1.1.

„nivel de acțiune” înseamnă nivelul unei anumite substanțe, astfel cum este menționat în anexa la Recomandarea 2011/516/UE, care declanșează investigații pentru a identifica sursa respectivei substanțe în cazurile în care sunt detectate niveluri crescute ale substanței;

1.2.

„metode bioanalitice” înseamnă metode bazate pe principii biologice precum teste bazate pe celule, teste bazate pe receptor sau imunoteste. Ele nu dau rezultate la nivel de congener, ci doar o indicație (2) cu privire la nivelul TEQ, exprimat în echivalente bioanalitice (BEQ), pentru a ține cont de faptul că nu toți compușii prezenți într-un extract de probă care determină un răspuns în cadrul testului pot îndeplini toate cerințele principiului TEQ;

1.3.

„recuperarea aparentă a biotestului” înseamnă nivelul BEQ calculat pornind de la curba de calibrare a TCDD sau PCB 126 corectată în funcție de martor și apoi divizată la nivelul TEQ determinat prin GC/HRMS. Aceasta vizează corectarea factorilor cum ar fi pierderea de PCDD-uri/PCDF-uri și compuși de tipul dioxinelor în timpul etapelor de extracție și curățare, coextragerea compușilor care duc la intensificarea sau atenuarea răspunsului (efecte agoniste și antagoniste), calitatea de ajustare a curbei sau diferențele dintre valorile TEF și ale REP. Recuperarea aparentă a biotestului se calculează pornind de la probe de referință adecvate cu modele de congeneri reprezentativi în jurul nivelului de interes;

1.4.

„metode semicantitative” înseamnă metode care dau o indicație aproximativă a concentrației de analit prezumtiv, în timp ce rezultatul numeric nu îndeplinește cerințele pentru metodele cantitative;

1.5.

„limita specifică acceptată de cuantificare a unui congener individual” înseamnă concentrația unui analit în extractul dintr-o probă care produce un răspuns instrumental la doi ioni diferiți care urmează să fie controlați cu un raport S/Z (semnal/zgomot) de 3:1 pentru semnalul mai puțin intens și îndeplinirea criteriilor de identificare, astfel cum sunt descrise, de exemplu, în standardul prEN 16215 (Hrană pentru animale – Determinarea dioxinelor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor prin GC/HRMS și a PCB-urilor indicatori prin GC/HRMS) și/sau în metoda EPA 1613, revizia B;

1.6.

„estimare superioară” înseamnă conceptul care necesită utilizarea limitei de cuantificare pentru contribuția fiecărui congener necuantificat;

1.7.

„estimare inferioară” înseamnă conceptul care necesită utilizarea valorii zero pentru contribuția fiecărui congener necuantificat;

1.8.

„estimarea mediană” înseamnă conceptul care necesită utilizarea jumătății limitei de cuantificare, calculându-se contribuția fiecărui congener necuantificat;

1.9.

„lot” înseamnă o cantitate identificabilă de produse alimentare livrată la un moment dat, pentru care oficialul stabilește că au caracteristici comune cum ar fi originea, varietatea, tipul de ambalaj, ambalatorul, expeditorul sau marcajele. În cazul peștilor și al produselor pescărești, mărimea peștilor trebuie să fie, de asemenea, comparabilă. În cazul în care mărimea și/sau greutatea peștilor nu sunt comparabile în cadrul unui lot, acesta poate să fie totuși luat în considerare ca fiind un lot, însă trebuie să i se aplice o procedură specifică de prelevare de probe;

1.10.

„sublot” înseamnă o anumită parte dintr-un lot mare, metoda de prelevare a probelor aplicându-se respectivei părți. Fiecare sublot trebuie să fie separat fizic și identificabil;

1.11.

„probă elementară” înseamnă o cantitate de material prelevată dintr-un singur loc al lotului sau sublotului;

1.12.

„probă globală” înseamnă totalul combinat al tuturor probelor elementare prelevate dintr-un lot sau sublot;

1.13.

„probă de laborator” înseamnă o parte/cantitate reprezentativă din proba globală destinată laboratorului.

BEQ

Bioanalytical Equivalents – Echivalente bioanalitice

GC

Gas chromatography – Cromatografie în fază gazoasă

HRMS

High resolution mass spectrometry – Spectrometrie de masă cu rezoluție mare

LRMS

Low resolution mass spectrometry – Spectrometrie de masă cu rezoluție mică

PCB

Polychlorinated biphenyls – Bifenili policlorurați

PCDD

Polychlorinated dibenzo-p-dioxins – Dibenzo-p-dioxine policlorurate

PCDF

Polychlorinated dibenzofurans – Dibenzofurani policlorurați

QC

Quality control – Controlul calității

REP

Relative potency – Potență relativă

TEF

Toxic Equivalency Factor – Factor de echivalență toxică

TEQ

Toxic Equivalents – Echivalente toxice

TCDD

Tetrachlorodibenzodioxin – Tetraclordibenzodioxină

U

Expanded measurement uncertainty – Incertitudine de măsurare extinsă

—

În cazul în care lotul din care se prelevează probe conține pești mici (pești individuali care cântăresc mai puțin de aproximativ 1 kg), aceștia se prelevează întregi ca probe elementare pentru a constitui proba globală. În cazul în care proba globală care rezultă cântărește mai mult de 3 kg, probele elementare pot consta din partea de mijloc, cântărind fiecare cel puțin 100 de grame, a peștilor care formează proba globală. Partea întreagă căreia i se aplică nivelul maxim se utilizează pentru omogenizarea probei.

