Accept Refuse

EUR-Lex Access to European Union law

This document is an excerpt from the EUR-Lex website

Document 31998L0073

1998 m. rugsėjo 18 d. Komisijos Direktyva 98/73/EB, dvidešimt ketvirtą kartą derinanti su technikos pažanga Direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimoTekstas svarbus EEE.

OJ L 305, 16.11.1998, p. 1–184 (ES, DA, DE, EL, EN, FR, IT, NL, PT, FI, SV)
Special edition in Czech: Chapter 13 Volume 021 P. 139 - 316
Special edition in Estonian: Chapter 13 Volume 021 P. 139 - 316
Special edition in Latvian: Chapter 13 Volume 021 P. 139 - 316
Special edition in Lithuanian: Chapter 13 Volume 021 P. 139 - 316
Special edition in Hungarian Chapter 13 Volume 021 P. 139 - 316
Special edition in Maltese: Chapter 13 Volume 021 P. 139 - 316
Special edition in Polish: Chapter 13 Volume 021 P. 139 - 316
Special edition in Slovak: Chapter 13 Volume 021 P. 139 - 316
Special edition in Slovene: Chapter 13 Volume 021 P. 139 - 316
Special edition in Bulgarian: Chapter 13 Volume 024 P. 125 - 302
Special edition in Romanian: Chapter 13 Volume 024 P. 125 - 302
Special edition in Croatian: Chapter 13 Volume 021 P. 38 - 40

No longer in force, Date of end of validity: 31/05/2015; netiesiogiai panaikino 32008R1272

ELI: http://data.europa.eu/eli/dir/1998/73/oj

31998L0073

1998 m. rugsėjo 18 d. Komisijos Direktyva 98/73/EB, dvidešimt ketvirtą kartą derinanti su technikos pažanga Direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimoTekstas svarbus EEE.

Oficialusis leidinys L 305 , 16/11/1998 p. 0001 - 0181
CS.ES skyrius 13 tomas 21 p. 139 - 316
ET.ES skyrius 13 tomas 21 p. 139 - 316
HU.ES skyrius 13 tomas 21 p. 139 - 316
LT.ES skyrius 13 tomas 21 p. 139 - 316
LV.ES skyrius 13 tomas 21 p. 139 - 316
MT.ES skyrius 13 tomas 21 p. 139 - 316
PL.ES skyrius 13 tomas 21 p. 139 - 316
SK.ES skyrius 13 tomas 21 p. 139 - 316
SL.ES skyrius 13 tomas 21 p. 139 - 316


Komisijos Direktyva 98/73/EB

1998 m. rugsėjo 18 d.

dvidešimt ketvirtą kartą derinanti su technikos pažanga Direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo

(tekstas svarbus EEE)

EUROPOS BENDRIJŲ KOMISIJA,

atsižvelgdama į Europos bendrijos steigimo sutartį,

atsižvelgdama į 1967 m. birželio 27 d. Tarybos direktyvą 67/548/EEB dėl įstatymų ir kitų teisės aktų, reglamentuojančių pavojingų medžiagų klasifikavimą, pakavimą ir ženklinimą etiketėmis, suderinimo [1] su paskutiniais pakeitimais, padarytais Komisijos direktyva 97/69/EB [2], ypač į jos 28 straipsnį,

kadangi Tarybos direktyvos 67/548/EEB I priede yra pateiktas pavojingų medžiagų sąrašas, taip pat informacija apie kiekvienos medžiagos klasifikavimo ir ženklinimo tvarką; kadangi turimos mokslo ir technikos žinios parodė, kad nurodytame priede pateiktą pavojingų medžiagų sąrašą reikėtų suderinti su turimomis žiniomis ir papildyti;

kadangi Direktyvos 67/548/EEB V priede nustatyti medžiagų ir preparatų fizikinių cheminių savybių, toksiškumo ir ekotoksiškumo nustatymo metodai; kadangi nurodytą priedą būtina suderinti su technikos pažanga;

kadangi šioje direktyvoje numatytos priemonės atitinka Direktyvų dėl techninių kliūčių panaikinimo pavojingų medžiagų ir preparatų prekybos srityje derinimo su technikos pažanga komiteto nuomonę,

PRIĖMĖ ŠIĄ DIREKTYVĄ:

1 straipsnis

Direktyva 67/548/EEB iš dalies keičiama taip:

1. I priedas iš dalies keičiamas taip:

a) šios direktyvos I priede pateikiami įrašai pakeičia atitinkamus Direktyvos 67/548/EEB I priede pateikiamus įrašus;

b) šios direktyvos II priede pateikiami įrašai įrašomi į Direktyvos 67/548/EEB I priedą.

2. V priedas iš dalies keičiamas taip:

a) šios direktyvos III A, III B ir III C priedų tekstai pridedami prie Direktyvos 67/548/EEB V priedo A dalies;

b) šios direktyvos III D priedo tekstas pridedamas prie Direktyvos 67/548/EEB V priedo C dalies.

2 straipsnis

Valstybės narės priima įstatymus ir kitus teisės aktus, kurie, įsigalioję ne vėliau kaip iki 1999 m. spalio 31 d., įgyvendina šią direktyvą. Apie tai jos nedelsdamos praneša Komisijai.

Valstybės narės, tvirtindamos šias priemones, daro jose nuorodą į šią direktyvąarba tokia nuoroda daroma jas oficialiai skelbiant. Nuorodos darymo tvarką nustato valstybės narės.

3 straipsnis

Ši direktyva įsigalioja dvidešimtą dieną po jos paskelbimo Europos Bendrijų oficialiajame leidinyje.

4 straipsnis

Ši direktyva skirta valstybėms narėms.

Priimta Briuselyje, 1998 m. rugsėjo 18 d.

Komisijos vardu

Ritt Bjerregaard

Komisijos narys

[1] OL 196, 1967 8 16, p. 1.

[2] OL L 343, 1997 12 13, p. 19.

--------------------------------------------------

ANEXO IBILAG IANHANG IΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IANNEX IANNEXE IALLEGATO IBIJLAGE IANEXO ILIITE IBILAGA I

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

ANEXO IIBILAG IIANHANG IIΠΑΡΑΡΤΗΜΑ IIANNEX IIANNEXE IIALLEGATO IIBIJLAGE IIANEXO IILIITE IIBILAGA II

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

+++++ TIFF +++++

--------------------------------------------------

III A PRIEDAS

A.18. POLIMERŲ SKAITINĖS VIDUTINĖS MOLEKULINĖS MASĖS IR MOLEKULINĖS MASĖS PASISKIRSTYMAS

1. METODAS

Šis gelchromatografijos (Gel Permeation Chromatographic) metodas yra OECD TG 118 (1996) kopija. Pagrindiniai principai ir papildoma techninė informacija pateikta 1 nuorodoje.

1.1. Įvadas

Kadangi polimerų savybės yra labai skirtingos, neįmanoma aprašyti vieną atskirą metodą, tiksliai nustatantį atskyrimo ir vertinimo sąlygas, kurios apimtų visas galimybes ir specifinius atvejus, pasitaikančius atskiriant polimerus. Ypač sudėtingas polimerų sistemas dažnai neįmanoma paruošti gelchromatografijai (GPC). Kai GPC nenaudotina, molekulinę masę galima nustatyti kitų metodų pagalba (žr. papildymą). Tokiais atvejais turi būti pateiktos visos taikyto metodo detalės ir pagrindimas.

Aprašytas metodas paruoštas DIN 55672 standarto (1) pagrindu. Visa detali informacija apie tai, kaip atlikti bandymus ir kaip vertinti duomenis, galima rasti šiame DIN standarte. Tuo atveju, kai būtina keisti bandymo sąlygas, šie keitimai turi būti pagrįsti. Galima taikyti kitus standartus, jei jie yra visiškai aprašyti. Aprašytame metode kalibravimui naudojami žinomo polidispersiškumo polistireno bandiniai ir metodą gali tekti keisti, pritaikant kai kuriems polimerams, pvz., vandenyje tirpiems ir ilgos šakotos grandinės polimerams.

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

Skaitinė vidutinė molekulinė masė Mn ir masinė vidutinė molekulinė masė Mw nustatomos taikant tokias lygtis:

+++++ TIFF +++++

kuriose:

Hi yra nuo pagrindo linijos išmatuotas detektoriaus signalo lygis sulaikymo tūriui Vi,

Mi sulaikymo tūrį Vi atitinkančios polimero frakcijos molekulinė masė ir

n yra duomenų taškų skaičius.

Molekulinės masės skirstinio plotį, kuris yra sistemos dispersiškumo matas, nustato santykis Mw/Mn.

1.3. Etaloninės medžiagos

Kadangi GPC yra santykinis metodas, turi būti atliekamas kalibravimas. Paprastai šiam tikslui naudojami siaurame intervale pasiskirstę linijinės sandaros polistireno etalonai, kurių vidutinės molekulinės masės Mn ir Mw ir molekulinės masės pasiskirstymas yra žinomi. Kalibravimo kreivę nežinomo bandinio molekulinei masei nustatyti galima naudoti tik tuomet, jei bandiniui ir etalonams atskirti naudotos sąlygos buvo parinktos identišku būdu.

Nustatyta priklausomybė tarp molekulinės masės ir eliuavimo tūrio galioja tik konkretaus bandymo specifinėmis sąlygomis. Svarbiausios sąlygos yra temperatūra, tirpiklis (arba tirpiklių mišinys), chromatografavimo sąlygos ir atskyrimo kolonėlė arba kolonėlių sistema.

Taip nustatytos bandinio molekulinės masės yra santykinės vertės ir vadinamos "molekulinėmis masėmis pagal polistireną". Tai reiškia, kad dėl sandaros ir cheminių skirtumų tarp bandinio ir etalonų molekulinės masės nuo absoliučiųjų verčių gali skirtis didesniu arba mažesniu laipsniu. Jei naudojami kiti etalonai, pvz., polietilenglikolis, polioksietilenas, polimetilmetakrilatas, poliakrilo rūgštis, turi būti nurodyta priežastis.

1.4. Bandymų metodo esmė

Bandinio molekulinės masės skirstinys ir vidutinės molekulinės masės (Mn, Mw) gali būti nustatyti taikant GPC. GPC yra specialus skysčių chromatografijos metodas, kuriame bandinys atskiriamas pagal atskirų komponentų hidrodinaminius tūrius (2).

Atskyrimas vyksta, kai bandinys praeina per kolonėlę, užpildytą poringa medžiaga, dažniausiai organiniu geliu. Mažos molekulės gali įsiskverbti į poras, tuo tarpu didelės molekulės ekskliuduojamos. Todėl didelių molekulių kelias yra trumpesnis ir jos išplaunamos pirmos. Vidutinio dydžio molekulės įsiskverbia į kai kurias poras ir išplaunamos vėliau. Mažiausios molekulės, kurių vidutinis hidrodinaminis spindulys yra mažesnis nei gelio poros, gali įsiskverbti į visas poras. Šios molekulės išplaunamos paskutinės.

Teoriškai atskyrimą apsprendžia vien tik molekulių dydis, tačiau praktikoje sunku išvengti kai kurių trukdančių sugerties veiksnių. Netolygus kolonėlės užpildymas ir nenaudingi tūriai gali bloginti padėtį (2).

Aptikimas atliekamas, pvz., matuojant lūžio rodiklį arba UV-sugertį, taip gaunama paprasta pasiskirstymo kreivė. Tačiau norint kreivei priskirti tikrąsias molekulinės masės vertes, kolonėlę reikia kalibruoti, leidžiant per ją žinomos molekulinės masės polimerus ir geriausiai būtų apskritai panašios sandaros polimerus, pvz., įvairius polistireno etalonus. Vertikaliojoje ašyje žymint įvairios molekulinės masės išplautų dalelių kiekį, kuris reiškiamas mase, o horizontaliojoje ašyje — molekulinės masės logaritmą, dažniausiai gaunama Gauso kreivė, kartais mažos molekulinės masės pusėje iškreipta nedidele uodega.

1.5. Kokybės kriterijai

Eliuavimo tūrio pakartojamumas (variacijos koeficientas) turi būti geresnis nei 0,3 %. Jei vertinant skirtingu laiku darytą chromatogramą, ji neatitinka tik ką minėto kriterijaus, reikiamas analizės pakartojamumas turi būti užtikrintas atliekant pataisą vidiniu etalonu (1). Polidispersiškumas priklauso nuo etalonų molekulinės masės. Polistireno etalonų atveju tipiškos vertės yra tokios:

Mp < 2000 | Mw/Mn < 1,20 |

2000 ≤ Mp ≤ 106 | Mw/Mn < 1,05 |

Mp > 106 | Mw/Mn < 1,20 |

(Mp yra etalono molekulinė masė, atitinkanti smailės viršūnę).

1.6. Bandymų metodo aprašymas

1.6.1. Etaloninių polistireno tirpalų ruošimas

Polistireno etalonai ištirpinami juos kruopščiai sumaišant su pasirinktu eliuentu. Ruošiant tirpalus turi būti atsižvelta į gamintojo rekomendacijas.

Pasirinktų etalonų koncentracijos priklauso nuo įvairių veiksnių, pvz., injekcijos tūrio, tirpalo klampio ir analizinio detektoriaus jautrumo. Norint išvengti perkrovos, didžiausias injekcijos tūris turi būti pritaikytas kolonėlės ilgiui. Taikant GPC medžiagų atskyrimui analizėje, tipiški injekcijos tūriai 30 cm x 7,8 mm kolonėlei paprastai yra 40-100 μ1. Galima naudoti didesnį tūrį, tačiau jis neturi viršyti 250 μ1. Prieš pradedant tikrąjį kolonėlės kalibravimą, turi būti nustatytas optimalus santykis tarp injekcijos tūrio ir koncentracijos.

