„PRILOG 1.

SVOJSTVA MASLINOVA ULJA

Kategorija

Etil esteri masnih kiselina (FAEE) mg/kg (*)

Kiselost (%) (*)

Peroksidni broj mEq O2/kg (*)

Voskovi mg/kg (**)

2-gliceril monopalmitat (%)

Stigmastadieni mg/kg (1)

Razlika: ECN42 (HPLC) i ECN42 (2) (teoretski izračun)

K232 (*)

K268 or K270 (*)

Delta-K (*)

Organoleptičko ocjenjivanje Medijan mana (Mm) (*)

Organoleptičko ocjenjivanje Medijan voćnosti (Mv) (*)

1. Ekstra djevičansko maslinovo ulje

FAEE ≤ 40 (godina usjeva 2013. – 2014.) (3) FAEE ≤ 35 (godina usjeva 2014. – 2015.) FAEE ≤ 30 (godine usjeva nakon 2015.)

≤ 0,8

≤ 20

≤ 0,9 ako je ukupni % palmitinske kiseline ≤ 14 %

≤ 0,05

≤ |0,2|

≤ 2,50

≤ 0,22

≤ 0,01

Mm = 0

Mv > 0

≤ 1,0 ako je ukupni % palmitinske kiseline > 14 %

2. Djevičansko maslinovo ulje

—

≤ 2,0

≤ 20

≤ 0,9 ako je ukupni % palmitinske kiseline ≤ 14 %

≤ 0,05

≤ |0,2|

≤ 2,60

≤ 0,25

≤ 0,01

Mm ≤ 3,5

Mv > 0

≤ 1,0 ako je ukupni % palmitinske kiseline > 14 %

3. Maslinovo ulje lampante

—

> 2,0

—

(4)

≤ 0,9 ako je ukupni % palmitinske kiseline ≤ 14 %

≤ 0,50

≤ |0,3|

—

—

—

Mm > 3,5 (5)

—

≤ 1,1 ako je ukupni udjel palmitinske kiseline > 14 %

4. Rafinirano maslinovo ulje

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 0,9 ako je ukupni % palmitinske kiseline ≤ 14 %

—

≤ |0,3|

—

≤ 1,10

≤ 0,16

—

—

≤ 1,1 ako je ukupni udjel palmitinske kiseline > 14 %

5. Maslinovo ulje koje se sastoji od rafiniranih i djevičanskih maslinovih ulja

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 0,9 ako je ukupni % palmitinske kiseline ≤ 14 %

—

≤ |0,3|

—

≤ 0,90

≤ 0,15

—

—

≤ 1,0 ako je ukupni % palmitinske kiseline > 14 %

6. Sirova komina maslina

—

—

—

(6)

≤ 1,4

—

≤ |0,6|

—

—

—

—

—

7. Rafinirano ulje komine maslina

—

≤ 0,3

≤ 5

≤ 1,4

—

≤ |0,5|

—

≤ 2,00

≤ 0,20

—

—

8. Ulje komine maslina

—

≤ 1,0

≤ 15

≤ 1,2

—

≤ |0,5|

—

≤ 1,70

≤ 0,18

—

—

Kategorija

Sastav masnih kiselina (7)

Suma transoleinskih izomera (%)

Suma translinolnih i translinolenskih izomera (%)

Sastav sterola

Ukupni steroli (mg/kg)

Eritrodiol i uvaol (%) (**)

Miristinska (%)

Linolenska (%)

Arahinska (%)

Eikozenska (%)

Behenska (%)

Lignocerinska (%)

Kolesterol (%)

Brasikasterol (%)

Kampesterol (8) (%)

Stigmasterol (%)

β–sitosterol (%) (9)

Delta-7-stigmastenol (8) (%)

1. Ekstra djevičansko maslinovo ulje

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

2. Djevičansko maslinovo ulje

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,05

≤ 0,05

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

3. Maslinovo ulje lampante

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5 (10)

4. Rafinirano maslinovo ulje

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

5. Maslinovo ulje koje se sastoji od rafiniranih i djevičanskih maslinovih ulja

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,30

≤ 0,5

≤ 0,1

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 000

≤ 4,5

6. Sirovo ulje komine maslina

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,20

≤ 0,10

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

—

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 2 500

> 4,5 (11)

7. Rafinirano ulje komine maslina

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 800

> 4,5

8. Ulje komine maslina

≤ 0,03

≤ 1,00

≤ 0,60

≤ 0,40

≤ 0,30

≤ 0,20

≤ 0,40

≤ 0,35

≤ 0,5

≤ 0,2

≤ 4,0

< kamp.

≥ 93,0

≤ 0,5

≥ 1 600

> 4,5

Napomena:

(a)	Rezultati analiza moraju biti izraženi onim brojem decimalnih mjesta kojim je izražena granična vrijednost za pojedino svojstvo. Posljednja se znamenka mora uvećati za jednu jedinicu ako je znamenka koja slijedi veća od 4.

(b)	Ako najmanje jedno od svojstava ne odgovara navedenim vrijednostima, za svrhu ove Uredbe kategorija ulja može se promijeniti ili se ulje može deklarirati kao onečišćeno.

(c)

Ako je svojstvo označeno jednom zvjezdicom (*), time se podrazumijeva sljedeće: - kod maslinova je ulja lampante moguće da se istodobno oba navedena ograničenja razlikuju od navedenih vrijednosti, - kod djevičanskih maslinovih ulja, ako se najmanje jedno od tih ograničenja razlikuje od navedenih vrijednosti, kategorija se ulja mijenja, iako se i dalje svrstava u jednu od kategorija djevičanskih maslinovih ulja.

(d)	Ako je svojstvo označeno s dvije zvjezdice (**), to znači da je za sve tipove ulja komine maslina moguće da se istodobno oba navedena ograničenja razlikuju od navedenih vrijednosti.

„Dodatak

Shema odlučivanja

Shema odlučivanja povezana s kampesterolom za djevičanska i ekstra djevičanska maslinova ulja:

4,0 % < Kampesterol ≤ 4,5 %

Stigmasterol ≤ 1,4 %

Δ-7-stigmastenol ≤ 0,3 %

Drugi parametri moraju biti u skladu s ograničenjima utvrđenima u ovoj Uredbi.

Shema odlučivanja povezana s delta-7-stigmastenolom za:

—	ekstra djevičanska i djevičanska maslinova ulja 0,5 % < Δ-7-stigmastenol ≤ 0,8 % Kampesterol ≤ 3,3 % App. β-sitosterol/ (kampest + Δ7stig) ≥ 25 Stigmasterol ≤ 1,4 % Δ ECN42 ≤ |0,1|

Drugi parametri moraju biti u skladu s ograničenjima utvrđenima u ovoj Uredbi.

—	Ulja komine maslina (sirova i rafinirana) 0,5 < Δ-7-stigmastenol ≤ 0,7 Δ ECN42 ≤ |0,40| Stigmasterol ≤ 1,4 % Ostali parametri unutar graničnih vrijednosti

„PRILOG I.a

UZORKOVANJE ULJA OD PLODA ILI KOMINE MASLINA KOJE SE DOSTAVLJA U UNUTARNJEM PAKIRANJU

Ova metoda uzorkovanja primjenjuje se na serije ulja od ploda ili komine maslina u unutarnjem pakiranju. Primjenjuju se različite metode uzorkovanja, ovisno o tome prelazi li unutarnje pakiranje 5 litara ili ne.

„Serija” označava niz prodajnih jedinica koje se proizvode, izrađuju i pakiraju u uvjetima koji omogućuju da se ulje koje se nalazi u svakoj prodajnoj jedinici smatra homogenim u smislu svih analitičkih osobina. Individuacija serije mora biti u skladu s Direktivom 2011/91/EU Europskog parlamenta i Vijeća (1).

„Dodana količina” označava količinu ulja koja se nalazi u unutarnjem pakiranju i koja je uzeta s nasumično odabranog mjesta serije.

1.   SADRŽAJ PRIMARNOG UZORKA

1.1.   Unutarnje pakiranje koje ne prelazi 5 litara

„Primarni uzorak” za unutarnje pakiranje koje ne prelazi 5 litara označava broj dodanih količina uzetih iz serije i u skladu s Tablicom 1.

Tablica 1.

Najmanja veličina primarnog uzorka mora sadržavati sljedeće

Kada unutarnje pakiranje ima zapreminu	Primarni se uzorak mora sastoji od ulja od
(a) 1 litre ili više	(a) 1-og unutarnjeg pakiranja;
(b) manje od 1 litre	(b) najmanjeg broja pakiranja ukupne zapremnine ne manje od 1,0 litre

Broj pakiranja iz Tablice 1. koji predstavlja unutarnje pakiranje može povećatisvaka država članica prema svojim vlastitim potrebama (na primjer, za organoleptičku ocjenu u laboratorijima različitim od onih koji su proveli kemijsku analizu, ponovnu analizu, itd.).

1.2.   Unutarnje pakiranje koje prelazi 5 litara

„Primarni uzorak” za unutarnje pakiranje koje prelazi 5 litara označava reprezentativni dio ukupnih dodanih količina dobivenih postupkom smanjenja i u skladu s Tablicom 2. Primarni se uzorak mora sastoji od različitih primjera.

„Primjerak” primarnog uzorka označava svaki paket koji čini primarni uzorak.

Tablica 2.

Minimalni broj dodanih količina koje se uzimaju

Broj pakiranja u seriji	Minimalni broj dodanih količina koje se uzimaju
Do 10	1
Od … 11 do 150	2
Od … 151 do 500	3
Od … 501 do 1 500	4
Od … 1 501 do 2 500	5
> 2 500 na 1 000 pakiranja	1 rezervna dodana količina

Kako bi se smanjio volumen uzorkovanja unutarnjih pakiranja, za pripremu primarnog uzroka homogenizira se sadržaj dodanih količina za uzorkovanje. Kako bi se najbolje zaštitili od zraka, dijelovi različitih dodanih količina miješanjem se ulijevaju u zajednički spremnik za njihovu homogenizaciju.

Sadržaj primarnog uzorka mora se uliti u niz pakiranja najmanje zapremnine 1,0 l od kojih svaki predstavlja primjer primarnog uzorka.

Broj primarnih uzoraka može povećati svaka država članice prema svojim vlastitim potrebama (na primjer, za organoleptičku procjenu u laboratorijima različitima od onih koji su proveli kemijsku analizu, ponovno analizu, itd.).

Svako pakiranje puni se tako da se sloj zraka na vrhu svede na najmanju moguću mjeru i zatim se primjereno zatvori i zapečati kako bi se osiguralo da se proizvod ne može mijenjati.

Ti se primjeri moraju označavati kako bi se omogućila ispravna identifikacija.

2.   ANALIZE I REZULTATI

2.1.

Svaki primarni uzorak mora se podijeliti na laboratorijske uzorke, u skladu s točkom 2.5. norme EN ISO 5555, i analizirati prema redoslijedu prikazanom u shemi odlučivanja iz Priloga I.b ili bilo kojim drugim nasumičnim redoslijedom.

2.2.

