1.

Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky je testovacia metóda in vitro, ktorá sa môže používať za určitých okolností a so špecifickými obmedzeniami na klasifikáciu látok a zmesí ako ‚očných žieravín a silne dráždivých látok‘ (1) (2) (3). Na účely tejto testovacej metódy sa silne dráždivé látky vymedzujú ako dráždivé látky vyvolávajúce očné lézie, ktoré u králikov pretrvávajú najmenej 21 dní po podaní. Hoci sa nepovažuje za platnú a plnohodnotnú náhradu in vivo testu králičích očí, na účely regulačnej klasifikácie a označovania v rámci určitej sféry použiteľnosti sa odporúča používať testovaciu metódu zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky ako súčasť stratégie postupného testovania (4) (5). Testované látky a zmesi (6) možno klasifikovať ako očné žieraviny alebo silne dráždivé látky bez ďalšieho testovania na králikoch. Látka, ktorej testovanie je negatívne, by sa musela testovať na králikoch s využitím stratégie sekvenčného testovania, ako sa ustanovuje v usmernení OECD pre testy 405 (7) (kapitola B.5 tejto prílohy).

2.

Účelom tejto metódy je opis postupov, ktoré sa používajú na posudzovanie možnej očnej žieravosti alebo silnej dráždivosti testovanej látky meraním jej schopnosti vyvolať zákal a zvýšenú priepustnosť v izolovanej hovädzej rohovke. Toxické účinky na rohovku sa merajú: i) zníženým prestupom svetla (zákal) a ii) zvýšeným prechodom farbiva fluoresceínu sodného (priepustnosť). Hodnotenia zákalu a priepustnosti rohovky po vystavení pôsobeniu testovanej látky sa zlúčia a odvodí sa hodnotiace číslo in vitro (In Vitro Irritancy Score, ďalej len ‚IVIS‘), ktoré sa používa na klasifikáciu úrovne dráždivosti testovanej látky.

3.

Očné dráždivé látky vyvolávajúce lézie, ktoré ustúpia za menej ako 21 dní, a nedráždivé látky sa takisto testovali s využitím testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky. Presnosť a spoľahlivosť testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky pre látky v týchto kategóriách sa však formálne neposudzovala.

4.

Vymedzenie pojmov sa uvádza v dodatku 1.

5.

Táto testovacia metóda vychádza z protokolu testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky medziagentúrneho koordinačného výboru pre overovanie alternatívnych metód (Interagency Coordinating Committee on the Validation of Alternative Methods, ďalej len ‚ICCVAM‘) (8), ktorý bol vytvorený podľa medzinárodnej hodnotiacej štúdie (4)(5)(9) s príspevkami od Európskeho centra pre validáciu alternatívnych metód a japonského centra pre overovanie alternatívnych metód. Tento protokol vychádza z informácií získaných od Inštitútu pre vedy in vitro a z protokolu INVITTOX 124 (10), ktorý predstavuje protokol používaný pri rozbore predbežnej hodnotiacej štúdie testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky, ktorú financovalo Európske spoločenstvo a ktorá prebehla v rokoch 1997 –1998. Obidva protokoly vychádzajú z metodiky rozboru testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky, ktorú prvýkrát zverejnil Gautheron a kolektív (11).

6.

Zistené obmedzenia tejto testovacej metódy vychádzajú z vysokých mier falošnej pozitivity na alkoholy a ketóny a z vysokej miery falošnej negativity na tuhé látky zaznamenané v overovacej databáze (pozri odsek 44) (5). Keď sa látky týchto chemických a fyzikálnych tried vylúčia z databázy, presnosť testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky v klasifikačných systémoch EÚ, Agentúry na ochranu životného prostredia (ďalej len ‚EPA‘) a Globálneho harmonizovaného systému klasifikácie a označovania chemických látok a zmesí (ďalej len ‚GHS‘) sa výrazne zlepší (5). Vzhľadom na účely tohto rozboru (t. j. iba na zisťovanie očných žieravín/silne dráždivých látok) nie sú miery falošnej negativity rozhodujúce, pretože takéto látky by sa následne testovali na králikoch alebo inými vhodne overenými testami in vitro v závislosti od regulačných požiadaviek s použitím stratégie sekvenčného testovania, ktorá vychádza z prístupu podľa závažnosti dôkazov. Okrem toho aktuálna overovacia databáza neumožňuje primerané posúdenie niektorých chemických tried alebo tried výrobkov (napr. zmesí). Výskumníci by však mohli zvážiť použitie tejto testovacej metódy pre všetky druhy testovaných materiálov (vrátane zmesí), pričom pozitívny výsledok by sa mohol akceptovať ako údaj, ktorý naznačuje reakciu vo forme očnej žieravosti alebo silného podráždenia. Pozitívny výsledok získaný pre alkoholy alebo ketóny by sa však mal interpretovať opatrne pre riziko nadsadenej predpovede.

7.

Všetky postupy s hovädzími očami a s hovädzími rohovkami by mali zodpovedať platným nariadeniam pre dané testovacie zariadenie a postupom na narábanie s materiálom živočíšneho pôvodu, medzi ktoré, okrem iných, patria tkanivá a tkanivové tekutiny. Odporúčajú sa všeobecne platné laboratórne bezpečnostné opatrenia (12).

8.

Obmedzením tejto testovacej metódy je, že i keď sa pri nej zohľadňujú niektoré účinky na oči, ktoré sa posudzujú metódou testovania očnej dráždivosti králikov, a do istej miery aj ich závažnosť, neprihliada sa na poškodenia spojiviek a dúhovky. I keď sa vratnosť lézií rohovky nemôže pri rozbore zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky posudzovať samostatne, na základe štúdií očí králikov sa takisto podal návrh, aby sa hodnotenie počiatočnej hĺbky poškodenia rohovky mohlo používať na rozlišovanie nevratných a vratných účinkov (13). A napokon, testovanie zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky neumožňuje vykonať hodnotenie potenciálnej systémovej toxicity súvisiacej s expozíciou očí.

9.

Práce na charakterizovaní použiteľnosti a obmedzení rozboru zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky pri zisťovaní slabo dráždivých a nedráždivých látok (pozri aj odsek 45) pokračujú. Používateľom sa takisto odporúča, aby poskytli vzorky a/alebo údaje hodnotiacim organizáciám na formálne posúdenie možných budúcich spôsobov použitia testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky aj na zisťovanie slabo dráždivých a nedráždivých látok.

10.

V každom laboratóriu, ktoré prvýkrát zavádza tento rozbor, by sa mali použiť chemikálie na preukázanie spôsobilosti uvedené v dodatku 2. Laboratórium môže použiť tieto chemikálie na preukázanie svojej technickej spôsobilosti na vykonávanie testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky prv, ako predloží údaje z rozboru zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na účely klasifikácie nebezpečenstva podľa predpisov.

11.

Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky je organotypický model, ktorý poskytuje krátkodobé zachovanie normálnej fyziologickej a biochemickej funkcie hovädzej rohovky in vitro. Pri tejto testovacej metóde sa poškodenie testovanou látkou hodnotí kvantitatívnymi meraniami zmien zákalu a priepustnosti rohovky opacitometrom, resp. spektrofotometrom vo viditeľnej oblasti svetla. Obidve merania sa používajú na výpočet hodnotiaceho čísla in vitro, ktoré sa používa na priradenie klasifikačnej kategórie nebezpečenstva podráždenia in vitro na predvídanie schopnosti testovanej látky vyvolať očné podráždenie in vivo (pozri časť Rozhodovacie kritériá).

12.

V testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa používajú izolované rohovky z očí čerstvo zabitých zvierat. Zákal rohovky sa kvantitatívne meria ako množstvo svetla prepusteného cez rohovku. Priepustnosť sa kvantitatívne stanovuje ako množstvo farbiva fluoresceínu sodného, ktoré prejde cez celú hrúbku rohovky, a meria sa v médiu zadnej komory. Testované látky sa nanášajú na epiteliálny povrch rohovky pridaním do prednej komory držiaka rohovky. Dodatok 3 obsahuje opis a schému držiaka rohovky, ktorý sa používa v testovacej metóde zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky. Držiaky rohovky sa dajú zakúpiť z rôznych zdrojov alebo sa dajú zhotoviť.

13.

Dobytok odoslaný na bitúnky sa zvyčajne zabíja pre ľudskú spotrebu alebo pre iné komerčné spôsoby použitia. Ako zdroj rohoviek pre testovanie zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa používajú iba zdravé zvieratá, ktoré sa považujú za vhodné na vstup do ľudského potravinového reťazca. Keďže rozsah hmotnosti dobytka je široký v závislosti od spôsobu chovu, veku a pohlavia, neexistuje žiadne odporúčanie pre hmotnosť zvieraťa v čase zabitia.

