1.

Naudan sarveiskalvon sameuteen ja läpäisevyyteen perustuva testimenetelmä (Bovine Corneal Opacity and Permeability, BCOP) on in vitro -testimenetelmä, jota voidaan tietyissä olosuhteissa ja tietyin rajoituksin käyttää aineiden ja seosten luokittelemiseksi silmää syövyttäviksi ja silmää vakavasti ärsyttäviksi (1) (2) (3). Tätä testimenetelmää sovellettaessa määritellään vakavasti ärsyttävät aineet sellaisiksi, jotka aiheuttavat silmävaurioita, jotka kestävät kanissa vähintään 21 vuorokautta annostelun jälkeen. Vaikka BCOP-testin ei katsota täysin korvaavan in vivo -kaninsilmätestiä, sen käyttöä suositellaan vaiheittaisessa testauksessa sääntömääräistä luokitusta ja merkintöjen määräämistä varten tietyllä sovellusalalla (4) (5). Testiaineet ja seokset (6) voidaan luokitella silmää syövyttäviksi tai silmää vakavasti ärsyttäviksi ilman kaneilla tehtävää lisätestausta. Aine, jolle saadaan testissä negatiivinen tulos, olisi testattava kaneissa käyttäen vaiheittaista testausstrategiaa, kuten OECD:n ohjeessa Test Guideline 405 (7) (tämän liitteen B. 5 luku) esitetään.

2.

Tässä testimenetelmässä kuvataan menettelyt, joilla arvioidaan testiaineen mahdollinen kyky syövyttää tai ärsyttää vakavasti silmää mittaamalla kykyä aiheuttaa sameutta ja läpäisevyyden lisääntymistä eristetyssä naudan sarveiskalvossa. Myrkylliset vaikutukset sarveiskalvoon mitataan seuraavilla menetelmillä: i) valon läpikulun (transmission) vähentyminen (sameus) ja ii) natriumfluoreseiini-väriaineen lisääntynyt siirtyminen silmään (läpäisevyys). Testiaineelle altistuksen jälkeen tehhtyjä sarveiskalvon sameus- ja läpäisevyysarviointeja tarkastellaan yhdessä siten, että voidaan johtaa in vitro -ärsyttävyysarvo (In Vitro Irritancy Score, IVIS), jonka avulla luokitellaan testiaineen ärsyttävyystaso.

3.

BCOP-menetelmällä on testattu myös silmää ärsyttäviä aineita, jotka aiheuttavat alle 21 päivässä palautuvia vaurioita ja aineita, jotka eivät ärsytä silmää. BCOP-menetelmän tarkkuutta ja luotettavuutta näihin kategorioihin kuuluvien aineiden testauksessa ei ole kuitenkaan validoitu virallisesti.

4.

Määritelmät esitetään lisäyksessä 1.

5.

Tämä testimenetelmä perustuu ICCVAMin (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, vaihtoehtoisten menetelmien validoinnin virastojenvälinen koordinointikomitea) BCOP-testimenetelmäprotokollaan (8), joka kehitettiin kansainvälisen validointitutkimuksen perusteella (4)(5)(9). Siihen ovat osallistuneet vaihtoehtoisten menetelmien eurooppalainen validointikeskus ECVAM ja Japanin vastaava keskus (JaCVAM). Protokolla perustuu tietoihin, jotka on saatu In vitro -tieteiden instituutista (IIVS) ja INVITTOX-protokollasta 124 (10), joka edustaa protokollaa, jota käytettiin Euroopan yhteisön tukemassa vuosina 1997–1998 tehdyssä BCOP-testin esivalidointitutkimuksessa. Molemmat protokollat perustuvat BCOP-määritysmenetelmään, jonka raportoivat ensimmäisenä Gautheron et al. (11).

6.

Tämän testimenetelmän haittoja ovat validointitietokannassa havaitut alkoholeille ja ketoneille saatujen väärien positiivisten tulosten suuri määrä ja kiinteille aineille saatujen väärien negatiivisten tulosten suuri määrä (ks. kohta 44) (5). Kun tietokannasta poistetaan näihin kemiallisiin ja fysikaalisiin luokkiin kuuluvat aineet, parantuu BCOP-menetelmän tarkkuus EU:n, EPAn ja GHS:n luokitusjärjestelmissä huomattavasti (5). Koska tämän testin tarkoituksena on ainoastaan tunnistaa silmiä syövyttävät ja/tai silmiä vakavasti ärsyttävät aineet, väärät negatiiviset tulokset eivät haittaa, koska tällaiset aineet testattaisiin myöhemmin kaneilla tai muilla asianmukaisesti validoiduilla in vitro -testeillä sääntömääräisistä vaatimuksista riippuen käyttäen vaiheittaista testausstrategiaa ja todistusnäytön arviointia. Nykyisen validointitietokannan avulla ei myöskään voida arvioida asianmukaisesti tiettyjä kemikaali- tai tuoteluokkia (esimerkiksi seoksia). Tutkijat voisivat kuitenkin harkita tätä testimenetelmää kaikentyyppisille testimateriaaleille, myös seoksille, jolloin positiivisen tuloksen voitaisiin katsoa viittaavan silmän syövytykseen tai vakavaan ärsytykseen. Alkoholeilla ja ketoneilla saatuihin positiivisiin tuloksiin olisi kuitenkin suhtauduttava varovaisesti.

7.

Kaikissa naudan silmiä ja sarveiskalvoja käyttävissä menettelyissä olisi noudatettava testauslaitoksen määräämiä eläinperäisten materiaalien (muun muassa muttei ainoastaan kudosten ja kudosnesteiden) käsittelyä koskevia sääntöjä. Suositellaan yleismaailmallisia laboratorioissa noudatettavia ennaltavarautumiskäytänteitä (12).

8.

Eräs tämän testimenetelmän rajoitus on se, että vaikka siinä otetaan huomioon joitakin kanin silmä-ärsytystestissä arvioituja silmävaikutuksia ja jossain määrin niiden vakavuus, siinä ei tarkastella sidekalvon ja värikalvon vaurioita. Kaninsilmätutkimusten perusteella on myös ehdotettu, että vaikka BCOP-testissä ei sinänsä voida arvioida sarveiskalvovaurioiden palautuvuutta, voidaan kuitenkin arvioida sarveiskalvovaurion alkusyvyys ja sen avulla erottaa palautuvat ja palautumattomat vaikutukset (13). BCOP-menetelmällä ei voida myöskään arvioida sitä, missä määrin silmäaltistukseen voi liittyä systeemistä myrkyllisyyttä.

9.

Tutkimuksissa pyritään selvittämään lisää BCOP-määrityksen käyttökelpoisuutta ja rajoituksia ei-vakavien ärsyttävien aineiden ja ei-ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi (ks. myös kohta 45). Käyttäjiä rohkaistaan antamaan näytteitä ja/tai tuloksia validointijärjestöille, jotta BCOP-testimenetelmän mahdollisia tulevia käyttötapoja, kuten ei-vakavien ärsyttävien aineiden ja ei-ärsyttävien aineiden tunnistusta, voidaan arvioida virallisesti.

10.

Kun laboratorio alkaa käyttää tätä määritysmenetelmää, sen olisi käytettävä lisäyksessä 2 mainittuja pätevyyden osoittamiseen tarkoitettuja kemikaaleja. Laboratorio voi käyttää näitä kemikaaleja osoittaakseen teknisen pätevyytensä BCOP-testin suorituksessa ennen kuin se toimittaa BCOP-määritystuloksia sääntömääräistä vaaraluokitusta varten.

11.

BCOP-testimenetelmä on elinmalli, joka mahdollistaa naudan sarveiskalvon tavanomaisten fysiologisten ja biokemiallisten toimintojen lyhytaikaisen ylläpitämisen in vitro -oloissa. Testiaineen aiheuttamaa vauriota arvioidaan tässä menetelmässä mittaamalla muutokset sarveiskalvon sameudessa ns. opasitometrillä ja muutokset läpäisevyydessä näkyvää valoa mittaavalla spektrofotometrillä. Molempia mittauksia käytetään IVIS-arvon laskemiseen. IVIS-arvon avulla osoitetaan aineelle in vitro -ärsyttävyyteen perustuva vaaraluokituskategoria, jotta voidaan ennustaa testiaineen in vivo -silmä-ärsytyskyky (ks. päätöskriteerit).

