1.1.1.1

ELISA-levyt pinnoitetaan karbonaatti/bikarbonaattipuskurissa (pH 9,6) laimennetulla AHRV-4:n rekombinantilla VP7:llä. Levyjä inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa.

1.1.1.2

Levyt pestään viidesti tislatulla vedellä, jossa on 0,01 % (v/v) Tween 20:tä (pesuliuos). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois.

1.1.1.3

Levyille annostellaan liuosta, jossa on fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), pH 7,2, ja 5 % (w/v) rasvatonta maitoa (kuivattu rasvaton maito Nestlé Dry Skim MilkTM), 200 μl/kuoppa, ja annetaan olla 1 tunti lämpötilassa 37 °C.

1.1.1.4

Estoliuos poistetaan, ja levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan pois.

1.1.2.1

Testattavat seeruminäytteet sekä positiiviset ja negatiiviset kontrolliseerumit laimennetaan suhteessa 1:25 liuoksella, jonka koostumus on PBS + 5 % (w/v) rasvatonta maitoa + 0,05 % (v/v) Tween 20:tä, ja pipetoidaan 100 μl kuoppaa kohti. Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

Titrausta varten tehdään kaksoislaimennosten sarja alkaen laimennussuhteesta 1:25 (100 μl/kuoppa), yksi seerumi levyriviä kohti, ja sama toistetaan positiivisten ja negatiivisten kontrollien kanssa. Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

1.1.2.2

Levyt pestään viidesti tislatulla vedellä, jossa on 0,01 % (v/v) Tween 20:tä (pesuliuos). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois.

1.1.3.1

Lsätään 100 μl/kuoppa piparjuuriperoksidaasi(HRP)-konjugoitua hevosen gammaglobuliinia vastaan tehtyä antiseerumia, joka on esilaimennettu (PBS + 5 % maito + 0,05 % Tween 20, pH 7,2). Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

1.1.3.2

Levyt pestään viiteen kertaan tislatulla vedellä, jossa on 0,01 % (v/v) Tween 20:tä (pesuliuos). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois.

1.1.4.1

Lisätään 200 μl/kuoppa kromogeeni-substraattiliuosta [10 ml 80,6 mM DMAB (dimetyyli-aminobentsaldehydi) + 10 ml 1,56 mM MBTH (3-metyyli-2-bentso-tiatsoliinihydratsonihydrokloridi) + 5 μl H2O2].

Värimuutos pysäytetään lisäämällä 50 μl 3 N H2SO4:ää noin 5–10 minuutin jälkeen (ennen kuin negatiivinen kontrolli alkaa värjäytyä).

Muita kromogeeneja, kuten ABTS (2,2′-atsino-bis-[3-etyylibentsotiatsoliini-6-sulfonihappo]), TMB (tetrametyylibentsidiini) tai OPD (ortofenyleenidiamiini), voidaan myös käyttää.

1.1.4.2

Levyt luetaan aallonpituudella 600 nm (tai 620 nm).

1.2.1

Raja-arvo lasketaan lisäämällä negatiivisen kontrollin arvoon 0,06. (0,06 on 30 negatiivisen seerumin ryhmällä saatu vakiopoikkeama.)

1.2.2

Raja-arvon alittavan absorbanssin antavia testinäytteitä pidetään negatiivisina.

1.2.3

Raja-arvon +0,15 ylittävän absorbanssin antavia testinäytteitä pidetään positiivisina.

1.2.4

Testinäytteitä, joiden absorbanssi on edellä mainittujen välillä, pidetään epävarmoina, ja jotain muuta menetelmää on käytettävä tuloksen vahvistamiseksi.

2.1.1.1

ELISA-levyt pinnoitetaan 50–100 ng:llä karbonaatti/bikarbonaattipuskurissa (pH 9,6) laimennettua AHRV-4:n rekombinanttia VP7:ää. Levyjä inkuboidaan yön yli 4 °C:ssa.

2.1.1.2

Levyt pestään kolmesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS 0,1 ×), jossa on 0,135 M NaCl:a ja 0,05 % (v/v) Tween-20:tä (PBST). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois.

2.1.2.1

Testattavat seeruminäytteet sekä positiiviset ja negatiiviset kontrolliseerumit laimennetaan suhteessa 1:5 laimenteella, joka sisältää 0,35 M NaCl:a, 0,05 % (v/v) Tween 20:tä ja 0,1 % Kathonia, siten, että lopputilavuus on 100 μl/kuoppa. Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

Titrausta varten valmistetaan testiseerumeista kaksoislaimennosten sarja (1:10–1:280) kahdeksaan kuoppaan (100 μl/kuoppa), yksi seerumi levyriviä kohti, ja sama toistetaan positiivisten ja negatiivisten kontrollien kanssa. Inkuboidaan 1 tunnin ajan 37 °C:ssa.

2.1.2.2

Levyt pestään viidesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS 0,1 ×), jossa on 0,135 M NaCl:a ja 0,05 % (v/v) Tween-20:tä (PBST). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois.