Partea din mijloc a peștelui este cea unde se află centrul de gravitate. Acesta este localizat, în cele mai multe cazuri, la nivelul aripioarei dorsale (în cazul în care peștele are aripioară dorsală) sau la mijlocul distanței dintre branhii și anus.

—

În cazul în care lotul din care se prelevează probe conține pești mai mari (fiecare cântărind mai mult de aproximativ 1 kg), proba elementară este reprezentată de partea din mijloc a peștelui. Fiecare probă elementară cântărește cel puțin 100 de grame.

În cazul peștilor de mărime intermediară (aproximativ 1-6 kg), proba elementară constă dintr-o bucată prelevată din partea mijlocie a peștelui, între coloana vertebrală și abdomen.

Pentru peștii foarte mari (de exemplu > aproximativ 6 kg), proba elementară este prelevată din masa musculară dorso-laterală de pe partea dreaptă (vedere frontală), de la mijlocul peștelui. În cazul în care prelevarea unei asemenea bucăți din partea de mijloc a peștelui ar însemna o pagubă economică semnificativă, prelevarea a trei probe elementare de câte cel puțin 350 de grame fiecare poate fi considerată ca fiind suficientă, indiferent de dimensiunea lotului sau, alternativ, pot fi prelevate câte o parte egală din masa musculară din apropierea cozii și din cea din apropierea capului pentru a constitui proba elementară care să fie reprezentativă pentru nivelul de dioxine din peștele întreg.

—

În ceea ce privește constituirea probei, se aplică dispozițiile de la punctul III.3.

—

În cazul în care predomină o clasă/categorie de mărime sau greutate (aproximativ 80% sau mai mult din lot), proba se prelevează de la peștii cu mărime sau greutate predominantă. Această probă se consideră reprezentativă pentru întregul lot.

—

În cazul în care nu predomină o anumită clasă/categorie de mărime sau de greutate, trebuie să se asigure faptul că peștii selectați în vederea prelevării de probe sunt reprezentativi pentru lot. Instrucțiuni specifice pentru astfel de cazuri sunt puse la dispoziție în „Ghidul de prelevare de probe din pești întregi de mărime și/sau greutate diferită” (2).

—

calculându-se incertitudinea extinsă cu ajutorul unui coeficient de acoperire cu valoarea 2, care conferă un nivel de încredere de aproximativ 95%. Un lot sau un sublot nu este conform în cazul în care valoarea măsurată minus U depășește nivelul permis stabilit;

—

prin stabilirea limitei de decizie (CCα) în conformitate cu dispozițiile Deciziei 2002/657/CE (punctul 3.1.2.5 din anexa I la decizia respectivă – cazul substanțelor pentru care este stabilită o limită permisă). Un lot sau un sublot nu este conform în cazul în care valoarea măsurată este egală sau mai mare decât CCα.

—

efectuate printr-o metodă de screening cu o rată de falsă-conformitate de sub 5 % indică faptul că nivelul nu depășește nivelul maxim respectiv de PCDD/F-uri și suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, astfel cum sunt menționate în Regulamentul (CE) nr. 1881/2006;

—

efectuate printr-o metodă de confirmare nu depășește nivelul maxim respectiv de PCDD/F-uri și suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor, astfel cum sunt menționate în Regulamentul (CE) nr. 1881/2006, ținând cont de incertitudinea de măsurare.

—

calculându-se incertitudinea extinsă cu ajutorul unui coeficient de acoperire cu valoarea 2, care conferă un nivel de încredere de aproximativ 95%. Un lot sau un sublot nu este conform în cazul în care valoarea măsurată minus U depășește nivelul permis stabilit. În cazul unei determinări separate a PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor, suma incertitudinii extinse estimate a rezultatelor analitice separate ale PCDD/F-urilor și PCB-urilor de tipul dioxinelor trebuie utilizată pentru incertitudinea extinsă estimată a sumei dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor;

—

prin stabilirea limitei de decizie (CCα) în conformitate cu dispozițiile Deciziei 2002/657/CE (punctul 3.1.2.5 din anexa I la decizia respectivă – cazul substanțelor pentru care este stabilită o limită permisă), un lot sau un sublot nu este conform în cazul în care valoarea măsurată este egală sau mai mare decât CCα.

(a)

selectarea acelor probe cu niveluri de PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor care depășesc nivelurile maxime sau nivelurile de acțiune. Această abordare poate implica o metodă de screening care permite o capacitate sporită de analiză a probelor, eficientă din punctul de vedere al costurilor, sporind astfel șansa de a descoperi noi incidente cu un nivel mare de expunere și riscuri de sănătate importante pentru consumatori. Metodele de screening pot să cuprindă metode bioanalitice și metode GC/MS. Aplicarea lor ar trebui să urmărească evitarea rezultatelor false-conforme. Concentrația de PCDD/F-uri și suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor din acele probe cu niveluri semnificative trebuie determinată/confirmată printr-o metodă de confirmare;

