1.1.1.1.

Az ELISA-lemezeket 9,6 pH-értékű karbonát/bikarbonát pufferoldatban hígított rekombináns ALPV-4 VP7-tel vonjuk be. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C-on.

1.1.1.2.

A lemezeket ötször kimossuk 0,01 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó desztillált vízzel (mosóoldat). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

1.1.1.3.

Blokkoljuk a lemezeket 7,2 pH-értékű, foszfáttal pufferelt sóoldat (PBS) és 5 % (w/v) sovány tej (Nestlé Dry Skim MilkTM) lyukanként 200 μl-nyi keverékével egy órán át 37 °C-on.

1.1.1.4.

Távolítsuk el a blokkoló oldatot, és finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz.

1.1.2.1.

A vizsgálandó szérummintákat, valamint a pozitív és negatív kontrollszérumokat 1:25 arányban PBS, 5 % (w/v) sovány tej és 0,05 % (v/v) Tween-20 lyukanként 100 μl-nyi keverékében hígítjuk. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

Titráláshoz készítsünk kétszeres hígítási sort 1:25 aránytól kezdve (lyukanként 100 μl), a lemez minden oszlopában egy szérumból, majd ugyanezt a pozitív és negatív kontrollszérumból is. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

1.1.2.2.

A lemezeket ötször kimossuk 0,01 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó desztillált vízzel (mosóoldat). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

1.1.3.1.

Adagoljunk lyukanként 100 μl-nyi, PBS, 5 % tej és 0,05 % Tween-20 7,2 pH értékű keverékében hígított torma-peroxidázzal (HRP) konjugált anti-ló gamma-globulint. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

1.1.3.2.

A lemezeket ötször kimossuk 0,01 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó desztillált vízzel (mosóoldat). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

1.1.4.1.

Adjunk mindegyik lyukhoz 200 μl kromogén-/szubsztrátoldatot (10 ml 80,6 mM DMAB (dimetil-aminobenzaldehid) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metil-2-benzo-tiazolin hidrazon hidroklorid) + 5 μl H2O2).

A színképződést kb. 5–10 perccel később 50 μl 3N H2SO4 hozzáadásával állítjuk le (mielőtt a negatív kontrollszérum elszíneződne).

Más kromogének is alkalmazhatók, mint pl. az ABTS (2,2′-azino-bisz-[3-etilbenzotiazolin-6-szulfonsav]), TMB (tetra-metil benzidin) vagy az OPD (orto-fenildiamin).

1.1.4.2.

Olvassuk le a lemezeket 600 (vagy 620) nm-en.

1.2.1.

A küszöbértéket úgy számítjuk ki, hogy 0,06-ot hozzáadunk a negatív kontroll értékéhez (0,06 a standard szórás 30 negatív szérumból származtatva).

1.2.2.

A küszöbértéknél alacsonyabb abszorpciós értéket mutató vizsgált mintákat negatívnak tekintjük.

1.2.3.

A küszöbérték + 0,15-nél nagyobb abszorpciós értéket mutató vizsgált mintákat pozitívnak tekintjük.

1.2.4.

A köztes abszorpciós értéket mutató vizsgált minták kétesnek tekintendők, ezért egy második technikát kell alkalmazni az eredmények megerősítéshez.

2.1.1.1.

Az ELISA-lemezeket 9,6 pH-értékű karbonát/bikarbonát pufferoldatban hígított, 50-100 ng mennyiségű rekombináns ALPV-4 VP7-tel vonjuk be. A lemezeket egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C-on.

2.1.1.2.

A lemezeket háromszor kimossuk 0,135 M NaCl-ot és 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, 0,1× foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

2.1.2.1.

A vizsgálandó szérummintákat, valamint a pozitív és negatív kontrollszérumokat 1:5 arányban 0,35 M NaCl, 0,05 % (v/v) Tween-20 és 0,1 % Kathon lyukanként 100 μl-nyi keverékében hígítjuk. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

Titráláshoz készítsünk a vizsgálandó szérumokból kétszeres hígítási sort 1:10 aránytól 1:280 arányig 8 lyukban (lyukanként 100 μl), a lemez minden oszlopában egy szérumból, majd ugyanezt a pozitív és negatív kontrollszérumból is. Egy órán át 37 °C-on inkubáljuk.