1.6.2. Bandinio tirpalo ruošimas

Iš esmės tie patys reikalavimai taikomi ruošiant bandinių tirpalus. Bandinys ištirpinamas tinkamame tirpiklyje, pvz., tetrahidrofurane, kruopščiai maišant. Jokiu būdu negalima tirpinti naudojant ultragarsinę vonią. Jei būtina, bandinio tirpalas gryninamas, filtruojant per membraninį filtrą, kurio porų dydis 0,2-2 μm.

Galutinėje ataskaitoje turi būti pažymėta, ar buvo neištirpusių dalelių, nes tai gali būti didelės molekulinės masės medžiagų dalelės. Ištirpusių dalelių procentinei masės daliai nustatyti turi būti taikomas tinkamas metodas. Tirpalai turi būti panaudoti per 24 valandas.

1.6.3. Aparatūra

- rezervuaras tirpikliui,

- nudujinimo įtaisas (jei reikia),

- siurblys,

- pulsacijų slopintuvas (jei reikia),

- injekcijos sistema,

- chromatografinės kolonėlės,

- detektorius,

- debitmatis (jei reikia),

- duomenų registruotuvas-procesorius,

- atliekų indas.

Turi būti užtikrinta, kad GPC sistema būtų inertiška naudojamiems tirpikliams (pvz., naudoti plieninius kapiliarus, jei tirpiklis tertrahidrofuranas).

1.6.4. Injekcijos ir tirpiklio tiekimo sistema

Tam tikras bandinio tirpalo tūris griežtai nustatytoje zonoje įleidžiamas į kolonėlę, naudojant automatinį bandinio tiektuvą arba rankiniu būdu. Švirkšto plunžerio per greitas ištraukimas arba spaudimas įleidžiant rankiniu būdu gali būti molekulinių masių stebimo pasiskirstymo pokyčių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo sistema turi būti be pulsacijų, geriausiu atveju jai reikia pulsacijų slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.

1.6.5. Kolonėlė

Atsižvelgiant į bandinį, polimeras tiriamas naudojant vieną paprastą kolonėlę arba kelias nuosekliai sujungtas kolonėles. Prekyboje yra keletas kolonėlėms užpildyti naudojamų poringų medžiagų su apibrėžtomis savybėmis (pvz., porų dydžiu, ekskliudavimo ribomis). Atskyrimui naudojamo gelio arba kolonėlės aukščio pasirinkimas priklauso ir nuo bandinio savybių (hidrodinaminių tūrių, molekulinės masės pasiskirstymo) ir nuo specifinių atskyrimo sąlygų, pvz., tirpiklio, temperatūros ir srauto (1) (2) (3).

1.6.6. Teorinės lėkštelės

Atskyrimui naudojama kolonėlė arba kolonėlių sistema turi būti apibūdinta teorinių lėkštelių skaičiumi. Tetrahidrofurano kaip eliuento atveju reikia į žinomo ilgio kolonėlę įleisti etilbenzeno arba kito tinkamo nepolinio tirpiklio tirpalą. Teorinių lėkštelių skaičius randamas pagal tokią lygtį:

N = 5,54

arba

N = 16

kurioje:

N teorinių lėkštelių skaičius,

Ve smailės viršūnę atitinkantis eliuavimo tūris,

W smailės plotis pagrindo linijoje,

W1/2 smailės plotis per smailės aukščio vidurį.

1.6.7. Atskyrimo efektyvumas

Be teorinių lėkštelių skaičiaus, kuris apsprendžia juostos plotį, tam tikrą vaidmenį vaidina atskyrimo efektyvumas, kurį apibūdina kalibracinės kreivės statumas. Kolonėlės atskyrimo efektyvumas nustatomas pagal tokią priklausomybę:

V

- V

10M

≥ 6,0

cm3cm2

kurioje:

Ve, Mx polistireno, turinčio molekulinę masę Mx, eliuavimo tūris,

Ve, (10Mx) polistireno, turinčio 10 kartų didesnę molekulinę masę, eliuavimo tūris.

Sistemos atskiriamoji galia dažniausiai apibrėžiama taip:

R

= 2 ×

×

M

/M

1

čia:

Ve1, V e2 dviejų polistireno etalonų eliuavimo tūriai, atitinkantys smailės viršūnę,

W1, W2 smailių pločiai pagrindo linijoje,

M1, M2 molekulinės masės, atitinkančios smailių viršūnes (turi skirtis 10 kartų).

Kolonėlės sistemai R vertė turi būti didesnė kaip 1,7 (4).

1.6.8. Tirpikliai

Visi tirpikliai turi būti labai gryni (tetrahidrofurano grynumas 99,5 %). Tirpiklio indas (jei reikia, su inertinių dujų atmosfera) turi būti pakankamai didelis kolonėlei kalibruoti ir kelių bandinių analizei atlikti. Tirpiklis, prieš jį tiekiant siurbliu į kolonėlę, turi būti nudujintas.

1.6.9. Temperatūros reguliavimas

Svarbių vidinių komponentų (injekcijos kilpos, kolonėlių, detektoriaus ir vamzdžių) temperatūra turi būti pastovi ir atitikti pasirinktą tirpiklį.

1.6.10. Detektorius

Detektoriaus paskirtis — kiekybiškai registruoti iš kolonėlės išplauto bandinio koncentraciją. Norint, kas smailės nebūtų labai plačios, detektoriaus kiuvetės tūris turi būti kuo mažesnis. Jis neturi būti didesnis kaip 10 μl, išskyrus šviesos sklaidos ir klampio detektorius. Detektavimui paprastai naudojama diferencinė refraktometrija. Tačiau, jei to reikalauja bandinio specifinės savybės arba eliuavimo tirpiklis, gali būti naudojami kitų tipų detektoriai, pvz., UV/VIS, IR, klampio detektoriai ir t. t.

2. DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1. Duomenys

Išsamių vertinimo kriterijų, taip pat duomenų kaupimui ir apdorojimui keliamų reikalavimų reikia ieškoti DIN standarte (1).

Kiekvienam bandiniui turi būti atlikti du nepriklausomi bandymai. Bandiniai turi būti analizuojami atskirai.

Kiekvieną kartą matuojant reikia gauti Mn, Mw, Mw/Mn ir Mp vertes. Būtina aiškiai nurodyti, kad išmatuotos vertės yra santykinės vertės, atitinkančios naudojamų etalonų molekulinę masę.

Po sulaikymo tūrio arba sulaikymo trukmės verčių (galbūt pataisytų naudojant vidinį etaloną) nustatymo vienam šių dydžių atidedamos log Mp vertės (Mp yra kalibravimo etalono smailės viršūnę atitinkanti vertė). Kiekvienai molekulinės masės dešimtainei skilčiai būtina turėti bent du kalibravimo taškus, o visai kalibracinei kreivei, kuri turi apimti įvertintą bandinio molekulinę masę, turi būti bent penki matavimų taškai. Mažą molekulinę masę atitinkantis kalibracinės kreivės galinis taškas nustatomas pagal n — heksilbenzeną arba kitokį tinkamą nepolinį tirpiklį. Skaitinė vidutinė ir masinė vidutinė molekulinės masės paprastai apskaičiuojamos elektroninėmis duomenų apdorojimo priemonėmis, taikant 1.2 skyriaus formules. Atliekant apskaičiavimus rankiniu būdu, galima pasižiūrėti į ASTM D 3536-91 (3).

Pasiskirstymo kreivė turi būti pateikta lentelės pavidalu arba kaip grafikas (diferencinis dažnis arba bendrojo kiekio procentinės dalys pagal log M). Vaizduojant grafiškai viena molekulinės masės dešimtainė skiltis paprastai turi būti 4 cm pločio, o smailės viršūnės aukštis turi būti apie 8 cm. Integralinių pasiskirstymo kreivių atveju atstumas ordinatėje tarp taškų, atitinkančių 0 ir 100 %, turi būti apie 10 cm.

2.2. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:

2.2.1. Bandymų medžiaga

- turima informacija apie bandomąją medžiagą (identiškumas, priedai, priemaišos),

- bandinio apdorojimo aprašymas, pastebėjimai, problemos.

2.2.2. Aparatūra

- tirpiklio rezervuaras, inertinės dujos, eliuento nudujinimas, eliuento sudėtis, priemaišos,

- siurblys, pulsacijų slopintuvas, injekcijos sistema,

- atskyrimo kolonėlės (gamintojas, visa informacija apie kolonėlių chakteristikas, pvz., porų dydis, atskyrimo medžiagos rūšis ir t. t., naudotų kolonėlių skaičius, ilgis ir jungimo tvarka),

- kolonėlės (arba jų rinkinio) teorinių lėkštelių skaičius, atskyrimo efektyvumas (sistemos atskyrimo galia),

- informacija apie smailių simetriją,

- kolonėlės temperatūra, temperatūros reguliavimo būdas,

- detektorius (matavimo principas, tipas, kiuvetės tūris),

- debitmatis, jei buvo naudotas (gamintojas, matavimo principas),

- duomenų registravimo ir apdorojimo sistema (aparatinė įranga ir programinė įranga).

2.2.3. Sistemos kalibravimas

- kalibracinės kreivės gavimo metodo detalus aprašymas,

- informacija apie šio metodo kokybės kriterijus (pvz., koreliacijos koeficientą, paklaidų kvadratų sumą ir t. t.),

- informacija apie visas ekstrapoliacijas, prielaidas ir aproksimacijas, darytas bandymo eigoje ir vertinant bei apdorojant duomenis,

- visi matavimai, naudoti kalibracinei kreivei gauti, turi būti dokumentuoti lentelėje, kurioje kiekvienam kalibravimo taškui būtų pateikta tokia informacija:

- bandinio pavadinimas,

- bandinio gamintojas,

- etalonų būdingosios vertės Mp, Mn, Mw ir Mw/Mn, kokias pateikė gamintojas, arba gautos vėlesniuose matavimuose, kartu nurodant nustatymo metodo detales,

- injekcijos tūris ir injekcijos koncentracija,

- kalibravimui naudota Mp vertė,

- išmatuotas eliuavimo tūris arba pataisyta sulaikymo trukmė, atitinkantys smailės viršūnę,

- smailės viršūnę atitinkanti apskaičiuota Mp vertė,

- apskaičiuotos ir kalibravimui naudotos Mp vertės procentinė paklaida.

2.2.4. Vertinimas:

- vertinimas laiko pagrindu: metodai taikyti reikiamam pakartojamumui užtikrinti (pataisų darymo metodas, vidinis standartas ir t. t.),

- informacija apie tai, ar vertinimas buvo atliekamas pagal eliuavimo tūrį ar pagal sulaikymo trukmę,

- informacija apie vertinimo ribas, jei smailė nėra iki galo analizuota,

- suglodinimo metodų aprašymas, jei jie buvo taikyti,

- bandinio ruošimo ir išankstinio apdorojimo metodikos,

- duomenys apie neištirpusias daleles, jei yra,

- injekcijos tūris (μl) ir injekcijos koncentracija (mg/ml),

- stebėjimų duomenys, nurodantys veiksnius, kurie yra nukrypimų nuo teorinio GPC profilio priežastis,

- bandymo metodikose darytų visų keitimų detalus aprašymas,

- detalės apie paklaidų intervalus,

- bet kokia kita informacija ir stebėjimų duomenys, reikalingi duomenims interpretuoti.

3. NUORODOS

(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J., and Bly, D. D. eds, (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing and Materials, Philadelphia, Pennsylvania.

--------------------------------------------------

III B PRIEDAS

A.19 MAŽOS MOLEKULINĖS MASĖS MEDŽIAGŲ KIEKIS POLIMERUOSE

1. METODAS

Šis gelchromatografijos (Gel Permeation Chromatographic) metodas yra OECD TG 119 (1996) kopija. Pagrindiniai principai ir papildoma techninė informacija pateikta nuorodose.

1.1. Įvadas

Kadangi polimerų savybės yra labai skirtingos, neįmanoma aprašyti vieną atskirą metodą, tiksliai nustatantį atskyrimo ir vertinimo sąlygas, kurios apimtų visas galimybes ir specifinius atvejus, pasitaikančius atskiriant polimerus. Ypač sudėtingas polimerų sistemas dažnai neįmanoma paruošti gelchromatografijai (GPC). Kai GPC nenaudotina, molekulinę masę galima nustatyti kitų metodų pagalba (žr. papildymą). Tokiais atvejais turi būti pateiktos visos taikyto metodo detalės ir pagrindimas.

Aprašytas metodas paruoštas DIN 55672 standarto (1) pagrindu. Visa detali informacija apie tai, kaip atlikti bandymus ir kaip vertinti duomenis, galima rasti šiame DIN standarte. Tuo atveju, kai būtina keisti bandymo sąlygas, šie keitimai turi būti pagrįsti. Galima taikyti kitus standartus, jei jie yra visiškai aprašyti. Aprašytame metode kalibravimui naudojami žinomo polidispersiškumo polistireno bandiniai ir metodą gali tekti keisti, pritaikant kai kuriems polimerams, pvz., vandenyje tirpiems ir ilgos šakotos grandinės polimerams.

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

Mažesnė nei 1000 daltonų molekulinė masė sąlygiškai apibrėžiama kaip maža molekulininė masė.