(b)

determinarea nivelurilor de PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor din probele de produse alimentare în intervalul nivelurilor de fond mici. Acest fapt este important pentru a urmări tendințele în timp, evaluarea expunerii populației și pentru a crea o bază de date pentru posibila reevaluare a nivelurilor de acțiune și a nivelurilor maxime. Acest obiectiv este atins prin metode de confirmare care permit PCDD/F-urilor și PCB-urilor de tipul dioxinelor să fie identificate și cuantificate fără echivoc la nivelul de interes. Aceste metode pot fi utilizate pentru confirmarea rezultatelor obținute prin metode de screening și pentru determinarea nivelurilor de fond mici în cadrul monitorizării produselor alimentare. Ele sunt, de asemenea, importante pentru stabilirea modelelor pentru congeneri în scopul de a identifica sursa unei posibile contaminări. În prezent, astfel de metode utilizează cromatografia de rezoluție mare în fază gazoasă/spectrometria de masă cu rezoluție mare (HRGC/HRMS).

—

metode bioanalitice care pot detecta analiții de interes, includ o curbă de calibrare, conferă o decizie da/nu pentru indicarea posibilității depășirii nivelului de interes și permit raportarea rezultatelor ca echivalente bioanalitice (BEQ), fiind o indicație pentru valoarea TEQ a probei;

—

teste fizico-chimice (de exemplu, GC-MS/MS sau GC/LRMS), caz în care caracteristicile de precizie a măsurării ale metodei nu îndeplinesc cerințele pentru testele cantitative.

—

Trebuie luate măsuri pentru a se evita contaminarea încrucișată în fiecare etapă a procedurii de prelevare de probe și de analizare.

—

Probele trebuie depozitate și transportate în recipiente de sticlă, aluminiu, polipropilenă sau polietilenă, corespunzătoare pentru depozitare, fără nicio influență asupra nivelurilor de PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor din probe. Urmele de praf de hârtie trebuie îndepărtate de pe recipientul cu probe.

—

Depozitarea și transportul probelor trebuie efectuate astfel încât să se păstreze integritatea probei de produs alimentar.

—

În măsura în care este relevant, fiecare probă de laborator se macină fin și se amestecă temeinic printr-un procedeu dovedit că realizează o omogenizare completă (de exemplu, proba este măcinată fin astfel încât să treacă printr-o sită cu ochiuri de 1 mm); probele trebuie uscate înainte de măcinare, în cazul în care conținutul de apă este prea mare.

—

Controlul reactivilor, al sticlăriei și al echipamentului în vederea detectării unei posibile influențe a rezultatelor bazate pe TEQ sau BEQ sunt de importanță generală.

—

Se realizează o analiză martor parcurgând întreaga procedură analitică, însă fără probă.

—

Pentru metodele bioanalitice, este de mare importanță ca toată sticlăria și toți solvenții utilizați în cadrul analizei să fie testați pentru a se constata dacă sunt liberi de compuși care interferează cu detectarea compușilor-țintă în intervalul de lucru. Sticlăria se clătește cu solvenți sau/și se încălzește la temperaturi adecvate pentru a elimina urmele de PCDD/F-uri, de compuși de tipul dioxinelor și compuși interferenți de pe suprafața acesteia.

—

Cantitatea de probă utilizată pentru extracție trebuie să fie suficientă pentru a îndeplini cerințele referitoare la un interval de lucru aflat la niveluri suficient de mici, inclusiv concentrațiile de interes.

—

Procedurile specifice de pregătire a probelor utilizate pentru produsele avute în vedere urmează orientări recunoscute la nivel internațional.

—

În cazul peștilor, pielea trebuie îndepărtată, deoarece nivelul maxim se aplică mușchiului fără piele. Cu toate acestea, este necesar ca întreg restul de țesut muscular și adipos de pe partea internă a pielii să fie îndepărtat de piele cu grijă și în întregime și adăugat la proba de analizat.

—

În conformitate cu dispozițiile Regulamentului (CE) nr. 882/2004, laboratoarele sunt acreditate de un organism recunoscut care funcționează în conformitate cu Ghidul ISO 58, pentru a se asigura aplicarea de către acestea a procedurilor de asigurare a calității analizelor. Laboratoarele sunt acreditate conform standardului EN ISO/IEC 17025.

—

Competența laboratoarelor se demonstrează prin participarea continuă și cu succes la studiile interlaboratoare pentru determinarea PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor în matricele de produse alimentare și în intervalele de concentrații relevante.

—

Laboratoarele care aplică metode de screening pentru controlul de rutină al probelor stabilesc o cooperare strânsă cu laboratoarele care aplică metoda de confirmare, atât pentru controlul calității, cât și pentru confirmarea rezultatului analitic al probelor suspectate.

—

Pentru PCDD/F-uri, cantitățile detectabile trebuie să fie în gama superioară a femtogramelor (10–15 g) din cauza toxicității extreme a unora dintre acești compuși. Pentru majoritatea congenerilor PCB, limita de cuantificare de ordinul nanogramelor (10–9 g) este deja suficientă. Totuși, pentru măsurarea congenerilor PCB-urilor de tipul dioxinelor mai toxici (în special a congenerilor non-orto substituiți), extremitatea inferioară a intervalului de lucru trebuie să ajungă la nivelurile mici de ordinul picogramelor (10–12 g).

