13/ 24

BG

Официален вестник на Европейския съюз

125

---

31998L0073

---

L 305/1

ОФИЦИАЛЕН ВЕСТНИК НА ЕВРОПЕЙСКИЯ СЪЮЗ

---

ДИРЕКТИВА 98/73/ЕО НА КОМИСИЯТА

от 18 септември 1998 година

относно двадесет и четвърто привеждане в съответствие с техническия прогрес на Директива 67/548/ЕИО на Съвета за сближаване на законовите, подзаконовите и административни разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества

(текст от значение за ЕИП)

КОМИСИЯТА НА ЕВРОПЕЙСКИТЕ ОБЩНОСТИ,

като взе предвид Договора за създаване на Европейската общност,

като взе предвид Директива 67/548/ЕИО на Съвета от 27 юни 1967 г. за сближаване на законовите, подзаконовите и административни разпоредби относно класификацията, опаковането и етикетирането на опасни вещества (1), последно изменена с Директива 97/69/ЕО на Комисията (2), и по-специално член 28 от нея,

като има предвид, че приложение I към Директива 67/548/ЕИО съдържа списък на опасни вещества, заедно с подробности за класификацията и процедурите по етикетиране по отношение на всяко вещество; като има предвид, че съвременните научни и технически познания са показали, че списъка с опасни вещества в това приложение трябва да се адаптира и допълни;

като има предвид, че приложение V към Директива 67/548/ЕИО приема методите за определяне на физико-химичните свойства, токсичността и екотоксичността на веществата и препаратите; като има предвид, че е необходимо да се приведе това приложение в съответствие с техническия прогрес;

като има предвид, че мерките, предвидени в настоящата директива, са в съответствие със становището на Комитета за адаптиране към техническия прогрес на директивите за премахване на техническите пречки пред търговията с опасни вещества и препарати,

ПРИЕ НАСТОЯЩАТА ДИРЕКТИВА:

Член 1

Директива 67/548/ЕИО се изменя, както следва:

1.	Приложение I се изменя, както следва: а) вписаните данни в приложение I към настоящата директива заменят съответните вписани данни в приложение I към Директива 67/548/ЕИО; б) вписаните данни в приложение II към настоящата директива са включени в приложение I към Директива 67/548/ЕИО.

2.

Приложение V се изменя, както следва: а) текстовете в приложения III.A, III.Б и III.В към настоящата директива са прибавени към част А от приложение V към Директива 67/548/ЕИО; б) вписаните данни в приложение III.Г към настоящата директива са прибавени към част В от приложение V към Директива 67/548/ЕИО.

Член 2

Държавите-членки въвеждат в сила законовите, подзаконовите и административните разпоредби, необходими за да се съобразят с настоящата директива, най-късно до 31 октомври 1999 г. Те незабавно информират Комисията за това.

Когато държавите-членки приемат тези разпоредби, в тях се съдържа позоваване на настоящата директива или то се извършва при официалното им публикуване. Условията и редът на позоваване се определят от държавите-членки.

Член 3

Настоящата директива влиза в сила на двадесетия ден след нейното публикуване в Официален вестник на Европейските общности.

Член 4

Адресати на настоящата директива са държавите-членки.

---

(1)  ОВ 196, 16.8.1967 г., стр. 1.

(2)  ОВ L 343, 13.12.1997 г., стр. 19.

---

ANEXO IBILAG IANHANG IΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IANNEX IANNEXE IALLEGATO IBIJLAGE IANEXO ILIITE IBILAGA I

---

ANEXO IIBILAG IIANHANG IIΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IIANNEX IIANNEXE IIALLEGATO IIBIJLAGE IIANEXO IILIITE IIBILAGA II

---

ПРИЛОЖЕНИЕ III A

A.18. СРЕДНО БРОЙНО МОЛЕКУЛНО ТЕГЛО И РАЗПРЕДЕЛЕНИЕ НА МОЛЕКУЛНОТО ТЕГЛО НА ПОЛИМЕРИ

1.   МЕТОД

Този хроматографски метод с гел-инфилтрация е точно копие на метода ОИСР TG 118 (1996 г.). Основните принципи и по-нататъшна техническа информация са дадени в позоваване 1.

1.1.   Увод

Тъй като свойствата на полимерите са много разнообразни, невъзможно е да се опише един единствен метод, установяващ точно условията за сепарация и оценка, който да обхваща възможностите и спецификата, които се получават при сепарацията на полимерите. В частност, сложните полимерни системи често не се поддават на хроматография с гел-инфилтрация (GPC). Когато GPC е неприложима, молекулното тегло се определя с помощта на други методи (виж приложението). В такива случаи, пълните подробности и оценката се правят на база използвания метод.

Описаният метод се базира на DIN стандарт 55672 (1). В този DIN стандарт може да се намери подробна информация за това как да се извършат експериментите и как да се оценят данните. В случай, че са необходими модификации на експерименталните условия, тези промени трябва да бъдат оправдани. Могат да се използват и други стандарти, ако са напълно подходящи. Описаният метод използва проби от полистирол с позната полидисперсност за калибровка и може да се наложи да бъде променен, с цел да бъде подходящ за определени полимери, например водоразтворими полимери и полимери с дълги разклонени вериги.

1.2.   Определения и единици

Средното бройно молекулно тегло Mn и средното тегловно молекулно тегло Mw се определят с помощта на следните уравнения:

където,

Hi	е нивото на детекторния сигнал от базовата линия на обема на задържане Vi,
Mi	е молекулното тегло на полимерната фракция при обема на задържанеVi, а
n	е броят на точките с данни.

Широчината на разпределение на молекулното тегло, която е мярка за дисперсността на системата, се изразява чрез съотношението Mw/Mn.

1.3.   Еталонни вещества

Тъй като GPC e относителен метод, трябва да се извърши калибровка. За целта обикновено се използват полистиролови стандарти с линеен строеж и тясно разпределение, с известни средни молекулни тегла Mn и Mw и известно молекулно тегловно разпределение. Калибрационната крива може да се използва само при определяне на молекулното тегло на непозната проба, ако условията за разделяне на пробата и стандартите са били подбрани по идентичен способ.

Една установена връзка между молекулното тегло и елуиращия обем е валидна само при специфичните условия на дадения експеримент. Условията включват, преди всичко, температурата, разтворителя (или сместа от разтворители), хроматографските условия и сепарационната колона или система от колони.

Молекулните тегла на пробата, определени по този начин, са относителни стойности и се описват като „полистиролови еквивалентни молекулни тегла“. Това означава, че в зависимост от структурните и химически различия между пробата и стандартите, молекулните тегла могат да се отклоняват от абсолютните стойности в по-голяма или по-малка степен. Ако се използват други стандарти, например полиетиленгликол, полиетиленов окис, полиметил метакрилат, полиакрилна киселина, то трябва да се посочи причината за това.

1.4.   Принцип на тестовия метод

Както разпределението на молекулното тегло на пробата, така и нейните средни молекулни тегла (Mn, Mw) могат да се определят чрез GPC. GPC е специален тип течна хроматография, при която пробата се сепарира според хидродинамичните обеми на отделните съставни части (2).

Сепарацията се извършва като пробата преминава през колона, която е пълна с порест материал, обикновено органичен гел. Малките молекули могат да проникват през порите, докато големите молекули не могат. Следователно пътеката на по-големите молекули е по-къса и те елуират първи. Молекулите със среден размер проникват през някои от порите и елуират по-късно. Най-малките молекули, със среден хидродинамичен радиус, по-малък от този на порите на гела, могат да проникват през всички пори. Те елуират последни.

В идеалния случай сепарацията се контролира изцяло от размера на молекулните видове, но на практика е трудно да се избегнат поне някои от абсорбционнните ефекти, които смущават процеса. Неравномерната облицовка на колоната и мъртвите обеми могат да влошат ситуацията (2).

Детекцията се извършва например чрез рефрактивен индекс или UV-абсорбция и се получава проста крива на разпределението. За да се прибавят обаче действителните стойности на молекулните тегла към кривата, е необходимо да се калибрира колоната, като през нея се пуснат полимери с познато молекулно тегло и в идеалния случай, с доста широка подобна структура, например различни полистиролови стандарти. Резултатите са една типична крива на Gaussian, на места изкривена от малка опашка по посока на страната с ниско молекулно тегло, като вертикалната ос показва количеството, по тегло, на различните елуирани видове молекулни тегла, а хоризонталната ос показва регистрираното молекулно тегло.

1.5.   Критерии за качество

Повторяемостта (Относително стандартно отклонение - Relative Standard Deviation: RSD) на елуиращия обем трябва да бъде по-добра от 0,3 %. Желаната повторяемост на анализа трябва да се гарантира чрез корекция през вътрешен стандарт, ако хроматограмата се оценява в зависимост от времето и не отговаря на горепосочените критерии (1). Полидисперсностите зависят от молекулните тегла на стандартите. В случая с полистиролови еталони, типичните стойности са:

Mp < 2 000	Mw/Mn < 1,20
2 000 ≤ Mp ≤ 106	Mw/Mn < 1,05
Mp > 106	Mw/Mn < 1,20

(Mp е молекулното тегло на еталона при максималния пик)

1.6.   Описание на тестовия метод

1.6.1.   Подготовка на стандартните полистиролови разтвори

Полистироловите стандарти се разтварят чрез внимателно смесване в избрания елуент. При подготовката на разтворите трябва да се вземат предвид препоръките на производителя.

Концентрациите на избраните стандарти зависят от различни фактори, например обем на инжектиране, вискозитет на разтвора и чувствителност на аналитичния детектор. Максималният обем на инжектиране трябва да се адаптира към дължината на колоната с цел да се избегне претоварване. Типичните обеми на инжектиране за аналитична сепарация чрез GPC с колона 30 cm × 7,8 mm, са обикновено между 40 и 100 µl. Възможни са и по-големи обеми, но те не трябва да превишават 250 µl. Оптималното съотношение между обема на инжектиране и концентрацията трябва да се определи преди действителната калибровка на колоната.

1.6.2.   Подготовка на разтвора проба

Принципно, при подготовката на разтворите проби се прилагат същите изисквания. Мострата се разтваря в подходящ разтворител, например тетрахидрофуран (THF), чрез старателно разклащане. Тя не трябва при никакви обстоятелства да се разтваря с помощта на ултразвукова баня. Когато е необходимо, разтворът проба се пречиства през мембранен филтър с размер на порите между 0,2 и 2 µm.

Присъствието на неразтворени частици трябва да се отчете във финалния протокол, тъй като тези частици може да се дължат на високомолекулни видове. Трябва да се използва подходящ метод за определяне процента на теглото на разтворените частици. Разтворите трябва да се използват в рамките на 24 часа.

1.6.3.   Апаратура

—	резервоар за разтворител,

—	дегазатор (когато е уместно),

—

помпа,

—	гасител на пулсации (когато е уместно),

—	инжекторна система,

—	хроматографски колони,

—

детектор,

—	разходомер за дебит (когато е уместно),

—	процесор-рекордер за данни,

—	съд за отпадъци.

Трябва да се гарантира, че GPC системата е инертна по отношение на използваните разтворители (например чрез използване на стоманени капиляри за THF-разтворителя).

1.6.4.   Система за инжектиране и подаване на разтворител

Към колоната се подава определен обем разтвор на пробата, било автоматично или ръчно, в строго определена зона. Твърде бързото издърпване или натискане на буталото на помпата, ако се прави ръчно, може да причини промени в наблюдаваното разпределение на молекулното тегло. Системата за подаване на разтворител трябва, доколкото е възможно, да няма пулсации, включвайки гасител на пулсации в идеалния случай. Дебитът е от порядъка на 1 µl/min.

1.6.5.   Колона

В зависимост от пробата, полимерът може да се охарактеризира или с помощта на проста колона или чрез няколко колони, свързани последователно. На пазара се предлагат порести материали за колони с определени свойства (например, размер на порите, лимити на изключване). Изборът на сепарационен гел или на дължина на колоната зависи както от свойствата на пробата (хидродинамични обеми, разпределение на молекулното тегло), така и от специфичните условия за сепарация като разтворител, температура и дебит. (1) (2) (3).

1.6.6.   Теоретични пластини

Колоната или комбинацията от колони, използвани за сепарация, трябва да се охарактеризират чрез броя на теоретичните пластини. Това включва, в случая на THF като елуиращ разтворител, подаване на разтвор на етилбензол или друг подходящ неполярен разтвор към колона с позната дължина. Броят на теоретичните пластини се определя чрез следното уравнение:

или

където,

N	е броят на теоретичните пластини
Ve	Ve е елуиращият обем при максималния пик
W	е пикът на широчината на базовата линия
W 1/2	е пиковата широчина при половин височина.

