Lisäys I

RASVATON MAITOJAUHE: FOSFATIDYYLISERIININ JA FOSFATIDYYLIETANOLIAMIININ MÄÄRITYS

Menetelmä: käänteisfaasi-HPLC-menetelmä

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tässä kuvataan menetelmä rasvattomassa maitojauheessa (RMJ) olevan fosfatidyyliseriinin (FS) ja fosfatidyylietanoliamiinin (FE) kvantitatiiviseksi määrittämiseksi. Menetelmän avulla voidaan havaita RMJ:ssä esiintyvät kirnupiimän kiintoaineet.

2.   MÄÄRITELMÄ

FS + FE –pitoisuus: aineen massafraktio määritettynä tässä esitetyllä menetelmällä. Tulos ilmaistaan milligrammoina (mg) fosfatidyylietanoliamiinidipalmitoyyliä (FEDP) 100 grammassa jauhetta.

3.   MENETELMÄN PERIAATE

Aminofosfolipidit uutetaan ennastetusta maitojauheesta metanolilla. FS ja FE määritetään o-ftaalidialdehydi (OFA)-johdannaisina käänteisfaasi-HPLC:llä (RP-HPLC) ja fluoresenssidetektion avulla. Näytteen FS- ja FE -pitoisuudet määritetään kvantitatiivisesti vertaamalla standardinäytteeseen, joka sisältää tunnetun määrän FEDP:tä.

4.   REAGENSSIT

Kaikkien reagenssien on oltava tunnustettua analyysilaatua. Veden on oltava tislattua tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa, ellei toisin määritellä.

4.1   Standardi: PEDP, puhtaus vähintään 99 %

Huomautus: Standardia on säilytettävä – 18 °C:n lämpötilassa.

4.2   Reagenssit standardinäytteen ja testinäytteen valmistamiseksi

4.2.1   metanoli, HPLC-laatua

4.2.2   kloroformi, HPLC-laatua

4.2.3   tryptamiinimonohydrokloridi

4.3   Reagenssit o-ftaalidialdehydijohdannaisten valmistamiseen

4.3.1   natriumhydroksidi, 12 M vesiliuos

4.3.2   boorihappo, 0,4 M vesiliuos, pH säädettynä arvoon 10,0 natriumhydroksidin (4.3.1) avulla

4.3.3   2-merkaptoetanoli

4.3.4   o-ftaalidialdehydi (OFA)

4.4   HPLC-eluointiliuottimet

4.4.1   Eluointiliuottimet on valmistettava HPLC-laatuisia reagensseja käyttäen.

4.4.2   vesi, HPLC-laatua

4.4.3   metanoli, puhtaus tutkittu fluorometrillä

4.4.4   tetrahydrofuraani

4.4.5   natriumdivetyfosfaatti

4.4.6   natriumasetaatti

4.4.7   etikkahappo

5.   LAITTEET JA TARVIKKEET

5.1   Analyysivaaka, tarkkuus 1 mg, luettavuus 0,1 mg

5.2   Dekantterilaseja, tilavuus 25 ja 100 ml

5.3   Pipettejä, tilavuudet 1 ja 10 ml

5.4   Magneettisekoitin

5.5   Mittapipettejä, joilla voi pipetoida tilavuudet 0,2, 0,5 ja 5 ml

5.6   Mittapulloja, tilavuus 10, 50 ja 100 ml

5.7   Injektioruiskuja, tilavuus 20 ja 100 μl

5.8   Ultraäänihaude

5.9   Sentrifugi, 27 000 × g

5.10   Lasipulloja, tilavuus noin 5 ml

5.11   Mittalasi, tilavuus 25 ml

5.12   pH-mittari, tarkkuus 0,1 pH-yksikköä

5.13   HPLC-laite

5.13.1   säädettävä gradientin pumppausjärjestelmä, virtausnopeus 1,0 ml/min 200 barin paineessa

5.13.2   automaattinen näytteenkäsittelijä, jossa voi valmistaa johdannaisia

5.13.3   kolonniuuni, joka pysyy lämpötilassa 30 °C ± 1 °C

5.13.4   fluoresenssidetektori, joka toimii heräteaallonpituudella 330 nm ja emissioaallonpituudella 440 nm

5.13.5   integraattori tai tietojenkäsittelyohjelmisto, jolla pystytään mittaamaan piikkien pinta-aloja

5.13.6   LiChrospher®-100 -kolonni (250 × 4,6 mm) tai vastaava kolonni, joka on pakattu oktadekyylisilaanilla (C 18), hiukkaskoko 5 μm

6.   NÄYTTEENOTTO

Näytteet otetaan ISO-standardin 707 mukaisesti.

7.   SUORITUS

7.1   Sisäisen standardiliuoksen valmistus

7.1.1   Punnitaan 30,0 ± 0,1 mg tryptamiinimonohydrokloridia (4.2.3) 100 ml:n mittapulloon (5.6) ja täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1).

7.1.2   Pipetoidaan 1 ml (5.3) tätä liuosta 10 ml:n mittapulloon (5.6) ja täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1), jotta saadaan 0,15 mM:n tryptamiinipitoisuus.

7.2   Näyteliuoksen valmistus

7.2.1   Punnitaan 1,000 ± 0,001 g RMJ:ta 25 ml:n dekantterilasiin (5.2). Lisätään pipetillä 10 ml tislattua vettä (5.3), lämpötila 40 °C ± 1 °C, ja sekoitetaan magneettisekoittimella (5.4) 30 minuutin ajan mahdollisten paakkujen liuottamiseksi.

7.2.2   Pipetoidaan 0,2 ml (5.5) ennastettua maitoa 10 ml:n mittapulloon (5.6), lisätään injektioruiskulla (5,7) 100 μl 0,15 mM:n tryptamiiniliuosta (7.1) ja täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1). Sekoitetaan huolellisesti käännellen ja käsitellään ultraäänellä (5.8) 15 minuutin ajan.

7.2.3   Sentrifugoidaan (5.9) kiihtyvyydellä 27 000 g × g 10 minuutin ajan ja kerätään supernatantti neste pieneen lasipulloon (5.10).

Huomautus: Näyteliuos on säilytettävä 4 °C:n lämpötilassa, kunnes HPLC-analyysi suoritetaan.

7.3   Ulkoisen standardiliuoksen valmistus

7.3.1   Punnitaan 55,4 mg FEDP:tä (4.1) 50 ml:n mittapulloon (5.6) ja lisätään mittalasilla (5.11) noin 25 ml kloroformia (4.2.2). Kuumennetaan tulpallinen pullo lämpötilaan 50 °C ± 1 °C ja sekoitetaan huolellisesti, kunnes FEDP liukenee. Jäähdytetään pullo 20 °C:n lämpötilaan, täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1) ja sekoitetaan käännellen.

7.3.2   Pipetoidaan (5.3) 1 ml tätä liuosta 100 ml:n mittapulloon (5.6) ja täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1). Pipetoidaan (5.3) 1 ml tätä liuosta 10 ml:n mittapulloon (5.6), lisätään 100 μl (5.7) 0,15 mM tryptamiiniliuosta (7.1) ja täytetään merkkiin metanolilla (4.2.1). Sekoitetaan käännellen.

Huomautus: Vertailunäyteliuos on säilytettävä 4 °C:n lämpötilassa, kunnes HPLC-analyysi suoritetaan.

7.4   Derivointireagenssin valmistus

Punnitaan 25,0 ± 0,1 mg OFA:ta (4.3.4) 10 ml:n mittapulloon (5.6), lisätään 0,5 ml (5.5) metanolia (4.2.1) ja sekoitetaan huolellisesti OFA:n liuottamiseksi. Täytetään merkkiin boorihappoliuoksella (4.3.2) ja lisätään injektioruiskulla (5.7) 20 μl 2-merkaptoetanolia (4.3.3).

Huomautus: Derivointireagenssi on säilytettävä 4 °C:n lämpötilassa ruskeassa lasipullossa. Se pysyy stabiilina 1 viikon ajan.

7.5   Määritys HPLC:llä

7.5.1   Eluointiliuottimet (4.4)

Liuotin A: 0,3 mM natriumdivetyfosfaattiliuos ja 3mM natriumasetaattiliuos (pH säädettynä etikkahapolla arvoon 6,5 ± 0,1): metanoli:tetrahydrofuraani = 558:440:2 (v/v/v).

Liuotin B: metanoli

7.5.2   Ehdotettu eluointigradientti:

Aika (min)	Liuotin A (%)	Liuotin B (%)	Virtausnopeus (ml/min)
Alku	40	60	0
0,1	40	60	0,1
5,0	40	60	0,1
6,0	40	60	1,0
6,5	40	60	1,0
9,0	36	64	1,0
10,0	20	80	1,0
11,5	16	84	1,0
12,0	16	84	1,0
16,0	10	90	1,0
19,0	0	100	1,0
20,0	0	100	1,0
21,0	40	60	1,0
29,0	40	60	1,0
30,0	40	60	0

Huomautus: Eluointigradientti voi vaatia pieniä muutoksia kuviossa 1 esitetyn erotuskyvyn saamiseksi.

Kolonnin lämpötila: 30 °C.

7.5.3   Injektiotilavuus: 50 μl derivointireagenssia ja 50 μl näyteliuosta

7.5.4   Kolonnin tasapainotus

Kolonnia huuhdellaan 100-prosenttisella liuottimella B 15 minuutin ajan, tämän jälkeen asetetaan A:B = 40:60 ja saatetaan tasapainoon virtausnopeuden ollessa 1 ml/min 15 minuutin ajan. Suoritetaan ajo injektoimalla metanolia (4.2.1) sokeakokeeksi.

Huomautus: Jos kolonnia ei aiota käyttää pitkään aikaan, sitä huuhdellaan metanolin ja kloroformin seoksella (80:20 (v/v)) 30 minuutin ajan.

7.5.5   Määritetään näytteen FS + FE -pitoisuus

7.5.6   Suoritetaan kromatografisten analyysien sarja pitäen ajojen välinen aika vakiona vakioisten retentioaikojen saamiseksi. Ulkoista standardiliuosta (7.3) injektoidaan aina 5–10 näyteliuoksen välein vastekertoimen laskemiseksi.