Skaitinė vidutinė molekulinė masė Mn ir masinė vidutinė molekulinė masė Mw nustatomos taikant tokias lygtis:

+++++ TIFF +++++

kuriose:

Hi yra nuo pagrindo linijos išmatuotas detektoriaus signalo lygis sulaikymo tūriui Vi,

Mi sulaikymo tūrį Vi atitinkančios polimero frakcijos molekulinė masė ir

n yra duomenų taškų skaičius.

Molekulinės masės skirstinio plotį, kuris yra sistemos dispersiškumo matas, duoda santykis Mw/Mn.

1.3. Etaloninės medžiagos

Kadangi GPC yra santykinis metodas, turi būti atliekamas kalibravimas. Paprastai šiam tikslui naudojami siaurame intervale pasiskirstę linijinės sandaros polistireno etalonai, kurių vidutinės molekulinės masės Mn ir Mw ir molekulinės masės pasiskirstymas yra žinomi. Kalibravimo kreivę nežinomo bandinio molekulinei masei nustatyti galima naudoti tik tuomet, jei bandiniui ir etalonams atskirti naudotos sąlygos buvo parinktos identišku būdu.

Nustatyta priklausomybė tarp molekulinės masės ir eliuavimo tūrio galioja tik konkretaus bandymo specifinėmis sąlygomis. Svarbiausios sąlygos yra temperatūra, tirpiklis (arba tirpiklių mišinys), chromatografavimo sąlygos ir atskyrimo kolonėlė arba kolonėlių sistema.

Taip nustatytos bandinio molekulinės masės yra santykinės vertės ir vadinamos "molekulinėmis masėmis pagal polistireną". Tai reiškia, kad dėl sandaros ir cheminių skirtumų tarp bandinio ir etalonų molekulinės masės nuo absoliučiųjų verčių gali skirtis didesniu arba mažesniu laipsniu. Jei naudojami kiti etalonai, pvz., polietilenglikolis, polioksietilenas, polimetilmetakrilatas, poliakrilo rūgštis, turi būti nurodyta priežastis.

1.4. Bandymų metodo esmė

Bandinio molekulinės masės skirstinys ir vidutinės molekulinės masės (Mn, Mw) gali būti nustatyti taikant GPC. GPC yra specialus skysčių chromatografijos metodas, kuriame bandinys atskiriamas pagal atskirų komponentų hidrodinaminius tūrius (2).

Atskyrimas vyksta, kai bandinys praeina per kolonėlę, užpildytą poringa medžiaga, dažniausiai organiniu geliu. Mažos molekulės gali įsiskverbti į poras, tuo tarpu didelės molekulės ekskliuduojamos. Todėl didelių molekulių kelias yra trumpesnis ir jos išplaunamos pirmos. Vidutinio dydžio molekulės įsiskverbia į kai kurias poras ir išplaunamos vėliau. Mažiausios molekulės, kurių vidutinis hidrodinaminis spindulys yra mažesnis nei gelio poros, gali įsiskverbti į visas poras. Šios molekulės išplaunamos paskutinės.

Teoriškai atskyrimą apsprendžia vien tik molekulių dydis, tačiau praktikoje sunku išvengti kai kurių trukdančių sugerties veiksnių. Netolygus kolonėlės užpildymas ir nenaudingi tūriai gali bloginti padėtį (2).

Aptikimas atliekamas, pvz., matuojant lūžio rodiklį arba UV-sugertį, gaunama paprasta pasiskirstymo kreivė. Tačiau norint kreivei priskirti tikrąsias molekulinės masės vertes, kolonėlę reikia kalibruoti, leidžiant per ją žinomos molekulinės masės polimerus ir geriausiai būtų apskritai panašios sandaros polimerus, pvz., įvairius polistireno etalonus. Vertikaliojoje ašyje žymint įvairios molekulinės masės išplautų dalelių kiekį, kuris reiškiamas mase, o horizontaliojoje ašyje — molekulinės masės logaritmą, paprastai gaunama Gauso kreivė, kartais mažos molekulinės masės pusėje iškreipta nedidele uodega.

Pagal šią kreivę nustatomas mažos molekulinės masės medžiagų kiekis. Apskaičiavimas gali būti tikslus tik tuo atveju, jei mažos molekulinės masės dalelių atsakas yra ekvivalentiškas jų masės daliai polimere.

1.5. Kokybės kriterijai

Eliuavimo tūrio pakartojamumas (variacijos koeficientas) turi būti geresnis nei 0,3 %. Jei vertinant skirtingu laiku darytą chromatogramą, ji neatitinka tik ką minėto kriterijaus, reikiamas analizės pakartojamumas turi būti užtikrintas atliekant korekciją vidiniu etalonu (1). Polidispersiškumas priklauso nuo etalonų molekulinės masės. Polistireno etalonų atveju tipiškos vertės yra tokios:

Mp < 2000 | Mw/Mn < 1,20 |

2000 ≤ Mp ≤ 106 | Mw/Mn < 1,05 |

Mp > 106 | Mw/Mn < 1,20 |

(Mp yra etalono molekulinė masė, atinkanti smailės viršūnę).

1.6. Bandymų metodo aprašymas

1.6.1. Etaloninių polistireno tirpalų ruošimas

Polistireno etalonai ištirpinami juos kruopščiai sumaišant su pasirinktu eliuentu. Ruošiant tirpalus turi būti atsižvelta į gamintojo rekomendacijas.

Pasirinktų etalonų koncentracijos priklauso nuo įvairių veiksnių, pvz., injekcijos tūrio, tirpalo klampio ir analizinio detektoriaus jautrumo. Norint išvengti perkrovos, didžiausias injekcijos tūris turi būti pritaikytas kolonėlės ilgiui. Taikant GPC medžiagų atskyrimui analizėje, tipiški injekcijos tūriai 30 cm x 7,8 mm kolonėlei paprastai yra 40–100 μ1. Galima naudoti didesnį tūrį, tačiau jis neturi viršyti 250 μ1. Prieš pradedant tikrąjį kolonėlės kalibravimą, turi būti nustatytas optimalus santykis tarp injekcijos tūrio ir koncentracijos.

1.6.2. Bandinio tirpalo ruošimas

Iš esmės tie patys reikalavimai taikomi ruošiant bandinių tirpalus. Bandinys ištirpinamas tinkamame tirpiklyje, pvz., tetrahidrofurane, kruopščiai maišant. Jokiu būdu negalima tirpinti naudojant ultragarsinę vonią. Jei būtina, bandinio tirpalas gryninamas, filtruojant per membraninį filtrą, kurio porų dydis 0,2-2 μm.

Galutinėje ataskaitoje turi būti pažymėta, ar buvo neištirpusių dalelių, nes tai gali būti didelės molekulinės masės medžiagų dalelės. Ištirpusių dalelių procentinei masės daliai nustatyti turi būti taikomas tinkamas metodas. Tirpalai turi būti panaudoti per 24 valandas.

1.6.3. Pataisos atsižvelgiant į priemaišų ir priedų kiekį

Paprastai būtina daryti medžiagų, kurių molekulinė masė M < 1000, kiekio pataisas atsižvelgiant į esančių nepolimerinių medžiagų (pvz., priemaišų ir (arba) priedų) indėlį, išskyrus kai nustatytas kiekis ir taip jau < 1 %. Tai daroma polimero tirpalo arba GPC eliuato tiesioginės analizės būdu.

Tais atvejais, kai išėjusio iš kolonėlės eliuato koncentracija tolesnei analizei per maža, jis turi būti koncentruojamas. Gali prireikti eliuatą išgarinti iki sauso likučio ir vėl jį ištirpinti. Eliuato koncentravimas turi būti atliktas tokiomis sąlygomis, kurios užtikrintų, kad eliuatas išliks nepakitęs. Eliuato apdorojimas po GPC pakopos priklauso nuo kiekybiniam nustatymui taikomo metodo.

1.6.4. Aparatūra

- rezervuaras tirpikliui,

- nudujinimo įtaisas (jei reikia),

- siurblys,

- pulsacijų slopintuvas (jei reikia),

- injekcijos sistema,

- chromatografinės kolonėlės,

- detektorius,

- debitmatis (jei reikia),

- duomenų registruotuvas-procesorius,

- atliekų indas.

Turi būti užtikrinta, kad GPC sistema būtų inertiška naudojamiems tirpikliams (pvz., naudojant plieninius kapiliarus, jei tirpiklis tetrahidrofuranas).

1.6.5. Injekcijos ir tirpiklio tiekimo sistema

Tam tikras bandinio tirpalo tūris griežtai nustatytoje zonoje įleidžiamas į kolonėlę, naudojant automatinį bandinio tiektuvą arba rankiniu būdu. Švirkšto plunžerio per greitas ištraukimas arba spaudimas įleidžiant rankiniu būdu gali būti molekulinių masių stebimo pasiskirstymo pokyčių priežastimi. Kiek įmanoma, tirpiklio tiekimo sistema turi būti be pulsacijų, geriausiu atveju jai reikia pulsacijų slopintuvo. Srautas yra apie 1 ml/min.

1.6.6. Kolonėlė

Atsižvelgiant į bandinį, polimeras tiriamas naudojant vieną paprastą kolonėlę arba kelias nuosekliai sujungtas kolonėles. Prekyboje yra keletas kolonėlėms užpildyti naudojamų poringų medžiagų su apibrėžtomis savybėmis (pvz., porų dydžiu, ekskliudavimo ribomis). Atskyrimui naudojamo gelio arba kolonėlės aukščio pasirinkimas priklauso ir nuo bandinio savybių (hidrodinaminių tūrių, molekulinės masės pasiskirstymo) ir nuo specifinių atskyrimo sąlygų, pvz., tirpiklio, temperatūros ir srauto (1) (2) (3).

1.6.7. Teorinės lėkštelės

Atskyrimui naudojama kolonėlė arba kolonėlių sistema turi būti apibūdinta teorinių lėkštelių skaičiumi. Tetrahidrofurano kaip eliuento atveju reikia į žinomo ilgio kolonėlę įleisti etilbenzeno arba kito tinkamo nepolinio tirpiklio tirpalą. Teorinių lėkštelių skaičius randamas pagal tokią lygtį:

N = 5,54

arba

N = 16

kurioje:

N teorinių lėkštelių skaičius,

Ve smailės viršūnę atitinkantis eliuavimo tūris,

W smailės plotis pagrindo linijoje,

W1/2 smailės plotis per smailės aukščio vidurį.

1.6.8. Atskyrimo efektyvumas

Be teorinių lėkštelių skaičiaus, kuris apsprendžia juostos plotį, tam tikrą vaidmenį vaidina atskyrimo efektyvumas, kurį apibūdina kalibracinės kreivės statumas. Kolonėlės atskyrimo efektyvumas nustatomas pagal tokią priklausomybę:

V

- V

10M

≥ 6,0

cm3/cm2

kurioje:

Ve, Mx polistireno, turinčio molekulinę masę Mx, eliuavimo tūris,

Ve, (10Mx) polistireno, turinčio 10 kartų didesnę molekulinę masę, eliuavimo tūris.

Sistemos atskiriamoji galia dažniausiai apibrėžiama taip:

R

= 2 ×

×

M

/M

1

čia:

Ve1, Ve2 dviejų polistireno etalonų eliuavimo tūriai, atitinkantys smailės viršūnę,

W1, W2 smailių pločiai pagrindo linijoje,

M1, M2 molekulinės masės, atitinkančios smailių viršūnes (turi skirtis 10 kartų).

Kolonėlės sistemai R vertė turi būti didesnė kaip 1,7 (4).

1.6.9. Tirpikliai

Visi tirpikliai turi būti labai gryni (tetrahidrofurano grynumas 99,5 %). Tirpiklio indas (jei reikia inertinių dujų atmosferoje) turi būti pakankamai didelis kolonėlei kalibruoti ir kelių bandinių analizei atlikti. Tirpiklis, prieš tai kaip jį tiekti siurbliu į kolonėlę, turi būti nudujintas.

1.6.10. Temperatūros reguliavimas

Svarbių vidinių komponentų (injekcijos kilpos, kolonėlių, detektoriaus ir vamzdžių) temperatūra turi būti pastovi ir atitikti pasirinktą tirpiklį.

1.6.11. Detektorius

Detektoriaus paskirtis — kiekybiškai registruoti iš kolonėlės išplauto bandinio koncentraciją. norint, kas smailės nebūtų labai plačios, detektoriaus kiuvetės tūris turi būti kuo mažesnis. Jis neturi būti didesnis kaip 10 μl, išskyrus šviesos sklaidos ir klampio detektorius. Detektavimui paprastai naudojama diferencinė refraktometrija. Tačiau, jei to reikalauja bandinio specifinės savybės arba eliuavimo tirpiklis, gali būti naudojami kitų tipų detektoriai, pvz., UV/VIS, IR, klampio detektoriai ir t. t.

2. DUOMENYS IR ATASKAITA

2.1. Duomenys

Išsamių vertinimo kriterijų, taip pat duomenų kaupimui ir apdorojimui keliamų reikalavimų reikia ieškoti DIN standarte (1).

Kiekvienam bandiniui turi būti atlikti du nepriklausomi bandymai. Bandiniai turi būti analizuojami atskirai. Visais atvejais taip pat yra svarbu apskaičiuoti tuščiųjų bandinių, apdorojamų vienodai su bandiniu, duomenis.

Būtina aiškiai nurodyti, kad išmatuotos vertės yra santykinės vertės, atitinkančios naudojamų etalonų molekulinę masę.