2.1.3.1

Lisätään piparjuuriperoksidaasikonjugoitua VP7:n monoklonaalista vasta-ainetta 100 μl/kuoppa. Tämä monoklonaalinen vasta-aine on edeltä käsin laimennettu suhteessa 1/5 000–1/15 000 liuoksessa, joka sisältää suhteessa 1:1 ainetta StabiliZyme Select® Stabilizer (SurModics. Reference: SZ03) ja tislattua vettä. Inkuboidaan 30 minuutin ajan 37 °C:ssa.

2.1.3.2

Levyt pestään viidesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS 0,1 ×), jossa on 0,135 M NaCl:a ja 0,05 % (v/v) Tween-20:tä (PBST). Levyjä taputetaan varovasti imukykyisen materiaalin päällä, jotta kaikki neste saadaan imeytettyä pois.

2.2.1

Kunkin näytteen estoprosentti (BP) määritetään käyttämällä seuraavaa kaavaa, jossa Abs tarkoittaa vasta-aineita:

2.2.2

Näytteitä, joiden estoprosentti on suurempi kuin 50, on pidettävä AHRV-vasta-ainepositiivisina.

2.2.3

Näytteitä, joiden estoprosentti on pienempi kuin 45, on pidettävä AHRV-vasta-ainenegatiivisina.

2.2.4

Näytteitä, joiden estoprosentti on 45–50, on pidettävä epävarmoina, ja ne on testattava uudestaan. Jos tulos on edelleen epävarma, kyseiset eläimet on testattava uudelleen uusilla näytteillä, jotka otetaan aikaisintaan kahden viikon kuluttua epävarmoiksi todettujen näytteiden ottamisesta.

—

nukleiinihappojen fenoli-kloroformiuutto

—

nukleiinihappojen absorbointi suodatinjärjestelmään

—

nukleiinihappojen absorbointi magneettihelmijärjestelmään.

1.1

Homogenoidaan 1 g kudosnäytettä 1 ml:ssä denaturointiliuosta (4 M guanidiinitiosyanaattia, 25 mM natriumsitraattia, 0,1 M 2-merkaptoetanolia, 0,5 % sarkosyyliä).

1.2

Sentrifugoinnin jälkeen supernatanttiin lisätään seuraavat: 1 μg hiiva-RNA:ta; 0,1 ml natriumasetaattia, 2 M, pH 4; 1 ml fenolia; 0,2 ml kloroformi-isoamyylialkoholiseosta (49/1).

1.3

Suspensiota ravistetaan voimakkaasti ja jäähdytetään jäissä 15 minuutin ajan.

1.4

Sentrifugoinnin jälkeen vesifaasissa oleva RNA uutetaan fenolilla, saostetaan etanolilla ja suspendoidaan uudelleen steriiliin veteen.

—

Etualuke

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

—

Taka-aluke

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

—

MGB-TaqMan-koetin

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1

Alukeliuos laimennetaan työskentelykonsentraatioon 8 μM (”8 μM:n aluketyöliuos”) ja koetin työskentelykonsentraatioon 50 μM (”50 μM:n koetintyöliuos”). Suunnitellaan testilevyn malli ja ladataan se reaaliaikaisen PCR-testauksen laiteohjelmistoon. Tätä mallia oppaana käyttäen lisätään 2,5 μl kutakin 8 μM:n aluketyöliuosta kuhunkin kuoppaan, joissa on RNA-näytteitä ja positiivisia ja/tai negatiivisia kontrolleja (alukkeen lopullinen konsentraatio on 1 μM 20 μl:ssa RT-PCR-seosta). Levy säilytetään jäissä.

2.1.2

Etu- ja taka-alukkeisiin sekoitetaan 2 μl eristettyä RNA:ta (testinäytteet ja positiivinen kontrolli) tai 2 μl RNase-vapaata vettä (negatiivinen kontrolli). Seos denaturoidaan kuumentamalla se lämpötilaan 95 °C viiden minuutin ajaksi, minkä jälkeen sitä jäähdytetään nopeasti jäissä vähintään viiden minuutin ajan.

2.1.3

Valmistajan ohjeiden mukaisesti valmistetaan testattavaa näytemäärää vastaava soveltuva määrä reaaliaikaisessa yksivaiheisessa RT-PCR-menettelyssä tarvittavaa mastermix-seosta. Lisätään 0,1 μl 50 μM:n koetintyöliuosta kuhunkin kuoppaan, joissa on RNA-näytteitä (koettimen lopullinen konsentraatio on 0,25 μM kussakin RNA-näytteitä sisältävässä kuopassa). Lisätään 13 μl reaaliaikaisen yksivaiheisen RT-PCR-menetelmän mastermix-seosta PCR-levyn kuhunkin kuoppaan, joissa on denaturoituja alukkeita ja RNA:ta.