14.

Pri použití očí zo zvierat v rôznom veku môžu byť rozmery rohoviek rôzne. Rohovky s vodorovným priemerom > 30,5 mm a s hodnotami stredovej hrúbky rohovky ≥ 1 100 μm sa vo všeobecnosti získavajú z dobytka staršieho ako osem rokov, zatiaľ čo rohovky s vodorovným priemerom < 28,5 mm a s hodnotami stredovej hrúbky rohovky < 900 μm sa vo všeobecnosti získavajú z dobytka mladšieho ako päť rokov (14). Z toho dôvodu sa oči dobytka staršieho ako 60 mesiacov zvyčajne nepoužívajú. Oči dobytka mladšieho ako 12 mesiacov sa takisto tradične nepoužívajú, pretože tieto oči sa ešte vyvíjajú a hrúbka rohovky a priemer rohovky sú značne menšie, ako sa uvádza v prípade očí dospelého dobytka. Použitie rohoviek mladých zvierat (t. j. 6 až 12 mesačných) je však prípustné, pretože to má niekoľko výhod, ako je vyššia dostupnosť, užší vekový interval a menšie nebezpečenstvo súvisiace s potenciálnym vystavením pracovníkov bovinnej spongiformnej encefalopatii (15). Keďže ďalšie posúdenie vplyvu veľkosti alebo hrúbky rohovky na schopnosť reagovať na žieravé a dráždivé látky by bolo prínosné, odporúča sa, aby používatelia oznámili odhadovaný vek a/alebo hmotnosť zvierat, od ktorých rohovky použité v štúdii pochádzajú.

15.

Odber očí vykonávajú zamestnanci bitúnkov. V snahe minimalizovať mechanické a iné druhy poškodenia očí by sa oči mali vylúpnuť čo najskôr po zabití. Zamestnanci bitúnkov by pri oplachovaní hlavy zvieraťa nemali použiť žiadny detergent, aby sa predišlo vystaveniu očí pôsobeniu potenciálne dráždivých látok.

16.

Oči by sa mali úplne ponoriť do Hankovho vyváženého soľného roztoku (ďalej len ‚HBSS‘) v nádrži vhodnej veľkosti a dopraviť do laboratória takým spôsobom, aby sa minimalizovalo poškodenie a/alebo kontaminácia baktériami. Keďže odber očí sa vykonáva počas zabíjania, tieto oči môžu byť vystavené styku s krvou alebo inými biologickými látkami vrátane baktérií a iných mikroorganizmov. Preto je dôležité minimalizovať nebezpečenstvo kontaminácie (napr. uložením nádrže s očami na ľad, pridaním antibiotík do HBSS, ktorý sa používa na skladovanie očí pri preprave [napr. dávkou penicilínu 100 IU/ml a streptomycínu 100 mg/ml]).

17.

Časový interval medzi odberom očí a použitím rohoviek na testovanie zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky by sa mal minimalizovať (zvyčajne sa odber a použitie vykoná v jednom dni) a mal by byť preukázateľný, aby sa nedali spochybniť výsledky rozboru. Základom pre tieto výsledky sú výberové kritériá na oči, ako aj reakcie pri pozitívnej a negatívnej kontrole. Všetky oči použité na rozbor by mali byť z jednej skupiny očí pochádzajúcich z odberu v určitý deň.

18.

Keď sa oči dopravia do laboratória, pozorne sa prekontrolujú s ohľadom na poškodenia vrátane zvýšeného zákalu, škrabancov a prekrvenia. Môžu sa použiť iba rohovky z očí bez takýchto chýb.

19.

V ďalších krokoch rozboru sa takisto posudzuje kvalita každej rohovky. Rohovky, ktoré majú po prvej hodine ustaľovania zákal väčší ako sedem zákalových jednotiek, sa majú vyradiť (POZNÁMKA: opacitometer by sa mal kalibrovať podľa noriem zákalu, ktoré sa používajú na stanovenie zákalových jednotiek, pozri dodatok 3).

20.

Skupina pre každú úpravu (testovaná látka, súbežné negatívne a pozitívne kontroly) sa skladá minimálne z troch očí. Tri rohovky by sa mali použiť na negatívnu kontrolu pri rozbore testovania zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky. Keďže odobrané rohovky pochádzajú z celých očných gulí a tieto sa inštalujú do komôr na rohovky, existuje tu možnosť, že táto manipulácia môže ovplyvniť jednotlivé hodnoty zákalu a priepustnosti rohovky (vrátane negatívnej kontroly). Okrem toho hodnoty zákalu a priepustnosti rohoviek z negatívnej kontroly sa používajú na korigovanie testovaného predmetu a hodnoty zákalu a priepustnosti rohoviek z pozitívnej kontroly pri výpočtoch IVIS.

21.

Rohovky bez chýb sa vyrežú s 2 až 3 mm prúžkom skléry, ktorá pomáha pri následnej manipulácii, pričom sa postupuje opatrne, aby nedošlo k poškodeniu epitelu a endotelu rohovky. Oddelené rohovky sa nainštalujú do špeciálne navrhnutých držiakov rohovky pozostávajúcich z prednej a zadnej priehradky, ktoré sa dotýkajú epiteliálnej, resp. endoteliálnej strany rohovky v uvedenom poradí. Obidve komory sa naplnia prebytkom predhriateho minimálneho základného média Eagle (Eagle's Minimum Essential Medium, ďalej len ‚EMEM‘) (najprv zadná komora), čím sa zabezpečí, že sa nevytvoria žiadne bubliny. Zariadenie sa potom ustaľuje pri teplote 32 ± 1 °C aspoň jednu hodinu, čím sa umožní, aby sa rohovky dostali do rovnováhy s médiom a dosiahli bežnú metabolickú aktivitu v najväčšej možnej miere (približná teplota povrchu rohovky in vivo je 32 °C).

22.

Po dobe ustaľovania sa do obidvoch komôr pridá čerstvé predhriate EMEM a pre každú rohovku sa odčítajú základné údaje o zákale. Všetky rohovky, ktoré vykazujú makroskopické poškodenie tkaniva (napr. škrabance, pigmentáciu, neovaskularizáciu) alebo zákal > 7 zákalových jednotiek, sa vyradia. Vypočítajú sa priemerné hodnoty zákalu všetkých ustálených rohoviek. Minimálne tri rohovky s hodnotami zákalu blízkymi strednej hodnote všetkých rohoviek sa vyberú ako rohovky na negatívnu kontrolu (alebo kontrolu rozpúšťadla). Zvyšné rohovky sa potom rozdelia do skupín na úpravu a pozitívnu kontrolu.

23.

Keďže tepelná kapacita vody je vyššia ako tepelná kapacita vzduchu, voda poskytuje stabilnejšie teplotné podmienky inkubácie. Preto sa odporúča použiť vodný kúpeľ na udržiavanie držiaka rohovky a jeho obsahu na teplote 32 ± 1 °C. Vzdušné inkubátory sa však takisto môžu používať, pričom sa predpokladajú opatrenia na udržiavanie stabilnej teploty (napr. predhriatím držiakov a médií).

24.

Používajú sa dva rôzne protokoly na úpravu, jeden na kvapaliny a povrchovo aktívne látky (tuhé látky alebo kvapaliny) a jeden na povrchovo neaktívne tuhé látky.

25.

Kvapaliny sa testujú nezriedené, zatiaľ čo povrchovo aktívne látky sa testujú pri koncentrácii 10 % m/V v 0,9 % roztoku chloridu sodného, v destilovanej vode alebo v inom rozpúšťadle, o ktorom sa preukázalo, že nemá žiadne nepriaznivé účinky na testovací systém. Polotuhé látky, pasty a vosky sa zvyčajne testujú ako kvapaliny. Pre alternatívne koncentrácie zriedenia by sa mali uviesť príslušné dôvody. Rohovky sa vystavia pôsobeniu kvapalín a povrchovo aktívnych látok počas 10 minút. Pri použití inej dĺžky expozície by sa malo uviesť primerané vedecké zdôvodnenie.

26.