Kad svi rezultati analize odgovaraju svojstvima deklarirane kategorije ulja, čitava se serija proglašava odgovarajućom. Ako samo jedan rezultat analize ne odgovara svojstvima deklarirane kategorije ulja, čitava se serija proglašava neodgovarajućom

3.   PROVJERA KATEGORIJE SERIJE

3.1.

Kako bi se provjerila kategorija serije, nadležno tijelo može povećati broj primarnih uzoraka uzetih s različitih mjesta serije u skladu sa sljedećom tablicom: Tablica 3. Broj primarnih uzoraka određenih veličinom serije Veličina serije (litre) Broj primarnih uzoraka manje od 7 500 2 Od 7 500 do manje od 25 000 3 Od 25 000 do manje od 75 000 4 Od 75 000 do manje od 125 000 5 Jednako i više od 125 000 6 + 1 za svakih dodatnih 50 000 litara Svaka dodana količinakoja predstavlja primarni uzorak mora se uzeti s neprekinutog mjesta u seriji; potrebno je zabilježiti položaj svakog primarnog uzorka i nedvosmisleno ga identificirati. Stvaranje svakog primarnog uzorka mora se provesti u skladu s postupcima iz točaka 1.1. i 1.2. Svaki primarni uzorak zatim podliježe analizi iz članka 2. stavka 1.

3.2.

Ako jedan od rezultata analize iz članka 2. stavka 1. najmanje jednog primarnog uzorka nije u skladu sa svojstvima deklarirane kategorije ulja, čitava se serija za uzorkovanje proglašava neodgovarajućom.”

„PRILOG I.b

SHEMA ODLUČIVANJA ZA PROVJERU USKLAĐENOSTI UZORKA MASLINOVA ULJA SA DEKLARIRANOM KATEGORIJOM

Tablica 1.

EKSTRA DJEVIČ. MASL. ULJE

(kriteriji kvalitete)

Kiselost %

≤ 0,8

> 0,8

Peroksidni broj mEqO2/kg

≤ 20

> 20

UV spektrometrija

K270 ≤ 0,22

K270 > 0,22

UV spektrometrija

ΔK ≤ 0,01

ΔK > 0,01

UV spektrometrija

K232 ≤ 2,50

K232 > 2,50

Organoleptička ocjena

med. voćn. > 0

i

med. mana=0

med. voćn. = 0

med. voćn. > 0

and

med. mana > 0

Etil esteri*

da

ne

Kriteriji kvalitete u skladu s deklariranom kat.

Idi na tablicu 3. (kriteriji čistoće)

Ulje nije u skladu s deklariranom kategorijom.

(a)

Ulje nije u skladu s deklariranom kategorijom.

(b)

* ≤ 40 mg/kg u 2013./2014.

≤ 35 mg/kg u 2014./2015.

≤ 30 mg/kg od godine usjeva 2015./2016.

Tablica 2.

Djevič. masl. ulje

(kriteriji kvalitete)

Kiselost %

≤ 2,0

> 2,0

Peroksidni broj mEq O2/kg

≤ 20

> 20

UV spektrometrija

K270 ≤ 0,25

K270 > 0,25

UV spektrometrija

Δ K ≤ 0,01

Δ K > 0,01

UV spektrometrija

K232 ≤ 2,60

K232 > 2,60

Organoleptička ocjena

Median of fruity > 0

and

Median of defects ≤ 3,5

Median of fruity = 0

or

median of fruity > 0

median of defects > 3,5

Ispunjuju li vrijednosti navedenih parametara kriterije za ekstra djevičansko maslinovo ulje?

(tablica 1.)

NE

DA

Kriteriji kvalitete u skladu s deklariranom kat.

Idi na tablicu 3. (kriteriji čistoće)

Ulje nije u skladu s deklariranom kategorijom

(a)

Ulje nije u skladu s deklariranom kategorijom

(b)

Tablica 3.

Ekstra djevič. i djevič. masl. ulja

(Kriteriji čistoće)

Kriteriji čistoće (tablice 1. i 2.)

DA

NE

3,5-Stigmastadieni mg/kg

≤ 0,05

> 0,05

Transizomeri % masnih kiselina

tC18:1 ≤ 0,05

t(C18:2 + C18:3) ≤ 0,05

tC18:1 > 0,05

t(C18:2 + C18:3) > 0,05

Sadržaj masnih kiselina

DA

NE

Δ ECN42

≤ |0,2|

> |0,2|

Sastav sterola i ukupno sterola

YES

NO

Eritrodiol + uvaol %

≤ 2,0

2,0 > E+U ≤ 4,5

> 4,5

Voskovi1 mg/kg

≤ 150

> 150

Vrsta ulja u skladu s deklariranom kategorijom

Ulje nije u skladu s deklariranom kategorijom

Ulje nije u skladu s deklariranom kategorijom

(a)

Ulje nije u skladu s deklariranom kategorijom

Ulje nije u skladu s deklariranom kategorijom

(b)

1C42+C44+C46

„Dodatak 1.

Tablica podudarnosti između priloga ove Uredbe i analiza navedenih u shemi odlučivanja

— Kiselost	Prilog II.	Određivanje slobodnih masnih kiselina, hladna metoda
— Peroksidni broj	Prilog III.	Određivanje peroksidnog broja
— UV spektrometrija	Prilog IX.	Spektrofotometrijska analiza
— Organoleptičko ocjenjivanje	Prilog XII.	Organoleptičko ocjenjivanje djevičanskog maslinova ulja
— Etil esteri	Prilog XX.	Metoda određivanja sadržaja voskova, metil estera masnih kiselina i etil estera masnih kiselina kapilarnom plinskom kromatografijom
— 3,5-stigmastadieni	PRILOG XVII.	Metoda utvrđivanja stigmastadiena u biljnim uljima
— Transizomeri masnih kiselina	PRILOG X.A i	Analiza metil estera masnih kiselina plinskom kromatografijom
	PRILOG X.B	Pripremanje metil estera masnih kiselina
— Sadržaj masnih kiselina	PRILOG X. A i	Analiza metil estera masnih kiselina plinskom kromatografijom
	PRILOG X.B	Pripremanje metil estera masnih kiselina
— ΔECN42	Prilog XVIII.	Određivanje sastava triglicerida s ECN42 (razlika između podataka HPLC-a i teoretskog sadržaja)
— Sastav sterola i ukupni steroli — Eritrodiol i uvaol	Prilog V.	Određivanje sastava i sadržaja sterola i triterpenskih dialkohola kapilarnom plinskom kromatografijom
— Voskovi	Prilog IV.	Određivanje sadržaja voska kapilarnom plinskom kromatografijom
— Alifatski alkoholi	PRILOG XIX.	Određivanje sadržaja alifatskih alkohola kapilarnom plinskom kromatografijom
— Zasićene masne kiseline u položaju 2.	Prilog VII.	Determination of the percentage of 2-glyceryl monopalmitate

„PRILOG V.

ODREĐIVANJE SASTAVA I SADRŽAJA STEROLA I TRITERPENSKIH DIALKOHOLA KAPILARNOM PLINSKOM KROMATOGRAFIJOM

1.   PODRUČJE PRIMJENE

U ovoj se metodi opisuje postupak određivanja udjela pojedinačnih i ukupnih sterola i triterpenskih dialkohola u maslinovim uljima i uljima komine maslina.

2.   NAČELO

Ulje s dodatkom α-kolestanola koji služi kao interni standard saponificira se otopinom kalijevog hidroksida u etanolu i zatim se neosapunjiva tvar ekstrahira etil eterom.

Frakcija sterola i triterpenskih dialkohola odjeljuje se od neosapunjivog ekstrakta tankoslojnom kromatografijom na osnovnoj silikagel ploči. Frakcije koje se dobiju sa silikagela pretvaraju se u trimetilsilil etere i zatim analiziraju kapilarnom plinskom kromatografijom.

3.   APARATURA

Uobičajena laboratorijska oprema, a posebno sljedeće:

3.1.	Tikvica od 250 ml s povratnim hladilom i nastavcima od brušenog stakla.

3.2.	Lijevak za odjeljivanje od 500 ml.

3.3.	Tikvice od 250 ml.

3.4.	Cjeloviti instrument za analizu tankoslojnom kromatografijom, korištenjem staklenih ploča veličine 20 × 20 cm.

3.5.	Ultraljubičasta svjetiljka valne duljine 254 ili 366 nm.

3.6.	Mikroštrcaljke od 100 μl i 500 μl.

3.7.	Cilindrični lijevak za filtriranje s poroznom pločom G 3 (poroznost između 15 i 40 μm) približnog promjera 2 cm i visine 5 cm, primjeren za filtriranje pod vakuumom s muškim spojem od brušenog stakla.

3.8.	Vakuumska tikvica od 50 ml, sa ženskim spojem od brušenog stakla koji se može pričvrstiti na lijevak za filtriranje (točka 3.7.).

3.9.	Epruveta od 10 ml s konusnim dnom i brtvenim staklenim čepom.

3.10.

Plinski kromatograf koji se može koristiti s kapilarnom kolonom s razdjelnim sustavom za injektiranje koji se sastoji od: 3.10.1. Termostatske komore za kolone koja može održavati željenu temperaturu s točnošću od ± 1 °C; 3.10.2. Jedinice za injektiranje s mogućnošću podešavanja temperature, s elementom za uparavanje od persilaniziranog stakla i razdjelnim sustavom; 3.10.3. Plameno-ionizacijskog detektora (FID); 3.10.4. Sustava za prikupljanje podataka koji se može koristiti s detektorom FID (točka 3.10.3.) koji se može uključiti ručno.

3.11.

Kvarcna kapilarna kolona duljine između 20 i 30 m, unutarnjeg promjera između 0,25 i 0,32 mm, sa slojem 5 % difenila - 95 % dimetilpolisiloksana (SE-52 ili SE-54 ili odgovarajućom stacionarnom fazom), s ujednačenom debljinom filma između 0,10 i 0,30 μm.

3.12.

Mikroštrcaljka za plinsku kromatografiju volumena 10 l s čvrsto učvršćenom iglom primjerenom za razdjelno injektiranje.

3.13.

Eksikator s kalcijevim kloridom

4.   REAGENSI

4.1.

Kalijev hidroksid, minimalne koncentracije 85 %

4.2.

Otopina kalijevog hidroksida u etanolu približno 2 mol/l Otopiti 130 g kalijevog hidroksida (točka 4.1.), uz hlađenje, u 200 ml destilirane vode, a zatim nadopuniti etanolom do jedne litre (točka 4.10). Otopinu treba čuvati u dobro začepljenim bocama od tamnog stakla i čuvati najviše dva dana.

4.3.

Etil eter, analitičke kvalitete.

4.4.

Otopina kalijevog hidroksida u etanolu približno 0,2 N Otopiti 13 g kalijevog hidroksida (točka 4.1.) u 20 ml destilirane vode i nadopuniti etanolom do jedne litre (točka 4.10.).

4.5.

Bezvodni natrijev sulfat, analitičke kvalitete.

4.6.

Staklene ploče (20 × 20 cm) sa slojem silikagela, bez indikatora fluorescencije, debljine 0,25 mm (na tržištu su dostupne ploče spremne za uporabu).

4.7.

Toluen, za kromatografiju.

