1.1.1.1.

Επιστρώνονται πλάκες ELISA με ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη VP7 από AHSV-4, αραιωμένη σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού/διττανθρακικού με pH 9,6. Οι πλάκες επωάζονται επί μία νύκτα σε θερμοκρασία 4 °C.

1.1.1.2.

Οι πλάκες εκπλένονται πέντε φορές με απεσταγμένο νερό που περιέχει Tween 20 σε αναλογία 0,01 % (κ.ό.) (διάλυμα έκπλυσης). Οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα έκπλυσης.

1.1.1.3.

Οι πλάκες παρεμποδίζονται (μπλοκάρονται) με την προσθήκη, σε κάθε κοιλότητα, 200 μl αλατούχου ρυθμιστικού διαλύματος φωσφορικών (PBS) με pH 7,2 + αποκορυφωμένο γάλα (Nestlé Dry Skim MilkTM), σε αναλογία 5 %, επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.

1.1.1.4.

Απομακρύνεται το παρεμποδιστικό διάλυμα και οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό.

1.1.2.1.

Τα δείγματα ορού που πρόκειται να υποβληθούν σε δοκιμασία, καθώς και οι οροί θετικού ή αρνητικού μάρτυρα, αραιώνονται σε 1 προς 25 με PBS + αποκορυφωμένο γάλα σε αναλογία 5 % (κ.β.) + Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (κ.ό.), και κατόπιν προστίθενται σε κάθε κοιλότητα 100 μl. Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.

Για την τιτλοδότηση, δημιουργείται σειρά αραιώσεων 1:1, αρχίζοντας από 1 προς 25 (100 μl/κοιλότητα), με έναν ορό ανά στήλη πλάκας, και επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία με τους θετικούς και τους αρνητικούς μάρτυρες. Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.

1.1.2.2.

Οι πλάκες εκπλένονται πέντε φορές με απεσταγμένο νερό που περιέχει Tween 20 (διάλυμα έκπλυσης) σε αναλογία 0,01 % (κ.ό.). Οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα έκπλυσης.

1.1.3.1.

Διανέμονται 100 μl/κοιλότητα γ-σφαιρίνης εναντίον πρωτεϊνών αλόγου συζευγμένης με υπεροξειδάση του αγριοράπανου (HRP), αφού αραιωθούν με PBS + γάλα 5 % + Tween 20 σε αναλογία 0,05 %, με pH 7,2. Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.

1.1.3.2.

Οι πλάκες εκπλένονται πέντε φορές με απεσταγμένο νερό που περιέχει Tween 20 (διάλυμα έκπλυσης) σε αναλογία 0,01 % (κ.ό). Οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα έκπλυσης.

1.1.4.1.

Προστίθενται 200 μl/κοιλότητα διαλύματος χρωμογόνου/υποστρώματος [10 ml διαλύματος DMAB (διμεθυλαμινοβενζαλδεΰδη) 80,6 mM + 10 ml διαλύματος MBTH (υδροχλωρική 3-μεθυλο-2-βενζοθειαζολινοϋδραζόνη) 1,56 mM + 5 μl H2O2].

Ύστερα από 5-10 λεπτά περίπου (πριν αρχίσει να χρωματίζεται ο αρνητικός μάρτυρας), η εμφάνιση χρώματος διακόπτεται με την προσθήκη 50 μl 3N H2SO4.

Επίσης, είναι δυνατόν να χρησιμοποιηθούν και άλλα χρωμογόνα, όπως ABTS (2,2′-αζινο-δις[3-αιθυλοβενζοθειαζολινο-6-σουλφονικό οξύ]), TMB (τετραμεθυλοβενζιδίνη) ή OPD (ορθο-φαινυλοδιαμίνη).

1.1.4.2.

Ανάγνωση των αποτελεσμάτων σε μήκος κύματος 600 nm (ή 620 nm).

1.2.1.

