir ekstraktui, kuris buvo laikomas glicerine –16–24 °C arba –68–86 °C temperatūroje.

Bandinio ekstrakto, kuriame nenustatyta C. m. subsp. sepedonicus ląstelių, alikvotines dalis naudoti kaip neigiamus kontrolinius bandinius.

3–5 dienų amžiaus kultūrų suspensijas, turinčias C. m. subsp. sepedonicus (pvz., NCPPB 4053 arba PD 406 štamo) 0,01M fosfatiniame buferiniame tirpale 105-106 ląstelių/ml, reikėtų naudoti kaip teigiamus kontrolinius bandinius (apie paruošimą žr. 2 priedėlyje). Paruošti atskiras teigiamas kontrolines plokšteles, skirtas homologiniam arba bet kuriam etaloniniam C. m. subsp. sepedonicus štamui, suspenduotam bulvių ekstrakte, kaip nurodyta 2 priedėlyje.

FITC žyma pažymėti oligonukleotidiniai bandiniai, būdingi eubakterijoms, labai naudingi kontroliuojant hibridizavimo procesą, kadangi jais nudažomos visos bandinyje esančios eubakterijos.

Kontrolinis bandinys tiriamas tokiu pat būdu, kaip ir tiriamasis bandinys.

5.1.   Bulvių ekstrakto fiksavimas

Paskesnė metodika pagal Wullings et al. (1998):

5.1.1.   Paruošti fiksavimo tirpalą (žr. 7 priedėlį).

5.1.2.   Į Eppendorfo mėgintuvėlį įlašinama po 100 µl kiekvieno bandinio ekstrakto, ir mėgintuvėlis centrifuguojamas 8 min 7 000 g greičiu.

5.1.3.   Nupilamas viršnuosėdinis skystis ir nuosėdos ištirpinamos 500 µl fiksavimo tirpalo, paruošto prieš mažiau kaip 24 valandas. Mėgintuvėlis sukratomas pavartant ir per naktį inkubuojamas 4° C temperatūroje.

Kita fiksuojanti medžiaga yra 96 % etanolis. Nuosėdos, gautos 5.1.2 etape, ištirpinamos 50 µl 0,01M fosfatinio buferinio tirpalo 50 µl 96 % etanolio. Mišinys apverčiamas aukštyn sumaišant ir 30–60 minučių inkubuojamas 4 °C temperatūroje.

5.1.4.   Mėgintuvėlis centrifuguojamas 8 min 7 000 g greičiu, viršnuosėdinis skystis nupilamas ir nuosėdos pakartotinai suspenduojamos 75 µl 0,01M fosfatinio buferinio tirpalo (žr. 3 priedėlį).

5.1.5.   Į švarios daug langelių turinčios plokštelės langelius įlašinama po 16 µl fiksuotų suspensijų taip, kaip parodyta 3 pav. Kiekviena plokštelė skiriama 2 bandiniams ištirti, įlašinus juos nepraskiestus po 10 µl, ir vėliau padaryti 1:100 praskiedimą (0,01M fosfatiniu buferiniu tirpalu). Likusį bandinio tirpalą (49 µl) galima saugoti –20 °C temperatūroje, įpylus 1 tūrį 96 % etanolio. Jei reikia pakartoti FISH testą, etanolis pašalinamas centrifuguojant ir įpilant tokį pat tūrį 0,01M fosfatinio buferinio tirpalo (sumaišoma pavartant).

3 pav.   FISH testui skirtos plokštelės išklotinė

1 bandinys	tuščias	tuščias	tuščias	2 bandinys
1 langelis	2 langelis	3 langelis	4 langelis	5 langelis
1 bandinys	tuščias	tuščias	tuščias	2 bandinys
6 langelis	7 langelis	8 langelis	9 langelis	10 langelis
1 dengiamasis stiklelis			2 dengiamasis stiklelis

5.1.6.   Plokštelės džiovinamos ore (arba plokštelių džiovintuve 37 °C temperatūroje) ir fiksuojamos liepsna.

Šiame etape darbą galima nutraukti ir hibridizavimą atlikti kitą dieną. Plokštelės turi būti nedulkėtos, ir jas reikia laikyti sausas kambario temperatūroje.

5.2.   Pasiruošimas hibridizacijai ir hibridizacija

5.2.1.   Paruošiamas lizocimo tirpalas, 10 mg lizocimo (Sigma L-6876) ištirpinus 10 ml buferinio tirpalo (100mM Tris-HCl, 50mM EDTA, pH 8,0). Šį tirpalą galima saugoti, tačiau jį užšaldyti ir atitirpdyti galima tik vieną kartą. Į kiekvieną bandiniui skirtą plokštelės langelį įlašinama po 50 µl lizocimo tirpalo, ir plokštelė 10 minučių laikoma kambario temperatūroje. Plokštelės pamerkiamos į demineralizuotą vandenį tik vieną kartą ir džiovinamos filtriniu popieriumi.

Priešingu atveju vietoj lizocimo į kiekvieną langelį galima įpilti po 50 µl 40–400µg ml–1 proteinazės K, ištirpintos buferiniame tirpale (20 mM Tris-HCl, 2mM CaCl2, pH 7,4), ir plokštelę 30 minučių inkubuoti 37 °C temperatūroje.

5.2.2.   Vanduo pašalinamas iš ląstelių, kas minutę įpilant laipsniškai didėjančios koncentracijos -50 %, 80 % ir 96 % - etanolio. Plokštelės džiovinamos oru, įdėjus jas į plokštelėms skirtą laikiklį.

5.2.3.   Parengiama drėgna inkubavimo kamera, oro nepraleidžiančios dėžės dugną uždengus sugeriamuoju arba filtriniu popieriumi, išmirkytu 1× hybmix (7 priedėlis). Dėžė mažiausiai 10 minučių paliekama hibridizavimui skirtoje krosnelėje 55 °C temperatūroje.

5.2.4.   Paruošti hibridizacijos tirpalą (7 priedėlis), į vienos plokštelės langelius įpylus 45µl ir 5 minutes atliekant išankstinį inkubavimą 55 °C temperatūroje.

5.2.5.   Plokštelės padedamos ant karšto 45 °C temperatūros padėklo ir į kiekvienos plokštelės 4 langelius įpilama po 10 µl hibridizavimo tirpalo.

5.2.6.   Kiekviena plokštelė uždengiama dviem dengiamaisiais stikleliais (24 × 24 mm), kad neprasiskverbtų oras. Plokštelės sudedamos į pašildytą drėgną kamerą ir per naktį krosnelėje 55 °C temperatūroje tamsoje atliekamas hibridizavimas.

5.2.7.   Į tris laboratorines kolbas įpilama po 1 l ypač gryno vandens (YGV), 1 l 1x hybmix tirpalo (334 ml 3x hybmix ir 666 ml YPV) ir 1 l 1/2x hybmix (167 ml 3x hybmix ir 833 ml YGV). Kiekviena kolba pašildoma 55 °C temperatūros vandens vonioje.

5.2.8.   Plokštelės atidengiamos ir įdedamos į plokštelių laikiklį.

5.2.9.   Bandinio perteklius pašalinamas 15 minučių inkubuojant plokštelę laboratorinėje kolboje 55 °C temperatūroje, į kurią įpilama vienąkart koncentruoto hybmix tirpalo

5.2.10.   Plokštelių laikiklis pamerkiamas į 1/2 koncentracijos hybmix plovimo tirpalą ir dar 15 minučių inkubuojamas.

5.2.11.   Plokštelės trumpam pamerkiamos į YGV ir padedamos ant filtrinio popieriaus. Perteklinis vanduo pašalinamas, paviršių padengiant filtriniu popieriumi. Į kiekvieną langelį pipete įlašinama po 5–10 μl priešblukinančiu aktyvumu pasižyminčio ryškintojo tirpalo (pvz., Vectashield, Vecta Laboratories, CA, USA arba jam lygiaverčio) ir visa plokštelė uždengiama viena (24 × 60 mm) dengiamuoju stikleliu.