4.8.

Aceton, za kromatografiju.

4.9.

n-heksan, za kvalitetu kromatografije.

4.10.

Etil eter, za kvalitetu kromatografije.

4.11.

Etanol analitičke kvalitete.

4.12.

Etil acetat analitičke kvalitete.

4.13.

Referentna otopina za tankoslojnu kromatografiju: 5 %-tna otopina kolesterola ili fitosterola i eritrodiola u etil acetatu (točka 4.11.).

4.14.

2,7-diklorofluorescein, 0,2 %-tna otopina u etanolu. Može se učiniti blago lužnatim dodavanjem nekoliko kapi otopine 2 N kalijevog hidroksida u alkoholu (točka 4.2.).

4.15.

Bezvodni piridin, za kvalitetu kromatografije (vidi Napomenu 5).

4.16.

Heksametildisilazan analitičke kvalitete.

4.17.

Trimetilklorosilan analitičke kvalitete.

4.18.

Otopine sterolnih trimetilsilil etera iz uzorka. Treba ih se pripremiti neposredno prije korištenja od sterola i eritrodiola dobivenih iz ulja koja ih sadrže.

4.19

α-kolestanol, čistoće veće od 99 % (čistoća se mora provjeriti plinskom kromatografijom).

4.20.

Otopina α-kolestanola internog standarda, 0,2 %-tna otopina (m/V) u etil acetatu (točka 4.11.).

4.21.

Otopina 10 g/l fenolftaleina u etanolu (točka 4.10.).

4.22.

Plinovi nosači: vodik ili helij, plinsko-kromatografske čistoće.

4.23.

Pomoćni plinovi: vodik, helij, dušik i zrak, plinsko-kromatografske čistoće.

4.24.

Smjesa n-heksana (točka 4.9.) i etil etera (točka 4.10.) 65:35 (V/V).

4.25.

Reagens za sililaciju koji se sastoji od smjese piridina, heksametildisilazana i trimetilklorosilana.

5.   POSTUPAK

5.1.   Pripremanje neosapunjive tvari.

5.1.1.   S pomoću mikroštrcaljke (točka 3.6.) od 500 μl u tikvicu volumena 250 ml ubrizgati onu količinu 0,2 %-tne otopine α-kolestanola internog standarda (točka 4.20.) koja sadržava količinu kolestanola koja je približno jednaka 10 % sadržaja sterola uzorka. Primjerice, na 5 g uzorka maslinova ulja treba dodati 500 μl otopine α-kolestanola (točka 4.20.) i 1 500 μl za ulje komine maslina. Upariti do suha pod blagom strujom dušika u toploj vodenoj kupelji i, nakon što se tikvica ohladi, izvagati 5 ± 0,01 g suhog filtriranog uzorka u istu tikvicu.

Napomena 1.:

Ulja i masti životinjskog ili biljnog podrijetla koja sadrže znatne količine kolesterola mogu pokazati pik s retencijskim vremenom koje je blizu onome kolestanola. U tom slučaju frakcija sterola treba se analizirati dvostruko - s internim standardom i bez njega.

5.1.2.   Dodati 50 ml 2 mol/l otopine kalijevog hidroksida u etanolu (točka 4.2.) i nešto plovućca, namjestiti povratno hladilo i zagrijavati do točke slabog vrenja dok se ne završi saponificiranje (otopina postane bistra). Nastaviti zagrijavanje još 20 minuta, zatim dodati 50 ml destilirane vode u vrh hladila, odvojiti hladilo i ohladiti tikvicu na približno 30 °C.

5.1.3.   Kvantitativno prenijeti sadržaj tikvice u lijevak za odjeljivanje od 500 ml (točka 3.2.) s nekoliko obroka destilirane vode (50 ml). Dodati približno 80 ml etil etera (točka 4.10.), snažno protresti približno 60 sekundi, povremeno ispuštajući pritisak okretanjem lijevka za odjeljivanje i otvaranjem zaustavnog pipca. Odložiti dok se dvije faze potpuno ne odvoje (Napomena 2.).

Odvojiti sapunastu otopinu što je moguće potpunije u drugi lijevak za odjeljivanje. Provesti još dvije ekstrakcije na vodeno-alkoholnoj fazi na jednak način, uz korištenje između 60 i 70 ml etil etera (točka 4.10.).

Napomena 2.: Svaka se emulzija može uništiti dodavanjem malih količina etanola (točka 4.11.).

5.1.4.   Kombinirati tri ekstrakta etera u jednom lijevku za odjeljivanje koji sadržava 50 ml vode. Nastaviti ispirati s vodom (50 ml) sve dok se u vodi kojom se ispiralo više ne pojavljuje ružičasto obojenje prilikom dodavanja kapljica otopine fenolftaleina (točka 4.21.).

Nakon uklanjanja vode kojom se ispiralo profiltrirati kroz bezvodni natrijev sulfat (točka 4.5.) u prethodno izvaganoj tikvici od 250 ml perući lijevak i filtar malim količinama etil etera (točka 4.10.).

5.1.5.   Otapalo ispariti destiliranjem pod vakuumom u rotirajućem isparivaču na 30 °C. Dodati 5 ml acetona i potpuno odstraniti hlapivo otapalo pod blagom strujom zraka. Ostatak osušiti u peći 15 min na 103 ± 2 °C. Ohladiti u eksikatoru i izvagati uz odstupanje do 0,1 mg.

5.2.   Odjeljivanje frakcija sterola i triterpenskih dialkohola (eritrodiol + uvaol)

5.2.1.   Pripremanje osnovnih ploča za tankoslojnu kromatografiju. Uroniti silikagel ploče (točka 4.6.) u otopinu 0,2 mol/l kalijevog hidroksida u etanolu (točka 4.5.) na 10 sekundi, zatim ih ostaviti da se dva sata suše u digestoru i na kraju ih staviti u peć na sat vremena na 100 °C.

Izvaditi ploče iz peći i pohraniti u eksikator s kalcijevim kloridom (točka 3.13.) do upotrebe (ploče obrađene na ovaj način moraju se upotrijebiti u roku od 15 dana).

Napomena 3.:

Kad se za odjeljivanje frakcije sterola koriste osnovne silikagel ploče, nema potrebe da se neosapunjive tvari obrađuju aluminijem. Na taj način svi sastojci koji su po prirodi kiseli (masne kiseline i drugi) zadržavaju se na liniji raspršivanja, a vrpca sterola jasno se odvaja od vrpce alifatskih i triterpenskih alkohola.

5.2.2.   U komoru za razvijanje unijeti smjesu heksana i etil etera (točka 4.24.) (Napomena 4.) do razine od približno 1 cm. Komoru zatvoriti odgovarajućim poklopcem i ostaviti tako na najmanje pola sata, na hladnom mjestu, kako bi se uspostavila ravnoteža tekućine ipare. Trake filtar-papira namočene u eluens mogu se postaviti na unutarnje površine komore. Time se skraćuje vrijeme razvijanja za otprilike jednu trećinu i dobiva jednoličnija, pravilna eluacija komponenata.

Napomena 4.:

Smjesa za razvijanje treba se zamijeniti za svako ispitivanje da bi se postigli savršeni reproducibilni uvjeti eluacije ili se umjesto toga može koristiti otapalo n-heksana i etilnog etera 50:50 (V/V).

5.2.3.   Pripremiti približno 5 %-tnu otopinu neosapunjivih tvari (točka 5.1.5.) u etil acetatu (točka 4.12.) i s pomoću mikroštrcaljke od 100 μl nanijeti 0,3 ml te otopine u tankoj i ujednačenoj liniji na donji rub (2 cm) kromatografske ploče (točka 5.2.1.). Poravnato s nanosom nanijeti između 2 i 3 μl referentne otopine tvari (točka 4.13.) tako da se vrpca sterola i triterpenskih dialkohola može identificirati nakon razvijanja.

5.2.4.   Postaviti ploču unutar komore za razvijanje koja je pripremljena kako je navedeno u točki 5.2.2. Sobnu temperaturu treba održavati između 15 i 20 °C (Napomena 5.). Komoru odmah zatvoriti poklopcem i ostaviti da eluira dok prednji dio otapala ne dosegne približno 1 cm od gornjeg ruba ploče. Ploča se zatim vadi iz komore za razvijanje, a otapalo isparuje pod strujom vrućeg zraka ili se ploča ostavlja još neko kraće vrijeme u digestoru.

Napomena 5.: Na višim temperaturama odjeljivanje se može pogoršati.

5.2.5.   Blago i jednoliko pošpricati ploču otopinom 2,7-diklorofluoresceina (točka 4.14.) i zatim je ostaviti da se osuši. Kad se ploča promatra pod ultraljubičastom svjetlošću, vrpce sterola i triterpenskih dialkohola mogu se identificirati tako što su poravnate s mrljama dobivenima od referentne otopine (točka 4.13.). Rubovi trake označe se uz rub fluorescencije crnom olovkom (vidi TLC ploču na slici 3).

5.2.6.   Silikagel koji se nalazi u označenom području sastruže se s pomoću metalne spatule. Tako dobiveni fino usitnjeni materijal unijeti u lijevak za filtriranje (točka 3.7.). Dodati 10 ml vrućeg etil acetata (točka 4.13.), pažljivo izmiješati metalnom spatulom i filtrirati pod vakuumom, skupljajući filtrat u vakuumsku tikvicu (točka 3.8.) spojenu na lijevak za filtriranje.

Ostatak u tikvici isprati tri puta etil eterom (točka 4.3.) (približno 10 ml svaki put), skupljajući filtrat u istu tikvicu spojenu na lijevak, ispariti filtrat do volumena od 4 do 5 ml, preostalu otopinu prenijeti u prethodno izvaganu epruvetu volumena 10 ml (točka 3.9.), upariti do suha laganim zagrijavanjem pod blagom strujom dušika, ponovno nadopuniti s nekoliko kapi acetona (točka 4.8.) i ponovno upariti do suha.

Ostatak unutar epruvete mora se sastojati od frakcija sterola i triterpenskih dialkohola.

5.3.   Pripremanje trimetilsilil etera.

5.3.1.   Dodati reagens za silaniziranje (točka 4.25.) (Napomena 6.), u omjeru od po 50 μl na svaki miligram sterola i triterpenskih alkohola, u epruvetu koja sadržava frakciju sterola i triterpena tako da se izbjegne bilo kakva apsorpcija vlage (Napomena 7.)

Napomena 6.:

Otopine spremne za uporabu dostupne su na tržištu. Dostupni su i drugi reagensi za silaniziranje kao što su npr. bistrimetilsililtrifluoracetamid + 1 % trimetilklorosilan za miješanje s jednakim volumenom bezvodnog piridina.

Piridin se može zamijeniti jednakom količinom acetonitrila.

5.3.2.   Epruvetu treba začepiti i pažljivo protresti (bez preokretanja) sve dok se sastojci u potpunosti ne rastope. Ostaviti da odstoji najmanje 15 minuta na sobnoj temperaturi te zatim centrifugirati nekoliko minuta. Bistra otopina spremna je za analizu plinskim kromatografom.