—

Este necesar să se facă o distincție între PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor și o multitudine de alți compuși coextrași și care pot să interfereze, prezenți în concentrații cu până la câteva ordine de mărime mai mari decât cele ale analiților de interes. Pentru metodele bazate pe cromatografie în fază gazoasă/spectrometrie de masă (GC/MS) este necesară o diferențiere între diverșii congeneri, respectiv între cei toxici (de exemplu, cele șaptesprezece PCDD/F-uri 2,3,7,8-substituite și cele doisprezece PCB-uri de tipul dioxinelor) și alți congeneri.

—

Metodele bioanalitice sunt capabile să detecteze compușii-țintă ca sumă de PCDD/F-uri și/sau PCB-uri de tipul dioxinelor. Curățarea probelor are drept scop eliminarea compușilor care duc la rezultate false-neconforme sau a compușilor care pot atenua răspunsul, ducând la rezultate false-conforme.

—

Pentru metodele GC/MS, determinarea oferă o estimare valabilă a concentrației reale dintr-o probă. Acuratețea mare (acuratețea măsurătorii: concordanța cât mai bună între rezultatul unei măsurători și valoarea reală sau alocată a mărimii măsurabile) este necesară pentru a evita respingerea rezultatului analizei unei probe în temeiul fiabilității slabe a nivelului TEQ determinat. Acuratețea se exprimă prin „autenticitate” (diferența dintre valoarea medie măsurată pentru un analit pe un material certificat și valoarea sa certificată, exprimată ca procent din această valoare) și „precizie” (deviația standard relativă RSDR calculată pe baza rezultatelor generate în condiții de reproductibilitate).

—

Pentru metodele bioanalitice, se determină recuperarea aparentă a biotestului.

—

Laboratoarele demonstrează performanța unei metode în intervalul nivelului de interes, de exemplu, 0,5 × 1 × și 2 × nivelul de interes, cu un coeficient de variație acceptabil pentru analize repetate, în timpul procedurii de validare și/sau în timpul analizei de rutină.

—

Ca măsuri interne de control al calității, se efectuează periodic controale martor, experimente cu îmbogățire sau analize ale unor probe de control (dacă este posibil, cu material de referință certificat). Se înregistrează și se verifică grafice de control al calității (QC) pentru controalele martor, experimentele cu îmbogățire sau analizele unor probe de control, pentru a se garanta că performanța analitică este conformă cerințelor.

—

Pentru o metodă bioanalitică de screening, stabilirea LOQ nu este o cerință indispensabilă, însă metoda trebuie să demonstreze că poate face distincție între valoarea-martor și valoarea-limită. La furnizarea unui nivel BEQ, se stabilește un nivel de raportare pentru a se lua decizii legate de probele care prezintă un răspuns sub acest nivel. Trebuie dovedit că nivelul de raportare este diferit față de probele martor din cadrul procedurii cu un factor care are cel puțin valoarea trei, cu un răspuns inferior intervalului de lucru. Prin urmare, se calculează pornind de la probe care conțin compușii-țintă în jurul nivelului minim necesar și nu de la un raport S/Z sau un test martor.

—

Limita de cuantificare (LOQ) pentru o metodă de confirmare este aproximativ o cincime din nivelul de interes.

—

Pentru ca metodele de confirmare sau de screening să ofere rezultate fiabile trebuie să fie respectate următoarele criterii pentru valoarea TEQ sau BEQ, indiferent dacă este determinată ca TEQ total (ca sumă de PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor) sau separat pentru PCDD/F-uri și pentru PCB de tipul dioxinelor:

—

Atât metodele GC/MS, cât și metodele bioanalitice, pot fi folosite pentru screening. Pentru metodele GC/MS trebuie să se utilizeze cerințele menționate la punctul 7 al prezentei anexe. Pentru metodele bioanalitice bazate pe celule sunt prevăzute cerințe specifice la punctul 8 din prezenta anexă.

—

Laboratoarele care aplică metode de screening pentru controlul de rutină al probelor stabilesc o cooperare strânsă cu laboratoarele care aplică metoda de confirmare.

—

Performanța metodei de screening trebuie verificată în timpul analizei de rutină, printr-un control al calității analizelor și printr-o validare continuă a metodei. Trebuie să existe un program continuu pentru controlul rezultatelor conforme.

—

Verificarea posibilei suprimări a răspunsului celular și a citotoxicității

20 % din extractele de probe sunt măsurate în screeningul de rutină cu și fără 2,3,7,8-TCDD care se adaugă în funcție de nivelul de interes, pentru a verifica dacă răspunsul este, eventual, suprimat de către substanțele interferente prezente în extractul de probă. Concentrația măsurată a probei îmbogățite se compară cu suma concentrației extractului neîmbogățit, plus concentrația cu îmbogățire. Dacă această concentrație măsurată este mai mică cu mai mult de 25 % față de concentrația (suma) calculată, aceasta indică posibilitatea eliminării semnalului, iar proba respectivă trebuie supusă analizei de confirmare prin GC/HRMS. Rezultatele sunt monitorizate prin grafice de control al calității.

—

Controlul calității probelor conforme

Aproximativ 2-10 % din probele conforme, în funcție de matricea probei și de experiența laboratorului, se confirmă prin GC/HRMS.

—

Determinarea ratelor fals-conform pornind de la datele QC

Se determină rata rezultatelor false-conforme care rezultă din screeningul probelor sub și peste nivelul maxim sau de acțiune. Ratele false-conforme reale sunt sub 5 %.