Huomautus: Kolonni on huuhdeltava 100-prosenttisella liuottimella B (7.5.1) vähintään 30 minuutin ajan aina 20–25 ajon jälkeen.

7.6   Integrointimenetelmä

7.6.1   FEDP-piikki

FEDP eluoituu yhtenä piikkinä. Määritetään piikin pinta-ala integroimalla laaksosta laaksoon.

7.6.2   Tryptamiinipiikki

Tryptamiini eluoituu yhtenä piikkinä (kuvio 1). Määritetään piikin pinta-ala integroimalla laaksosta laaksoon.

7.6.3   FS- ja FE-piikkiryhmät

Kuvatuissa olosuhteissa (kuvio 1) FS eluoituu kahtena pääasiallisena, osittain erottumattomana piikkinä, jota edeltää pieni piikki. FE eluoituu kolmena pääasiallisena, osittain erottumattomana piikkinä. Määritetään jokaisen piikkiryhmän kokonaispinta-ala asettaen pohjaviiva kuviossa 1 esitetyllä tavalla.

8.   TULOSTEN LASKEMINEN JA ILMOITTAMINEN

Näyteliuoksen FS + FE -pitoisuus lasketaan seuraavasti:

C = 55,36 × ((A2)/(A1)) × ((T1)/(T2))

jossa:

C	=	näytteen FS- tai FE-pitoisuus (mg/100 g jauhetta)
A1	=	standardinäyteliuoksen (7.3) FEDP-piikin pinta-ala
A 2	=	näyteliuoksen (7.2) FS- tai FE-piikin pinta-ala
T 1	=	standardinäyteliuoksen (7.3) tryptamiinipiikin pinta-ala
T 2	=	näyteliuoksen (7.2) tryptamiinipiikin pinta-ala

9.   MENETELMÄN TARKKUUS

Huomautus: Toistettavuusarvot on laskettu kansainvälisen IDF-standardin (*) mukaisesti.

9.1   Toistettavuus

Toistettavuuden suhteellinen standardipoikkeama, joka ilmaisee saman henkilön samalla laitteella samoissa olosuhteissa samasta näytteestä lyhyin väliajoin saamien toisistaan riippumattomien määritystulosten vaihtelevuutta, ei saa olla yli 2 % suhteellisesti. Jos näillä edellytyksillä tehdään kaksi määritystä, kahden tuloksen suhteellinen ero saa olla enintään 6 % tulosten aritmeettisesta keskiarvosta.

9.2   Uusittavuus

Kun eri henkilöt tekevät eri laboratorioissa eri välineistöillä ja eri olosuhteissa määritykset samasta näytteestä, näiden kahden tuloksen välinen suhteellinen ero saa olla enintään 11 % tulosten aritmeettisesta keskiarvosta.

10.   VIITTEET

10.1   Resmini P., Pellegrino L., Hogenboom J.A., Sadini V., Rampilli M., ”Detection of buttermilk solids in skimmilk powder by HPLC quantification of aminophospholipids.” Sci. Tecn. Latt.-Cas., 39,395 (1988).

Kuva 1

HPLC-kuvio fosfatidyyliseriinin (FS) ja fosfatidyylietanoliamiinin (FE) OFA-johdannaisista ennastetun rasvattoman maitojauheen metanoliuutteessa. Kuviossa esitetään FS-, FE- ja tryptamiini- (sisäinen standardi) piikkien integrointitapa.

Lisäys II

JULKISEEN VARASTOINTIIN TARKOITETUN RASVATTOMAN MAITOJAUHEEN HERAJUOKSETTEEN OSOITTAMINEN KASEIINIMAKROPEPTIDIEN MÄÄRITYKSEN AVULLA SUUREN EROTUSKYVYN NESTEKROMATOGRAFIAA (HPLC) KÄYTTÄEN

1.   TARKOITUS JA SOVELTAMISALA

Tämän menetelmän avulla voidaan osoittaa herajuoksetteen esiintyminen julkiseen varastointiin tarkoitetussa rasvattomassa maitojauheessa kaseiinimakropeptidien määrityksen avulla.

2.   VIITE

Kansainvälinen standardi ISO 707 – Maito ja maitotuotteet – Näytteenotto-menetelmät.

3.   MÄÄRITELMÄ

Kuiva herajuoksetepitoisuus ilmoitetaan massaprosentteina ja määritetään kaseiinimakropeptidipitoisuutena tässä esitetyllä menetelmällä.

4.   PERIAATE

—	Rasvattoman maitojauheen ennastus, rasvojen ja proteiinien poisto trikloorietikkahapolla ja sentrifugointi tai suodatus.

—	Supernatantissa esiintyvien kaseiinimakropeptidien (CMP) määrän määritys suuren erotuskyvyn nestekromatografialla (HPLC).

—	Saadun tuloksen arviointi suhteessa rasvattoman maitojauheen standardinäytteisiin, joissa ei ole tai joihin on lisätty tunnettu prosenttimäärä herajauhetta.

5.   REAGENSSIT

Kaikkien reagenssien on oltava tunnustettua analyysilaatua. Veden on oltava tislattua tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa.

5.1   Trikloorietikkahappoliuos

Liuotetaan 240 g trikloorietikkahappoa (CCl3COOH) veteen ja täytetään 1 000 ml:ksi. Liuoksen tulee olla kirkasta ja väritöntä.

5.2   Eluointiliuos, pH 6,0

Liuotetaan 1,74 g dikaliumvetyfosfaattia (K2HPO4), 12,37 g monokaliumdivetyfosfaattia (KH2PO4) ja 21,41 g natriumsulfaattia (Na2SO4) noin 700 ml:aan vettä. Tarvittaessa säädetään pH 6,0:ksi fosforihappo- tai kaliumhydroksidiliuoksen avulla.

Täytetään 1 000 ml:ksi vedellä ja homogenoidaan.

Huomautus: Eluointiliuoksen koostumusta voidaan ajantasaistaa standardista annetun todistuksen tai kolonninpakkausmateriaalin valmistajan suositusten mukaisesti.

Eluointiliuos suodatetaan ennen käyttöä 0,45 μm:n kalvosuodattimen läpi.

5.3   Pesuliuos

Sekoitetaan yksi tilavuusosa asetonitriiliä (CH3CN) 9 tilavuusosaan vettä. Suodatetaan seos ennen käyttöä 0,45 μm:n kalvosuodattimen läpi.

Huomautus: Tässä voidaan käyttää mitä tahansa pesuliuosta, jolla on bakteereja tappava vaikutus ja joka ei heikennä kolonnien erotuskykyä.

5.4   Standardinäytteet

5.4.1   Tämän asetuksen vaatimuksia vastaava rasvaton maitojauhe eli [0].

5.4.2   Sama rasvaton maitojauhe sekoitettuna 5-prosenttiseksi (m/m) juoksetetyyppisellä, koostumukseltaan standardilla herajauheella eli [5].

6.   LAITTEET JA TARVIKKEET

6.1   Analyysivaaka

6.2   Sentrifugi, jolla voidaan saavuttaa 2 200 g:n keskipakovoima, varustettuna noin 50 ml:n sentrifugiputkilla, joissa on tulppa tai korkki

6.3   Mekaaninen ravistelija

6.4   Magneettisekoitin

6.5   Lasisuppiloita, halkaisija noin 7 cm

6.6   Suodatinpapereita, keskinopea suodatus, halkaisija noin 12,5 cm

6.7   Lasinen suodatuslaite, varustettuna huokoskooltaan 0,45 μm:n kalvosuodattimella

6.8   Mittapipettejä, joilla voidaan annostella 10 ml (ISO 648, luokka A tai ISO/R 835) tai laite, jolla voidaan annostella 10,0 ml kahdessa minuutissa

6.9   Laite, jolla voidaan annostella 20,0 ml vettä noin 50 °C:ssa

6.10   Vesihaude säädettynä termostaatilla 25 ± 0,5 °C:seen

6.11   HPLC-laitteisto, johon kuuluu:

6.11.1

pumppu

6.11.2

käsikäyttöinen tai automaattinen injektori, jonka injektiotilavuus on 15–30 μl

6.11.3

kaksi TSK 2 000 SW -kolonnia sarjassa (pituus 30 cm, sisähalkaisija 0,75 cm) tai tehokkuudeltaan vastaavat kolonnit (esim. yksi TSK 2 000-SWxl, yksi Agilent Technologies Zorbax GF 250) ja esikolonni (3 cm × 0,3 cm) pakattuna I 125:llä tai tehokkuudeltaan vastaavalla materiaalilla

6.11.4

kolonniuuni, jonka lämpötila on säädetty termostaatilla 35 ± 1 °C:seen

6.11.5

aallonpituudeltaan säädettävissä oleva UV-detektori, jolla voidaan suorittaa mittauksia 205 nm:ssä 0,008 Å:n herkkyydellä

6.11.6

integraattori, jolla voidaan integroida laaksosta laaksoon. Huomautus: Huoneenlämpötilassa olevilla kolonneilla voidaan työskennellä, mutta niiden erotuskyky on hieman heikompi. Tässä tapauksessa lämpötilan muutosten saman analyysisarjan aikana täytyy olla alle ± 5 °C.

7.   NÄYTTEENOTTO

7.1   Näytteet otetaan kansainvälisessä ISO-standardissa 707 kuvatun menettelyn mukaisesti. Jäsenvaltiot voivat kuitenkin käyttää muuta näytteenottomenetelmää, jos se on edellä mainitun standardin periaatteiden mukainen.

7.2   Näyte on säilytettävä olosuhteissa, joissa näyte ei pilaannu eikä sen koostumus muutu.

8.   SUORITUS

8.1   Testinäytteen esikäsittely

Maitojauhe siirretään astiaan, joka on siihen verrattuna tilavuudeltaan noin kaksinkertainen ja jossa on ilmatiivis kansi. Astia suljetaan välittömästi. Maitojauhe sekoitetaan käännellen astiaa toistuvasti ympäri.

8.2   Testinäyte

Punnitaan 2,000 ± 0,001 g näytettä sentrifugiputkeen (6.2) tai suljettuun pulloon (50 ml).

8.3   Rasvan ja proteiinien poisto

8.3.1   Lisätään näytteeseen 20,0 ml lämmintä vettä (50 °C). Liuotetaan jauhe ravistaen 5 minuutin ajan ravistelijalla (6.3). Asetetaan putki vesihauteeseen (6.10) ja annetaan putken lämpötilan tasaantua 25 °C:ksi.