Napomena 7.:

Normalno je da dođe do blage opalescencije koja neće uzrokovati anomalije. Stvaranje bijelog floka ili pojava ružičastog obojenja znakovi su prisutnosti vlage ili propadanja reagensa. U tom slučaju treba ponoviti ispitivanje (samo ako se koristi heksametildisilazan ili trimetilklorosilan).

5.4.   Analiza plinskim kromatografom

5.4.1.   Pripremne djelatnosti i kondicioniranje kapilarne kolone.

5.4.1.1.

Namjestiti kolonu (točka 3.11.) u plinski kromatograf tako da se početak kolone spoji na razdjelni injektor, a izlazni kraj kolone na detektor. Provesti opću provjeru stanja jedinice plinskog kromatografa (curenje iz plinskih tokova, učinkovitost detektora, učinkovitost sustava za razdvajanje i sustava za bilježenje, itd.).

5.4.1.2.

Ako se kolona koristi prvi put, preporučljivo je podvrgnuti je postupku kondicioniranja: kroz kolonu se pusti malo plina, a zatim se jedinica plinskog kromatografa uključi i postupno zagrijava dok se ne postigne temperatura koja je najmanje 20 °C iznad radne temperature (Napomena 8.). Ta se temperatura treba održavati najmanje dva sata, zatim se cijela jedinica stavlja u radne uvjete (prilagođavanje protoka plina i razdvajanja, paljenja plamena, provjera spoja s računalnim sustavom, prilagođavanje komore za kolonu, temperature detektora i injektora, itd.), a zatim se bilježi signal uz osjetljivost koja je najmanje dvostruko viša od razine predviđene za analizu. Bazna linija za praćenje treba biti linearna, bez pikova ikakve vrste i ne smije pokazivati nikakve znakove otklona. Negativan pravocrtni otklon ukazuje na to da je došlo do curenja iz spojeva kolone, a pozitivan otklon ukazuje na to da kolona nije kondicionirana na odgovarajući način. Napomena 8.: Temperatura kondicioniranja mora uvijek biti najmanje 20 °C niža od maksimalne temperature utvrđene za primijenjenu stacionarnu fazu.

5.4.2.   Odabir radnih uvjeta.

5.4.2.1.

Opći radni uvjeti su kako slijedi: — Temperatura kolone: 260 ± 5 °C; — Temperatura injektora: 280 - 300 °C; — Temperatura detektora: 280 - 300 °C; — Linearna brzina plina nosača: helij između 20 i 35 cm/s, vodik između 30 i 50 cm/s; — Omjer razdvajanja: između 1:50 i 1:100, — Osjetljivost instrumenta: između 4 i 16 puta viša od minimalne atenuacije; — Osjetljivost bilježenja: - Između 1 i 2 mV pune skale; — Količina injektirane tvari: između 0,5 i 1 μl otopine TMSE. Gore navedeni uvjeti mogu se modificirati u skladu sa svojstvima kolone i svojstvimaplinskog kromatografa ne bi li se dobili kromatogrami koji udovoljavaju sljedećim zahtjevima: — Retencijsko vrijeme pika β-sitosterola treba biti 20 ± 5 minuta; — Pik kampesterola treba biti: za maslinovo ulje (prosječni udjel 3 %) 20 ± 5 % vrijednosti pune skale; za sojino ulje (prosječni udjel 20 %) 80 ± 10 % vrijednosti pune skale; — Svi prisutni steroli moraju biti odijeljeni. Osim odjeljivanja, pikovi tmoraju biti i potpuno razdvojeni, tj. trag pika mora se vratiti na baznu liniju prije no što krene stvarati novi pik. Međutim, nepotpuno razdvajanje tolerira se u slučaju da se pik pri RRT 1,02 može kvantificirati korištenjem okomice.

5.4.3.   Analitički postupak

5.4.3.1.

Korištenjem mikroštrcaljke volumena 10 μl unijeti 1 μl heksana, 0,5 μl zraka, i zatim između 0,5 i 1 μl otopine uzorka. Pritom podignuti klip mikroštrcaljke da bi se igla ispraznila. Igla se uvodi kroz membranu injektora; nakon jedne do dvije sekunde otopina se brzo injektira, a nakon približno pet sekundi igla se polako izvlači. Može se upotrijebiti i automatski injektor.

5.4.3.2.

Bilježenje treba provoditi sve dok se TMSE prisutnih triterpenskih dialkohola u potpunosti ne eluiraju. Bazna linija treba u svakom trenutku odgovarati zahtjevima (točka 5.4.1.2.).

5.4.4.   Identificiranje pikova

Identificiranje pojedinačnih pikova provodi se na temelju retencijskog vremena i uspoređivanjem s mješavinom sterolnih i triterpenskih dialkohola TMSE koja se analizirala u jednakim uvjetima (vidi Dodatak).

Steroli i triterpenski dialkoholi se eluiraju sljedećim redoslijedom: kolesterol, brasikasterol, ergosterol, 24-metilen kolesterol, kampesterol, kampestanol, stigmasterol, Δ 7-kampesterol, Δ 5,23-stigmastadienol, klerosterol, β-sistosterol, sitostanol, Δ 5-avenasterol, Δ 5,24-stigmastadienol, Δ 7-stigmasterol, Δ 7-avenasterol, eritrodiol i uvaol.

Retencijska vremena ß-sitosterola za kolone SE-52 i SE-54 prikazana su u Tablici 1.

Slike 1. i 2. prikazuju tipične kromatograme za neka ulja.

5.4.5.   Kvantitativna procjena.

5.4.5.1.

Površine pikova α-kolestanola i sterola i triterpenskih dialkohola izračunavaju se korištenjem računalnog sustava. Pikove bilo kojega od spojeva koji nisu uključeni među one navedene u Tablici 1. (ergosterol se ne smije izračunavati) ne treba uzimati u obzir. Koeficijent odziva za α-kolestanol treba biti jednak 1.

5.4.5.2.

Treba izračunati koncentraciju svakog pojedinačnog sterola u mg/kg masnog materijala kako slijedi: pri čemu je: Ax = površina pika sterola x, u izračunima računalnog sustava; As = površina pika α-kolestanola; u izračunima računalnog sustava; ms = masa dodanog α-kolestanola, u miligramima; m = masa uzorka korištenog za određivanje, u gramima.

6.   IZRAŽAVANJE REZULTATA

6.1.

Koncentracije pojedinačnih sterola iskazuju se kao mg/kg masnog materijala, a njihov zbroj kao „ukupni steroli”. Sastav svakog pojedinačnog sterola i eritrodiola i uvaola iskazuje se jednim decimalnim mjestom. Ukupni sastav sterola mora se iskazati bez ijednog decimalnog mjesta.

6.2.

Postotak svakog pojedinačnog sterola izračunava se iz omjera površine relevantnog pika prema ukupnoj površini pikova za sterole i eritrodiol i uvaol: pri čemu je: Ax = površina pika za x; ΣA = ukupna površina pikova za sterole;

6.3.

Beta-sitosterol: 5-23-stigmastadienol + klerosterol + -sitosterol + sitostanol + 5-avenasterol + 5-24-stigmastadienol.

6.4.

Izračunavanje postotka eritrodiola i uvaola: pri čemu je ΣA = zbroj površine sterola u izračunima računalnog sustava; Er = površina eritrodiola u izračunima računalnog sustava; Uv = površina uvaola u izračunima računalnog sustava;

„Dodatak

Određivanje linearne brzine plina

U plinski kromatograf postavljen na normalne radne uvjete injektira se između 1 i 3 μl metana (ili propana) i zatim se mjeri vrijeme koje je plinu potrebno da proteče kroz kolonu od trenutka injektiranja do trenutka pojavljivanja pika (tM).

Linearna brzina u cm/s zadana je s L/tM, pri čemu je L duljina kolone u cm, a tM izmjereno vrijeme u sekundama.

Tablica 1.

Relativna retencijska vremena za sterole

Pik	Identifikacija		Relativno retencijsko vrijeme
			SE 54 kolona	SE 54 kolona
1	Kolesterol	Δ-5-kolesten-3ß-ol	0,67	0,63
2	Kolestanol	5α-kolestan-3ß-ol	0,68	0,64
3	Brasikasterol	[24S]-24-metil-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol	0,73	0,71
*	Ergosterol	[24S] 24 meti Δ5-7-22 kolestatrien 3β-ol	0,78	0,76
4	24-metilen-kolesterol	24-metilen-Δ-5,24-kolestadien-3ß-o1	0,82	0,80
5	Kampesterol	(24R)-24-metil-Δ-5-kolesten-3ß-ol	0,83	0,81
6	Kampestanol	(24R)-24-metil-kolestan-3ß-ol	0,85	0,82
7	Stigmasterol	(24S)-24-etil-Δ-5,22-kolestadien-3ß-ol	0,88	0,87
8	Δ-7-kampesterol	(24R)-24-metil-Δ-7-kolesten-3ß-ol	0,93	0,92
9	Δ-5,23-stigmastadienol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,23-kolestadien-3ß-ol	0,95	0,95
10	Klerosterol	(24S)-24-etil-Δ-5,25-kolestadien-3ß-ol	0,96	0,96
11	ß-sitosterol	(24R)-24-etil-Δ-7-kolesten-3ß-ol	1,00	1,00
12	Sitostanol	24-etil-kolestan-3ß-ol	1,02	1,02
13	Δ-5-avenasterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-kolesten-3ß-ol	1,03	1,03
14	Δ-5-24-stigmastadienol	(24R,S)-24-etil-Δ-5,24-kolestadien-3ß-ol	1,08	1,08
15	Δ-7-stigmastenol	(24R,S)-24-etil-Δ-7-kolesten-3ß-ol	1,12	1,12
16	Δ-7-avenasterol	(24Z)-24-etiliden-Δ-7-kolesten-3ß-ol	1,16	1,16
17	Eritrodiol	5α olean-12en-3b28 diol	1,41	1,41
18	Uvaol	Δ12-ursen-3β28 diol	1,52	1,52

Slika 1.

Plinski kromatogram frakcije sterola i triterpenskih alkohola maslinova ulja lampante (dodan unutarnji standard)

Slika 2.

Plinski kromatogram frakcije sterola i triterpenskih alkohola rafiniranog maslinova ulja (dodan unutarnji standard)

Slika 3.

TLC ploča ulja komine maslina sa područjem koja se sastruže za određivanje sterola i triterpenskih alkohola

1 –

Skvalen

2 –	Triterpen i alifatski alkoholi

3 –	Steroli i alifatski dialkoholi

4 –	Početak i slobodne masne kiseline

„PRILOG XII.

POSTUPAK MEĐUNARODNOG VIJEĆA ZA MASLINE ZA ORGANOLEPTIČKU OCJENJIVANJE DJEVIČANSKOG MASLINOVA ULJA

1.   SVRHA I PODRUČJE PRIMJENE

Svrha je ove međunarodne metode određivanje postupka ocjenjivanja organoleptičkih svojstava djevičanskog maslinova ulja u smislu točke 1. Priloga XVI. Uredbi (EZ) br. 1234/2007 te utvrđivanje metode za njegovu klasifikaciju na temelju tih svojstava. Također sadržava i upute za neobvezno označivanje.