Povrchovo neaktívne tuhé látky sa zvyčajne testujú ako roztoky alebo suspenzie s koncentráciou 20 % v 0,9 % roztoku chloridu sodného, v destilovanej vode alebo v inom rozpúšťadle, o ktorom sa preukázalo, že nemá žiadne nepriaznivé účinky na testovací systém. Za určitých okolností a pri riadnom vedeckom zdôvodnení sa tuhé látky môžu testovať aj čisté priamym nanesením na povrch rohovky s použitím metódy otvorenej komory (pozri odsek 29). Rohovky sa vystavia pôsobeniu tuhých látok na štyri hodiny, ale podobne ako pri kvapalinách a povrchovo aktívnych látkach môžu sa použiť iné dĺžky expozície s primeraným vedeckým zdôvodnením.

27.

V závislosti od fyzikálnej povahy a chemických vlastností (napr. tuhé látky, kvapaliny, viskózne či neviskózne kvapaliny) testovanej látky sa môžu používať rôzne metódy úpravy. Najdôležitejšie je zabezpečiť, aby testovaná látka primerane pokrývala epiteliálny povrch a aby sa pri oplachovaní primerane odstránila. Metóda uzavretej komory sa zvyčajne používa na neviskózne až mierne viskózne kvapalné testované látky, zatiaľ čo metóda otvorenej komory sa zvyčajne používa na poloviskózne a viskózne kvapalné testované látky a na čisté tuhé látky.

28.

Pri metóde uzavretej komory sa do prednej komory cez dávkovacie otvory na hornej strane komory zavedie dostatočné množstvo testovanej látky (750 μl) tak, aby sa ňou pokryla epiteliálna strana rohovky, a otvory komory sa následne uzavrú zátkami na čas expozície. Dôležité je zabezpečiť, aby každá rohovka bola vystavená pôsobeniu testovanej látky počas primeraného obdobia.

29.

Pri metóde otvorenej komory sa pred úpravou vyberie prstencový zámok okna a sklenené okno z prednej komory. Kontrolná alebo testovaná látka (750 μl alebo dostatočné množstvo testovanej látky na úplné pokrytie rohovky) sa nanesie priamo na epiteliálny povrch rohovky pomocou mikropipety. Ak sa testovaná látka ťažko pipetuje, môže sa na uľahčenie dávkovania naplniť do piestovej pipety pod tlakom. Špička piestovej pipety sa vloží do dávkovacieho hrotu striekačky tak, aby sa materiál mohol zaviesť do vytláčacieho hrotu pod tlakom. Súčasne s posúvaním piestu pipety nahor sa tlačí na piest striekačky. Ak sa v špičke pipety objavia vzduchové bubliny, testovaný materiál sa odstráni (vytlačí) a postup sa opakuje, pokiaľ sa špička nenaplní bez vzduchových bublín. Ak je potrebné, môže sa použiť obyčajná striekačka (bez ihly), pretože umožňuje odmerať presný objem testovanej látky a jej ľahšie nanesenie na epiteliálny povrch rohovky. Po dávkovaní sa sklenené okno vráti na svoje miesto v prednej komore a tým sa systém znova uzavrie.

30.

Po uplynutí expozičného obdobia sa testovaná látka, látka na negatívnu kontrolu alebo na pozitívnu kontrolu odstránia z prednej komory a epitel sa prepláchne aspoň trikrát (alebo pokiaľ nie sú viditeľné žiadne znaky prítomnosti testovanej látky) s EMEM (obsahujúcim fenolovú červeň). Médium s obsahom fenolovej červene sa používa na oplachovanie, lebo zmena farby fenolovej červene sa môže monitorovať, čím sa zistí účinnosť oplachovania kyslých alebo zásaditých materiálov. Rohovky sa umývajú viac ako trikrát, pokiaľ je farba fenolovej červene zmenená (na žltú alebo fialovú) alebo je testovaná látka stále viditeľná. Keď médium neobsahuje testovanú látku, rohovky sa opláchnu posledný krát s EMEM (bez fenolovej červene). EMEM (bez fenolovej červene) sa používa na konečné opláchnutie, aby sa zabezpečilo odstránenie fenolovej červene z prednej komory pred meraním zákalu. Predná komora sa potom znova naplní čerstvým EMEM bez fenolovej červene.

31.

V prípade kvapalín alebo povrchovo aktívnych látok sa rohovky po opláchnutí inkubujú ďalšie dve hodiny pri teplote 32 ± 1 °C. Dlhší poexpozičný čas môže byť za určitých podmienok užitočný a mohlo by sa o ňom v jednotlivých prípadoch uvažovať. Rohovky upravené tuhou látkou sa na konci štvorhodinového expozičného obdobia dôkladne opláchnu, ale nevyžaduje sa ďalšia inkubácia.

32.

Na konci poexpozičného inkubačného obdobia, v prípade kvapalín a povrchovo aktívnych látok, a na konci štvorhodinového expozičného obdobia, v prípade povrchovo neaktívnych tuhých látok, sa zaznamená zákal a priepustnosť každej rohovky. Každá rohovka sa takisto vizuálne prehliadne a prípadné pozorovania sa zaznamenajú (napr. zlupovanie tkaniva, zvyšky testovanej látky, vzorky s nerovnomerným zákalom). Tieto pozorovania by mohli byť dôležité, lebo sa môžu prejaviť v kolísaní údajov opacitometra.

33.

Súbežné negatívne kontroly alebo kontroly rozpúšťadla/nosiča a pozitívne kontroly sú súčasťou každého pokusu.

34.

Keď sa testuje kvapalná látka s koncentráciou 100 %, do testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa začleňuje súbežná negatívna kontrola (napr. 0,9 % roztok chloridu sodného alebo destilovaná voda), aby sa dali zistiť nešpecifické zmeny v testovacom systéme a aby sa poskytol základ na koncové body rozboru. Tým sa takisto zabezpečuje, aby v dôsledku podmienok rozboru nedošlo k neprimeranej reakcii vo forme podráždenia.

35.

Keď sa testuje zriedená kvapalina, povrchovo aktívna látka alebo tuhá látka, do testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa začleňuje súbežná kontrolná skupina rozpúšťadla/nosiča, aby sa dali zistiť nešpecifické zmeny v testovacom systéme a aby sa poskytol základ na koncové body rozboru. Môže sa použiť iba také rozpúšťadlo/nosič, u ktorého sa preukázalo, že nemá žiadne nepriaznivé účinky na testovací systém.

36.

Do každého pokusu sa začleňuje nejaká známa očná dráždivá látka ako súbežná pozitívna kontrola a tým sa overuje vyvolanie primeranej reakcie. Keďže rozbor zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky sa používa v tejto testovacej metóde na zisťovanie žieravých alebo silne dráždivých látok, v ideálnom prípade by sa na pozitívnu kontrolu mala použiť referenčná látka, ktorá v tejto testovacej metóde vyvoláva závažnú reakciu. V snahe zabezpečiť možnosť vyhodnotiť premenlivosť reakcie pri pozitívnej kontrole v čase by však závažnosť dráždivej reakcie nemala byť extrémne silná.

37.

Príklady pozitívnych kontrol na kvapalné testované látky sú dimetylformamid alebo 1 % hydroxid sodný. Príkladom pozitívnej kontroly na tuhé testované látky je 20 % (hmotnosť na objem) roztok imidazolu v 0,9 % roztoku chloridu sodného.

38.

Referenčné látky sú užitočné na posudzovanie potenciálu očnej dráždivosti neznámych chemikálií určitej chemickej triedy alebo triedy výrobkov alebo na posudzovanie potenciálu pomernej dráždivosti očnej dráždivej látky v rámci určitého rozsahu dráždivých reakcií.

39.

Zákal určuje množstvo svetla prepusteného cez rohovku. Zákal rohovky sa kvantitatívne meria pomocou opacitometra a výsledkom sú hodnoty zákalu merané na spojitej stupnici.

40.

Priepustnosť určuje množstvo farbiva fluoresceínu sodného, ktoré prejde cez všetky bunkové vrstvy rohovky (t. j. od epitelu na vonkajšom povrchu rohovky cez endotel na vnútornom povrchu rohovky). 1 ml roztoku fluoresceínu sodného (4 alebo 5 mg/ml, keď sa testujú kvapaliny a povrchovo aktívne látky, resp. povrchovo neaktívne tuhé látky) sa pridá do prednej komory držiaka rohovky, ktorá sa dotýka epiteliálnej strany rohovky, zatiaľ čo zadná komora, ktorá sa dotýka endoteliálnej strany rohovky, sa naplní čerstvým EMEM. Držiak sa potom inkubuje vo vodorovnej polohe počas 90 ± 5 minút pri teplote 32 ± 1 °C. Množstvo fluoresceínu sodného, ktorý prejde do zadnej komory, sa kvantitatívne odmeria pomocou ultrafialovej/viditeľnej spektrofotometrie. Spektrofotometrické merania stanovené pri 490 nm sa zaznamenajú ako hodnoty optickej hustoty (OD490) alebo absorbancie, ktoré sa merajú na spojitej stupnici. Hodnoty priepustnosti fluoresceínu sa stanovia z hodnôt OD490 nameraných spektrofotometrom pri viditeľnom svetle s použitím štandardnej optickej dĺžky 1 cm.