5.3.   FISH testo rezultatų aiškinimas

5.3.1.   Plokšteles, pamerktas į imersinį aliejų, nedelsiant stebėti mikroskopu, tinkančiu epifluorescencinei mikroskopijai ir padidinus 630 ir 1000 kartų. Bandinyje esančios eubakterinės ląstelės (įskaitant Gram(-) ląsteles), stebimos per fluoresceino izotiocianatui (FITC) tinkamą filtrą, atrodo fluorescuojančiai žaliai. Cy3 dažu dažytos C. m. subsp. sepedonicus ląstelės, stebimos per tetrametilrodamino-5-izotiocianatui skirtą filtrą, atrodo fluorescuojančiai raudonai. Palyginti tiriamųjų ir teigiamų kontrolinių ląstelių morfologiją. Ląstelės turi fluorescuoti šviesia spalva ir būti visiškai nusidažiusios. FISH testą (9.4 skirsnis) reikia pakartoti, jei dažymasis nepavyko. Langeliai stebimi per dvigubą skersmenį dešiniuosiuose kampuose ir aplink perimetrą. Jei bandiniai neturi ląstelių arba turi jų nedaug, stebima mažiausiai 40 laukelių.

5.3.2.   Stebėti būdingos morfologijos šviesiai fluorescuojančias C. m. subsp. sepedonicus ląsteles tiriamųjų plokštelių tiriamuosiuose langeliuose (žr. tinklavietę http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main). Fluorescencijos intensyvumas privalo būti lygiavertis arba net didesnis už teigiamo kontrolinio štamo fluorescencijos intensyvumą. Į ne visai nusidažiusias ląsteles ar silpnai fluorescuojančias ląsteles nekreipiama dėmesio.

5.3.3.   Įtarus bet kokią taršą, testą privaloma pakartoti. Taip gali atsitikti tuo atveju, kai visose vienos partijos plokštelėse matomos teigiamos ląstelės dėl buferinio tirpalo taršos arba dėl to, kad stebimos teigiamos ląstelės (už plokštelės langelio ribų) ant plokštelės dangtelio.

5.3.4.   Yra keletas būdingų FISH testo specifiškumo problemų. Gali pasitaikyti foninių fluorescuojančių netipiškos morfologijos ląstelių populiacijų ir į C. m. subsp. sepedonicus savo dydžiu bei morfologija panašių kryžmiškai reaguojančių saprofitinių bakterijų, nors tokie atvejai gerokai retesni nei IF testo atveju tiriant bulvių stiebagumbių viršūnės gabaliukų segmentų nuosėdas.

5.3.5.   Tirti tik tipiško dydžio ir morfologijos fluorescuojančias ląsteles, žr. 5.3.2 skirsnį.

5.3.6.   FISH testo rezultato aiškinimas:

i)

Teigiami FISH testo rezultatai gaunami tada, kai per FITC filtrą stebimos tipiško dydžio bei morfologijos šviesiai žaliai fluorescuojančios C. m. subsp. sepedonicus ląstelės, ir per rodamino filtrą stebimos visos teigiamos kontrolinės ląstelės fluorescuoja šviesiai raudona spalva, o tarp neigiamų kontrolinių ląstelių jokios fluorescencijos nėra. Jei randama šviesiai fluorescuojančių būdingos morfologijos ląstelių, apskaičiuojamas tipiškų ląstelių viename mikroskopiniame laukelyje vidurkis ir tipiškų ląstelių skaičius pakartotinai suspenduotų nuosėdų viename mililitre (4 priedėlis). Bandiniai, kurių 1 ml yra mažiausiai 5 × 103 tipiškų ląstelių, laikomi užkrėstais. Reikalaujama juos tirti toliau. Bandiniai, kurių pakartotinai suspenduotų nuosėdų 1 ml yra mažiau kaip 5 × 103 tipiškų ląstelių, laikomi neigiamais.

ii)	FISH testas yra neigiamas tada, kai per rodamino filtrą tipiško dydžio ir morfologijos šviesiai raudonai fluorescuojančios C. m. subsp. sepedonicus nėra stebimos, jei šviesiai raudonai fluorescuojančios ląstelės per rodamino filtrą stebimos teigiamuose kontroliniuose bandiniuose.

6.   POLIMERAZĖS GRANDININĖS REAKCIJOS (PGR) TESTAS

Principai

Kai PGR testas atliekamas kaip pagrindinis atrankos testas ir gaunami teigiami rezultatai, yra būtina atlikti IF testą kaip antrą privalomąjį atrankos testą. Kai PGR testas atliekamas kaip antras atrankos testas ir gaunami teigiami rezultatai, tai paskesnį testavimą reikia atlikti pagal vaizduojamąją diagramą tam, kad diagnozė būtų baigta.

Šio metodo, kaip pagrindinio atrankos testo, visas galimybes rekomenduojama panaudoti tik įgijus atitinkamos patirties.

Pastaba:

Šiuo metodu atliekant išankstinį testą, bandinių ekstraktuose, kurie anksčiau buvo neigiami, viename mililitre turėtų būti pakartotinai aptinkama mažiausiai 103-104 C. m. subsp. sepedonicus ląstelių. Gali būti reikalaujama atlikti optimizavimo eksperimentus, kad visose laboratorijose būtų pasiektas didžiausias nustatymo jautrumas ir specifiškumas.

Naudoti patvirtintus PGR reagentus ir metodikas. Pirmiausia pasirinkti metodą, kurį taikant naudojamas vidinis kontrolinis bandinys.

Imtis atitinkamų atsargumo priemonių, siekiant išvengti bandinio užteršimo tiriamąja DNR. PGR testą turėtų atlikti patyręs molekulinės biologijos laboratorijų techninis personalas, kad būtų sumažinta taršos tiriamąja DNR galimybė.

Neigiami kontroliniai bandiniai (DNR išskyrimo ir PGR procedūroms) turėtų visada būti laikomi galutiniais bandiniais, kuriais įrodoma, ar įvyko tarša DNR.

Atliekant PGR testą reikėtų naudoti šiuos neigiamus kontrolinius bandinius:

—	bandinio ekstraktą, kuris atlikus ankstesnį tyrimą buvo laikomas neužkrėstas C. m. subsp. sepedonicus,

—	buferinius kontrolinius tirpalus, naudojamus iš bandinio išskirti bakterijai ir DNR,

—	PGR reakcinį mišinį.

Reikėtų naudoti šiuos teigiamus kontrolinius bandinius:

—	pakartotinai suspenduotų nuosėdų, į kurias pridėta C. m. subsp. sepedonicus, alikvotines dalis (apie paruošimą žr. 2 priedėlyje),

—	virulentiško C. m. subsp. sepedonicus izoliato (pvz., NCPPB 2140 arba NCPPB 4053)106/ml ląstelių vandeninę suspensiją,

—	jei įmanoma, atliekant PGR testą taip pat reikėtų naudoti iš teigiamų kontrolinių bandinių išskirtą DNR.

Siekiant išvengti galimos taršos, tiriamieji teigiami kontroliniai bandiniai paruošiami atskirai nuo tiriamųjų bandinių.

Reikėtų stengtis, kad bandinių ekstraktuose nebūtų dirvožemio. Todėl tam tikrais atvejais rekomenduotina ekstraktus paruošti naudojant plautas bulves, jei dirbama pagal PGR metodikas.

6.1.   DNA gryninimo metodai

Naudoti teigiamus ir neigiamus kontrolinius bandinius, kaip aprašyta pirmiau.

Kontrolinę medžiagą paruošti taip pat, kaip ir bandinį.

Tiriamoji DNR iš sudėtingų bandinių substratų išskiriama įvairiais metodais, taigi PGR ir kitų fermentinių reakcijų inhibitoriai pašalinami ir tiriamoji DNT sukoncentruojama bandinio ekstrakte.

Paskesnis metodas buvo optimizuotas tam, kad būtų atliekama patvirtinta PGR, aprašyta 6 priedėlyje.