Opisana metoda primjenjuje se samo na djevičansko maslinovo ulje i na klasifikaciju ili označivanje takvog ulja na temelju intenziteta uočenih mana i voćnosti koje je utvrdila skupina odabranih, obučenih i praćenih ocjenjivača koji sačinjavaju komisiju.

Njome se također predviđaju podaci za neobvezno označivanje.

Standardi IOC-a navedeni u ovom Prilogu koriste se u njihovoj posljednjoj dostupnoj verziji.

2.   OPĆENITI TEMELJNI RJEČNIK SENZORNE ANALIZE

Vidi normu IOC/T.20/dok. br. 4. „Senzorska analiza: Opći osnovni rječnik”

3.   SPECIFIČNI RJEČNIK

3.1.   Negativna svojstva

Pljesnivo/blatno Aroma karakteristična za ulje dobiveno iz maslina koje su bile naslagane u hrpama ili uskladištene i kod kojih je došlo do visokog stupnja anaerobne fermentacije,ili ulje koje je ostalo u dodiru s talogom koji se stvara u podzemnim rezervoarima i spremnicima i koje je bilo izloženo i procesu anaerobne fermentacije.

Ustajalo-vlažno-zemljasto Aroma karakteristična za ulja dobivena iz plodova na kojima su se, zbog skladištenja u vlažnim uvjetima tijekom razdoblja od nekoliko dana, razvile brojne gljivice i kvasci ili za ulje dobiveno iz maslina koje su sakupljene s ostacima zemlje ili blata i nisu oprane.

Vinski-octikavo-kiselo-kiselkasto Aroma karakteristična za nekaulja koja podsjeća na vino ili ocat. Ovu je aromu uglavnom uzrokovao proces aerobne fermentacije u plodovima ili ostacima maslinova tijesta na neodgovarajuće očišćenim filtar-slojnicama, što dovodi do stvaranja octene kiseline, etil acetata i etanola.

Užeglo Aroma ulja koja su bila izložena intenzivnim oksidacijskim procesima.

Smrznute masline (mokro drvo) Aroma karakteristična za ulja dobivena od maslina koje su bile smrznute na stablu.

3.2.   Ostala negativna svojstva

Zagrijano ili zagoreno Aroma karakteristična za ulja koja su bila izložena pretjeranom i/ili dugotrajnom

Zagoreno zagrijavanju tijekom prerade, posebno u slučaju kad se miješanje provodilo u neprikladnim temperaturnim uvjetima.

Sijeno -drvo Aroma karakteristična za neka ulja proizvedena od maslina koje su se posušile.

Grubo Osjećaj gustoće i pastoznosti u ustima koji daju pojedina stara ulja.

Strojno ulje Aroma ulja koja podsjeća na naftu, ulje za podmazivanje ili mineralno ulje.

Biljna voda Aroma kakvu ulje poprima zbog dužeg dodira s biljnom vodom koja je pretrpjela fermentacijske procese.

Salamura Aroma ulja dobivenog iz maslina koje su čuvane u salamuri.

Metalno Aroma koja podsjeća na metal. Karakteristična je za ulja koja su bila u dužem dodiru s metalnim površinama tijekom drobljenja, miješanja, prešanja ili skladištenja.

Oporo Aroma karakteristična za ulje dobiveno iz maslina koje su prešane na novim filtar-slojnicama. Aroma se može razlikovati ovisno o tome jesu li filtar-slojnice napravljene od zelene trave esparto ili sušene trave esparto.

Crvljivo Aroma karakteristična za ulje dobiveno iz maslina koje su napale ličinke maslinine muhe (Bactrocera oleae).

Krastavci Aroma koja nastaje kad je ulje predugo hermetički zatvoreno, posebno u limenim spremnicima, a pripisuje se stvaranju 2,6 nonadienala.

3.3.   Pozitivna svojstva

Voćno Skup mirisnih osjeta koji ovisi o sorti karakterističan za ulje od zdravih i svježih maslina, bilo dozrelih ili nedozrelih. Zapaža se izravno i/ili u stražnjem dijelu nosa.

Gorko Primarni okus karakterističan za ulje dobiveno od zelenih maslina ili maslina koje su tek počele mijenjati boju. Percipira se putem okruženih papila poredanih na jeziku u obliku slova „V”.

Oštro Taktilni osjećaj peckanja svojstven uljima proizvedenima na početku godine usjeva, uglavnom još od nedozrelih maslina. Može se raspoznati po cijeloj usnoj šupljini, a posebno u grlu.

3.4.   Neobvezna terminologija u svrhe označivanja

Predsjednik komisije može na zahtjev izdati potvrdu da ocjenjivana ulja odgovaraju definicijama i intervalima koji na temelju intenziteta i percepcije svojstava odgovaraju sljedećim pridjevima.

Pozitivna svojstva (voćno, gorko, oštro): Prema intenzitetu percepcije: Intenzivno, kad je medijan svojstva veći od 6; Srednje, kad je medijan svojstva između 3 i 6; Blago, kad je medijan svojstva manji od 3.

Voćno Skup mirisnih osjećaja karakterističan za ulja koji ovisi o sorti masline i nastaje od zdravih i svježih maslina u kojima ne prevladava ni zelena ni zrela voćnost. Zapaža se izravno i/ili u stražnjem dijelu nosa.

Zeleno voćno Skup mirisnih osjećaja karakterističan za ulja koji podsjeća na zeleno voće, ovisi o sorti masline i nastaje od zelenih, zdravih i svježih maslina. Zapaža se izravno i/ili u stražnjem dijelu nosa.

Zrelo voćno Skup mirisnih osjećaja karakterističan za ulja koji podsjeća na zrelo voće, ovisi o sorti masline i nastaje od zdravih i svježih maslina. Zapaža se izravno i/ili u stražnjem dijelu nosa.

Skladno Ulje koje ne pokazuje neuravnoteženost, čime se misli na mirisno-okusno i taktilno svojstvo gdje je medijan za svojstva gorčine i/ili oštrine za dvije točke veći od medijana voćnosti.

Blago ulje Ulje čiji je medijan za svojstva gorčine i oštrine manji ili jednaki 2.

4.   ČAŠA ZA ORGANOLEPTIČKO OCJENJIVANJE ULJA

Vidi normu IOC/T.20/dok. br. 5. „Čaša za organoleptičko ocjenjivanje ulja”.

5.   PROSTORZA ORGANOLEPTIČKO OCJENJIVANJE

Vidi normu IOC/T.20/Doc. br. 6. „Vodič za uređivanje prostora za organoleptičko ocjenjivanje”.

6.   PRIBOR

The following accessories, which are required by tasters to perform their task properly, must be supplied in each booth and must be within easy reach:Da bi organoleptički ocjenjivači mogli pravilno provesti svoj zadatak, u svakom odjeljku nadohvat ruke treba se nalaziti sljedeći pribor:

—	čaše (standardizirane) koje sadrže uzorke označene šifrom, ostavljene poklopljenima satnim stakalcem na temperaturi 28 °C ± 2 °C;

—	obrazac za ocjenjivanje (vidi Sliku 1.) u tiskanom obliku ili u elektronskom obliku pod uvjetom da su zadovoljeni uvjeti obrasca za prosudbu i, ako je potrebno, s uputama za njegovo korištenje;

—	kemijska olovka ili neizbrisiva tinta;

—	pladnjevi s kriškama jabuke i/ili vodom, gaziranom vodom i/ili prepečencem;

—	čaša vode sobne temperature;

—	list u kojem se podsjeća na opća pravila navedena u odjeljcima 8.4. i 9.1.1.;

—	pljuvačnice.

7.   PREDSJEDNIK KOMISIJE I OCJENJIVAČI

7.1.   Predsjednik komisije

Predsjednik komisije treba biti odgovarajuće osposobljen sa stručnim poznavanjem vrsti ulja s kojima će se susretati tijekom svojeg rada. On je ključna osoba u komisiji i odgovoran je za njezinu organizaciju i djelovanje.

Rad predsjednika komisije zahtijeva osnovnu obuku o alatima senzorske analize, senzorske vještine, pedantnost prilikom pripremanja, organizacije i ocjenjivanja te vještinu i strpljivost potrebne za planiranje i provođenje ocjenjivanja na znanstveni način.

On je jedina osoba odgovorna za odabir, obuku i nadzor ocjenjivača s ciljem potvrđivanja njihove razine sposobnosti. Predsjednik je stoga odgovoran za procjenu ocjenjivača koji uvijek trebaju biti objektivni i za koje moraju razviti posebne postupke koji se temelje na testovima i čvrstim kriterijima prihvaćanja i odbijanja. Vidi normu IOC/T.20/Doc. br. 14. „Vodič za odabir, obuku i nadzor kvalificiranih ocjenjivača djevičanskog maslinova ulja.”

Predsjednici komisije odgovorni su za rad komisije i stoga i za njezino ocjenjivanje za koje moraju dati pouzdan i objektivan dokaz. U svakom slučaju, oni u svakom trenutku moraju dokazati da su metoda i ocjenjivači pod kontrolom. Preporučuje se periodička kalibracija komisije (IOC/T.20/dok. br. 14, § 5.).

Oni snose krajnju odgovornost za čuvanje evidencije komisije. Ta evidencija uvijek mora biti sljediva. Oni moraju ispuniti zahtjeve za osiguravanje i kvalitetu utvrđene u međunarodnim normama za senzorsku analizu i u svakom trenutku osigurati anonimnost uzoraka.

Oni su odgovorni za inventuru i osiguravanje da su aparatura i oprema potrebni za ispunjenje zahtjeva iz specifikacija ove metode odgovarajuće čisti i održavani i o tome moraju oditi pisane dokaze, kao i o usklađenosti s uvjetima ocjenjivanja.

Oni su odgovorni za primanje i čuvanje uzoraka po njihovom dolasku u laboratorij, kao i o njihovom čuvanju nakon ocjenjivanja. Pri tome oni u svakom trenutku osiguravaju anonimnost i ispravno skladištenje uzoraka zbog čega moraju razviti pisane postupke kako bi se osiguralo da čitav proces bude sljediv i osiguran.

Nadalje, odgovorni su za pripremanje i kodiranje uzoraka i njihovu podjelu organoleptičkim ocjenjivačima u skladu s odgovarajućim načinom ispitivanja koji odgovara prethodno utvrđenim potokolima, kao i za prikupljanje i statističku obradu podataka dobivenih od ocjenjivača.

Oni su nadležni za razvoj i izradu nacrta svih drugih postupaka koji bi mogli biti potrebni za nadopunu ove norme i za osiguravanje ispravnog rada komisije.

Oni moraju tražiti načine za usporedbu rezultata komisije s onima koje su dobili od drugih komisija koje su obavile analizu djevičanskog maslinova ulja kako bi potvrdili da komisija radi ispravno.

Dužnost je predsjednika komisije i motiviranje članova komisije poticanjem interesa, radoznalosti i natjecateljskog duha među njima. U tu svrhu preporučuje im se da osiguraju neometani dvostrani protok informacija s članovima komisije informirajući ih o svim zadacima koje obavljaju i o dobivenim rezultatima. Uz to, oni trebaju osigurati da neće odati svoje mišljenje i trebaju spriječiti moguće voditelje da svoje kriterije nametnu drugim ocjenjivačima.