Υπολογίζεται η τιμή αποκοπής, προσθέτοντας τον αριθμό 0,06 στην τιμή που αντιστοιχεί στον αρνητικό μάρτυρα (0,06 είναι η τυπική απόκλιση που προκύπτει από ομάδα 30 αρνητικών ορών).

1.2.2.

Τα δείγματα της δοκιμασίας που δίνουν τιμές απορρόφησης χαμηλότερες από την τιμή αποκοπής θεωρούνται αρνητικά.

1.2.3.

Τα δείγματα της δοκιμασίας που δίνουν τιμές απορρόφησης υψηλότερες από την τιμή αποκοπής + 0,15 θεωρούνται θετικά.

1.2.4.

Από τα δείγματα της δοκιμασίας που δίνουν ενδιάμεσες τιμές απορρόφησης θεωρείται ότι δεν συνάγονται ασφαλή συμπεράσματα και πρέπει να χρησιμοποιείται δεύτερη μέθοδος για την επιβεβαίωση των αποτελεσμάτων.

2.1.1.1.

Επιστρώνονται πλάκες ELISA με 50-100 ng ανασυνδυασμένης πρωτεΐνης VP7 από AHSV-4, αραιωμένης σε ρυθμιστικό διάλυμα ανθρακικού/διττανθρακικού, με pH 9,6. Επωάζονται επί μία νύκτα σε θερμοκρασία 4 °C.

2.1.1.2.

Οι πλάκες εκπλένονται τρεις φορές με αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) 0,1 × που περιέχει 0,135 M NaCl και Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (κ.ό.) (PBST). Οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα έκπλυσης.

2.1.2.1.

Τα δείγματα ορού που θα υποβληθούν σε δοκιμασία, καθώς και οι θετικοί και αρνητικοί οροί μάρτυρα, αραιώνονται σε αναλογία 1 προς 5 με διάλυμα αραίωσης που περιέχει 0,35 M NaCl, Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (κ.ό.) και 0,1 % Kathon, και κατόπιν προστίθενται 100 μl σε κάθε κοιλότητα. Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.

Για την τιτλοδότηση, δημιουργείται σειρά αραιώσεων 1:1 των δοκιμαστικών ορών, αρχίζοντας από 1 προς 10 έως 1 προς 280, σε 8 κοιλότητες (100 μl/κοιλότητα), έναν ορό ανά στήλη πλάκας, και επαναλαμβάνεται η ίδια διαδικασία με τους θετικούς και τους αρνητικούς μάρτυρες. Ακολουθεί επώαση επί μία ώρα σε θερμοκρασία 37 °C.

2.1.2.2.

Οι πλάκες εκπλένονται πέντε φορές με αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) 0,1 × που περιέχει 0,135 M NaCl και Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (κ.ό.) (PBST). Οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα έκπλυσης.

2.1.3.1.

Διανέμονται 100 μl/κοιλότητα Mab εναντίον της πρωτεΐνης VP7 συζευγμένου με υπεροξειδάση αγριοράπανου. Εκ των προτέρων, το Mab έχει αραιωθεί σε αναλογία 1/5 000 – 1/15 000 σε διάλυμα 1/1 σταθεροποιητή StabiliZyme Select® (SurModics, αριθ. αναφοράς: SZ03) σε απεσταγμένο νερό. Ακολουθεί επώαση για 30 λεπτά σε θερμοκρασία 37 °C.

2.1.3.2.

Οι πλάκες εκπλένονται πέντε φορές με αλατούχο ρυθμιστικό διάλυμα φωσφορικών (PBS) 0,1 × που περιέχει 0,135 M NaCl και Tween 20 σε αναλογία 0,05 % (κ.ό.) (PBST). Οι πλάκες κτυπώνται ελαφρά σε απορροφητικό υλικό για να απομακρυνθούν τυχόν υπολείμματα έκπλυσης.

2.2.1.

Προσδιορίζεται το ποσοστό παρεμπόδισης (BP) κάθε δείγματος βάσει του ακόλουθου τύπου, όπου «Abs» συμβολίζει τα αντισώματα:

2.2.2.

Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμή BP που υπερβαίνει το 50 % θα πρέπει να θεωρούνται θετικά ως προς τα αντισώματα κατά του AHSV.

2.2.3.

Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμή BP κάτω από το 45 % θα πρέπει να θεωρούνται αρνητικά ως προς τα αντισώματα κατά του AHSV.

2.2.4.

Τα δείγματα που εμφανίζουν τιμή BP μεταξύ 45 % και 50 % θα πρέπει να θεωρείται ότι δεν μπορούν να οδηγήσουν σε ασφαλή συμπεράσματα και πρέπει να υποβάλλονται εκ νέου σε δοκιμασία. Αν βάσει του αποτελέσματος πάλι δεν συνάγονται ασφαλή συμπεράσματα, τα ζώα θα πρέπει να υποβάλλονται εκ νέου σε δοκιμασία με δειγματοληψία που πραγματοποιείται τουλάχιστον δύο εβδομάδες μετά τη δειγματοληψία που θεωρήθηκε ότι δεν οδήγησε σε ασφαλή συμπεράσματα.

—

εξαγωγή νουκλεϊκών οξέων με φαινόλη-χλωροφόρμιο·

—

προσρόφηση νουκλεϊκών οξέων σε σύστημα διήθησης·

—

προσρόφηση νουκλεϊκών οξέων σε σύστημα μαγνητικών σφαιριδίων.

1.1.

1 g δείγματος ιστού ομογενοποιείται σε 1 ml διαλύματος μετουσίωσης (θειοκυανικό άλας γουανιδίου 4 M, κιτρικό νάτριο 25 mM, 2-μερκαπτοαιθανόλη 0,1 M, λαουροϋλοσαρκοσινικό νάτριο 0,5 %).

1.2.

Μετά από φυγοκέντρηση, 1 μg RNA ζυμομύκητα, 0,1 ml διαλύματος οξικού νατρίου 2 Μ με pH 4, 1 ml φαινόλης και 0,2 ml μείγματος χλωροφορμίου/ισοαμυλικής αλκοόλης (σε αναλογία 49/1) προστίθενται στο υπερκείμενο υγρό.

1.3.

Το υπερκείμενο υγρό ανακινείται ζωηρά και ψύχεται με πάγο για 15 λεπτά.

1.4.

Μετά από φυγοκέντρηση, το RNA που βρίσκεται στην υδατική φάση εκχυλίζεται με φαινόλη, κατακρημνίζεται με αιθανόλη και επανεναιωρείται σε αποστειρωμένο νερό.

—

πρόσθιος εκκινητής

5′-CCA-GTA-GGC-CAG-ATC-AAC-AG-3′

—

αντίστροφος εκκινητής

5′-CTA-ATG-AAA-GCG-GTG-ACC-GT-3′

—

ανιχνευτής MGB-TaqMan

5′-FAM-GCT-AGC-AGC-CTA-CCA-CTA-MGB-3′

2.1.1.

Η συγκέντρωση αποθέματος εκκινητών αραιώνεται μέχρι μια συγκέντρωση εργασίας στα 8 μM («απόθεμα εργασίας εκκινητή στα 8 μM») ενώ ο ανιχνευτής αραιώνεται μέχρι μια συγκέντρωση εργασίας στα 50 μM («απόθεμα εργασίας ανιχνευτή στα 50 μΜ»). Μια διάταξη πλάκας δοκιμής θα πρέπει να σχεδιαστεί και να φορτωθεί στο λογισμικό του μηχανήματος PCR σε πραγματικό χρόνο. Με τη χρήση της διάταξης ως οδηγού, 2,5 μl από κάθε απόθεμα εργασίας εκκινητή στα 8 μM προστίθενται σε κάθε κοιλότητα που πρόκειται να περιέχει δείγματα RNA, θετικού και/ή αρνητικού μάρτυρα (η τελική συγκέντρωση του εκκινητή θα είναι 1 μM στα 20 μl μείγματος RT-PCR). Η πλάκα φυλάσσεται σε πάγο.