2.1.4

Levy asetetaan reaaliaikalämpöblokkiin, joka on ohjelmoitu käänteiskopiointia ja cDNA-amplifikaatio/fluoresenssidetektiota varten. Amplifikaatio-olosuhteet ovat seuraavat: ensimmäinen käänteiskopiointivaihe lämpötilassa 48 °C 25 minuutin ajan, sitten 10 minuuttia lämpötilassa 95 °C (”kuumakäynnistys”) ja 40 kappaletta 15 sekunnin syklejä lämpötilassa 95 °C, 35 sekuntia lämpötilassa 55 °C ja 30 sekuntia lämpötilassa 72 °C (tai 40 sykliä 2 sekunnin ajan lämpötilassa 97 °C ja 30 sekunnin ajan lämpötilassa 55 °C, jos käytetään nopeat reaktiot sallivia reagentteja ja lämpöblokkia). Fluoresenssitiedot saadaan 55 °C:n vaiheen lopussa.

2.1.5

Jos saadaan epätyypilliset amplifikaatiokäyrät, määritys katsotaan pätemättömäksi, ja se on uusittava.

Näyte katsotaan positiiviseksi, jos Ct-arvo (syklimäärä, jolla reaktiossa tuotettu fluoresenssi ylittää fluoresenssikynnyksen) on pienempi tai yhtä suuri kuin määritelty Ct-kynnys (35) 40 PCR-syklin aikana (Ct ≤ 35).

Näyte katsotaan epävarmaksi, jos Ct-arvo on suurempi kuin määritelty Ct-kynnys (35) 40 PCR-syklin aikana (Ct ≥ 35).

Näyte katsotaan negatiiviseksi, jos saadaan horisontaalinen amplifikaatiokäyrä, joka ei ylitä kynnyslinjaa 40 PCR-syklin aikana.

—

Etualuke

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

—

Taka-aluke

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

—

MGB-TaqMan-koetin

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1

Valmistetaan aluke- ja koetinseosten perusliuokset 25 × -konsentraatiolla (etu- ja taka-alukkeet 5 μΜ ja koetin 3 μΜ). Suunnitellaan testilevyn malli ja ladataan se reaaliaikaisen PCR-testauksen laiteohjelmistoon. Tätä mallia oppaana käyttäen lisätään levyn asianmukaisiin kuoppiin mallin mukaisesti 5 μl RNA-näytteitä, mukaan luettuina testinäytteet sekä positiiviset ja negatiiviset kontrollit.

2.2.2

RNA denaturoidaan kuumentamalla se lämpötilaan 95 °C viiden minuutin ajaksi, minkä jälkeen sitä jäähdytetään nopeasti jäissä vähintään kolmen minuutin ajan.

2.2.3

Valmistajan ohjeiden mukaisesti valmistetaan testattavaa näytemäärää vastaava soveltuva määrä reaaliaikaisessa yksivaiheisessa RT-PCR-menettelyssä tarvittavaa mastermix-seosta. Mastermix-seokseen lisätään 1 μl aluke-koetinseoksen 25 ×-perusliuosta (2.2.1 kohdasta), jolloin kunkin kuopan lopulliseksi konsentraatioksi saadaan kunkin alukkeen osalta 200 nM ja koettimen osalta 120 nM. Lisätään 20 μl mastermix-seosta PCR-levyn kuhunkin kuoppaan, joissa on denaturoitua RNA:ta.

2.2.4

Levy asetetaan reaaliaikalämpöblokkiin, joka on ohjelmoitu käänteiskopiointia ja cDNA-amplifikaatio/fluoresenssidetektiota varten valmistajan ohjeiden mukaisesti. Amplifikaatio-olosuhteet voivat olla esimerkiksi seuraavat: ensimmäinen käänteiskopiointivaihe lämpötilassa 48 °C 10 minuutin ajan, sitten 10 minuuttia lämpötilassa 95 °C ja 40 15 sekunnin sykliä lämpötilassa 95 °C ja 45 sekuntia lämpötilassa 60 °C.

2.2.5

Näytteiden katsotaan olevan positiivisia, jos AHRV:n RT-PCR-määrityksen normalisoitu fluoresenssi ylittää kynnyksen 0,1 kaikissa rinnakkaisnäytteissä 36 PCR-syklin aikana.

Näytteiden katsotaan olevan epävarmoja, jos AHRV:n RT-PCR-määrityksen normalisoitu fluoresenssi ylittää kynnyksen 0,1 jossakin rinnakkaisnäytteessä PCR-syklien 36 ja 40 välillä.

Näytteiden katsotaan olevan negatiivisia, jos AHRV:n RT-PCR-määrityksen normalisoitu fluoresenssi ei ylittänyt kynnystä 0,1 missään rinnakkaisnäytteessä 40 PCR-syklin aikana ja jos synteettisen ulkoisen kontrollimäärityksen normalisoitu fluoresenssi ylitti kynnyksen 0,1 33 PCR-syklin aikana.”