Atunci când, în urma controlului de calitate al probelor conforme, sunt disponibile cel puțin 20 de rezultate confirmate per matrice/grup de matrice, concluziile privind rata fals-conform trebuie să fie desprinse din această bază de date. Rezultatele probelor analizate prin intermediul testărilor interlaboratoare sau în timpul incidentelor de contaminare, care acoperă un interval de concentrații de până la, de exemplu, 2 × nivelul maxim (NM), pot fi, de asemenea, incluse în cele cel puțin 20 de rezultate pentru evaluarea ratei fals-conform. Probele acoperă cele mai frecvente modele realizate de congeneri, reprezentând diverse surse.

Deși testele de screening au, preferabil, ca scop detectarea probelor care depășesc nivelul de acțiune, criteriul de determinare a ratelor false-conforme este nivelul maxim, ținând seama de incertitudinea de măsurare a metodei de confirmare.

—

Probele potențial neconforme care rezultă în urma screeningului trebuie să fie întotdeauna verificate printr-o metodă analitică de confirmare (GC/HRMS). Aceste probe pot fi, de asemenea, folosite pentru a evalua rata rezultatelor false-neconforme. Pentru metodele de screening, rata „rezultatelor false-neconforme” este procentul rezultatelor confirmate ca fiind conforme în urma analizei de confirmare prin GC/HRMS, în timp ce, în screeningul anterior, s-a declarat că proba este suspectată de a fi neconformă. Totuși, evaluarea caracterului avantajos al metodei de screening se bazează pe compararea probelor false-neconforme cu numărul total de probe verificate. Această rată este suficient de mică pentru a face ca utilizarea unui instrument de screening să fie avantajoasă.

—

Cel puțin în condiții de validare, metodele bioanalitice oferă o indicație valabilă a nivelului TEQ, calculat și exprimat ca BEQ.

—

Și pentru metodele bioanalitice efectuate în condiții de repetabilitate, valoarea RSDr intralaborator ar fi, în general, mai mică decât RSDR (reproductibilitate).

—

Diferența dintre estimarea superioară și estimarea inferioară nu trebuie să depășească 20 % pentru produsele alimentare cu o contaminare de aproximativ 1 pg OMS-TEQ/g de grăsime (pe baza sumei dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor). Pentru produsele alimentare cu conținut scăzut de grăsime, trebuie să se aplice aceleași cerințe pentru nivelurile de contaminare, de aproximativ 1 pg OMS-TEQ/g produs. Pentru niveluri de contaminare inferioare, de exemplu, 0,5 pg OMS-TEQ/g de produs, diferența dintre estimarea superioară și estimarea inferioară poate fi între 25 % și 40 %.

—

Pentru a se valida procedura analitică, la începutul efectuării analizei, de exemplu, înaintea fazei de extracție, trebuie să se adauge etaloane interne de PCDD/F-uri substituite cu clor la pozițiile 2,3,7,8 și marcate cu 13C, precum și etaloane interne de PCB-uri de tipul dioxinelor marcate cu 13C. Trebuie adăugat cel puțin un congener pentru fiecare din grupele omoloage tetra- până la octo-clorurate de PCDD/F-uri și cel puțin un congener pentru fiecare dintre grupele omoloage de PCB-uri de tipul dioxinelor (alternativ, cel puțin un congener pentru fiecare funcție de înregistrare a ionului selecționat prin spectrometrie de masă, utilizat pentru monitorizarea PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor). În cazul metodelor de confirmare, trebuie să fie utilizate toate cele 17 etaloane interne de PCDD/F-uri substituite la pozițiile 2,3,7,8, și marcate cu 13C, precum și toate cele 12 etaloane interne de PCB-uri de tipul dioxinelor marcate cu 13C.

—

De asemenea, se determină factorii de răspuns relativ pentru acei congeneri pentru care nu se adaugă niciun analog marcat cu 13C, utilizându-se soluții de calibrare corespunzătoare.

—

Pentru produsele alimentare de origine vegetală și cele de origine animală care conțin mai puțin de 10 % grăsime, este obligatorie adăugarea etaloanelor interne înainte de extracție. Pentru produsele alimentare de origine animală care conțin mai mult de 10 % grăsime, etaloanele interne se pot adăuga fie înainte, fie după extracția grăsimii. Se procedează la o validare corespunzătoare a eficacității extracției, în funcție de etapa în care se introduc etaloanele interne și de modul în care sunt prezentate rezultatele (pe bază de produs sau de grăsimi).

—

Înaintea analizei GC/MS, trebuie să se adauge 1 sau 2 etaloane de recuperare (surogat).

—

Este necesar controlul recuperării. Pentru metodele de confirmare, recuperările de etaloane interne individuale trebuie să se situeze în intervalul 60-120 %. Sunt acceptabile recuperări inferioare sau superioare pentru congeneri individuali, în special pentru unele p-dibenzodioxine și unii dibenzofurani hepta- și octo-clorurați, atât timp cât contribuția acestora la valoarea TEQ nu depășește 10 % din valoarea TEQ totală (bazată pe suma dintre PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor). Pentru metodele de screening prin GC/MS, recuperările trebuie să se situeze în intervalul 30-140 %.