2.1.2.2.

A lemezeket ötször kimossuk 0,135 M NaCl-ot és 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, 0,1× foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

2.1.3.1.

Adagoljunk lyukanként 100 μl-nyi, torma-peroxidázzal konjugált mea anti-VP7-et. Előzetesen ezt a mea-t 1/5 000–1/15 000 arányban hígították StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Referencia: SZ03) és desztillált víz 1/1 arányú oldatában. 30 percig 37 °C-on inkubáljuk.

2.1.3.2.

A lemezeket ötször kimossuk 0,135 M NaCl-ot és 0,05 % (v/v) Tween-20-at tartalmazó, 0,1× foszfáttal pufferelt sóoldattal (PBST). Finoman ütögessük a lemezeket nedvszívó anyaghoz, hogy a rajtamaradt oldatot eltávolítsuk.

2.2.1.

Határozzuk meg minden egyes minta blokkoló százalékát (BSz) a következő képlet használatával, amelynél az „Ea” ellenanyagot jelöl:

2.2.2.

Az 50 %-nál magasabb BSz értéket mutató minták ALPV ellenanyagokra pozitívnak tekintendők.

2.2.3.

A 45 %-nál alacsonyabb BSz értéket mutató minták ALPV ellenanyagokra negatívnak tekintendők.

2.2.4.

A 45-50 % közötti BSz értékeket mutató minták kétesnek tekintendők, és újra kell azokat vizsgálni. Amennyiben az eredmény ismételten kétes, a kétes minta vételétől számított legalább két hét elteltével az állatoktól újabb mintát kell venni.

—

a nukleinsavak fenol-kloroform extrakciója;

—

a nukleinsavak adszorpciója egy filter rendszerre;

—

a nukleinsavak adszorpciója egy mágneses gyöngy-rendszerre;

1.1.

1 g szövetmintát 1 ml denaturáló oldatban (4 M guanidium-tiocianát, 25 mM nátrium-citrát, 0,1 M 2-merkaptoetanol, 0,5 % sarcosyl) homogenizálunk.

1.2.

A centrifugálást követően a felülúszóhoz hozzáadjuk 1 μg élesztő RNS, 0,1 ml 2 M-os, 4 pH-értékű nátrium-acetát, 1 ml fenol és 0,2 ml kloroform/izoamil-alkohol keverékét (49/1).

1.3.

A szuszpenziót erősen felrázzuk, majd 15 percig jégen hűtjük.

1.4.

A centrifugálást követően a vizes fázisban jelenlévő RNS-t fenollal kivonjuk, etanollal precipitáljuk, majd steril vízben újraszuszpendáljuk.

—

forward primer

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

—

reverse primer

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

—

MGB-TaqMan próba

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1.

A primer törzskoncentrációt 8 μM munkakoncentrációra hígítjuk („8 μM primer munkatörzs”), a próbát pedig 50 μM munkakoncentrációra hígítjuk („50 μM próba munkatörzs”). Alakítsunk ki egy tesztlemez tervet és töltsük be azt a valós idejű PCR készülék szoftverébe. A tervet használva útmutatóként, minden egyes 8 μM-os primer törzsoldatból 2,5 μl-nyit (végső koncentráció 1 μM) hozzáadunk minden egyes lyukhoz, amely RNS mintákat, pozitív és/vagy negatív kontrollokat fog tartalmazni (a primer oldat végső koncentrációja 1 μM 20 μl RT-PCR oldatban). A lemezt jégen tároljuk.

2.1.2.

Az izolált RNS (tesztminták és pozitív kontroll) 2 μl-jét, illetve negatív reakciós kontrollok esetén 2 μl RNáz-mentes vizet keverünk el a forward és reverse primerekkel. Ezt a keveréket 5 percig 95 °C-ra hevítve denaturáljuk, ezt gyors hűtés követi a jégen legalább 5 percig.

2.1.3.

A vizsgálandó minták számára megfelelő mennyiségű valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeveréket készítünk a gyártó utasításait követve. Minden RNA-mintát tartalmazó lyukhoz 0,1 μl 50 μM-os próba törzsoldatot adunk (a próbaoldat koncentrációja 0,25 μM minden RNA-mintát tartalmazó lyuk esetében). A valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeverékből 13 μl-nyit oszlatunk el minden egyes lyukban a denaturált primereket és RNS-t tartalmazó PCR lemezen.