12.

BCOP-testimenetelmässä käytetään vasta teurastetuista naudoista saaduista silmistä eristettyjä sarveiskalvoja. Sarveiskalvon sameus mitataan sinä valomääränä, joka kulkee sarveiskalvon läpi. Läpäisevyys mitataan sinä määränä natriumfluoreseiini-väriainetta, joka imeytyy koko sarveiskalvon läpi ja joka mitataan takakammiossa olevassa mediumissa (väliaineessa). Testiaineet annostellaan sarveiskalvon epiteelipinnalle lisäämällä sitä sarveiskalvotelineen etukammioon. Lisäyksessä 3 on kuvaus ja kaavio BCOP-testissä käytetystä sarveiskalvotelineestä. Sarveiskalvotelineitä saa kaupallisesti eri lähteistä, tai ne voi rakentaa itse.

13.

Teurastamoihin tuodut nautaeläimet teurastetaan useimmiten käytettäväksi ihmisravinnoksi tai muihin kaupallisiin tarkoituksiin. BCOP-testiin voidaan käyttää vain sarveiskalvoja, jotka on saatu terveistä, ihmisravinnoksi kelpaavista eläimistä. Koska nautaeläinten paino vaihtelee paljon riippuen rodusta, iästä ja sukupuolesta, ei anneta mitään suositusta siitä, minkä painoisia eläinten olisi oltava teurastushetkellä.

14.

Sarveiskalvojen mitat voivat vaihdella käytettäessä eri ikäisistä eläimistä saatuja silmiä. Yli kahdeksan vuoden ikäisistä eläimistä saatujen sarveiskalvojen halkaisija vaakasuunnassa on yleensä > 30,5 mm ja sarveiskalvon keskiosan paksuus (CCT) ≥ 1 100 μm, kun taas alle viiden vuoden ikäisten sarveiskalvon halkaisija on < 28,5 mm ja CCT < 900 μm. Tästä syystä ei yleensä käytetä silmiä, jotka on saatu yli 60 kuukauden ikäisistä eläimistä. Perinteisesti ei ole käytetty alle 12 kuukauden ikäisten nautojen silmiä, koska silmien kehitys on vielä kesken ja sarveiskalvo on huomattavasti ohuempi ja sen halkaisija pienempi kuin täysikasvuisten eläinten sarveiskalvon. Nuorista eläimistä (eli 6–12 kuukautta vanhoista) saatuja sarveiskalvoja voidaan käyttää, koska siihen liittyy joitakin etuja. Niitä saa helpommin, ikävaihtelu on pienempi, ja vaara työntekijöiden altistumisesta naudan spongiformiselle enkefalopatialle on pienempi (15). Koska olisi hyödyllistä arvioida lisää sarveiskalvon koon tai paksuuden vaikutusta sarveiskalvon reagoimiseen syövyttäviin ja ärsyttäviin aineisiin, käyttäjiä kehotetaan raportoimaan niiden eläinten arvioitu ikä ja/tai paino, joista tutkimuksessa käytetyt sarveiskalvot on saatu.

15.

Teurastamon henkilökunta kerää silmät. Jotta silmille aiheutuisi mahdollisimman vähän mekaanista tai muuta vahinkoa, olisi silmämuna poistettava mahdollisimman pian kuoleman jälkeen. Jotta silmät eivät altistuisi mahdollisesti ärsyttäville aineille, teurastamon työntekijät eivät saisi käyttää detergenttejä huuhtoessaan eläimen päätä.

16.

Silmät olisi upotettava kokonaan Hanksin suolaliuokseen (Hanks’ Balanced Salt Solution, HBSS) sopivankokoisessa astiassa ja kuljetettava laboratorioon sellaisella tavalla, että bakteerikontaminaatio tai muut vauriot ovat mahdollisimman pieniä. Koska silmät kerätään teurastuksen yhteydessä, niihin saattaa roiskua verta ja muita biologisia aineita, kuten bakteereja ja muita pieneliöitä. Siksi on tärkeää varmistaa, että kontaminaatioriski on mahdollisimman pieni. Esimerkiksi astia, jossa silmät ovat, on pidettävä jäähauteessa, ja kuljetusta varten käytettävään HBSS:ään on lisättävä antibiootteja (esim. penisilliiniä 100 IU/ml ja streptomysiiniä 100 μg/mL]).

17.

Silmien keräämisen ja BCOP-testin tekemisen välisen ajan pitäisi olla mahdollisimman lyhyt (keräys ja käyttö mieluiten samana päivänä), ja pitäisi osoittaa, etteivät määritystulokset ole sen takia epäluotettavia. Nämä tulokset perustuvat silmien valintaperusteisiin sekä positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden vasteisiin. Kaikkien määrityksessä käytettyjen silmien olisi oltava peräisin samasta tiettynä päivänä kerätystä silmäryhmästä.

18.

Heti kun silmät saapuvat laboratorioon, tutkitaan huolellisesti, onko niissä vikoja, kuten lisääntynyttä sameutta, naarmuja ja verisuonittumista. Testissä saa käyttää vain sellaisista silmistä saatuja sarveiskalvoja, joissa ei ole tällaisia vikoja.

19.

Kaikkien sarveiskalvojen laatua arvioidaan myös määrityksen myöhemmissä vaiheissa. Sarveiskalvot, joiden sameusaste yhden tunnin tasapainottumisajan jälkeen on suurempi kuin seitsemän sameusyksikköä (HUOM. opasitometri pitäisi kalibroida sameusyksikköjen vahvistamiseen käytetyillä sameusstandardeilla, ks. lisäys 3), hylätään.

20.

Kussakin käsittelyryhmässä (testiaine, samaan aikaan tehtävät negatiiviset ja positiiviset kontrollit) on oltava vähintään kolme silmää. BCOP-määrityksessä pitäisi negatiiviseen kontrolliin käyttää kolme sarveiskalvoa. Koska kaikki sarveiskalvot leikataan kokonaisesta silmämunasta ja asetetaan sarveiskalvokammioihin, voi käsittelystä aiheutua vahinkoa, joka vaikuttaa yksittäisen sarveiskalvon sameuteen ja läpäisevyyteen (myös negatiivisessa kontrollissa). Negatiivisista kontrollisarveiskalvoista saatuja sameus- ja läpäisevyysarvoja käytetään lisäksi IVIS-laskelmissa korjaamaan testituotteella ja positiivisella kontrollilla käsiteltyjen sarveiskalvojen sameus- ja läpäisevyysarvoja.

21.

Virheettömät sarveiskalvot leikataan siten, että niihin jää 2–3 mm:n reuna kovakalvoa, mikä helpottaa myöhempää käsittelyä. Varotaan vahingoittamasta sarveiskalvon epiteeliä ja endoteeliä. Eristetyt sarveiskalvot asetetaan erikoistelineisiin, joissa on etu- ja takaosasto. Nämä ovat kosketuksissa sarveiskalvon epiteelipuoleen (etukammio) ja endoteelipuoleen (takakammio). Molemmat kammiot täytetään ylimäärin esilämmitetyllä Eaglen Minimum Essential Medium (EMEM) -viljelynesteellä (mediumilla) (takakammio ensin) ja varmistetaan, ettei muodostu kuplia. Laitteen annetaan tasapainottua 32 ± 1 celsiusasteessa vähintään tunnin, jotta sarveiskalvot tasapainottuvat mediumin kanssa ja niiden metabolinen toiminta palautuu normaaliksi (mikäli mahdollista). Sarveiskalvon pinnan lämpötila in vivo on noin 32°C.

22.