6.1.(a)   Pastrick (2000) metodas:

1.	220 µl lizės buferinio tirpalo (100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8,0], 1 mM EDTA [pH 8,0]) įlašinti į 1,5 ml tūrio Eppendorf mėgintuvėlį.

2.	Įpilti 100 µl bandinio ekstrakto ir mėgintuvėlį 10 minučių laikyti termostate arba vandens vonelėje 95 °C temperatūroje.

3.	Mėgintuvėlį 5 minutes palaikyti lede.

4.	Įpilti 80 µl lizocimo pradinio tirpalo (50 mg lizocimo/ml 10 mM Tris HCl, pH 8,0 buferiniame tirpale) ir 30 minučių inkubuoti 37 °C temperatūroje.

5.	Įpilti 220 µl Easy DNA ® tirpalo A (Invitrogen), gerai sukratyti ir 30 minučių inkubuoti 65 °C temperatūroje.

6.	Įpilti 100 µl Easy DNA ® tirpalo B (Invitrogen), intensyviai kratyti, kol nuosėdos išsisklaidys mėgintuvėlyje ir bandinys taps vienodai klampus.

7.	Įpilti 500 µl chloroformo ir kratyti tol, kol sumažėja klampumas ir mišinys tampa homogeniškas.

8.	20 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje, kad būtų atskirtos fazės ir susidarytų interfazė.

9.	Perpilti viršutinę fazę į naujai paruoštą Eppendorf mėgintuvėlį.

10.	Įpilti 1 ml 100 % etanolio (–20 °C), trumpai pakratyti ir 10 minučių inkubuoti lede.

11.	20 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje ir iš nuosėdų pašalinti etanolį.

12.	Įpilti 500 µl 80 % etanolio (–20 °C) ir sumaišyti, pavartant mėgintuvėlį.

13.	20 minučių centrifuguoti 15 000 g greičiu 4 °C temperatūroje ir išsaugoti nuosėdas bei pašalinti etanolį.

14.	Leisti nuosėdoms išdžiūti ore arba greitajame DNR siurblyje.

15.	Pakartotinai suspenduoti nuosėdas 100 µl steriliame ypač gryname vandenyje ir mažiausiai 20 minučių palikti kambario temperatūroje.

16.	Kol bus atliekama PGR, laikyti –20 °C temperatūroje.

17.	Centrifuguojant išsodinti bet kurį baltos spalvos precipitatą ir 5 µl supernatanto, turinčio DNR, panaudoti PGR atlikti.

6.1.(b)   Kiti metodai

Kiti DNR išskyrimo metodai (pvz., naudojant bendrovės Qiagen DNeasy rinkinį, skirtą augalų DNR išskirti) galėtų būti taikomi, jei įrodoma, kad jie tokie pat efektyvūs išskiriant DNR iš kontrolinių bandinių, kurių 1 ml yra 103-104 patogeno ląstelių.

6.2.   PGR

6.2.1.   Tiriamosios ir kontrolinės matricos paruošiamos PGR pagal patvirtintą metodiką (6 priedėlis). Bandinio DNR ekstraktas praskiedžiamas ypač grynu vandeniu santykiu 1:10.

6.2.2.   Pagal paskelbtą metodiką paruošiamas atitinkamas PGR reakcinis mišinys taršai atsparioje aplinkoje (6 priedėlis). Patvirtinta PGR yra daugybinė reakcija, kurią atliekant taip pat naudojamas vidinis PGR kontrolinis bandinys.

6.2.3.   Į 25 µl PGR reakcinio mišinio, esančio steriliuose PGR skirtuose mėgintuvėliuose, įpilama 5 µl DNR ekstrakto.

6.2.4.   Naudojamas neigiamas kontrolinis bandinys, sudarytas tik iš PGR reakcinio mišinio, ir vietoj bandinio į jį įpilama ypač gryno vandens, kuris naudojamas ir PGR mišinyje.

6.2.5.   Mėgintuvėliai įdedami į ta patį PGR reaktorių, kuris buvo naudojamas atliekant išankstinį tyrimą, ir atliekama atitinkamai optimizuota PGR (6 priedėlis).

6.3.   PGR produkto analizė

6.3.1.   Padaugintos matricinės DNR bandiniai analizuojami elektroforezės agarozės gelyje metodu. Į gelį įnešama mažiausiai po 12 µl padauginto DNR reakcinio mišinio, sumaišyto su 3 µl įnešimo buferinio tirpalo (6 priedėlis). Naudojami 2 % (svoris/tūris) agarozės geliai, pagaminti taikant tris-acetato-EDTA (TAE) buferinį tirpalą (6 priedėlis), ir elektroforezė atliekama esant 5–8 V/cm. Naudojama atitinkamo ilgio DNR žymė, pvz., 100bp ilgio fragmentas.

6.3.2.   DNR juostelės išryškinamos 30–45 minutes dažant etidiumo bromido dažu (0,5 mg/l); dirbant su šiuo mutagenu yra imamasi atsargumo priemonių.

6.3.3.   Gelis apžiūrimas apšvietus jį trumpųjų UV bangų peršvietėju (pvz., bangos ilgiui siekiant λ = 302 nm), stebimi numatomo ilgio padaugintos DNR fragmentai (6 priedėlis), ir stebėjimai užrašomi.

6.3.4.   Gavus naujų duomenų arba esant naujiems atvejams, padaugintos DNR tapatybė nustatoma, atliekant likusios padaugintos DNR restrikcinę analizę, DNR inkubuojant atitinkamo fermento ir buferinio tirpalo mišinyje kambario temperatūroje (žr. 6 priedėlį). Suskaldyti fragmentai analizuojami agarozės gelio elektroforezės metodu ir stebimas būdingas restrikcijos fragmentas, gelį nudažius etidiumo bromidu ir apšviečiant UV peršvietėju, bei palyginant su nesuskaldytu ir suskaldytu teigiamu kontroliniu bandiniu.

PGR testo rezultato aiškinimas:

PGR testas yra neigiamas, jei tiriamajame bandinyje nenustatomas numatomo dydžio padaugintos C. m. subsp. sepedonicus būdingos DNR fragmentas, bet jis nustatomas visuose teigiamuose kontroliniuose bandiniuose (kai daugybinė PGR atliekama naudojant augalui būdingus vidinius kontrolinius pradmenis, antrąjį numatomą PGR produktą reikia padauginti kartu su tiriamuoju bandiniu).

PGR testas yra teigiamas, jei aptinkamas numatomo dydžio padaugintos C. m. subsp. sepedonicus būdingos DNR fragmentas, suskaldytas restriktaze (kai reikalaujama), ir jei jis negaunamas iš bet kurio neigiamo kontrolinio bandinio. Patikimas teigiamo rezultato patvirtinimas gali būti gaunamas pakartojant testą ir naudojant antrąjį DNR pradmenų rinkinį (9.3 skirsnis).

Pastaba:

PGR inhibiciją galima įtarti, jei padaugintos matricinės DNR fragmetas gaunamas iš teigiamo kontrolinio bandinio, turinčio C. m. subsp. sepedonicus vandenyje, tačiau neigiami rezultatai gaunami naudojant teigiamą kontrolinį bandinį, turintį C. m. subsp. sepedonicus bulvių ekstrakte. Kai daugybinė PGR atliekama naudojant vidinius PGR kontrolinius bandinius, reakcijos inhibicija stebima negavus abiejų padaugintų matricinių DNR.

Užsikrėtimą galima įtarti, jei numatoma padauginta DNR gaunama iš vieno arba daugiau neigiamų kontrolinių bandinių.

7.   BIOTESTAS

Pastaba:

Šiuo metodu išankstinį tyrimą atliekant bandinių ekstraktuose, kurie anksčiau buvo neigiami, 1 ml turėtų būti galima nustatyti 103-104 C. m. subsp. sepedonicus kolonijas sudarančių vienetų (apie paruošimą žr. 2 priedėlyje).

Didžiausio nustatymo jautrumo galima tikėtis, kai naudojamas šviežiai paruoštas bandinio ekstraktas ir laikomasi optimalių augimo sąlygų. Tačiau šį metodą galima sėkmingai taikyti tiriant ekstraktus, laikytus glicerine –68–86 °C temperatūroje.