1.6.7.   Сепарационна производителност

Освен броя на теоретичните пластини, който е количество, определящо широчината на зоната, известна роля играе и сепарационната производителност, която се определя от стръмността на калибрационната крива. Сепарационната производителност на една колона се получава от следната зависимост:

където:

Vey,Mx	е елуиращият обем за полистирол с молекулно тегло Мх
Vey(10Mx)	е елуиращият обем за полистирол с 10 пъти по-голямо молекулно тегло.

Резолюцията на системата обикновено се определя както следва:

където,

Ve1, Ve2	са елуиращите обеми на двата полистиролови стандарта в максималния пик
W1, W2	са пиковите широчини в базовата линия
M1, M2	са молекулните тегла в максималния пик (трябва да се различава с коефициент 10).

R-стойността на системата колони трябва да бъде по-голяма от 1,7 (4).

1.6.8.   Разтворители

Всички разтворители трябва да бъдат с висока чистота (за THF се използва чистота 99,5 %). Резервоарът за разтворител (ако е необходимо в атмосфера от инертен газ) трябва да е достатъчно голям за калибровката на колоната и няколко анализи на проби. Разтворителят трябва да се дегазира, преди да бъде транспортиран през помпата.

1.6.9.   Температурен контрол

Температурата на критичните вътрешни компоненти (инжекторна верига, колони, детектор и тръбна инсталация) трябва да бъде постоянна и съвместима с избора на разтворител.

1.6.10.   Детектор

Предназначението на детектора е да отчита количествено концентрацията на пробата, елуирала от колоната. С цел да се избегне ненужното разширяване на пиковете, обемът на кюветката на детекторната клетка трябва да се поддържа възможно най-малък. Той не трябва да бъде по-голям от 10 µl освен при разсейване и детектори за вискозитет. За детекция обикновено се използва диференциална рефрактометрия. Въпреки това, ако специфичните свойства на пробата или на елуиращия разтвор го изискват, могат да се използват други видове детектори, например UV/VIS, IR, детектори за вискозитет, и т.н.

2.   ДАННИ И ОТЧИТАНЕ

2.1.   Данни

За подробни оценъчни критерии, както и за изискванията относно събирането и обработката на данни, трябва да се обърнете към DIN стандарт (1).

За всяка проба трябва да се извършат два независими опита. Те се анализират индивидуално.

При всяко измерване се обезпечават Mn, Mw, Mw/Mn и Mp. Необходимо е изрично да се посочи, че измерените стойности са относителни стойности, еквивалентни на молекулните тегла на използвания стандарт.

След определяне на обемите на задържане или времената на задържане (които може би са коригирани чрез вътрешен стандарт), регистрираните Mp стойности (Mp като максимален пик на калибрационния стандарт) се изчертават спрямо едно от тези количества. Необходими са поне две калибрационни точки за десет молекулни тегла, и поне пет измервателни точки са необходими за цялата крива, които трябва да покриват очакваното молекулно тегло на пробата. Прекъсващата точка с нискомолекулно тегло на калибрационната крива се определя от n-хексилбензола или друг подходящ неполярен разтворител. Бройните и тегловните средни молекулни тегла обикновено се определят с помощта на електронна обработка на данните, на база на формулите в част 1.2. В случай, че се използва ръчна цифровизация на данните, може да се обърнете към ASTM D 3536-91 (3).

Кривата на разпределението трябва да се направи под формата на таблица или като диаграма (диференциална честота или сума на процентите спрямо отчетените M). При графичното представяне, една декада от молекулни тегла трябва да има около 4 см широчина и максималния пик да има около 8 см височина. При интегрални криви на разпределение, разликата в ординатата между 0 и 100 % трябва да бъде около 10 см.

2.2.   Протокол от теста

Протоколът от теста включва следна информация:

2.2.1.   Тестово вещество

—	налична информация за тестовото вещество (идентичност, добавки, примеси),

—	описания на обработката на пробата, наблюдения, проблеми.

2.2.2.   Оборудване

—	резервоар за елуент, инертен газ, дегазиране на елуента, състав на елуента, примеси,

—	помпа, гасител на пулсации, инжекторна система,

—	сепарационни колони (производител, пълна информация за характеристиките на колоните, като размер на порите, вид на сепарационния материал, брой, дължина и ред на използваните колони),

—	брой на теоретичните пластини на колоната (или комбинацията от колони), сепарационна производителност (резолюция на системата),

—	информация за симетрията на пиковете,

—	температура на колоната, вид на температурния контрол,

—	детектор (принцип на измерване, тип, обем на кюветката),

—	разходомер, ако се използва (производител, принцип на измерване),

—	система за записване и обработка на данните (хардуер и софтуер).

2.2.3.   Калибровка на системата

—	подробно описание на метода, използван за построяване на калибрационната крива,

—	информация за критериите за качество при този метод (например корелационен коефициент, квадратична сума на грешките, и т.н.),

—	информация за всички екстраполации, допускания и приближения, направени по време на експерименталната процедура, а също оценката и обработката на данните,

—

всички измервания, използвани за построяване на калибрационната крива, трябва да са документирани в таблица, която включва следната информация за всяка калибрационна точка: — име на пробата, — производител на пробата, — характерни стойности на стандартите Mp, Mn, Mw и Mw/Mn, дадени от производителя или получени при последващи измервания, заедно с подробностите за метода на определяне, — инжекторен обем или инжекторна концентрация, — стойност на Mp, използвана за калибровка, — елуиращ обем или коригирано време на задържане, измерено в максималния пик, — Mp, изчислено при максималния пик, — процентна грешка на изчисленото Mp и калибрационната стойност.

2.2.4.   Оценка:

—	оценка на база време: методи, използвани за обезпечаване на необходимата възпроизводимост (метод на корекция, вътрешен стандарт и т.н.),

—	информация за това дали оценката е била извършена на базата на елуиращия обем или на база времето на задържане,

—	информация за лимитите на оценката, ако пикът не е напълно анализиран,

—	описание на методите за изглаждане, ако са използвани такива,

—	подготовка и предварителни процедури преди обработката на пробата,

—	наличие на неразтворени частици, ако има,

—	инжекторен обем (µl) и инжекторна концентрация (mg/ml),

—	наблюдения, посочващи ефекти, които водят до отклонения от идеалния GPC профил,

—	подробно описание на всички модификации в тестовите процедури,

—	подробности за диапазоните на грешките,

—	всякаква друга информация и наблюдения, подходящи за интерпретация на резултатите.

3.   ПОЗОВАВАНИЯ

(1)	DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2)	Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3)	ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4)	ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Приложение

Примери за други методи за определяне на средното бройно молекулно тегло (Mn) за полимери

Хроматографският метод с гел-инфилтрация (GPC) е предпочитания метод за определяне на Mn, особено когато има набор от стандарти, чиято структура е сравнима с полимерната структура. Независимо от това, било поради практически трудности при използването на GPC или поради очакването, че веществото няма да отговори на задължителните критерии за Mn (което води до потвърждаване), се срещат алтернативни методи, като например:

1.   Употреба на колигативни свойства

1.1.   Ебулиоскопия/криоскопия: включват измерване на повишаването на точката на кипене (ебулиоскопия) или понижаването на точката на замръзване (криоскопия) на разтворител при прибавяне на полимер. Този метод се базира на факта, че ефекта от разтворения полимер върху точката на кипене/замръзване на течността зависи от молекулното тегло на полимера (1) (2).

Приложимост: Mn < 20 000.

1.2.   Понижаване на парното налягане: включва измерване на парното налягане на избрана еталонна течност преди и след прибавянето на определени количества полимер (1) (2).

Приложимост: Mn < 20 000 (теоретично; на практика обаче лимитирана стойност).

1.3.   Мембранна осмометрия: основава се на принципа на осмозата, т.е. естествената тенденция на молекулите на разтворителя да преминават през полупропускливата мембрана от разреден към концентриран разтвор, за да се получи равновесие. В теста разреденият разтвор е с нулева концентрация, докато концентрирания разтвор съдържа полимера. Ефектът на преминаване на разтворителя през мембраната причинява разлика в налягането, която зависи от концентрацията и молекулното тегло на полимера (1) (3) (4).

Приложимост: Mn: между 20 000—200 000.

1.4.   Осмометрия в парова фаза: включва сравнение на скоростта на изпаряване на чист аерозолен разтворител спрямо поне три аерозола, съдържащи полимера в различни концетрации (1) (5) (6).

Приложимост: Mn < 20 000.

2.   Анализ на групата, прекъсваща нарастването на веригата

За да се използва този метод са необходими както познания за общата структура на полимерите, така и за естеството на групите, прекъсващи нарастването на веригата (която трябва да се разграничава от основния скелет по, например, NMR или титруване/дериватизация). Определянето на молекулната концентрация на прекъсващите групи, присъстващи в полимера, може да доведе до стойност за молекулното тегло (7) (8) (9).

Приложимост: Mn до 50 000 (с намаляваща надеждност).

ПОЗОВАВАНИЯ

(1)	Billmeyer, F. W. Jr., (1984). Textbook of Polymer Science, 3rd Edn., John Wiley, New York.

(2)	Glover, C. A., (1975). Absolute Colligative Property Methods. Chapter 4. In: Polymer Molecular Weights, Part I P. E. Slade, Jr. ed., Marcel Dekker, New York.

(3)	ASTM D 3750-79, (1979). Standard Practice for Determination of Number-Average Molecular Weight of Polymers by Membrane Osmometry. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4)	Coll, H. (1989). Membrane Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., J. Wiley and Sons, pp. 25 to 52.

(5)	ASTM 3592-77, (1977). Standard Recommended Practice for Determination of Molecular Weight by Vapour Pressure, American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania. EN Official Journal of the European Communities 16. 11. 98 L 305/150

(6)	Morris, C. E. M., (1989). Vapour Pressure Osmometry. In: Determination of Molecular Weight, A. R. Cooper ed., John Wiley and Sons.

(7)	Schrîder, E., MÅller, G., and Arndt, K-F., (1989). Polymer Characterisation, Carl Hanser Verlag, Munich.

(8)	Garmon, R. G., (1975). End-Group Determinations, Chapter 3. In: Polymer Molecular Weights, Part I, P. E. Slade, Jr. ed. Marcel Dekker, New York.

(9)	Amiya, S., et al. (1990). Pure and Applied Chemistry, 62, 2139-2146.

---

ПРИЛОЖЕНИЕ III Б

A.19. НИСКОМОЛЕКУЛНО ТЕГЛОВНО СЪДЪРЖАНИЕ НА ПОЛИМЕРИ

1.   МЕТОД

Този хроматографски метод с гел-инфилтрация е точно копие на метода ОИСР TG 119 (1996 г.). Основните принципи и по-нататъшна техническа информация са дадени в позоваванията.

1.1.   Увод

Тъй като свойствата на полимерите са много разнообразни, невъзможно е да се опише един единствен метод, установяващ точно условията за сепарация и оценка, който да обхваща възможностите и спецификата, които се получават при сепарацията на полимерите. По-специално сложните полимерни системи често не се поддават на хроматография с гел-инфилтрация (GPC). Когато GPC е неприложима, молекулното тегло се определя с помощта на други методи (виж приложението). В такива случаи, пълните подробности и оценката се правят на база използвания метод.

Описаният метод се базира на DIN стандарт 55672 (1). В този DIN стандарт може да се намери подробна информация за това как да се извършат експериментите и как да се оценят данните. В случай, че са необходими модификации на експерименталните условия, тези промени трябва да бъдат оправдани. Могат да се използват и други стандарти, ако са напълно подходящи. Описаният метод използва проби от полистирол с позната полидисперсност за калибровка и може да се наложи да бъде променен, с цел да бъде подходящ за определени полимери, например водоразтворими полимери и полимери с дълги разклонени вериги.

1.2.   Определения и единици

Нискомолекулното тегло условно се определя като молекулно тегло под 1 000 далтона.

Средното бройно молекулно тегло Mn и средното тегловно молекулно тегло Mw се определят с помощта на следните уравнения:

където,

Hi	е нивото на детекторния сигнал от базовата линия на обема на задържане Vi,
Mi	е молекулното тегло на полимерната фракция при обема на задържане Vi, и
n	е броят на точките с данни.

Широчината на разпределение на молекулното тегло, която е мярка за дисперсността на системата, се изразява чрез съотношението Mw/Mn.

1.3.   Еталонни вещества

Тъй като GPC e относителен метод, трябва да се извърши калибровка. За целта обикновено се използват полистиролови стандарти с линеен строеж и тясно разпределение, с познати средни молекулни тегла Mn и Mw и познато молекулно тегловно разпределение. Калибрационната крива може да се използва само при определяне на молекулното тегло на непозната проба, ако условията за разделяне на пробата и стандартите са били подбрани по идентичен способ.