Tasapainottumisjakson jälkeen molempiin kammioihin lisätään tuoretta esilämmitettyä EMEM:iä, ja kustakin sarveiskalvosta otetaan sameuden perustasolukema. Kaikki sarveiskalvot, joissa esiintyy makroskooppisia kudosvaurioita (esimerkiksi naarmuja, värihäiriöitä, verisuonittumista) tai joiden sameus ylittää 7 sameusyksikköä, hylätään. Kaikille tasapainotetuille sarveiskalvoille lasketaan sameuden keskiarvo. Negatiivisiksi kontrollisarveiskalvoiksi (liuotinkontrolli) valitaan vähintään kolme sarveiskalvoa, joiden sameusarvot ovat lähellä kaikkien sarveiskalvojen mediaania. Muut sarveiskalvot jaetaan käsittelyryhmään ja positiivisen kontrollin ryhmään.

23.

Koska veden lämpökapasiteetti on suurempi kuin ilman, vedellä saadaan tasaisempi inkubaatiolämpötila. Siksi suositellaan vesihauteen käyttöä sarveiskalvotelineen ja sen sisällön pitämiseksi 32 ± 1 celsiusasteessa. Kuitenkin myös ilmainkubaattoreita voidaan käyttää, kunhan huolehditaan siihen, että lämpötila pysyy vakaana (esimerkiksi esilämmittämällä telineet ja mediumit).

24.

Käsittelyä varten on kaksi eri protokollaa, toinen nesteille ja pinta-aktiivisille aineille (kiinteät tai nestemäiset) ja toinen kiinteille aineille, jotka eivät ole pinta-aktiivisia.

25.

Nesteet testataan laimentamattomina. Pinta-aktiiviset aineet testataan 10-prosenttisen liuoksena (w/v) 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa, tislatussa vedessä tai muussa liuottimessa, josta on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestelmää. Puoliksi kiinteät aineet, voiteet ja vahat testataan tavallisesti kuten nesteet. Jos laimennuksia muutetaan, on ne perusteltava. Sarveiskalvot altistetaan nesteille ja pinta-aktiivisille aineille 10 minuutin ajan. Jos altistusaikaa muutetaan, olisi se perusteltava tieteellisesti.

26.

Kiinteät aineet, jotka eivät ole pinta-aktiivisia, testataan tavallisesti 20-prosenttisena liuoksena tai suspensiona 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa, tislatussa vedessä tai muussa liuottimessa, josta on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestelmää. Joissakin olosuhteissa ja asianmukaisesti tieteellisesti perusteltuna kiinteitä aineita voidaan testata myös sellaisenaan annostelemalla niitä suoraan sarveiskalvon pinnalle avoimen kammion menetelmässä (ks. kohta 29). Sarveiskalvot altistetaan kiinteille aineille neljän tunnin ajan. Kuten nesteiden ja pinta-aktiivisten aineiden tapauksessa, altistusajan muuttaminen on perusteltava tieteellisesti.

27.

Käsittely voi olla erilaista riippuen testattavan aineen fysikaalisista ja kemiallisista ominaisuuksista, esimerkiksi siitä, onko kyseessä kiinteä aine, neste, viskoosi tai ei-viskoosi neste. Tärkeintä on varmistaa, että testiaine peittää riittävästi epiteelin pinnan ja että se voidaan huuhtelemalla poistaa riittävästi. Suljetun kammion menetelmää käytetään tavallisesti testattaville nesteille, jotka vaihtelevat ei-viskoosista lievästi viskoosiin, kun taas avoimen kammion menetelmää käytetään tavallisesti puoliksi viskooseille ja viskooseille nesteille ja kiinteille aineille.

28.

Suljetun kammion menetelmässä annostellaan etukammioon niin paljon testiainetta (750 μl), että se peittää sarveiskalvon epiteelipuolen. Annostelu tapahtuu kammion yläosassa olevien aukkojen kautta. Aukot suljetaan sitten tulpilla altistuksen ajaksi. On tärkeää varmistaa, että kukin sarveiskalvo altistetaan testiaineelle niin pitkäksi aikaa kuin on asianmukaista.

29.

Avoimen kammion menetelmässä ikkunan lukitusrengas ja etukammion lasi-ikkuna poistetaan ennen käsittelyä. Kontrollia tai testiainetta (750 μl tai niin paljon, että testiaine peittää sarveiskalvon kokonaan) annostellaan suoraan sarveiskalvon epiteelipinnalle mikropipetillä. Jos testiainetta on vaikea pipetoida, se voidaan siirtää paineen avulla ns. positive displacement -pipetointilaitteeseen annostelun helpottamiseksi. Positive displacement -pipetin kärki työnnetään ruiskun annostelukärkeen niin, että aine voidaan siirtää displacement-pipetin kärkeen paineen avulla. Ruiskun mäntää painetaan samalla kun pipetin mäntää vedetään ylöspäin. Jos pipetin kärkeen ilmestyy ilmakuplia, testiaine puhalletaan ulos ja prosessi toistetaan, kunnes kärki saadaan täytettyä ilman ilmakuplia. Jos on tarpeen, voidaan käyttää tavallista ruiskua (ilman neulaa), koska sillä voidaan mitata tarkka tilavuus testiainetta, ja annostelu sarveiskalvon epiteelipinnalle on helpompaa. Annostelun jälkeen lasi-ikkuna pannaan paikalleen etukammion päälle, jotta järjestelmä on jälleen suljettu.

30.

Altistusajan jälkeen testiaine, negatiivinen kontrolliaine tai positiivinen kontrolliaine poistetaan etukammiosta ja epiteeli pestään vähintään kolmesti (tai kunnes testiainetta ei näy) EMEM:illä (jossa on fenolipunaa). Huuhteluun käytetään fenolipunaa sisältävää mediumia, koska fenolipunan värin vaihtumista voidaan seurata, kun halutaan määrittää happamien tai emäksisten aineiden huuhtelun tehokkuus. Sarveiskalvoja pestään enemmän kuin kolme kertaa, jos fenolipuna on edelleen vääränvärinen (keltainen tai purppuranvärinen) tai jos testiainetta on vielä näkyvillä. Kun mediumissa ei ole enää testiainetta, sarveiskalvot pestään vielä kerran EMEM:illä (jossa ei ole fenolipunaa). EMEM-huuhtelua (ilman fenolipunaa) käytetään viimeiseksi sen varmistamiseksi, että fenolipuna on poistunut etukammiosta ennen sameusmittausta. Etukammio täytetään sitten uudelleen tuoreella EMEM:illä (ilman fenolipunaa).

31.

Kun testiaine on neste tai pinta-aktiivinen aine, sarveiskalvoja inkuboidaan huuhtelun jälkeen vielä kaksi tuntia 32 ± 1 celsiusasteessa. Tietyissä olosuhteissa voi pitempi aika altistuksen jälkeen olla hyödyksi. Sitä voidaan harkita tapauskohtaisesti. Kiinteillä aineilla käsitellyt sarveiskalvot huuhdellaan perusteellisesti neljän tunnin altistuksen päätteeksi, mutta niitä ei tarvitse enää inkuboida enempää.

32.

Kunkin sarveiskalvon sameus ja läpäisevyys kirjataan nesteille ja pinta-aktiivisille aineille altistuksen jälkeisen inkubaation jälkeen ja kiinteille aineille, jotka eivät ole pinta-aktiivisia aineita, neljän tunnin altistuksen jälkeen. Kutakin sarveiskalvoa tarkastellaan myös silmämääräisesti ja kirjataan merkitykselliset havainnot (esimerkiksi kudoksen kuoriutuminen, testiaineen jäämät, epätasainen sameusjakauma). Tällaiset havainnot voivat olla tärkeitä, sillä ne voivat näkyä opasitometrin lukemien vaihteluna.

33.

Kussakin kokeessa on mukana samanaikaisesti määritettävät negatiiviset eli liuotin/vehikkelikontrollit ja positiiviset kontrollit.

34.