41.

Alternatívne sa môže použiť snímač 96-jamkových mikrotitračných platní za predpokladu, že i) je možné vytvoriť lineárny rozsah snímača platní na stanovenie hodnôt OD490 pre fluoresceín a ii) použijú sa správne objemy vzoriek fluoresceínu na 96-jamkovej platničke, aby výsledkom boli hodnoty OD490, ktoré sa rovnajú štandardnej optickej dĺžke 1 cm (to by mohlo vyžadovať kompletné naplnenie jamky [obyčajne 360ml]).

42.

Keď sa vykoná korekcia hodnôt zákalu a priemernej priepustnosti (OD490) vzhľadom na zákal pozadia a hodnoty priepustnosti OD490 negatívnej kontroly, priemerné hodnoty zákalu a priepustnosti OD490 pre každú upravenú skupinu by sa mali dosadiť do empiricky odvodeného vzorca na výpočet hodnotiaceho čísla dráždivosti in vitro (ďalej len ‚IVIS‘) pre každú upravenú skupinu takto:

IVIS = priemerná hodnota zákalu + (15 × priemerná hodnota priepustnosti OD490)

Sina a kol. (16) oznámili, že tento vzorec bol odvodený pri vnútrolaboratórnych a medzilaboratórnych štúdiách. Údaje vypočítané na súbor 36 zlúčenín v rámci štúdie za účasti viacerých laboratórií sa podrobili analýze podľa viacerých náhodných premenných s cieľom určiť rovnicu, ktorá by najlepšie vyjadrovala vzťah medzi údajmi in vivo a in vitro. Túto analýzu vykonali vedci v dvoch nezávislých spoločnostiach a odvodili takmer totožné rovnice.

43.

Hodnoty zákalu a priepustnosti by sa mali posudzovať aj samostatne, aby sa zistilo, či testovaná látka vyvolala žieravý účinok, alebo silné podráždenie iba prostredníctvom jednej z dvoch koncových hodnôt (pozri Rozhodovacie kritériá).

44.

Látka, ktorá vyvoláva IVIS ≥ 55,1, sa vymedzuje ako žieravá alebo silne dráždivá. Ako sa uvádza v odseku 1, ak sa testovaná látka nepreukáže ako očná žieravina alebo silne dráždivá látka, malo by sa vykonať ďalšie testovanie na účely klasifikácie a označovania. Testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky má celkovú presnosť 79 % (113/143) až 81 % (119/147), mieru falošnej pozitivity 19 % (20/103) až 21 % (22/103) a mieru falošnej negativity 16 % (7/43) až 25 % (10/40) v porovnaní s údajmi metódy na testovanie očí králikov in vivo klasifikovanej podľa klasifikačného systému EPA (1), EÚ (2) alebo GHS (3). Keď sa látky v rámci určitých chemických tried (t. j. alkoholy, ketóny) alebo fyzikálnych tried (t. j. tuhé látky) vylúčia z databázy, presnosť testovania zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky v klasifikačných systémoch EÚ, EPA a GHS je v rozsahu 87 % (72/83) až 92 % (78/85), miera falošnej pozitivity je v rozsahu 12 % (7/58) až 16 % (9/56) a miera falošnej negativity je v rozsahu 0 % (0/27) až 12 % (3/26).

45.

Aj keď sa nezíska klasifikácia očnej žieravosti alebo silnej dráždivosti testovanej látky, údaje testovania zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky môžu byť užitočné v spojení s testovacími údajmi z testu očí králikov in vivo alebo z vhodne overeného testu in vitro na ďalšie posúdenie použiteľnosti a obmedzení testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky na zisťovanie slabo dráždivých alebo nedráždivých látok (usmernenie na používanie testovacích metód očnej toxicity in vitro je v štádiu vývoja).

46.

Test sa považuje za prijateľný, ak výsledkom pozitívnej kontroly je IVIS, ktoré patrí do rozsahu dvoch štandardných odchýlok aktuálneho historického priemeru, ktorý sa má aktualizovať najmenej každé tri mesiace alebo vždy, keď sa vykoná nejaký prijateľný test v laboratóriách, kde sa testy vykonávajú zriedkavo (t. j. menej ako jedenkrát za mesiac). Výsledkom reakcií negatívnej kontroly alebo kontroly rozpúšťadla/nosiča by mali byť hodnoty zákalu a priepustnosti, ktoré sú menšie ako stanovené horné hranice hodnôt zákalu a priepustnosti pozadia pre hovädzie rohovky upravené príslušnou negatívnou kontrolou alebo kontrolou rozpúšťadla/nosiča.

47.

Správa o testovaní by mala obsahovať tieto informácie, ak sú dôležité na vykonanie štúdie:

Testované a kontrolné látky

Informácie týkajúce sa objednávateľa a testovacieho zariadenia

Zdôvodnenie testovacej metódy a použitý protokol

Integrita testovacej metódy

Postup, ktorý sa používa na zabezpečenie integrity (t. j. presnosti a spoľahlivosti) testovacej metódy v čase (napr. pravidelné testovanie látok na preukázanie spôsobilosti, používanie historických negatívnych a pozitívnych kontrolných údajov).

Kritériá na prijateľný test

Podmienky testovania

Výsledky

Diskusia

Záver

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual (Príručka na kontrolu označení): 2. vydanie. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency (Agentúra USA pre ochranu životného prostredia).

(2)

Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene a doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006. Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1.

(3)

OSN (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS) [Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemikálií (ďalej len ‚GHS‘)]. Druhé prepracované vydanie, New York a Ženeva: United Nations Publications, 2007. Dostupné na:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants (Oznámenie o záveroch retrospektívnej štúdie ICCVAM o organotypických rozboroch in vitro ako kontrolných testoch na zisťovanie potenciálnych očných žieravín a silne dráždivých látok). Dostupné na:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(5)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives (Správa o hodnotení testovacích metód – testovacie metódy očnej toxicity in vitro na zisťovanie očných silne dráždivých a žieravých látok). Medziagentúrny koordinačný výbor pre overovanie alternatívnych metód a národný toxikologický program (ďalej len ‚NTP‘) medziagentúrneho strediska pre overovanie alternatívnych toxikologických metód (ďalej len ‚NICEATM‘). Publikácia NIH č.: 07-4517. Dostupné na:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(6)

Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES. Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405 (Usmernenie na testovanie 405). OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion (Usmernenie OECD na testovanie chemikálií. Akútne podráždenie očí/žieravosť). Dostupné na:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol (Protokol testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky odporúčaný výborom ICCVAM). In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives (V: Správa ICCVAM o hodnotení testovacej metódy – testovacie metódy očnej toxicity in vitro na zisťovanie očných silne dráždivých látok a žieravín). Medziagentúrny koordinačný výbor pre overovanie alternatívnych metód a národný toxikologický program medziagentúrneho strediska na overovanie alternatívnych toxikologických metód. Publikácia NIH č.: 07-4517. Dostupné na:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability Test Method (Súčasný stav testovacích metód in vitro na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok: testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky). Publikácia NIH č.: 06-4512. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Dostupné na:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

INVITTOX (1999). Protocol 124: Bovine Corneal Opacity and Permeability Assay – SOP of Microbiological Associates Ltd. (Protokol 124: rozbor zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky – ŠPP Microbiological Associates Ltd.), Ispra, Taliansko: Európske centrum pre validáciu alternatívnych metód (ďalej len ‚ECVAM‘).

(11)

Gautheron, P., Dukic, M., Alix, D. a Sina, J.F. (1992). Bovine corneal opacity and permeability test: An in vitro assay of ocular irritancy (Testovanie zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky: rozbor dráždivosti očí in vitro). Fundam. Appl. Toxicol. 18:442 – 449.

(12)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L. a the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (Poradný výbor pre postupy kontroly nákaz v zdravotnej starostlivosti) (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings (Usmernenie na izolačné opatrenia: predchádzanie prenosu pôvodcov nákaz v organizáciách zdravotnej starostlivosti). Dostupné na:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf].

(13)

Maurer, J.K., Parker, R.D. a Jester, J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays (Rozsah poranení rohovky ako mechanický základ podráždenia očí: hlavné zistenia a odporúčania na vývoj alternatívnych rozborov). Reg. Tox. Pharmacol. 36:106 – 117.