—

Separarea PCDD/F-urilor de compușii clorurați interferenți, cum sunt PCB-urile care nu sunt de tipul dioxinelor și bifenileterii clorurați, se realizează prin tehnici cromatografice adecvate (de preferință pe coloană de florisil, alumină și/sau cărbune).

—

Separarea izomerilor prin cromatografie în fază gazoasă trebuie să fie suficientă (< 25 % de la pic la pic între 1,2,3,4,7,8-HxCDF și 1,2,3,6,7,8-HxCDF).

—

Intervalul curbei de calibrare trebuie să acopere intervalul relevant de niveluri de interes.

—

Atunci când se calculează concentrațiile pornind de la o curbă de calibrare a TCDD, valorile la extremitățile inferioare și superioare ale curbei vor prezenta o variație importantă [coeficient de variație (CV) mare]. Intervalul de lucru este aria în care acest CV este mai mică decât 15 %. Extremitatea inferioară a intervalului de lucru (limita de raportare) trebuie să fie fixată semnificativ (cel puțin cu un factor de trei) peste martorii procedurii. Extremitatea superioară a intervalului de lucru este, de obicei, reprezentată de valoarea EC70 (70 % din concentrația maximă efectivă), dar mai scăzută dacă CV este mai mare de 15 % în acest interval. Intervalul de lucru este stabilit în timpul validării. Valorile-limită (8.3) trebuie să fie situate în intervalul de lucru.

—

Soluțiile etalon și extractele de probe trebuie să fie testate cel puțin în duplicat. Atunci când se utilizează duplicate, o soluție etalon sau un extract de control testată (testat) în 4 până la 6 godeuri repartizate pe placă produce un răspuns sau o concentrație (posibilă doar în intervalul de lucru) pe baza unui CV < 15 %.

—

Nivelurile din probe pot fi estimate prin compararea răspunsului la test cu o curbă de calibrare a TCDD (sau a PCB 126 sau a unui amestec etalon de PCDD/F/PCB-uri de tipul dioxinelor) pentru a se calcula nivelul BEQ din extract și, prin urmare, din probă.

—

Curbele de calibrare conțin între 8 și 12 concentrații (cel puțin în duplicate), cu concentrații suficiente în partea inferioară a curbei (intervalul de lucru). Se acordă atenție specială calității ajustării curbei în intervalul de lucru. Ca atare, valoarea R2 are valoare redusă sau nicio valoare în estimarea calității ajustării în regresia nelineară. Se ajunge la o ajustare mai bună prin reducerea la minimum a diferenței între nivelurile calculate și cele observate în intervalul de lucru al curbei (de exemplu, prin reducerea la minimum a sumei pătratelor rezidualelor).

—

Nivelul estimat din extractul de probă este corectat ulterior în funcție de nivelul BEQ calculat pentru o probă-martor de matrice/solvent (pentru a se ține cont de impuritățile din solvenți și din substanțele chimice utilizate) și recuperarea aparentă (calculată pornind de la nivelul BEQ al probelor de referință adecvate cu modele reprezentative de congeneri în jurul nivelului de interes). Pentru a efectua o corecție a recuperării, recuperarea aparentă trebuie să fie situată întotdeauna în intervalul necesar (a se vedea punctul 8.1.4). Probele de referință utilizate pentru corecția recuperării trebuie să respecte cerințele de la punctul 8.2.

—

Pierderea de compuși în timpul curățării se verifică în timpul validării. O probă-martor îmbogățită cu un amestec de congeneri diferiți face obiectul curățării (n = 3 cel puțin), iar recuperarea și variabilitatea sunt verificate prin GC/HRMS. Recuperarea se situează între 60 % și 120 %, mai ales pentru congenerii care contribuie cu mai mult de 10% la nivelul TEQ în diverse amestecuri.

—

Atunci când se raportează nivelurile BEQ, se determină o limită de raportare pornind de la probele de matrice relevante care implică modele tipice pentru congeneri, dar nu pornind de la curba de calibrare a etaloanelor din cauza preciziei mici în intervalul inferior al curbei. Efectele extracției și ale curățării trebuie luate în considerare. Limita de raportare se fixează semnificativ (cel puțin cu un factor de trei) peste martorii procedurii.

—

Probele de referință reprezintă matricea probei, modelele pentru congeneri și intervalele de concentrație pentru PCDD/F-uri și PCB-uri de tipul dioxinelor în jurul nivelului de interes (niveluri maxime sau de acțiune).

—

În fiecare serie de teste se include un martor pentru procedură sau, de preferință, un martor pentru matrice, precum și o probă de referință la nivelul de interes. Aceste probe trebuie extrase și testate în același timp și în condiții identice. Proba de referință trebuie să prezinte un răspuns clar mai mare în comparație cu proba-martor, asigurând astfel caracterul adecvat al testului. Aceste probe pot fi utilizate pentru corecțiile recuperării și ale martorului.

—

Probele de referință alese pentru a efectua o corecție a recuperării sunt reprezentative pentru probele testate, în sensul că modelele pentru congeneri nu conduc la o subestimare a nivelurilor.

—

Se pot include probe de referință suplimentare, de exemplu la 0,5 × și 2 × nivelul de interes, pentru a se demonstra performanța corespunzătoare a testului în intervalul de interes, pentru controlul nivelului de interes. Combinate, aceste probe pot fi utilizate pentru calcularea nivelurilor BEQ în probele testate (8.1.2.2).