Kun testataan 100-prosenttista nestemäistä ainetta, otetaan BCOP-määritykseen samanaikaisesti määritettävä negatiivinen kontrolli (esimerkiksi 0,9-prosenttinen natriumkloridiliuos tai tislattu vesi) sitä varten, että epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä voidaan havaita ja määrityksen päätepisteille saadaan perustaso. Näin varmistetaan myös, etteivät määritysolosuhteet aiheuta ärsytysvastetta tahattomasti.

35.

Kun testataan laimennettua nestettä, pinta-aktiivista ainetta tai kiinteää ainetta, otetaan BCOP-määritykseen samanaikaisesti määritettävä liuotin/vehikkelikontrolliryhmä sitä varten, että epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä voidaan havaita ja määrityksen päätepisteille saadaan perustaso. Liuotinta/vehikkeliä saa käyttää vain, jos on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestelmää.

36.

Kuhunkin kokeeseen otetaan mukaan tunnettu silmiä ärsyttävä aine positiivisena kontrollina, jotta voidaan varmistaa, että saadaan asianmukainen vaste. Koska BCOP-määritystä käytetään tässä testimenetelmässä syövyttävien tai vakavasti ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi, positiivisen kontrollin olisi mielellään oltava aine, joka aiheuttaa vakavan vasteen tässä testimenetelmässä. Ärsytysvaste ei kuitenkaan saisi olla liian voimakas, jotta positiivisen kontrollivasteen vaihtelu ajan funktiona voidaan määrittää.

37.

Nestemäisille testiaineille voidaan positiivisena kontrollina käyttää esimerkiksi dimetyyliformamidia tai 1-prosenttista natriumhydroksidia. Kiinteiden testiaineiden positiivisena kontrollina voidaan käyttää esimerkiksi 20-prosenttista (w/v) imidatsolia 0,9-prosenttisessa natriumkloridiliuoksessa.

38.

Vertailuaineet ovat hyödyllisiä, kun arvioidaan tiettyyn kemikaali- tai tuoteryhmään kuuluvien tuntemattomien kemikaalien silmä-ärsytyskykyä tai silmää ärsyttävän aineen suhteellista ärsytyskykyä tietyllä ärsytysvastealueella.

39.

Sarveiskalvon sameus mitataan sinä valomääränä, joka kulkee sarveiskalvon läpi. Sarveiskalvon sameus mitataan kvantitatiivisesti opasitometrillä, jolla saadaan jatkuvalla asteikolla mitattuja sameusarvoja.

40.

Läpäisevyys mitataan sinä määränä natriumfluoreseiini-väriainetta, joka imeytyy kaikkien sarveiskalvon solukerrosten (ts. sarveiskalvon ulkopinnan epiteelin ja sisäpinnan endoteelin) läpi. 1 ml natriumfluoreseiiniliuosta (4 mg/ml testattaessa nesteitä tai pinta-aktiivisia aineita tai 5 mg/ml testattaessa kiinteitä aineita, jotka eivät ole pinta-aktiivisia) lisätään sarveiskalvotelineen etukammioon, joka on kosketuksissa sarveiskalvon epiteelipuolen kanssa. Takakammiossa, joka on kosketuksissa sarveiskalvon endoteelipuolen kanssa, on tuoretta EMEM:iä. Telinettä inkuboidaan vaakasuorassa 90 ± 5 min 32 ± 1 celsiusasteessa. Takakammioon siirtyvän natriumfluoreseiinin määrä mitataan UV/VIS-spektrofotometrillä. 490 nanometrin aallonpituudella mitatut spektrofotometrin lukemat kirjataan optisena tiheytenä (OD490) tai absorbanssiarvoina, jotka mitataan jatkuvalla asteikolla. Fluoreseiiniläpäisevyysarvot määritetään käyttäen OD490 -arvoja, jotka on mitattu spektrofotometrillä tavanomaisella 1 senttimetrin valotiellä.

41.

Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää 96 kuopan kuoppalevyjen lukulaitetta, jos i) laitteen fluoreseiinin OD490 -arvojen mittausalue on lineaarinen; ja ii) 96 kuopan levyissä käytetään sellaista fluoreseiininäytteiden tilavuutta, jolla saadaan 1 cm:n valotiellä saatuja arvoja vastaavat OD490 -arvot (tämä saattaa edellyttää, että kuoppa täytetään kokonaan [tavallisesti 360ml]).

42.

Kun sameusarvot ja keskimääräiset läpäisevyysarvot (OD490) on korjattu taustan sameuden ja negatiivisen kontrollin läpäisevyyden OD490 -arvojen suhteen, yhdistetään kunkin käsittelyryhmän sameuden keskiarvot ja läpäisevyyden keskimääräiset OD490 -arvot kokemusperäiseen kaavaan, josta lasketaan kullekin käsittelyryhmälle in vitro -ärsytysaste (IVIS) seuraavasti:

IVIS = sameuden keskiarvo + (15 × keskimääräinen läpäisevyyden OD490 -arvo)

Sina et al. (16) ovat raportoineet, että tämä kaava on johdettu heidän laboratoriossaan ja laboratorioidenvälisissä tutkimuksissa. Monilaboratoriotutkimuksessa 36 yhdisteen sarjalle saaduille tuloksille tehtiin monimuuttuja-analyysi, jossa määritettiin paras yhtälö in vivo ja in vitro saatujen tuloksien välille. Kahden yhtiön tutkijat tekivät tämän analyysin. He johtivat lähes identtiset yhtälöt.

43.

Sameus- ja läpäisevyysarvoja olisi arvioitava myös erikseen, jotta nähdään, aiheuttaako testiaine syövytystä tai vakavaa ärsytystä vain yhden päätepisteen määrityksessä (ks. päätöskriteerit).

44.

Aine, jonka aiheuttama IVIS on vähintään 55.1, määritellään syövyttäväksi tai vakavaa ärsytystä aiheuttavaksi aineeksi. Kuten 1 kohdassa mainittiin, jos testiainetta ei tunnisteta silmiä syövyttäväksi tai niitä vakavasti ärsyttäväksi, on testausta jatkettava luokitusta ja merkintöjen määräämistä varten. BCOP-testimenetelmän yleinen tarkkuus on välillä 79 % (113/143) – 81 % (119/147), siinä saatujen väärien positiivisten tulosten määrä on välillä 19 % (20/103) – 21 % (22/103) ja väärien negatiivisten tulosten määrä välillä 16 % (7/43) – 25 % (10/40) verrattuna kanin silmää in vivo käyttävällä testimenetelmällä saatuihin tuloksiin luokiteltuna EPAn (1), EU:n (2) tai GHS:n (3) luokitusjärjestelmien mukaan. Kun tietokannasta jätetään pois tiettyihin kemiallisiin (alkoholit, ketonit) tai fysikaalisiin (kiinteät aineet) luokkiin kuuluvat aineet, BCOP-menetelmän tarkkuus EPAn, EU:n ja GHS:n luokitusjärjestelmissä vaihtelee väillä 87 % (72/83) – 92 % (78/85), väärien positiivisten tulosten määrä on välillä 12 % (7/58) – 16 % (9/56) ja väärien negatiivisten tulosten määrä välillä 0 % (0/27) – 12 % (3/26).

45.

Vaikka testiaineelle ei saataisi luokitusta silmiä syövyttäväksi tai niitä vakavasti ärsyttäväksi aineeksi, BCOP-menetelmässä saaduista tuloksista voi olla hyötyä käytettynä yhdessä in vivo -kaninsilmätestissä tai asianmukaisesti validoidussa in vitro -testissä saatujen testitulosten kanssa, kun arvioidaan BCOP-menetelmän käyttökelpoisuutta ja rajoituksia muiden kuin vakavasti ärsyttävien ja ei-ärsyttävien aineiden tunnistamisessa (valmisteilla on ohjeet in vitro -silmämyrkyllisyystestimenetelmien käytöstä).

46.