2.1.4.

A lemezt egy reverz transzkripcióra és cDNS amplifikációra/fluoreszcencia detektálásra programozott valós idejű thermal cycler-be helyezzük. Az amplifikációs körülmények a következőkből állnak: első reverz transzkripciós lépés 48 °C-on 25 percig, majd 10 percig 95 °C-on („forró start”), ezután egy 95 °C-on 15 másodpercből, 55 °C-on 35 másodpercből és 72 °C-on 30 másodpercből álló ciklus 40-szer ismételve (vagy 40 ciklusnyi 97 °C 2 másodpercig és 55 °C 30 másodpercig, amennyiben gyors reakciókat lehetővé tevő reagenseket és a termocyler-t használnak). A fluoreszcencia adatokat az 55 °C-os lépés végén vesszük fel.

2.1.5.

A vizsgálat érvénytelennek tekintendő, ha atípusos amplifikációs görbéket kaptunk, és meg kell azt ismételni.

A minták pozitívnak tekintendők, ha a Ct érték (azon ciklus száma, amelynél a reakcióban generált fluoreszcencia meghaladja a fluoreszcencia küszöbértéket) kisebb vagy egyenlő a meghatározott Ct küszöbértékkel (35) 40 PCR cikluson belül (Ct ≤ 35).

A minták kétesnek tekintendők, ha a Ct érték magasabb mint a meghatározott Ct küszöbérték (35) 40 PCR cikluson belül (Ct > 35).

A minták negatívnak tekintendők, ha egy horizontális amplifikációs görbét nyerünk, amely nem keresztezi a küszöbvonalat 40 PCR cikluson belül.

—

forward primer

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

—

reverse primer

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

—

MGB-TaqMan próba

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1.

A primer és próba keverék törzsoldatokat 25x, 5 μΜ-os koncentrációban készítjük el a forward és reverse primerek esetén, 3 μΜ-osan pedig a próba esetében. Alakítsunk ki egy tesztlemez tervet és töltsük be azt a valós idejű PCR készülék szoftverébe. A tervet használva útmutatóként, RNS mintákból 5 μl-t, beleértve a tesztmintákat, valamint pozitív és negatív kontrollokat, hozzáadunk a lemez megfelelő lyukaihoz a tervet követve.

2.2.2.

Az RNS-t 5 percig 95 °C-ra hevítve denaturáljuk, ezt gyors hűtés követi a jégen legalább 3 percig.

2.2.3.

A vizsgálandó minták számára megfelelő mennyiségű valós idejű egylépcsős RT-PCR mesterkeveréket készítünk a gyártó utasításait követve. 1 μl 25× primer próba keverék törzsoldatot (a fenti 2.2.1. pontból) adunk a mesterkeverékhez, így minden egyes lyukban 200 nM-os végleges koncentrációt érünk el minden primer és 120 nM-t a próba esetében. A mesterkeverékből 20 μl-nyit oszlatunk el minden egyes lyukban a denaturált primereket tartalmazó PCR lemezen.

2.2.4.

A lemezt egy reverz transzkripcióra és cDNS amplifikációra/fluoreszcencia detektálásra programozott valós idejű thermal cycler-be helyezzük a gyártó javaslata szerint. Az amplifikációs körülmények például a következőkből állnak: első reverz transzkripciós lépés 48 °C-on 10 percig, majd 95 °C-on 10 percig, ezután 95 °C-on 15 másodpercből és 60 °C-on 45 másodpercből álló ciklus 40-szer ismételve.

2.2.5.

A minták pozitívnak tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az AHSV RT-PCR vizsgálatnál meghaladja a 0,1-es küszöböt 36 PCR cikluson belül a minta összes replikátumában.

A minták kétesnek tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az AHSV RT-PCR vizsgálatnál meghaladja a 0,1-es küszöböt 36-40 PCR ciklus között a minta bármely replikátumában.

A minták negatívnak tekintendők, ha a normalizált fluoreszcencia az RT-PCR vizsgálatnál nem haladta meg a 0,1-es küszöböt 40 PCR cikluson belül a minta összes replikátumában, és ha a normalizált fluoreszcencia a védett szintetikus külső kontrollteszt esetében meghaladja a 0,1-es küszöböt 33 PCR cikluson belül.