2.1.2.

2 μl απομονωμένου RNA (δείγματα δοκιμής και θετικός μάρτυρας), ή 2 μl νερού απαλλαγμένου από ριβονουκλεάση σε μάρτυρες αρνητικής αντίδρασης, αναμειγνύονται με πρόσθιους και αντίστροφους εκκινητές. Αυτό το μείγμα μετουσιώνεται με θέρμανση στους 95 °C επί 5 λεπτά και κατόπιν ψύχεται ταχέως σε πάγο για 5 λεπτά τουλάχιστον.

2.1.3.

Παρασκευάζεται όγκος διαλύματος Master Mix για RT-PCR ενός βήματος σε πραγματικό χρόνο, κατάλληλος για τον αριθμό δειγμάτων προς δοκιμή, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. Προστίθενται 0,1μl αποθέματος εργασίας του ανιχνευτή στα 50 μΜ σε κάθε κοιλότητα που περιέχει δείγματα RNA (η τελική συγκέντρωση του ανιχνευτή πρόκειται να είναι 0,25 μM σε κάθε κοιλότητα που περιέχει δείγματα RNA). 13 μl διαλύματος Master Mix για RT-PCR ενός βήματος κατανέμονται σε κάθε κοιλότητα στην πλάκα PCR που περιέχει τους μετουσιωμένους εκκινητές και το RNA.

2.1.4.

Η πλάκα τοποθετείται σε θερμικό κυκλοποιητή πραγματικού χρόνου που έχει προγραμματιστεί για αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση συμπληρωματικού DΝΑ/ανίχνευση φθορισμού. Οι συνθήκες ενίσχυσης συνίσταται σε ένα πρώτο βήμα αντίστροφης μεταγραφής στους 48 °C επί 25 λεπτά, που ακολουθείται από 10 λεπτά στους 95 °C («hot start») και 40 κύκλους 15 δευτερολέπτων στους 95 °C, 35 δευτερολέπτων στους 55 °C και 30 δευτερολέπτων στους 72 °C (ή 40 κύκλους στους 97 °C επί 2 δευτερόλεπτα και στους 55 °C επί 30 δευτερόλεπτα εάν χρησιμοποιούνται αντιδραστήρια και θερμικός κυκλοποιητής που επιτρέπουν ταχείες αντιδράσεις). Τα δεδομένα για τον φθορισμό συλλέγονται στο τέλος του βήματος των 55 °C.

2.1.5.

Εάν προκύπτουν άτυπες καμπύλες ενίσχυσης, η δοκιμή δεν θεωρείται έγκυρη και πρέπει να επαναληφθεί.

Τα δείγματα θεωρούνται θετικά εάν η τιμή Ct (αριθμός κύκλου στον οποίον ο φθορισμός που παράγεται από μια αντίδραση υπερβαίνει το όριο φθορισμού) είναι μικρότερη ή ίση με το καθορισμένο όριο Ct (35) εντός 40 κύκλων PCR (Ct ≤ 35).

Τα δείγματα θεωρείται ότι δεν οδηγούν σε ασφαλή συμπεράσματα εάν η τιμή Ct είναι υψηλότερη από το καθορισμένο όριο Ct (35) εντός 40 κύκλων PCR (Ct ≥ 35).

Τα δείγματα θεωρούνται αρνητικά εάν προκύπτει οριζόντια καμπύλη ενίσχυσης η οποία δεν τέμνει τη γραμμή ορίου εντός 40 κύκλων PCR.

—

πρόσθιος εκκινητής

5′-AGA-GCT-CTT-GTG-CTA-GCA-GCC-T-3′

—

αντίστροφος εκκινητής

5′-GAA-CCG-ACG-CGA-CAC-TAA-TGA-3′

—

ανιχνευτής MGB-TaqMan

5′-FAM-TGC-ACG-GTC-ACC-GCT-MGB-3′

2.2.1.