Testiä pidetään hyväksyttävänä, jos positiivisella kontrollilla saadaan IVIS-arvo, joka on kahden standardipoikkeaman sisällä senhetkisestä pitkän aikavälin keskiarvosta, joka on päivitettävä vähintään kolmen kuukauden välein tai joka kerta kun sellaisissa laboratorioissa, joissa testejä tehdään vain harvoin (vähemmän kuin kerran kuussa) saadaan hyväksytty testi. Negatiivisista tai liuotin/vehikkelivasteista saatujen sameus- ja läpäisevyysarvojen pitäisi olla pienemmät kuin vahvistetut sameuden ja läpäisevyyden taustaraja-arvot naudan sarveiskalvolle, jota on käsitelty negatiivisilla tai liuotin/vehikkelikontrolleilla.

47.

Testiselosteessa olisi annettava seuraavat tiedot, jos ne ovat merkityksellisiä tutkimuksen suorittamiselle:

Testi- ja kontrolliaineet

Sponsoria ja testauslaitosta koskevat tiedot:

Käytetyn testimenetelmän ja protokollan perustelu

Testimenetelmän integriteetti

Menettely, jolla testimenetelmän integriteetti (ts. tarkkuus ja luotettavuus) ajan suhteen varmistetaan (esimerkiksi pätevöittämiseen käytettyjen aineiden säännöllinen testaus, aiempien negatiivisten ja positiivisten kontrollitulosten käyttö).

Hyväksyttävän testin kriteerit

Testausolosuhteet

Tulokset

Tulosten tarkastelu

Päätelmä

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

(2)

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, annettu 16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/45/EY muuttamisesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) N:o 1907/2006 muuttamisesta. EUVL L 353, 31.12.2008, s. 1.

(3)

YK (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS). Second revised edition, New York & Geneve: United Nations Publications, 2007. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(5)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(6)

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1907/2006, annettu 18 päivänä joulukuuta 2006, kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemikaaliviraston perustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/21/EY kumoamisesta. EUVL L 396, 30.12.2006, s. 1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340, en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method. NIH Publication No.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. Ispra, Italia: European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM).

(11)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. and Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy. Fundam. Appl. Toxicol. 18:442-449.

(12)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(13)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. and Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse. Can. J. Zool. 73:2159-2165.

(15)

Collee, J. and Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I. The Lancet 349: 636-641.

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., and Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates. Fundam Appl Toxicol 26:20-31.

(17)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

1.

Eristetyn kanan silmän käyttöön perustuva testimenetelmä (Isolated Chicken Eye, ICE) on in vitro -testimenetelmä, jota voidaan tietyissä olosuhteissa ja tietyin rajoituksin käyttää aineiden ja seosten luokittelemiseksi silmää syövyttäviksi ja silmää vakavasti ärsyttäviksi (1) (2) (3). Tätä testimenetelmää sovellettaessa määritellään vakavasti ärsyttävät aineet sellaisiksi, jotka aiheuttavat silmävaurioita, jotka kestävät kanissa vähintään 21 vuorokautta annostelun jälkeen. Vaikka ICE-testin ei katsota täysin korvaavan in vivo -kaninsilmätestiä, sen käyttöä suositellaan vaiheittaisessa testauksessa sääntömääräistä luokitusta ja merkintöjen määräämistä varten tietyllä sovellusalalla (4) (5). Testiaineita ja seoksia (6), jotka ovat tässä määrityksessä positiivisia, voidaan luokitella silmää syövyttäviksi tai silmää vakavasti ärsyttäviksi ilman kaneilla tehtävää lisätestausta. Aine, jolle saadaan testissä negatiivinen tulos, olisi testattava kaneissa käyttäen vaiheittaista testausstrategiaa, kuten OECD:n ohjeessa Test Guideline 405 (7) (tämän liitteen B. 5 luku) esitetään.

2.

Tässä testimenetelmässä kuvataan menettelyt, joilla arvioidaan testiaineen mahdollinen kyky syövyttää tai ärsyttää vakavasti silmää mittaamalla kykyä aiheuttaa myrkyllisyyttä eristetyssä kanan silmässä, josta silmämuna on poistettu. Sarveiskalvoon kohdistuneet myrkyllisyysvaikutukset mitataan i) määrittämällä sameus kvalitatiivisesti, ii) määrittämällä epiteelivaurio kvalitatiivisesti, kun silmään lisätään fluoreseiiniä (fluoreseiinin retentio), iii) mittaamalla kvantitatiivisesti paksuuntuminen (turpoaminen) ja iv) arvioimalla kvalitatiivisesti pinnan makroskooppiset morfologiset vauriot. Sarveiskalvon sameus, turpoaminen ja vaurio arvioidaan testiaineelle altistuksen jälkeen erikseen ja yhdistetään sen jälkeen, jotta voidaan johtaa silmä-ärsytysluokitus.

3.

ICE-menetelmällä on testattu myös silmää ärsyttäviä aineita, jotka aiheuttavat alle 21 päivässä palautuvia vaurioita ja aineita, jotka eivät ärsytä silmää. ICE-menetelmän tarkkuutta ja luotettavuutta näihin kategorioihin kuuluvien aineiden testauksessa ei ole kuitenkaan validoitu virallisesti.

4.

Määritelmät esitetään lisäyksessä 1.

5.

Tämä testimenetelmä perustuu ICCVAMin (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, vaihtoehtoisten menetelmien validoinnin virastojenvälinen koordinointikomitea) ICE-testimenetelmäprotokollaan (8), joka kehitettiin kansainvälisen validointitutkimuksen perusteella (4)(5)(9). Tutkimukseen ovat osallistuneet vaihtoehtoisten menetelmien eurooppalainen validointikeskus, Japanin vastaava keskus ja Alankomaiden sovelletun luonnontieteen tutkimuslaitoksen TNO toksikologian ja sovelletun farmakologian elämän laatu -osasto. Protokolla perustuu julkaistuista protokollista ja TNO:n nykyisin käyttämästä protokollasta saatuihin tietoihin (10) (11) (12) (13) (14).

6.

Tämän menetelmän tunnistettuja rajoituksia ovat alkoholeille saatujen väärien positiivisten tulosten määrä ja kiinteille aineille ja pinta-aktiivisille aineille saatujen väärien negatiivisten tulosten määrä (ks. kohta 47) (4). Kun tietokannasta poistetaan näihin kemiallisiin ja fysikaalisiin luokkiin kuuluvat aineet, parantuu ICE-menetelmän tarkkuus EU:n, EPAn ja GHS:n luokitusjärjestelmissä huomattavasti (4). Koska tämän testin tarkoituksena on ainoastaan tunnistaa silmiä syövyttävät ja/tai silmiä vakavasti ärsyttävät aineet, väärät negatiiviset tulokset eivät haittaa, koska tällaiset aineet testattaisiin myöhemmin kaneilla tai muilla asianmukaisesti validoiduilla in vitro –testeillä sääntömääräisistä vaatimuksista riippuen käyttäen vaiheittaista testausstrategiaa ja todistusnäytön arviointia. Nykyisen validointitietokannan avulla ei myöskään voida arvioida asianmukaisesti tiettyjä kemikaali- tai tuoteluokkia (esimerkiksi seoksia). Tutkijat voisivat kuitenkin harkita tätä testimenetelmää kaikentyyppisille testimateriaaleille, myös seoksille, jolloin positiivisen tuloksen voitaisiin katsoa viittaavan silmän syövytykseen tai vakavaan ärsytykseen. Alkoholeilla saatuihin positiivisiin tuloksiin olisi kuitenkin suhtauduttava varovaisesti yliennustuksen vaaran takia.

7.

Kaikissa kanan silmiä käyttävissä menettelyissä olisi noudatettava testauslaitoksen määräämiä ihmis- tai eläinperäisten materiaalien (muun muassa muttei ainoastaan kudosten ja kudosnesteiden) käsittelyä koskevia sääntöjä ja menettelyjä. Suositellaan yleismaailmallisia laboratorioissa noudatettavia ennaltavarautumiskäytänteitä (15).

8.