Kai kurios baklažanų veislės yra puiki C. m. subsp. sepedonicus dauginimosi terpė net ir nesant simptomų ir yra puikus bakterijos šeimininko patvirtinimo testas.

Augimo sąlygas reikėtų optimizuoti, kad būtų sumažintas netikrų neigiamų rezultatų gavimo pavojus.

Dėl auginimo žr. 8 priedėlį.

7.1.   Likusią pagal 3.1.6 arba 3.2.5 skirsnį pakartotinai suspenduotų nuosėdų alikvotinę dalį paskirstyti tarp baklažanų taikant vieną iš toliau pateikiamų metodų (7.3 arba 7.4 skirsnis). Naudoti tik 2–3 lapelių stadijos augalus ir sudaryti sąlygas visiškai pasiekti trečiojo tikrojo lapelio stadiją. Kad būtų visiškai sunaudota pakartotinai suspenduotų nuosėdų likusi dalis ir būtų efektyviai atliktas toliau aprašytas inokuliavimas, reikia, kad vieną bandinį sudarytų 15-25 baklažanai.

7.2.   Baklažanai 1–2 dienas prieš inokuliavimą nelaistomi, kad būtų sumažintas turgorinis lapų slėgis.

Inokuliavimas įpjovos vietoje

7.3.1.   Laikant augalą dviem pirštais, suspenduotų nuosėdų lašas (apytiksliai 5–10 µl) užlašinamas ant stiebo tarp sėklaskilčių ir pirmojo lapelio.

7.3.2.   Steriliu skalpeliu padaromas įstrižinis 1 cm ilgio ir 2/3 stiebo storio gylio pjūvis nuo tos vietos, kur buvo užlašintas suspenduotų nuosėdų lašas.

7.3.3.   Pjūvis užsandarinamas steriliu vazelinu, tam naudojant švirkštą.

7.4.   Inokuliavimas švirkštu

Baklažanų stiebai virš sėklaskilčių inokuliuojami, tam naudojant švirkštą su hipodermine adata (ne mažiau kaip 23G). Bandinys padalijamas po lygiai visuose baklažanuose.

7.5.   Kaip teigiami kontroliniai augalai, 5 baklažanai inokuliuojami žinomos C. m. subsp. sepedonicus kultūros 105–106 ląstelių/ml vandenine suspensija ir, kai įmanoma, užkrėstu stiebagumbio audiniu (4 skirsnis), taikant tą patį inokuliavimo metodą (žr. 7.3 arba 7.4 skirsnį).

7.6.   Kaip neigiami kontroliniai augalai, 5 baklažanai steriliu nuosėdų buferiniu tirpalu inokuliuojami taikant tą patį metodą (7.3 arba 7.4 skirsnis).

7.7.   Augalai 4 savaites 18–24 °C temperatūroje laikomi karantino sąlygomis. Augalai auginami esant pakankamai šviesos ir drėgmės (70–80 %) ir vandens, kad nepermirktų ar nenuvystų dėl vandens trūkumo. C. m. sepedonicus ląstelės žūva esant aukštesnei kaip 30 °C temperatūrai, o jų optimali temperatūra yra 21 °C. Siekiant išvengti taršos, teigiami kontroliniai ir neigiami kontroliniai augalai auginami aiškiai atskirtuose loveliuose šiltnamyje arba auginimui skirtoje patalpoje, o jei trūksta erdvės, tai užtikrinama atskirtis. Jei skirtingais bandiniais inokuliuojamus augalus reikia auginti kartu, jie atskiriami skydeliais. Tręšimo, laistymo, patikrinimo ir kitų operacijų metu labai rūpinamasi, kad būtų išvengta kryžminio užsikrėtimo. Būtina užtikrinti, kad į šiltnamius ir auginimui skirtas patalpas nepatektų jokie vabzdžiai kenkėjai, nes jie perneša bakteriją nuo vieno bandinio prie kito.

7.8.   Simptomai pradedami reguliariai stebėti po savaitės. Suskaičiuojami simptomų turintys augalai. C. m. subsp. sepedonicus sukelia baklažanų lapų vytimą, dėl kurio lapų pakraščiuose arba tarpgyslinėse vietose audinys ima nykti. Suvytęs audinys iš pradžių gali būti tamsiai žalias arba taškuotas, tačiau vėliau dėl vytimo, prieš virsdamas nekrotiniu audiniu, jis pabąla. Tarpgysliniai vytuliai atrodo taip, lyg būtų permirkę riebaluotu vandeniu. Nekrotinio audinio kraštai dažnai būna ryškiai geltoni. Augalai gali įveikti infekciją. Augalai nebūtinai sunyksta; kuo ilgiau simptomai vystosi, tuo didesnė išgyvenimo galimybė. Jauni baklažanai nedidelėms C. m. subsp. sepedonicus populiacijoms mažiau atsparūs nei senesni augalai, todėl būtina naudoti augalus, esančius trečioje lapelio stadijoje arba jos dar nepasiekusius.

Vytulių atsiradimą gali sukelti ir kitos stiebagumbių audinyje esančios bakterijos ir grybai. Joms priklauso Ralstonia solanacearum, Erwinia carotovora subsp. carotovora ir E. carotovora subsp. atroseptica, Erwinia chrysanthemi, Phoma exigua var. foveata, taip pat ir gausios saprofitinių bakterijų populiacijos. Ypač Erwinia chrysanthemi gali sukelti lapų vytulius, labai panašius į C. m. sepedonicus sukeliamus vytulius. Vienintelis skirtumas yra stiebų patamsėjimas užkrėtimo Erwinia chrysanthemi atveju. Kitus vytulius nuo C. m. subsp. sepedonicus sukeliamų vytulių galima atskirti pagal tai, kad visi lapai ir augalas labai greitai vysta. Atskirti galima ir pagal dažymąsi Gramo būdu: šiuo testu užkrėtimą C. m. subsp. sepedonicus galima atskirti nuo užkrėtimo Erwinia spp.

7.9.   Baklažanuose pastebėjus simptomų, reikėtų pakartoti išskyrimą, tam panaudojant augalų suvytusių lapų audinio arba stiebo audinio dalį (žr. 3.1.3 skirsnį apie audinio išmirkymą). Baklažanų lapų ir stiebų paviršiai suvilgomi 70 % etanoliu. Atliekamas IF arba PGR testas, jam naudojant baklažano sultis, ir atliekamas išskyrimas tinkamoje (selektyvioje) terpėje (žr. 8 skirsnį). Galima dažyti ir pagal Gramą (9 priedėlis). Identifikuojamos įtariamos išgrynintos C. m. subsp. sepedonicus ir patvirtinamas patogeniškumas (žr. 9 ir 10 skirsnius).

7.10.   Tam tikromis sąlygomis, ypač kai augimo sąlygos nėra optimalios, yra galimybė, kad C. m. subsp. sepedonicus baklažanuose sukels latentinę infekciją net praėjus 4 savaičių trukmės inkubaciniam laikotarpiui. Jei po 4 savaičių simptomai nėra stebimi, atliekamas 1 cm ilgio stiebo dalies sudėtinio bandinio, paimto iš aukščiau nei inokuliacijos vieta, IF/PGR testas. Jei testo rezultatai teigiami, reikėtų 8 skirsnyje nurodyta tvarka atlikti pakartotinį išskyrimą tinkamoje (selektyvioje) terpėje. Identifikuojamos įtariamos išgrynintos C. m. subsp. sepedonicus ir patvirtinamas patogeniškumas (žr. 9 ir 10 skirsnius).

Biotesto rezultatų aiškinimas

Biotesto tinkami rezultatai gaunami, kai teigiamuose kontroliniuose augaluose pasireiškia tipiški simptomai ir iš šių augalų galima pakartotinai išskirti bakterijas, o neigiamuose kontroliniuose augaluose simptomai nėra pastebimi.