Το μείγμα διαλυμάτων παρακαταθήκης εκκινητή και ανιχνευτή παρασκευάζεται με συγκέντρωση 25 × σε 5 μΜ για τον πρόσθιο και τον αντίστροφο εκκινητή και 3 μΜ για τον ανιχνευτή. Μια διάταξη πλάκας δοκιμής θα πρέπει να σχεδιαστεί και να φορτωθεί στο λογισμικό του μηχανήματος PCR σε πραγματικό χρόνο. Χρησιμοποιώντας τη διάταξη ως οδηγό, 5 μl δειγμάτων RNA, συμπεριλαμβανομένων των δειγμάτων δοκιμασίας και των θετικών και αρνητικών μαρτύρων, προστίθενται στις κατάλληλες κοιλότητες της πλάκας σύμφωνα με τη διάταξη.

2.2.2.

Το RNA μετουσιώνεται με θέρμανση στους 95 °C επί 5 λεπτά, και κατόπιν ταχεία ψύξη σε πάγο επί 3 λεπτά τουλάχιστον.

2.2.3.

Παρασκευάζεται όγκος διαλύματος Master Mix RT-PCR ενός βήματος σε πραγματικό χρόνο, κατάλληλος για τον αριθμό δειγμάτων που πρέπει να υποβληθούν σε δοκιμασία, σύμφωνα με τις οδηγίες του κατασκευαστή. 1 μl μείγμα διαλυμάτων παρακαταθήκης εκκινητών και ανιχνευτή 25 × (από το ανωτέρω σημείο 2.2.1) προστίθενται στο Master Mix ώστε να επιτευχθεί τελική συγκέντρωση σε κάθε κοιλότητα 200 nM για κάθε εκκινητή και 120 nM για τον ανιχνευτή. Τα 20 μl του Master Mix κατανέμονται σε κάθε κοιλότητα στην πλάκα PCR που περιέχει μετουσιωμένο RNA.

2.2.4.

Η πλάκα τοποθετείται σε θερμικό κυκλοποιητή πραγματικού χρόνου που έχει προγραμματιστεί για αντίστροφη μεταγραφή και ενίσχυση συμπληρωματικού DΝΑ/ανίχνευση φθορισμού όπως προτείνεται από τον κατασκευαστή. Οι συνθήκες ενίσχυσης συνίστανται σε ένα πρώτο στάδιο αντίστροφης μεταγραφής στους 48 °C επί 10 λεπτά, που ακολουθείται από 10 λεπτά στους 95 °C και 40 κύκλους 15 δευτερολέπτων στους 95 °C και 45 δευτερολέπτων στους 60 °C.

2.2.5.

Τα δείγματα θεωρούνται θετικά εάν ο κανονικοποιημένος φθορισμός για τη δοκιμασία RT-PCR AHSV υπερβαίνει το όριο του 0,1 εντός 36 κύκλων PCR σε όλες τις επαναλήψεις ενός δείγματος.

Τα δείγματα θεωρείται ότι δεν οδηγούν σε ασφαλή συμπεράσματα εάν ο κανονικοποιημένος φθορισμός για τη δοκιμασία RT-PCR AHSV υπερβαίνει το όριο του 0,1 μεταξύ 36 και 40 κύκλων PCR σε οποιαδήποτε επανάληψη του δείγματος.

Τα δείγματα θεωρούνται αρνητικά εάν ο κανονικοποιημένος φθορισμός για τη δοκιμασία RT-PCR AHSV δεν υπερέβη το όριο του 0,1 εντός 40 κύκλων PCR σε όλες τις επαναλήψεις ενός δείγματος και εάν ο κανονικοποιημένος φθορισμός για την κατοχυρωμένη δοκιμή συνθετικού εξωτερικού μάρτυρα υπερέβη το όριο του 0,1 εντός 33 κύκλων PCR.»