Eräs tämän testimenetelmän rajoitus on se, että vaikka siinä otetaan huomioon joitakin kanin silmä-ärsytystestissä arvioituja silmävaikutuksia ja jossain määrin niiden vakavuus, siinä ei tarkastella sidekalvon ja värikalvon vaurioita. On myös ehdotettu kaninsilmätutkimusten perusteella, että vaikka ICE-testissä ei sinänsä voida arvioida sarveiskalvovaurioiden palautuvuutta, voidaan kuitenkin arvioida sarveiskalvovaurion alkusyvyys ja sen avulla erottaa palautuvat ja palautumattomat vaikutukset (16). ICE-menetelmällä ei voida myöskään arvioida sitä, missä määrin silmäaltistukseen voi liittyä systeemistä myrkyllisyyttä.

9.

ICE-testimenetelmän käyttökelpoisuutta ja rajoituksia ei-vakavien ärsyttävien aineiden ja ei-ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi pyritään selvittämään lisää (ks. myös kohta 48). Käyttäjiä rohkaistaan myös antamaan näytteitä ja/tai tuloksia validointijärjestöille, jotta ICE-testimenetelmän mahdollisia tulevia käyttötapoja, kuten ei-vakavien silmää ärsyttävien aineiden ja ei-ärsyttävien aineiden tunnistusta, voidaan arvioida virallisesti.

10.

Kun laboratorio alkaa käyttää tätä määritysmenetelmää, sen olisi käytettävä lisäyksessä 2 mainittuja pätevyyden osoittamiseen tarkoitettuja kemikaaleja. Laboratorio voi käyttää näitä kemikaaleja osoittaakseen teknisen pätevyytensä ICE-testin suorituksessa ennen kuin se toimittaa ICE-määritystuloksia sääntömääräistä vaaraluokitusta varten.

11.

ICE-testimenetelmä on elinmalli, joka mahdollistaa kanan silmän lyhytaikaisen ylläpitämisen in vitro. Tässä testimenetelmässä testiaineen aiheuttama vaurio arvioidaan määrittämällä sarveiskalvon turpoaminen, sameus ja fluoreseiinin retentio. Kaksi jälkimmäistä muuttujaa arvioidaan kvalitatiivisesti, kun taas sarveiskalvon turpoaminen voidaan määrittää kvantitatiivisesti. Kukin mittaus joko muunnetaan kvantitatiiviseksi arvoksi yleisen ärsyttävyysindeksin laskemiseksi tai sille osoitetaan kvalitatiivinen kategoria, jonka avulla vahvistetaan sitten luokitus in vitro silmää syövyttäväksi ja vakavasti silmää ärsyttäväksi. Kummankin tuloksen avulla voidaan sitten ennustaa testiaineen in vivo -silmäsyövyttävyyttä ja kykyä aiheuttaa vakavaa ärsytystä (ks. päätöskriteerit).

12.

Tässä määrityksessä on tavanomaisesti käytetty teurastamosta saaduista kanoista (jotka on teurastettu elintarviketuotantoa varten) kerättyjä silmiä, jolloin ei ole tarvittu laboratorioeläimiä. Testiin voidaan käyttää vain silmiä, jotka on saatu terveistä, ihmisravinnoksi kelpaavista eläimistä.

13.

Parasta kanan ikää ei ole arvioitu kontrolloidussa tutkimuksessa. Testimenetelmässä on tavanomaisesti käytetty sen ikäisiä ja painoisia kanoja kuin ovat siipikarjateurastamossa tavanomaisesti teurastetut kevätkananpojat (ts. noin 7 viikon ikäisiä, paino 1,5–2,5 kg).

14.

Päät pitäisi irrottaa heti kanojen tainnutuksen jälkeen, mikä tehdään tavallisesti sähkösokilla, ja sen jälkeen, kun kaula on katkaistu verenlaskua varten. Olisi hyvä löytää laboratorion lähellä sijaitseva paikallinen kanojen teurastamo, jotta kanojen päät voidaan kuljettaa teurastamosta laboratorioon riittävän nopeasti, että pilaantuminen ja/tai bakteerikontaminaatio ovat mahdollisimman vähäisiä. Kananpäiden keräämisen ja silmien käytön (ICE-testissä) välisen ajan pitäisi olla mahdollisimman lyhyt (mieluiten alle kaksi tuntia), ja pitäisi osoittaa, etteivät määritystulokset ole sen takia epäluotettavia. Nämä tulokset perustuvat silmien valintaperusteisiin sekä positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden vasteisiin. Kaikkien määrityksessä käytettyjen silmien olisi oltava peräisin samasta tiettynä päivänä kerätystä silmäryhmästä.

15.

Koska silmät dissekoidaan laboratoriossa, koskemattomat päät kuljetetaan teurastamosta ympäristön lämpötilassa muovilaatikoissa kosteutettuina isotonisella fysiologisella keittosuolaliuoksella kostutetuilla pyyheliinoilla.

16.

Silmät, jotka värjäytyvät voimakkaasti fluoreseiinillä (> 0,5) tai joiden sarveiskalvon sameus on korkea (> 0,5) silmämunan poistamisen jälkeen, hylätään.

17.

Kussakin käsitellyssä ryhmässä ja samanaikaisesti määritettävässä positiivisessa kontrollissa on oltava vähintään kolme silmää. Negatiivisessa kontrolliryhmässä tai liuotinkontrollissa (jos käytetään muuta liuotinta kuin fysiologista keittosuolaliuosta) on oltava vähintään yksi silmä.

18.

Silmäluomet leikataan huolellisesti pois varoen vahingoittamasta sarveiskalvoa. Sarveiskalvon eheys arvioidaan nopeasti lisäämällä tippa 2-prosenttista (w/v) natriumfluoreseiiniä sarveiskalvon pinnalle muutamaksi sekunniksi, minkä jälkeen huuhdotaan isotonisella fysiologisella keittosuolaliuoksella. Fluoreseiinillä käsiteltyjä silmiä tarkastellaan rakovalomikroskoopilla, jotta voidaan varmistaa, ettei sarveiskalvo ole vahingoittunut (ts. fluoreseiinin retentio ja sarveiskalvon sameusarvo on enintään 0,5).

19.

Jos silmä on vahingoittumaton, se dissekoidaan kallosta varoen vahingoittamasta sarveiskalvoa. Silmämuna vedetään irti silmäkuopasta pitäen tiukasti vilkkukalvosta kiinni kirurgisilla pihdeillä, ja silmän lihakset leikataan käyrillä, tylppäkärkisillä saksilla. On tärkeää, ettei sarveiskalvoa vahingoiteta liialla paineella (kompressioartefakta).

20.

Kun silmää poistetaan silmäkuopasta, pitäisi osa näköhermoa jättää kiinni ja näkyville. Kun silmä on poistettu silmäkuopasta, se asetetaan imupaperialustalle, ja vilkkukalvo ja muu sidekudos leikataan pois.

21.

Silmämunasta poistettu silmä kiinnitetään ruostumattomasta teräksestä valmistettuun pitimeen siten, että sarveiskalvo on pystysuorassa. Pidin siirretään tiputuslaitteen (superfuusiolaite) kammioon (16). Pitimet asetetaan tiputuslaitteeseen siten, että koko sarveiskalvoon voidaan kohdistaa isotonisesta fysiologisesta keittosuolaliuoksesta koostuva tiputus. Tiputuslaitteen kammioiden lämpötila on pidettävä arvossa 32 ± 1,5°C. Lisäyksessä 3 esitetään kaavio tyypillisestä tiputuslaitteesta ja silmänpitimistä. Niitä saa kaupallisesti tai ne voi rakentaa itse. Laite voidaan mukauttaa yksittäisen laboratorion tarpeisiin (esimerkiksi useille silmille).

22.

Kun silmät on asetettu tiputuslaitteeseen, niitä tarkastellaan jälleen rakovalomikroskoopilla, jotta voidaan varmistaa, etteivät ne ole vahingoittuneet dissektiossa. Sarveiskalvon paksuus sen kärjessä olisi myös mitattava rakovalomikroskooppiin kuuluvalla syvyydenmittauslaitteella. Jos silmien i) fluoreseiinin retentioarvo on yli 0.5; ii) sarveiskalvon sameus on yli 0.5; tai iii) silmissä on muita vahingoittumisen merkkejä, ne on vaihdettava toisiin. Niistä silmistä, joita ei ole hylätty edellä mainittujen kriteerien perusteella, hylätään sellaiset, joiden sarveiskalvon paksuus poikkeaa yli 10 prosentilla kaikkien silmien keskiarvosta. Käyttäjien pitäisi olla tietoisia siitä, että rakovalomikroskoopeilla voi saada erilaisia arvoja sarveiskalvon paksuudelle, jos raon leveyden asetus on erilainen. Raon leveys olisi asetettava arvoon 0,095 mm.