Една установена връзка между молекулното тегло и елуиращия обем е валидна само при специфичните условия на дадения експеримент. Условията включват, преди всичко, температурата, разтворителя (или сместа от разтворители), хроматографските условия и сепарационната колона или система от колони.

Молекулните тегла на пробата, определени по този начин, са относителни стойности и се описват като „полистиролови еквивалентни молекулни тегла“. Това означава, че в зависимост от структурните и химически различия между пробата и стандартите, молекулните тегла могат да се отклоняват от абсолютните стойности в по-голяма или по-малка степен. Ако се използват други стандарти, например полиетиленгликол, полиетиленов окис, полиметил метакрилат, полиакрилна киселина, то трябва да се посочи причината за това.

1.4.   Принцип на тестовия метод

Както разпределението на молекулното тегло на пробата, така и нейните средни молекулни тегла (Mn, Mw) могат да се определят чрез GPC. GPC е специален тип течна хроматография, при която пробата се сепарира според хидродинамичните обеми на отделните съставни части (2).

Сепарацията се извършва като пробата преминава през колона, която е пълна с порест материал, обикновено органичен гел. Малките молекули могат да проникват през порите, докато големите молекули не могат. Следователно пътеката на по-големите молекули е по-къса и те елуират първи. Молекулите със среден размер проникват през някои от порите и елуират по-късно. Най-малките молекули, със среден хидродинамичен радиус, по-малък от този на порите на гела, могат да проникват през всички пори. Те елуират последни.

В идеалния случай сепарацията се контролира изцяло от размера на молекулните видове, но на практика е трудно да се избегнат поне някои от абсорбционнните ефекти, които смущават процеса. Неравномерната облицовка на колоната и мъртвите обеми могат да влошат ситуацията (2).

Детекцията се извършва например чрез рефрактивен индекс или UV-абсорбция и се получава проста крива на разпределението. За да се прибавят обаче действителните стойности на молекулните тегла към кривата, е необходимо да се калибрира колоната, като през нея се пуснат полимери с известно молекулно тегло и в идеалния случай, с доста широка подобна структура, например различни полистиролови стандарти. Резултатите са една типична крива на Gaussian, на места изкривена от малка опашка по посока на страната с ниско молекулно тегло, като вертикалната ос показва количеството, по тегло, на различните елуирани видове молекулни тегла, а хоризонталната ос показва регистрираното молекулно тегло.

Съдържанието на нискомолекулно тегло се получава от тази крива. Изчислението може да бъде точно, само ако нискомолекулните видове реагират еквивалентно на база маса спрямо полимера като цяло.

1.5.   Критерии за качество

Повторяемостта (Относително стандартно отклонение - Relative Standard Deviation: RSD) на елуиращия обем трябва да бъде по-добра от 0,3 %. Желаната повторяемост на анализа трябва да се гарантира чрез корекция през вътрешен стандарт, ако хроматограмата се оценява в зависимост от времето и не отговаря на горепосочените критерии (1). Полидисперсностите зависят от молекулните тегла на стандартите. В случая с полистиролови еталони, типичните стойности са:

Mp < 2 000	Mw/Mn < 1,20
2 000 ≤ Mp ≤ 106	Mw/Mn < 1,05
Mp > 106	Mw/Mn < 1,20

(Mp е молекулното тегло на еталона при максималния пик)

1.6.   Описание на тестовия метод

1.6.1.   Подготовка на стандартните полистиролови разтвори

Полистироловите стандарти се разтварят чрез внимателно смесване в избрания елуент. При подготовката на разтворите трябва да се вземат предвид препоръките на производителя.

Концентрациите на избраните стандарти зависят от различни фактори, например обем на инжектиране, вискозитет на разтвора и чувствителност на аналитичния детектор. Максималният обем на инжектиране трябва да се адаптира към дължината на колоната с цел да се избегне претоварване. Типичните обеми на инжектиране за аналитична сепарация чрез GPC с колона 30 cm × 7,8 mm, са обикновено между 40 и 100 µl. Възможни са и по-големи обеми, но те не трябва да превишават 250 µl. Оптималното съотношение между обема на инжектиране и концентрацията трябва да се определи преди действителната калибровка на колоната.

1.6.2.   Подготовка на разтвора проба

Принципно, при подготовката на разтворите проби се прилагат същите изисквания. Мострата се разтваря в подходящ разтворител, например тетрахидрофуран (THF), чрез старателно разклащане. Тя не трябва при никакви обстоятелства да се разтваря с помощта на ултразвукова баня. Когато е необходимо, разтворът проба се пречиства през мембранен филтър с размер на порите между 0,2 и 2 µm.

Присъствието на неразтворени частици трябва да се отчете във финалния протокол, тъй като тези частици може да се дължат на високомолекулни видове. Трябва да се използва подходящ метод за определяне процента на теглото на разтворените частици. Разтворите трябва да се използват в рамките на 24 часа.

1.6.3.   Корекция за съдържанието на примеси и добавки.

Обикновено не се налага корекцията на съдържанието на видове с M < 1 000 поради приноса от присъстващите неполимерни специфични компоненти (например, примеси и/или добавки), освен ако измереното съдържание е вече < 1 %. Това се постига чрез пряк анализ за полимерния разтвор или GPC елуат.

В случаите, когато елуатът, след преминаване през колоната, е твърде разреден за по-нататъшен анализ, той трябва да се концентрира. За целта може би е ще е необходимо да се изпари елуата до изсушаване и да се разтвори отново. Концентрацията на елуата трябва да се извърши при условия, които да не допускат никакви промени в елуата. Обработката на елуата след GPC зависи от използвания аналитичен метод за количествено определяне.

1.6.4.   Апаратура

GPC апаратурата се състои от следните компоненти:

—	резервоар за разтворител,

—	дегазатор (когато е уместно),

—

помпа,

—	гасител на пулсации (когато е уместно),

—	инжекторна система,

—	хроматографски колони,

—

детектор,

—	разходомер за дебит (когато е уместно),

—	процесор-рекордер за данни,

—	съд за отпадъци.

Трябва да се гарантира, че GPC системата е инертна по отношение на използваните разтворители (например, чрез използване на стоманени капиляри за THF-разтворителя).

1.6.5.   Система за инжектиране и подаване на разтворител

Към колоната се подава определен обем разтвор на пробата, било автоматично или ръчно в строго определена зона. Твърде бързото издърпване или натискане на буталото на помпата, ако се прави ръчно, може да причини промени в наблюдаваното разпределение на молекулното тегло. Системата за подаване на разтворител трябва, доколкото е възможно, да няма пулсации, включвайки гасител на пулсации в идеалния случай. Дебитът е от порядъка на 1 ml/min.

1.6.6.   Колона

В зависимост от пробата, полимерът може да се охарактеризира или с помощта на проста колона или чрез няколко колони, свързани последователно. На пазара се предлагат порести материали за колони с определени свойства (например, размер на порите, лимити на изключване). Изборът на сепарационен гел или на дължина на колоната зависи както от свойствата на пробата (хидродинамични обеми, разпределение на молекулното тегло), така и от специфичните условия за сепарация като разтворител, температура и дебит (1) (2) (3).

1.6.7.   Теоретични пластини

Колоната или комбинацията от колони, използвани за сепарация, трябва да се охарактеризират чрез броя на теоретичните пластини. Това включва, в случая на THF като елуиращ разтворител, подаване на разтвор на етилбензол или друг подходящ неполярен разтвор към колона с известна дължина. Броят на теоретичните пластини се определя чрез следното уравнение:

или

където,

N	е броят на теоретичните пластини
Ve	е елуиращият обем при максималния пик
W	е пикът на широчината на базовата линия
W 1/2	е пиковата широчина при половин височина.

1.6.8.   Сепарационна производителност

Освен броя на теоретичните пластини, който е количество, определящо широчината на зоната, известна роля играе и сепарационната производителност, която се определя от стръмността на калибрационната крива. Сепарационната производителност на една колона се получава от следната зависимост:

където,

VeyMx	е елуиращият обем за полистирол с молекулно тегло Мх
V ey(10Mx)	е елуиращият обем за полистирол с 10 пъти по-голямо молекулно тегло.

Резолюцията на системата обикновено се определя както следва:

където,

Ve1, Ve2	са елуиращите обеми на двата полистиролови стандарта в максималния пик
W1, W2	са пиковите широчини в базовата линия
M1, M2	са молекулните тегла в максималния пик (трябва да се различава с коефициент 10).

R-стойността на системата колони трябва да бъде по-голяма от 1,7 (4).

1.6.9.   Разтворители

Всички разтворители трябва да бъдат с висока чистота (за THF се използва чистота 99,5 %). Резервоарът за разтворител (ако е необходимо в атмосфера от инертен газ) трябва да е достатъчно голям за калибровката на колоната и няколко анализи на проби. Разтворителят трябва да се дегазира, преди да бъде транспортиран през помпата.

1.6.10.   Температурен контрол

Температурата на критичните вътрешни компоненти (инжекторна верига, колони, детектор и тръбна инсталация) трябва да бъде постоянна и съвместима с избора на разтворител.

1.6.11.   Детектор

Предназначението на детектора е да отчита количествено концентрацията на пробата, елуирала от колоната. С цел да се избегне ненужното разширяване на пиковете, обемът на кюветката на детекторната клетка трябва да се поддържа възможно най-малък. Той не трябва да бъде по-голям от 10 µl освен при разсейване и детектори за вискозитет. За детекция обикновено се използва диференциална рефрактометрия. Въпреки това, ако специфичните свойства на пробата или на елуиращия разтвор го изискват, могат да се използват други видове детектори, например UV/VIS, IR, детектори за вискозитет и т.н.

2.   ДАННИ И ОТЧИТАНЕ

2.1.   Данни

За подробни оценъчни критерии, както и за изискванията относно събирането и обработката на данни, трябва да се обърнете към DIN стандарт (1).

За всяка проба трябва да се извършат два независими опита. Те се анализират индивидуално. При всички случаи е важно да се определят също данните от контролните опити, обработени при същите условия както пробата.

Необходимо е изрично да се посочи, че измерените стойности са относителни стойности, еквивалентни на молекулните тегла на използвания стандарт.

След определяне на обемите на задържане или времената на задържане (които може би са коригирани чрез вътрешен стандарт), регистрираните Mp стойности (Mp като максимален пик на калибрационния стандарт) се изчертават спрямо едно от тези количества. Необходими са поне две калибрационни точки за една декада молекулни тегла, и поне пет измервателни точки са необходими за цялата крива, които трябва да покриват очакваното молекулно тегло на пробата. Прекъсващата точка с нискомолекулно тегло на калибрационната крива се определя от n-хексилбензола или друг подходящ неполярен разтворител. Частта от кривата, съответстваща на молекулни тегла под 1 000 се определя и коригира както е необходимо за примеси и добавки. Елуиращите криви обикновено се оценяват чрез електронна обработка на данните. В случай, че се използва ръчна цифровизация на данните, може да се обърнете към ASTM D 3536-91 (3).

Ако в колоната се задържи някакъв неразтворим полимер, неговото молекулно тегло вероятно ще бъде по-високо от това на разтворимата фракция, и ако не се отчете, ще резултира в надценяване на съдържанието на нискомолекулно тегло. В приложението има ръководство за съдържание на нискомолекулно тегло за неразтворим полимер.

Кривата на разпределението трябва да се направи под формата на таблица или като диаграма (диференциална честота или сума на процентите спрямо отчетените M). При графичното представяне, една декада от молекулни тегла трябва да има около 4 cm широчина и максималния пик да има около 8 cm височина. При интегрални криви на разпределение, разликата в ординатата между 0 и 100 % трябва да бъде около 10 cm.

2.2.   Протокол от теста

Протоколът от теста включва следна информация:

2.2.1.   Тестово вещество

—	налична информация за тестовото вещество (идентичност, добавки, примеси),

—	описания на обработката на пробата, наблюдения, проблеми.

2.2.2.   Оборудване

—	резервоар за елуент, инертен газ, дегазиране на елуента, състав на елуента, примеси,

—	помпа, гасител на пулсации, инжекторна система,

—	сепарационни колони (производител, пълна информация за характеристиките на колоните, като размер на порите, вид на сепарационния материал, брой, дължина и ред на използваните колони),

—	брой на теоретичните пластини на колоната (или комбинацията от колони), сепарационна производителност (резолюция на системата),

—	информация за симетрията на пиковете,

—	температура на колоната, вид на температурния контрол,

—	детектор (принцип на измерване, тип, обем на кюветката),

—	разходомер, ако се използва (производител, принцип на измерване),

—	система за записване и обработка на данните (хардуер и софтуер).