BEQDL

BEQ care corespunde limitei de decizie aferente GC/HRMS, fiind nivelul maxim, inclusiv incertitudinea de măsurare

sy,x

deviație standard reziduală

t α,f=m-2

factor Student (α = 5 %, f = grade de libertate, o singură parte)

m

numărul total de puncte de calibrare (indice j)

n

numărul de repetări la fiecare nivel

xi

concentrația probei GC/HRMS (în TEQ) a punctului de calibrare i

medie a concentrațiilor (în TEQ) ale tuturor probelor de calibrare

SDR

deviația standard a rezultatelor biotestului la BEQDL, măsurată în condiții de reproductibilitate intralaborator

—

Având în vedere faptul că nu se pot utiliza standarde interne în metodele bioanalitice, testele cu privire la repetabilitate se efectuează pentru obținerea unor informații privind deviația standard în cadrul unei serii de teste și între serii de teste. Repetabilitatea trebuie să fie sub 20 %, iar reproductibilitatea intralaborator sub 25 %. Aceasta se bazează pe nivelurile calculate în BEQ după corecția în funcție de martor și recuperare.

—

Ca parte din procesul de validare, testul trebuie să permită stabilirea diferenței între o probă-martor și un nivel la valoarea-limită, permițând identificarea probelor peste valoarea-limită corespunzătoare (a se vedea 8.1.2).

—

Se definesc compușii țintă, interferențele potențiale și nivelurile maxime tolerabile ale martorului.

—

Deviația standard în procente a răspunsului sau concentrației calculate pornind de la răspuns (posibilă numai în intervalul de lucru) a unei determinări triple a unui extract de probă nu poate fi mai mare de 15 %.

—

Rezultatele necorectate ale probei (probelor) de referință exprimată (exprimate) în BEQ-uri (martor și nivelul de interes) sunt utilizate pentru evaluarea performanței metodei bioanalitice pe o perioadă de timp constantă.

—

Graficele de control al calității (QC) pentru martorii procedurii și fiecare tip de probă de referință se înregistrează și se verifică pentru a se asigura că performanța analitică este în conformitate cu cerințele, în special pentru martorii procedurii cu privire la diferența minimă solicitată la extremitatea inferioară a intervalului de lucru și pentru probele de referință cu privire la reproductibilitatea intralaborator. Martorii procedurii sunt bine controlați într-un mod care să evite rezultatele false-conforme atunci când se scad.

—

Rezultatele analizelor prin GC/HRMS ale probelor suspectate și a 2-10 % din probele conforme (minimum 20 de probe pentru fiecare matrice) sunt colectate și folosite pentru a evalua performanța metodei de screening și relația dintre BEQ-uri și TEQ-uri. Această bază de date ar putea fi utilizată pentru reevaluarea valorilor-limită aplicabile probelor de rutină pentru matricele validate.

—

Buna performanță a metodelor poate fi, de asemenea, demonstrată prin participarea la testările interlaboratoare. Rezultatele probelor analizate în testările interlaboratoare, care acoperă un interval de concentrații care ajunge până la, de exemplu, 2 × nivelul maxim, pot fi, de asemenea, incluse în evaluarea ratei fals-conform, în cazul în care un laborator este în măsură să demonstreze buna sa performanță. Probele acoperă cele mai frecvente modele pentru congeneri, reprezentând diverse surse.

—

În timpul incidentelor, valorile-limită pot fi reevaluate, reflectând matricea specifică și modelele pentru congeneri doar ale acestui incident.

—

În măsura în care procedura analitică utilizată permite acest lucru, rezultatele analitice includ nivelurile de congeneri individuali din grupul PCDD/F-urilor și PCB-urilor de tipul dioxinelor și sunt raportate ca estimare inferioară, estimare superioară și estimare mediană, pentru a include o cantitate maximă de informații în raportarea rezultatelor, ceea ce permite o interpretare a rezultatelor în conformitate cu cerințele specifice.

—

Raportul include și metoda utilizată pentru extracția PCDD/F-urilor, PCB-urilor de tipul dioxinelor și lipidelor. Conținutul de lipide al probei se determină și se raportează pentru probe din produse alimentare cu niveluri maxime sau de acțiune exprimate pe bază de grăsimi și o concentrație de grăsimi estimată în intervalul 0-2 % (în concordanță cu legislația existentă), iar pentru alte eșantioane determinarea conținutului de lipide este opțională.

—

Recuperările etaloanelor interne individuale trebuie să fie disponibile în cazul în care recuperările se situează în afara intervalului menționat la punctul 7.2, în cazul în care nivelul maxim este depășit, iar în celelalte cazuri la cerere.

—

Întrucât, atunci când se decide conformitatea unei probe, se ține seama de incertitudinea de măsurare, acest parametru este, de asemenea, pus la dispoziție. Prin urmare, rezultatele analitice se raportează ca x +/– U, unde x este rezultatul analitic, iar U este incertitudinea de măsurare extinsă folosind un factor de acoperire 2, care conferă un nivel de încredere de aproximativ 95 %. În cazul unei determinări separate a PCDD/F-urilor și a PCB-urilor de tipul dioxinelor, suma incertitudinii extinse estimate a rezultatelor analitice separate ale PCDD/F-urilor și ale PCB-urilor de tipul dioxinelor se utilizează pentru suma PCDD/F-urilor și PCB-urilor de tipul dioxinelor.