Trebaju dovoljno rano okupiti ocjenjivače i odgovoriti na sve upite koji se odnose na provođenje ocjenjivanja, notrebaju se suzdržati od izražavanja svog mišljenja o predmetnom uzorku.

7.2.   Ocjenjivači

Ljudi koji djeluju u svojstvu ocjenjivača za organoleptička ocjenjivanja koja se provode za maslinova ulja moraju to činiti dobrovoljno, sa svim posljedicama takvog dobrovoljnog djelovanja u smislu obveza i izostanka financijskog plaćanja. Stoga se kandidatima preporučuje da svoj zahtjev podnesu pisanim putem. Kandidate odabire, obučava i nadzire predsjednik komisije u skladu s njihovim sposobnostima razlikovanja sličnih uzoraka; treba se imati na umu da se njihova preciznost razvija s obukom.

Ocjenjivači moraju djelovati kao pravi senzorski promatrači, ostavljajući postrance svoje osobne sklonosti i izvještavajući isključivo o osjećajima koje percipiraju. Zbog toga uvijek moraju raditi u tišini, opušteno i bez žurbe, usmjeravajući pažnju što je više moguće na uzorak koji ocjenjuju.

Za svako organoleptičko ocjenjivanje potrebno je između 8 i 12 ocjenjivača, iako je dobro imati nekoliko rezervnih ocjenjivača u slučaju moguće odsutnosti nekih ocjenjivača.

8.   UVJETI TESTIRANJA

8.1.   Prikaz uzorka

Uzorak ulja za analizu dijeli se u standardiziranim čašama za ocjenjivanje u skladu s normom IOC/T.20/dok. br. 5 „Čaša za organoleptičko ocjenjivanje ulja”.

Čaša treba sadržavati 14–16 ml ulja, ili između 12,8 i 14,6 g ako se uzorci moraju vagati, i biti poklopljena satnim stakalcem.

Svako se staklo označava šifrom koja se sastoji od nasumično odabranih brojeva ili kombinacije slova i brojeva. Šifra se bilježi na temelju bezmirisnog sustava.

8.2.   Testiranje i temperatura uzorka

Za vrijeme trajanja testiranja uzorci ulja za ocjenjivanje čuvaju se u čašama na 28 °C ± 2 °C. Ta je temperatura odabrana zato što je na njoj lakše promatrati organoleptičke razlike nego na sobnoj temperaturi i zato što pri nižim temperaturama aromatski sastojci svojstveni tim uljima slabo hlape, a više temperature dovode do stvaranja hlapivih sastojaka tipičnih za zagrijana ulja. Vidi normu IOC/T.20/dok. br. 5. „Čaša za organoleptičko ocjenjivanje ulja” za metodu koja se mora koristiti za zagrijavanje uzoraka dok su u čaši.

Prostor za testiranje mora biti sobne temperature između 20° i 25 °C (vidi IOC/T.20/dok. br. 6.).

8.3.   Vrijeme testiranja

Jutro je najbolje vrijeme za testiranje ulja. Dokazano je da tijekom dana postoje optimalna razdoblja za osjetila okusa i mirisa. Prije obroka povećava se osjetljivost na podražaje mirisa i okusa, dok se nakon njih ta percepcija smanjuje.

Međutim, s ovim kriterijem ne treba pretjerivati do te mjere da glad počne ometati ocjenjivače u smislu smanjivanja njihove sposobnosti razlikovanja; stoga se preporučuje da se sesije za testiranje održavaju između 10 i 12 sati ujutro.

8.4.   Ocjenjivači: opća pravila ponašanja

Preporuke u nastavku odnose se na ponašanje ocjenjivača tijekom njihova rada.

Kad ih predsjednik komisije pozove da sudjeluju u ocjenjivanju, ocjenjivači trebaju moći sudjelovati u unaprijed određeno vrijeme i trebaju se pridržavati sljedećega:

—	Ne smiju pušiti barem 30 minuta prije vremena određenog za testoranje.

—

Ne smiju prethodno koristiti nikakav parfem, kozmetički preparat niti sapun čiji bi se miris mogao zadržati do vremena testiranja. Trebaju koristiti neparfimirani ili blago parfimirani sapun za pranje ruku koji nakon tog trebaju isprati i osušiti onoliko puta koliko je potrebno da bi se uklonili svi mirisi.

—	Moraju postiti barem jedan sat prije početka testiranja.

—	Ako osjete da se fizički ne osjećaju dobro, a posebno ako su im zahvaćenaosjetila mirisa ili okusa, ili ako se zbog nekog psihološkog čimbenika ne može koncentrirati na posao, organoleptički ocjenjivači odustat će od testiranja i o tome izvijestiti predsjednika komisije.

—	Nakon što su udovoljili svim gore navedenim uvjetima, ocjenjivači mirno i u tišini zauzimaju svoje mjesto u dodijeljenom im odjeljku za testiranje.

—

Pažljivo će pročitati upute koje se nalaze na obrascu za ocjenjivanje i neće početi s ocjenjivanjem uzoraka sve dok nisu u potpunosti pripremljeni za zadatak koji trebaju ispuniti (opušteno i bez žurbe). Pojavi li se ikakva nedoumica, trebaju nasamo razgovarati s predsjednikom ocjenjivačke komisije.

—	Za vrijeme zadatka trebaju biti tihi.

—	Njihovi mobilni telefoni moraju cijelo vrijeme biti isključeni kako bi se spriječilo ometanje koncentracije i rada njihovih kolega.

9.   POSTUPAK ZA ORGANOLEPTIČKO OCJENJIVANJE I KLASIFIKACIJU DJEVIČANSKOG MASLINOVA ULJA

9.1.   Tehnika kušanja

9.1.1.

Ocjenjivači trebaju uzeti čašu, koju pritom trebaju držati poklopljenom staklenim poklopcem, i lagano je nagnuti; zatim je u tom položaju trebaju potpuno zarotirati tako da tekućina obloži čim veću unutarnju površinu čaše. Nakon što je ovaj korak završen, trebaju otklopiti čašu i mirisati uzorak polaganim i dubokim udisajima kako bi ocijenili ulje. Mirisanje ne bi trebalo trajati dulje od 30 sekundi. Ako u tom roku ne dođu do zaključka, prije novog pokušaja trebaju se nakratko odmoriti. Nakon završetka testiranja mirisa ocjenjivači trebaju ocijeniti osjećaje izazvane u usnoj šupljini (cjelokupni retronazalni doživljaj dobiven mirisom, okusom i dodirom). U tu svrhu trebaju uzeti mali gutljaj ulja od približno 3 ml. Iznimno je važno ulje rasporediti po cijeloj usnoj šupljini, od prednjeg dijela usta i jezika, sa strane i do stražnjeg dijela pa sve do nepca i grla jer je poznato da intenzitet percepcije okusa i osjetilni doživljaj varira ovisno o dijelu jezika, nepca i grla. Treba istaknuti da je od ključne važnosti rasporediti dovoljnu količinu ulja vrlo polako preko stražnje strane jezika prema grlu i da se istodobno ocjenjivač koncentrira na redoslijed kojim se javljaju gorki i oštri podražaji. U protivnome bi oba ta podražaja kod nekih ulja mogla proći nezamijećeno ili bi pak podražaj oštrine mogao prikriti gorčinu. Uvlačenje kratkih uzastopnih udisaja kroz usta omogućava organoleptičkom ocjenjivaču ne samo da dobro rasporedi uzorak po cijeloj usnoj šupljini, već i da uoči hlapive aromatske sastojke u stražnjem dijelu nosa forsirajući upotrebu ovog kanala. Trebalo bi razmotriti i osjetilni doživljaj oštrine. U tu se svrhu preporučuje progutati ulje.

9.1.2.

Prilikom organoleptičkog ocjenjivanja djevičanskog maslinova ulja preporučuje se ocjenjivanje najviše ČETIRI UZORKA u svakoj sesiji s najviše tri sesije dnevno kako bi se izbjegli kontrastni učinci koji bi mogli nastati neposrednim kušanjem drugih uzoraka. Budući da uzastopno ocjenjivanje dovodi do zamora ili smanjuje osjetljivost, potrebno je koristiti neko sredstvo koje će iz usta odstraniti ostatke ulja iz prethodnog ocjenjivanja. Preporučuje se mala kriška jabuke koju se nakon žvakanja može ispljunuti u pljuvačnicu. Nakon tog se usta isperu s malo vode sobne temperature. Između završetka jedne sesije i početka druge mora proteći barem 15 minuta.

9.2.   Način na koji ocjenjivači upotrebljavaju obrazac za ocjenjivanje

Obrazac za ocjenjivanje koji koriste ocjenjivači detaljno je prikazan na Slici 1. ovog Priloga.

Svaki ocjenjivač u komisiji treba pomirisati i zatim kušati (1) razmatrano ulje. Oni zatim na skali od 10 cm prikazanoj na predmetnom obrascu za ocjenjivanje označavaju intenzitet svakog negativnog i pozitivnog svojstva.

Ako ocjenjivač zamijeti negativna svojstva koja nisu navedena u odjeljku 4., navodi ih pod naslovom „ostalo” koristeći izraz ili izraze koji najpreciznije opisuju ta svojstva.

9.3.   Način na koji predsjednik komisije upotrebljava podatake

Predsjednik komisije skuplja obrasce za ocjenjivanje koje je ispunio svaki ocjenjivač i pregledava intenzitete označene za pojedina svojstva. Ako uoče ikakvu nepravilnost, pozivaju ocjenjivača da ponovno pregleda svoj obrazac za ocjenjivanje i, ako je potrebno, ponovi testiranje.

Predsjednik komisije unosi podatke ocjenjivanja od svakog člana komisije u računalni program poput onoga propisanog normom IOC/T.20/dok. br. 15.) radi statističkog izračunavanja rezultata analize, na temelju izračuna njihovog medijana. Vidi odjeljke 9.4. i Dodatak ovom Prilogu. Podaci za dotični uzorak upisuju se s pomoću matrice koja se sastoji od 9 stupaca koji predstavljaju 9 senzornih svojstava i n linija koje predstavljaju n članova komisije.

Kad se zamijeti mana i nju pod naslov „ostalo” navede najmanje 50 % članova komisije, predsjednik komisije treba izračunati medijan te mane i napraviti odgovarajuću klasifikaciju.

Vrijednost grubog koeficijenta varijacije kojim se utvrđuje klasifikacija (nedostatak najvećeg intenziteta i svojstva voćnosti) ne smije biti veći od 20 %.

U suprotnom predsjednik komisije mora ponoviti ocjenjivanje specifičnog uzorka u drugoj sesiji ocjenjivanja.

Ako se to često događa, predsjedniku se komisije preporučuje da ocjenjivačima pruži dodatnu obuku (IOC/T.20/dok. br. 14, § 5.) i da upotrijebi indeks ponovljivosti i indeks odstupanja kako bi provjerio rad komisije (IOC/T.20/Doc. br. 14, § 6.).