2.2.3.   Калибровка на системата

—	подробно описание на метода, използван за посторяване на калибрационната крива,

—	информация за критериите за качество при този метод (например корелационен коефициент, квадратична сума на грешките и т.н.),

—	информация за всички екстраполации, допускания и приближения, направени по време на експерименталната процедура, а също оценката и обработката на данните,

—

всички измервания, използвани за построяване на калибрационната крива, трябва да са документирани в таблица, която включва следната информация за всяка калибрационна точка: — име на пробата, — производител на пробата, — характерни стойности на стандартите Mp, Mn, Mw and Mw/Mn, дадени от производителя или получени при последващи измервания, заедно с подробностите за метода на определяне, — инжекторен обем или инжекторна концентрация, — стойност на Mp, използвана за калибровка, — елуиращ обем или коригирано време на задържане, измерено в максималния пик, — Mp, изчислено при максималния пик, — процентна грешка на изчисленото Mp и калибрационната стойност.

2.2.4.   Информация за съдържанието на полимер с нискомолекулно тегло

—	описание на методите, използвани в анализа и начина, по който са проведени експериментите,

—	информация за процента на съдържанието на видове полимери с нискомолекулно тегло (w/w), отнесен към общата проба,

—	информация за примесите, добавките и други неполимерни видове, в тегловен процент, отнесен към общата проба.

2.2.5.   Оценка

—	оценка на база време: всички методи, използвани за обезпечаване на необходимата възпроизводимост (метод на корекция, вътрешен стандарт и т.н.),

—	информация за това дали оценката е била извършена на базата на елуиращия обем или на база времето на задържане,

—	информация за лимитите на оценката, ако пикът не е напълно анализиран,

—	описание на методите за изглаждане, ако са използвани такива,

—	подготовка и предварителни процедури преди обработката на пробата,

—	наличие на неразтворени частици, ако има,

—	инжекторен обем (µl) и инжекторна концентрация (mg/ml),

—	наблюдения, посочващи ефекти, които водят до отклонения от идеалния GPC профил,

—	подробно описание на всички модификации в тестовите процедури,

—	подробности за диапазоните на грешките,

—	всякаква друга информация и наблюдения, подходящи за интерпретация на резултатите.

3.   ПОЗОВАВАНИЯ

(1)	DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2)	Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3)	ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4)	ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

Приложение

Ръководство за коригиране нискомолекулното съдържание за присъствието на неразтворим полимер

Когато в една проба присъства неразтворим полимер, това резултира в загуба на маса по време на GPC-анализа. Неразтворимият полимер необратимо се задържа върху колоната или филтъра за пробата, докато разтворимата част преминава през колоната. В случая, когато може да се изчисли или измери нарастването (dn/dc) на рефрактивния индекс на полимера, е възможно да се изчисли и загубата на маса на пробата в колоната. В този случай се прави корекция с помощта на външна калибровка със стандартни материали с позната концентрация и (dn/dc), за да се калибрира реакцията на рефрактометъра. В дадения тук пример е използван поли(метилметакрилат) (pMMA) стандарт.

При външна калибровка за анализ на акрилни полимери, един pMMA стандарт с позната концентрация в тетрахидрофуран, се анализира чрез GPC и получените данни се използват за намиране на константата на рефрактометъра съгласно уравнението:

K = R/(C × V × dn/dc)

където,

K	е рефрактометричната константа (в микроволтсекунда/ml)
R	е реакцията на pMMA стандарта (в микроволтсекунда)
C	е концентрацията на pMMA стандарта (в ml/mg)
V	е инжекторният обем (в ml), и
dn/dc	е нарастването на рефрактивния индекс за pMMA в тетрахидрофуран (в ml/mg).

Следните данни са типични за един pMMA стандарт:

R	=	2 937 891
C	=	1,07 mg/ml
V	=	0,1 ml
dn/dc	=	9 × 10-5ml/mg.

Резултантната K стойност, 3,05 × 1011 се използва за изчисление на теоретичната детекторна реакция, ако 100 % от инжектирания полимер е елуирал през детектора.

---

ПРИЛОЖЕНИЕ III В

A.20. ПОВЕДЕНИЕ НА РАЗТВАРЯНЕ/ЕКСТРАКЦИЯ НА ПОЛИМЕРИ ВЪВ ВОДА

1.   МЕТОД

Описаният метод е точно копие на преработената версия на ОИСР TG 120 (1997 г.). По-нататъшна техническа информация е дадена в позоваване (1).

1.1.   Увод

За някои полимери като емулсионните полимери например, вероятно ще бъде необходима първоначална подготвителна работа, преди да се използва описания по-долу метод. Този метод не е приложим за течни полимери и за полимери, които взаимодействат с вода при условията на теста.

Когато методът не е практичен или възможен, поведението на разтваряне/екстракция може да се изследва чрез други методи. В такива случаи трябва да се дадат пълни подробности и причини за използвания метод.

1.2.   Еталонни вещества

Няма.

1.3.   Принцип на тестовия метод

Поведението на разтваряне/екстракция на полимерите във водна среда се определя с помощта на метод с колба (вижте A.6 разтворимост във вода, метод с колба) с модификациите, описани по-долу.

1.4.   Критерии за качество

Няма.

1.5.   Описание на тестовия метод

1.5.1.   Оборудване

За метода се изисква следното оборудване:

—	устройство за надробяване, например мелница за производство на частици с определен размер,

—	апаратура за разбъркване с възможност за температурен контрол,

—	мембранна филтърна система,

—	подходящо аналитично оборудване,

—	стандартизирани сита.

1.5.2.   Подготовка на пробата

Една представителна проба първо се довежда до размер на частиците между 0,125 и 0,25 mm с помощта на подходящи сита. Може да е необходимо да се извърши охлаждане за устойчивостта на пробата или за процеса на смилане. Материалите с каучуково естество се раздробяват при температурата на течния азот (1).

Ако не се получи фракция с желания размер на частиците, трябва да се предприемат действия за намаляване на размера на частиците доколкото е възможно, и резултата да се отчете. В протокола е необходимо да се посочи начина, по който раздробената проба е съхранявана преди теста.

1.5.3.   Процедура

Три проби по 10 g от тестовото вещество се претеглят във всеки един от трите съда, снабдени със стъклени запушалки и към всеки съд се добавя по 1 000 ml вода. Ако се докаже, че количеството от 10 g е непригодно, се използва следващото най-голямо количество и обемът вода се напасва съответно.

Съдовете се запушват плътно и след това се разбъркват при 20 °C. За целта се използва прибор за разбъркване или разклащане, който да работи при постоянна температура. След период от 24 часа, съдържанието на всеки съд се центрофугира или филтрира и концентрацията на полимера в бистрата водна фаза се определя чрез подходящ аналитичен метод. Ако няма подходящи аналитични методи за водната фаза, общата разтворимост/екстракция може да се изчисли от сухото тегло на филтърния остатък или центрофугираната утайка.

Обикновено е необходимо да се разграничат количествено примесите и добавките от една страна, и нискомолекулните видове от друга. При гравиметричното определяне е важно също да се извърши да се извърши контролен (празен тест), без тестово вещество, за да се отчетат остатъците, които се появяват при процедурата на експеримента.

Поведението на разтворимост/екстракция на полимерите във вода при 37 °C и pH 2 и pH 9 се определя по същия начин, описан по-горе за провеждането на експеримента 20 °C. Стойностите за pH могат да се постигнат чрез добавяне или на подходящи буферни разтвори или на подходящи киселини или основи като солна киселина, оцетна киселина, аналитичен натриев или калиев хидроокис или NH3.

В зависимост от използвания метод за анализ, трябва да се извършат един или два теста. Когато са налице достатъчно специфични методи за директен анализ на водната фаза за полимерната компонента, един тест като описания по-горе би бил достатъчен. Ако обаче не са налице такива методи и определянето на поведението на разтворимост/екстракция на полимера се ограничава до индиректен анализ чрез определяне само на общото съдържание на въглерод (ТОС) на водния екстракт, трябва да бъде проведен допълнителен тест. Този допълнителен тест също трябва да бъде извършен три пъти, като се използват 10 пъти по-малки проби от полимера и същите количества вода, като тези, използвани в първия тест.

1.5.4.   Анализ

1.5.4.1.   Тест, проведен с един обем проба

Съществуват методи за директен анализ на полимерните компоненти във водната фаза. Алтернативно, може да се използва и индиректния анализ на разтворени/екстрахирани полимерни компоненти, чрез определяне на общото съдържание на разтворими части и коригиране за неполимерни специфични компоненти във водната фаза.

Анализ на водната фаза за общите полимерни видове е възможен:

било чрез достатъчно чувствителен метод например: — ТОС, използващ изваряване на персулфат или дихромат, за да се получи CO2, последван от изчисление чрез IR или химичен анализ, — атомна абсорбционна спектрометрия (AAS) или нейния индуктивно куплиран плазмен (ICP) емисионен еквивалент за силиций или полимери, съдържащи метали, — UV абсорбция или спектрофлуорометрия за арилни полимери, — LC-MS за нискомолекулни проби,

или чрез вакуумно изпарение до изсушаване на водния екстракт и спектроскопен (IR, UV и т.н.) или AAS/ICP анализ на остатъка.

Ако анализа на водната фаза като такъв, не е приложим, водният екстракт трябва да се екстрахира с органичен разтворител, който не се смесва с вода, например хлориран въглеводород. Разтворителят тогава се изпарява и остатъка се анализира както е описано по-горе, за оповестеното съдържание на полимера. Всички компоненти в този остатък, идентифицирани като примеси или добавки, трябва да се извадят за целите на определянето на степента на разтворимост/екстракция на самия полимер.

Когато присъстват относително големи количества от такива материали, може би ще е необходимо да се направи анализ на остатъка, например HPLC или GC анализ, за да се разграничат примесите от мономера и присъстващите видове, получени от мономера, така че да бъде определено истинското съдържание на последния.

В някои случаи може да е достатъчно просто изпаряване на органичния разтворител до изсушаване и претегляне на сухия остатък.

1.5.4.2.   Тест, проведен с два различни обема проба

Всички водни екстракти се анализират за TOC.

Извършва се гравиметрично определяне на неразтворената/неекстрахиралата част на пробата. Ако след центрофугирането или филтрирането на съдържанието на всеки съд, полимерните остатъци останат залепнали към стената на съда, то съдът трябва да се изплаква с филтрата, докато се изчисти от всички видими остатъци. След това филтрата отново се центрофугира или филтрира. Остатъците, останали върху филтъра или в центрофугиращата тръба, се изсушават при 40 °C във вакуум и се претеглят. Сушенето продължава, докато се достигне постоянно тегло.

2.   ДАННИ

2.1.   Тест, проведен с един обем проба

Индивидуалните резултати за всяка от трите колби и средните стойности се посочват и изразяват в единици за маса/обем на разтвора (обикновено mg/l) или за маса на полимера (обикновено mg/g). Освен това се посочват загубата на тегло на пробата (изчислена като тегло на разтвора, разделено на началното тегло на пробата). Трябва да се изчислят и относителните стандартни отклонения (RSD). Посочват се индивидуалните цифри за общото количество вещество (полимер + съществени добавки и т.н.) и само за полимера (т.е. след изваждане на участието от такива добавки).

2.2.   Тест, проведен с два различни обема проба

Индивидуалните TOC стойности на водните екстракти на два тройни експеримента и средната стойност за всеки експеримент се посочват като единици за маса/обем на разтвора (обикновено mgС/l), както и като единици за маса/тегло на първоначалната проба (обикновено mgС/g).

Ако няма разлика между резултатите при най-високото и най-ниското съотношение проба/вода, това може да означава, че всички ектрахируеми компоненти наистина са били екстрахирани. В такъв случай обикновено не е необходим директен анализ.

Индивидуалните тегла на остатъците се посочват и изразяват в процент от началните тегла на пробите. Средните стойности се изчисляват за всеки експеримент. Разликите между 100 и процентите, които се получават, представляват процента на разтворения и екстрахирал материал в първоначалната проба.

3.   ОТЧИТАНЕ

3.1.   Протокол от теста

Протоколът от теста трябва да включва следна информация:

3.1.1.   Тестово вещество

—	налична информация за тестовото вещество (идентичност, добавки, примеси, съдържание на нискомолекулни видове).

3.1.2.   Условия на експеримента

—	описание на използваните процедурите и условията на експеримента,

—	описание на аналитичните методи и методите за детекция.