Biotestas yra neigiamas, jei tiriamieji augalai nėra užkrėsti C. m. subsp. sepedonicus, ir laikomasi nuostatos, kad C. m. subsp. sepedonicus nustatomas teigiamuose kontroliniuose augaluose.

Biotestas yra teigiamas, jei tiriamieji augalai yra užkrėsti C. m. subsp. sepedonicus.

8.   C. M. SUBSP. SEPEDONICUS IŠSKYRIMAS

Pastaba:

Diagnozė baigiama tik tuo atveju, jei C. m. subsp. sepedonicus išskiriamas ir vėliau yra identifikuojamas (žr. 9 skirsnį) ir patvirtinamas patogeniškumas (10 skirsnis). Nors C. m. subsp. sepedonicus yra išrankus organizmas, jį galima išskirti iš simptominio audinio.

Tačiau jo augimą gali užmaskuoti peraugusios saprofitinės bakterijos, todėl tiesioginis išskyrimas iš stiebagumbio arba stiebo audinio nuosėdų yra sudėtingas (žr. 3.1.6 arba 3.2.5 skirsnį). Naudojant atrankinę terpę ir atitinkamai praskiedžiant pakartotinai suspenduotas bulvių stiebagumbių viršūnės gabaliukų nuosėdas, galima atlikti tiesioginį C. m. subsp. sepedonicus išskyrimą.

Išskirti reikia iš visų simptominių bulvių stiebagumbių ar stiebo segmentų ir iš baklažanų, kuriuose simptomai nebuvo stebimi, tačiau sudėtinio bandinio IF/PGR testo rezultatai buvo teigiami (žr. 7.10 skirsnį). Kai būtina, baklažanų stiebai išmirkomi 3.1.3 skirsnyje aprašyta tvarka.

Ruošiant teigiamus kontrolinius bandinius, yra atliekami C. m. subsp. sepedonicus štamų (pvz., NCPPB 4053 arba PD 406) 106 ksv/ml ląstelių suspensijos praskiedimai 1:10. Siekiant išvengti taršos, teigiami kontroliniai bandiniai paruošiami atskirai nuo tiriamųjų bandinių.

Kiekvienos selektyvios terpės partija prieš pradedant įprastinių bandinių tyrimą patikrinama pagal patogeno gebėjimą augti joje.

Kontrolinė medžiaga tiriama taip pat, kaip ir bandinys.

8.1.   Selektyvus pasėjimas į lėkšteles

8.1.1.   100 µl tūrio pakartotinai suspenduotas bulvių nuosėdų bandinys arba baklažanų sultys nuosėdų buferiniame tirpale praskiedžiamos praskiedimo 1:10 principu. (3 priedėlis).

8.1.2.   Išskyrimas iš nepraskiestų bulvių nuosėdų paprastai būna nesėkmingas dėl C. m. subsp. sepedonicus išrankaus augimo ir saprofitinių bakterijų konkurencijos. Kadangi užkrėstuose audiniuose bakterijos populiacija būna gausi, saprofitus galima pašalinti patogenui išliekant. Todėl rekomenduojama 100 µl kiekvieno bandinio praskiesti santykiu nuo 1:100 iki 1:10 000 MTNA arba NCP-88 terpėje (5 priedėlis) (jei naudojamos 90 mm skersmens Petri lėkštelės, tai tūris modifikuojamas, naudojant kitų dydžių plokšteles), naudojant skleistukus (L formos lazdeles) ir taikant paskleidimo lėkštelėje metodą.

Pastaba:

Kitas būdas yra 100 µl bulvių nuosėdų alikvotinės dalies pasėjimas paskleidimo būdu pirmoje agaru užpildytoje lėkštelėje, naudojant skleistuką, kuris vėliau perkeliamas į antrą lėkštelę, nuo jo pašalinant bet kokias nuosėdas ruožuojant; galiausiai ši operacija pakartojama trečioje lėkštelėje, sukuriant praskiedimo persėjimo į lėkšteles būdu efektą, tam naudojant skleistuką.

8.1.3.   Plokštelės inkubuojamos tamsoje 21–23 0C temperatūroje.

8.1.4.   Atliekant pradinius tyrimus po 3 dienų nustatomas į C. m. subsp. sepedonicus panašių kolonijų skaičius, vėliau jis nustatomas po 5, 7 ir galiausiai po 10 dienų.

8.2.   Įtariamų kolonijų gryninimas

Pastaba:

Į C. m. subsp. sepedonicus panašių kolonijų persėjimą reikėtų atlikti MGT terpėje baklažano inokuliacijai ir (arba) paskesniam identifikavimui; tai turėtų būti atliekama prieš kolonijų peraugimą lėkštelėse, pvz., geriausia po 3–5 dienų.

8.2.1.   Persėti į C. m. subsp. sepedonicus panašias kolonijas į vieną iš šių terpių: (jų sudėtis aprašyta 5 priedėlyje):

mitybinės dekstrozės agarą (tik persėjimui),

mielių peptono gliukozės agarą,

mielių ekstrakto mineralinių druskų agarą.

Inkubuoti 21–24 °C temperatūroje iki 10 dienų.

C. m. subsp. sepedonicus auga lėtai, dažnai per 10 dienų sudaro smeigtuko pavidalo kreminės spalvos skliautiškai išsidėsčiusias kolonijas (C. m. subsp. sepedonicus tipiškų kolonijų nuotraukų galima rasti tinklavietėje http://forum.europa.eu.int/Public/irc/sanco/Home/main).

8.2.2.   Dar kartą persėti siekiant sukurti gryną kultūrą.

Augimo greitį galima padidinti persėjimu. Tipiškos kolonijos yra balto kremo arba dramblio kaulo spalvos, retkarčiais geltonos spalvos, apvalios, lygios, išsipūtusios, sudarančios skliautą, gleivėtos, turinčios lygius kraštus, jų skersmuo yra 1-3 mm.

Paskesniam testavimui kolonijos atrenkamos jas dažant Gramo būdu (9 priedėlis).

8.2.3.   Įtariamas kolonijas identifikuoti (9 priedėlis) ir atlikti jų patogeniškumo testą (10 priedėlis).

9.   IDENTIFIKAVIMAS

Įtariamų C. m. subsp. sepedonicus izoliatų grynos kolonijos identifikuojamos taikant bent du testus, pagrįstus skirtingais biologiniais principais.

Atliekant kiekvieną testą, naudojami atitinkami etaloniniai štamai.

9.1.   Mitybiniai ir fermentiniai identifikavimo testai

Fenotipinės savybės, kurios paprastai stebimos arba nėra stebimos C. m. subsp. sepedonicus atveju, nustatomos Lelliott ir Stead (1987), Klement et al. (1990), Schaad (2001) ir anoniminio autoriaus (1987) aprašytais metodais.

Visos terpės turėtų būti inkubuojamos 21 °C temperatūroje ir, praėjus šešioms dienoms, tiriamos. Jei kolonijos neauga, terpės inkubuojamos dar 20 dienų.

Visi testai privalo būti atliekami naudojant žinomą C. m. subsp. sepedonicus kontrolinį bandinį. Atliekant mitybinius ir fiziologinius testus, naudojamas inokuliatas, persėtas į mitybinį agarą. Morfologinį palyginimą privaloma atlikti naudojant dekstrozės agare auginamas kolonijas.

Testai	Numatomas rezultatas
Oksidacijos/fermentacijos(O/F) testas	Inertiškas arba silpnaihidrolizuojasi
Oksidazės aktyvumas	–
Augimas 37 °C temperatūroje	–
Ureazės aktyvumas	–
Aeskulino hidrolizė	+
Krakmolo hidrolizė	– arba silpna hidrolizė
Tolerancija 7 % NaCl	–
Indolo sintezė	–
Katalazės aktyvumas	+
H2S sintezė	–
Citrato sunaudojimas	–
Želatinos suskystėjimas	–
Rūgštis iš glicerino	–
Rūgštis iš laktozės	– arba silpnas
Rūgštis iš ramnozės	–
Rūgštis iš salicino	–
Dažymasis pagal Gramą (9 priedėlis)	+

9.2.   IF testas

a)	Paruošti apytiksliai 106 ląstelių/1 ml IF buferinio tirpalo suspensiją (3 priedėlis).

b)	Paruošti dukart skiestų atitinkamų antiserumų serijas.

c)	Atlikti imunofluorescencinį testą (4 skirsnis).

d)	Imunofluorescencinio testo rezultatas laikomas teigiamu, jei jo metu nustatytas kultūros titras yra lygiavertis teigiamo kontrolinio bandinio titrui.