8.3.2   Lisätään 10,0 ml trikloorietikkahappoliuosta (5.1), noin 25 °C, kahden minuutin aikana magneettisekoittajalla (6.4) voimakkaasti sekoittaen. Asetetaan putki vesihauteeseen (6.10) ja pidetään sitä siellä 60 minuuttia.

8.3.3   Sentrifugoidaan (6.2) kiihtyvyydellä 2 200 g kymmenen minuuttia, tai suodatetaan paperin läpi (6.6), poistetaan suodoksen viisi ensimmäistä millilitraa.

8.4   Kromatografinen määritys

8.4.1   Injektoidaan tarkasti mitattuna 15–30 μl supernatanttia tai suodosta (8.3.3) HPLC-laitteistoon (6.11), jonka virtausnopeus on 1,0 ml eluointiliuosta (5.2) minuutissa.

Huomautus 1. Muuta virtausnopeutta voidaan käyttää, jos otetaan huomioon kolonnien sisähalkaisija tai kolonnin valmistajan ohjeet.

Huomautus 2. Jokaisen keskeytyksen aikana kolonnit on huuhdeltava vedellä. Eluointiliuosta (5.2) ei saa koskaan jättää niihin.

Ennen jokaista yli 24 tunnin keskeytystä kolonnit on huuhdeltava vedellä ja pestävä sitten liuoksella (5.3) vähintään kolmen tunnin ajan virtausnopeudella 0,2 ml/minuutti.

8.4.2   Näytteen [E] kromatografisen määrityksen tulokset saadaan kromatogrammin muodossa, jossa jokainen piikki tunnistetaan sen retentioajasta RT seuraavasti:

Piikki II:	kromatogrammin toinen piikki, jonka RT on noin 12,5 minuuttia.
Piikki III:	kromatogrammin kolmas piikki, joka on CMP, joiden RT on 15,5 minuuttia.

Kolonnien valinta voi vaikuttaa merkittävästi eri piikkien retentioaikoihin.

Integraattori (6.11.6) laskee automaattisesti jokaisen piikin pinta-alan A, eli:

AII:	piikin II pinta-ala
AIII:	piikin III pinta-ala

Laitteiston tai kolonnien huonosta toiminnasta tai määritetyn näytteen luonteesta ja alkuperästä johtuvien mahdollisten poikkeavuuksien havaitsemiseksi on välttämätöntä tutkia jokainen kromatogrammi ennen kvantitatiivista tulkintaa.

Jos esiintyy epäilyjä, määritys on toistettava.

8.5   Kalibrointi

8.5.1   Standardinäytteisiin (5.4) sovelletaan täsmälleen 8.2–8.4.2 kohdassa kuvattua menettelyä.

On käytettävä juuri valmistettuja liuoksia, sillä CMP:t hajoavat 8 %:n triklooriasetaatissa. Niiden pitoisuus pienenee noin 0,2 %/tunti 30 °C:ssa.

8.5.2   Ennen näytteiden kromatografista määritystä kolonnit on valmisteltava injektoimalla toistuvasti standardinäytteen (5.4.2) liuosta (8.5.1), kunnes CMP:jä vastaavan piikin pinta-ala ja retentioaika pysyvät vakiona.

8.5.3   Määritetään vastekertoimet R injektoimalla sama tilavuusmäärä suodoksia (8.5.1) kuin näytteitä.

9.   TULOSTEN ILMOITTAMINEN

9.1   Laskutapa ja kaavat

9.1.1   Vastekertoimen R laskeminen:

Piikki II:

RII = 100/(AII[0])

jossa:

RII	=	piikin II vastekertoimet
AII [0]	=	kohdassa 8.5.3 saatu standardinäytteen [0] piikkien II pinta-ala

Piikki III:

RIII = W/(AIII[5] – AIII[0])

jossa:

RIII	=	piikin III vastekerroin
AIII [0] ja AIII [5]	=	kohdassa saadut standardinäytteiden [0] ja [5] piikin III pinta-alat
W	=	standardinäytteessä [5] esiintyvän heran määrä eli 5.

9.1.2   Näytteen [E] piikkien suhteellisen pinta-alan laskeminen

SII[E] = RII × AII[E]

SIII[E] = RIII × AIII[E]

SIV[E] = RIV × AIV[E]

jossa:

SII [E], SIII [E], SIV [E]	=	näytteen [E] piikkien II, III ja IV suhteelliset pinta-alat
AII [E], AIII [E]	=	kohdassa 8.4.2 saadut näytteen [E] piikkien II ja III pinta-alat
RII, RIII	=	kohdassa lasketut vastekertoimet

9.1.3   Näytteen [E] piikin III suhteellisen retentioajan laskeminen:

RRTIII[E] = (RTIII[E])/(RTIII[5])

jossa:

RRTIII [E]	=	näytteen [E] piikin III suhteellinen retentioaika
RTIII [E]	=	kohdassa 8.4.2 saatu näytteen [E] piikin III retentioaika
RTIII [5]	=	kohdassa 8.5.3 saatu vertailunäytteen [5] piikin III retentioaika

9.1.4   Kokeet ovat osoittaneet, että piikin III suhteellisen retentioajan eli RRTIII [E]:n ja aina 10 %:iin asti lisätyn herajauheen prosenttiosuuden välillä on olemassa lineaarinen riippuvuus:

—	RRTIII [E] on < 1,000, kun herapitoisuus on > 5 %,

—	RRTIII [E] on ≥ 1,000, kun herapitoisuus on ≤ 5 %.

Sallittu epätarkkuus RRTIII -arvoille on ± 0,002.

Tavallisesti RRTIII [0] -arvo eroaa vähän arvosta 1,034. Kolonnien kunnosta riippuen tämä arvo voi lähestyä arvoa 1,000, mutta sen on oltava aina tätä suurempi.

9.2   Näytteessä esiintyvän herajuoksetejauheen prosenttiosuuden laskeminen:

W = SIII[E] – [1, 3 + (SIII[0] – 0, 9)]

jossa:

W	=	näytteen [E] herajuoksetteen prosenttiosuus m/m
SIII [E]	=	kohdassa 9.1.2 saatu näytteen [E] piikin III suhteellinen pinta-ala
1,3	=	piikin III suhteellinen keskimääräinen pinta-ala grammoina herajuoksetetta 100 grammassa määritettynä alkuperältään erilaisista muuntamattomista rasvattomista maitojauheista. Tämä luku on saatu kokeellisesti.
SIII [0]	=	piikin III pinta-ala, joka on yhtä suuri kuin RIII × AIII [0]. Nämä arvot saadaan kohdissa 9.1.1 ja 8.5.3.
(SIII [0] – 0,9)	=	suhteelliseen pinta-alaan 1,3 tehtävä korjaus, kun SIII [0] ei ole yhtä suuri kuin 0,9. Kokeellisesti vertailunäytteen [0] piikin III keskimääräinen suhteellinen pinta-ala on 0,9.

9.3   Menetelmän tarkkuus

9.3.1   Toistettavuus

Kahden määritystuloksen, jotka sama henkilö on saanut samanaikaisesti tai aivan perätysten samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 0,2 % m/m.

9.3.2   Uusittavuus

Kahden toisistaan riippumattoman yksittäisen tuloksen, jotka on saatu kahdessa eri laboratoriossa täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 0,4 % m/m.

9.4   Tulkinta

9.4.1   Todetaan herattomuus, jos piikin III suhteellinen pinta-ala SIII [E], grammoina herajuoksetetta 100:aa tuotegrammaa kohti ilmaistuna, on ≤ 2,0 + (SIII[0] – 0,9),

jossa

2,0	on suurin sallittu arvo piikin III suhteelliselle pinta-alalle ottaen huomioon piikin III suhteellinen keskimääräinen pinta-ala (eli 1,3), rasvattomien maitojauheiden koostumuksen vaihteluista johtuva epätarkkuus ja menetelmän uusittavuus (9.3.2)
(SIII [0] – 0,9)	tehtävä korjaus, kun pinta-ala SIII [0] eroaa 0,9:stä (ks. 9.2 kohta)

9.4.2   Jos piikin III suhteellinen pinta-ala SIII [E] on > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) ja piikin II suhteellinen pinta-ala SII [E] ≤ 160, määritetään herajuoksetteen pitoisuus 9.2 kohdassa esitetyllä tavalla.

9.4.3   Jos piikin III suhteellinen pinta-ala SIII [E] on > 2,0 + (SIII[0] – 0,9) ja piikin II suhteellinen pinta-ala SII [E] ≤ 160, määritetään kokonaisproteiinipitoisuus (P %); sitten tutkitaan kuvia 1 ja 2.

9.4.3.1   Kuvissa 1 ja 2 esitetään tiedot, jotka on saatu analysoitaessa runsaasti proteiineja sisältäviä muuntamattomia rasvattomia maitojauheita.

Yhtenäisellä viivalla kuvattu suora edustaa lineaarisen regression suoraa, jonka kertoimet on laskettu pienimmän neliösumman menetelmällä.

Katkoviivalla kuvattu suora määrää piikin III suhteellisen pinta-alan ylärajan, joka ei ylity todennäköisyydellä 90 % tapauksista.

Kuvien 1 ja 2 katkoviivalla kuvattujen suorien yhtälöt ovat

SIII = 0,376 P % – 10,7	(kuva 1)
SIII = 0,0123 SII [E] + 0,93	(kuva 2)

jossa

SIII	on piikin III suhteellinen pinta-ala laskettuna joko proteiinien kokonaispitoisuudesta tai piikin SII [E] suhteellisesta pinta-alasta,
P %	on kokonaisproteiinipitoisuus painoprosentteina ilmaistuna,
SII [E]	on 9.1.2 kohdassa laskettu näytteen suhteellinen pinta-ala.

Nämä yhtälöt vastaavat 9.2 kohdassa mainittua lukua 1,3.

Poikkeama (T1 and T2) saadun suhteellisen pinta-alan SIII [E] ja suhteellisen pinta-alan SIII välillä saadaan seuraavista yhtälöistä: T1 = SIII[E] – [(0,376 P% – 10,7) + (SIII[0] – 0,9)]T2 = SIII[E] – [(0,0123 SII[E] + 0,93) + (SIII[0] – 0,9)]

Jos T1 ja/tai T2	ovat pienempiä tai yhtä suuria kuin nolla, herajuoksetteen esiintymistä ei voida määrittää.
Jos T1 ja/tai T2	ovat suurempia kuin nolla, herajuoksetetta todetaan esiintyvän.