23.

Kun kaikki silmät on tutkittu ja hyväksytty, silmiä inkuboidaan noin 45–60 min, jotta ne tasapainottuvat testijärjestelmässä ennen annostelua. Tasapainottumisjakson jälkeen otetaan sarveiskalvon paksuudelle ja sameudelle lukema perusarvoa varten (nolla-arvo ajanhetkellä 0). Dissektion yhteydessä määritettyä fluoreseiiniarvoa käytetään fluoreseiiniretention perusarvona.

24.

Välittömästi nolla-arvojen mittausten jälkeen silmä (telineineen) poistetaan tiputuslaitteesta, asetetaan vaakasuoraan, ja testiaine annostellaan sarveiskalvolle.

25.

Nestemäiset testiaineet testataan tavallisesti laimentamattomina, mutta ne voidaan laimentaa tarvittaessa (esimerkiksi jos se kuuluu tutkimussuunnitelmaan). Aineet laimennetaan mieluiten fysiologisella keittosuolaliuoksella. Muitakin liuottimia voidaan käyttää valvotuissa olosuhteissa, mutta muiden liuottimien kuin fysiologisen keittosuolaliuoksen käyttökelpoisuus olisi osoitettava.

26.

Nestemäiset testiaineet annostellaan sarveiskalvolle siten, että testiaine peittää kokonaan ja tasaisesti sarveiskalvon pinnan; tavallinen tilavuus on 0,03 ml.

27.

Kiinteät aineet olisi mahdollisuuksien mukaan jauhettava mahdollisimman hienoksi morttelissa huhmareella tai vastaavalla jauhamislaitteella. Jauhe annostellaan sarveiskalvolle siten, että testiaine peittää pinnan tasaisesti; tavallinen määrä on 0,03 g.

28.

Testiaineen (nesteen tai kiinteän aineen) annetaan vaikuttaa 10 sekunnin ajan, ja se huuhdellaan silmästä isotonisella fysiologisella keittosuolaliuoksella (noin 20 ml) huoneenlämpötilassa. Telineessä oleva silmä asetetaan uudelleen tiputuslaitteeseen pystysuoraan.

29.

Kussakin kokeessa on oltava mukana negatiiviset eli liuotin/vehikkelikontrollit ja positiiviset kontrollit.

30.

Testattaessa 100-prosenttisia nesteitä tai kiinteitä aineita käytetään ICE-testissä negatiivisena kontrollina fysiologista keittosuolaliuosta, jotta voidaan havaita epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä ja varmistaa, etteivät määritysolosuhteet aiheuta tahattomasti ärsytysvastetta.

31.

Testattaessa laimennettuja nesteitä käytetään testissä samanaikaisesti liuotin/vehikkelikontrolliryhmää, jotta voidaan havaita epäspesifiset muutokset testijärjestelmässä ja varmistaa, etteivät määritysolosuhteet aiheuta tahattomasti ärsytysvastetta. Kuten kohdassa 25 mainitaan, liuotinta/vehikkeliä saa käyttää vain, jos on osoitettu, ettei se häiritse testijärjestelmää.

32.

Kuhunkin kokeeseen otetaan mukaan tunnettu silmiä ärsyttävä aine positiivisena kontrollina, jotta voidaan varmistaa, että saadaan asianmukainen vaste. Koska ICE-määritystä käytetään tässä testimenetelmässä syövyttävien tai vakavasti ärsyttävien aineiden tunnistamiseksi, positiivisen kontrollin olisi mielellään oltava vertailuaine, joka aiheuttaa tässä testimenetelmässä vakavan vasteen. Vakava ärsytysvaste ei kuitenkaan saisi olla liian voimakas, jotta positiivisen kontrollivasteen vaihtelu ajan funktiona voidaan arvioida. Positiivisesta kontrollista olisi hankittava riittävästi in vitro -tuloksia, jotta positiiviselle kontrollille voidaan laskea tilastollisesti määritelty hyväksyttävä alue. Jos tietylle positiiviselle kontrollille ei ole saatavilla riittävästi aiempia ICE-testimenetelmällä saatuja tuloksia, on tietojen saamiseksi mahdollisesti tehtävä lisätutkimuksia.

33.

Nestemäisten testiaineiden positiivisina kontrolleina voidaan käyttää esimerkiksi 10-prosenttista etikkahappoa tai 5-prosenttista bentsalkoniumkloridia, ja kiinteiden aineiden positiivisina kontrolleina voidaan käyttää esimerkiksi natriumhydroksidia tai imidatsolia.

34.

Vertailuaineet ovat hyödyllisiä, kun arvioidaan tiettyyn kemikaali- tai tuoteryhmään kuuluvien tuntemattomien kemikaalien silmä-ärsytyskykyä tai silmää ärsyttävän aineen suhteellista ärsytyskykyä tietyllä ärsytysvastealueella.

35.

Käsitellyt sarveiskalvot arvioidaan ennen käsittelyä ja alkaen 30, 75, 120, 180 ja 240 minuuttia (± 5 minuuttia) käsittelyn jälkeen tehdyn huuhtelun jälkeen. Näillä ajankohdilla saadaan riittävä määrä mittauksia neljän tunnin käsittelyn aikana, ja mittauksien välillä on riittävästi aikaa tehdä kaikista silmistä tarvittavat havainnot.

36.

Arvioidut päätepisteet ovat sarveiskalvon sameus, turpoaminen, fluoreseiinin retentio ja morfologiset vaikutukset (esimerkiksi epiteelin pistemäinen syöpyminen tai irtoaminen). Kaikki määritykset (lukuun ottamatta fluoreseiinin retentiota, joka määritetään vain ennen käsittelyä ja 30 minuutin kuluttua testiaineen annostelusta) tehdään kullakin mainitulla ajanhetkellä.

37.

On suositeltavaa ottaa valokuvia osoitukseksi sarveiskalvon sameudesta, fluoreseiinin retentiosta, morfologisista muutoksista ja histopatologiasta (jos sellaisia tutkimuksia on tehty).

38.

Kun viimeinen tutkimus on tehty neljän tunnin kohdalla, suositellaan, että silmät säilytetään sopivassa kiinnitysaineessa (esimerkiksi neutraalissa puskuroidussa formaliinissa), jotta voidaan mahdollisesti tehdä histopatologisia tutkimuksia.

39.

Sarveiskalvon turpoaminen arvioidaan sarveiskalvon paksuuden mittauksista, jotka tehdään rakovalomikroskooppiin kuuluvalla optisella paksuudenmittauslaitteella. Turpoaminen ilmoitetaan prosenttilukuna, ja se lasketaan sarveiskalvon paksuuden mittauksista seuraavalla kaavalla:

40.

Kaikkien testattujen silmien sarveiskalvon turpoamisen prosenttikeskiarvo lasketaan kaikille havaintojankohdille. Kullekin testiaineelle annetaan yleinen kategoriaa koskeva arvo sarveiskalvon turpoamiselle saadun korkeimman (minä tahansa ajankohtana havaitun) keskiarvon perusteella.

41.

Sarveiskalvon sameus lasketaan käyttäen sitä sarveiskalvon alaa, joka antaa suurimman sameusarvon. Kaikkien testattujen silmien sarveiskalvon keskimääräinen sameusarvo lasketaan kaikille havaintoajankohdille. Kullekin testiaineelle annetaan yleinen kategoriaa koskeva arvo sarveiskalvon sameudelle saadun korkeimman (minä tahansa ajankohtana havaitun) keskimääräisen arvon perusteella (Taulukko 1).