3.1.3.   Резултати

—	резултати за разтворимост/екстрахируемост в mg/l; индивидуални усреднени стойности за тестовете на екстракция при различните разтвори, с разбивка за съдържание на полимер и примеси, добавки и т.н.,

—	резултати за разтворимост/екстрахируемост в mg/l на полимера,

—	TOC-стойности на водни екстракти, тегло на разтвора и изчислените проценти, ако са измерени,

—	pH на всяка проба,

—	информация за контролните стойности,

—	когато е необходимо, указания за химичната неустойчивост на тестовото вещество, както по време на тестовия процес, така и по време на аналитичния процес,

—	цялата информация, която е важна за интерпретацията на резултатите.

4.   ПОЗОВАВАНИЯ

(1)	DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

---

ПРИЛОЖЕНИЕ III Г

C.13 БИОКОНЦЕНТРАЦИЯ: ПРОТОЧЕН ТЕСТ ВЪРХУ РИБИ

1.   МЕТОД

Настоящият метод на биоконцентрация е точно копие на ОИСР TG 305 (1996 г.).

1.1.   Увод

Настоящият метод описва процедура за охарактеризиране на биоконцентрационния потенциал на вещества в риба при проточни условия. Въпреки, че проточните тестови режими са за предпочитане, полустатичните режими също са допустими, при условие че са удовлетворени критериите за валидност.

Методът дава достатъчно подробности за извършване на теста, като същевременно допуска задоволителна свобода за адаптиране на експерименталния проект към условията в отделните лаборатории и по отношение на променящите се характеристики на тестовите вещества. Той се прилага най-успешно при стабилни органични химикали със стойности log Pow между 1,5 и 6,0 (1), но може да се прилага към суперлипофилни вещества (с log Pow > 6,0). Предварителната оценка на коефициента на биоконцентрация (BCF), понякога отбелязван като KB, за такива суперлипофилни вещества вероятно ще бъде по-голяма от стойността на коефициента на биоконцентрация в устойчиво състояние (BCFSS), която се очаква при лабораторни експерименти. Предварителните оценки на коефициента на биоконцентрация за органични химикали с log Pow-стойности до около 9,0 могат да се получат чрез използване на уравнението на Bintein et al (2). Параметрите, които характеризират биоконцентрационния потенциал, включват константата на скорост на поглъщане (k1), константата на скорост на очистване (k2) и BCFSS.

Радиомаркираните тестови вещества могат да улеснят анализа на водата и на пробите риба и могат да се използват за определяне на това, дали да се прави идентификация за израждане и количествена оценка. Ако се измерят общите радиоактивни отпадъци (например чрез изгаряне или разтваряне на тъкани), то BCF се базира на основното съединение, на всички задържани метаболити, а също и на асимилирания въглерод. Коефициентите BCF, базирани на общите радиоактивни отпадъци, могат следователно да се сравняват директно с BCF, получен при специфичен химически анализ само на основното съединение.

При радиомаркирани изследвания може да се използват процедури за очистване, за да се определи BCF, базиран на основното съединение, а главните метаболити се охарактеризират, ако се счете за необходимо. Възможно е също да се комбинира изследване на метаболизма при рибите с изследване на биоконцентрацията, чрез анализ и идентификация на отпадъците в тъканите.

1.2.   Определения и единици

Биоконцентрация/биоакумулиране е увеличението в концентрацията на тестовото вещество в или върху организъм (определени негови тъкани), отнесено към концентрацията на тестовото вещество в заобикалящата среда.

Коефициентът на биоконцентрация (BCF или KB) по всяко време на фазата на поглъщане в този акумулиращ тест, е концентрацията на тестовото вещество в/върху рибата или определени нейни тъкани (Cf като μg/g (ppm)), разделено на концентрацията на химикала в окръжаващата среда (Cw като μg/ml(ppm)).

Коефициент на биоконцентрация в устойчиво състояние (BCFSS или KB) не се променя съществено за дълъг период от време, като концентрацията на тестовото вещество в окръжаващата среда през този период е константа.

Равна линия (плато) или устойчиво състояние на графиката на тестовото вещество в рибата (Cf) спрямо времето, се достига когато кривата стане успоредна на времевата ос и се направени три успешни анализа на Cf на проби, взети на интервали от поне два дни, които три анализа не се отличават с повече от ± 20 % един от друг, и няма никакви съществени разлики между трите периода на вземане на проба. Когато се анализират обединени проби, са необходими поне четири успешни анализа. За тестови вещества, които са взети бавно, е по-подходящо интервалите да бъдат по седем дни.

Коефициентите на биоконцентрация, изчислени директно от константите на кинетичната скорост (k1/k2), се определят като кинетичен коефициент на концентрация, BCFk.

Коефициентът на разпределение октанол-вода (Pow) е съотношението на химичната разтворимост в n-октанол и водата при равновесно състояние (метод A.8), изразяван също като Kow. Логаритъмът от Pow се използва като индикация на химичния потенциал за биоконцентрация при водни организми.

Фазата на излагане или поглъщане е времето, през което рибата е изложена на въздействието на тестовия химикал.

Константата на скорост на поглъщане (k1) е цифровата стойност, определяща скоростта на нарастване на концентрацията на тестовото вещество в/върху рибата, подложена на теста (или определени нейни тъкани), когато рибата е изложена на въздействието на този химикал (k1 се изразява в ден -1).

Фазата след излагането или очистването (загуба) е времето, което следва след прехвърлянето на тестовата риба от среда, съдържаща тестово вещество, към среда, несъдържаща такова вещество, през което време се изследва очистването (или нетната загуба) на веществото от тестовата риба (или определени нейни тъкани).

Константа за скорост на очистването (загуба) (k2) е цифровата стойност, определяща скоростта на намаляване на концентрацията на тестовото вещество в тестовата риба (или определени нейни тъкани), следваща прехвърлянето на тестовата риба от среда, съдържаща тестово вещество, към среда, несъдържаща такова вещество (k2 се изразява в ден–1).

1.3.   Принцип на тестовия метод

Тестът се състои от две фази: фаза на излагане на въздействие (поглъщане) и фаза след излагане (очистване). По време на фазата на поглъщането, отделни групи риба от един вид се излагат на поне две концентрации на тестовото вещество. След това те се прехвърлят в среда, несъдържаща тестово вещество. Фазата на очистването е необходима винаги, освен ако поглъщането на веществото по време на тази фаза е незначително (например, BCF е по-малко от 10). Концентрацията на тестовото вещество в/върху рибата (или определени нейни тъкани) се проследява по време на двете фази на теста. Освен двете тестови концентрации, една контролна група риби се държи при идентични условия с изключение отсъствието на тестово вещество, за да се отнесат възможните странични ефекти, наблюдавани при теста за биоконцентрация, към съответната контролна група и да се получат концентрации за тестовото вещество.

Фазата на поглъщането протича 28 дни, освен ако не се установи, че равновесието е достигнато по-рано. Предвиждане за дължината на фазата на поглъщането и времето за достигане на устойчиво състояние може да се направи на база уравнението в Приложение 3. След това започва периодът за очистване, като рибата се прехвърля към същата среда, но без тестово вещество, в друг чист съд. Когато е възможно, коефициента на биоконцентрация се изчислява, за предпочитане както чрез съотношението (BCFSS) на концентрацията на рибата (Cf) и във водата (Cw) при видимо устойчиво състояние, така и като коефициент за кинетична биоконцентрация (BCFk), като съотношение на константите на скоростта на поглъщането (k1) и очистването (k2), приемайки кинетика от първи ред. Ако не се получава с кинетика от първи ред, се използват по-сложни модели (приложение 5).

Ако устойчивото състояние не се постигне за 28 дни, фазата на поглъщането се удължава докато се постигне устойчиво състояние, или за още 60 дни, в зависимост от това кое ще се случи по-напред; след това започва фазата на очистването.

Константите на скоростта на поглъщането, на очистването (загуба), (или константите, при които се използват по-сложни модели), коефициента на биоконцентрация, и когато е възможно, доверителните граници на всеки един от тези параметри се изчисляват от модела, който най-добре описва измерените концентрации на тестовото вещество в рибата и водата.

BCF се изразява като функция на общото мокро тегло на рибата. За специални цели обаче, определени тъкани или органи (например, мускули, черен дроб) могат да се използват, ако рибата е достатъчно голяма или може да се раздели на ядивна част (филе) и неядивна част (вътрешности). Тъй като при много органични вещества има ясна връзка между потенциала за биоконцентрация и липофилността, то има също и съответна връзка между липидното съдържание на тестовата риба и наблюдаваната биоконцентрация на такива вещества. Следователно, за да се намали този източник на променливост в тестовите резултати за веществата с висока липофилност (т.е. с log Pow > 3), биоконцентрацията се изразява по отношение на липидно съдържание като допълнение към цялото телесно тегло.

Липидното съдържание се определя върху същия биологичен материал, който се използва за определяне на концентрацията на тестовото вещество, когато това е възможно.

1.4.   Информация за тестовото вещество

Преди провеждането на теста за биоконцентрация, трябва да се знае следната информация за тестовото вещество:

a)	разтворимост във вода;

б)	коефициент на разпределение октанол-вода Pow (обозначаван също като Kow, определен чрез HPLC-метода в A.8);

в)	хидролиза;

г)	фототрансформация във вода, определена при слънчево лъчене или при условия, симулиращи слънчево лъчене и при условия на лъчене на теста за биоконцентрация (3);

д)	повърхностно напрежение (т.е. за вещества, при които log Pow не може да се определи);

е)	парно налягане;

ж)	готово биологично разграждане (когато е уместно).

Друга необходима информация е токсичността към рибните видове, която се използва в теста, за предпочитане асимптотичен LC50 (т.е. независим по време). Необходими са подходящ аналитичен метод, с позната точност, прецизност и чувствителност, за количественото определяне на тестовото вещество в тестовите разтвори и биологичен материал, заедно с подробности за подготовката на пробата и нейното съхранение. Аналитичната граница за детекция на тестовото вещество както във вода, така и в рибните тъкани, трябва също да се познават. Когато се използва 14C маркирано тестово вещество, трябва да се знае процента радиоактивност, свързан с примесите.

1.5.   Валидност на теста

За да бъде валиден един тест, трябва да се прилагат следните условия:

—	температурното колебание да е по-малко от ± 2 °C,

—	концентрацията на разтворения кислород да не пада под 60 % насищане,

—	концентрацията на тестовото вещество в камерите да се поддържа в рамките на ± 20 % от усреднените величини на измерените стойности по време на фазата на поглъщане,

—

смъртността или други странични ефекти/болести както в контролната, така и в обработваната риба, да е по-малка от 10 % в края на теста; когато теста продължи повече от няколко седмици или месеци, смъртността или други странични ефекти в двата комплекта риба да е по-малка от 5 % за месец и да не превишава общо 30 %.

1.6.   Еталонни съединения

Използването на еталонни съединения с познат биоконцентрационен потенциал би било полезно при проверката на експерименталната процедура, когато е необходимо. Специфични вещества обаче все още не могат да се препоръчат.

1.7.   Описание на тестовия метод

1.7.1.   Апаратура

Трябва внимателно да се избягва използването на материали, за всички части от оборудването, които могат да разтворят, абсорбират или разтопят и да окажат страничен ефект върху рибата. Могат да се използват стандартни правоъгълни или цилиндрични резервоари, изработени от химически инертен материал, с подходящ обем спрямо скоростта на зареждане. За предпочитане е да се използва Teflon (R), неръждаема стомана и/или стъклени тръби, а използването на тръби от мека пластмаса да се ограничи до минимум. Опитът показва, че за вещества с високи коефициенти на абсорбция, като синтетични пиретроиди например, може да се изисква използването на силикатни стъкла. В такива ситуации оборудването трябва да се изхвърли след употреба.

1.7.2.   Вода

Обикновено в теста се използва натурална вода, която се взема от незамърсен източник с постоянно качество на водата. Водата за разреждане трябва да има качество, което да позволява оцеляването на избраните видове риба за периодите на аклиматизация и тест, без те да показват необичаен външен вид или поведение. В идеалния случай трябва да се демонстрира, че тестовите видове могат да оцеляват, да растат и да се възпроизвеждат в разреждащата вода (например, в лабораторна култура или тест за токсичност при жизнен цикъл). Водата трябва да се характеризира поне чрез pH, твърдост, общо съдържание на твърди частици, общо съдържание на органичен въглерод и, за предпочитане амониеви йони, нитрит и алкалност, а за морските видове и соленост. Параметрите, които са важни за оптималното физическо състояние, са напълно известни, но приложение 1 дава препоръчителните максимални концентрации за определен брой параметри за тест при сладководни и морски води.