Herajuoksetteen pitoisuus lasketaan seuraavalla kaavalla: W = T2 + 0,91

jossa:

0,91 on etäisyys pystyakselilla yhtenäisellä viivalla kuvatun suoran ja katkoviivalla kuvatun suoran välillä.

Lisäys III

RASVATTOMASSA MAITOJAUHEESSA OLEVAN KUIVAN HERAJUOKSETTEEN MÄÄRITYS

1.   TARKOITUS: RASVATTOMAAN MAITOJAUHEESEEN LISÄTYN KUIVAN HERAJUOKSETTEEN HAVAITSEMINEN

2.   VIITTEET: KANSAINVÄLINEN ISO-STANDARDI 707

3.   MÄÄRITELMÄ

Kuiva herajuoksetepitoisuus ilmoitetaan massaprosentteina ja määritetään kaseiinimakropeptidipitoisuutena tässä esitetyllä menetelmällä.

4.   PERIAATE

Näytteistä määritetään kaseiinimakropeptidi A suuren erotuskyvyn nestekromatografialla käänteisfaasimenetelmällä (HPLC). Tulos arvioidaan vertaamalla sitä rasvatonta maitojauhetta sisältäviin standardinäytteisiin, joista toisiin on ja toisiin ei ole lisätty herajauhetta. Jos tulos on yli 1 % (m/m), näytteessä on kuivaa herajuoksetta.

5.   REAGENSSIT

Kaikkien reagenssien on oltava tunnustettua analyysilaatua. Veden on oltava tislattua tai puhtaudeltaan vähintään sitä vastaavaa. Asetonitriilin on oltava spektroskopia- tai HPLC-laatua.

5.1   Trikloorietikkahappoliuos

Liuotetaan 240 g trikloorietikkahappoa (CCl3COOH) veteen ja täytetään 1 000 ml:ksi. Liuoksen tulee olla kirkasta ja väritöntä.

5.2   Eluointiliuokset A ja B

Eluointiliuos A: Mitataan 1 000 ml:n mittapulloon 150 ml asetonitriiliä (CH3CN), 20 ml isopropanolia (CH3CHOHCH3) ja 1,00 ml trifluorietikkahappoa (TFA, CF3COOH). Täytetään 1 000 ml:aan vedellä.

Eluointiliuos B: Mitataan 1 000 ml:n mittapulloon 550 ml asetonitriiliä, 20 ml isopropanolia ja 1,00 ml TFA:a. Täytetään 1 000 ml:aan vedellä. Eluointiliuos suodatetaan ennen käyttöä 0,45 μm:n kalvosuodattimen läpi.

5.3   Kolonnin säilytys

Määritysten jälkeen kolonni huuhdellaan ensin eluointiliuoksella B (gradientilla) ja sitten asetonitriilillä (gradientilla 30 minuuttia). Kolonni säilytetään asetonitriilissä.

5.4   Standardinäytteet

5.4.1   Julkista varastointia koskevia vaatimuksia vastaava rasvaton maitojauhe (eli [0]).

5.4.2   Sama rasvaton maitojauhe sekoitettuna 5-prosenttiseksi (m/m) juoksetetyyppisellä, koostumukseltaan standardilla herajauheella eli [5].

5.4.3   Sama rasvaton maitojauhe sekoitettuna 50-prosenttiseksi (m/m) juoksetetyyppisellä, koostumukseltaan standardilla herajauheella eli [5].

6.   LAITTEET JA TARVIKKEET

6.1   Analyysivaaka

6.2   Sentrifugi, jolla voidaan saavuttaa 2 200 g:n keskipakovoima, varustettuna noin 50 ml:n sentrifugiputkilla, joissa on tulppa tai korkki

6.3   Mekaaninen ravistelija

6.4   Magneettisekoitin

6.5   Lasisuppiloita, halkaisija noin 7 cm

6.6   Suodatinpapereita, keskinopea suodatus, halkaisija noin 12,5 cm

6.7   Lasinen suodatuslaite, varustettuna huokoskooltaan 0,45 μm:n kalvosuodattimella

6.8   Mittapipettejä, joilla voidaan annostella 10 ml (ISO 648, luokka A tai ISO/R 835) tai laite, jolla voidaan annostella 10,0 ml kahdessa minuutissa

6.9   Laite, jolla voidaan annostella 20,0 ml vettä noin 50 °C:ssa

6.10   Vesihaude säädettynä termostaatilla 25 ± 0,5 °C:seen

6.11   HPLC-laitteisto, johon kuuluu:

6.11.1

kaksikanavainen gradienttipumppu

6.11.2

käsikäyttöinen tai automaattinen injektori, tilavuus 100 μl

6.11.3

Agilent Technologies Zorbax 300 SB-C3 -kolonni (pituus 25 cm, sisähalkaisija 0,46 cm) tai vastaava käänteisfaasikolonni, silikapohjainen, suurihuokoinen

6.11.4

kolonniuuni, jonka lämpötila on säädetty termostaatilla 35 ± 1 °C:seen

6.11.5

aallonpituudeltaan muunneltavissa oleva UV-detektori, jolla voidaan mitata 210 nm:ssä (tarvittaessa voidaan käyttää suurempaa aallonpituutta aina 220 nm:iin asti), herkkyys 0,02 Å

6.11.6

integraattori, jolla voidaan integroida yhteiseen perusviivaan tai laaksosta laaksoon Huomautus: Kolonneja voi käyttää myös huoneenlämmössä, jos lämpötilavaihtelua on enintään 1 °C; muussa tapauksessa CMPA:n retentioajassa esiintyy melko suuria vaihteluita.

7.   NÄYTTEENOTTO

7.1   Näytteet otetaan kansainvälisessä ISO-standardissa 707 kuvatun menettelyn mukaisesti. Jäsenvaltiot voivat kuitenkin käyttää muuta näytteenottomenetelmää, jos se on edellä mainitun standardin periaatteiden mukainen.

7.2   Näyte on säilytettävä olosuhteissa, joissa näyte ei pilaannu eikä koostumus muutu.

8.   SUORITUS

8.1   Testinäytteen esikäsittely

Maitojauhe siirretään astiaan, joka on siihen verrattuna tilavuudeltaan noin kaksinkertainen ja jossa on ilmatiivis kansi. Astia suljetaan välittömästi. Maitojauhe sekoitetaan käännellen astiaa toistuvasti ympäri.

8.2   Testinäyte

Punnitaan 2,00 ± 0,001 g näytettä sentrifugiputkeen (6.2) tai tulpalliseen pulloon (50 ml).

Huomautus: Kun kyseessä ovat esiseokset, punnitaan sellainen määrä näytettä, että rasvattoman näytteen osuus on 2,00 g.

8.3   Rasvan ja proteiinien poisto

8.3.1   Lisätään näytteeseen 20,0 ml lämmintä vettä (50 °C). Liuotetaan jauhe ravistaen 5 minuutin ajan ravistelijalla (6.3). Asetetaan putki vesihauteeseen (6.10) ja annetaan putken lämpötilan tasaantua 25 °C:ksi.

8.3.2   Lisätään kahden minuutin aikana 10,0 ml noin 25 °C trikloorietikkahappoliuosta (5.1), koko ajan voimakkaasti magneettisekoittimella sekoittaen (6.4). Asetetaan putki vesihauteeseen (6.10) ja pidetään sitä siellä 60 minuuttia.

8.3.3   Sentrifugoidaan (6.2) kiihtyvyydellä 2 200 g kymmenen minuuttia tai suodatetaan paperin läpi (6.6). Heitetään pois suodoksen viisi ensimmäistä millilitraa.

8.4.   Kromatografinen määritys

8.4.1   Käänteisfaasi-HPLC-menetelmää käytettäessä happaman kirnupiimäjauheen esiintymisestä johtuvien väärien positiivisten tulosten mahdollisuus on poissuljettu.

8.4.2   Ennen käänteisfaasi-HPLC-määritystä on gradientin olosuhteet optimoitava. Retentioaika 26 ± 2 minuuttia CMP A:lle on ihanteellinen gradienttijärjestelmille, joissa kuollut tilavuus on noin 6 ml (tilavuus siitä kohdasta, jossa liuottimet yhtyvät siihen kohtaan, jossa injektiosilmukka loppuu). Gradienttijärjestelmissä, joissa kuollut tilavuus on pienempi (esimerkiksi 2 ml), on käytettävä 22 minuuttia optimaalisena retentioaikana.

Otetaan standardinäytteet (5.4) ilman 50-prosenttista herajuoksetetta ja sen kanssa.

Injektoidaan 100 μl supernatanttia tai suodosta (8.3.3) HPLC-laitteistoon käyttäen taulukossa 1 esitettyjä gradientin viiteolosuhteita.

Taulukko 1

Gradientin viiteolosuhteet kromatografian optimoimiseksi

Aika (min.)	Virtausnopeus (ml/min)	% A	% B	Kuvaaja
Alku	1,0	90	10	*
27	1,0	60	40	lineaarinen
32	1,0	10	90	lineaarinen
37	1,0	10	90	lineaarinen
42	1,0	90	10	lineaarinen

Näiden kahden kromatogrammin vertailun avulla olisi voitava paikallistaa CMPΑ-piikki.

Jäljempänä annetulla kaavalla voidaan laskea normaalille gradientille alussa käytettävän liuottimen koostumus (8.4.3) seuraavasti: % B = 10 – 2,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 30 / 27 % B = 7,5 + (13,5 + (RTcmpA – 26) / 6) * 1,11

jossa

RTcmpA	:	CMPΑ:n retentioaika viitegradientissa
10	:	viitegradientin B % alussa
2,5	:	B-liuoksen prosenttiosuus keskikohdassa miinus B-liuoksen prosenttiosuus alussa normaaligradientissa
13,5	:	13,5 viitegradientin keskikohdan ajankohta
26	:	CMPΑ:lle vaadittu retentioaika
6	:	viitegradientin ja normaaligradientin kulmakertoimien suhde
30	:	B-liuoksen prosenttiosuus alussa miinus B-liuoksen prosenttiosuus 27 minuutin kohdalla viitegradientissa
27	:	viitegradientin ajoaika

8.4.3   Näytteiden injektointi

Injektoidaan tarkasti mitattuna 100 μl supernatanttia tai suodosta (8.3.3) HPLC-laitteistoon virtausnopeudella 1,0 ml eluointiliuosta (5.2) minuutissa.