9.3.   PGR testas

a)	Paruošti apytiksliai 106 ląstelių/1 ml suspensiją ypač gryname vandenyje.

b)

100 µl ląstelių suspensijos 4 minutes uždaruose mėgintuvėliuose termostate arba vandens vonelėje pakaitinti 100 °C temperatūroje. Jei reikia, pridėti šviežiai paruošto NaOH, kad būtų pasiekta 0,05M galutinė koncentracija ir įvyktų ląstelių lizė. Po to bandinius galima saugoti –16–24 °C temperatūroje tol, kol jų prireiks.

c)	Atitinkamomis PGR procedūromis padauginami C..m. subsp. sepedonicus būdingi matricinės DNR fragmentai (pvz., Pastrik, 2000; žr. 4 priedėlį; Li ir de Boer, 1995; Mills et al., 1997; Pastrik ir Rainey, 1999; Schaad et al., 1999).

d)	C. m. subsp. sepedonicus identifikuojama, jei padauginti matricinės DNR fragmentai yra to paties dydžio ir pasižymi tuo pačiu restrikcinio fragmento ilgio polimorfizmu, kaip ir teigiamas kontrolinis štamas.

9.4.   FISH testas

a)	Paruošti apytiksliai 106 ląstelių/1 ml suspensiją ypač gryname vandenyje.

b)	Taikyti FISH procedūrą (žr. 5 skirsnį).

c)	FISH testo teigiamas rezultatas gaunamas, jei tiriant kultūrą ir teigiamą kontrolinį bandinį gaunamas tas pats rezultatas.

9.5.   Riebiųjų rūgščių tipo nustatymas (FAP)

a)	72 valandas auginti kultūrą triptikazės sojos agare (Oxoid) 21 °C (+/– 1°) temperatūroje.

b)	Riebiųjų rūgščių tipą nustatyti taip, kaip nurodyta (Janse, 1991; Stead, 1992).

c)

Riebiųjų rūgščių tipo nustatymo testo teigiamas rezultatas gaunamas, jei įtariamos kultūros riebiųjų rūgščių tipas atitinka teigiamo kontrolinio bandinio riebiųjų rūgščių tipą. C. m. sepedonicus būdingos riebiosios rūgštys yra 15:1 Anteiso A, 15:0 Iso, 15:0 Anteiso, 16:0 Iso, 16:0 ir 17:0. Kitos gentys, tokios kaip Curtobacterium, Arthrobacter ir Micrococcus, taip pat turi keletą šių rūgščių, tačiau 15:1 Anteiso A yra retai tarp šių bakterijų pasitaikanti riebioji rūgštis, nors visose Clavibacter spp. pasitaiko apie 1–5 %. C. m. sepedonicus atveju ši rūgštis pasitaiko apie 5 %.

9.6.   Bakterijos pasikartojančių sekų BOX padauginimas PGR metodu

a)	Paruošti apytiksliai 106 ląstelių/1 ml suspensiją ypač gryname vandenyje.

b)	Testą atlikti taip, kaip nurodyta (Smith et al., 2001).

10.   PATVIRTINIMO TESTAS

Patogeniškumo testą privaloma atlikti galiausiai diagnozuojant C. m. subsp. sepedonicus ir įvertinant kultūrų, identifikuojamų kaip C. m. subsp. sepedonicus, virulentiškumą.

10.1.   Paruošti apytiksliai 106 ląstelių, paimtų po 3 dienų auginimo iš atitinkamo teigiamo C. m. subsp. sepedonicus bandinio tiriamojo izoliato kultūrų ir atitinkamo teigiamo kontrolinio C. m. subsp. sepedonicus štamo, inokuliatą.

10.2.   Inokuliuoti 5–10 baklažanų daigų 3 lapelio stadijoje esančius stiebus (7.3 arba 7.4 skirsnis).

10.3.   Inkubuoti 18–24 °C temperatūroje, esant pakankamai šviesos ir palyginti daug drėgmės, tinkamai laistant, stengiantis išvengti permirkimo arba sausros sukeliamo poveikio (7.7 skirsnis). Esant grynoms kultūroms, tipiškas vytimas turėtų įvykti po 2 savaičių, tačiau augalų simptomų nebus stebima (žr. 7.8 skirsnį). Pasibaigus šiam laikotarpiui, augalai dar 3 savaitėms inkubuojami esant baklažanų augimui palankiai temperatūrai, neviršijančiai 25 °C (8 priedėlis). Jei po 3 savaičių simptomai nėra stebimi, C. m. subsp. sepedonicus kultūros negalima laikyti patogenine.

10.4.   Išskirti iš simptominių augalų, nupjaunant stiebo dalį 2 cm virš inokuliavimo vietos. Pašalinta dalis susmulkinama ir suspenduojama nedideliame sterilaus distiliuoto vandens tūryje arba 50 mM fosfatiniame buferiniame tirpale (3 priedėlis). Išskiriama iš suspensijos skiedimo būdu paskleidžiant arba ruožuojant į MTNA ir YPGA terpes (5 priedėlis), 3–5 dienas inkubuojama 21–23 °C temperatūroje ir stebimas C. m. subsp. sepedonicus tipiškų kolonijų susiformavimas.

II PRIEDAS

1.

Kiekvienu įtariamu organizmo buvimo atveju, kai taikant I priede išdėstytus metodus buvo gautas teigiamas atrankos testo rezultatas, ir baigus šį tyrimą yra laukiama patvirtinimo arba paneigimo, reikia atskirti ir tinkamai užkonservuoti: — visus atrinktus bandiniams stiebagumbius ir, jei įmanoma, visus atrinktus augalus, — bet kurį likusį ekstraktą ir atrankos testui paruoštą papildomą medžiagą, pvz., imunofluorescencines skaidres, ir — visus atitinkamus dokumentus, kol tyrimas taikant minėtus metodus bus baigtas. Atskyrus stiebagumbius, tam tikrais atvejais bus galima ištirti įvairias veisles.

2.

Jeigu organizmo buvimas patvirtinamas, reikia atskirti ir tinkamai užkonservuoti: — visą medžiagą, minėtą 1 dalyje, ir — užkrėstos baklažanų medžiagos bandinį, kuris buvo inokuliuotas stiebagumbio arba augalo ekstraktu, ir — išskirtą organizmo kultūrą, mažiausiai per vieną mėnesį nuo pranešimo 5 straipsnio 2 dalyje nurodyta tvarka.

III PRIEDAS

1.

Nustatant galimo užkrėtimo mastą pagal 5 straipsnio 1 dalies b punktą, reikia atsižvelgti į: — stiebagumbius ir augalus, auginamus produkcijos gamybos vietoje, kuri laikoma užkrėsta pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, — produkcijos gamybos vietą (-as), kuri susijusi su stiebagumbiais ar augalais, laikomais užkrėstais pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, įskaitant tas, kur tiesiogiai arba tiekėjui tarpininkaujant per tą patį tiekėją yra dalijamasi gamybos įranga ir priemonėmis, — stiebagumbius arba augalus, esančius produkcijos gamybos vietoje(-ose), kuri(-ios) minima(-os) ankstesnėje įtraukoje, arba esančius tokioje(-iose) gamybos vietoje(-ose), tuo laikotarpiu, kai stiebagumbiai ir augalai, laikomi užkrėstais pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, buvo produkcijos gamybos vietoje, kuri minima pirmojoje įtraukoje, — patalpas, kuriose laikomos bulvės, užaugintos produkcijos gamybos vietose, nurodytose ankstesnėse įtraukose, — bet kokią techniką, transporto priemonę, laivą, saugyklą arba jų dalis ir visus kitus atitinkamus objektus, įskaitant pakuotę, kurie galėjo turėti sąlytį su stiebagumbiais arba augalais, laikomais užkrėstais pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, — bet kokius stiebagumbius arba augalus, laikomus arba turėjusius sąlytį su bet kokiomis struktūromis ar objektais, minėtais ankstesnėje įtraukoje, iki tokių struktūrų ar objektų išvalymo ir dezinfekavimo, — taip pat, atlikus tyrimą pagal 6 straipsnį, stiebagumbius arba augalus, susijusius motininiais ar seseriniais klonavimo ryšiais su stiebagumbiais arba augalais, kurie laikomi užkrėstais pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, ir kurie, kaip buvo nustatyta, neužkrėsti organizmu, tačiau užkrėtimo galimybė dėl klonavimo kilmės yra didelė. Galima tirti veislę užkrėstų ir klonavimu susijusių stiebagumbių ar augalų identitetui nustatyti, — stiebagumbių ar augalų, nurodytų ankstesnėje įtraukoje, produkcijos gamybos vietą (-as).