Taulukko 1

Sarveiskalvon sameusarvot

42.

Kaikkien testattujen silmien fluoreseiinin retention keskiarvo lasketaan ainoastaan 30 minuutin ajanhetkelle. Sitä käytetään kullekin testiaineelle annettavaan yleiseen kategoria-arvoon (taulukko 2).

Taulukko 2

Fluoreseiinin retention arvot

43.

Morfologisia vaikutuksia ovat esimerkiksi sarveiskalvon epiteelisolujen ”pistemäinen syöpyminen”, epiteelin ”irtoaminen”, sarveiskalvon pinnan ”karhentuminen” ja testiaineen ”takertuminen” sarveiskalvoon. Näiden löydösten vakavuus voi vaihdella, ja ne voivat esiintyä samanaikaisesti. Näiden löydösten luokittelu riippuu tutkijan tulkinnasta.

44.

Sarveiskalvon sameutta, turpoamista ja fluoreseiinin retentiota koskevat tulokset olisi arvioitava erikseen, jotta kullekin päätepisteelle voidaan muodostaa ICE-luokka. Kutakin päätepistettä koskevat ICE-luokat yhdistetään sitten ärsytysluokituksen muodostamiseksi kullekin testiaineelle.

45.

Kun kukin päätepiste on arvioitu, voidaan ICE-luokat osoittaa ennalta määrätyn vaihteluvälin perusteella. Sarveiskalvon paksuus (taulukko 3), sameus (taulukko 4) ja fluoreseiinin retentio (taulukko 5) ICE-luokkia käyttäen tulkitaan seuraavien asteikkojen mukaisesti:

Taulukko 3

ICE-luokituskriteerit sarveiskalvon paksuudelle

Taulukko 4

ICE-luokituskriteerit sameudelle

Taulukko 5

ICE-luokituskriteerit keskimääräiselle fluoreseiinin retentiolle

46.

Testiaineen yhdistetty in vitro -ärsyttävyysluokitus arvioidaan lukemalla ärsyttävyysluokitus, joka vastaa sarveiskalvon turpoamiselle, sarveiskalvon sameudelle ja fluoreseiinin retentiolle saatujen kategorioiden yhdistelmää, soveltamalla taulukossa 6 esitettyä järjestelmää.

Taulukko 6

Yhdistetyt in vitro -ärsyttävyysluokitukset

47.

Kuten 1 kohdassa mainittiin, jos testiainetta ei tunnisteta silmiä syövyttäväksi tai niitä vakavasti ärsyttäväksi, on testausta jatkettava luokitusta ja merkintöjen määräämistä varten. ICE-testimenetelmän yleinen tarkkuus on välillä 83 % (120/144) – 87 % (134/154), siinä saatujen väärien positiivisten tulosten määrä on välillä 6 % (7/122) – 8 % (9/116) ja väärien negatiivisten tulosten määrä välillä 41 % (13/32) – 50 % (15/30), kun menetelmää käytetään tunnistettaessa aineita silmää syövyttäviksi ja silmää vakavasti ärsyttäviksi, verrattuna kanin silmää in vivo käyttävällä testimenetelmällä saatuihin tuloksiin luokiteltuna EPAn (1), EU:n (2) tai GHS:n (3) luokitusjärjestelmien mukaan. Kun tietokannasta jätetään pois tiettyihin kemiallisiin (alkoholit, pinta-aktiiviset aineet) ja fysikaalisiin (kiinteät aineet) luokkiin kuuluvat aineet, ICE-menetelmän tarkkuus EPAn, EU:n ja GHS:n luokitusjärjestelmissä vaihtelee väillä 91 % (75/82) – 92 % (69/75), väärien positiivisten tulosten määrä on välillä 5 % (4/73) – 6 % (4/70) ja väärien negatiivisten tulosten määrä välillä 29 % (2/7) – 33 % (3/9) (4).

48.

Vaikka testiaineelle ei saataisi luokitusta silmiä syövyttäväksi tai niitä vakavasti ärsyttäväksi aineeksi, ICE-menetelmässä saaduista tuloksista voi olla hyötyä käytettynä yhdessä in vivo -kaninsilmätestissä tai asianmukaisesti validoidussa in vitro -testissä saatujen testitulosten kanssa, kun arvioidaan ICE-menetelmän käyttökelpoisuutta ja rajoituksia muiden kuin vakavasti ärsyttävien ja ei-ärsyttävien aineiden tunnistamisessa (valmisteilla on ohjeet in vitro -silmämyrkyllisyystestimenetelmien käytöstä).

49.

Testiä pidetään hyväksyttävänä, jos samanaikaisesti tehtyjen negatiivisten tai liuotin/vehikkelikontrollien antama ärsyttävyysluokitus on ”ei ärsyttävä” ja samanaikaisesti tehtyjen positiivisten kontrollien antama ärsyttävyysluokitus on ”vakavasti ärsyttävä / syövyttävä”.

50.

Testiselosteessa olisi annettava seuraavat tiedot, jos ne ovat merkityksellisiä tutkimuksen suorittamiselle:

Testi- ja kontrolliaineet

Sponsoria ja testauslaitosta koskevat tiedot:

Käytetyn testimenetelmän ja protokollan perustelu

Testimenetelmän integriteetti

Menettely, jolla testimenetelmän integriteetti (ts. tarkkuus ja luotettavuus) ajan suhteen varmistetaan (esimerkiksi pätevöittämiseen käytettyjen aineiden säännöllinen testaus, aiempien negatiivisten ja positiivisten kontrollitulosten käyttö).

Hyväksyttävän testin kriteerit

Tapauksen mukaan hyväksyttävät aiempiin tuloksiin perustuvat samaan aikaan tehtyjen vertailukontrollien vaihteluvälit.

Testausolosuhteet

Tulokset

Tulosten tarkastelu

Päätelmä

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual: 2nd Edition. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency.

(2)

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1272/2008, annettu 16 päivänä joulukuuta 2008, aineiden ja seosten luokituksesta, merkinnöistä ja pakkaamisesta sekä direktiivien 67/548/ETY ja 1999/45/EY muuttamisesta ja kumoamisesta ja asetuksen (EY) N:o 1907/2006 muuttamisesta. EUVL L 353, 31.12.2008, s. 1.

(3)

Yhdistyneet Kansakunnat (YK) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS), Second revised edition, UN New York ja Geneve, 2007. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(5)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(6)

Euroopan parlamentin ja neuvoston asetus (EY) N:o 1907/2006, annettu 18 päivänä joulukuuta 2006, kemikaalien rekisteröinnistä, arvioinnista, lupamenettelyistä ja rajoituksista (REACH), Euroopan kemikaaliviraston perustamisesta, direktiivin 1999/45/EY muuttamisesta sekä neuvoston asetuksen (ETY) N:o 793/93, komission asetuksen (EY) N:o 1488/94, neuvoston direktiivin 76/769/ETY ja komission direktiivien 91/155/ETY, 93/67/ETY, 93/105/EY ja 2000/21/EY kumoamisesta. EUVL L 396, 30.12.2006, s. 1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405. OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340, en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended ICE Test Method Protocol. In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives. Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods (ICCVAM) and the National Toxicology Program (NTP) Interagency Center for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (NICEATM). NIH Publication No.: 07-4517. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method. NIH Publication No.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

Prinsen, M.K. and Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits. Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.

(11)

INVITTOX (1994). Protocol 80: Chicken enucleated eye test (CEET). Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(12)

Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. and Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test. Toxicol. In Vitro 9:871-929.

(13)

Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials. Food Chem. Toxicol. 34:291-296.

(14)

Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. and Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation. Food Chem. Toxicol. 35:23-37.

(15)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., and the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].

(16)

Maurer, J.K., Parker, R.D. and Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays. Reg. Tox. Pharmacol. 36:106-117.

(17)

Burton, A.B.G., M. York and R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants. Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471-480.

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(19)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe IrritantsIsolated Chicken Eye (ICE) Test Method. Saatavilla seuraavassa osoitteessa:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]