Po sulaikymo tūrio arba sulaikymo trukmės verčių (galbūt pataisytų naudojant vidinį etaloną) nustatymo vienam šių dydžių atidedamos log Mp vertės (Mp yra kalibravimo etalono smailės viršūnę atitinkanti vertė). Kiekvienai molekulinės masės dešimtainei skilčiai būtina turėti bent du kalibravimo taškus, o visai kalibracinei kreivei, kuri turi apimti įvertintą bandinio molekulinę masę, turi būti bent penki matavimų taškai. Mažą molekulinę masę atitinkantis kalibracinės kreivės galinis taškas nustatomas pagal n — heksilbenzeną arba kitokį tinkamą nepolinį tirpiklį. Kreivės dalis, atitinkanti mažesnę nei 1000 molekulinę masę, apskaičiuojama ir prireikus pataisoma atsižvelgiant į priemaišas ir priedus. Eliavimo kreivės paprastai vertinamos elektroninio duomenų apdorojimo būdu. Atliekant apskaičiavimus rankiniu būdu, galima pasižiūrėti į ASTM D 3536-91 (3).

Jei kolonėlėje sulaikomas koks nors netirpus polimeras, jo molekulinė masė greičiausiai yra didesnė nei tirpiosios dalies, ir jei į jo kiekį neatsižvelgti, gaunamas mažos molekulinės masės medžiagų kiekio pervertinimas. Papildyme pateikiamos rekomendacijos, kaip daryti mažos molekulinės masės medžiagų kiekio pataisą atsižvelgiant į netirpų polimerą.

Pasiskirstymo kreivė turi būti pateikta lentelės pavidalu arba kaip grafikas (diferencinis dažnis arba bendrojo kiekio procentinės dalys pagal log M). Vaizduojant grafiškai viena molekulinės masės dešimtainė skiltis paprastai turi būti 4 cm pločio, o smailės viršūnės aukštis turi būti apie 8 cm. Integralinių pasiskirstymo kreivių atveju atstumas ordinatėje tarp taškų, atitinkančių 0 ir 100 %, turi būti apie 10 cm.

2.2. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:

2.2.1. Bandymų medžiaga

- turima informacija apie bandomąją medžiagą (identiškumas, priedai, priemaišos),

- bandinio apdorojimo aprašymas, pastebėjimai, problemos.

2.2.2. Aparatūra

- tirpiklio rezervuaras, inertinės dujos, eliuento nudujinimas, eliuento sudėtis, priemaišos,

- siurblys, pulsacijų slopintuvas, injekcijos sistema,

- atskyrimo kolonėlės (gamintojas, visa informacija apie kolonėlių chakteristikas, pvz., porų dydis, atskyrimo medžiagos rūšis ir t. t., naudotų kolonėlių skaičius, ilgis ir jungimo tvarka),

- kolonėlės (arba jų rinkinio) teorinių lėkštelių skaičius, atskyrimo efektyvumas (sistemos atskyrimo galia),

- informacija apie smailių simetriją,

- kolonėlės temperatūra, temperatūros reguliavimo būdas,

- detektorius (matavimo principas, tipas, kiuvetės tūris),

- debitmatis, jei buvo naudotas (gamintojas, matavimo principas),

- duomenų registravimo ir apdorojimo sistema (aparatinė įranga ir programinė įranga).

2.2.3. Sistemos kalibravimas

- kalibracinės kreivės gavimo metodo detalus aprašymas,

- informacija apie šio metodo kokybės kriterijus (pvz., koreliacijos koeficientą, paklaidų kvadratų sumą ir t. t.),

- informacija apie visas ekstrapoliacijas, prielaidas ir aproksimacijas, darytas bandymo eigoje ir vertinant bei apdorojant duomenis,

- visi matavimai, naudoti kalibracinei kreivei gauti, turi būti dokumentuoti lentelėje, kurioje kiekvienam kalibravimo taškui būtų pateikta tokia informacija:

- bandinio pavadinimas,

- bandinio gamintojas,

- etalonų būdingosios vertės Mp, Mn, Mw ir Mw/Mn, kokias pateikė gamintojas, arba gautos vėlesniuose matavimuose, kartu nurodant nustatymo metodo detales,

- injekcijos tūris ir injekcijos koncentracija,

- kalibravimui naudota Mp vertė,

- išmatuotas eliuavimo tūris arba pataisyta sulaikymo trukmė, atitinkantys smailės viršūnę,

- smailės viršūnę atitinkanti apskaičiuota Mp vertė,

- apskaičiuotos ir kalibravimui naudotos Mp vertės procentinė paklaida.

2.2.4. Informacija apie mažą molekulinę masę turinčio polimero kiekį

- analizei taikytų metodų aprašymas ir bandymų atlikimo eiga,

- informacija apie mažos molekulinės masės medžiagų procentinę dalį (m/m), apskaičiuotą viso bandinio masei,

- informacija apie priemaišų, priedų ir kitų nepolimerinių medžiagų masės procentinę dalį, apskaičiuotą viso bandinio masei.

2.2.5. Vertinimas:

- vertinimas laiko pagrindu: visi metodai taikyti reikiamam pakartojamumui užtikrinti (pataisų darymo metodas, vidinis standartas ir t. t.),

- informacija apie tai, ar vertinimas buvo atliekamas pagal eliuavimo tūrį ar pagal sulaikymo trukmę,

- informacija apie vertinimo ribas, jei smailė nėra iki galo analizuota,

- suglodinimo metodų aprašymas, jei jie buvo taikyti,

- bandinio ruošimo ir išankstinio apdorojimo metodikos,

- duomenys apie neištirpusias daleles, jei yra,

- injekcijos tūris (μl) ir injekcijos koncentracija (mg/ml),

- stebėjimų duomenys, nurodantys veiksnius, kurie yra nukrypimų nuo teorinio GPC profilio priežastis,

- bandymo metodikose darytų visų keitimų detalus aprašymas,

- detalės apie paklaidų intervalus,

- bet kokia kita informacija ir stebėjimų duomenys, reikalingi duomenims interpretuoti.

3. NUORODOS

(1) DIN 55672 (1995). Gelpermeationschromatographie (GPC) mit Tetrahydrofuran (THF) als Elutionsmittel, Teil 1.

(2) Yau, W. W., Kirkland, J. J. and Bly, D. D. eds. (1979). Modern Size Exclusion Liquid Chromatography, J. Wiley and Sons.

(3) ASTM D 3536-91, (1991). Standard Test Method for Molecular Weight Averages and Molecular Weight Distribution by Liquid Exclusion Chromatography (Gel Permeation Chromatography-GPC). American Society for Testing and Materials. Philadelphia, Pennsylvania.

(4) ASTM D 5296-92, (1992). Standard Test Method for Molecular Weight Averages ir Molecular Weight Distribution of Polystyrene by High Performance Size-Exclusion Chromatography. American Society for Testing ir Materials. Philadelphia. Pennsylvania.

--------------------------------------------------

III C PRIEDAS

A.20. POLIMERŲ TIRPIMAS (EKSTRAHAVIMAS) VANDENYJE

1. METODAS

Aprašytas metodas yra OECD TG 120 (1997) pataisytos versijos kopija. Kita techninė informacija pateikta (1) nuorodoje.

1.1. Įvadas

Prieš taikant toliau išdėstytą metodą, kai kuriems polimerams, pvz., emulsiniams polimerams, gali būti reikalingi paruošiamieji darbai. Metodas netaikomas skystiesiems polimerams ir polimerams, kurie bandymo sąlygomis reaguoja su vandeniu.

Kai metodą taikyti netikslinga arba neįmanoma, polimerų tirpimas (ekstrahavimas) gali būti tiriamas kitų metodų pagalba. Tokiais atvejais turi būti pateiktos visos metodo detalės ir pagrindimas.

1.2. Etaloninės medžiagos

Nėra.

1.3. Bandymų metodo esmė

Polimerų tirpimas (ekstrahavimas) vandeninėje terpėje nustatomas taikant kolbos metodą (žr. A.6 tirpumas vandenyje, kolbos metodas), kuriame daromi toliau aprašyti pakeitimai.

1.4. Kokybės kriterijai

Nėra.

1.5. Bandymų metodo aprašymas

1.5.1. Įranga

Bandant šiuo metodu reikalinga tokia įranga:

- trupintuvas, pvz., malūnas žinomo dydžio dalelėms gauti,

- purtyklė, kur būtų galima reguliuoti temperatūrą,

- membraninių filtrų sistema,

- atitinkama analizinė įranga,

- standartizuoti sietai.

1.5.2. Bandinių ruošimas

Reprezentatyvus bandinys iš pradžių turi būti susmulkintas iki 0,125-0,25 mm dydžio dalelių, naudojant atitinkamus sietus. Bandinio patvarumui užtikrinti arba malimo procese gali būti reikalingas aušinimas. Medžiagos gumos pagrindu gali būti trupinamos skystojo azoto temperatūroje (1).

Jei reikiamo dydžio dalelių frakcijos gauti negalima, turi būti imtasi veiksmų dalelių dydžiui kiek įmanoma sumažinti, o rezultatas turi būti pateiktas ataskaitoje. Ataskaitoje būtina nurodyti būdą, kaip sutrupintas bandinys buvo laikomas prieš bandymą.

1.5.3. Bandymo eiga

Į tris indus su stikliniais kamščiais atskirai pasveriami trys bandomosios medžiagos 10 g masės bandiniai ir į kiekvieną indą įpilama 1000 ml vandens. Jei pasirodo, kad 10 g polimero apdoroti nėra galimybės, turi būti naudojamas kitas gretimas didžiausias kiekis, kurį galima apdoroti, o vandens tūris atitinkamai keičiamas.

Indai gerai užkemšami ir purtomi 20 °C temperatūroje. Turi būti naudojamas purtymo arba maišymo įtaisas, galintis veikti pastovioje temperatūroje. Po 24 valandų kiekvieno indo turinys centrifuguojamas arba filtruojamas ir atinkamu analizės metodu skaidrioje vandeninėje fazėje nustatoma polimero koncentracija. Jei tinkamų metodų analizuoti vandeninėje terpėje nėra, bendrasis tirpumas (ekstrahuojamumas) gali būti nustaytas pagal sauso likučio ant filtro arba sausų centrifugavimo nuosėdų masę.

Paprastai būtina kiekybiškai atskirti priemaišas ir priedus nuo mažos molekulinės masės medžiagų. Gravimetrinio nustatymo atveju, norint atsižvelgti į likučius, atsirandančius dėl bandymo metodikos taikymo, svarbu atlikti tuščiąjį bandymą be bandomosios medžiagos.

Polimerų tirpimas (ekstrahavimas) vandenyje 37 °C temperatūros ir pH 2 bei pH 9 sąlygomis gali būti nustatytas tokiu pat būdu, kuris aprašytas atliekant bandymą 20 °C temperatūroje. pH vertė gali būti reguliuojama pridedant tinkamo buferinio tirpalo arba tinkamų rūgščių ar šarmų, pvz., druskos rūgšties, acto rūgšties, analiziškai gryno natrio ar kalio hidroksido, arba NH3.

Atsižvelgiant į taikomą analizės metodą turi būti atliekami vienas arba du bandymai. Kai yra pakankamai specifiniai tiesioginės polimerų komponentų analizės vandeninėje terpėje metodai, turėtų pakakti vieno anksčiau aprašyto bandymo. Tačiau kai tokių metodų nėra, o polimero tirpimo (ekstrahavimo) nustatymas apribotas tik netiesiogine analize, vandeniniame ekstrakte nustatant tik bendrosios organinės anglies kiekį (BOA), turi būti atliktas papildomas bandymas. Be to, šis papildomas bandymas turi būti atliekamas tris kartus, naudojant 10 kartų mažesnius polimero bandinius ir tuos pačius vandens kiekius, kurie buvo naudojami pirmajame bandyme.

1.5.4. Analizė

1.5.4.1. Vieno dydžio bandinio analizė

Gali būti tiesioginės polimero komponentų analizės vandeninėje terpėje metodai. Kaip alternatyvą galima būtų svarstyti galimybę netiesiogiai analizuoti ištirpintų (ekstrahuotų) polimerų komponentus, nustatant bendrąjį tirpiųjų dalių kiekį ir darant pataisas dėl polimerams nebūdingų komponentų buvimo.

Analizė vandeninėje fazėje visų polimerinių medžiagų bendrajam kiekiui nustatyti galima:

jei taikomas pakankamai jautrus metodas, pvz.:

- BOA nustatymas, taikant šlapią suardymą persulfatu arba dichromatu CO2 gauti, kurio kiekis įvertinamas IR arba cheminės analizės metodu,

- atominė absorbcinė analizė (AAS) arba jos induktyviai sužadintos plazmos (ICP) emisijos atitikmuo silicio arba metalų turintiems polimerams nustatyti,

- UV absorbcija arba spektrofluorimetrija arilų polimerams,

- LC-MS (skysčių chromatografija — masių spektroskopija) mažos molekulinės masės bandiniams,

arba atliekamas vandeninio ekstrakto garinimas vakuume iki sauso likučio ir jo spektrinė analizė (IR, UV ir t. t.) arba likučio AAS (ICP) analizė.

Jei pačios vandeninės fazės analizė neįmanoma, vandeninis ekstraktas turi būti ekstrahuojamas organiniu tirpikliu, kuris nesimaišo su vandeniu, pvz., chlorintuoju angliavandeniliu. Tirpiklis vėliau išgarinamas, o likutis analizuojamas, kaip anksčiau nurodyta, polimero kiekiui nustatyti. Visų šio likučio komponentų, kurie identifikuojami kaip priemaišos arba priedai, kiekis turi būti atimtas, kad būtų galima nustatyti paties polimero tirpimo (ekstrahavimo) laipsnį.