(14)

Doughty, M.J., Petrou, S. a Macmillan, H. (1995). Anatomy and morphology of the cornea of bovine eyes from a slaughterhouse (Anatómia a morfológia rohoviek hovädzích očí z bitúnka). Can. J. Zool. 73:2159 – 2165.

(15)

Collee, J. a Bradley, R. (1997). BSE: A decade on - Part I (BSE: o desaťročie ďalej – časť I). The Lancet 349:636 – 641.

(16)

Sina, J.F., Galer, D.M., Sussman, R.S., Gautheron, P.D., Sargent, E.V., Leong, B., Shah, P.V., Curren, R.D., a Miller, K. (1995). A collaborative evaluation of seven alternatives to the Draize eye irritation test using pharmaceutical intermediates (Spolupráca pri posudzovaní siedmich alternatív k Draize testu dráždivosti očí s použitím farmaceutických medziproduktov). Fundam Appl Toxicol 26:20 – 31.

(17)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method (Informačný dokument o kontrole, aktuálny stav testovacích metód in vitro na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok: testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky). Dostupné na:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method. (Informačný dokument o kontrole, aktuálny stav testovacích metód in vitro na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok: testovacia metóda izolovaného kuracieho oka). Dostupné na:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm]

1.

Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka je testovacia metóda in vitro, ktorá sa môže používať za určitých okolností a s určitými obmedzeniami na klasifikáciu látok a zmesí ako očných žieravín a silne dráždivých látok (1) (2) (3). Na účely tejto testovacej metódy sa silne dráždivé látky vymedzujú ako látky vyvolávajúce očné lézie, ktoré u králikov pretrvávajú najmenej 21 dní po podaní. I keď sa nepovažuje za platnú a plnohodnotnú náhrada testu králičích očí in vivo, odporúča sa používať testovaciu metódu izolovaného kuracieho oka ako súčasť stratégie postupného testovania pre regulačnú klasifikáciu a na označovanie v rámci určitej sféry použiteľnosti (4) (5). Testované látky a zmesi (6), ktoré sú v tomto rozbore pozitívne, možno klasifikovať ako očné žieraviny alebo silne dráždivé látky bez ďalšieho testovania na králikoch. Látka, ktorej testovanie je negatívne, sa musí testovať na králikoch s využitím stratégie sekvenčného testovania, ako sa ustanovuje v usmernení OECD na testy 405 (7) (kapitola B.5 tejto prílohy).

2.

Účelom tejto metódy je opísať postupy, ktoré sa používajú na posudzovanie potenciálnej očnej žieravosti alebo silnej dráždivosti testovanej látky meraním jej schopnosti vyvolať toxicitu vo vylúpnutom kuracom oku. Toxické účinky na rohovku sa merajú: i) kvalitatívnym hodnotením zákalu, ii) kvalitatívnym hodnotením poškodenia epitelu na základe nanesenia fluoresceínu do oka (zadržania fluoresceínu), iii) kvantitatívnym meraním zväčšenej hrúbky (zdurenia) a iv) kvalitatívnym posudzovaním makroskopického morfologického poškodenia povrchu. Zákal rohovky, zdurenie a hodnotenie poškodenia po vystavení pôsobeniu testovanej látky sa hodnotia jednotlivo a potom sa zlúčia a odvodí sa klasifikácia očného podráždenia.

3.

Očné dráždivé látky vyvolávajúce lézie, ktoré ustúpia za menej ako 21 dní, a nedráždivé látky sa takisto testovali s využitím testovacej metódy izolovaného kuracieho oka. Presnosť a spoľahlivosť testovacej metódy izolovaného kuracieho oka na látky v týchto kategóriách sa však formálne neposudzovala.

4.

Vymedzenia sú uvedené v dodatku 1.

5.

Táto testovacia metóda vychádza z protokolu testovacej metódy izolovaného kuracieho oka medziagentúrneho koordinačného výboru pre overovanie alternatívnych metód (ďalej len ‚ICCVAM‘) (8), ktorý bol vytvorený podľa medzinárodnej hodnotiacej štúdie (4) (5) (9) s príspevkami od Európskeho centra pre validáciu alternatívnych metód, japonského centra pre overovanie alternatívnych metód a z Odboru toxikológie a aplikovanej farmakológie Organizácie pre aplikovaný prírodovedecký výskum pre kvalitu života (ďalej len ‚TNO‘) (Holandsko). Tento protokol vychádza z informácií získaných zo zverejnených protokolov, ako aj z aktuálneho protokolu, ktorý používa TNO (10) (11) (12) (13) (14).

6.

Zistené obmedzenia tejto testovacej metódy vychádzajú z vysokej miery falošnej pozitivity na alkoholy a z vysokých mier falošnej negativity na tuhé látky a povrchovo aktívne látky (pozri odsek 47) (4). Keď sa látky týchto chemických a fyzikálnych tried vylúčia z údajovej základne, presnosť testovacej metódy izolovaného kuracieho oka v klasifikačných systémoch EÚ, EPA a GHS sa výrazne zlepší (4). Na základe účelu tohto rozboru (t. j. iba na zisťovanie očných žieravín/silne dráždivých látok) miery falošnej negativity nie sú rozhodujúce, pretože takéto látky sa následne testujú na králikoch alebo inými vhodne overenými testami in vitro v závislosti od regulačných požiadaviek s použitím stratégie sekvenčného testovania, ktorá vychádza z prístupu podľa závažnosti dôkazov. Okrem toho aktuálna overovacia databáza neumožňuje primerané posúdenie niektorých chemických tried alebo tried výrobkov (napr. zmesí). Výskumníci by však mohli zvážiť použitie tejto testovacej metódy na testovanie všetkých druhov materiálov (vrátane zmesí), pričom pozitívny výsledok by sa mohol akceptovať ako údaj, ktorý naznačuje reakciu vo forme očnej žieravosti alebo silného podráždenia. Pozitívny výsledok získaný pre alkoholy by sa však mal interpretovať opatrne pre riziko nadsadenej predpovede.

7.

Všetky postupy s kuracími očami a s hovädzími rohovkami by mali vyhovovať platným nariadeniam daného testovacieho zariadenia a postupom na narábanie s materiálmi pochádzajúcimi z ľudí alebo zo zvierat, medzi ktoré okrem iných patria tkanivá a tkanivové tekutiny. Odporúčajú sa všeobecne platné laboratórne bezpečnostné opatrenia (15).

8.

Obmedzením tejto testovacej metódy je, že i keď sa zohľadňujú niektoré účinky na oči, ktoré sa posudzujú metódou testovania očnej dráždivosti králikov, a do istej miery aj ich závažnosť, neprihliada sa na poškodenia spojiviek a dúhovky. I keď sa samotná vratnosť lézií rohovky nemôže posudzovať testovacou metódou izolovaného kuracieho oka, na základe štúdií očí králikov bol takisto podaný návrh, aby sa hodnotenie počiatočnej hĺbky poškodenia rohovky mohlo používať na rozlišovanie nevratných a vratných účinkov (16). A nakoniec, testovacia metóda izolovaného kuracieho oka neumožňuje vykonať hodnotenie potenciálu pre systémovú toxicitu súvisiacu s expozíciou očí.

9.

Pokračujú práce na ďalšom charakterizovaní použiteľnosti a obmedzení testovacej metódy izolovaného kuracieho oka na zisťovanie slabo dráždivých a nedráždivých látok (pozri aj odsek 48). Používateľom sa takisto odporúča, aby poskytli vzorky a/alebo údaje overovacím organizáciám na formálne posúdenie možných budúcich spôsobov použitia testovacej metódy izolovaného kuracieho oka, vrátane zisťovania očných slabo dráždivých a nedráždivých látok.

10.

V každom laboratóriu, ktoré prvýkrát zavádza tento rozbor, by sa mali použiť chemikálie na preukázanie spôsobilosti uvedené v dodatku 2. Laboratórium môže použiť tieto chemikálie na preukázanie svojej technickej spôsobilosti na vykonávanie testovacej metódy izolovaného kuracieho oka prv, ako predloží údaje z testovania izolovaného kuracieho oka na účely regulačnej klasifikácie nebezpečenstva.

11.

Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka je organotypický model, ktorý poskytuje krátkodobé zachovanie kuracieho oka in vitro. Pri tejto testovacej metóde sa poškodenie testovanou látkou hodnotí stanovením zdurenia rohovky, zákalu rohovky a zadržania fluoresceínu v rohovke. Zatiaľ čo posledné dva parametre vyžadujú kvalitatívne hodnotenie, analýza zdurenia rohovky poskytuje kvantitatívne hodnotenie. Každé meranie sa prevedie na kvantitatívny údaj, ktorý sa použije na výpočet celkového indexu podráždenia, alebo sa priradí kvalitatívna kategória, ktorá sa použije na priradenie klasifikácie očnej žieravosti a silnej dráždivosti in vitro. Každý z týchto výsledkov sa potom môže použiť na predvídanie potenciálu testovanej látky pôsobiť ako žieravina a silne dráždivá látka in vivo (pozri Rozhodovacie kritériá).

12.

Historicky sa na tento rozbor používali oči pochádzajúce z kurčiat z bitúnkov, kde sa zabíjajú na ľudskú spotrebu, čím sa odstránila potreba laboratórnych zvierat. Používajú sa iba oči zo zdravých zvierat, ktoré sa považujú za vhodné na vstup do ľudského potravinového reťazca.

13.

I keď sa ešte nevykonala žiadna kontrolovaná štúdia na posúdenie optimálneho veku kurčiat, vek a hmotnosť kurčiat, ktoré sa používajú historicky na túto testovaciu metódu, zodpovedajú veku a hmotnosti jarných kurčiat spracovávaných tradične na hydinových bitúnkoch (t. j. približne 7 týždňov, 1,5 – 2,5 kg).

14.

Hlavy by sa mali odoberať hneď po znehybnení kurčiat zvyčajne elektrickým šokom alebo narezaním krku s následným vykrvácaním. Miestny zdroj kurčiat v blízkosti laboratória by mal byť situovaný tak, aby sa hlavy mohli dopraviť z bitúnka do laboratória dostatočne rýchlo, čím sa minimalizuje zhoršenie ich kvality a/alebo kontaminácia baktériami. Časový interval medzi odberom kuracích hláv a použitím očí v testovacej metóde izolovaného kuracieho oka by mal byť čo najmenší (zvyčajne do dvoch hodín) a mal by byť preukázateľný, aby sa nedali spochybniť výsledky rozboru. Základom týchto výsledkov sú výberové kritériá na oči, ako aj reakcie na pozitívne a negatívne kontroly. Všetky oči použité na rozbor by mali byť z jednej skupiny očí pochádzajúcich z odberu v určitý deň.

15.

Keďže oči sa odoberajú v laboratóriu, neporušené hlavy sa dopravujú z bitúnka pri teplote okolitého prostredia v plastových boxoch a zvlhčujú sa utierkami namočenými do izotonického fyziologického roztoku.

16.

Oči, ktoré majú po vylúpnutí vysoké počiatočné sfarbenie fluoresceínom (t. j. > 0,5) alebo vysokú hodnotu zakalenia rohovky (t. j. > 0,5), sa vyradia.

17.

Každá skupina na úpravu a súbežnú pozitívnu kontrolu sa skladá najmenej z troch očí. Skupina na negatívnu kontrolu alebo na kontrolu rozpúšťadla (ak sa používa iné rozpúšťadlo ako fyziologický roztok) obsahuje minimálne jedno oko.

18.

Očné viečka sa opatrne odrežú, pričom sa dbá na to, aby sa nepoškodila rohovka. Celistvosť rohovky sa rýchlo vyhodnotí kvapkou 2 % (m/V) fluoresceínu sodného, ktorá sa nanesie na povrch rohovky na niekoľko sekúnd a potom sa opláchne izotonickým fyziologickým roztokom. Oči ošetrené fluoresceínom sa potom prehliadnu pod biomikroskopom, aby sa potvrdilo, že rohovka je nepoškodená (t. j. hodnota zadržania fluoresceínu a zákalu rohovky ≤ 0,5).

19.

Ak je rohovka nepoškodená, oko sa vyreže z lebky a dbá sa na to, aby sa nepoškodila rohovka. Očná guľa sa vytiahne z očnej jamky, pričom sa tretie viečko pevne zachytí chirurgickými kliešťami a očné svaly sa prestrihnú ohnutými nožnicami s tupými hrotmi. Dôležité je zabrániť poškodeniu rohovky nadmerným tlakom (napr. kompresnými predmetmi).

20.

Keď sa oko vyberie z očnej jamky, mala by sa na ňom ponechať viditeľná časť očného nervu. Po vybratí z očnej jamky sa oko položí na absorpčnú podložku a odreže sa tretie viečko a iné spojovacie tkanivá.

21.

Vylúpnuté oko sa upevní do svorky z nehrdzavejúcej ocele tak, aby rohovka bola v kolmej polohe. Svorka sa potom prenesie do komory superfúzneho prístroja (16). Svorky by sa mali do superfúzneho prístroja vložiť tak, aby celá rohovka bola ponorená v izotonickom fyziologickom roztoku. Komory superfúzneho prístroja by mali mať riadenú teplotu 32 ± 1,5 °C. V dodatku 3 je uvedená schéma typického superfúzneho prístroja a očných svoriek, ktoré je možné kúpiť alebo zhotoviť. Prístroj sa môže upraviť tak, aby vyhovoval potrebám konkrétneho laboratória (napr. na uloženie rôzneho počtu očí).

22.

Po vložení do superfúzneho prístroja sa oči znova prehliadnu pod biomikroskopom a skontroluje sa, či počas resekcie nedošlo k ich poškodeniu. Súčasne by sa mala odmerať aj hrúbka rohovky na vrchole rohovky s použitím meracieho zariadenia na biomikroskope. Oči s i) hodnotou zadržania fluoresceínu > 0,5; ii) hodnotou zákalu rohovky > 0,5 alebo iii) s akýmikoľvek inými znakmi poškodenia by sa mali nahradiť inými. Spomedzi očí, ktoré sa nevyradia na základe niektorého z týchto kritérií, sa musia vyradiť oči s hrúbkou rohovky, ktorá má odchýlku viac ako 10 % z priemernej hodnoty za všetky oči. Používatelia by mali vedieť, že biomikroskopy môžu poskytovať rôzne namerané údaje hrúbky rohovky, ak je nastavená rôzna šírka štrbiny. Šírka štrbiny by mala byť nastavená na 0,095 mm.

23.

Keď sa všetky oči prezrú a sú vyhovujúce, inkubujú sa asi 45 až 60 minút, aby sa dostali do ustáleného stavu s testovacím systémom pred dávkovaním. Po dobe ustaľovania sa zaznamená nulové referenčné meranie na hrúbku a zákal rohovky, ktoré slúži ako základný stav (t. j. čas = 0). Hodnota fluoresceínu stanovená pri resekcii sa používa ako základné meranie tohto konečného výsledku.

24.

Hneď po nulových referenčných meraniach sa oko (v držiaku) vyberie zo superfúzneho prístroja, uloží sa do vodorovnej polohy a na rohovku sa nanesie testovaná látka.

25.

Kvapalné testované látky sa zvyčajne testujú nezriedené, ale ak sa to považuje za potrebné, môžu sa zriediť (napr. ako súčasť návrhu štúdie). Ako rozpúšťadlo pre zriedené látky sa uprednostňuje fyziologický roztok. V riadených podmienkach sa však môžu používať aj iné rozpúšťadlá, ale mala by sa preukázať vhodnosť iných rozpúšťadiel použitých namiesto fyziologického roztoku.

26.

Kvapalné testované látky sa nanesú na rohovku tak, aby celý povrch rohovky bol rovnomerne pokrytý testovanou látkou; štandardný objem je 0,03 ml.

27.

Ak je to možné, tuhé látky by sa mali čo najjemnejšie rozdrviť tĺčikom v trecej miske alebo podobným drviacim nástrojom. Prášok sa potom nanesie na rohovku tak, aby povrch bol rovnomerne pokrytý testovanou látku; štandardné množstvo je 0,03 g.

28.

Testovaná látka (kvapalná alebo tuhá) sa nanesie na 10 sekúnd a potom sa opláchne z oka izotonickým fyziologickým roztokom (približne 20 ml) pri teplote okolitého prostredia. Oko (v držiaku) sa následne vráti do superfúzneho prístroja do pôvodnej zvislej polohy.

29.

Súbežné negatívne kontroly alebo kontroly rozpúšťadla/nosiča a pozitívne kontroly by sa mali začleniť do každého pokusu.

30.

Keď sa testujú kvapaliny s koncentráciou 100 % alebo tuhé látky, v testovacej metóde izolovaného kuracieho oka sa používa fyziologický roztok ako súbežná negatívna kontrola na zisťovanie nešpecifických zmien v testovacom systéme a aby sa zabezpečilo, že podmienky rozboru nevyvolajú nežiaducu reakciu vo forme podráždenia.