9.4.   Klasifikacija ulja

Ulje se razvrstava kako slijedi u skladu s medijanom mana i medijanom voćnosti. Medijan mana definiran je kao medijan mane koja se osjeća najvećim intenzitetom. Medijan mana i medijan voćnosti izražavaju se do jednog decimalnog mjesta.

Ulje se razvrstava uspoređujući vrijednost medijana mana i medijana voćnosti s referentnim intervalima navedenima u nastavku. U obzir je uzeta i pogreška metode prilikom utvrđivanja ograničenja tih intervala koji se stoga smatraju apsolutnima. Programskim paketima omogućuje se prikaz razvrstavanja u obliku statističke tablice ili grafa.

(a)	Ekstra djevičansko maslinovo ulje: medijan mana je 0 i medijan voćnosti je iznad 0;

(b)	Djevičansko maslinovo ulje: medijan mana je iznad 0 ali ne veći od 3,5 i medijan voćnosti je iznad 0;

(c)	Maslinovo ulje lampante: medijan mana je iznad 3,5 ili medijan mana je manji ili jednak 3,5 a medijan voćnosti je jednak 0.

Napomena 1.:

Kad je medijan svojstva oštrine i/ili gorčine veći od 5,0, predsjednik komisije to navodi na potvrdi o ocjenjivanju.

Slika 1.

OBRAZAC ZA OCJENJIVANJE DJEVIČANSKOG MASLINOVA ULJA

Intenzitet percepcije mana
Pljesnivo/blatno (*1)
Ustajalo/vlažno/zemljasto (*1)
Vinski/octikavo kiselo/kiselkasto (*1)
Smrznute masline (mokro drvo)
Užeglo
Ostala negativna svojstva:
Opis:	Metalno  Sijeno  Crvljivo  Grubo  Salamura  Zagrijano ili zagoreno  Biljna voda  Oporo  Krastavci  Strojno ulje 
Intenzitet percepcije pozitivnih svojstava
Voćno:
	Zeleno 	Zrelo 
Gorko
Oštro
Ime ocjenjivača:			Šifra ocjenjivača:
Oznaka uzorka:	Potpis:

„Dodatak

Metoda izračuna medijana i intervala pouzdanosti

Medijan

Medijan se definira kao realni broj Xm za koji vrijedi da je vjerojatnost (p) da vrijednosti raspodjele (X) budu niže od tog broja (Xm) manja ili jednaka 0,5 i da je istovremeno vjerojatnost (p) da vrijednosti raspodjele (X) budu manje ili jednake Xm veća ili jednaka 0,5. Praktičnija definicija glasi da je medijan 50-i postotnik unutar distribucije brojeva u rastućem nizu. Jednostavnijim riječima, to je središnja točka posloženog skupa neparnih brojeva ili prosjek dvije središnje točke u posloženom skupu parnih brojeva.

Gruba standardna devijacija

Kako bi došli do pouzdanog procjenjivanja varijabilnosti oko prosjeka, potrebno je pozvati se na grubu standardnu devijaciju kako se procjenjuje prema Stuartu i Kendallu (4). Formula daje asimptotsku grubu standardnu devijaciju, tj. grubu procjenu varijabilnosti razmatranih podataka pri čemu je N broj očitanja, a IQR međukvartilni interval koji obuhvaća točno 50 % slučajeva u dotičnoj raspodjeli vjerojatnosti.

Međukvartilni interval izračunava se izračunom najveće razlike između 75-tog i 25-tog postotnika.

Pri čemu je postotnik ona vrijednost Xpc za koju vrijedi da je vjerojatnost (p) da vrijednosti raspodjele budu manje od Xpc niža ili jednaka specifičnom postotku i da je istovremeno vjerojatnost (p) da vrijednosti raspodjele budu manje ili jednake Xpc veća ili jednaka tom specifičnom postotku. Postotak ukazuje na odabrani dio distribucije. U slučaju medijana on iznosi 50/100.

Radi praktičnosti, postotnik je ona vrijednost raspodjele koja odgovara specifičnoj površini ispod krivulje distribucije ili gustoće. Na primjer, 25. postotnik predstavlja vrijednost distribucije koja odgovara površini od 0,25 ili 25/100.

U ovoj su metodi postotnici izračunati na temelju stvarnih vrijednosti koje se pojavljuju u matrici podataka (postupak izračuna postotnika).

Grubi koeficijent varijacije (%)

CVr% predstavlja čisti broj koji ukazuje na postotak varijabilnosti analiziranog skupa brojeva. Iz tog je razloga on posebno koristan za ispitivanje pouzdanosti ocjenjivača u komisiji.

Intervali pouzdanosti medijana od 95 %

Intervali pouzdanosti od 95 % (vrijednost greške prve vrste koja iznosi 0,05 ili 5 %) predstavlja interval unutar kojeg bi vrijednost medijana mogla varirati kada bi bilo moguće ocjenjivanje ponoviti bezbroj puta. Praktično predstavlja interval varijabilnosti ocjenjivanja u danim uvjetima rada krenuvši od pretpostavke da ga je moguće ponoviti mnogo puta. Kao i kod CVr%, interval pomaže u procjeni pouzdanosti ocjenjivanja.

pri čemu je C = 1,96 za interval pouzdanosti na razini od 95 %.

Primjer izračuna naveden je u Prilogu I. normi IOC/T 20/dok. br. 15.

Literatura

(1)	Wilkinson, L., 1990. Systat: The system for statistics. Evanston, IL.SYSTAT Inc.

(2)	Cicchitelli, G., 1984. Probabilità e Statistica. Maggioli Editore, Rimini.

(3)	Massart, D.L.; Vandeginste, B.G.M.; Deming, Y.; Michotte, L., 1988. Chemometrics. A textbook. Elsevier. Amsterdam.

(4)	Kendall, M.G.; Stuart, A., 1967. The advanced theory of statistics. Vol. 1. Hafner Publishing Co.

(5)	McGill, R.; Tukey, J.W.; Larsen, W.A. 1978. Variation of Box Plots. The American Statistician, 32, (2), 12.-16.

(6)	IOC/T.28/dok. br. 1., rujan 2007, Vodič za akreditaciju laboratorija za senzorsko ocjenjivanje posebno u vezi s djevičanskim maslinovim uljem u skladu s normom ISO/IEC 17025:2005.

(7)	IOC/T.20/dok. br. 14.

(8)	IOC/T.20/dok. br. 15.

(9)	ISO/IEC 17025:05.

„PRILOG XXa

METODA OTKRIVANJA STRANIH ULJA U MASLINOVIM ULJIMA

1.   PODRUČJE PRIMJENE

Ova se metoda koristi za otkrivanje prisutnosti stranih ulja u maslinovim uljima. U maslinovim uljima mogu se otkriti biljna ulja s visokim linolnim udjelom (soja, repica, suncokret, itd.) i neka biljna ulja s visokim oleinskim udjelom – poput lješnjaka, suncokreta s visokim oleinskim udjelom i ulja komine maslina. Otkrivena razina ovisi o vrsti stranog ulja i sorti masline. Za ulje od lješnjaka, uobičajena razina otkrivanja je između 5 i 15 %. Metodom se ne može utvrditi vrsta otkrivenog ulja i njome se samo ukazuje na to je li maslinovo ulje autentično ili nije.

2.   NAČELO

Ulje se pročišćava ekstrakcijom na čvrstu fazu (SPE) na silikagel ulošcima. Sastav triacilglicerola (TAG) određuje se visokorazlučivom tekućinskom kromatografijom obrnutih faza koristeći detektor indeksa refrakcije i propionitril kao mobilnu fazu. Metil esteri masnih kiselina (FAME) pripremaju se od pročišćenih ulja metiliranjem s hladnom otopinom KOH-a u metanolu (Dodatak X. B) i zatim se kapilarnom plinskom kromatografijom analiziraju esteri koristeći visokopolarne kolone (Prilog X. A). Teoretski sastav triacilglicerola izračunava se iz sastava masnih kiselina računalnim programom preuzimanjem 1,3-nasumične i 2-nasumične raspodjele masnih kiselina u triacilglicerolu, s ograničenjima za zasićene masne kiseline na 2-položaju. Metoda izračuna je izmjena postupka opisanog u Prilogu XVIII. Iz teoretskog i eksperimentalnog (HPLC) sastava triacilglicerola izračunava se nekoliko matematičkih algoritama i dobivene se vrijednosti uspoređuju s onima sadržanima u bazi podataka izgrađenoj od autentičnih maslinovih ulja.

3.   MATERIJALI I REAGENSI

3.1.   Pročišćavanje ulja

3.1.1.

Vakuumska tikvica 25 ml.

3.1.2.

Staklene epruvete volumena 5 ml s navojnim čepom i čepovi s PTFE spojem.

3.1.3.

Silikagel ulošci, 1 g (6 ml) za ekstrakciju na čvrstu fazu ( na primjer, Waters, Massachusetts, SAD).

3.1.4.

n-heksan, analitičke čistoće.

3.1.5.

Smjesa otapala heksana i etil etera (87:13, v/v).

3.1.6.

N-heptan, analitičke čistoće.

3.1.7.

Aceton, analitičke čistoće.

3.2.   HPLC analiza triacilglicerola

3.2.1.

Mikro štrcaljke (50 μL) i igle za injektiranje za HPLC.

3.2.2.

Propionitril, super čistoće ili čistoće za HPLC (na primjer, ROMIL, Cambridge, Ujedinjena Kraljevina) koji se koristi kao mobilna faza.

3.2.3.

Kolona HPLC (unutarnjeg promjera 25 cm x 4 mm) s RP-18 fazom (veličina čestica 4 μm)

3.3.   Pripremanje metil estera masnih kiselina

(vidi Dodatak X. B)

3.3.1.

Metanol koji ne sadržava više od 0,5 % vode.

3.3.2.

Heptan, analitičke čistoće.

3.3.3.

2 N otopina kalijevog hidroksida u metanolu. Otopiti 1,1 g kalijevog hidroksida u 10 ml metanola.

3.3.4.

Staklene epruvete s navojnim poklopcem i čepovi volumena 5 ml sa zglobom PTFE.

3.4.   GC analiza FAME-a

(Vidi metodu za određivanje trans-nezasićenih masnih kiselina kapilarnom plinskom kromatografijom utvrđenu u Prilogu X. A).

3.4.1.

Mikro štrcaljke (5 μL) i igle za GC injektiranje.

3.4.2.

Vodik ili helij kao plinovi nosači.

3.4.3.

Vodik i kisik za detektor FID.

3.4.4.

Dušik ili helij kao pomoćni plin nosač.

3.4.5.

Kvarcna kapilarna kolona (unutarnjeg promjera 50 – 60 m x 0,25 – 0,30 mm) obložena cijanopropilpolisiloksan ili cijanopropilfenilsiloksan fazama (SP-2380 ili slično) debljine filma 0,20-0,25 μm.

4.   APARATURA

4.1.

Vakuumska aparatura za ekstrakciju na čvrstoj fazi.

4.2.

Rotacijski isparivač.

4.3.