Водата трябва да има постоянно качество по време на целия период на теста. Нейната pH трябва да е в границите на 6,0 до 8,5, но по време на даден тест, тя трябва да е в границите на ± 0,5 pH единици. С цел да се обезпечи, че разреждащата вода няма да повлияе прекомерно върху резултата от теста (например, чрез образуване на комплексни съединения с тестовото вещество) или да окаже странично въздействие върху качествата на семейството риби, на определени интервали трябва да се вземат проби за анализ. Определянето на тежки метали (например Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), главни аниони и катиони, (например, Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), пестициди (например, общо органофосфорни и общо органохлорни пестициди), общо органичен въглерод и суспендирали твърди частици трябва да се прави, например, на всеки три месеца, когато се знае, че разреждащата вода има относително постоянно качество. Ако се установи, че качеството на водата е постоянно за период от поне една година, тези определяния могат да се правят по рядко и интервалите да се удължат (примерно, на всеки шест месеца).

Съдържанието на природни частици, а също и общото съдържание на органичен въглерод (TOC) на разредената вода трябва да е възможно най-ниско, за да се избегне абсорбция на органична материя от тестовото вещество, която може да намали неговата биологична степен на абсорбция (4). Максимално допустимата стойност е 5 mg/l за определено конкретно вещество (сухо вещество, непреминаващо през 0,45 мкм филтър) и 2 mg/l за общото количество органичен въглерод (виж приложение 1). Ако е необходимо, водата се филтрира преди употреба. Приносът на органичния въглерод във водата от тестовата риба (екскрети) и от хранителните остатъци, трябва да е възможно най-ниско. По време на теста, концентрацията на органичен въглерод в тестовия съд не трябва да превишава концентрацията на органичен въглерод, получаван от тестовото вещество и на разтварящият агент, ако се използва такъв, с повече от 10 mg/l (±20 %).

1.7.3.   Тестови разтвори

Приготвя се основен разтвор от тестовото вещество в подходяща концентрация. Той се приготвя чрез просто смесване или разбъркване на тестовото вещество в разреждаща вода. Не се препоръчва употребата на разтворители или диспергиращи агенти (разтварящи агенти); това обаче може да се получи в някои случаи, с цел да се направи подходящо концентриран основен разтвор. Могат да се използват следните разтворители: етанол, метанол, етиленгликол монометилетер, етиленгликол диметилетер, диметилформамид и триетиленгликол. Като диспергиращи агенти могат да се използват Cremophor RH40, Tween 80, метилцелулоза 0,01 % и HCO-40. Трябва да се внимава когато се използват агенти с лесно биоразграждане, тъй като те могат да причинят проблеми при бактериалния растеж в проточните тестове. Тестовото вещество може да бъде радиомаркирано и трябва да има най-голямата чистота (например за предпочитане > 98 %).

За проточни тестове се изисква система, която непрекъснато дозира и разрежда основен разтвор от тестовото вещество (например, дозираща помпа, пропорционален разредител, система за насищане) и го изпраща към тестовите камери. Допускат се поне пет замествания на обема на ден през всяка тестова камера. Проточният метод е за предпочитане, но където това не е възможно (например, когато тестовите организми са подложени на неблагоприятно въздействие), може да се използва полустатичната техника, при условие че са удовлетворени критериите за валидност. Дебитите на основните разтвори и разреждащата вода се проверяват 48 часа преди теста и след това поне веднъж на ден по време на теста. Тази проверка включва определянето на дебита през всяка камера и следенето да не варира с повече от 20 % както в, така и извън камерите.

1.7.4.   Избор на видове

Важни критерии при избора на видове са те да са достъпни, да могат да се получат с необходимите размери и да могат да се гледат в лабораторни условия. Другите критерии при избора на видове риба включват развлекателното, търговско и екологично значение, а също и сравнима чувствителност, успешна употреба в миналото и т.н.

Препоръчваните видове риба са дадени в приложение 2. Могат да се използват и други видове, но може да се наложи адаптиране на тестовата процедура за постигане на подходящи тестови условия. В този случай се докладват обосновката за избора на видовете и експерименталния метод.

1.7.5.   Хващане на рибата

Основната популация риба се аклиматизира за поне две седмици във вода при тестова температура и се хранете достатъчно добре, на същия хранителен режим, на който ще бъде и по време на теста.

След 48-часов период, се отчита смъртността и се прилагат следните критерии:

—	при смъртност по-голяма от 10 % за седем дни се отказва цялата партида,

—	при смъртност между 5 и 10 % за седем дни се аклиматизира още седем дни,

—	при смъртност по-малка от 5 % за седем дни приемете партидата; ако смъртността през втората седмица надвиши 5 %, се отказва цялата партида.

Проверява се дали рибата, която се използва при тестовете, не страда от видими болести и отклонения. Болната риба се изхвърля. Рибата не трябва да бъде лекувана от болести две седмици преди теста или по време на теста.

1.8.   Извършване на теста

1.8.1.   Предварителен тест

Би било полезно да се извърши един предварителен експеримент, с цел да се оптимизират тестовите условия на окончателния тест, например избора на концентрация(и) на тестовото вещество, продължителност на фазите на поглъщане и очистване.

1.8.2.   Условия на експозиция

1.8.2.1.   Продължителност на фазата на поглъщане

Предвиждане за продължителността на фазата на поглъщане може да се направи на база практически опит (например, от предишно изследване или химикал, свързан с акумулиране) или от определени емпирични взаимовръзки, използващи познания относно водоразтворимостта или коефициента на разпределение на октанол/вода на тестовото вещество (виж приложение 3).

Фазата на поглъщане трае 28 дни, освен ако не се установи, че равновесието е постигнато по-рано. Ако устойчивото състояние не се постигне за 28 дни, фазата на поглъщане трябва да се удължи, докато се постигне устойчиво състояние или с още 60 дни, в зависимост от това кое ще се случи по-напред.

1.8.2.2.   Продължителност на фазата на очистването

Обикновено, за да се получи подходящо (например 95 %) намаляване на веществото в тялото на рибата (виж приложение 3 за обяснение на оценката), е необходим период от време, на половината от периода на поглъщане. Ако времето, необходимо за да се постигне 95 % загуба, е прекалено дълго, превишаващо два пъти нормалната продължителност на фазата на поглъщане (т.е. повече от 56 дни), може да се използва по-къс период (т.е. докато концентрацията на тестовото вещество стане по-малко от 10 % от концентрацията в устойчиво състояние). Обаче за вещества, които имат по-сложни схеми на поглъщане и очистване, отколкото са тези, представени чрез модел риба от една категория, даващи кинетика от първи ред, трябва да се оставят по-дълги фази на очистване за да се определят константите за загуба на скорост. Периодът може да се регулира чрез периода, през който концентрацията на тестовото вещество в рибата остава над аналитичния лимит на детекция.

1.8.2.3.   Брой на тестовите риби

Подберете такъв брой риби за теста, че да има минимум по 4 риби за проба при всяко вземане на проба. Ако са необходими повече статистически данни, ще трябват и повече риби за проба.

Ако се използват възрастни риби, отчетете какви се използват в експеримента - мъжки, женски или смесени. Ако се използват риби и от двата пола, разликите в липидното съдържание между половете се документира като незначително преди началото на излагането; може би ще е необходимо събирането на мъжките и женските риби.

За всеки един тест се избират риби с близко тегло, така че най-малките да не са по-малки от две трети теглото на най-големите. Рибите трябва да са от един и същи годишен клас и от един и същи източник. Понеже теглото и възрастта на една риба понякога оказва значително влияния върху BCF стойностите (1), тези подробности се записват акуратно. Препоръчва се по-малка проба риби да се измери преди теста, за да се прецени средното тегло.

1.8.2.4.   Зареждане

Използват се високи съотношения вода-към-риба, за да се намали до минимум намаляването на Cw, причинено от прибавянето на риба в началото на теста, а също за да се избегне намаляване на концентрацията на разтворения кислород. Важно е скоростта на зареждане да е подходяща спрямо използваните видове за теста. При всички случаи скорост на зареждане от 0,1 до 1,0 g риба (мокро тегло) за литър вода на ден е нормално препоръчваната скорост. По-високи скорости могат да се използват, ако се установи, че желаната концентрация на тестовото вещество може да се поддържа в рамките на ± 20 %, и че концентрацията на разтворения кислород не пада под 60 % насищане.

При подбора на подходящи режими на зареждане се отчита нормалния хабитат на рибите. Например, дънните риби може да изискват повече място на дъното на аквариума за същия обем вода в сравнение с пелагичните видове.

1.8.2.5.   Хранене

По време на аклиматизационния и тестовия периоди, хранителният режим на рибата е на база познато съдържание на липиди и протеини, при количество, достатъчно да я поддържа здрава и да запазва теглото ѝ. През тези периоди рибата дневно се храни с количества от 1 до 2 % от телесеното ѝ тегло; това поддържа липидната концентрация на постоянно ниво по време на теста при повечето видове риби. Количеството храна се преизчислява, например, веднъж седмично, за да може да се поддържа постоянно телесно тегло и липидно съдържание. За целите на това изчисление, теглото на рибата във всяка тестова камера се пресмята на база теглото на рибата, тествана напоследък в тази камера. Не претегляйте теглото на рибата, останала в камерата.

Неконсумираната храна и изпражненията се източват ежедневно от камерите, малко след храненето (30 минути до 1 час). Камерите се поддържат доколкото е възможно най-чисти по време на теста, така че концентрацията на органично вещество да е възможно най-ниска, тъй като присъствието на органичен въглерод може да ограничи биологичната годност на тестовото вещество (1).

Понеже много от храненията са получени от рибно месо, то те се анализират за тестовото вещество. Желателно е също да се анализират за пестициди и тежки метали.

1.8.2.6.   Светлина и температура

Фотопериодът обикновено е от 12 до 16 часа, а температурата (±2 °C) трябва да е подходяща за тестовите видове (виж приложение 2). Типът и характеристиките на осветлението трябва да са познати. Трябва да се внимава относно възможната фототрансформация на тестовото вещество при условията на лъчението на изследването. Използва се подходящо осветление, за да се избегне излагане на рибата на неестествени фотопродукти. В някои случаи може да е подходяща употребата на екран, ограничаващ ултравиолетовите излъчвания под 290 nm.

1.8.2.7.   Тестови концентрации

Рибата се излага на проточни условия при поне две концентрации на тестовото вещество във водата. Обикновено, по-високата (или най-високата) концентрация се избира да бъде около 1 % от своята силна асимптотична LC50 и поне 10 пъти по-висока от своя лимит на детекция във вода чрез използвания аналитичен метод.

Най-високата тестова концентрация може също да бъде определена чрез разделяне на силната 96 ч. LC50 при подходящото съотношение силна/продължителна (подходящи съотношения за някои химикали могат да бъдат от 3 до 100). Ако е възможно, изберете друга концентрация (и), така че, тя да се различава от горната с коефициент 10. Ако това не е възможно поради критерия 1 % от LC50 и аналитичния лимит, може да се използва коефициент или да се разглежда използването на 14 C маркирано тестово вещество. Нито една от използваните концентрации не трябва да е над разтворимостта на тестовото вещество.

Когато се използва разтварящ агент, неговата концентрация не трябва да е по-голяма от 0,1 ml/l и трябва да бъде една и съща във всички тестови съдове. Неговият принос, заедно с тестовото вещество, към общото съдържание на органичен въглерод в тестовата вода, трябва да са познати. Необходимо е обаче да се положат максимални усилия, за избягване употребата на такива материали.

1.8.2.8.   Контролни проверки

Една контролна проверка на разреждащата вода, или ако е уместно, на разтварящия агент, се извършва допълнително към тестовите серии, при условие че е установено, че агентът няма въздействия върху рибата. Ако не е така, се залагат и двете контролни проверки.

1.8.3.   Честота на измерванията на чистотата на водата

По време на теста, разтвореният кислород, TOC, pH и температурата се измерват във всички съдове. Общата твърдост и соленост, ако е уместно, се измерват при контролните проверки и един съд с по-висока (или най-високата) концентрация. Като минимум, разтвореният кислород и солеността, ако е уместно, се измерват 3 пъти — в началото, около средата и в края на периода на поглъщане – е веднъж седмично в периода на очистване. TOC се измерва в началото на теста (24 часа и 48 часа преди началото на теста във фазата на поглъщане. Температурата се измерва ежедневно, pH в началото и края на всеки период, а твърдостта веднъж за всеки тест. Желателно е температурата да се контролира непрекъснато поне в един съд.