31.

Keď sa testujú nezriedené kvapaliny, súbežná skupina na kontrolu rozpúšťadla/nosiča sa začlení do testovacej metódy, aby sa zistili nešpecifické zmeny v testovacom systéme a aby sa zabezpečilo, že podmienky rozboru nevyvolajú nežiaducu reakciu vo forme podráždenia. Ako sa uvádza v odseku 25, môže sa použiť iba také rozpúšťadlo/nosič, o ktorom sa preukázalo, že nemá nepriaznivé účinky na testovací systém.

32.

Do každého pokusu sa začlení známa očná dráždivá látka ako súbežná pozitívna kontrola, aby sa overilo, že sa vyvolala náležitá reakcia. Keďže v tejto testovacej metóde sa používa rozbor izolovaného kuracieho oka na zisťovanie žieravín alebo silne dráždivých látok, na pozitívnu kontrolu by sa mala použiť referenčná látka, ktorá pri tejto testovacej metóde vyvoláva silnú reakciu. Aby sa však umožnilo vyhodnotenie premenlivosti reakcie pri pozitívnej kontrole v čase, závažnosť dráždivej reakcie by nemala byť extrémne silná. Mali by sa vygenerovať dostatočné údaje in vitro na pozitívnu kontrolu, aby bolo možné vypočítať štatisticky vymedzený prijateľný rozsah pre pozitívnu kontrolu. Ak na určitú pozitívnu kontrolu nie sú k dispozícii primerané historické údaje testovacej metódy izolovaného kuracieho oka, môže byť potrebné vykonať štúdie, ktoré by tieto informácie poskytli.

33.

Príkladom pozitívnych kontrol na kvapalné testované látky je 10 % kyselina octová alebo 5 % benzalkónium chlorid, zatiaľ čo príkladom pozitívnych kontrol na tuhé testované látky je hydroxid sodný alebo imidazol.

34.

Referenčné látky sú užitočné na posudzovanie schopnosti neznámych chemikálií určitých chemických tried alebo tried výrobkov spôsobovať očné podráždenie alebo na posudzovanie pomerného dráždivého potenciálu očnej dráždivej látky v určitom rozsahu dráždivých reakcií.

35.

Merané rohovky sa posudzujú pred úpravou a 30, 75, 120, 180 a 240 minút (± 5 minút) po opláchnutí po testovanej látke. Tieto časové body poskytujú primeraný počet meraní počas 4 hodín ošetrenia, pričom medzi meraniami zostáva dostatok času na vykonanie predpísaných pozorovaní pre všetky oči.

36.

Posudzované konečné výsledky sú zákal rohovky, zdurenie rohovky, zadržanie fluoresceínu v rohovke a morfologické účinky (napr. tvorba jamiek alebo uvoľnenie epitelu). Všetky konečné výsledky, s výnimkou zadržania fluoresceínu (ktoré sa stanovuje iba pred úpravou a 30 minút po vystavení pôsobeniu testovanej látky), sa stanovujú v každom z uvedených časových bodov.

37.

Odporúča sa vyhotoviť fotografie na zdokumentovanie zákalu rohovky, zadržania fluoresceínu, morfologických účinkov a histopatológie, ak sa vykoná.

38.

Po poslednom prehliadnutí po štyroch hodinách sa používateľom odporúča, aby oči uložili do vhodného fixačného roztoku (napr. neutrálneho tlmivého roztoku formalínu) pre prípadné histopatologické skúmanie.

39.

Zdurenie rohovky sa stanovuje meraním hrúbky rohovky optickým pachymetrom na biomikroskope. Vyjadruje sa v percentách a vypočíta sa z nameraných údajov hrúbky rohovky podľa tohto vzorca:

40.

Priemerná percentuálna hodnota zdurenia rohovky za všetky testované oči sa vypočíta pre všetky časové body merania. Na základe najvyššej priemernej hodnoty zdurenia rohovky, nameranej v každom časovom bode, sa potom určí celková hodnota kategórie na každú testovanú látku.

41.

Zákal rohovky sa vypočíta tak, že na hodnotenie sa použije časť rohovky, ktorá je najhustejšie zakalená. Priemerná hodnota zákalu rohovky za všetky testované oči sa vypočíta pre všetky časové body merania. Na základe najvyššej priemernej hodnoty zákalu rohovky, nameranej v každom časovom bode, sa potom určí celková hodnota kategórie pre každú testovanú látku (tabuľka 1).

Tabuľka 1

Hodnoty zákalu rohovky

42.

Priemerná hodnota zadržania fluoresceínu za všetky testované oči sa vypočíta len na meranie v časovom bode 30 minút a použije sa na určenie celkovej hodnoty kategórie na každú testovanú látku (tabuľka 2).

Tabuľka 2

Hodnoty zadržania fluoresceínu

43.

Medzi morfologické účinky patrí ‚jamkovanie‘ buniek epitelu rohovky, ‚uvoľnenie‘ epitelu, ‚zdrsnenie‘ povrchu rohovky a ‚priľnutie‘ testovanej látky k rohovke. Tieto zistenia môžu byť rôzne, pokiaľ ide o ich závažnosť, a môžu sa vyskytovať súčasne. Klasifikácia týchto zistení je subjektívna podľa výkladu výskumníka.

44.

Výsledné hodnoty zákalu rohovky, zdurenia rohovky a zadržania fluoresceínu by sa mali posudzovať osobitne, aby sa stanovila trieda izolovaného kuracieho oka pre každý konečný výsledok. Triedy izolovaného kuracieho oka pre každý konečný výsledok sa potom zlúčia a stanoví sa klasifikácia dráždivosti na každú testovanú látku.

45.

Keď sa posúdi každý konečný výsledok, môžu sa priradiť triedy izolovaného kuracieho oka na základe vopred určeného rozsahu. Výklad hrúbky rohovky (tabuľka 3), zákalu (tabuľka 4) a zadržania fluoresceínu (tabuľka 5) s použitím štyroch tried izolovaného kuracieho oka sa robí podľa týchto stupníc:

Tabuľka 3

Klasifikačné kritériá izolovaného kuracieho oka na hrúbku rohovky

Tabuľka 4

Klasifikačné kritériá izolovaného kuracieho oka na zákal

Tabuľka 5

Klasifikačné kritériá izolovaného kuracieho oka na priemerné zadržanie fluoresceínu

46.

Celková klasifikácia dráždivosti in vitro na testovanú látku sa hodnotí pomocou klasifikácie dráždivosti, ktorá zodpovedá kombinácii kategórií získaných pre zdurenie rohovky, zákal rohovky a zadržanie fluoresceínu a použitím schémy uvedenej v tabuľke 6.

Tabuľka 6

Celková klasifikácia dráždivosti in vitro

47.

Ako sa uvádza v odseku 1, ak sa testovaná látka nepreukáže ako očná žieravina alebo silne dráždivá látka, malo by sa vykonať ďalšie testovanie na účely klasifikácie a označovania. Testovacia metóda izolovaného kuracieho oka má celkovú presnosť 83 % (120/144) až 87 % (134/154), mieru falošnej pozitivity 6 % (7/122) až 8 % (9/116) a mieru falošnej negativity 41 % (13/32) až 50 % (15/30) na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok v porovnaní s údajmi metódy na testovanie očí králikov in vivo klasifikovanej podľa klasifikačného systému EPA (1), EÚ (2) alebo GHS (3). Keď sa látky v rámci určitých chemických tried (t. j. alkoholy a povrchovo aktívne látky) a fyzikálnych tried (t. j. tuhé látky) vylúčia z databázy, presnosť testovania izolovaného kuracieho oka v klasifikačných systémoch EÚ, EPA a GHS je v rozsahu 91 % (75/82) až 92 % (69/75), miery falošnej pozitivity sú v rozsahu 5 % (4/73) až 6 % (4/70) a miery falošnej negativity sú v rozsahu 29 % (2/7) až 33 % (3/9) (4).

48.

Aj keď sa nezíska klasifikácia očnej žieravosti alebo silnej dráždivosti testovanej látky, údaje testovania izolovaného kuracieho oka môžu byť užitočné v spojení s testovacími údajmi z testu očí králikov in vivo alebo z vhodne overeného testu in vitro na ďalšie posúdenie použiteľnosti a obmedzení testovacej metódy izolovaného kuracieho oka na zisťovanie slabo dráždivých a nedráždivých látok (usmernenie na používanie testovacích metód očnej toxicity in vitro je v štádiu vývoja).

49.