Määrityksen alussa eluenttikoostumus saadaan 8.4.2 kohdasta. Se on tavallisesti lähellä arvoa A:B = 76:24 (5.2). Välittömästi injektoinnin jälkeen aloitetaan lineaarinen gradientti, joka johtaa 5 % suurempaan B:n prosenttiosuuteen 27 minuutin jälkeen. Sen jälkeen aloitetaan lineaarinen gradientti, joka saa eluaattikoostumuksen B:n 90 %:ksi viidessä minuutissa. Tätä koostumusta ylläpidetään viisi minuuttia. Sen jälkeen aina lineaarisen gradientin avulla palataan alkuperäiseen koostumukseen viidessä minuutissa. Pumppausjärjestelmän sisäisestä tilavuudesta riippuen seuraava injektointi voidaan tehdä 15 minuutin kuluttua siitä kun alkuperäiset olosuhteet on saavutettu.

Huomautus 1. CMPA:n retentioajan olisi oltava 26 ± 2 minuuttia. Tämä voidaan saavuttaa vaihtelemalla ensimmäisen gradientin alku- ja loppuolosuhteita. Ensimmäisen gradientin B %:n alku- ja loppuolosuhteiden eron on kuitenkin pysyttävä 5 %:ssa B:stä.

Huomautus 2. Eluenteista on poistettava kaasut riittävässä määrin, ja ne on myös säilytettävä kaasuttomina. Tämä on välttämätöntä gradientin pumppausjärjestelmän asianmukaisen toiminnan kannalta. CMPA-piikin retentioajan standardipoikkeaman on oltava pienempi kuin 0,1 minuuttia (n = 10).

Huomautus 3. Joka viidennen näytteen jälkeen on injektoitava vertailunäytettä [5] ja käytettävä sitä uuden vastekertoimen R laskemiseksi (9.1.1).

8.4.4.   Näytteen (E) kromatografisen määrityksen tulokset saadaan kromatogrammina, jossa CMPA-piikki tunnistetaan sen retentioajasta, joka on noin 26 minuuttia.

Integraattori (6.11.6) laskee automaattisesti CMPA-piikin korkeuden H. Jokaisen kromatogrammin perusviiva on tarkistettava. Määritys tai integrointi on toistettava, jos perusviiva on sijainnut väärässä kohdassa.

Huomautus: Jos CMPA-piikki erottuu riittävästi muista piikeistä, olisi käytettävä perusviivaa laaksosta laaksoon; muutoin tehdään kohtisuorat viivat yhteiseen perusviivaan, jonka pitäisi alkaa läheltä CMPA-piikkiä (eli ei t = 0 min!).Standardille ja näytteelle on käytettävä samaa integrointityyppiä, ja jos käytetään yhteistä perusviivaa, on tarkistettava, että se on näytteen ja standardin osalta johdonmukainen.

Mahdollisesti laitteiston tai kolonnin huonosta toiminnasta tai määritettävän näytteen alkuperästä ja luonteesta johtuvien poikkeavuuksien havaitsemiseksi on välttämätöntä tarkastella jokaista kromatogrammia ennen kvantitatiivista tulkintaa. Jos esiintyy epäilyjä, määritys on toistettava.

8.5   Kalibrointi

8.5.1   Standardinäytteille (5.4.1–5.4.2) sovelletaan täsmälleen 8.2–8.4.4 kohdassa kuvattua menettelyä. On käytettävä juuri valmistettuja liuoksia, sillä CMP hajoaa 8 % trikloorietikkahapossa huoneenlämmössä. Liuos pysyy 4 °C:ssa stabiilina 24 tuntia. Jos määrityssarjat ovat pitkiä, on toivottavaa käyttää jäähdytettyä näytetarjotinta automaatti-injektorissa.

Huomautus: Edellä oleva 8.4.2 kohta voidaan jättää pois, jos B:n % tunnetaan alkuolosuhteissa aikaisempien määritysten perusteella.

Vertailunäytteen [5] kromatogrammin on oltava kuvan 1 mukainen. 1. Tässä kuvassa CMPA-piikkiä edeltää kaksi pientä piikkiä. On välttämätöntä saada samanlainen erottuminen.

8.5.2   Ennen näytteiden kromatografista määritystä injektoidaan 100 μl standardinäytettä, joka ei sisällä herajuoksetetta [0] (5.4.1).

Kromatogrammissa ei saa esiintyä piikkiä CMPA-piikin retentioajan kohdalla.

8.5.3   Määritetään vastekertoimet R injektoimalla sama tilavuusmäärä suodoksia (8.5.1) kuin näytteitä.

9.   TULOSTEN ILMOITTAMINEN

9.1   Laskutapa ja kaavat

9.1.1   Vastekertoimen R laskeminen:

CMPA-piikki: R = W/H

jossa

R	=	CMPA-piikin vastekerroin
H	=	CMPA-piikin korkeus
W	=	standardinäytteen [5] sisältämän heran määrä

9.2   Näytteessä esiintyvän herajuoksetejauheen prosenttiosuuden laskeminen

W(E) = R × H(E)

jossa

W(E)	=	näytteen (E) herajuoksetteen prosenttiosuus m/m
R	=	CMPA-piikin vastekerroin (9.1.1)
H(E)	=	näytteen (E) CMPA-piikin korkeus

Jos W(E) on yli 1 % ja jos näytteen retentioajan ja standardinäytteen [5] retentioajan välinen ero on pienempi kuin 0,2 minuuttia, herajuoksetteen esiintyminen on osoitettu.

9.3   Menetelmän tarkkuus

9.3.1   Toistettavuus

Kahden määritystuloksen, jotka sama henkilö on saanut samanaikaisesti tai aivan perätysten samalla välineistöllä täysin samanlaiselle testimateriaalille, ero saa olla enintään 0,2 % m/m.

9.3.2   Uusittavuus

Ei määritetty.

9.3.3   Lineaarisuus

Kuvaajan on oltava lineaarinen herajuoksetteen pitoisuusalueella 0–16 %, ja korrelaatiokertoimen on oltava > 0,99.

9.4   Tulkinta

1 %:n raja sisältää uusittavuudesta johtuvan epävarmuuden.

Kuva 1

Ni—4.6 standardi

LIITE VI

Yksityisessä varastoinnissa olevan voin analyysimenetelmät

Parametri	Menetelmä
Rasva (6)	ISO 17189 tai ISO 3727 osa 3
Vesi	ISO 3727 osa 1
Rasvaton kuiva-aine (suola pois luettuna)	ISO 3727 osa 2
Suola	ISO 15648

LIITE VII

Yksityisessä varastoinnissa olevan rasvattoman maitojauheen analyysimenetelmät

Parametri	Menetelmä
Rasva	ISO 1736
Proteiini	ISO 8968 osa 1
Vesi	ISO 5537

LIITE VIII

Yksityisessä varastoinnissa olevan juuston analyysimenetelmät

1.

Lisäyksessä esitettyä menetelmää sovelletaan sen varmistamiseksi, ettei juusto, joka on valmistettu yksinomaan lampaan-, vuohen- tai puhvelinmaidosta taikka lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista, sisällä lehmänmaidon kaseiinia. Lehmänmaidon kaseiinia katsotaan esiintyvän, jos analysoitavan näytteen lehmänmaidon kaseiinipitoisuus on yhtä suuri tai suurempi kuin lisäyksessä esitetyn, 1 prosenttia lehmänmaitoa sisältävän vertailunäytteen pitoisuus.

2.

Lehmänmaidon kaseiinin osoittamiseksi 1 kohdassa tarkoitetuista juustoista voidaan käyttää menetelmiä seuraavin edellytyksin: a) toteamisraja on enintään 0,5 prosenttia ja b) vääriä positiivisia tuloksia ei esiinny ja c) lehmänmaidon kaseiini on osoitettavissa vaaditulla herkkyydellä pitkienkin kypsyttämisjaksojen jälkeen, kuten voi tapahtua tavanomaisissa kaupallisissa olosuhteissa. Jos jokin edellä mainituista edellytyksistä ei täyty, on käytettävä lisäyksessä esitettyjä menetelmiä.

Lisäys

MENETELMÄ LEHMÄNMAIDON JA KASEINAATIN OSOITTAMISEKSI LAMPAAN-, VUOHEN- TAI PUHVELINMAIDOSTA TAI LAMPAAN-, VUOHEN- JA PUHVELINMAIDON SEOKSISTA VALMISTETUISSA JUUSTOISSA

1.   SOVELTAMISALA

Lehmänmaidon ja kaseinaatin osoittaminen lampaan-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa juustoissa plasminolyysissä muodostuvien γ-kaseiinien isoelektrisellä fokusoinnilla.

2.   SOVELTAMISALA

Menetelmä sopii käsittelemättömän ja lämpökäsitellyn lehmänmaidon ja kaseinaatin osoittamiseen hyvällä herkkyydellä ja spesifistisesti lampaan-, vuohen- tai puhvelinmaidosta tai lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetuissa tuoreissa ja kypsytetyissä juustoissa. Se ei sovellu niiden osoittamiseen, jos maito tai juusto on väärennetty lämpökäsitellyillä naudan heraproteiinikonsentraateilla.

3.   MENETELMÄN PERIAATE

3.1   Kaseiinien eristäminen juustosta ja vertailustandardeista

3.2   Eristettyjen kaseiinien liuottaminen ja pilkkominen plasmiinilla (EC.3.4.21.7)

3.3   Plasmiinilla käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi urean läsnäollessa ja proteiinien värjäys

3.4   Värjättyjen γ3- ja γ2-kaseiinikuvioiden (näyttö lehmänmaidosta) arviointi vertaamalla näytteestä saatua kuviota kuvioihin, jotka on saatu samassa geelissä 0 % ja 1 % lehmänmaitoa sisältävistä vertailustandardeista

4.   REAGENSSIT

On käytettävä analyysilaatuisia kemikaaleja, ellei toisin mainita. Veden on oltava kahdesti tislattua tai puhtaudeltaan sitä vastaavaa.