1.8.4.   Вземане на проба и анализ на рибата и водата

1.8.4.1.   Програма за вземане на проба на вода и риба

Проба от водата от тестовите камери за определяне на концентрацията на тестовото вещество се взема преди слагането на рибата и по време както на фазата на поглъщане, така и на фазата на очистване. Като минимум, проба от водата се взема по същото време, когато се взема от рибата и преди хранене. По време на фазата на поглъщане, се определят концентрациите на тестовото вещество, за да се провери съответствието с критериите за валидност.

Проба от рибата се взема поне при пет случая през фазата на поглъщане, и поне при четири през фазата на очистване. Тъй като при някои случаи ще бъде трудно да се пресметне една сравнително точна преценка на стойността на BCF на база броя на пробите, особено когато се използва друга кинетика, освен простата кинетика за очистване от първи ред, то може би е препоръчително да се вземат проби по-често и в двата периода (виж приложение 4). По-голямото количество взети проби се съхранява и анализира само ако резултатите от първия кръг анализи докажат, че не се адекватни за изчислението на BCF с желаната точност.

Пример за приемлива програма за вземане на проби е даден в приложение 4. Могат да се изчислят и други програми, с помощта на други приети стойности на Pow, за да се изчисли времето за излагане при 95 % поглъщане.

Вземането на проби продължава през фазата на поглъщането до установяване на устойчивото състояние или 28 дни, в зависимост от това кое се случва по-напред. Ако устойчивото състояние не се постигне за 28 дни, вземането на проби продължава докато се постигне или още 60 дни, в зависимост от това кое се случва по-напред. Преди началото на фазата на очистването, рибата се прехвърля в чисти резервоари.

1.8.4.2.   Вземане на проба и подготовка на пробата

Анализите на водните проби се получават, например, чрез източване през инертни тръби от централната точка в тестовата камера. Понеже нито филтрирането, нито центрофугирането могат винаги да отделят фракцията от тестовото вещество, която не е биологично годна, от тази, която е (особено за супер-липофилни химикали, т.е. онези химикали с log Pow > 5) (1) (5), пробите може да не са обекти на такова третиране.

Вместо това, се правят измервания, за да се поддържат резервоарите доколкото е възможно най-чисти и общото съдържание на органичен въглерод се контролира и през двете фази – на поглъщане и очистване.

Подходящ брой риби (нормално минимум четири) се изваждат от тестовите камери при всяко вземане на проби. Тези риби се изплакват бързо с вода, изсушават се и се убиват моментално чрез най-подходящия и хуманен метод, след което се претеглят.

Желателно е рибата и водата да се анализират веднага след вземането на проба, с цел да се избегне разлагането или други загуби, и да се изчислят приблизителните скорости на поглъщане и очистване, докато теста продължава. Незабавните анализи избягват закъснението, когато се достига равната част (платото) на кривата.

Ако не се извършат незабавни анализи, пробите се съхраняват по подходящ метод. Преди началото на изследването се проучва информацията относно подходящи методи за съхранение на конкретното тестово вещество — например дълбоко замразяване, съхранение при 4 °C, продължителност на съхранението, екстракция и др.

1.8.4.3.   Качество на аналитичния метод

Понеже цялата процедура се обуславя по същество от точността, прецизността и чувствителността на аналитичния метод, използван за тестовото вещество, проверете експериментално дали прецизността и възпроизводимостта на химичния анализ, а също и възстановяването на тестовото вещество от водата и рибата, са задоволителни за конкретния метод. Проверете също тестовото вещество да не е забележимо в използваната разреждаща вода.

Ако е необходимо, стойностите на Cw и Cf, получени при теста, се коригират за стойностите на възстановяване и подготовка от контролните проверки. С пробите вода и риба се борави по начин, който намалява до минимум замърсяването и загубите (които, например, могат да се получат при абсорбция от устройството за вземане на проба).

1.8.4.4.   Анализ на пробата риба

Ако при теста се използват радиомаркирани материали, може да се анализира общата радиомаркировка (т.е. източник и метаболити) или пробите може да се почистят така че основното съединение да се анализира отделно. Също, основните метаболити може да се охарактеризират при устойчиво състояние или в края на фазата на поглъщането, в зависимост от това кое се случва по-напред. Ако BCF по отношение на общите радиомаркирани остатъци е > 1 000 %, може би е желателно, а за някои категории химикали като пестициди силно препоръчително, да се идентифицират и определят количествено продуктите на разпадането, представляващи > 10 % от общите остатъци в рибните тъкани при устойчиво състояние. Ако продуктите на разпадането, представляващи > 10 % от общите радиомаркирани остатъци в рибните тъкани са идентифицирани и определени количествено, тогава се препоръчва да се направи същото и за продуктите на разпадането в тестовата вода.

Концентрация на тестовото вещество обикновено се определя за всяка отделна претеглена риба. Ако това не е възможно, се прави събиране на пробите при всяко вземане на проба, но това ограничава статистическите процедури, които могат да се приложат към данните. Ако една статистическа процедура представлява важен фактор, тогава в теста се включват достатъчен брой риби, за да се пригоди желаната процедура на събиране (6) (7).

BCF се изразява едновременно като функция на общото мокро тегло, а за високолипофилни вещества като функция на липидното съдържание. Липидното съдържание при рибата се определя при всяко вземане на проба когато е възможно. За определянето му се използват подходящи методи (позовавания 8 и 2 от приложение 3). Екстракционната техника за хлороформ/метанол може да се препоръча като стандартен метод (9). Различните методи не дават идентични стойности (10), така че е важно да се дадат подробности за използвания метод. Когато е възможно, анализът за липиди се прави върху същия екстракт, както този, произведен за анализа за тестовото вещество, понеже често липидите често трябва да се отстраняват от екстракта, преди той да бъде анализиран хроматографски. Липидното съдържание на рибата (в мг/кг мокро тегло) в края на експеримента не трябва да се различава от това в началото с повече от ± 25 %. Отчита се също и процентното съдържание на твърди частици в тъканите, за да се позволи превръщане на липидната концентрация от мокра на суха база.

2.   ДАННИ

2.1.   Обработка на резултатите

Кривата на поглъщането на тестовото вещество се получава чрез изчертаване на нейната концентрация в/върху рибата (или определени тъкани) във фазата на поглъщането спрямо времето в аритметични скали. Ако кривата достигне стабилно равнище, това означава да бъде приблизително асимптотична към времевата ос, устойчивото състояние BCFSS се изчислява от:

Когато не се достига устойчиво състояние, може би е възможно да се изчисли BCFSS с достатъчна точност за оценка на риска от „устойчиво състояние“ при 80 % (1,6/k2) или 95 % (3,0/k2) на равновесието.

Определя се също и коефициента на концентрация (BCFk), като съотношение k1/k2, двете кинетични константи от първи ред. Константата за скорост на очистване (k2) обикновено се определя от кривата на очистването (т.е. графиката на намалението на концентрацията на тестовото вещество в рибата спрямо времето). След това константата за скорост на поглъщане (k1) се изчислява при дадена k2 и стойност на Cf, която се получава от кривата на поглъщането (виж също приложение 5). Предпочитаният метод за получаване на BCFk и константите за скорост k1 и k2, е да се използват нелинейни параметрични изчислителни методи на компютър (11). В противен случай, за изчисление на k1 и k2 могат да се използват графичните методи. Ако кривата на очистването очевидно не е от първи ред, се прилагат по-сложни модели (виж позоваванията в приложение 3) и се търси консултация от статистик в областта на биологията.

2.2.   Тълкуване на резултатите

Резултатите трябва да се тълкуват с внимание, когато измерените концентрации на тестовите разтвори са на нива, близки до лимита на детекция на аналитичния метод.

Ясно определените криви на поглъщане и загуби са показател за биоконцентрационни данни с добро качество. Вариациите в константите поглъщане/очистване между двете тестови концентрации трябва да бъдат по-малки от 20 %. Наблюдаваните значителни разлики в скоростите при поглъщане/очистване между двете приложени тестови концентрации трябва да се отчетат и да получат възможно обяснение. Обикновено границата на достоверност на BCF при добре направени изследвания доближава ± 20 %.

3.   ОТЧИТАНЕ

Протоколът от теста трябва да включва следна информация:

3.1.   Тестово вещество

—	физическо естество и където е уместно, физико-химични свойства,

—	химическа идентификация (включително съдържание на органичен въглерод, ако е уместно),

—	ако е радиомаркирано, точно положение на маркирания атом (и) и процент на радиоактивността, свързана с примесите.

3.2.   Тестови видове

—	научно име, род, източник, всякаква предварителна обработка, аклиматизация, възраст, размер, и т.н.

3.3.   Тестови условия

—	използвана тестова процедура (например, проточна или полустатична),

—	тип и характеристики на използваното осветление и фотопериода (те),

—	тестов дизайн (например, брой и размер на тестовите камери, скорост на подмяна на обема вода, брой на възпроизвежданията, брой на тестовите концентрации, време на поглъщане и време на очистване, честота на вземане на проби от риба и вода),

—	метод на подготовка на наличните разтвори и честота на подновяването им (разтварящия агент, неговата концентрация и приноса му към съдържанието на органичен въглерод в тестовата вода трябва да се посочат, когато се използват),

—	номиналните тестови концентрации, средните величини на измерваните стойности и техните стандартни отклонения в тестовите съдове и метода, по който са получени,

—

източник на разреждаща вода, описание на всякаква предварителна обработка, резултати от всякакви демонстрации на способността на рибата да живее във водата и характеристики на водата: pH, твърдост, температура, концентрация на разтворен кислород, остатъчни нива на хлор (ако се мерят), общо съдържание на органичен въглерод, суспензирали твърди частици, соленост на тестовата среда (ако е уместно) и всякакви други направени измервания,

—	качество на водата в тестовите съдове, pH, твърдост, TOC, температура и концентрация на разтворен кислород,

—	подробна информация за храненето (например, тип на храната, източник, състав — поне липидното и протеиново съдържание, ако е възможно, количеството, което се дава и на какви интервали),

—	информация за обработката на пробите риба и вода, включително подробности от подготовката, съхранението, екстракцията и аналитичните процедури (и прецизност) за тестовото вещество и липидното съдържание (ако се измерва).

3.4.   Резултати

—	резултати от всякакви извършени предишни изследвания,

—	смъртност на контролната риба и рибата във всяка камера за излагане, и всякакво наблюдавано необичайно поведение,

—	липидното съдържание на рибата (ако е определено при този тест),

—	криви (включително всички измерени данни), показващи поглъщането и очистването на тестовия химикал в рибата, времето на устойчиво състояние,

—	Cf и Cw (със стандартно отклонение и гама, ако е уместно) за всички времена на вземане на проба (Cf изразено в μg/g мокро тегло (ppm) от цялото тяло или определени негови тъкани, например липиди, и Cw в μg/ml (ppm). Стойностите не Cw за контролните серии (произхода също се отчита),

—

биоконцентрационният коефициент в устойчиво състояние (BCFSS) и/или кинетичния коефициент на концентрация (BCFk) и ако е приложимо, 95 % граници на достоверност за константите на скорост на поглъщане и очистване (загуба) (всички изразени по отношение на цялото тяло и общото липидно съдържание, ако се измерва, на животното или определени негови тъкани), граници на достоверност и стандартно отклонение (ако има) и методи на анализ на изчисления/данни за концентрация на използваното тестово вещество,

—	когато се използват радиомаркирани вещества, и ако се изисква, може да се даде натрупването на всички открити метаболити,

—	всичко необичайно относно теста, всяко отклонение от тестовите процедури, и всякаква друга уместна информация.

Намалете до минимум резултати като „неоткрито за времето на детекция“, като разработите предварителен тестов метод и експериментален дизайн, защото такива резултати не могат да се използват за изчисления на константите за скорост.

4.   ПОЗОВАВАНИЯ

(1)	Connell D.W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117—156.

(2)	Bintein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR and QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29—390.

(3)	OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing and Assessment of Chemicals. № 3.

(4)	Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailability of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

(5)	US EPA 822-R-94-002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document for the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

(6)	US FDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

(7)	US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human or animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Evironmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N.C. 27711.

(8)	Compaan H. (1980) in „The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation©“, Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.

(9)	Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099—1105.

(10)	Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431—1436.

(11)	CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method- Ring Test Programme, 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.

(12)	ASTM E-1022-84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.