2.	Nustatant galimą išplitimą pagal 5 straipsnio 1 dalies c punktą reikia atsižvelgti į: — arti esančias kitas produkcijos gamybos vietas, kuriose auginamos bulvės arba kiti augalai šeimininkai, — bendro gamybos proceso metu gautų ir naudotų sėklinių bulvių atsargas.

3.

Pagal 5 straipsnio 2 dalies pirmąją pastraipą informuojama: — nedelsiant, nustačius organizmą laboratorijoje I priede išdėstytais metodais, nurodant bent: — bulvių siuntos veislės pavadinimą, — bulvių tipą (maistinės, sėklinės ir pan.) ir tam tikrais atvejais – sėklinių bulvių kategoriją, — kai yra pavojus, kad iš kitos (-ų) valstybės (-ių) narės (-ių) ar į jas pateks užkrėstos bulvės, valstybė narė, kurioje toks atvejis buvo patvirtintas, nedelsdama pateikia suinteresuotai (-oms) valstybei (-ėms) narei (-ėms) informaciją, būtiną, kad būtų laikomasi 5 straipsnio 3 dalies nuostatų, nurodydama: — bulvių siuntos veislės pavadinimą, — krovinio siuntėjo ir krovinio gavėjo pavadinimą ir adresą, — bulvių siuntos pristatymo dieną, — pristatytos bulvių siuntos dydį, — augalo paso kopiją arba tam tikrais atvejais – bent augalo paso numerį arba tam tikrais atvejais – augintojo arba prekiautojo registravimo numerį bei pranešimo apie pristatymą kopiją. Pateikus šią informaciją, apie tai yra nedelsiant pranešama Komisijai. — Baigus visus tyrimus, visuomet yra pateikiama: — užkrėtimo patvirtinimo diena, — tyrimo, atlikto užkrėtimo šaltiniui ir galimam plitimui nustatyti, įskaitant bandinių ėmimo lygį, trumpas aprašymas, — informacija apie identifikuotą (-us) arba tariamą (-us) užkrėtimo šaltinį (-ius), — duomenys apie nustatyto užkrėtimo mastą, įskaitant produkcijos gamybos vietų skaičių ir siuntų skaičių, nurodant veislę ir, jei sėklinės bulvės, kategoriją, — duomenys apie teritorijos demarkavimą, įskaitant produkcijos vietų, kurios nelaikomos užkrėstomis, bet esančios toje teritorijoje, skaičių, — Komisijai pareikalavus – bet kokią kitą informaciją apie patvirtintą protrūkį.

IV PRIEDAS

1.

Oficialiai prižiūrimos priemonės, minimos 7 straipsnio 1 dalyje, yra tokios: — panaudojimas gyvūnų pašarui po terminio apdorojimo, užtikrinant, kad nėra organizmo išlikimo pavojaus, arba — pašalinimas oficialiai tam tikslui patvirtintoje atliekų šalinimo vietoje, kurioje nėra nustatyto pavojaus, kad patogenai pateks į aplinką, pvz., nutekės į dirbamą žemės plotą, arba — sudeginimas, arba — panaudojimas pramoniniam perdirbimui tiesiai ir skubiai pristatant į perdirbimo cechą, kuriame yra oficialiai patvirtinti atliekų šalinimo įrenginiai, nustačius, kad nėra organizmo išplitimo pavojaus ir kur yra bent išvykstančių transporto priemonių valymo ir dezinfekavimo sistema, arba — kitos priemonės, jeigu užtikrinama, kad nėra organizmo išplitimo pavojaus; apie tokias priemones ir jų patvirtinimą turi būti pranešta Komisijai ir kitoms valstybėms narėms. Visos likusios atliekos, susijusios su pirmiau nurodytais atliekų šalinimo procesais, arba atsiradusios jų metu, yra pašalinamos oficialiai patvirtintais metodais pagal šios direktyvos V priedo nuostatas.

2.

Tinkamos stiebagumbių arba augalų, laikomų galbūt užkrėstais pagal 5 straipsnio 1 dalies b punktą, kaip minėta 7 straipsnio 2 dalyje, panaudojimo ar sunaikinimo priemonės, taikomos kontoliuojant valstybės narės atsakingoms oficialioms institucijoms ir joms atitinkamai bendradarbiaujant, kai siekiama visada užtikrinti tokią kontrolę ir patvirtinimą, atliktą valstybės narės atsakingų oficialių institucijų, kad bulvės yra pakuojamos ar perdirbamos tose įmonėse, kuriose yra pirmojoje ir antrojoje įtraukose minimi atliekų šalinimo įrenginiai, yra šios: — naudojimas kaip maistinių bulvių, skirtų žmonėms vartoti, supakuotų tiesioginiam pristatymui ir naudojimas neperpakuojant vietoje, kurioje naudojami atitinkami atliekų šalinimo įrenginiai. Bulvės, skirtos sodinti gali būti tvarkomos toje pačioje vietoje, jei tai atliekama atskirai, ar baigus valymą ir dezinfekavimą, arba — naudojimas kaip maistinių bulvių, skirtų pramoniniam perdirbimui ir tiesioginiam ir neatidėliotinam pristatymui į perdirbimo įmonę, kurioje yra tinkami atliekų šalinimo įrenginiai arba yra naudojama bent išvykstančių transporto priemonių valymo ir dezinfekavimo sistema, arba — kitas panaudojimas ar šalinimas, nustačius, kad nėra organizmo išplitimo pavojaus ir patvirtinus minėtoms atsakingoms oficialioms institucijoms.

3.	Tinkamais objektų, minimų 7 straipsnio 3 dalyje, valymo ir dezinfekavimo metodais laikomi tie, kurie neleidžia organizmui išplisti ir yra taikomi prižiūrint atsakingoms oficialioms valstybių narių institucijoms.