Huomautus: Seuraavia yksityiskohtaisia ohjeita sovelletaan laboratoriossa valmistettuihin ureaa sisältäviin polyakryyliamidigeeleihin, joiden mitat ovat 265 × 125 × 0,25 mm. Jos käytetään muunkokoisia ja -tyyppisiä geelejä, erotusolosuhteita voidaan joutua säätämään.

Isoelektrinen fokusointi

4.1   Reagenssit ureaa sisältävien polyakryyliamidigeelien valmistamiseksi

4.1.1   Geelin kantaliuos

Liuotetaan

4,85 g akryyliamidia

0,15 g N, N′-metyleeni-bis-akryyliamidia (BIS)

48,05 g ureaa

15,00 g glyserolia (87 % w/w)

veteen ja täytetään 100 ml:aan, säilytetään ruskeassa lasipullossa jääkaapissa.

Huomautus: Painoltaan määrättyjen hermomyrkyllisten akryyliamidien sijasta voi käyttää myös kaupallisesti saatavaa esisekoitettua akryyliamidi/BIS-liuosta. Kun tällainen liuos sisältää 30 % w/v akryyliamidia ja 0,8 % w/v BIS:ä, tätä on käytettävä 16,2 ml varastoliuokseen määrättyjen painojen sijaan. Varastoliuoksen säilyvyys on enintään 10 päivää; jos sen johtokyky on suurempi kuin 5 μS, on suoritettava ioninpoisto sekoittamalla sitä 2 g:n Amberlite MB-3:n kanssa 30 minuutin ajan ja sitten suodatettava 0,45 μm:n kalvon läpi.

4.1.2   Geeliliuos

Valmistetaan geeliliuos sekoittamalla varastoliuokseen lisäaineita ja amfolyyttejä (*) (ks. 4.1.1).

9,0 ml varastoliuosta

24 mg de β-alaniinia

500 μl amfolyyttiä, pH 3,5–9,5

250 μl amfolyyttiä, pH 5-7

250 μl amfolyyttiä, pH 6-8

Geeliliuosta sekoitetaan ja poistetaan ilmaa 2–3 minuutin ajan ultraäänihauteessa tai tyhjiössä.

Huomautus: Geeliliuos valmistetaan välittömästi ennen sen kaatamista (ks. 6.2).

4.1.3   Katalyyttiliuokset

4.1.3.1   N, N, N′, N′-tetrametyylietyleenidiamiini (TEMED)

4.1.3.2   40 % w/v ammoniumpersulfaatti (PER):

Liuotetaan 800 mg PER:ää veteen ja täytetään 2 ml:aan.

Huomautus: Aina on käytettävä juuri valmistettua PER-liuosta.

4.2   Kontaktineste

Petroli tai parafiiniöljy.

4.3   Anodiliuos

Liuotetaan 5,77 g fosforihappoa (85 % w/w) veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi.

4.4   Katodiliuos

Liuotetaan 2,00 g natriumhydroksia veteen ja laimennetaan 100 ml:ksi vedellä.

Näytteen valmistus

4.5   Reagenssit proteiinien eristämiseksi

4.5.1   Laimea etikkahappo (25,0 ml jääetikkaa täytetään 100 ml:aan vedellä)

4.5.2   Dikloorimetaani

4.5.3   Asetoni

4.6   Proteiinia liuottava puskuriliuos

Liuotetaan

5,75 g glyserolia (87 % w/w)

24,03 g ureaa

250 mg ditiotreitolia

veteen ja täytetään 50 ml:aan.

Huomautus: Säilytetään jääkaapissa, säilyvyys enintään 1 viikko.

4.7   Reagenssit kaseiinien pilkkomiseksi plasmiinilla

4.7.1   Ammoniumkarbonaattipuskuri

Titrataan 0,2 mol/l ammoniumvetykarbonaattiliuos (1,58 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l etyleenidiamiinitetraetikkahappoa (EDTA, 1,46 g/100 ml vettä), 0,2 mol/l ammoniumkarbonaattiliuoksella (1,92 g/100 ml vettä), joka sisältää 0,05 mol/l EDTA:a, siten että pH:ksi saadaan 8.

4.7.2   Naudan plasmiini (E.C.3.4.21.7), aktiivisuus vähintään 5 U/ml

4.7.3   ε-Aminokapronihappoliuos entsyymi-inhibitiota varten

Liuotetaan 2 624 g ε-aminokapronihappoa (6-amino-n-heksaanihappoa) 100 ml:aan 40 % (v/v) etanolia.

4.8   Standardit

4.8.1   Varmennettuja vertailustandardeja juoksetetusta rasvattomasta lampaan- ja vuohenmaidon seoksesta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa, on saatavana vertailumateriaalien ja -mittausten tutkimuslaitoksesta (IRMM), B-2440 Geel, Belgia.

4.8.2   Laboratorion välistandardien valmistaminen puhvelin juoksutetusta maidosta, joka sisältää 0 % ja 1 % lehmänmaitoa

Rasvaton maito valmistetaan sentrifugoimalla joko puhvelin tai naudan käsittelemätöntä irtomaitoa 37 °C:ssa, 2 500 g 20 minuutin ajan. Kun koeputki ja sen sisältö on jäähdytetty nopeasti lämpötilaan 6–8 °C, poistetaan ylempi rasvakerros kokonaan. 1 % standardin valmistamiseksi lisätään 5,00 ml naudan rasvatonta maitoa 495 ml:aan puhvelin rasvatonta maitoa 1 l:n dekantterilasissa, säädetään pH:n arvoksi 6,4 laimeaa maitohappoa (10 % w/v) lisäämällä. Säädetään lämpötila 35 °C:seen ja lisätään 100 μl vasikanjuoksetetta (juoksetteen aktiivisuus 1:10 000, n. 3 000 U/ml), sekoitetaan 1 minuutin ajan ja sen jälkeen dekantterilasi jätetään seisomaan alumiinifoliolla päällystettynä 35 °C:seen yhdeksi tunniksi juustomassan muodostamiseksi. Kun juustomassa on muodostunut, juoksettunut maito kylmäkuivataan kokonaisuudessaan ilman enempää homogenointia tai heran valuttamista. Kylmäkuivauksen jälkeen se jauhetaan hienoksi homogeenisen jauheen saamiseksi. Sama menettely suoritetaan 0 %:n standardin valmistamiseksi aitoa rasvatonta puhvelinmaitoa käyttäen. Standardeja on säilytettävä lämpötilassa – 20 °C.

Huomautus: On suositeltavaa tarkistaa puhvelinmaidon puhtaus plasmiini-käsiteltyjen kaseiinien isoelektrisellä fokusoinnilla ennen standardien valmistamista.

Reagenssit proteiinien värjäykseen

4.9   Kiinnitysaine

Liuotetaan 150 g trikloorietikkahappoa veteen ja täytetään 1 000 ml:aan.

4.10   Värinpoistoliuos

Laimennetaan 500 ml metanolia ja 200 ml jääetikkaa 2 000 ml:ksi tislatulla vedellä.

Huomautus: Tuore värinpoistoliuos on valmistettava joka päivä; se voidaan valmistaa sekoittamalla yhtä suuret tilavuudet varastoliuoksia, 50 % (v/v) metanolia ja 20 % (v/v) jääetikkaa.

4.11   Värjäysliuokset

4.11.1   Värjäysliuos (kantaliuos 1)

Liuotetaan 3,0 g Coomassie-briljanttisinistä G 250 (C.I. 42655) 1 000 ml:aan 90 % (v/v) metanolia magneettisekoittajaa käyttäen (n. 45 minuuttia), suodatetaan kahden keskinopean taitetun suodatinpaperin läpi.

4.11.2   Värjäysliuos (kantaliuos 2)

Liuotetaan 5,0 g kuparisulfaattipentahydraattia 1 000 ml:aan 20 % (v/v) etikkahappoa.

4.11.3   Värjäysliuos (työskentelyliuos)

Sekoitetaan yhteen 125 ml kumpaakin varastoliuosta (4.11.1, 4.11.2) välittömästi ennen värjäystä.

Huomautus: Värjäysliuos tulisi valmistaa sinä päivänä, jona sitä käytetään.

5.   LAITTEET JA TARVIKKEET

5.1   Lasilevyjä (265 × 125 × 4 mm); kumitela (leveys 15 cm); vaakatasopöytä

5.2   Kantaja-arkki geelille (265 × 125 mm)

5.3   Peitearkki (280 × 125 mm). Kiinnitetään teippinauha (280 × 6 × 0,25 mm) kummallekin pitkälle sivulle (ks. kuva 1).

5.4   Elektrofokusointikammio, jossa on jäähdytyslevy (esim. 265 × 125 mm) ja sopiva virtalähde (≥ 2,5 kV) tai automaattinen elektroforeesilaite

5.5   Kiertokryostaatti, säädetty termostaatilla lämpötilaan 12 ± 0,5 °C

5.6   Sentrifugi, säädettävissä nopeuteen 3 000 g

5.7   Elektrodiliuskat (pituus ≥ 265 mm)

5.8   Muovisia tippapulloja anodi- ja katodiliuoksille

5.9   Näyteapplikaattoreita (10 × 5 mm, viskoosia tai suodatinpaperia, joka ei absorboi proteiineja)

5.10   Ruostumatonta terästä olevia tai lasisia värjäys- ja värinpoistoastioita (esim. 280 × 150 mm instrumenttitarjottimia)