Kai tokių medžiagų kiekis yra gana didelis, likutį gali tekti analizuoti, pvz., HPLC (didelio efektyvumo skysčių chromatografijos) arba GPC (gelchromatografijos) metodais, kurių pagalba priemaišos būtų atskirtos nuo monomero ir jo darinių, kad būtų galima nustatyti tikrąjį pastarųjų medžiagų kiekį.

Kai kuriais atvejais gal būt pakaktų tiesiog išgarinti organinį tirpiklį iki sauso likučio ir jį pasverti.

1.5.4.2. Bandymas su dviem skirtingo dydžio bandiniais

Visuose vandeniniuose ekstraktuose atliekama BOA analizė.

Neištirpusi bandinio dalis (likutis po ekstrahavimo) analizuojama gravimetriškai. Jei po kiekvieno indo turinio centrifugavimo arba filtravimo, polimero likučiai lieka ant indo sienelių, indas turi būti skalaujamas filtratu tol, kol inde nelieka jokių matomų likučių. Toliau filtratas vėl centrifuguojamas arba filtruojamas. Ant filtro arba centrifugavimo mėgintuvėlyje esantis likutis džiovinamas vakuume 40 °C temperatūroje ir sveriamas. Džiovinama tol, kol gaunama pastovi masė.

2. DUOMENYS

2.1. Bandymas, atliktas naudojant vieno dydžio bandinį

Turi būti pateikti kiekvienai iš trijų kolbų gauti atskiri rezultatai ir jų vidutinės vertės, išreiškiant masės vienetais tirpalo tūriui (paprastai mg/1) arba masės vienetais polimero masei (paprastai mg/g). Taip pat papildomai turi būti pateiktas bandinio masės nuostolis (apskaičiuotas tirpinio masę dalinant iš pradinio bandinio masės). Turi būti apskaičiuoti variacijos koeficientai. Atskiri skaičiai turi būti pateikti visai medžiagai (polimeras + pagrindiniai priedai ir t. t.) ir tik polimerui (t. y. atimant tokių priedų indėlį).

2.2. Bandymas, atliktas naudojant dvejus skirtingus bandinio dydžius

Turi būti pateiktos atskiros BOA kiekio vandeniniuose ekstraktuose vertės, gautos dviejuose trigubuose bandymuose, ir kiekvieno bandymo vidutinė vertė, išreiškiant masės vienetais tirpalo tūriui (paprasta mgC/l), taip pat masės vienetais pradinio bandinio masei (paprastai mgC/g).

Jei tarp rezultatų, gautų dideliam ir mažam bandinio masės bei vandens santykiui, skirtumo nėra, tai galėtų rodyti, kad visi ekstrahuojami komponentai buvo iš tikrųjų ekstrahuoti. Tokiu atveju, tiesioginė analizė paprastai nebūtina.

Turi būti pateiktos likučių atskiros masės ir išreikštos pradinės bandinio masės procentais. Turi būti apskaičiuojamos bandyme gautos vidutinės vertės. Skirtumas tarp 100 ir nustatyto procentinio kiekio rodo tirpios ir ekstrahuojamos medžiagos procentinį kiekį pradiniame bandinyje.

3. ATASKAITA

3.1. Bandymų ataskaita

Bandymų ataskaitoje turi būti tokia informacija:

3.1.1. Bandomoji medžiaga

- turima informacija apie bandomąją medžiaga (identiškumas, priedai, priemaišos, mažos molekulinės masės medžiagų kiekis).

3.1.2. Bandymų sąlygos

- naudotų metodikų ir bandymų sąlygų aprašymas,

- analizės ir aptikimo metodų aprašymas.

3.1.3. Rezultatai

- tirpumo (ekstahuojamumo) rezultatai, mg/1; atskiros ir vidutinės vertės ekstrahavimo bandymuose įvairiuose tirpaluose, suardyto polimero kiekis ir priemaišos, priedai ir t. t.,

- tirpumo (ekstrahuojamumo) rezultatai mg/g polimero,

- vandeninių ekstraktų BOA vertės, tirpalo masė ir apskaičiuotas kiekis procentais, jei matuotas,

- kiekvieno bandinio pH,

- informacija apie tuščiajame bandyme gautas vertes,

- jei būtina, nuorodos į bandymo medžiagos nepatvarumą bandymo ir analizės eigoje,

- visa informacija, kuri yra svarbi interpretuojant rezultatus.

4. NUORODOS

(1) DIN 53733 (1976) Zerkleinerung von Kunststofferzeugnissen für Prüfzwecke.

--------------------------------------------------

III D PRIEDAS

C.13 BIOLOGINIS KONCENTRAVIMAS: BANDYMAS SU ŽUVIMIS PRATEKĖJIMO SĄLYGOMIS

1. METODAS

Šis biologinio koncentravimo metodas yra OECD TG 305 (1996) kopija.

1.1. Įvadas

Šis metodas aprašo pratekėjimo sąlygomis vykstančio medžiagų biologinio kaupimosi žuvyse gebos apibūdinimo metodiką. Nors kur kas geriau taikyti metodą pratekėjimo sąlygomis, leidžiama naudoti pusiau stacionarius režimus, jei jie atitinka patikimumo kriterijus.

Metodas pateikia pakankamą kiekį bandymui atlikti reikalingų detalių, tačiau palieka atitinkamą laisvę eksperimento schemai pritaikyti konkrečių laboratorijų sąlygoms ir keisti bandymo medžiagų charakteristikas. Jis labiausiai tinka patvarioms organinėms medžiagoms, kurių log Pow vertės yra nuo 1,5 iki 6,0 (1), tačiau gali būti taikomas ir ypatingai lipofilinėms medžiagoms (kurių log Pow > 6,0). Tokių ypatingai lipofilinių medžiagų biologinio koncentravimo faktoriaus (BKF), kartais žymimo KB, išankstinis įvertis greičiausiai būtų didesnis, nei nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktoriaus (BKFNB) vertė, kurios reikėtų laukti laboratoriniuose bandymuose. Medžiagų, kurių log Pow vertės yra iki 9,0, išankstiniai biologinio koncentravimo faktoriaus įverčiai gali būti gauti naudojant Bintein ir kt. lygtį (2). Parametrams, kurie apibūdina biologinio koncentravimo gebą, priklauso sugerties greičio konstanta (k1), apsivalymo greičio konstanta (k2) ir BKFNB.

Žymėtuosius atomus turinčios bandymo medžiagos gali palengvinti vandens ir žuvų bandinių analizę ir gali būti naudojamos norint nustatyti, ar reikia atlikti irimo produktų identifikavimą ir kiekybinį nustatymą. Jei matuojamas bendras radioaktyviųjų likučių kiekis (pvz., deginant arba tirpinant audinius), BKF remiasi pradinio junginio, visų sulaikytų metabolitų, o taip pat įsisavintos anglies kiekiu. Taigi, BKF vertės, besiremiančios bendruoju radioaktyviųjų likučių kiekių, negali būti tiesiogiai lyginamos su BKF vertėmis, gautomis atliekant tik pradinio junginio selektyviąją analizę.

Norint nustatyti BKF, kuris remiasi tik pradinio junginio kiekiu, tyrimuose su žymėtaisiais atomais gali būti naudojamos gryninimo metodikos, o pagrindiniai irimo produktai gali būti apibūdinti, jei manoma, kad tai yra būtina. Analizuojant ir identifikuojant likučius audiniuose, galima sujungti medžiagų apykaitos žuvyse tyrimus su biologinio koncentravimo tyrimais.

1.2. Apibrėžimai ir vienetai

Biologinis koncentravimas (biologinis kaupimas) yra bandymo medžiagos koncentracijos didėjimas organizme (jo nustatytuose audiniuose) arba organizmo paviršiuje lyginant su bandymo medžiagos koncentracija aplinkinėje terpėje.

Biologinio koncentravimo faktorius (BKF arba KB) yra bandymo medžiagos koncentracijos žuvies viduje (paviršiuje) arba jos nustatytuose audiniuose (Cf, μg/g (ppm)) ir cheminės medžiagos koncentracijos aplinkinėje terpėje (Cw, as (μg/ml (ppm)) santykis bet kuriuo šio koncentravimo bandymo sugerties tarpsnio metu.

Nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BKFNB arba KB) žymiai nekinta ilgesnį laiko tarpą, bandymo medžiagos koncentracijai aplinkinėje terpėje šį laiko tarpą esant pastoviai.

Horizontalioji dalis arba nuostovioji būsena pasiekiama tuomet, kai bandymo medžiagos koncentracijos žuvyje (Cf) priklausomybės nuo laiko kreivė tampa lygiagreti laiko ašiai, o trys Cf vertės, gautos paeiliui analizuojant bent kas dvi paras paimtus bandinius, viena nuo kitos nesiskiria daugiau kaip ± 20 %, ir nėra žymių skirtumų tarp trijų bandinių ėmimo periodų. Kai analizuojami sujungti bandiniai, reikia ne mažiau kaip keturių paeiliui padarytų analizių. Lėtai sugeriamoms bandymų medžiagoms labiau tiktų septynių parų tarpai.

Biologinio koncentravimo faktorius, apskaičiuotas tiesiog iš kinetinių greičio konstantų (k1/k2), yra vadinamas kinetiniu koncentravimo faktoriumi, BKFk.

Pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientas (Pow) yra cheminės medžiagos pusiausvyrojo tirpumo n — oktanolyje ir vandenyje santykis (A.8 metodas), taip pat išreiškiamas Kow. Pow logaritmas naudojamas cheminės medžiagos biologinio koncentravimo vandens organizmuose gebos rodikliu.

Veikimo arba sugerties tarpsnis yra laikas, kurį žuvis yra veikiama bandymo medžiagos.

Sugerties greičio konstanta (k1) yra skaitinė vertė, apibūdinanti bandymo medžiagos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba nustatytuose jos audiniuose) didėjimo greitį, kai žuvis veikiama chemine medžiaga (k1 išreiškiama para- 1).

Tarpsnis po veikimo arba apsivalymo (netekimo) tarpsnis yra laikas, kai bandomoji žuvis buvo pernešta iš terpės su bandymo medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra, kuomet tiriamas apsivalymas (arba bendras mažėjimas) nuo šios medžiagos žuvyje (arba nustatytuose jos audiniuose).

Apsivalymo (netekimo) greičio konstanta (k2) yra skaitinė vertė, apibūdinanti bandymo medžiagos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba nustatytuose jos audiniuose) mažėjimo greitį po to, kai bandomoji žuvis buvo pernešta iš terpės su bandymo medžiaga į terpę, kurioje šios medžiagos nėra (k2 išreiškiama para- 1).

1.3. Bandymų metodo esmė

Bandymas susideda iš dviejų tarpsnių: veikimo (sugerties) ir tarpsnio po veikimo (apsivalymo). Sugerties tarpsnio metu atskiros vienos rūšies žuvų grupės veikiamos bent dviejų koncentracijų bandymo medžiaga. Vėliau apsivalymo tarpsniui jos pernešamos į terpę be bandymo medžiagos. Apsivalymo tarpsnis būtinas visuomet, išskyrus atvejus, kai medžiagos sugertis sugerties tarpsnio metu buvo nežymi (pvz., BKF yra mažesnis kaip 10). Bandymo medžiagos koncentracija žuvyje (jos paviršiuje) (arba nustatytuose jos audiniuose) matuojama abiejuose bandymo tarpsniuose. Be dviejų bandymo koncentracijų, kontrolinė žuvų grupė laikoma tokiomis pačiomis sąlygomis, bet be bandymo medžiagos, norint biologinio koncentravimo bandyme pastebėtas galimas neigiamas pasekmes palyginti su palyginamąja kontroline grupe ir gauti bandymo medžiagos fono koncentracijas.

Sugerties tarpsnis vykdomas 28 paras, jei neįrodoma, kad pusiausvyra yra pasiekta anksčiau. Sugerties tarpsnio trukmės ir nuostoviosios būsenos laiko prognozė gali būti padaryta pagal 3 papildymo lygtį. Pernešus žuvis į kitą švarų indą su ta pačia terpe, bet be bandymo medžiagos, pradedamas apsivalymo periodas. Pageidautina, jei įmanoma, biologinio koncentravimo faktorių apskaičiuoti ir kaip santykį koncentracijos žuvyje (Cf) su koncentracija vandenyje (Cw) tariamosios nuostoviosios būsenos sąlygomis (BKFNB) ir kaip kinetinį biologinio koncentravimo faktorių (BKFk), išreiškiamą sugerties (k1) ir apsivalymo (k2) greičio konstantų santykiu, darant prielaidą apie pirmojo laipsnio kinetiką. Jei pirmojo laipsnio kinetikos akivaizdžiai nepaisoma, turi būti naudojami sudėtingesni modeliai (5 papildymas).

Jei nuostovioji būsena per 28 paras nepasiekiama, sugerties tarpsnis turi būti pratęstas, kol ji bus pasiekta, arba iki 60 parų, žiūrint, kas anksčiau; tuomet pradedamas apsivalymo tarpsnis.

Sugerties greičio konstanta, apsivalymo (netekimo) greičio konstanta (ar konstantos, jei naudojami sudėtingesni modeliai), biologinio koncentravimo faktorius ir, jei įmanoma, kiekvieno šių parametrų pasikliovimo ribos apskaičiuojami pagal modelį, kuris geriausiai aprašo žuvyse ir vandenyje išmatuotas bandymo medžiagos koncentracijas.