Test sa považuje za prijateľný, ak výsledkom súbežných negatívnych kontrol a kontrol rozpúšťadla/nosiča a súbežných pozitívnych kontrol je klasifikácia dráždivosti, ktorá patrí do triedy nedráždivých látok, resp. silne dráždivých látok/žieravín.

50.

Správa o testovaní by mala obsahovať tieto informácie, ak sú dôležité na vykonanie štúdie:

Testované a kontrolné látky

Informácie týkajúce sa objednávateľa a testovacieho zariadenia

Zdôvodnenie testovacej metódy a použitý protokol

Integrita testovacej metódy

Postup, ktorý sa používa na zabezpečenie integrity (t. j. presnosti a spoľahlivosti) testovacej metódy v čase (napr. pravidelné testovanie látok na preukázanie spôsobilosti, používanie historických negatívnych a pozitívnych kontrolných údajov).

Kritériá pre prijateľný test

Prijateľné rozsahy prípadných súbežných referenčných kontrol na základe historických údajov.

Podmienky testovania

Výsledky

Diskusia

Záver

(1)

U.S. EPA (1996). Label Review Manual (Príručka na kontrolu označení): 2. vydanie. EPA737-B-96-001. Washington, DC: U.S. Environmental Protection Agency (Agentúra USA pre ochranu životného prostredia).

(2)

Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1272/2008 zo 16. decembra 2008 o klasifikácii, označovaní a balení látok a zmesí, o zmene a doplnení a zrušení smerníc 67/548/EHS a 1999/45/ES a o zmene a doplnení nariadenia (ES) č. 1907/2006. Ú. v. EÚ L 353, 31.12.2008, s. 1.

(3)

Organizácia Spojených národov (OSN) (2007). Globally Harmonized System of Classification and Labelling of Chemicals (GHS) [Globálny harmonizovaný systém klasifikácie a označovania chemikálií (ďalej len ‚GHS‘)]. Druhé prepracované vydanie, OSN New York a Ženeva, 2007. Dostupné na:

[http://www.unece.org/trans/danger/publi/ghs/ghs_rev02/02files_e.html]

(4)

ICCVAM (2007). Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives (Správa o hodnotení testovacích metód –testovacie metódy očnej toxicity in vitro na zisťovanie očných silne dráždivých a žieravých látok). Medziagentúrny koordinačný výbor pre overovanie alternatívnych metód a národný toxikologický program (ďalej len ‚NTP‘) medziagentúrneho strediska pre overovanie alternatívnych toxikologických metód (ďalej len ‚NICEATM‘). Publikácia NIH č.: 07-4517. Dostupné na:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(5)

ESAC (2007). Statement on the conclusion of the ICCVAM retrospective study on organotypic in vitro assays as screening tests to identify potential ocular corrosives and severe eye irritants (Oznámenie o závere retrospektívnej štúdie ICCVAM o organotypických rozboroch in vitro ako kontrolných testoch na zisťovanie potenciálnych očných žieravín a silne dráždivých látok). Dostupné na:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm]

(6)

Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1907/2006 z 18. decembra 2006 o registrácii, hodnotení, autorizácii a obmedzovaní chemikálií (REACH) a o zriadení Európskej chemickej agentúry, o zmene a doplnení smernice 1999/45/ES a o zrušení nariadenia Rady (EHS) č. 793/93 a nariadenia Komisie (ES) č. 1488/94, smernice Rady 76/769/EHS a smerníc Komisie 91/155/EHS, 93/67/EHS, 93/105/ES a 2000/21/ES. Ú. v. EÚ L 396, 30.12.2006, s. 1.

(7)

OECD (2002). Test Guideline 405 (Usmernenie na testovanie 405). OECD Guideline for Testing of Chemicals. Acute eye irritation/corrosion (Usmernenie OECD na testovanie chemikálií. Akútne podráždenie očí/žieravosť). Dostupné na:

[http://www.oecd.org/document/40/0,2340,en_2649_34377_37051368_1_1_1_1,00.html]

(8)

ICCVAM (2007). ICCVAM Recommended BCOP Test Method Protocol (Protokol testovacej metódy zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky odporúčaný výborom ICCVAM). In: ICCVAM Test Method Evaluation Report - In Vitro Ocular Toxicity Test Methods for Identifying Ocular Severe Irritants and Corrosives (V: Správa ICCVAM o hodnotení testovacej metódy – testovacie metódy očnej toxicity in vitro na zisťovanie očných silne dráždivých látok a žieravín). Medziagentúrny koordinačný výbor pre overovanie alternatívnych metód a národný toxikologický program medziagentúrneho strediska na overovanie alternatívnych toxikologických metód. Publikácia NIH č.: 07-4517. Dostupné na:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_tmer.htm]

(9)

ICCVAM. (2006). Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye Test Method (Súčasný stav testovacích metód in vitro na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok: testovacia metóda izolovaného kuracieho oka). Publikácia NIH č.: 06-4513. Research Triangle Park: National Toxicology Program. Dostupné na:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_ice.htm]

(10)

Prinsen, M.K. a Koëter, B.W.M. (1993). Justification of the enucleated eye test with eyes of slaughterhouse animals as an alternative to the Draize eye irritation test with rabbits (Dôvody na testovanie vylúpnutých očí na očiach jatočných zvierat ako alternatívy k Draize testu dráždivosti na králikoch). Fd. Chem. Toxicol. 31:69-76.

(11)

INVITTOX (1994). Chicken enucleated eye test (CEET). (Protokol 80: Testovanie vylúpnutých kuracích očí). Dostupné na:

[http://ecvam.jrc.it/index.htm].

(12)

Balls, M., Botham, P.A., Bruner, L.H. a Spielmann H. (1995). The EC/HO international validation study on alternatives to the Draize eye irritation test (Medzinárodná hodnotiaca štúdia ES/humanitárnych organizácií o alternatívach k Draize testu očnej dráždivosti). Toxicol. In Vitro 9:871-929.

(13)

Prinsen, M.K. (1996). The chicken enucleated eye test (CEET): A practical (pre)screen for the assessment of eye irritation/corrosion potential of test materials [Testovanie vylúpnutých kuracích očí: praktická (predbežná) kontrola na hodnotenie schopnosti testovaných materiálov vyvolať očné podráždenie/žieravý účinok]. Food Chem. Toxicol. 34:291 – 296.

(14)

Chamberlain, M., Gad, S.C., Gautheron, P. a Prinsen, M.K. (1997). IRAG Working Group I: Organotypic models for the assessment/prediction of ocular irritation (Organotypické modely na hodnotenie/predvídanie očného podráždenia). Food Chem. Toxicol. 35:23 – 37.

(15)

Siegel, J.D., Rhinehart, E., Jackson, M., Chiarello, L., a the Healthcare Infection Control Practices Advisory Committee (Poradný výbor pre postupy na kontrolu nákaz v zdravotnej starostlivosti) (2007). Guideline for Isolation Precautions: Preventing Transmission of Infectious Agents in Healthcare Settings (Usmernenie pre izolačné opatrenia: predchádzanie prenosu pôvodcov nákaz v organizáciách zdravotnej starostlivosti). Dostupné na:

[http://www.cdc.gov/ncidod/dhqp/pdf/isolation2007.pdf].

(16)

Maurer, J.K., Parker, R.D. a Jester J.V. (2002). Extent of corneal injury as the mechanistic basis for ocular irritation: key findings and recommendations for the development of alternative assays (Rozsah poranení rohovky ako mechanický základ podráždenia očí: hlavné zistenia a odporúčania na vývoj alternatívnych rozborov). Reg. Tox. Pharmacol. 36:106 – 117.

(17)

Burton, A.B.G., M. York a R.S. Lawrence (1981). The in vitro assessment of severe irritants (Hodnotenie silne dráždivých látok in vitro). Fd. Cosmet.- Toxicol.- 19, 471 – 480.

(18)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Bovine Corneal Opacity and Permeability (BCOP) Test Method (Informačný dokument o kontrole, aktuálny stav testovacích metód in vitro na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok: testovacia metóda zákalu a priepustnosti hovädzej rohovky). Dostupné na:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].

(19)

ICCVAM (2006). Background review document, Current Status of In Vitro Test Methods for Identifying Ocular Corrosives and Severe Irritants: Isolated Chicken Eye (ICE) Test Method (Informačný dokument o kontrole, aktuálny stav testovacích metód in vitro na zisťovanie očných žieravín a silne dráždivých látok: testovacia metóda izolovaného kuracieho oka). Dostupné na:

[http://iccvam.niehs.nih.gov/methods/ocutox/ivocutox/ocu_brd_bcop.htm].