Приложение 1

Химически характеристики на приемлива разреждаща вода

	Вещество	Гранична концентрация
1	Специфично вещество	5 mg/l
2	Общо органичен въглерод	2 mg/l
3	Нейонизиран амоняк	1 µg/l
4	Остатъчен хлор	10 µg/l
5	Общо органофосфорни пестициди	50 ng/l
6	Общо органохлорни пестициди плюс полихлорирани бифенили	50 ng/l
7	Общо органичен хлор	25 ng/l
8	Алуминий	1 µg/l
9	Арсен	1 µg/l
10	Хром	1 µg/l
11	Кобалт	1 µg/l
12	Мед	1 µg/l
13	Желязо	1 µg/l
14	Олово	1 µg/l
15	Никел	1 µg/l
16	Цинк	1 µg/l
17	Кадмий	100 ng/l
18	Живак	100 ng/l
19	Сребро	100 ng/l

Приложение 2

Видове риба, препоръчвани за тест

	Препоръчвани видове	Препоръчвана гама за тестова температура (°C)	Препоръчвана обща дължина на тестовото животно (cm)
1	Danio rerio (1) (Teleostei, Cyprinidae) (Hamilton-Buchanan) — аквариумна рибка Данио	20—25	3,0 ± 0,5
2	Pimephales promelas (Teleostei, Cyprinidae) (Rafinesque) — вид лещанка	20—25	5,0 ± 2,0
3	Cyprinus carpio (Teleostei, Cyprinidae) (Linnaeus) — шаран	20—25	5,0 ± 3,0
4	Oryzias latipes (Teleostei, Poeciliidae) (Temminck and Schlegel) — японска оризова рибка	20—25	4,0 ± 1,0
5	Poccilia reticulata (Teleostei, Poeciliidae) (Peters) — гупа	20—25	3,0 ± 1,0
6	Lepomis macrochirus (Teleostei, Centrarchidae) (Rafinesque) — вид слънчева рибка	20—25	5,0 ± 2,0
7	Oncorhynchus mykiss (Teleostei, Salmonidae) (Walbaum) — дъгова пъстърва (американска пъстърва)	13—17	8,0 ± 4,0
8	Gasterosteus aculeatus (Teleostei, Gasterosteidae) (Linnaeus) — триглава бодливка	18—20	3,0 ± 1,0

В различните страни се използват различни речни и морски видове например:

Leiostomus xanthurus	Leiostomus xanthurus
Cyprinodon variegatus	Cyprinodon variegatus
Menidia beryllina	Menidia beryllina
Cymatogaster aggregata	Cymatogaster aggregata
Parophrys vertulus	Parophrys vertulus
Leptocottus armatus	Leptocottus armatus
Триглава бодливка	Gasterosteus aculeatus
Лаврак	Dicentracus labrax
Уклей	Alburnus alburnus

Събиране

Пресноводната риба, дадена в таблицата, е лесна за развъждане и/или се среща през цялата година, като се има предвид, че наличността на морските и речни риби е частично ограничена до съответните страни. Тези риби могат да бъдат развъждани и култивирани било в рибни ферми или лабораторно, при условия на контрол върху болести и паразити, така че тестовите животни да са здрави и с познат произход. Тези риби се срещат в много части на света.

---

(1)  Meyer A., Orti G. (1993) Proc. Royal Society of London, Series B., Vol. 252, p. 231.

Приложение 3

Предвиждане на продължителността на фазите на поглъщане и очистване

1.   Предвиждане на продължителността на фазата на поглъщане

Преди извършването на теста, се прави пресмятане на k2 и следователно, някакъв процент време, необходим за достигане на устойчиво състояние, може да се получи от емпиричната връзка между k2 и коефициент на разделяне октанол/вода (Pow) или k2 и водоразтворимостта (s).

Пресмятане на k2 (ден-1) се получава например, от следната емпирична връзка (1):

log10k2 = – 0,414 log10(Pow) + 1,47 (r2 = 0,95)

(уравнение 1)

За другите връзки виж позоваване 2.

Ако коефициентът на разделяне (Pow) не е известен, пресмятане може да се направи (3) от информацията за водоразтворимост (s) на веществото, като се използва:

log10(Pow) = 0,862 log10(s) + 0,710 (r2 = 0,994)

(уравнение 2)

където s = разтворимост (mol/l): (n = 36).

Тези връзки се прилагат само за химикали със стойности на log Pow между 2 и 6,5 (4).

Времето, необходимо за достигане на процент устойчиво състояние може да се получи чрез прилагане на пресмятането за k2, от общото кинетично уравнение, описващо поглъщане и очистване (кинетика от първи ред):

Или ако Cw е константа:

Когато се достигне устойчиво състояние, (t → ∞), уравнение 3 може да се редуцира (5) (6) до:

Тогава k1/k2.Cw е едно приближение към концентрацията в рибата при устойчиво състояние (Cf, s).

Уравнение 3 може да се напише така:

или	(уравнение 4)

Като приложим уравнение 4, времето за достигане на някакъв процент устойчиво състояние може да се предвиди, когато k2 е преизчислено с помощта на уравнение 1 или 2.

Като насока, статистически оптималната продължителност на фазата на поглъщане за производство на статистически приемливи данни (BCFk) е онзи период, който се изисква за логаритмичната крива на концентрация на тестовото вещество в рибата спрямо линейното време за достигане на средната му точка, или 1,6/k2, или 80 % от устойчивото състояние, но не повече от 3,0/k2 или 95 % устойчивото състояние (7).

Времето за достигане на 80 % от устойчивото състояние е (уравнение 4):

или	(уравнение 5)

По подобен начин 95 % от устойчивото състояние е:

(уравнение 6)

Например, продължителността на фазата на поглъщане (up) за тестово вещество с log Pow = 4 ще бъде (използвайки уравнения 1, 5 и 6):

	log10k2 = – 0,414.(4) + 1,47	k2 = 0,652 дни –1
	up (80 %) = 1,6/0,652, т.е. 2,45 дни (59 часа)
или	up (95 %) = 3,0/0,652, т.е. 4,60 дни (110 часа)

По подобен начин, за тестово вещество с s = 10–5 mol/l (log(s) = 5,0), продължителността на up ще бъде (използвайки уравнения 1, 2, 5 и 6):

	log10 (Pow)	= –0,862 (-5,0) + 0,710 = 5,02
	log10k2	= –0,414 (5,02) + 1,47
	k2	= 0,246 дни –1
	up (80 %)	= 1,6/0,246, т.е. 6,5 дни (156 часа)
или	up (95 %)	= 3,0/0,246, т.e. 12,2 дни (293 часа)

Алтернативно, изразът:

teq = 6,54 × 10–3 Pow + 55,31 (часа)

може да се използва за изчисляване на времето за достигане на ефективно устойчиво състояние (4).

2.   Предвиждане на продължителността на фазата на очистване

Предвиждане на времето, необходимо за намаляване на товара на теглото до някакъв процент на начална концентрация може също да се получи от общото уравнение, описващо поглъщането и очистването (кинетика от първи ред) (1) (8).

За фазата на очистването, Cw се приема за нула. Уравнението може да се редуцира до:

където Cf,o е концентрацията при старта на периода на очистването. Тогава 50 % очистване ще се достигне за времето (t50):

По подобен начин 95 % очистване ще се достигне при:

Ако 80 % поглъщане се използва за първия период (1,6/k2) и 95 % загуба при фазата на очистването (3,0/k2), тогава фазата на очистването е приблизително два пъти продължителността на фазата на поглъщането.

Важно е да се отбележи обаче, че пресмятанията са базирани на допускането, че кривите на поглъщане и очистване ще следват кинетика от първи ред. Ако такава кинетика не се получи, трябва да се използват по-сложни модели (например позоваване (1)).

Позовавания (в приложение 3)

(1)	Spacie A. and Hamelink J. L. (1982).Alternative models for describing the bioconcentration of organics in fish. Toxicol. and Chem. 1, pp. 309—320.

(2)	Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of BCFs derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate matter to the bioavailability of chemicals. Danish Water Quality Institute.

(3)	Chiou C. T. and Schmedding D. W. (1982). Partitioning of organic compounds in octanol-water systems. Environ. Sci. Technol. 16 (1), pp. 4—10.

(4)	Hawker D. W. and Connell D. W. (1988). Influence of partition coefficient of lipophilic compounds on bioconcentration kinetics with fish. Wat. Res. 22 (6), pp. 701—707.

(5)	Branson D. R., Blau G. E., Alexander H. C. and Neely W. B. (1975). Transactions of the American Fisheries Society, 104 (4), pp. 785—792.

(6)	Ernst W. (1985). Accumulation in Aquatic organisms. In: Appraisal of tests to predict the environmental behaviour of chemicals. Ed. by Sheehman P., Korte F., Klein W. and Bourdeau P. H. Part 4.4, pp. 243-255. SCOPE, 1985, John Wiley & Sons Ltd N.Y.

(7)	Reilly P. M., Bajramovic R., Blau G. E., Branson D. R. and Sauerhoff M. W. (1977). Guidelines for the optimal design of experiments to estimate parameters in first order kenetic models, Can. J. Chem. Eng. 55, pp. 614—622.

(8)	Könemann H. and Van Leeuwen K. (1980). Toxicokinetics in fish: Accumulation and Elimination of six Chlorobenzenes by Guppies. Chemosphere, 9, pp. 3—19.

Приложение 4

Теоретичен пример за програма за вземане на проби за биоконцентрационни тестове на вещества с log Pow = 4

Вземане на проба от риба	Програма за вземане на проби		Брой на пробите вода	Брой на рибите за проба
	Минимална изисквана честота (дни)	Допълнително вземане на проби
Фаза на поглъщане	–1 0		2 (1) 2	Прибавете 45 до 80 риби
1-ва	0,3	0,4	2 (2)	4 (4)
2-ра	0,6	0,9	2 (2)	4 (4)
3-та	1,2	1,7	2 (2)	4 (4)
4-та	2,4	3,3	2 (2)	4 (4)
5-та	4,7		2	6
Фаза на очистване				Прехвърлете рибата към вода без тестови химикали
6-та	5,0	5,3		4 (4)
7-ма	5,9	7,0		4 (4)
8-ма	9,3	11,2		4 (4)
9-та	9,3	17,5		6 (4)
NB Предварително пресмятане на k2 за log Pow от 4,0 е 0,652 дни–1. Общата продължителност на експеримента е за 3 × up = 3 × 4,6 дни, т.e. 14 дни. За пресмятането на „нагоре“ се обърнете към приложение 3. Стойностите в скобите са броя на пробите (вода, риба), които трябва да се вземат, ако се прави допълнително вземане на проби.

---

(1)  Пробата вода след минимум три прехвърляния на обема на камерата.

NB Предварително пресмятане на k2 за log Pow от 4,0 е 0,652 дни–1. Общата продължителност на експеримента е за 3 × up = 3 × 4,6 дни, т.e. 14 дни. За пресмятането на „нагоре“ се обърнете към приложение 3.

Стойностите в скобите са броя на пробите (вода, риба), които трябва да се вземат, ако се прави допълнително вземане на проби.

Приложение 5

Оценка на модела

Повечето данни за биоконцентрация се считат за сравнително добре описани чрез прост модел на две прегради) два параметъра, както е показано чрез правата линия на графиката, която се доближава до точките на концентрация в рибата, по време на фазата на очистване, когато са изчертани върху полулогаритмична хартия. (Когато тези точки не могат да се опишат с такава права линия, тогава трябва да се използват по-сложни модели, например този на Spacie and Hamelink, позоваване 1 в приложение 3).

Графичен метод за определяне на константата на очистване (загуба) k2

Изчертайте концентрацията на тестовото вещество, отчетена във всяка проба от риба спрямо времето за вземане на проба, върху полулогаритмична хартия. Наклонът на тази линия е k2.

Забележете, че отклоненията от правата линия може да означават по-сложна графика на очистването от такава в кинетика първи ред. Може да се приложи графичен метод за анализиране на видове очистване, което се отклонява от кинетика първи ред.

Графичен метод за определяне на константата на поглъщане k1

При дадена k2, изчислете k1 както следва:

Стойността на Cf се отчита от средната точка на гладката крива на поглъщането, получена от данните, когато log концентрация се изчертава спрямо времето (върху аритметична скала).

Компютърен модел за изчисление на константите на скоростта на поглъщане и очистване

Предпочитан начин за получаване на коефициента на биоконцентрация и на константите за скорост k1 и k2 е използването на нелинейни параметрични изчислителни методи на компютър. Такъв софтуер намира стойностите на k1 и k2 при наличие на данни за време и концентрация и модела:

	0 < t < tc	(уравнение 2)
	t < tc	(уравнение 3)

където tc= време в края на фазата на поглъщане.

Този подход осигурява изчисление на k1 и k2 със стандартно отклонение.

Понеже k2 в повечето случаи може да се пресметне от кривата на очистването с относително висока точност, и тъй като съществува силна корелация между двата параметъра k1 и k2, ако се пресмятат едновременно, препоръчително е първо да се изчисли k2 само от кривата на очистването, а след това да се изчисли k1 от данните за поглъщане, като се използва нелинейна регресия.

---