BKF yra išreiškiamas kaip žuvies bendrosios šlapios masės funkcija. Tačiau specialiems tikslams, jei žuvis yra pakankamai didelė, gali būti naudojami nustatyti audiniai arba organai (pvz., raumuo, kepenys) arba žuvis gali būti padalinta į valgomąją (filė) ir nevalgomą (viduriai) dalis. Kadangi daugeliui organinių medžiagų yra aiški priklausomybė tarp jų biologinio koncentravimo gebos ir lipofiliškumo, taip pat yra atitinkama priklausomybė tarp riebalų kiekio bandomosiose žuvyse ir stebimo tokių medžiagų biologinio koncentravimo. Tokiu būdu, norint sumažinti šį bandymo rezultatų kintamumo šaltinį, lipofiliškų (t. y. kurių log Pow > 3) medžiagų biologinis koncentravimas turi būti apskaičiuojamas ne tik viso kūno masei, bet ir riebalų kiekiui.

Kai tai galima įgyvendinti, riebalų kiekis turi būti nustatomas toje pačioje biologinėje medžiagoje, kurioje nustatoma bandymų medžiaga.

1.4. Informacija apie bandymų medžiagą

Prieš atliekant biologinio koncentravimo bandymą apie bandymo medžiagą turi būti žinoma tokia informacija:

a) tirpumas vandenyje;

b) pasiskirstymo koeficientas oktanolio ir vandens mišinyje Pow (taip pat žymimas Kow, nustatomas HPLC metodu pagal A.8);

c) hidrolizė;

d) fotocheminis virtimas vandenyje, nustatytas apšvietimo saulės arba modeliuota saulės spinduliuote sąlygomis ir biologinio koncentravimo bandyme naudoto apšvietimo sąlygomis (3);

e) paviršiaus įtempis (t. y. medžiagoms, kurioms log Pow negali būti nustatytas);

f) garų slėgis;

g) biologinio suardomumo lengvumas (jei reikia).

Kita reikalinga informacija yra nuodingumas bandyme naudojamoms žuvų rūšims, geriausiai asimptotiška (t. y. nuo laiko nepriklausanti) LC50 vertė. Reikia turėti tinkamą žinomo tikslumo, preciziškumo ir jautrumo analizinį metodą bandymo medžiagai bandymo tirpaluose ir biologinėje medžiagoje kiekybiškai nustatyti, kartu su bandinių ruošimo ir laikymo detalėmis. Tai pat turi būti žinoma bandymo medžiagos analizinio nustatymo vandenyje ir žuvies audiniuose riba. Kai naudojama 14C žymėta bandymo medžiaga, turi būti žinoma radioaktyvumo dėl priemaišų buvimo procentinė dalis.

1.5. Bandymų patikimumas

Turi būti taikomos tokios sąlygos, kad bandymas būtų patikimas:

- temperatūros kitimas mažesnis kaip ± 2 °C,

- ištirpusio deguonies koncentracija neturi sumažėti daugiau kaip iki 60 % soties koncentracijos,

- sugerties tarpsnio metu bandymo medžiagos koncentracija kameroje palaikoma vidutinių išmatuotų verčių ribose su ± 20 % nuokrypiu,

- bandymo pabaigoje kontrolinių ir veikiamų žuvų mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai (liga) yra mažesnis kaip 10 %; jei bandymas vyksta kelias savaites arba mėnesius, mirtingumas arba kiti neigiami veiksniai abiejose žuvų grupėse turi būti mažesnis kaip 5 % per mėnesį, o bendras mirtingumas ne didesnis kaip 30 %.

1.6. Etaloninės medžiagos

Tikrinant eksperimento metodiką, prireikus būtų naudinga naudoti etalonines medžiagas su žinoma biologinio koncentravimo geba. Tačiau specialios medžiagos vis dar negali būti rekomenduotos.

1.7. Bandymų metodo aprašymas

1.7.1. Aparatūra

Reikia žiūrėti, kad visoms įrangos dalims gaminti būtų vengiama naudoti medžiagas, kurios gali tirpti, sugerti arba išsiplauti ir turėti neigiamą poveikį žuvims. Gali būti naudojami stačiakampio arba ritinio formos standartiniai rezervuarai, kurie būtų pagaminti iš chemiškai inertiškų medžiagų ir kurių tūris atitiktų įkrovos dydį. Minkšti plastikiniai vamzdžiai turi būti kuo mažiau naudojami. Geriausiai naudoti vamzdžius iš teflono (R), nerūdijančio plieno arba stiklo. Patyrimas parodė, kad medžiagoms su dideliu sugerties koeficientu, pvz., sintetiniams piretroidams, gali būti reikalingas silanizuotas stiklas. Tokiais atvejais įranga po naudojimo turėtų būti išmesta.

1.7.2. Vanduo

Bandymuose dažniausiai naudojamas paprastas vanduo, jis turi būti imamas iš neužteršto ir vienodos kokybės šaltinio. Skiedimo vandens kokybė turi būti tokia, kad pasirinktų rūšių žuvys nežūtų per aklimatizavimo ir bandymo laiką, jų išvaizdoje arba elgesyje neatsirandant kažko neįprasto. Geriausiu atveju reikėtų pademonstruoti, kad bandomosios rūšys skiedimo vandenyje gali išlikti, augti ir daugintis (pvz., laboratoriniame bandyme su kultūra arba ilgaamžiškumo ciklo toksikologiniame bandyme). Apibūdinant vandenį turi būti nurodyta bent pH vertė, kietumas, bendras kietųjų dalelių kiekis, bendroji organinė anglis, taip pat pageidautina nurodyti amonio ir nitrito jonų kiekį bei šarmingumą, o jūros žuvų rūšims — sūrumą. Parametrai, kurie būtų svarbūs žuvų optimaliam gerbūviui, yra visiškai žinomi, tačiau 1 papildyme pateiktos rekomenduojamos bandymuose naudojamo gėlo ir jūros vandens eilės komponentų didžiausios koncentracijos.

Vandens kokybė turi būti pastovi visą bandymo laiką. pH vertė turi būti 6,0-8,5 intervale, tačiau konkrečiame bandyme pH reikšmė turi būti ± 0, 5 pH vieneto ribose. Norint užtikrinti, kad skiedimo vanduo per daug neturėtų įtakos bandymo rezultatui (pavyzdžiui, sudarydamas kompleksus su bandymo medžiaga) arba neigiamai veiktų žuvų būrio elgesį, bandiniai per tam tikrus laiko tarpus turi būti imami analizei. Sunkiųjų metalų jonų (pvz., Cu, Pb, Zn, Hg, Cd, Ni), pagrindinių anijonų ir katijonų (pvz., Ca, Mg, Na, K, Cl, SO4), pesticidų (pvz., bendrojo fosforoorganinų ir chlororganinių pesticidų kiekio), bendrosios organinės anglies ir suspenduotų kietųjų dalelių analizė turi būti daroma, pavyzdžiui, kas tris mėnesius, jei žinoma, kad skiedimo vandens kokybė yra gana pastovi. Jei butų parodyta, kad vandens kokybė yra pastovi bent metus, analizė gali būti daroma ne taip dažnai, o tarpai tarp jų padidinti (pvz., kas šešis mėnesius).

Natūralus kietųjų dalelių kiekis, o taip pat bendrosios organinės anglies (BOA) kiekis skiedimo vandenyje turi būti kuo mažesnis, kad būtų išvengta bandymo medžiagos sugerties organine medžiaga, dėl ko gali sumažėti bandymo medžiagos biologinis prieinamumas (4). Didžiausias kietųjų dalelių leistinas kiekis yra 5 mg/l (sausos medžiagos, sulaikomos 0,45 μm filtru), o bendrosios organinės anglies — 2 mg/l (žr. 1 papildymą). Jei reikia, vanduo prieš naudojimą turi būti filtruojamas. Bandomųjų žuvų (ekskrementų) ir maisto likučių indėlis į bendrosios organinės anglies kiekį turi būti kiek įmanoma mažesnis. Organinės anglies koncentracija bandymo rezervuare visą bandymo laiką neturi viršyti bandymo medžiagoje ir, jei naudojama, soliubiliavimo medžiagoje, esančios organinės anglies koncentracijos daugiau kaip 10 mg/l (± 20 %).

1.7.3. Bandymų tirpalai

Ruošiamas reikiamos koncentracijos bandymo medžiagos pradinis tirpalas. Pradinį tirpalą geriausiai būtų ruošti bandymų medžiagą tiesiog maišant arba plakant skiedimo vandenyje. Naudoti tirpiklius arba disperguojančias medžiagas (solubilizavimo medžiagas) nerekomenduojama; tačiau jų gali prireikti kai kuriais atvejais, norint pagaminti pakankamai koncentruotą pradinį tirpalą. Tirpikliai, kuriuos būtų galima naudoti, yra etanolis, metanolis, etandiolio monometilis eteris, etandiolio dimetilis eteris, dimetilformamidas ir trietilenglikolis. Disperguojančios medžiagos, kurias galima naudoti, yra Cremophor RH40, Tween 80, metilceliuliozės 0,01 % tirpalas ir HCO-40. Naudojant biologiškai lengvai suardomas medžiagas reikia žiūrėti, kad neatsirastų problemų dėl bakterijų augimo bandymuose pratekančiame vandenyje. Bandymo medžiaga gali turėti žymėtuosius atomus ir turi būti aukščiausio grynumo (pvz., geriausiai > 98 %).

Bandymuose su pratekančiu vandeniu bandymų koncentracijai bandymų kameroje užtikrinti reikalinga sistema, kuri nuolat dozuotų ir skiestų bandymų medžiagos pradinį tirpalą (pvz., dozuojantis siurblys, proporcingas skiestuvas, saturatoriaus sistema). Geriausiai būtų daryti bent penkis vandens tūrio keitimus per dieną kiekvienoje bandymų kameroje. Geriau naudoti pratekėjimo režimą, tačiau jei jis netinka (pvz., kai tai kenkia bandomiesiems organizmams), galima taikyti pusiau stacionariąją metodiką, jei ji atitinka patikimumo kriterijus. Pradinio tirpalo ir skiedimo vandens srautas turi būti tikrinamas 48 valandas prieš bandymą ir vėliau bent kasdieną visą bandymo laiką. Šio tikrinimo metu nustatomas srautas per kiekvieną kamerą ir užtikrinama, kad jis kameroje arba tarp kamerų nesikeistų daugiau kaip 20 %.

1.7.4. Žuvų rūšies parinkimas

Pasirenkant rūšis svarbu yra tai, ar jas lengva gauti, ar galima gauti tinkamų dydžių žuvis ir ar galima žuvis patenkinamai prižiūrėti laboratorijoje. Kiti žuvų rūšies pasirinkimo kriterijai apima rekreacinę, komercinę, ekologinę svarbą, taip pat palyginamą jautrumą, sėkmingą naudojimą praeityje ir t. t.

Rekomenduotos bandomosios rūšys pateiktos 2 papildyme. Galima naudoti kitas rūšis, tačiau tinkamoms bandymo sąlygoms užtikrinti gali tekti keisti bandymo metodiką. Šiuo atveju ataskaitoje turi būti pateikta rūšies pasirinkimo priežastis ir bandymų metodas.

1.7.5. Žuvų laikymas

Laikomų žuvų populiacija bent dvi savaites aklimatizuojama vandenyje bandymo temperatūroje ir pakankamai maitinama tos pačios rūšies maistu, kuris bus naudojamas bandyme.

Po 48 valandų stabilizacijos periodo, registruojamas mirtingumas ir taikomi tokie kriterijai:

- populiacijos mirtingumas per septynias paras didesnis kaip 10 %: visa partija atmetama,

- populiacijos mirtingumas per septynias paras 5-10 %: aklimatizuojama dar septynias papildomas paras,

- populiacijos mirtingumas per septynias paras mažesnis kaip 5 %: partija priimama, jei mirtingumas per kitas septynias dienas didesnis kaip 5 %, visa partija atmetama.

Reikia žiūrėti, kad bandymuose naudojamos žuvys neturėtų pastebimų ligų ir nenormalumų. Pašalinamos visos ligotos žuvys. Žuvys dvi savaites prieš pradedant bandymą arba bandymo metu neturi būti gydomos nuo ligų.

1.8. Bandymo atlikimas

1.8.1. Išankstinis bandymas

Gali būti naudinga atlikti išankstinį bandymą, norint optimizuoti galutinio bandymo sąlygas, pvz., bandymo medžiagos koncentraciją (-as), sugerties ir apsivalymo tarpsnių trukmę.

1.8.2. Veikimo sąlygos

1.8.2.1. Sugerties tarpsnio trukmė

Sugerties tarpsnio trukmės prognozavimas gali būti daromas remiantis praktiniu patyrimu (pvz., iš ankstesnio panašios cheminės medžiagos sugerties tyrimo) arba pagal tam tikras empirines priklausomybes, naudojant tirpumo vandenyje duomenis arba bandymo medžiagos pasiskirstymo tarp oktanolio ir vandens koeficientą (žr. 3 papildymą).

Sugerties tarpsnis turi trukti 28 paras, jei negalima įrodyti, kad pusiausvyra pasiekta anksčiau. Jei nuostovioji būsena nepasiekiama per 28 paras, sugerties tarpsnis turi būti pratęstas, atliekant tolesnius matavimus, kol pasiekiama nuostovioji būsena arba, iki 60 parų, kas trumpiau.