4.	Priemonės, kurias valstybės narės įgyvendina demarkuotoje teritorijoje, nustatytoje pagal 5 straipsnio 1 dalies c punktą ir minimoje 7 straipsnio 4 dalyje, yra šios:

4.1.

produkcijos gamybos vietose, kurios laikomos užkrėstomis pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą: a) lauke, kuris laikomas užkrėstu pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą: i) — mažiausiai trejus auginimo metus, einančius po tų, kuriais buvo nustatytas užkrėtimas, — yra imamasi priemonių, stengiantis išnaikinti savaime augančius bulvių augalus ir kitus natūraliai aptiktus organizmo šeimininkus, ir — jokie stiebagumbiai, augalai, tikrosios sėklos ar kiti natūraliai aptinkami augalai šeimininkai ar kitos kultūros, keliančios organizmo išplitimo pavojų, negali būti sodinami, — pirmąjį bulvių auginimo sezoną, einantį po ankstesnėje įtraukoje apibūdinto laikotarpio, ir laikantis sąlygos, kad bent dvejus pastaruosius metus iki sodinimo patikrinimo metu lauke nebuvo rasta savaime sudygstančių bulvių augalų ar kitų natūraliai augančių organizmo šeimininkų, leidžiama auginti tik maistines bulves ir surinktas stiebagumbių derlius tiriamas I priede nurodyta tvarka; — bulvių auginimo sezoną, einantį po ankstesnėje įtraukoje minimo sezono, ir pasibaigus atitinkamam sėjomainos ciklui, kuris tęsiasi mažiausiai du metus, jei ketinama auginti sėklines bulves, gali būti auginamos sėklinės arba maistinės bulvės, taip pat atliekamas oficialus tyrimas, kaip apibūdinta 2 straipsnio 1 dalyje; arba ii) — ketverius auginimo metus po tų, kuriais buvo nustatytas užkrėtimas, — yra imamasi priemonių, stengiantis išnaikinti savaime sudygstančius bulvių augalus ir kitus natūraliai aptiktus organizmo šeimininkus, — laukas paliekamas pūdymui arba daugiametei ganyklai, kuri dažnai visiškai nupjaunama arba kurioje yra intensyviai ganoma, — pirmąjį bulvių auginimo sezoną, einantį po ankstesnėje įtraukoje apibūdinto laikotarpio, ir laikantis sąlygos, kad bent dvejus pastaruosius metus iki sodinimo patikrinimo metu lauke nebuvo rasta savaime sudygstančių bulvių augalų ar kitų natūraliai augančių organizmo šeimininkų, leidžiama auginti sėklines ar maistines bulves, ir surinktas stiebagumbių derlius tiriamas I priede nurodyta tvarka; b) kituose užkrėstuose laukuose laikantis sąlygos, kad atsakingos oficialios institucijos patvirtina, jog yra pašalintas natūraliai sudygstančių bulvių augalų arba kitų natūraliai aptinkamų organizmo šeimininkų keliamas pavojus: — auginimo metais, einančiais po tų metų, kuriais buvo nustatytas užkrėtimas, jokie stiebagumbiai, augalai, tikrosios sėklos ar kiti natūraliai aptinkami augalai šeimininkai negali būti sodinami, arba — sertifikuotos sėklinės bulvės gali būti sodinamos tiktai maistui, — antrais auginimo metais po tų metų, kuriais buvo nustatytas užkrėtimas, tik sertifikuotos sėklinės bulvės ar sėklines bulves, kurias oficialiai patikrinus žiedinio puvinio nebuvo rasta ir kurios auginamos produkcijos gamybos vietose, kitose nei nurodytos 4.1 dalyje, yra auginamos sėklai arba maistui, — bent trečiais auginimo metais po tų metų, kuriais buvo nustatytas užkrėtimas, tik sertifikuotos sėklinės bulvės ar sėklinės bulvės, kurios išaugintos atliekant oficialią kontrolę iš sertifikuotų sėklinių bulvių, yra auginamos sėklai arba maistui, — kiekvienais auginimo metais, nurodytais pirmesnėse įtraukose, imamasi priemonių pašalinti savaime sudygstančius bulvių augalus ar kitus natūraliai augančius organizmo šeimininkus, ir bulvių derlius iš kiekvieno lauko yra oficialiai patikrinamas I priede nurodyta tvarka, c) iškart po to, kai nustatomas užkrėtimas pagal 5 straipsnio 1 dalies a punktą, ir po sekančių auginimo metų, produkcijos gamybos vietose esantys visi mechanizmai ir sandėliavimo įranga, naudojami bulvių gamybos proceso metu, valomi ir dezinfekuojami, kaip nurodyta 3 dalyje; d) tose gamybos sistemose, kur galima visiškai pakeisti auginimo terpę, — jokie stiebagumbiai, augalai ar tikrosios sėklos nesodinami, kol produkcijos gamybos vietoje nebus imtasi oficialiai prižiūrimų priemonių, skirtų organizmui išnaikinti ir pašalinti visą augalų šeimininkų medžiagą, įskaitant bent jau auginimo terpės pakeitimą ir produkcijos gamybos vietoje esančių objektų valymą ir dezinfekavimą, ir visos įrangos pakeitimą, o paskui iš atsakingų oficialių institucijų gauti leidimą bulvių produkcijai gaminti, ir — bulvės auginamos iš sertifikuotų sėklinių bulvių arba iš minigumbų ar mikroaugalų, gautų iš patikrintų šaltinių.

4.2.

Nepažeisdamos 4.1 dalyje apibūdintų priemonių, demarkuotoje teritorijoje valstybės narės: a) nedelsdamos po nustatyto užkrėtimo užtikrina visų mašinų ir saugojimo patalpų, naudojamų bulvių produkcijos gamyboje valymą ir dezinfekciją, kaip numatyta, ir pagal atitinkamus metodus, kaip nurodyta 3 punkte; b) nedelsdamos ir mažiausiai tris auginimo sezonus po nustatyto užkrėtimo: — užtikrina, kad jų atsakingos oficialios institucijos prižiūrėtų vietas ir patalpas, kur yra auginami, laikomi ir apdorojami bulvių stiebagumbiai, taip pat patalpas, kur bulvių apdorojimo mašinomis dirbama pagal sutartį, — reikalauja, kad toje teritorijoje būtų sodinamos tik sertifikuotos sėklinės bulvės arba sėklinės bulvės, išaugintos vykdant oficialią kontrolę ir tiriamos po sėklinių bulvių pasėlių derliaus nuėmimo produkcijos gamybos vietose, laikomomis galbūt užkrėstomis pagal 5 straipsnio 1 dalies b punktą, — reikalauja, kad būtų atskirai apdorojamas nukastų sėklinių bulvių derlius ir tos maistinės bulvės, kurios buvo laikomos visuose toje teritorijoje esančiuose sandėliuose, arba kad tarp sėklai ir maistui skirtų bulvių atsargų tvarkymo būtų taikoma valymo ir dezinfekavimo sistema, — atlieka oficialų tyrimą, kaip nustatyta 2 straipsnio 1 dalyje; c) prireikus per reikiamą laikotarpį parengia visų sėklinių bulvių atsargų pakeitimo programą.

V PRIEDAS

Kad būtų išvengta nustatyto organizmo plitimo pavojaus, taikant IV priedo 1 dalyje nurodytus oficialiai patvirtintus atliekų šalinimo metodus yra laikomasi šių sąlygų:

i)

bulvių atliekos (įskaitant ir netinkamas bulves bei lupenas) ir kitos kietosios su bulvėmis susijusios atliekos (įskaitant ir dirvožemį, akmenis bei nuolaužas) yra pašalinamos — oficialiai tam tikslui patvirtintoje atliekų šalinimo vietoje, kurioje nėra nustatyto pavojaus, kad kenksmingasis organizmas pateks į aplinką, pvz., nutekės į dirbamą žemės plotą. Atliekos yra saugiai pristatomos tiesiai į šalinimo vietą, užtikrinant, kad jokia jų dalis nebus išbarstyta, arba — jas sudeginant, arba — kitomis priemonėmis, jeigu užtikrinama, kad nėra organizmo išplitimo pavojaus. Apie tokias priemones turi būti pranešta Komisijai ir kitoms valstybėms narėms.

ii)

skystos atliekos: prieš pašalinant skystas atliekas, savo sudėtyje turinčias kietų dalelių, šios dalelės pašalinamos filtruojant arba nusodinamos. Šios dalelės pašalinamos kaip nurodyta i papunktyje. Tuomet skystos atliekos: — prieš pašalinant mažiausiai 30 minučių yra kaitinamos mažiausiai 60 °C temperatūroje, užtikrinant tokią temperatūrą visame jų tūryje, arba — yra kitaip pašalinamos, oficialiai tam pritarus ir oficialiai kontroliuojant, kad nebūtų pavojaus atliekoms patekti į dirbamą žemę. Apie atliekų pašalinimo metodo detales yra pranešama kitoms valstybėms narėms ir Komisijai.

Šiame priede pateikti šalinimo būdai taip pat taikomi atliekoms, susidarančioms tvarkant, šalinant ir perdirbant užkrėstų bulvių siuntas.