—

În cazul în care se ia în considerare incertitudinea de măsurare prin aplicarea CCα (astfel cum se descrie în anexa II punctul IV.2), acest parametru se raportează.

—

Rezultatele se exprimă în aceleași unități și prin (cel puțin) același număr de cifre semnificative ca și nivelurile maxime menționate în Regulamentul (CE) nr. 1881/2006.

—

Rezultatul screeningului se exprimă ca și „conform” sau „suspectat a fi neconform” („suspectat”).

—

În plus, se poate da un rezultat pentru PCDD/F-uri și/sau PCB-uri de tipul dioxinelor exprimat în echivalente bioanalitice (BEQ), nu în TEQ (a se vedea anexa III, punctul 2).

—

În cazul în care se dă incertitudinea de măsurare a nivelului BEQ calculat, de exemplu, ca deviație standard, aceasta trebuie să se bazeze pe cel puțin o analiză triplă a probei (inclusiv extracția, curățarea și determinarea răspunsului la test).

—

Probele cu un răspuns inferior limitei de raportare se exprimă ca fiind „sub limita de raportare”.

—

Pentru fiecare tip de matrice a probei, raportul menționează nivelul de interes (nivel maxim, nivel de acțiune) pe care se bazează evaluarea.

—

Raportul menționează tipul de test aplicat, principiul de bază al testului și tipul de calibrare.

—

Raportul include și metoda utilizată pentru extracția PCDD/F-urilor, PCB-urilor de tipul dioxinelor și lipidelor. Conținutul de lipide al probei se determină și se raportează pentru probe din produse alimentare cu niveluri maxime sau de acțiune exprimate pe bază de grăsimi și o concentrație de grăsimi estimată în intervalul 0-2 % (în concordanță cu legislația existentă), iar pentru alte eșantioane determinarea conținutului de lipide este opțională.

—

Timpul de retenție relativ în raport cu etaloanele interne sau etaloanele de referință (deviație acceptabilă +/– 0,25 %).

—

Separarea gaz-cromatografică a tuturor celor șase PCB indicatori (PCB 28, PCB 52, PCB 101, PCB 138, PCB 153 și PCB 180) de substanțele interferente, în special PCB-uri co-eluante, mai ales în cazul în care nivelurile probelor sunt în limite legale și neconformitatea trebuie să se confirme.

Notă: Congeneri despre care s-a constatat că sunt adesea co-eluanți sunt, de exemplu, PCB 28/31, PCB 52/69 și PCB 138/163/164. Pentru GC/MS este necesar să se țină seama și de interferențele posibile din partea fragmentelor de congeneri mai puternic clorurați.

—

Pentru tehnicile GC/MS:

—

Pentru GC/ECD:

Confirmarea rezultatelor care depășesc limita de toleranță cu două coloane de GC cu fază staționară cu o polaritate diferită.

—

Utilizarea de standarde interne corespunzătoare, cu proprietăți fizico-chimice comparabile cu ale analiților de interes.

—

Adăugarea de etaloane interne:

—

Cerințele pentru metode care utilizează toți cei șase congeneri ai PCB-urilor indicatori marcați cu un izotop:

—

Cerințele pentru metode care nu utilizează toate cele șase etaloane interne marcate cu un izotop sau alte etaloane interne:

—

Recuperările congenerilor nemarcați se verifică prin probe îmbogățite sau probe pentru controlul calității cu concentrații în intervalul nivelului de interes. Recuperări acceptabile pentru acești congeneri sunt între 70 și 120 %.

—

În măsura în care procedura analitică utilizată permite acest lucru, rezultatele analitice includ nivelurile de congeneri individuali din grupul PCB-urilor și sunt raportate ca estimare inferioară, estimare superioară și estimare mediană, pentru a include o cantitate maximă de informații în raportarea rezultatelor, ceea ce permite o interpretare a rezultatelor în conformitate cu cerințele specifice.

—

Raportul include și metoda utilizată pentru extracția PCB-urilor și a lipidelor. Conținutul de lipide al probei se determină și se raportează pentru probe din produse alimentare cu niveluri maxime exprimate pe bază de grăsimi și o concentrație de grăsimi estimată în intervalul 0-2 % (în concordanță cu legislația existentă), iar pentru alte eșantioane determinarea conținutului de lipide este opțională.

—

Recuperările etaloanelor interne individuale trebuie să fie disponibile în cazul în care recuperările se situează în afara intervalului menționat la punctul 6, în cazul în care nivelul maxim este depășit, iar în celelalte cazuri la cerere.

—

Întrucât, atunci când se decide conformitatea unei probe, se ține seama de incertitudinea de măsurare, acest parametru este, de asemenea, pus la dispoziție. Prin urmare, rezultatele analitice se raportează ca x +/– U, unde x este rezultatul analitic, iar U este incertitudinea de măsurare extinsă folosind un factor de acoperire 2, care conferă un nivel de încredere de aproximativ 95 %.

—

În cazul în care se ia în considerare incertitudinea de măsurare prin aplicarea CCα (astfel cum se descrie în anexa II, punctul IV. 1), acest parametru se raportează.

—

Rezultatele se exprimă în aceleași unități și prin (cel puțin) același număr de cifre semnificative ca și nivelurile maxime menționate în Regulamentul (CE) nr. 1881/2006.