1.8.2.2. Apsivalymo tarpsnio trukmė

Pusės sugerties tarpsnio laiko paprastai pakanka, kad sugertos medžiagos kiekis sumažėtų iki atitinkamos vertės (pvz., 95 %) (žr. 3 papildymą dėl šio įverčio aiškinimo). Jei laikas, reikalingas 95 % netekimo vertei pasiekti yra neįvykdomai ilgas, pavyzdžiui, du kartus ilgesnis nei normali sugerties tarpsnio trukmė (t. y. daugiau kaip 56 paros) galima naudoti trumpesnį periodą (pvz., kol bandymo medžiagos koncentracija pasiekia mažiau nei 10 % nuostoviosios būsenos koncentracijos). Tačiau medžiagų, kurių sugerties ir apsivalymo modelis yra sudėtingesnis nei tas, kurį vaizduoja žuvų vienoje kameroje modelis, turintis pirmojo laipsnio kinetiką, netekimo greičio konstantoms nustatyti naudojami ilgesni apsivalymo tarpsniai. Tačiau šio periodo trukmę gali apspręsti laikas, kurį bandymo medžiagos koncentracija žuvyje yra vis dar didesnė nei analizinio aptikimo riba.

1.8.2.3. Bandomųjų žuvų skaičius

Koncentracijai nustatyti parenkamas toks žuvų skaičius, kad kiekvieną bandinio ėmimą bandiniui tektų ne mažiau kaip keturios žuvys. Jei reikia didesnio statistinio reikšmingumo, vienam bandiniui žuvų reikės daugiau.

Jei naudojamos suaugusios žuvys, nurodykite, kokios vienos lyties žuvys ar abiejų lyčių žuvys buvo naudojamos bandyme. Jei naudojamos abiejų lyčių žuvys, prieš veikimo pradžią turi būti dokumentuota, kad riebalų kiekio skirtumas tarp lyčių yra nereikšmingas; gali būti būtina sujungti visas vyriškos ir moteriškos lyties žuvis į vieną grupę.

Kiekvienam atskiram bandymui parenkamos panašios masės žuvys, kad mažiausių žuvų masė nebūtų mažesnė kaip du trečdaliai didžiausios žuvies masės. Visos žuvys turi būti tų pačių metų ir iš to paties šaltinio. Kadangi kartais paaiškėja, kad žuvų masė ir amžius turi didelę įtaką BKF vertėms (1), šios detalės turi būti tiksliai registruojamos. Norint įvertinti vidutinę masę, rekomenduojama prieš bandymą pasverti turimų žuvų atsargų pobandinį.

1.8.2.4. Įkrova

Norint mažinti Cw sumažėjimą dėl žuvų pridėjimo bandymo pradžioje ir išvengti ištirpusio deguonies koncentracijos mažėjimo, naudojami dideli vandens ir žuvų kiekio santykiai. Svarbu, kad įkrovos dydis atitiktų naudojamą bandomąją rūšį. Bet kuriuo atveju paprastai rekomenduojamas įkrovos dydis yra 0,1-1,0 g žuvies (šlapios masės) litrui vandens parai. Dideles įkrovas galima taikyti, jei įrodoma, kad reikiamą bandymo medžiagos koncentraciją įmanoma palaikyti ± 20 % ribose ir kad ištirpusio deguonies koncentracija nesumažėja daugiau kaip iki 60 % soties koncentracijos.

Pasirenkant tinkamus įkrovos režimus, atsižvelgiama į žuvų rūšies įprastosios gyvenimo aplinkos sąlygas. Pavyzdžiui, dugne gyvenančioms žuvims tam pačiam vandens tūriui gali būti reikalingas didesnis akvariumo dugno plotas nei jūros žuvų rūšims.

1.8.2.5. Maitinimas

Aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu žuvys maitinamos tinkamu maistu, kurio žinomas riebalų ir baltymų bendrasis kiekis ir kurio pakanka, kad žuvys būtų sveikos ir būtų palaikoma jų kūno masė. Žuvys aklimatizavimo ir bandymo laikotarpiu maitinamos kasdien, pašaro kiekis sudaro maždaug 1-2 % kūno masės per parą; taip bandymo metu riebalų koncentracija daugumoje žuvų rūšių palaikoma santykinai pastovi. Norint išlaikyti atitikimą tarp kūno masės ir riebalų kiekio, maisto kiekis turi būti perskaičiuotas, pvz., kartą per savaitę. Šiam apskaičiavimui atlikti žuvų masė kiekvienoje kameroje gali būti įvertinta pagal neseniai iš šios kameros bandiniui paimtų žuvų masę. Nesverkite žuvų, kurios lieka kameroje.

Nesuvalgytas maistas ir išmatos kasdien iš kameros išsiurbiami neužilgo po maitinimo (nuo 30 minučių iki vienos valandos). Kameros visą bandymo laiką turi būti kuo švaresnės, kad būtų palaikoma kiek įmanoma mažesnė organinių medžiagų koncentracija, nes organinės anglies buvimas gali riboti bandymo medžiagos biologinį prieinamumą (1).

Kadangi daugelis pašarų gaminama iš žuvies miltų, pašaras turi būti analizuojamas, ieškant bandymo medžiagos. Taip pat pageidautina analizuoti pašarą pesticidams ir sunkiesiems metalams nustatyti.

1.8.2.6. Šviesa ir temperatūra

Apšvietimo periodo trukmė paprastai lygi 12-16 valandų, o temperatūra (± 2 °C) turi būti tinkama žuvų rūšims (žr. 2 papildymą). Turi būti žinomas apšvietimo tipas ir jo charakteristikos. Reikia atkreipti dėmesį į galimą bandymo medžiagos fotocheminį virsmą tyrimo metu naudoto apšvietimo sąlygomis. Turi būti naudojamas tinkamas apšvietimas, vengiant žuvis veikti gamtoje nesančiais fotocheminio irimo produktais. Kai kuriais atvejais gali būti reikalingas filtras, kuris nepraleistų trumpesnio nei 290 nm bangos ilgio UV spinduliuotę.

1.8.2.7. Bandymų koncentracija

Žuvys pratekėjimo sąlygomis veikiamos vandenyje bent dvejų koncentracijų bandymo medžiaga. Paprastai didesnė (arba didžiausia) bandomosios medžiagos koncentracija parenkama taip, kad ji būtų lygi maždaug 1 % jos aštrios asimptotinės LC50 ir būtų bent dešimt kartų didesnė nei jos aptikimo riba vandenyje taikomu analizės metodu.

Didžiausią bandymo medžiagos koncentraciją taip pat galima nustatyti padalinant aštrios 96 h LC50 vertė iš atitinkamo aštrios ir chroniškos koncentracijų santykio (kai kurių cheminių medžiagų atitinkamas santykis gali keistis maždaug nuo trijų iki 100). Jei galima, pasirinkite kitokią koncentraciją (-as), kuri būtų didesnė už nurodytają 10 kartų. Jei tai neįmanoma dėl 1 % LC50 sąlygos ir analizinio nustatymo ribos, galima taikyti mažesnį nei 10 daugiklį arba turi būti atsižvelgta į galimybę naudoti 14C žymėtą bandymo medžiagą. Neturi būti naudojama koncentracija, kuri būtų didesnė nei bandymo medžiagos tirpumas.

Jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, jos koncentracija turi būti ne didesnė kaip 0,1 ml/l ir ji turi būti vienoda visuose bandymo induose. Turi būti žinoma, kokią bendrosios organinės anglies kiekio bandymo vandenyje dalį kartu sudaro ši medžiaga ir bandymo medžiaga. Tačiau reikia dėti visas pastangas, kad tokių medžiagų naudoti nereikėtų.

1.8.2.8. Kontroliniai bandymai

Papildomai bandymo bandinių serijai turi būti atliekamas skiedimo vandens tikrinimas arba, jei tinka, vandens su soliubilizavimo medžiaga tikrinimas, jei buvo nustatyta, kad soliubilizavimo medžiaga neveikia žuvų. Jei taip nėra, turi būti atliekami abu tikrinimai.

1.8.3. Vandens kokybės matavimų dažnis

Bandymo metu visuose induose būtina matuoti ištirpusį deguonį, BOA, pH ir temperatūrą. Bendrasis kietumas ir sūrumas, jei tinka, turi būti nustatyti kontroliniuose bandiniuose ir viename inde su didesne (arba didžiausia) koncentracija. Turi būti nustatomas bent jau ištirpęs deguonis ir sūrumas, jei tinka, ir tai daroma tris kartus — sugerties tarpsnio pradžioje, maždaug per vidurį ir pabaigoje, o apsivalymo laikotarpiu — kartą per savaitę. BOA turi būti nustatyta bandymo pradžioje (24 valandos ir 48 valandos prieš pradedant sugerties tarpsnį) prieš žuvų pridėjimą ir bent kartą per savaitę sugerties iš apsivalymo tarpsnių metu. Temperatūra turi būti matuojama kasdien, pH kiekvieno laikotarpio pradžioje ir pabaigoje, o kietumas kartą kiekviename bandyme. Temperatūrą bent viename inde būtų geriausiai kontroliuoti nuolat.

1.8.4. Bandinių ėmimas ir žuvų bei vandens analizė

1.8.4.1. Žuvies ir vandens bandinio ėmimo grafikas

Vanduo iš bandymo kamerų bandymo medžiagos koncentracijai nustatyti imamas prieš žuvų pridėjimą ir sugerties bei apsivalymo tarpsnių metu. Mažiausiai vandens bandinys imamas tuo pačiu metu kaip ir žuvies bandinys ir dar prieš maitinimą. Sugerties tarpsnio metu bandymo medžiagos koncentracija nustatoma tikrinant atitikimą patikimumo kriterijams.

Žuvų bandinys imamas bent penkis kartus sugerties tarpsnio metu ir bent keturis kartus apsivalymo tarpsnio metu. Kadangi, remiantis tokiu bandinių skaičiumi, kai kuriais atvejais bus sunku gauti pakankamai tikslų BKF vertės įvertį, ypač kai pasirodo, kad apsivalymo kinetika nėra pirmojo laipsnio, galima būtų patarti abu bandinius imti dažniau (žr. 4 papildymą). Papildomi bandiniai dedami saugoti ir analizuojami tik tuo atveju, jei pasirodo, kas pirmosios eilės analizės duomenų nepakanka BKF apskaičiuoti norimu tikslumu.

Tinkamo bandinių ėmimo grafiko pavyzdys pateiktas 4 papildyme. Naudojant kitas Pow numanomas vertes veikimo laikui, per kurį būtų pasiekta 95 % sugerties, apskaičiuoti, gali būti lengvai sudaryti kiti grafikai.

Bandinių ėmimas sugerties tarpsnio metu tęsiamas tol, kol pasiekiama nuostovioji būsena, arba 28 paras, žiūrint, kas trumpiau. Jei nuostovioji būsena nebuvo pasiekta per 28 paras, bandinių ėmimas tęsiamas toliau, kol pasiekiama nuostovioji būsena, arba iki 60 parų, žiūrint, kas trumpiau. Prieš pradedant apsivalymo tarpsnį, žuvys pernešamos į švarius rezervuarus.

1.8.4.2. Bandinių ėmimas ir bandinio ruošimas

Vandens bandiniai analizei gaunami, pvz., siurbiant juos vamzdžiais iš inertiškos medžiagos, įstatytais į bandymo kameros vidurį. Kadangi įrodyta, kad filtravimas ir centrifugavimas ne visuomet leidžia atskirti bandymo medžiagos biologiškai neįsisavinamą dalį nuo tos dalies, kuri yra biologiškai prieinama (ypač labai lipofilinių cheminių medžiagų, t. y. tokių medžiagų, kurių log Pow > 5) (1) (5), bandinių tokiais būdais galima neapdoroti.

Vietoj to reikia imtis priemonių, kad rezervuarai būtų kiek įmanoma švaresni, o bendrosios organinės anglies kiekis sugerties ir apsivalymo tarpsnių metu turi būti nuolat kontroliuojamas.

Per kiekvieną bandinio ėmimą iš bandymo kameros paimamas atitinkamas žuvų skaičius (paprastai ne mažiau kaip keturios žuvys). Bandinio žuvys iš karto nuplaunamos vandeniu, "sausinamos" filtravimo popieriumi, tuojau pat užmušamos pačiu tinkamiausiu ir žmoniškiausiu būdu ir sveriamos.

Vandenį ir žuvis geriausiai analizuoti iš karto po bandinio ėmimo, kad būtų išvengta irimo arba kitų nuostolių, ir apskaičiuoti apytikrius sugerties bei apsivalymo greičius bandymo eigoje. Iš karto atlikta analizė taip pat leidžia nevėluojant nustatyti, kada pasiekiama horizontalioji sugerties kreivės dalis.

Jei iš karto analizė nedaroma, bandiniai tinkamu būdu laikomi. Prieš pradedant tyrimą gaunama informacija apie tinkamą konkrečios bandymo medžiagos laikymo metodą, pvz., šaldymą, laikymą 4 °C temperatūroje, laikymo trukmę, ekstrahavimą ir t. t.

1.8.4.3. Analizės metodo kokybė

Kadangi visa bandymo eiga iš esmės priklauso nuo bandymo medžiagai nustatyti taikomo analizės metodo tikslumo, preciziškumo ir jautrumo, eksperimentiškai patikrinkite, ar konkretaus metodo cheminės analizės preciziškumas ir atkuriamumas, taip pat bandymo medžiagos regeneravimas iš vandens ir žuvies yra patenkinami. Taip pat patikrinkite, ar bandymo medžiagos negalima aptikti naudojamame skiedimo vandenyje.