5.12   Säädettävissä oleva sauvahomogenisaattori (varren halkaisija 10 mm), rpm alueella 8 000–20 000

5.13   Magneettisekoitin

5.14   Ultraäänihaude

5.15   Kalvojen saumaukseen sopiva laite

5.16   Mikropipettejä, 25 μl

5.17   Tyhjiöhaihdutin tai kylmäkuivain

5.18   Vesihaude, joka on termostaatilla säädeltävissä lämpötiloihin 35 ja 40 ± 1 °C, ravistelijalla varustettuna

5.19   Tiheysmittari, luettavissa aallonpituudella λ = 634 nm

6.   SUORITUS

6.1   Näytteen valmistus

6.1.1   Kaseiinien eristäminen

Punnitaan 5:ttä g:aa juuston kuiva-ainetta vastaava määrä näytettä tai vertailustandardeja 100 ml:n sentrifugiputkeen, lisätään 60 ml tislattua vettä ja homogenoidaan sauvahomogenisaattorilla (8 000–10 000 rpm). Säädetään pH-arvoon 4,6 laimealla etikkahapolla (4.5.1) ja sentrifugoidaan (5 min., 3 000 g). Dekantoidaan rasva ja hera, homogenoidaan jäännös kierrosnopeudella 20 000 rpm 40 ml:n kanssa tislattua vettä, jonka pH on säädetty arvoon 4,5 laimealla etikkahapolla (4.5.1), lisätään 20 ml dikloorimetaania (4.5.2), homogenoidaan jälleen ja sentrifugoidaan (5 min., 3 000 g). Poistetaan lastalla kaseiinikerros, joka kelluu vesifaasin ja orgaanisen faasin välissä (ks. kuva 2) ja dekantoidaan molemmat faasit pois. Homogenoidaan kaseiini uudelleen 40 ml:n tislattua vettä (ks. edellä) ja 20 ml:n dikloorimetaania (4.5.2) kanssa ja sentrifugoidaan. Toistetaan menettely, kunnes molemmat uuttofaasit ovat värittömiä (2–3 kertaa). Homogenoidaan proteiinijäännös 50 ml:lla asetonia (4.5.3) ja suodatetaan keskinopean taitetun suodatinpaperin läpi. Pestään suodatinpaperille jäävä jäännös kahdesti kahdella erillisellä 25 ml:n annoksella asetonia ja annetaan kuivua ilmassa tai typpivirrassa; tämän jälkeen jauhetaan hienoksi huhmareessa.

Huomautus: Eristetyt kuivat kaseiinit on säilytettävä lämpötilassa – 20 °C.

6.1.2   β-kaseiinien pilkkominen plasmiinilla γ-kaseiinin vahvistamiseksi

Dispergoidaan 25 mg eristettyjä kaseiineja (6.1.1) 0,5 ml:aan ammoniumkarbonaattipuskuria (4.7.1) ja homogenoidaan 20 minuutin ajan esim. ultraäänellä. Kuumennetaan lämpötilaan 40 °C ja lisätään 10 μl plasmiinia (4.7.2), sekoitetaan ja inkuboidaan tunnin ajan 40 °C:ssa jatkuvasti ravistellen. Entsyymin inhiboimiseksi lisätään 20 μl ε-kapronihappoliuosta (4.7.3), tämän jälkeen lisätään 200 mg kiinteää ureaa ja 2 mg ditiotreitolia.

Huomautus: Symmetrisempien kaseiinijuovien saamiseksi fokusoinnissa on suositeltavaa kylmäkuivata liuos ε-kapronihappoliuoksen lisäämisen jälkeen ja liuottaa sitten jäännökset 0,5 ml:aan proteiinia liuottavaan puskuriin (4.6).

6.2   Ureaa sisältävien polyakryyliamidigeelien valmistus

Muutaman vesipisaran avulla levitetään geelin kantaja-arkki (5.2) lasilevyn (5.1) päälle ja kuivataan kaikki ylimääräinen vesi paperipyyhkeellä. Samoin levitetään peitearkki (5.3), jossa on välikkeet (0,25 mm), toisen lasilevyn päälle. Asetetaan levy vaakasuoraan vaakatasopöydälle.

Lisätään 10 μl TEMED:tä (4.1.3.1) valmistettuun ilmattomaan geeliliuokseen (4.1.2), sekoitetaan ja lisätään 10 μl PER-liuosta (4.1.3.2), sekoitetaan huolellisesti ja kaadetaan välittömästi tasaisesti peitearkin keskikohtaan. Asetetaan geelin kantajalevyn yksi reuna (arkkipuoli alaspäin) peitearkin päälle ja lasketaan sitä hitaasti niin, että geelikerros muodostuu arkkien väliin ja leviää tasaisesti ja ilman kuplien muodostumista (kuva 3). Lasketaan varovasti geelin kantajalevy kokonaan alas ohutta lastaa käyttäen ja asetetaan vielä kolme lasilevyä sen päälle painoksi. Kun polymeroituminen on tapahtunut (noin 60 min), poistetaan geelin kantaja-arkille polymeroitunut geeli yhdessä peitearkin kanssa lasilevyjä koputellen. Puhdistetaan kantaja-arkin kääntöpuolelta huolellisesti geelijäännökset ja urea. Saumataan geeli-sandwich kalvoon ja säilytetään jääkaapissa (enintään 6 viikkoa).

Huomautus: Välikkeellistä peitearkkia voidaan käyttää uudelleen. Polyakryyliamidigeeli voidaan leikata pienempiin osiin, mitä suositellaan, kun näytteitä on ainoastaan muutama tai jos käytetään automaattista elektroforeesilaitetta (2 geeliä, koko 4,5 × 5 cm).

6.3.   Isoelektrinen fokusointi

Säädetään jäähdyttävä termostaatti 12 °C:seen. Pyyhkäistään geelin kantaja-arkin kääntöpuoli petrolilla, tipautetaan sitten muutama pisara petrolia (4.2) jäähdytyslohkon keskelle. Sen jälkeen geeli-sandwich levitetään kantajapuoli alaspäin lohkon päälle siten, ettei muodostu kuplia. Pyyhkäistään ylimääräinen petroli pois ja poistetaan peitearkki. Imeytetään elektrodinauhoihin elektrodiliuoksia (4.3, 4.4), leikataan geelin pituisiksi ja asetetaan asianmukaisille paikoille (elektrodien etäisyys 9,5 cm).

Isoelektrisen fokusoinnin olosuhteet:

6.3.1   Geelikoko 265 × 125 × 0,25 mm

Vaihe	Aika (min)	Jännite (V)	Sähkövirta (mA)	Teho (W)	Volttituntia (Vh)
1. Esifokusointi	30	enintään 2 500	enintään 15	vak. 4	noin 300
2. Näytteen fokusointi (7)	60	enintään 2 500	enintään 15	vak. 4	noin 1 000
3. Lopullinen fokusointi	60	enintään 2 500	enintään 5	enintään 20	noin 3 000
	40	enintään 2 500	enintään 6	enintään 20	noin 3 000
	30	enintään 2 500	enintään 7	enintään 25	noin 3 000

Huomautus: Jos geelien paksuutta tai leveyttä muutetaan, sähkövirran ja tehon arvoja on säädettävä sopivasti (esim. sähkövirran ja tehon arvot on kaksinkertaistettava, jos käytetään 265 mm × 125 mm × 0,5 mm geeliä).

6.3.2   Esimerkki automaattisen elektroforeesilaitteen jänniteohjelmasta (2 kooltaan 5,0 × 4,5 cm geeliä); elektrodit asetetaan suoraan geeliin ilman liuskoja.

Vaihe	Jännite	Sähkövirta	Teho	Lämpötila	Volttituntia
1. Esifokusointi	1 000 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	85 Vh
2. Näytteen fokusointi	250 V	5,0 mA	2,5 W	8 °C	30 Vh
3. Fokusointi	1 200 V	10,0 mA	3,5 W	8 °C	80 Vh
4. Fokusointi	1 500 V	5,0 mA	7,0 W	8 °C	570 Vh

Asetetaan näyteapplikaattori vaiheessa 2, kun volttitunnit ovat 0 Vh.

Poistetaan näyteapplikaattori vaiheessa 2, kun volttitunnit ovat 30 Vh.

6.4   Proteiinien värjäys

6.4.1   Proteiinien kiinnitys

Poistetaan elektrodinauhat välittömästi voimanlähteen sammuttamisen jälkeen ja asetetaan geeli välittömästi värjäys/värinpoistoastiaan, joka on täytetty 200 ml:lla kiinnitysainetta (4.9); jätetään 15 minuutiksi, jatkuvasti ravistellen.

6.4.2   Geelilevyn pesu ja värjäys

Valutetaan kiinnitysaine huolellisesti pois ja pestään geelilevy kahdesti, 30 sekuntia kummallakin kerralla, 100 ml:lla värinpoistoliuosta (4.10). Kaadetaan värinpoistoliuos pois ja täytetään astia 250 ml:lla värjäysliuosta (4.11.3); annetaan värjäytyä 45 minuuttia kevyesti ravistellen.

6.4.3   Geelilevyn värinpoisto

Kaadetaan värjäysliuos pois, pestään geelilevy kahdesti käyttäen 100 ml värinpoistoliuosta (4.10) kummallakin kerralla, ravistellaan sitten 15 minuutin ajan 200 ml:ssa värinpoistoliuosta ja toistetaan värinpoistovaihe vähintään 2 tai 3 kertaa, kunnes tausta on kirkas ja väritön. Huuhdellaan geelilevy sen jälkeen tislatulla vedellä (2 × 2 min.) ja kuivataan ilmassa (2–3 tuntia) tai hiustenkuivaajalla (10–15 min.).

Huomautus 1: Kiinnitys, pesu, värjäys ja värinpoisto on tehtävä 20 °C:ssa. Korkeampia lämpötiloja ei saa käyttää.

Huomautus 2: Jos herkempää hopeavärjäystä (esim. Silver Staining Kit, Protein, Pharmacia Biotech, Code N:o 17–1150–01) pidetään parempana, plasmiinilla käsitellyt kaseiininäytteet on laimennettava 5 mg/ml:ksi.

7.   ARVIOINTI

Arviointi suoritetaan vertaamalla tuntemattoman näytteen proteiinikuviota vertailustandardeihin samassa geelissä. Lehmänmaidon toteaminen lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidosta sekä lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksesta valmistetuissa juustoissa tapahtuu sellaisten γ3- ja γ2-kaseiinien välityksellä, joiden isoelektriset pisteet vaihtelevat välillä pH 6,5–7,5 (kuvat 4 a ja 4 b, kuva 5). Toteamisraja on alle 0,5 %.