Oprema HPLC koja se sastoji od: 4.3.1. Otplinjač za mobilnu fazu. 4.3.2. Ventil injektora Rheodyne s petljom 10 μl. 4.3.3. Visokotlačna pumpna jedinica. 4.3.4. Termostatska peć za HPLC kolonu koja ima sposobnost održavanja temperature ispod sobne (15-20 °C), (na primjer, tipa Peltier). 4.3.5. Detektor indeksa refrakcije. 4.3.6. Kompjuterizirani sustav prikupljanja podataka s integracijskim programom.

4.4

Oprema za kapilarnu plinsku kromatografiju opisanu u Prilogu X. A, koja ima: 4.4.1. Razdjelni injektor. 4.4.2. Plameno-ionizacijski detektor (FID). 4.4.3. Peć s programibilnom temperaturom. 4.4.4. Kompjuterizirani sustav prikupljanja podataka s integracijskim programom.

4.5.

Računalo s programom Microsoft EXCEL.

5.   ANALITIČKI POSTUPAK

5.1.   Pročišćavanje ulja

SPE silikagel uložak stavi se u vakuumski instrument za eluaciju i ispere pod vakumom sa 6 ml heksana. Vakuum se ispušta kako bi se spriječilo sušenje kolone a tikvica se postavi ispod uloška. Otopina ulja (približno 0,12 g) u 0,5 ml heksana stavi se u kolonu i otopina se provuče i zatim eluira s 10 ml smjese otapala (3.1.5.) heksan-etil etera (87:12 v/v) pod vakuumom. Eluirano otapalo se homogenizira i približno polovina volumena se prelije u drugu tikvicu. Obje se otopine odvojeno uparuju do suha u rotirajućem isparivaču pod smanjenim pritiskom pri sobnoj temperaturi. Za analizu triacilglicerola se jedan od ostataka otopi u 1 ml acetona (vidi točku 5.2. stavak 1.) i ulije u staklenu epruvetu s navojnim poklopcem volumena 5 ml. Drugi se ostatak otopi u 1 ml n-heptana i ulije u drugu staklenu epruvetu s navojnim poklopcem volumena 5 ml za pripremu metil estera masnih kiselina.

Napomena: Pročišćavanje ulja može se postići upotrebom silikagel kolone, kao što je opisano u metodi IUPAC 2.507.

5.2.   HPLC analiza triacilglicerola

Postaviti HPLC sustav, održavajući temperaturu kolone na 20 % i koristeći propionitril kao mobilnu fazu protoka 0,6 ml/min. Kad je bazna linija stabilna, pokrenuti injektiranje otapala, a ako se na baznoj liniji javi smetnja u području od 12 do 25 min, koristiti drugu vrstu acetona ili smjese propionitrila i acetona (25:75) kako bi otopili uzorak.

Napomena: Neke vrste acetona uzrokuju smetnje na baznoj liniji u prethodno navedenom području.

Injektirati 10 μl alikvote otopine pročišćenog ulja u acetonu (5 %). Pokretanje traje približno 60 min. Temperatura peći i/ili protok moraju biti postavljeni tako da se dobije kromatogram sličan onom prikazanom na Slici 1. gdje trilinolein (pik 1) eluira na 15,5 min i razdvajanje između parova LLL/OLLn (pik 1 i 2) i OLL/OOLn (pik 4 i 5) su dobri.

Visina pika 2 (OLLn+PoLL) mora dosegnuti najmanje 3 % pune skale.

5.3.   Pripremanje metil estera masnih kiselina

Dodati 0,1 ml 2 N otopine kalijevog hidroksida u metanolu otopini pročišćenog ulja u 1 ml n-heptana. Staviti čep na epruvetu i čvrsto ga zaviti. Snažno protresti epruvetu 15 sekundi i ostaviti da se taloži dok gornji sloj ne postane bistar (5 minuta). Otopina n-heptana spremna je za injektiranje u plinski kromatograf. Otopina može stajati na sobnoj temperaturi najviše 12 sati.

5.4.   GC analiza metilnih estera masnih kiselina

Treba se koristiti postupak opisan u metodi za određivanje trans-nezasićenih masnih kiselina (vidi Dodatak X. A).

GC sustav postavljen je na temperaturu peći od 165 °C. Preporučena temperatura peći je izotermalna 10 min na 165 °C, zatim se povisuje na 200 °C 1,5 °C/min. Preporučuje se temperatura injektora između 220 °C i 250 °C kako bi se stvaranje trans-masnih kiselina svelo na najmanju mjeru (vidi Prilog X. A). Temperatura detektora: 250 °C. Kao plin nosač moraju se koristiti vodik ili helij s pritiskom od približno 130 kPa na vrhu kolone. Volumen injektiranja 1μl razdjelnim injektiranjem.

Mora se dobiti GC profil sličan onom prikazanom na Slici 2. Posebnu pozornost treba obratiti na razdvajanje između C18:3 i C20:1 (pik C18:3 mora se pojaviti prije C20:1). Kako vi se ostvarili ti uvjeti, početna temperatura i/ili pritisak na vrhu kolone moraju biti optimizirani. Prilagodite uvjete injektiranja (temperaturu, omjer razdvajanja i volumen injektiranja) kako biste na najmanju mjeru sveli razlikovanje palmitinske i palmitoleinske kiseline.

Visina pika C20:0 mora biti otprilike 20 % pune skale kako bi se kvantificirali transizomeri. Ako se pik C18:0 poremeti, smanjite količinu uzorka.

6.   INTEGRACIJA KROMATOGRAFSKIH PIKOVA

6.1.   HPLC kromatogram

Na Slici 1. prikazan je uobičajeni HPLC kromatogram triacilglicerola pročišćenog maslinova ulja. Za integraciju pika moraju se zacrtati tri bazne linije: prva između početka pika 1 i kraja pika 3, druga između početka pika 4 i doline prije pika 8, treća između doline koja prethodi piku 8 i kraja pika 18.

Ukupna površina je zbroj područja svih pikova (identificiranih ili neidentificiranih) od pika 1 do pika 18. Postotak svakog pika zadan je kao

Postotke treba iskazati s dva decimalna broja.

6.2.   GC kromatogram

Na Slici 2. prikazan je GC kromatogram alkil estera masnih kiselina dobivenih od pročišćenog maslinova ulja. Moraju se izračunati postotci sljedećih masnih kiselina:

Palmitinska;	P (C16:0)	=	metil ester + etil ester
Stearinska;	S (C18:0)	=	metil ester
Palmitoleinska;	Po (C16:1)	=	zbroj metil estera dva cis-izomera
Oleinska;	O (C18:1)	=	zbroj metil estera dva cis-izomera + etil ester + trans-izomeri
Linolna;	L (C18:2)	=	metil ester + etil ester + trans-izomeri
Linolenska;	Ln (C18:3)	=	metil ester + trans-izomeri
Arahinska;	A (C20:0)	=	metil ester
Eikozenska (gondoinska);	G (C20:1)	=	metil ester

Etil esteri i esteri trans-izomera mogu izostati u GC kromatogramu.

Ukupno područje (AT) zbroj je svih pikova koji se pojavljuju u kromatogramu od C14:0 do C24:0, osim onih koji odgovaraju skvalenu. Postotak svakog pika izračunava se na sljedeći način:

Rezultate treba izraziti s dva decimalna mjesta.

Za izračune računalnim programima nije potrebno normalizirati na 100 jer je to automatski.

Slika 1.

HPLC kromatogram TAG-ova djevičanskog maslinova ulja „Chamlali”. Glavne sastavnice kromatografskih pikova

(1) LLL; (2) OLLn+PoLL; (3) PLLn; (4) OLL; (5) OOLn+PoOL;

(6) PLL+PoPoO; (7) POLn+PPoPo+PPoL; (8) OOL+LnPP; (9) PoOO;

(10) SLL+PLO; (11) PoOP+SPoL+SOLn+SPoPo; (12) PLP;

(13) OOO+PoPP; (14) SOL; (15) POO; (16) POP; (17) SOO;

(18) POS+SLS.

Tablica 1.

Podaci o ponovljivosti određivanja TAG-ova djevičanskog maslinova ulja HPLC-om na temperaturi kolone od 20 °C i koristeći propionitril kao mobilnu fazu

ECN	pikovi HPLC-a	TAG-ovi	Uzorak 1.		Uzorak 2.		Uzorak 3.		Uzorak 4.		Uzorak 5.
			Prosjek (%)	RSDr (%)	Prosjek (%)	RSDr (%)	Prosjek (%)	RSDr (%)	Prosjek (%)	RSDr (%)	Prosjek (%)	RSDr (%)
42	1	LLL	0,020	7,23	0,066	5,18	0,095	4,10	0,113	0,95	0,34	1,05
	2	OLLn+ PoLL	0,085	7,44	0,24	1,78	0,26	2,25	0,35	2,02	0,50	2,83
	3	PLLn	0,023	15,74	0,039	5,51	0,057	5,62	0,082	4,35	0,12	6,15
44	4	OLL	0,47	1,52	1,53	0,42	2,62	0,98	3,35	1,05	4,37	1,13
	5	OOLn+ PoOL	1,07	2,01	1,54	0,46	1,61	0,71	1,72	1,07	1,77	2,40
	6	PLL+ PoPoO	0,11	12,86	0,24	4,37	0,65	1,32	1,35	0,73	2,28	1,24
	7	POLn+ PpoPo+ PpoL	0,42	5,11	0,49	2,89	0,55	2,01	0,85	1,83	1,09	1,96
46	8	OOL+ LnPP	6,72	0,63	8,79	0,31	11,21	0,42	13,25	0,33	15,24	0,23
	9	PoOO	1,24	2,86	1,49	0,95	1,63	0,85	2,12	0,45	2,52	0,56
	10	SLL+ PLO	2,70	0,65	4,05	0,70	6,02	0,65	9,86	0,53	11,53	0,31
	11	PoOP+ SpoL+ SOLn+ SpoPo	0,64	4,42	0,69	3,02	0,79	1,23	1,53	0,89	1,70	1,66
48	12+13	OOO+ PLP+ PoPP	49,60	0,07	48,15	0,06	42,93	0,06	33,25	0,10	24,16	0,06
	14	SOL	0,82	1,72	0,92	1,56	1,05	1,32	1,25	1,05	1,60	1,77
	15	POO	22,75	0,25	21,80	0,20	21,05	0,30	20,36	0,35	20,17	0,14
50	16	POP	3,05	0,46	4,56	0,42	4,98	0,52	5,26	0,41	5,57	0,38
	17	SOO	6,87	0,21	5,56	0,33	4,86	0,43	4,12	0,72	3,09	0,69
	18	POS+ SLS	1,73	1,23	1,65	1,10	1,54	0,99	1,49	1,10	1,41	1,00
n = 3 replike RSDr = Relativna standardna devijacija ponovljivosti

Slika 2.

GC kromatogram alkilnih estera masnih kiselina dobivenih od ulja od komine maslina transesterifikacijom s hladnom otopinom KOH-a u metanolu

7.   OTKRIVANJE STRANIH ULJA U MASLINOVIM ULJIMA

Metoda izračuna otkrivanja stranih ulja u maslinovim uljima usporedbom matematičkih algoritama s bazom podataka izgrađenom od autentičnih maslinovih ulja utvrđena je u Prilogu I. normi IOC/T.20/dok. br.25.” br. 25.”