Jei būtina, bandyme gautoms Cw ir Cf vertėms daromos pataisos, atsižvelgiant į regeneravimo ir fono kontroliniuose bandiniuose gautas vertes. Su žuvies ir vandens bandiniais visą laiką elgiamasi taip, kad užteršimas ir nuostoliai (pvz., dėl bandinio ėmimo įtaiso sugerties) būtų kuo mažesni.

1.8.4.4. Žuvies bandinio analizė

Jei bandyme naudojamos žymėtuosius atomus turinčios medžiagos, galima nustatyti bendrą jų kiekį (t. y. pradinę medžiagą ir metabolitus) arba bandiniai gali būti gryninami, kad pradinę medžiagą galima būtų analizuoti atskirai. Taip pat pasiekus nuostoviąją būseną arba sugerties tarpsnio pabaigą, kas būtų anksčiau, galima apibūdinti pagrindinius metabolitus. Jei BKF, apskaičiuotas pagal bendrąjį žymėtuosius atomus turinčių likučių kiekį, yra ≥ 1000 %, būtų patartina, o kai kurių cheminių medžiagų rūšių, pvz., pesticidų, atveju labai rekomenduotina, identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus, kurie sudaro daugiau kaip ≥ 10 % bendrojo likučių kiekio žuvies audiniuose nuostoviosios būsenos sąlygomis. Jei yra identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktai, kurie atstovauja daugiau kaip ≥ 10 % bendrojo žymėtuosius atomus turinčių likučių kiekio, taip pat rekomenduojama identifikuoti ir kiekybiškai nustatyti irimo produktus bandymo vandenyje.

Bandymo medžiagos koncentracija paprastai turi būti nustatoma kiekvienoje pasvertoje atskiroje žuvyje. Jei tai neįmanoma, kiekvieno bandinio ėmimo bandinius galima jungti, tačiau bandinių jungimas riboja statistines metodikas, kurios galėtų būti taikomos duomenims apdoroti. Jei svarbi yra specifinė statistinė metodika ir jos statistinis reikšmingumas, tuomet bandyme turi būti naudojamas pakankamas žuvų skaičius, kuris atitiktų norimą jungimo metodiką ir statistinį reikšmingumą (6) (7).

BKF turi būti išreikštas kaip visos šlapios masės funkcija, o labai lipofiliškoms medžaigoms — kaip riebalų kiekio funkcija. Riebalų kiekis žuvyje nustatomas kiekvieno bandinio ėmimo atveju, jei tai įmanoma. Riebalų kiekiui nustatyti turi būti taikomi atinkami metodai (3 papildymo 8 ir 2 nuorodos). Etaloniniu metodu gali būti rekomenduota ekstrahavimo chloroformo ir metanolio mišiniu metodika (9). Įvairūs metodai neleidžia gauti vienodas vertes (10), todėl svarbu pateikti taikyto metodo detales. Kai tai įmanoma, riebalų analizė turi būti daroma tame pačiame ekstrakte, kuris buvo gautas bandymo medžiagai analizuoti, kadangi riebalus dažnai reikia pašalinti iš ekstrakto prieš tai, kai jį galima būtų analizuoti chromatografiškai. Riebalų kiekis žuvyje (mg/kg šlapios masės) bandymo pabaigoje turi nesiskirti nuo bandymo pradžioje nustatyto kiekio daugiau kaip ± 25 %. Taip pat reikia pateikti procentais apskaičiuotą sausos audinio medžiagos kiekį, kad riebalų koncentraciją būtų galima apskaičiuoti sausos medžiagos kiekiui.

2. REZULTATAI

2.1. Rezultatų apdorojimas

Bandymo medžiagos sugerties kreivė gaunama aritmetinėje skalėje brėžiant sugerties bandyme gautos koncentracijos žuvyje arba jos paviršiuje (arba nustatytuose audiniuose) kitimą laike. Jei kreivė pasiekė horizontaliąją dalį, t. y., pasidaro beveik asimptotiška laiko ašiai, nuostoviosios būsenos BKFNB apskaičiuojamas taip:

C

C

wnuostovioji būsenavidutinė vertė

Kai nuostovioji būsena nepasiekiama, BKFNB pakankamu pavojui įvertinti tikslumu gali būti įmanoma apskaičiuoti pagal 80 % (1,6/k2) arba 95 % (3,0/k2) "nuostoviosios būsenos" pusiausvyros.

Taip pat nustatomas koncentravimo faktorius (BKFk), kaip dviejų pirmojo laipsnio kinetinių konstantų k1/k2 santykis. Apsivalymo greičio konstanta (k2) paprastai nustatoma pagal apsivalymo kreivę (t. y., bandymo medžiagos žuvyje koncentracijos mažėjimo laike grafiką). Tuomet, turint k2 vertę ir Cf, kuri gaunama pagal sugerties kreivę, apskaičiuojama sugerties greičio konstanta (k1) (taip pat žr. 5 papildymą). Tinkamiausias metodas BKFk ir greičio konstantoms k1 ir k2 apskaičiuoti yra netiesinių parametrų vertinimo metodų taikymas panaudojant kompiuterį (11). Kitaip k1 ir k2 apskaičiuoti gali būti naudojami grafiniai metodai. Jei apsivalymo kreivė akivaizdžiai yra ne pirmojo laipsnio, turi būti taikomi sudėtingesni modeliai (žr. 3 papildymo nuorodas) ir prašoma biologinio statistiko patarimo.

2.2. Rezultatų interpretavimas

Rezultatai turi būti interpretuojami atsargiai, jei išmatuotos bandymo tirpalų koncentracijos yra arti analizinio metodo aptikimo ribos.

Aiškiai apibrėžtos sugerties ir apsivalymo kreivės yra biologinio koncentravimo duomenų geros kokybės ženklas. Dvejoms koncentracijoms nustatytų sugerties (apsivalymo) konstantų kitimas turi būti mažesnis kaip 20 %. Dvejoms bandymų koncentracijoms stebėti dideli sugerties (apsivalymo) greičių skirtumai turi būti registruojami ir pateikti galimi aiškinimai. Dažniausiai gero planavimo tyrimuose BKF verčių pasikliovimo rėžis artėja prie ± 20 %.

3. ATASKAITOS PATEIKIMAS

Bandymų ataskaita turi apimti tokią informaciją:

3.1. Bandymų medžiaga

- fizikinė prigimtis ir, jei tinka, fizikinės ir cheminės savybės,

- cheminio identifikavimo duomenys (įskaitant organinės anglies kiekį, jei tinka),

- jei turi žymėtųjų atomų, tiksli žymėtojo atomo (-ų) padėtis ir su priemaišomis siejamo radioaktyvumo procentinė dalis.

3.2. Bandomosios rūšys

- mokslinis pavadinimas, rūšis, šaltinis, bet koks išankstinis apdorojimas, aklimatizavimas, amžius, dydžio intervalas ir t. t.

3.3. Bandymų sąlygos

- naudota bandymų metodika (pvz., pratekėjimo arba pusiau stacionariomis sąlygomis),

- naudoto apšvietimo tipas ir charakteristikos bei apšvietimo periodas (-ai),

- bandymų schema (pvz., bandymo kamerų skaičius ir dydis, vandens tūrio pasikeitimo sparta, lygiagrečių bandymų skaičius, žuvų skaičius lygiagrečiame bandyme, bandyme naudotų koncentracijų skaičius, sugerties ir apsivalymo tarpsnių trukmė, žuvų ir vandens bandinių ėmimo dažnis),

- pradinių tirpalų ruošimo metodas ir jų keitimo dažnis (jei naudojama soliubilizavimo medžiaga, turi būti nurodyta jos koncentracija ir indelis į organinės anglies kiekį bandymo vandenyje),

- norminės bandymų koncentracijos, bandymų rezervuarose nustatytų koncentracijų vidutinės vertės ir jų standartiniai nuokrypiai bei metodas, kuriuo jie buvo nustatyti,

- skiedimo vandens šaltinis, bet kokio jo apdorojimo aprašymas, bandomųjų žuvų galimybių gyventi vandenyje demonstravimo rezultatai ir vandens charakteristikos: pH, kietumas, temperatūra, ištirpusio deguonies koncentracija, liekamojo chloro lygiai (jei matuoti), bendroji organinė anglis, suspenduotos kietosios dalelės, bandymo terpės sūrumas (jei tinka) ir visi kiti daryti matavimai,

- vandens kokybė bandymų rezervuaruose, pH, kietumas, BOA, temperatūra ir ištirpusio deguonies koncentracija,

- detali informacija apie maitinimą (pvz., maisto tipas, šaltinis, sudėtis, bent riebalų ir baltymų kiekis, jei įmanoma, duodamas kiekis ir maitinimo dažnis),

- informacija apie žuvų ir vandens bandinių apdorojimą, įskaitant ruošimo, laikymo, ekstrahavimo detales ir bandymų medžiagos bei riebalų (jei nustatomi) analizės metodikas (ir preciziškumą).

3.4. Rezultatai

- bet kokių atliktų išankstinių tyrimų rezultatai,

- kontrolinių žuvų ir žuvų kiekvienoje veikimo kameroje mirtingumas bei bet koks jų neįprastas elgesys,

- riebalų kiekis žuvyje (jei nustatymas daromas bandymo proga),

- kreivės (įskaitant visus matavimuose gautus duomenis), rodančios bandymų medžiagos sugertį žuvimis ir jų apsivalymą, laikas iki nuostoviosios būsenos,

- Cf ir Cw (ir jų standartinis nuokrypis bei intrevalas, jei tinka) visiems bandinio ėmimo atvejams (Cf išreikšta μg/g viso kūno arba tam tikrų jo audinių, pvz., riebalų, šlapios masės (ppm), o Cw — μg/ml (ppm)). Cw vertės kontrolinėse serijose (taip pat turi būti nurodytas fonas),

- nuostoviosios būsenos biologinio koncentravimo faktorius (BKFNB) ir (arba) kinetinis koncentravimo faktorius (BKFk) ir, jei taikytina, 95 % pasikliovimo ribos sugerties ir apsivalymo (netekimo) greičio konstantoms (viskas apskaičiuota viso gyvūno kūno ir bendro riebalų kiekio, jei nustatytas, arba tam tikrų jo audinių atžvilgiu), pasikliovimo ribos ir standartinis nuokrypis (kai yra) bei apskaičiavimo (duomenų analizės) metodai kiekvienai naudotos bandymo medžiagos koncentracijai,

- jei naudojamos žymėtuosius atomus turinčios medžiagos ir jei to reikia, gali būti pateikti bet kokių aptiktų metabolitų kaupimosi rezultatai,

- visa kas bandyme buvo neįprasto, bet koks nukrypimas nuo šių metodikų ir bet kuri kita tinkama informacija.

Mažinkite rezultatų, kurie būtų "nenustatyti aptikimo riboje", kiekį, kurdami išankstinio bandymo metodus ir vykdydami bandymų planavimą, kadangi tokie rezultatai negali būti panaudoti greičio konstantoms apskaičiuoti.

4. NUORODOS

(1) Connell D. W. (1988). Bioaccumulation behaviour of persistent chemicals with aquatic organisms. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 102, pp. 117-156.

(2) Birsein S., Devillers J. and Karcher W. (1993). Non-linear dependence of fish bioconcentration on n-octanol/water partition coefficient. SAR ir QSAR in Environmental Research, 1, pp. 29-390.

(3) OECD, Paris (1996). Direct phototransformation of chemicals in water. Environmental Health and Safety Guidance Document Series on Testing ir Assessment of Chemicals. Nr. 3.

(4) Kristensen P. (1991). Bioconcentration in fish: comparison of bioconcentration factors derived from OECD and ASTM testing methods; influence of particulate organic matter to the bioavailabilily of chemicals. Water Quality Institute, Denmark.

(5) US EPA 822-R-94–002 (1994) Great Lake Water Quality Initiative Technical Support Document (or the Procedure to Determine Bioaccumulation Factors. July 1994.

(6) US PDA (Food and Drug Administration) Revision. Pesticide analytical manual, 1, 5600 Fisher's Lane, Rockville, MD 20852, July 1975.

(7) US EPA (1974). Section 5, A(1). Analysis of Human arba animal Adipose Tissue, in Analysis of Pesticide Residues in Human and Evironmental Samples, Thompson J. F. (ed.) Research Triangle Park, N. C. 27711.

(8) Compaan H. (1980) in "The determination of the possible effects of chemicals and wastes on the aquatic environment: degradation, toxicity, bioaccumulation", Ch. 2.3, Part II. Government Publishing Office, the Hague, Netherlands.

(9) Gardner et al, (1995). Limn. & Oceanogr. 30, pp. 1099-1105.

(10) Randall R. C., Lee H., Ozretich R. J., Lake J. L. and Pruell R. J. (1991). Evaluation of selected lipid methods for normalising pollutant bioaccumulation. Envir. Toxicol. Chem. 10, pp 1431-1436.

(11) CEC, Bioconcentration of chemical substances in fish: the flow-through method, Ring Test Programme,. 1984 to 1985. Final report March 1987. Authors: P. Kristensen and N. Nyholm.

(12) ASTM E-1022–84 (Reapproved 1988). Standard Practice for conducting Bioconcentration Tests with Fishes and Saltwater Bivalve Molluscs.

--------------------------------------------------

Top