7.1   Silmämääräinen arviointi

Naudanmaidon määrän arvioimiseksi silmämääräisesti on suositeltavaa säätää näytteiden ja standardien pitoisuudet samantasoisten väri-intensiteettien saamiseksi lampaan, vuohen ja/tai puhvelin γ3- ja γ2-kaseiineille (ks. ”γ2 E,G,B” ja ”γ3 E,G,B” kuvissa 4 a, 4 b ja 5). Naudanmaidon määrä (vähemmän kuin, yhtä paljon kuin tai enemmän kuin 1 %) tuntemattomassa näytteessä voidaan todeta suoraan vertaamalla naudan γ3- ja γ2-kaseiinien isoelektrisessä fokusoinnissa saadun värin intensiteettiä (ks. ”γ3 C” ja ”γ2 C” kuvissa 4 a, 4 b ja 5) vastaaviin 0 %:n ja 1 %:n vertailustandardeihin (lammas, vuohi) tai laboratorion välistandardeihin (puhveli).

7.2   Tiheysmittaukseen perustuva arviointi

Jos mahdollista, käytetään tiheysmittaria (5.19) naudan γ3- ja γ2-kaseiinien piikkien pinta-alojen määrittämiseksi suhteessa lampaan, vuohen ja/tai puhvelin vastaaviin (ks. kuva 5). Tätä arvoa verrataan 1 %:n vertailustandardin (lammas, vuohi) tai laboratorion välistandardin (puhveli) γ3- ja γ2-kaseiinipiikkien pinta-alan suhteeseen, kun analysointi on suoritettu samassa geelissä.

Huomautus: Menetelmä toimii tyydyttävästi, jos 1 %:n vertailustandardissa esiintyy selvä positiivinen merkki sekä naudan γ3- että γ2-kaseiineista, muttei merkkejä 0 %:n vertailustandardeissa. Jos näin ei ole, menettelyä on parannettava noudattamalla täsmällisesti menetelmän yksityiskohtia.

Näyte todetaan positiiviseksi, jos naudan sekä γ3- että γ2-kaseiinien tai vastaavien piikkien pinta-alojen suhteet ovat yhtä suuret tai suuremmat kuin 1 %:n vertailustandardin taso.

8.   VIITTEET

Addeo F., Moio L., Chianese L., Stingo C., Resmini P., Berner I, Krause I., Di Luccia A., Bocca A.: Use of plasmin to increase the sensitivity of the detection of bovine milk in ovine and/or caprine cheese by gel isoelectric focusing of γ2-caseins. Milchwissenschaft 45, 708-711 (1990).

Addeo F., Nicolai M.A., Chianese L., Moio L., Spagna Musso S., Bocca A., Del Giovine L.: A control method to detect bovine milk in ewe and water buffalo cheese using immunoblotting. Milchwissenschaft 50, 83-85 (1995).

Krause I., Berner I, Klostermeyer H.: Sensitive detection of cow milk in ewe and goat milk and cheese by carrier ampholyte — and carrier ampholyte/immobilized pH gradient — isoelectric focusing of γ-caseins using plasmin as signal amplifier. in: Electrophoresis-Forum 89 (B. J. Radola, ed.) pp 389-393, Bode-Verlag, München (1989).

Krause Ι., Belitz H.-D., Kaiser K.-P.: Nachweis von Kuhmilch in Schaf and Ziegenmilch bzw. -käse durch isoelektrische Fokussierung in harnstoffhaltigen Polyacrylamidgelen. Z. Lebensm. Unters. Forsch. 174, 195-199 (1982).

Radola B.J.: Ultrathin-layer isoelectric focusing in 50-100 μm polyacrylamide gels on silanised glass plates or polyester films. Electrophoresis 1, 43-56 (1980).

Kuva 1

Kuva peitearkista

Kuva 2

Vesifaasin ja orgaanisen faasin välissä kelluva kaseiinikerros sentrifugoinnin jälkeen

Kuva 3

Sulkemistekniikka erittäin ohuiden polyakryyliamidigeelien valmistamiseksi

a = väliketeippi (0,25 mm); b = peitearkki (5.3); c, e = lasilevyt (5.1); d = geeliliuos (4.1.2); f = geelin kantaja-arkki (5.2)

Kuva 4 a

Lampaan- ja vuohenmaidosta valmistetun, eri määriä lehmänmaitoa sisältävän juuston plasmiinilla käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi

% CM = lehmänmaidon prosenttiosuus, C = lehmä, E = lammas, G = vuohi.

Kuvassa on esitetty IEF-geelin ylempi puolisko.

Kuva 4 b

Lampaan-, vuohen- ja puhvelinmaidon seoksista valmistetun, eri määriä lehmänmaitoa sisältävän juuston plasmiinilla käsiteltyjen kaseiinien isoelektrinen fokusointi

% CM = lehmänmaidon prosenttiosuus; 1 + = näyte, joka sisältää 1 % lehmänmaitoa ja johon on lisätty puhdasta naudan kaseiinia linjan keskellä. C = lehmä, E = lammas; G = vuohi, B = puhveli.

Kuvassa on esitetty IEF-geelin koko erotusetäisyys.

Kuvio 5

Standardin (STD) sekä lampaan- ja vuohenmaidon seoksesta valmistetun juuston näytteiden densitogrammit päällekkäin asetettuna isoelektrisen fokusoinnin jälkeen

a, b = standardit, jotka sisältävät 0 ja 1 % lehmänmaitoa; c–g = juustonäytteet, jotka sisältävät 0, 1, 2, 3 ja 7 % lehmänmaitoa. C = lehmä, E = lammas, G = vuohi.

Ylempi puolisko IEF-geelistä tutkittiin aallonpituudella λ = 634 nm.

LIITE IX

Analyysien arviointi

1.   Laadunvarmistus

Analyysit on tehtävä laboratorioissa, jotka on nimetty asetuksen (EY) N:o 882/2004 (**) 12 artiklan mukaisesti tai jotka jäsenvaltion toimivaltaiset viranomaiset ovat nimenneet.

2.   Näytteenotto ja analyysien tulosten kiistäminen

1.

Näytteenotto on tehtävä asianomaista tuotetta koskevien säännösten mukaisesti. Jos näytteenotosta ei ole säädetty nimenomaisesti, sovelletaan standardia ISO 707 Milk and milk products – Guidance on sampling (Maito ja maitovalmisteet – Näytteenottoa koskevia ohjeita).

2.

Analyysin tuloksista tehdyissä laboratorioraporteissa on oltava riittävästi tietoja, jotta tuloksia voidaan arvioida lisäyksen mukaisesti.

3.

Unionin lainsäädännössä säädettyjen analyysien tekemiseksi on otettava kaksoisnäytteitä.

4.

Jos tulokset kiistetään, maksajavirasto teettää kyseisestä tuotteesta tarvittavat testit uudelleen, ja häviävän osapuolen on maksettava tähän liittyvät kustannukset. Edellä mainittu analyysi tehdään, jos tuotteesta on saatavilla sinetöityjä rinnakkaisnäytteitä ja jos ne on asianmukaisesti varastoitu toimivaltaisten viranomaisten tiloihin. Valmistajan on lähetettävä maksajavirastolle analyysintekopyyntö seitsemän työpäivän kuluessa ensimmäisen analyysin tulosten tiedoksiantamisesta. Maksajaviraston on tehtävä analyysi 21 työpäivän kuluessa pyynnön vastaanottamisesta.

5.

Uusintatestin tulokset ovat lopulliset.

6.

Jos valmistaja voi viiden työpäivän kuluessa näytteenotosta todistaa, ettei näytteenottoa suoritettu asianmukaisesti, on mahdollisuuksien mukaan otettava uudet näytteet. Jos uusia näytteitä ei voida ottaa, erä on hyväksyttävä.

Lisäys

Arviointi siitä, onko erä lakisääteisten rajojen mukainen

1.   Periaate

Jos julkista interventiota ja yksityisen varastoinnin tukea koskevassa lainsäädännössä on vahvistettu yksityiskohtaiset näytteenottomenetelmät, niitä on noudatettava. Kaikissa muissa tapauksissa tarkastettavasta erästä on otettava satunnaisesti vähintään kolme näyteyksikköä. Voidaan valmistaa yhdistetty näyte. Tulosta verrataan lakisääteisiin rajoihin laskemalla 95 prosentin luottamusväli, joka on 2 kertaa standardipoikkeama, jossa standardipoikkeama riippuu joko siitä, 1) onko menetelmä validoitu kansainvälisessä yhteistyössä ja muuttujille σr ja σR on vahvistettu arvot, tai siitä, 2) onko laskettu laboratorion sisäinen uusittavuus, kun kyseessä on sisäinen validointimenettely. Luottamusväli osoittaa tuloksen mittausepävarmuuden.

2.   Menetelmä on validoitu kansainvälisessä yhteistyössä

Tällöin toistettavuuden standardipoikkeama σr ja uusittavuuden standardipoikkeama σR on vahvistettu ja laboratorio voi osoittaa noudattavansa validoitua menetelmää.

Lasketaan n kertaa toistetun mittauksen aritmeettinen keskiarvo .

Lasketaan :n laajennettu epävarmuus (k = 2) seuraavasti:

Jos lopullinen mittaustulos x = y 1 + y 2, x = y 1 – y 2, x = y 1 · y 2 tai x = y 1/y 2, tällaisissa tapauksissa on yleensä käytettävä noudatettavia tavanomaisia menetelmiä standardipoikkeamien yhdistämiseksi.

Erän katsotaan olevan lakisääteisen ylärajan UL vastainen, jos

;

muutoin sen katsotaan olevan ylärajan UL mukainen.

Erän katsotaan olevan lakisääteisen alarajan LL vastainen, jos

;

muutoin sen katsotaan olevan ylärajan LL mukainen.

3.   Sisäinen validointimenettely, johon liittyy uusittavuuden sisäisen standardipoikkeaman laskeminen

Jos käytetään muita kuin tässä asetuksessa esitettyjä menetelmiä, eikä ole vahvistettu tarkkuutta koskevia toimenpiteitä, on suoritettava sisäinen validointi. Laajennetun epävarmuuden U laskukaavassa on käytettävä standardipoikkeamien σr ja σ R sijasta sisäisen toistettavuuden standardipoikkeamaa sir ja sisäisen uusittavuuden standardipoikkeamaa si R.

Säännöt, joita on noudatettava lakisääteisen rajan noudattamisen määrittämiseksi, ovat 1 kohdassa esitetyt säännöt. Jos erän ei kuitenkaan katsota olevan lakisääteisen rajan mukainen, mittaukset on toistettava tässä asetuksessa esitetyin menetelmin ja tulos on arvioitava 1 kohdan mukaisesti.